UA118955C2

UA118955C2 - Клітина та спосіб одержання рекомбінантного білка ідуронат-2-сульфатази

Info

Publication number: UA118955C2
Application number: UAA201413829A
Authority: UA
Inventors: Ференс Болдог; Міхаель Хартлейн
Original assignee: Шир Хьюман Дженетік Терапіс, Інк.
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2019-04-10
Also published as: TR201904435T4; EP2874649B1; ZA201409396B; PE20150957A1; EA201492183A1; JP6302499B2; DOP2014000298A; KR101710487B1; EP2874649A4; PH12016500011A1; KR20150030242A; AU2016200460B2; BR112014032560B1; PH12014502868B1; WO2014005019A3; IL254560A0; AU2013282400B2; SG10201509397SA; BR112014032560A2; MY189314A

Abstract

Винахід стосується клітини, що містить першу нуклеїнову кислоту, яка кодує білок ідуронат-2-сульфатази (I2S), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну SEQ ID NO: 1; та другу нуклеїнову кислоту, яка кодує білок формілгліцинутворюючого ферменту (FGE), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну SEQ ID NO: 5, при цьому перша та/або друга нуклеїнова кислота є екзогенною, а клітина за культивування в умовах клітинного культивування виробляє білок I2S, що містить щонайменше близько 70 % залишків цистеїну, які відповідають Cys59 з SEQ ID NO: 1, перетворених у C(-формілгліцин (FGly), причому рівень білка ідуронат-2-сульфатази, який експресує клітина, в 0,3-10 разів вище рівня білка формілгліцинутворюючого ферменту, який експресує ця клітина.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки

Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США 61/666719, поданою на реєстрацію 29 червня 2012 р., яка в повному обсязі включена в цей документ в якості посилання.

Перелік послідовностей

Цей винахід посилається на Перелік послідовностей, поданий в електронній формі у вигляді файлу АЗСПЛХ під назвою "2006685-00340 5ЕО І1І5Т" 27 червня 2013 р. Файліхі був створений 25 червня 2013 р., його розмір становить 25 КБ. Повний зміст Переліку послідовностей включений в цей документ за допомогою посилання.

Рівень техніки

Мукополісахаридоз І типу (МПС ІІ, синдром Хантера) - це зчеплене з Х-хромосомою рецесивне захворювання з групи лизосомних хвороб накопичення, причиною якого є дефіцит ферменту ідуронат-2-сульфатази (125). І25 відщеплює термінальні 2-О-сульфатні компоненти від глікозаміногліканів (ЗАС) дерматансульфату та гепарансульфату. Внаслідок відсутності або дефективності ферменту І25 у пацієнтів з синдромом Хантера САС поступово накопичується в лізосомах різних типів клітин, що призводить до клітинного переповнення, органомегалії, руйнування тканин та систематичної дисфункції органів.

Зазвичай фізичні прояви синдрому Хантера у людей включають як соматичні, так і нейрональні симптоми. Наприклад, у деяких випадках синдрому Хантера ураження центральної нервової системи призводить до затримки в розвитку та проблем нервової системи. Хоча при народженні симптоми синдрому Хантера, не пов'язані з нервовою системою, зазвичай відсутні, з часом постійне накопичення ЗАС в клітинах тіла може сильно впливати на периферичні тканини тіла. Накопичення САС в периферичній тканині призводить до характерної грубості рис обличчя пацієнта та обумовлює видатний лоб, сплощене перенісся та збільшений язик - відмітні ознаки пацієнта з синдромом Хантера. Аналогічно, накопичення ЗАС може негативно впливати на системи органів тіла. Від початку виявляючись у вигляді потовщення стінок серця, легенів та дихальних шляхів, а також патологічного збільшення печінки, селезінки та нирок, ці кардинальні зміни можуть, зрештою, призвести до загальної катастрофічної недостатності органів. Як наслідок, синдром Хантера завжди є важким, прогресуючим та обмежуючим час життя захворюванням.

Ферментозамісна терапія (ФЗ3Т) є схваленою терапією для лікування синдрому Хантера (МПеС Ії), яка включає введення екзогенного замісного ферменту І25 пацієнтам з синдромом

Хантера.

Суть винаходу

У винаході, серед іншого, запропоновані вдосконалені способи та композиції для отримання рекомбінантного білка І25, який робить можливою більш ефективну ферментозамісну терапію за синдрому Хантера. Цей винахід включає відкриття, що більш ефективний рекомбінантний білок 25 можна отримати за допомогою клітин ссавців, сконструйованих так, щоб вони коекспресували рекомбінантний білок І25 та формілгліцин-утворюючий фермент (ЕСЕ).

Несподівано рекомбінантний білок І25, отриманий за допомогою таких сконструйованих клітин, характеризується незвично високим рівнем відсотка конверсії у Са-формілгліцин (ЕСІУу) (наприклад, більш ніж 7095 та аж до 10095), що призводить до значного поліпшення ферментативної активності рекомбінантного білка І25. Додатково, клітини ссавців, які коекспресують білки І25 та ЕСЕ відповідно до цього винаходу, були успішно адаптовані для вирощування в суспензійній культурі у великих масштабах. Отже, цей винахід забезпечує можливість більш ефективного отримання високоактивного рекомбінантного білку І25 у великих масштабах.

Таким чином, в одному аспекті у цьому винаході запропонована клітина, що містить першу нуклеїнову кислоту, кодуючу білок ідуронат-2-сульфатази (125), що має амінокислотну послідовність, щонайменше приблизно на 50 95 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, б6О бо, 65 У, 70 Зо, 75 96, 80 бо, 85 У, 90 9, 95 9Уо, 96 9о, 97 90, 98 90 або 99 Фо) ідентичну ЗЕО І

МО:1; та другу нуклеїнову кислоту, кодуючу білок формілгліцин-утворюючого ферменту (ЕСЕ), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше приблизно на 5095 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 60 9, 65 90, 70 У, 75 о, 80 95, 85 У, 90 90, 95 9, 96 90, 97 9, 98 95 або 99 95) ідентичну 5ЕО ІЮО МО:5, при чому перша та/або друга нуклеїнова кислота є екзогенними, а клітина за культивування в умовах клітинного культивування (наприклад, в суспензійній або адгезивній культурі) виробляє білок І25, що містить щонайменше близько 70 95 (наприклад, щонайменше близько 75 95, 80 95, 85 Зо, 90 95, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 90, 99 95 або 100 95) залишків цистеїну, які відповідають Суб559 з 5ЕБО ІЮ МО:1, перетворених у Са- бо формілгліцин (ЕС1У).

В іншому аспекті у цьому винаході запропонована клітина, що містить першу нуклеїнову кислоту, кодуючу білок ідуронат-2-сульфатази (125), що має амінокислотну послідовність, щонайменше приблизно на 50 95 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 60 95, 65 9, 7096, 75 96, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95) ідентичну ЗЕО ІЮ МО:1; та другу нуклеїнову кислоту, кодуючу білок формілгліцин-утворюючого ферменту (БОСЕ), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше приблизно на 5095 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 60 95, 65 90, 70 У, 75 о, 80 95, 85 У, 90 90, 95 9, 96 90, 97 9, 98 95 або 99 95) ідентичну 5ЕО ІЮО МО:5, при чому перша та/або друга нуклеїнова кислота є екзогенними, а клітина за культивування в умовах клітинного культивування виробляє білок І25, що містить щонайменше близько 50 95 (наприклад, щонайменше близько 55 95, 60 9о, 65 95, 70 9, 75 ув, 80 95, 85 9, 90 9, 95 90, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95) залишків цистеїну, які відповідають Субз59 з 5ЕО ІЮ МО:1, перетворених у Са-формілгліцин (ЕСІу), за рівня питомої продуктивності більшого, ніж близько 10 пікограмів/клітину/день (наприклад, більшого, ніж близько 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 пікограмів/клітину/день).

У деяких варіантах реалізації винаходу перша нуклеїнова кислота кодує білок І25, що містить амінокислотну послідовність, ідентичну 5ЕО ІЮ МО:1. У деяких варіантах реалізації винаходу друга нуклеїнова кислота кодує білок ЕСЕ, що містить амінокислотну послідовність, ідентичну 5ЕО ІЮ МО:5.

У деяких варіантах реалізації винаходу перша та/або друга нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з промотором ПСММ.

У деяких варіантах реалізації винаходу перша та/або друга нуклеїнова кислота є кодон- оптимізованими. У деяких варіантах реалізації винаходу перша нуклеїнова кислота містить послідовність, щонайменше приблизно на 50 95 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 6о0 то, 65 зо, 70 то, 75 то, 80 то, 85 то, 90 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 Фо) ідентичну ЗЕО ІЮО МО:7.

У конкретних варіантах реалізації винаходу перша нуклеїнова кислота містить послідовність

ЗЕО І МО:7.

У деяких варіантах реалізації винаходу друга нуклеїнова кислота містить послідовність, щонайменше приблизно на 50 95 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 60 95, 65 9,

Зо 70 95, 75 У, 80 95, 85 бо, 90 90, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 98 95, 99 90) ідентичну 5ЕО ІЮО МО:8. У деяких варіантах реалізації винаходу друга нуклеїнова кислота містить послідовність, ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:8.

У деяких варіантах реалізації винаходу і перша і друга нуклеїнові кислоти є екзогенними (також званими рекомбінантними). У деяких варіантах реалізації винаходу перша та/або друга нуклеїнові кислоти інтегровані (наприклад, стабільно) в геном клітини. У деяких варіантах реалізації винаходу перша та/або друга нуклеїнові кислоти присутні в одній або більше позахромосомних конструкцій.

У деяких варіантах реалізації винаходу клітина згідно цього винаходу є клітиною ссавця. У певних варіантах реалізації винаходу придатна клітина ссавця є клітиною людини. У конкретних варіантах реалізації винаходу придатна клітка ссавця є клітиною СНО.

У деяких варіантах реалізації винаходу клітина згідно з винаходом є такою, що адаптується до суспензійної культури. В інших варіантах реалізації винаходу клітина згідно з винаходом є адгезивною.

У додатковому аспекті в цьому винаході запропонований спосіб отримання рекомбінантного білку ідуронат-2-сульфатази (125) шляхом культивування клітини, описаної в різних наведених в цьому документі варіантах реалізації винаходу, в таких умовах, що рекомбінантні білки І25 та

ЕСЕ коекспресуються в клітині. У деяких варіантах реалізації винаходу клітку культивують у великих масштабах. У деяких варіантах реалізації винаходу великі масштаби, придатні для цього винаходу, відповідають процесу, який проходить у біореакторі. У деяких варіантах реалізації винаходу біореактор, придатний для цього винаходу, має об'єм, вибраний з 10 Л, 200

Л, 500 Л, 1000 Л, 1500 Л, 2000 Л. У деяких варіантах реалізації винаходу процес, який відповідає великим масштабам (наприклад, в біореакторі), придатний для цього винаходу, включає процес перфузії. У деяких варіантах реалізації винаходу процес, який відповідає великим масштабам (наприклад, в біореакторі), придатний для цього винаходу, включає використання періодичної культури. У деяких варіантах реалізації винаходу процес, який відповідає великим масштабам, придатний для цього винаходу, являє собою процес, який проходить у ролерному флаконі. У деяких варіантах реалізації винаходу клітину згідно з цим винаходом культивують в суспензії. В інших варіантах реалізації винаходу клітину згідно з цим винаходом культивують адгезивно.

У деяких варіантах реалізації винаходу клітину згідно з цим винаходом культивують в бо безсироватковому середовищі (наприклад, в середовищі нетваринного походження, хімічно визначеному або безбілюовому середовищі). В інших варіантах реалізації винаходу клітину згідно з цим винаходом культивують в середовищі, що містить сироватку.

У різних варіантах реалізації винаходу спосіб згідно з винаходом додатково включає етап очищення рекомбінантного білку І25.

В іншому аспекті в цьому винаході запропонований рекомбінантний білок ідуронат-2- сульфатази (125), отриманий за допомогою клітини або способу, описаних у наведених в цьому документі різних варіантах реалізації винаходу.

У деяких варіантах реалізації в цьому винаході запропонований спосіб отримання рекомбінантного білку ідуронат-2-сульфатази (125), в якому зазначений рекомбінантний білок

І25 має амінокислотну послідовність щонайменше приблизно на 5095 (наприклад, щонайменше приблизно на 55 95, 60 95, 65 90, 70 У, 75 о, 80 95, 85 У, 90 90, 95 9, 96 90, 97 9, 98 95, 99 95) ідентичну 5ЕО ІЮ МО:1; та що містить щонайменше близько 70 95 (наприклад, щонайменше близько 75 95, 80 95, 85 95, 90 90, 95 9, 96 95, 97 Фо, 98 95, 99 9», 100 95) залишків цистеїну, які відповідають Субз59 з 5ЕО ІЮ МО:1, перетворених у Са-формілгліцин (ЕС1У).. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 має амінокислотну послідовність, ідентичну ЗЕО ІЮ МО:1. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 характеризується специфічною активністю, що становить щонайменше близько 20

Е/мг, 30 Е/мг, 40 Е/мг, 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг або 100 Е/мг, яка визначається за допомогою іп міїго аналізу активності виділення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду.

Серед іншого, в цьому винаході також запропонований фармацевтична композиція, що містить рекомбінантний білок І25, описаний в наведених в цьому документі різних варіантах реалізації винаходу, та фармацевтично прийнятний носій, а також спосіб лікування синдрому

Хантера шляхом введення суб'єктові, який цього потребує, описаного в цьому документі рекомбінантного білка І25, або фармацевтичної композиції, яка його містить.

Терміни "білок 1257, "І25", "фермент І25", які використовуються в цьому документі, або їхні граматичні еквіваленти відносяться до отримання молекул рекомбінантного білку І25, якщо не вказане інше.

Терміни "близько" та "приблизно", які використовуються в цій заявці, застосовуються як

Зо еквівалентні. Мається на увазі, що будь-які чисельні значення, наведені в цій заявці з або без близько/лриблизно, включають будь-які нормальні відхилення, очевидні для фахівця у відповідній галузі техніки.

Інші ознаки, об'єкти та переваги цього винаходу стануть зрозумілими з нижченаведеного детального опису винаходу. При цьому варто розуміти, що детальний опис, хоча і вказує варіанти реалізації цього винаходу, наведений виключно з ілюстративною, але не обмежувальною метою. Для фахівців у цій галузі техніки різні зміни та модифікації, які входять в об'єм винаходу, стануть зрозумілими з детального опису.

Короткий опис графічних матеріалів

Описані нижче Фігури, які є Графічними матеріалами, наведені виключно з ілюстративною, але не обмежувальною метою.

На Фігурі 1 проілюстрована амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:1), кодуюча зрілу форму людського білку ідуронат-2-сульфатази (125), а в межах білкової послідовності вказані потенційні ділянки М-зв'язаного глікозилювання та конверсії цистеїну.

На Фігурі 2 проілюстровані типові конструкції для коекспресії І25 та ЕСЕ (тобто, БОМЕТ1). (А)

Експресійні одиниці на окремих векторах (для котрансфекції або послідовних трансфекцій); (В)

Експресійні одиниці на одному векторі (одна трансфекція): (1) окремі цистрони та (2) транскрипційно зв'язані цистрони.

На Фігурі З проілюстровані типові рівні специфічної активності І25, які спостерігаються, скорельовані відносно відсотка конверсії у формілгліцин.

На Фігурі 4 проілюстрований типовий профіль гліканів, відповідний рекомбінантному ферменту 125, отриманому за використання клітинних ліній І25-АЕ 20 та 40, які вирощуються в умовах безсироваткового клітинного культивування, порівняно з контрольним рекомбінантним ферментом 125.

Визначення

Для кращого розуміння цього винаходу наведені визначення деяких термінів. Додаткові визначення для нижченаведених термінів та інших термінів, наведені в продовження всього опису винаходу.

Амінокислота. Термін "амінокислота" який використовується в цьому документі, в найширшому своєму сенсі позначає будь-яке з'єднання та/або речовину, яка може бути бо включеною в поліпептидний ланцюг. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота має наступну загальну структуру: Н2М-С(НХА)-СООН. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота є амінокислотою природного походження. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота є синтетичною амінокислотою; у деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота є Ю-амінокислотою; у деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота є |і- амінокислотою. "Стандартна амінокислота" відноситься до будь-якої з двадцяти стандартних І - амінокислот, які зазвичай входять до складу пептидів природного походження. "Нестандартна амінокислота" відноситься до будь-якої амінокислоти, відмінної від стандартних амінокислот, незалежно від того, отримана вона синтетично або з природного джерела. Термін "синтетична амінокислота", який використовується в цьому документі, включає хімічно модифіковані амінокислоти, включаючи, але не обмежуючись цим, солі, похідні амінокислот (такі як аміди) та/або заміщення. Амінокислоти, включаючи карбокси- та/або аміно-термінальні амінокислоти в пептидах, можна модифікувати за допомогою метилування, амідування, ацетилювання, захисних груп та/або заміщень іншими хімічними групами, які можуть змінити час напівжиття циркуляції пептидів без істотного впливу на їх активність. Амінокислоти можуть брати участь в утворенні дисульфідного зв'язку. Амінокислоти можуть містити одну або більше посттрансляційних модифікацій, таких як асоціація з одним або більше хімічних компонентів (наприклад, метильними групами, ацетатними групами, ацетиловими групами, фосфатними групами, формільними компонентами, ізопреноїдними групами, сульфатними групами, поліетиленглікольними компонентами, ліпідними компонентами, вуглеводними компонентами, біотиновими компонентами і так далі). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислоти згідно з цим винаходом можна включати або застосовувати як добавку в середовищі для клітинних культур. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислоти, включені або такі, що застосовуються як добавка у клітинному культуральному середовищі, можуть бути представлені у вигляді солей або у гідратній формі.

Приблизно. Термін "приблизно" або "близько", який використовується в цьому документі, застосовується відносно однієї або більше величин, що представляють інтерес, позначає величину, яка є схожою із зазначеною заданою величиною. У певних варіантах реалізації винаходу термін "приблизно" або "близько" відноситься до діапазону величин, який потрапляє в межі 25 то, 20 то, 19 то, 18 95, 17 об, 16 то, 15 то, 14 55, 13 95, 12 то, 11 то, 10 б, 9 об, 8 б, 7 о,

Ко) бо, 596, 490, З Ов, 2 95, 1 Уб або менше в обидві сторони (більше ніж або менше ніж) від зазначеної заданої величини, якщо не вказане інше або інше не очевидне з контексту (за винятком випадку, коли таке число перевищувало б 100 95 від можливої величини).

Періодична культура. Термін "періодична культура", який використовується в цьому документі, відноситься до способу культивування клітин, в якому всі компоненти, які зрештою будуть застосовані в культивуванні клітин, включаючи середовище (дивіться визначення "середовища" нижче), а також самі клітини, додають на початку процесу культивування.

Періодичну культуру зазвичай зупиняють в певній точці, а клітини та компоненти із середовища збирають та в деяких випадках очищають.

Біодоступність. Термін "біодоступність", який використовується в цьому документі, в загальному випадку відноситься до тієї відсоткової долі введеної дози, яка досягає кровотоку суб'єкту.

Біологічно активний. Фраза "біологічно активний", яка використовується в цьому документі, відноситься до характеристики будь-якої речовини, яка має активність в біологічній системі (наприклад, клітинній культурі, організмі і так далі). Наприклад, речовина, яка за введення в організм чинить на цей організм біологічний ефект, вважається біологічно активною. Біологічну активність також можна визначити за допомогою методів іп міго аналізу (наприклад, іп міго ферментного аналізу, такого як аналіз вивільнення сульфату). У конкретних варіантах реалізації винаходу якщо білок або поліпептид є біологічно активним, частина цього білку або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білку або поліпептиду, зазвичай називають "біологічно активною" частиною. У деяких варіантах реалізації винаходу білок отримують та/або очищують від клітинної культуральної системи, яка проявляє біологічну активність за введення суб'єктові. У деяких варіантах реалізації винаходу білок потребує додаткового процесингу для того, щоб стати біологічно активним. У деяких варіантах реалізації винаходу білок, для того, щоб стати біологічно активним, потребує посттрансляційних модифікацій, таких як, без обмежень, глікозилювання (наприклад, сіалювання), фарнезилювання, розщеплювання, фолдінг, конверсія у формілгліцин та комбінації переліченого вище. У деяких варіантах реалізації винаходу білок, отриманий у вигляді проформи (тобто, незрілої форми), може потребувати додаткової модифікації для того, щоб стати біологічно активним. бо Біореактор. Термін "біореактор", який використовується в цьому документі, відноситься до ємності, яка застосовується для вирощування господарської клітинної культури. Біореактор може мати будь-який розмір, придатний для культивування клітин ссавців. Як правило, об'єм біореактора становить щонайменше 1 літр і може становити 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 літрів або більше, або будь-яке з проміжних значень. Умови всередині біореактору, включаючи, але не обмежуючись цим, рівень рН, осмолярність, насичення СО2, насичення 02, температуру та комбінації зазначених параметрів, зазвичай регулюють під час періоду культивування. Біореактор може бути виконаний з будь-якого матеріалу, придатного для вмісту клітин в середовищі в умовах культивування згідно з цим винаходом, включаючи скло, пластик або метал. У деяких варіантах реалізації винаходу біореактор можна застосовувати для вирощування культури клітин тварин. У деяких варіантах реалізації винаходу біореактор можна застосовувати для вирощування культури клітин ссавців. У деяких варіантах реалізації винаходу біореактор можна застосовувати для клітин та/або клітинних ліній, отриманих з таких організмів, як, без обмежень, клітини ссавців, клітини комах, бактерійні клітини, дріжджові клітини та клітини людини. У деяких варіантах реалізації винаходу біореактор використовують для отримання клітинних культур у великих масштабах, а його об'єм становить щонайменше 100 літрів та може становити 200, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 літрів або більше, або будь-яке з проміжних значень. Фахівець в цій галузі техніки має відповідні знання і зможе обрати біореактори, придатні для практичної реалізації цього винаходу.

Клітинна культура. Цей термін під час використання в цьому документі відноситься до клітинної популяції, яка вирощується в середовищі в умовах, придатних для виживання та зростання клітинної популяції. Для фахівця в цій галузі техніки зрозуміло, що зазначені терміни під час використання в цьому документі можуть відноситися до комбінації, що включають клітинну популяцію та середовище, в якому ця популяція вирощується.

Культивування. Термін "культивування", який використовується в цьому документі, або його граматичні еквіваленти відноситься до процесу вмісту клітин в умовах, що сприяють зростанню та виживанню. Терміни "культивування" та "клітинна культура" або будь-які інші синоніми використовуються в цій заявці взаємозамінно.

Ємність для культивування. Термін "ємність для культивування", який використовується в цьому документі, відноситься до будь-якого контейнеру, який може забезпечити асептичне

Зо середовище для культивування клітин. Типові ємності для культивування включають, але не обмежуються цим, скляні, пластикові або металеві контейнери.

Ферментозамісна терапія (ФЗ3Т): Термін "ферментозамісна терапія (ФЗ3Т), який використовується в цьому документі, відноситься до будь-якої терапевтичної стратегії, яка ліквідує дефіцит ферментів за допомогою введення необхідних ферментів. У деяких варіантах реалізації винаходу необхідний фермент вводять шляхом інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації винаходу необхідний фермент вводять шляхом інфузії у кровотік. Після введення фермент захоплюється клітинами та транспортується у лізосому, де фермент діє так, щоб знищити матеріал, який накопичився у лізосомах внаслідок дефіциту ферментів. Як правило, для того, щоб лизосомна ферментозамісна терапія була ефективною, терапевтичний фермент доставляють у лізосоми відповідних клітин тканин-мішеней, в яких виявляється дефект накопичення.

Експресія. Під час використання в цьому документі "експресією" нуклеотидної послідовності називають один або більше з наступних процесів: (1) отримання РНК-матриці за послідовністю

ДНК (наприклад, шляхом транскрипції); (2) процесинг РНК-транскрипту (наприклад, шляхом сплайсингу, редагування, утворення 5" кепу та/або утворення 3" кінцю); (3) трансляцію РНК у поліпептид або білок; та/або (4) посттрансляційну модифікацію поліпептиду або білку.

Культура з підживленням. Термін "культура з підживленням", який використовується в цьому документі, відноситься до способу культивування клітин, в якому через якийсь час після початку процесу культивування в культуру додають додаткові компоненти. Компоненти, що додаються, зазвичай містять живильні добавки для клітин, які виснажилися під час процесу культивування.

Культуру з підживленням зазвичай зупиняють у певній точці, а клітини та/або компоненти з середовища збирають та в деяких випадках очищують.

Фрагмент. Термін "фрагмент", який використовується в цьому документі, відноситься до поліпептидів та визначається як будь-яка дискретна частина цього поліпептиду, яка є унікальною або характерною для цього поліпептиду. Також під час використання в цьому документі зазначений термін відноситься до будь-якої дискретної частини цього поліпептиду, яка зберігає щонайменше частину активності повнорозмірного поліпептиду. Бажано, щоб частина активності, яка зберігається, становила щонайменше 10 95 активності повнорозмірного поліпептиду. Бажаніше, щоб частина активності, яка зберігається, становила щонайменше бо 20 о, ЗО Фо, 40 95, 50 о, 60 Фо, 70 95, 80 95 або 90 95 активності повнорозмірного поліпептиду. Ще бажаніше, щоб частина активності, яка зберігається, становила щонайменше 95 9», 96 95, 97 9, 98 95 або 99 95 активності повнорозмірного поліпептиду. Найбажаніше, щоб частина активності, яка зберігається, становила 100 95 активності повнорозмірного поліпептиду. Також під час використання в цьому документі зазначений термін відноситься до будь-якої частини заданого поліпептиду, яка містить щонайменше один встановлений елемент послідовності, що міститься в повнорозмірному поліпептиді. Бажано, щоб елемент послідовності збігався з щонайменше 4- 5, бажаніше - зі щонайменше близько 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 або більше амінокислот повнорозмірного поліпептиду.

Ген. Термін "ген", який використовується в цьому документі, відноситься до будь-якої нуклеотидної послідовності, ДНК або РНК, щонайменше частина якої кодує кінцевий дискретний продукт, як правило, але не обмежуючись цим, поліпептид, який бере участь в якомусь аспекті клітинного процесу. Зазначений термін відноситься не лише до кодуючої послідовності, яка кодує поліпептид або інший кінцевий дискретний продукт, але також може включати ділянки, попередні та наступні за кодуючою послідовністю, які модулюють базовий рівень експресії, а також вбудовані послідовності ("інтрони") між окремими кодуючими сегментами ("екзонами"). У деяких варіантах реалізації винаходу ген може містити регуляторні послідовності (наприклад, промотори, енхансери, послідовності поліаденілювання, послідовності термінації, послідовності

Козака, ТАТА-бокси і тому подібне)» та модифікаційні послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу ген може містити прив'язки до нуклеїнових кислот, які не кодують білки, але кодують функціональні молекули РНК, такі як тРНК, РНКи-індукуючі речовини і тому подібне.

Генний продукт або продукт експресії. Термін "генний продукт" або "продукт експресії", який використовується в цьому документі, в загальному випадку відноситься до РНК, яка транскрибується з гену (до та/або після процесингу), або поліпептиду (до та/або після модифікації), який кодується РНК, яка транскрибується з гену.

Генетичний регуляторний елемент. Термін "генетичний регуляторний елемент", який використовується в цьому документі, відноситься до будь-якого елементу послідовності, який модулює експресію гену, з яким він функціонально зв'язаний. Генетичні регуляторні елементи можуть діяти як підвищуючи, так і знижуючи рівні експресії, і можуть розташовуватися до, в межах або за кодуючою послідовністю. Генетичні регуляторні елементи можуть діяти на будь-

Зо якому етапі генної експресії, регулюючи, наприклад, ініціацію, елонгацію або термінацію транскрипції, сплайсинг мРНК, редагування мРНК, стабільність мРНК, локалізацію мРНК в клітині, ініціацію, елонгацію або термінацію трансляції, або будь-який інший етап генної експресії. Генетичні регуляторні елементи можуть діяти окремо або в комбінації один з одним.

Гомологія. Термін "гомологія", який використовується в цьому документі, відноситься до повної схожості між полімерними молекулами, наприклад, між молекулами нуклеїнових кислот (наприклад, молекулами ДНК та/або молекулами РНК), та/або між поліпептидними молекулами.

У деяких варіантах реалізації винаходу полімерні молекули вважаються "гомологічними" по відношенню одна до одної, якщо їхні послідовності ідентичні щонайменше на 25 95, З0 95, 35 95, то, 45 то, 50 Чо, 55 б, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 У, 80 то, 85 то, 90 то, 9595 або 99 95. У деяких 40 варіантах реалізації винаходу полімерні молекули вважаються "гомологічними" по відношенню одна до одної, якщо їхні послідовності Є однаковими щонайменше на 25 95, ЗО 9о, 35 90, 40 95, 96, 50 90, 55 9о, 60 90, 65 9Уо, 70 9о, 75 9о, 80 Фо, 85 9о, 90 9, 95 90 або 99 95.

Ідентичність. Термін "ідентичність", який використовується в цьому документі, відноситься до повної схожості між полімерними молекулами, наприклад, між молекулами нуклеїнових 45 кислот (наприклад, молекулами ДНК та/або молекулами РНК), та/"або між поліпептидними молекулами. Розрахунок відсоткової ідентичності двох нуклеотидних послідовностей, наприклад, можна проводити шляхом вирівнювання двох послідовностей для оптимального порівняння (наприклад, можна вносити гепи до однієї або обох - першу та другу - нуклеотидні послідовності для оптимального вирівнювання, а неідентичними послідовностями в цілях порівняння можна нехтувати). У певних варіантах реалізації винаходу довжина послідовності, що вирівнюється для порівняння, становить щонайменше 3095, щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 60 956, щонайменше 70 95, щонайменше 80 9565, щонайменше 90 96, щонайменше 95 95 або практично 100 95 від довжини контрольної послідовності. Потім проводять порівняння нуклеотидів у відповідних нуклеотидних позиціях. Якщо позицію в першій послідовності займає такий же нуклеотид, що й відповідну позицію в другій послідовності, молекули вважаються ідентичними у вказаній позиції. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій у вказаних послідовностях з врахуванням кількості гепів та довжини кожного гепу, який потрібно внести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей та визначення відсотку 60 ідентичності між двома послідовностями можна здійснити за допомогою математичного алгоритму. Наприклад, відсоток ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями можна визначити за допомогою алгоритму Майєрса та Міллера (САВІО5, 1989, 4: 11-17), який використовується в програмі АГІСМ (версія 2.0), із застосуванням таблиці ваги замін залишків

РАМ120, штрафу за довжину гепу 12 та штрафу за геп 4. У альтернативному варіанті відсоток ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями можна визначити за допомогою програми (ЗАР з пакету програмного забезпечення (Сб, використовуючи матрицю

МУуУздарапа.СМР. Багато інших програм для вирівнювання послідовностей, такі як Сіивіаї, є доступними і можуть бути застосовані для визначення ідентичності послідовностей.

Покращуватися, підвищуватися або знижуватися. Під час використання в цьому документі за допомогою термінів "покращуватися", "підвищуватися" або "знижуватися" або їх граматичних еквівалентів, оцінюють величини відносно базового вимірювання, такого як вимірювання, проведене для однієї й тієї ж особи до початку лікування, описаного в цьому документі, або вимірювання, проведене для контрольної особини (або декількох контрольних особин) у відсутності лікування, описаного в цьому документі. "Контрольною особиною" є особина, уражена тією ж самою формою лизосомної хвороби накопичення, що й особина, яка проходить лікування, приблизно того ж віку, що й особина, яка проходить лікування (для гарантії того, що стадії захворювання у особини, яка проходить лікування, і контрольної(их) особини(ин) можна порівняти).

Інтратекальне введення. Термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція", який використовується в цьому документі, відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, що оточує спинний мозок). Можна використовувати різні методи, включаючи, але не обмежуючись цим, латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через отвір бору або цистернальну або поперекову пункцію і т. п. У деяких варіантах реалізації винаходу "Інтратекальне введення" або "Іінтратекальна доставка" згідно з цим винаходом відноситься до

ІТ введення або доставки через поперекову область або ділянку, тобто, до поперекового ІТ введення або доставки. Термін "поперекова область" або "поперекова ділянка", який використовується в цьому документі, відноситься до області між третім та четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями та, точніше, до І 2-51 ділянки хребту.

Виділений. Термін "виділений", який використовується в цьому документі, відноситься до

Зо речовини та/або сполуки, яка була (1) відокремлена від щонайменше деяких компонентів, з якими вона зв'язана під час вихідного отримання (у природі та/"або експериментальній установці), і (2) отримана, виготовлена та/(або вироблена людиною. Виділені речовини та/або сполуки можуть бути відокремлені від близько 10 95, близько 20 95, близько 30 95, близько 40 95, близько 50 95, близько 60 95, близько 70 95, близько 80 95, близько 90 95, близько 91 95, близько 92 95, близько 93 95, близько 94 95, близько 95 95, близько 96 95, близько 97 95, близько 98 95, близько 99 95 або більше ніж близько 99 95 інших компонентів, з якими вони були зв'язані спочатку. У деяких варіантах реалізації винаходу виділені речовини є очищеними приблизно на 80 95, приблизно 85 95, приблизно 90 95, приблизно 91 95, приблизно 92 95, приблизно 93 95, приблизно 94 95, приблизно 95 95, приблизно 96 95, приблизно 97 95, приблизно 98 95, приблизно 99 95 або більше ніж приблизно 99 95. За вживання в цьому документі речовина є "очищеною", якщо вона в значній мірі вільна від інших компонентів. Під час використання в цьому документі розрахунок відсотку очищення виділених речовин та/або сполук не повинен включати допоміжні речовини (наприклад, буфер, розчинник, воду і так далі).

Середовище. За вживання в цьому документі цей термін позначає розчин, що містить живильні речовини, які живлять зростаючі клітини. Як правило, ці розчини містять незамінні і замінні амінокислоти, вітаміни, джерела енергії, ліпіди і слідові елементи, необхідні для мінімального росту та/або виживання клітин. Розчин може також містити компоненти, які підвищують зростання та/або виживання відносно мінімального рівня, включаючи гормони та чинники зростання. У деяких варіантах реалізації винаходу середовище отримують з оптимальними для виживання і проліферації клітин рівнем рН та сольовою концентрацією. У деяких варіантах реалізації винаходу середовище може бути "хімічно визначеним середовищем" - безсироватковим середовищем, яке не містить білків, гідролізату або компонентів з невідомою композицією. У деяких варіантах реалізації винаходу хімічно визначене середовище не містить компонентів тваринного походження, а всі компоненти середовища мають відому хімічну структуру. У деяких варіантах реалізації винаходу середовище може бути "середовищем на сироватковій основі" - середовищем, яке було доповнене компонентами тваринного походження, такими як, без обмежень, фетальна теляча сироватка, кінська сироватка, козлина сироватка, осляча сироватка та/або їх комбінації.

Нуклеїнова кислота. Термін "нуклеїнова кислота", який використовується в цьому документі, 60 в найширшому своєму сенсі позначає будь-яку сполуку та/"або речовину, яка включена або може бути включена у олігонуклеотидний ланцюг. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота є сполукою та/або речовиною, яка включена або може бути включена в олігонуклеотидний ланцюг за допомогою фосфодиефірного зв'язку. У деяких варіантах реалізації винаходу "нуклеїнова кислота" відноситься до окремих залишків нуклеїнових кислот (наприклад, нуклеотидам та/або нуклеозидам). У деяких варіантах реалізації винаходу "нуклеїнова кислота" відноситься до олігонуклеотидного ланцюга, що містить окремі залишки нуклеїнових кислот. Терміни "олігонуклеотид" та "полінуклеотид", які використовується в цьому документі, можна використовувати взаємозамінно. У деяких варіантах реалізації винаходу "нуклеїнова кислота" включає РНК, а також одно- та/(або дволанцюжкові ДНК та/або кКДНК. Крім того, терміни "нуклеїнова кислота", "ДНК", "РНК" та/або подібні ним терміни включають аналоги нуклеїнових кислот, тобто, аналоги, що містять скелет, відмінний від фосфодиефірного.

Наприклад, так звані "пептидні нуклеїнові кислоти", які відомі в цій галузі техніки та містять в скелеті пептидні зв'язки замість фосфодиефірних зв'язків, вважаються такими, що входять в об'єм цього винаходу. Термін "нуклеотидна послідовність, кодуюча амінокислотну послідовність" включає всі нуклеотидні послідовності, які є виродженими версіями одна одної та/або кодують одну й ту ж амінокислотну послідовність. Нуклеотидні послідовності, кодуючі білки та/або РНК, можуть містити інтрони. Нуклеїнові кислоти можуть бути отримані з природних джерел та очищені, отримані за допомогою рекомбінантних експресійних систем та необов'язково очищені, хімічно синтезовані і так далі. Коли це доцільно, наприклад, у випадку хімічно синтезованих молекул, нуклеїнові кислоти можуть містити нуклеозидні аналоги, такі як аналоги, що містять хімічно модифіковані основи або цукри, модифікації скелету і так далі.

Послідовність нуклеїнових кислот представляють в напрямі від 5" до 3", якщо не вказане інше.

Термін "сегмент нуклеїнової кислоти" використовується в цьому документі для позначення нуклеотидної послідоватльності, яка є частиною більш довгої нуклеотидної послідовності. У багатьох варіантах реалізації винаходу сегмент нуклеїнової кислоти містить щонайменше 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 або більше залишків. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота є або містить природні нуклеозиди (наприклад, аденозин, тимідин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимідин, дезоксигуанозин та дезоксицитидин); нуклеозидні аналоги (наприклад, 2-аміноаденозин, 2-тиотимідин, інозин, пирролопіримідин, З-метиладенозин, 5- метилцитидин, С-5 пропінілцитидин, С-5 пропінілуридин, 2-аміноаденозин, С5-бромоуридин,

Сб5-фторуридин, С5-йодоуридин, С5-пропінілуридин, С5-пропінілдитидин, С5-метилцитидин, 2- аміноаденозин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, Ф(6)- метилгуанін та 2-тиоцитидин); хімічно модифіковані основи; біологічно модифіковані основи (наприклад, метильовані основи); інтеркальовані основи; модифіковані цукри (наприклад, 2'- фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабінозу та гексозу); талабо модифіковані фосфатні групи (наприклад, тиофосфати та 5'-М-фосфорамідитні сполуки). У деяких варіантах реалізації цей винахід безпосередньо відноситься до "немодифікованих нуклеїнових кислот", під якими маються на увазі ті нуклеїнові кислоти (наприклад, полінуклеотидів та залишків, включаючи нуклеотиди та/або нуклеозиди), які не були хімічно модифіковані з метою полегшення або здійснення доставки.

Процес перфузії. Термін "процес перфузії" який використовується в цьому документі, відноситься до способу культивування клітин, в якому додаткові компоненти додають в культуру безперервно або напівбезперервно після початку процесу культивування. Компоненти, що додаються, зазвичай містять живильні добавки для клітин, які виснажилися під час процесу культивування. Частину клітин та/або компонентів середовища зазвичай збирають в безперервному або напівбезперервному режимі і в деяких випадках очищають. Зазвичай процес клітинного культивування, який включає процес перфузії, називають "перфузійною культурою". Як правило, живильні добавки додають в свіже середовище під час процесу перфузії. У деяких варіантах реалізації винаходу свіже середовище може бути ідентичним або схожим з основним середовищем, яке застосовується в процесі клітинного культивування. У деяких варіантах реалізації винаходу свіже середовище може відрізнятися від основного середовища, але при цьому містити необхідні живильні добавки. У деяких варіантах реалізації винаходу свіже середовище є хімічно визначеним середовищем.

Білок. Термін "білок", який використовується в цьому документі, відноситься до поліпептиду (тобто, ланцюги із щонайменше двох амінокислот, з'єднаних одна з одною пептидними зв'язками). Білки можуть містити відмінні від амінокислот компоненти (наприклад, вони можуть бути глікопротеїнами, протеогліканами і так далі) тал'або можуть бути процесованими або модифікованими будь-яким іншим способом. Фахівцям в цій галузі техніки зрозуміло, що "білок" може бути повним поліпептидним ланцюгом, який виробляється клітиною (з наявністю або бо відсутністю сигнальної послідовності), або може бути її характеристичною частиною. У деяких варіантах реалізації винаходу білок інколи може містити більше за один поліпептидний ланцюг, наприклад, ланцюги, зв'язані одним або більше дисульфідних зв'язків або з'єднані іншими способами. У деяких варіантах реалізації винаходу поліпептиди можуть містити І -амінокислоти,

Р-амінокислоти або й ті й інші, та можуть містити будь-які з безлічі відомих в цій галузі техніки амінокислотних модифікацій або аналогів. Модифікації, які застосовуються, включають, наприклад, термінальне ацетилювання, амідування, метилування і так далі. У деяких варіантах реалізації винаходу білки можуть містити амінокислоти природного походження, амінокислоти неприродного походження, синтетичні амінокислоти та їх комбінації. У загальному випадку термін "пептид" використовується для позначення поліпептиду, довжина якого становить менше ніж близько 100 амінокислот, менше ніж близько 50 амінокислот, менше ніж близько 20 амінокислот або менше ніж близько 10 амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу білки є антитілами, фрагментами антитіл, їх біологічно активними частинами та/або їх характеристичними частинами.

Рекомбінантний білок та рекомбінантний поліпептид. Ці терміни використовуються в цьому документі для позначення поліпептиду, який експресується клітиною-господарем, яка була генетично сконструйована для експресії цього поліпептиду. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині-господарі, отриманої від тварини.

У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині- господарі, отриманої від комахи. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині-господарі, отриманої з дріжджів. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині-господарі, отриманої з представника прокариотів. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині-господарі, отриманої від ссавця. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок може експресуватися в клітині-господарі, отриманої від людини.

У деяких варіантах реалізації винаходу поліпептид, який рекомбінантно експресується, може бути ідентичним або схожим з поліпептидом, який зазвичай експресується в клітині-господарі. У деяких варіантах реалізації винаходу поліпептид, який рекомбинантно експресується, може бути чужорідним клітині-осподарю, тобто, гетерологічним пептидам, які зазвичай експресуються в клітині-господарі. В альтернативному варіанті в деяких варіантах реалізації

Зо винаходу поліпептид, який рекомбінантно експресується, може бути химерним, що означає, що частини поліпептиду містять амінокислотні послідовності, які є ідентичними або схожими з поліпептидами, які зазвичай експресуються в клітині-господарі, тоді як інші частини є чужорідними клітині-господарю.

Замісний фермент. Термін "замісний фермент", який використовується в цьому документі, відноситься до будь-якого ферменту, який може діяти таким чином, щоб щонайменше частково замістити дефіцитний або відсутній фермент за захворювання, лікування якого проводиться. У деяких варіантах реалізації винаходу термін "замісний фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який може діяти так, щоб щонайменше частково замістити дефіцитний або відсутній лизосомний фермент за лизосомної хвороби накопичення, лікування якої проводиться. У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент здатний знижувати кількість накопиченого матеріалу в лізосомах ссавців або може знімати або полегшувати один або більше симптомів лизосомної хвороби накопичення. Замісні ферменти, придатні для винаходу, включають лизосомні ферменти як дикого типу, так і модифіковані, і можуть бути отримані за допомогою рекомбінантних та синтетичних способів або очищені з природних джерел. Замісний фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, таким, що генно-активується, або природним ферментом.

Вектор. Термін "вектор", який використовується в цьому документі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка здатна транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана.

У деяких варіантах реалізації винаходу вектори здатні до позахромосомної реплікації та/або експресії нуклеїнових кислот, з якими вони зв'язані в клітині-господарі, такій як еукариотична та/або прокариотична клітина. Вектори, здатні управляти експресією функціонально зв'язаних генів, називаються в цьому документі "експресійними векторами".

Детальний опис винаходу

У цьому винаході, серед іншого, запропоновані способи та композиції для отримання рекомбінантного білку І25 з покращеними ефективністю та активністю за допомогою клітин, коекспресуючих білки І25 та ЕРОБЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини згідно з цим винаходом сконструйовані так, щоб одночасно надекспресувати рекомбінантні білки І25 та БОБЕ.

Клітини згідно з винаходом адаптуються до багатьох умов клітинного культивування. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини згідно з цим винаходом адаптуються до суспензійного 60 безсироваткового культивування у великих масштабах.

Різні аспекти винаходу детально описані в нижченаведених підрозділах. Використання підрозділів не обмежує винахід. Кожний підрозділ можна застосовувати до будь-якого аспекту винаходу. У цій заявці використання "або" позначає "та/або", якщо не вказане інше.

Ідуронат-2-сульфатаза (125)

Під час використання в цьому документі білок І25 є будь-яким білком або частиною білку, який може щонайменше частково замінити активність білку ідуронат-2-сульфатази (125) природного походження або зняти одне або більше клінічних проявів або симптомів, пов'язаних з дефіцитом І25. Терміни "фермент 125" та "білок І25", які використовуються в цьому документі, та їх граматичні еквіваленти використовуються взаємозамінно.

Як правило, людський білок І25 виробляється у формі попередника. Форма попередника людського І25 містить сигнальний пептид (амінокислотні залишки 1-25 повнорозмірного попередника), пропептид (амінокислотні залишки 26-33 повнорозмірного попередника) та ланцюг (залишки 334-550 повнорозмірного попередника), який може бути додатково процесованим у 42 кДа ланцюг (залишки 34-455 повнорозмірного попередника) і 14 кДа ланцюг (залишки 446-550 повнорозмірного попередника). Зазвичай форму попередника називають також повнорозмірним попередником або повнорозмірним білком І25, який містить 550 амінокислот. Амінокислотні послідовності зрілої форми (ЗЕО ІЮ МО':1) з видаленим сигнальним пептидом та повнорозмірний попередник (ЗЕО ІЮ МО:2) типового білку 25 дикого типу або природного походження наведені в Таблиці 1. Сигнальний пептид виділений підкресленням.

Додатково, в Таблиці 1 також наведені амінокислотні послідовності ізоформ а та р попередника людського білку І25, 5ЕО ІЮ МО: та 4, відповідно.

Таблиця 1

Людська ідуронат-2-сульфатаза

ЗЕТОАМЗТТРАЇГ ММ МО АРБІ аСМаркІ МАЗРМІВОЇ АЗНОЇ І ГОМАБАОСАМО

АРБРЕУ5ЗЕЇ ТавВе!РОТТВІ МОЄМУ ВУНАСМЕЗТІРОМЕКЕМАУУ ТМЗУаКМЕНРИЇ

ЗЗМНТООБЗРУБМЗЕРРУНРЗЗЕКМЕМТКТСВОаРОСЕЇ НАМ І СРУОМІ ОМРЕСТІ Р

РКОЗТЕОАЛІОЇ ГГ ЕКМКТЗА5РЕБІ АМаУНКкКРНІРЕВУРКЕРОКІ МР ЕМІТАРОРЕМР

Зріла форма рагРРМАУМРУМОІВОВЕОМОАІ МІЗМРМаРІРМОРОВКІВОЗУБАБЗУЗМІ ОТОМаНВІ.

І ЗАГ ООГОЇ АМЗТАЄТЗОНСОУА аЕНСЕМАКУЗМЕОМАТНУРИ ІРМУРСВТАБІ РЕ

АСЕКІ ЕРМГОРЕОБАБОЇ МЕРЕВО5БМОЇІ МЕЇ М5І ЕРТІ АВІА ОМРРАСРУРБЗЕНМ

ЕГСВЕСКМ КНЕВЕВОГЕЕОРМІ РОМРАЄПАУЗОМРАРБЗОІРОМ МОКРІ КОІКІ

Мам5ІВТІЮМАУТУММУаєЕМРОЕРБІ АМЕЗОІНАСЕЇ МЕМОЗОР ОБНММУМОЗОССИОІ.

ЕОЇ ЕМР(ЗЕО ІЮ МО 1

МРРРАТОаВаИат У СІ МІ 55МСМАЇ ЗЕТОАМЗТТ АМС ПМОО АРБІГ ССМОаОКІ.

МАЗРМІВОЇ АЗНОЇ ЇЇ ГЄОМАБАОСАМСАРЗАВУЗЕЇ ТавАРєРОТТВІ МОЄМУ ВУНАСИ М

ЕЗБТІРОМЕКЕМИ У У ТМЗМакмЕНРИЗЗМНТВОЗРУБУМУЗЕРРУНРЗЗЕКУЕМТКТОСВА

Повно- СРОСЕЇ НАМГ'СРМОМІ ОМРЕСТІ РОКОЗТЕОАІОГ ЕКМКТЗАЗРЕБАМОМНКРНІ розмірний РЕВУРКЕРОКІ УРІ ЕМІТІ АРОРЕМРОСЇ РРМАУМРУМОІВОРВЕОМОАЇ МІЗМР МИ РІ попередник | РУСОЕОВКІВОЗМУЕАБУБВМІ ОТОМОИВІ І ЗА ОО ОЇ АМЗТПАЕТЗОНОСУАІ ЧЕНСЕУМА (ізоформа а) | КУ'ЄМЕОМАТНУРІІЕМУРИВТАБІ РЕАСЕКІ ЕРМІ ОРЕОБАБОЇ МЕРИВО5ЗМОІ МЕ М

ЗІ ЕРТІ АВГ АС ОМРРАСРУРБЗЕНМЕЇ СВЕСКМІ І КНЕВЕВОГЕЄЕОРМІ РАМРАЄЛІА

УБОМРАРБОІРОММЗОКРБІ КОЇКІМЕУБІВТІОМАУТУММУСЕМРОЕРІ АМЕЗОІНАСЕ

ГМЕМО5ОРСОЮНММУМОВОССИОСЕРОССМР(ЗЕО І1Ю МО

Попередник, | ЕЕТІРОМЕКЕМС УМ М5МакмМЕНРОІЗЗМНТООЗРУБМЗЕРРУНРЗЗЕКМЕМТКТОВ ізоформа б | сРОСЕЇ НАМ / СРУОМІ ОМРЕСТІ РОКОЗТЕОЛАІОЇ І ЕКМКТЗА5РЕНБІ АМатУНКРНІ

РЕВУРКЕРОКІ УРІ ЕМІТІ АРОРЕМРОСЇ РРМАУМРУМОІВОВЕРМОАЇ МІЗМР МИ РІ

РМОРОЕрОБЗТОЕВІКТОЗТАКУК (ЗЕО І МО:З

Попередник ЕБТІРОМЕКЕМС У У ТМЗМакмеЕНРОІЗЗМНТВОЗРУБМУЗЕРРУНРЗЗЕКУЕМТКТОСВ ізоформа с "таРОСЕГ НАМ /ССРМОМГОМРЕСТІ РОКОЗТЕОАІО Г ЕКМКТЗА5РЕРБ АМамУНКРНІ

РЕВУРКЕРОКІ УРІ ЕМІТІ АРОРЕМРОСЇ РРМАУМРУМОІВОРВЕОМОАЇ МІЗМР МИ РІ

РМОРОВКІВОЗУБАБУБМІ ОТОМОаВИ ЗАГОВІ ОЇ АМЗТПАЕЄТЗОНаИагІ МАТМТ(ЗЕО

ІО Мо:4

Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є зрілим людським білком

І25 (ЗЕБО ІЮ МО:1). Як розкрито в цьому документі, ЗЕО ІЮ МО:1 являє собою канонічну амінокислотну послідовність людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу білок

І25 може являти собою сплайс-ізоформу та/або варіант ЗЕО ІЮ МО:1, які утворюються в результаті транскрипції на іншій ділянці ініціації в межах 5" ОТК гену 125. У деяких варіантах реалізації винаходу відповідний замісний фермент може бути гомологом або аналогом зрілого людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог зрілого людського білку 25 може бути модифікованим зрілим людським білком І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з білююом І25 дикого типу або природного походження (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:1), та при цьому зберігати значну частину активності білку І25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі гомологічним зрілому людському білку І25 (5ЕО ІЮО МО:1). У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 90, 65 о, 70 У, 75 У, 80 У, 85 о, 90 оо, 91 96, 92 95, 93 95, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Уо, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ

МО:1. У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі ідентичним зрілому людському білку І25 (5ЕО ІЮО МО:1). У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 90, 65 о, 70 У, 75 У, 80 У, 85 о, 90 Фо, 91 Фо, 92 Фо, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 У, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:1.

У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину зрілого людського білку 125.

В альтернативному варіанті фермент І25 є повнорозмірним білком І25. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25 може бути гомологом або аналогом повнорозмірного людського білку 125. Наприклад, гомолог або аналог повнорозмірного людського білку І25 може бути модифікованим повнорозмірним людським білком І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з повнорозмірним білком І25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ МО:2), і при цьому зберігати значну частину активності білку І25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125

Зо є в значній мірі гомологічним повнорозмірному людському білку І25 (ЗЕО ІЮ МО:2). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 90, 65 о, 70 У, 75 У, 80 У, 85 о, 90 оо, 91 96, 92 95, 93 95, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Уо, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ

МО:2. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі ідентичним 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 Зо, 55 9б, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 У, 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 Фо, 96 о, 97 У, 98 95, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:2. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину повнорозмірного людського білка 125. У контексті цього документу повнорозмірний білок І25 зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, є ізоформою а людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу придатний фермент

І25 може бути гомологом або аналогом ізоформи а людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог ізоформи а людського білку І25 може бути модифікованою ізоформою а людського білку І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій у порівнянні з ізоформою а людського білку 25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ МО:3), і при цьому зберігати значну частину активності білку 125. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25 є в значній мірі гомологічною ізоформою а людського білку 25 (ЗЕО ІЮ МО:3). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 9, 65 95, 70 95, 75 Ув, 80 оо, 85 У, 90 9о, 91 У, 92 90, 93 У, 94 90, 95 У, 96 9, 97 У, 98 90, 99 90 або більше гомологічну з5ЕО ІО МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є в значній мірі ідентичним 5ЕО ІЮ МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 95, 60 ро, 65 бо, 70 9, 75 Зо, 80 95, 85 9о, 90 9о, 91 9, 92 о, 93 9о, 94 96, 95 96, 96 9, 97 90, 98 90, 99 90 або більше ідентичну 5ЕО ІЮ МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину ізоформи а людського білка І25. У контексті цього документу ізоформа а людського білка І25 зазвичай містить сигнальну пептидну 60 послідовність.

У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є ізоформою Б людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу придатний фермент І25 може бути гомологом або аналогом ізоформи р людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог ізоформи Б людського білку І25 може бути модифікованою ізоформою Б людського білку І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з ізоформою Б людського білку І25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ МО 4), і при цьому зберігати значну частину активності білку І25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є в значній мірі гомологічним ізоформі Б людського білку 125 (5ЕО ІО

МО:4). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 1/25 містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 бо, 65 0, 70 У, 75 0, 80 о, 85 0, 90 90, 91 о, 92 9, 93 У», 94 90, 95 90, 96 90, 97 Фо, 98 95, 99 956 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є в значній мірі ідентичним 5ЕО ІЮ МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25 містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 5, 60 У5, 65 96, 70 95, 75 95, 80 о, 85 90, 90 У, 91 У, 92 95, 93 95, 94 У, 95 У, 96 9, 97 У, 98 9», 99 95 або більше ідентичну 5ЕО ІЮО МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину ізоформи р людського білку 125. У контексті цього документу ізоформа Б людського білку І25 зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

Гомологи або аналоги людських білків І25 можна отримати відповідно до способів зміни поліпептидної послідовності, відомих фахівцеві в цій галузі техніки, такими як ті, що можна знайти в посиланнях, які описують подібні способи. У деяких варіантах реалізації винаходу консервативні амінокислотні заміни включають заміни, що проводяться для амінокислот в межах наступних груп: (а) М, І, С, М; (Б) Е, М, УМ; (с) К, ЕК, Н; (9) А, 0; (є) 5, Т; (0, М; та (ФУ) Е, О. У деяких варіантах реалізації винаходу "консервативна амінокислотна заміна" відноситься до амінокислотної заміни, яка не призводить до зміни відносного заряду або характерних розмірів білка, в якому проводиться амінокислотна заміна.

У деяких варіантах реалізації винаходу ферменти 125 містять компонент, який зв'язується з рецептором на поверхні клітин для того, щоб полегшити клітинне поглинання та/або лизосомне націлювання. Наприклад, таким рецептором може бути катіон-незалежний манозо-6-фосфатний

Зо рецептор (СІ-МРК), який зв'язує залишки манозо-6-фосфату (МбР). Додатково, СІ-МРК також зв'язує інші білки, включаючи ІСБ-ІЇ. Компонентом, придатним для лизосомного націлювання, може бути ІСБЕ-Ї, ІСЕ-ІЇ, КАР, ро7, а також їх варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи ті пептиди, що містять послідовність, щонайменше на 70 95, 75 95, 80 Фо, 85 Фо, 90 Фо або 95 95 ідентичну пептидним послідовностям зрілих людських ІСБ-І, ІСЕ-ІЇ, КАР, р97 дикого типу). У деяких варіантах реалізації винаходу відповідний рецептор, з яким зв'язуються залишки

МБ6Р, може бути катіон-залежним.

Формілгліцин-утворюючий фермент (ЕСЕ)

Як правило, на ферментативну активність 25 впливає посттрансляційна модифікація консервативного цистеїну (наприклад, відповідного амінокислоті 59 зрілого людського 125 (5ЕО

ІО МО:1)) у формілгліцин, який також називають 2-аміно-3-оксопропіоновою кислотою або оксо- аланіном. Посттрансляційна модифікація зазвичай відбувається в ендоплазматичному ретикулумі під час синтезу білку та каталізує формілгліцин-утворюючим ферментом (ЕСЕ).

Специфічна ферментативна активність 25 зазвичай позитивно корелює зі ступенем формілгліцинової модифікації І25. Наприклад, препарат білку І25, що містить відносно велику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно високою специфічною ферментативною активністю; а препарат білку І25, що містить відносно невелику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно низькою специфічною ферментативною активністю.

Таким чином, клітини, придатні для отримання рекомбінантного білку І25 згідно цього винаходу, зазвичай експресують також білок ЕСЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини експресують ендогенний білок ЕОЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини сконструйовані так, щоб експресувати екзогенний (також званий рекомбінантним) формілгліцин-утворюючий фермент (ЕСЕ) в комбінації з рекомбінантним 125. У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини сконструйовані так, щоб активувати ендогенний ген ЕСЕ для підвищення рівня експресії або активності білка ЕСЕ.

Як правило, людський білок ЕСЕ виробляється у формі попередника. Форма попередника людського ЕОЕ містить сигнальний пептид (амінокислотні залишки 1-33 повнорозмірного попередника) і ланцюг (залишки 34-374 повнорозмірного попередника). Зазвичай форму попередника називають також повнорозмірним попередником або повнорозмірним білком ЕСЕ, 60 що містить 374 амінокислоти. Амінокислотні послідовності зрілої форми (5ЕО ІЮО МО:5) з видаленим сигнальним пептидом і повнорозмірний попередник (ЗЕО ІЮ МО:6) типового білку

ЕСЕ дикого типу або природного походження наведені в Таблиці 2.

Таблиця 2

Людський формілгліцин-утворюючий фермент (ЕСЕ)

ЗОЕгАС,тТадаАавбі АаЗСИ,СОТРОВРИАНИЗЗАААНАУЗАЕАМАРИаРМУ

РОЕВОЇ АНЗКМУРІРАСМЕТМатрОРОІКОРССЕАРАВАВМТІСАЕММрАМУ

ЕМ5МТЕРЕКЕУМЗТам! ТЕАЕКРООЗЕМЕЕСМІ ЗЕОУКТМООСАМААДАР

Зріла форма МЛМ РУКАМ АВНРЕСРОБТІ НАРОНРМІ НИЗУ МОАМАУСТУМ АСК.

РТЕАЕМЖМЕУЗСВОИаИї НМАВГЕРМУСМКІ ОРКИОНМАМУОСЕЕРУТМТИЕ рагОатТАРМОАЕРРМИамМаИаї УМІМЕМАМУ ЕТ ЗОМ ТУННЗМУЕЕТІ МРК сСРєРРЗУСКОВУККОСаЗУМСНАЗУСУВУВСААВЗОМТРОББЗАЗМІ ЕВСА

АОВІРТМО (ЗЕО ІО МО:5

МААРАЇ СІ МСОаВАСРЕ СІ МІ ЛІ БІ І СаААаЗОєАХатТаАсАсаОІ Аа

СаСатТРОАВРЕАНИаЗЗАААНАУЗАЕАМАРИИРУРСЕВНОЇ АН5КМУРІРАС

МЕТМатТрОРОІКОЮССЕАРАВАЕМТІСАЕММОАМЕМЗМТЕРЕКЕУМЗТИаМІ.

Повнорозмірний ТЕАЕКРЕОЗЕМЕЕОМІ БЕОМКТМООСАМААДАРМ/ЛММІ РУКСАМУ/АНРЕСР попередник ОБТІ НАРОНРМІ НУЗМУМОАМАМСТУАСКАІ РТЕАЕМ ЕУЗС ВО НМА

ГЕРЖамМКкГ ОРКАІОНУМАМУМСЕЕРУТМТаЕрИаРОСТАРМОАЕРРМОа У

СІ УМІМамМмАМ ЕМТЗОММТУННЗУЕЕТІ МРКОаРРЗОСОКОВУККСОСОЗУМО

НАЗУСУВУВСААВЗОМТРОБЗБЗАБЗМІ СЕВСААОВІ РТМО (5ЕО ІЮ МО:6

Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу ферментом ЕСЕ, придатним для цілей цього винаходу, є зрілий людський білок ЕСЕ (ЗЕО ІЮ МО:5). У деяких варіантах реалізації винаходу придатний фермент ЕСЕ може бути гомологом або аналогом зрілого людського білка

ЕСЕ. Наприклад, гомолог або аналог зрілого людського більюу ЕСЕ може бути модифікованим зрілим людським білком ЕСЕ, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з білком ЕСЕ дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ

МО:5), і при цьому зберігати значну частину активності білюу ЕСЕ. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі гомологічним зрілому людському білку ЕСЕ (ЗЕО ІЮ МО:5). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 95, бО Зо, 65 У, 70905, 7595, 80 У, 8595, 90 Фо, 91 о, 92 9, 93 У», 94 90, 95 90, 96 90, 97 Фо, 98 95, 99 956 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ МО:5. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі ідентичним зрілому людському білюу ЕСЕ (5ЕО ІО МО:5). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 бо, 65 0, 70 У, 75 0, 80 о, 85 0, 90 90, 91 о, 92 оо, 93 У, 94 90, 95 У, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:5. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину зрілого людського білку ЕОЕ.

В альтернативному варіанті ферментом ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, є повнорозмірний людський білок ЕСЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ може бути гомологом або аналогом повнорозмірного людського білку ЕСЕ. Наприклад, гомолог або аналог повнорозмірного людського білюу ЕСЕ може бути модифікованим повнорозмірним людським білюм ЕСЕ, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з повнорозмірним білююм ЕСЕ дикого типу або природного походження

Зо (наприклад, 5ЕО ІЮО МО:6), і при цьому зберігати значну частину активності білюку ЕСЕ. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕОЕ, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі гомологічним повнорозмірному людському білку ЕСЕ (5ЕО ІО МО:6). У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 Уо, 60 Уо, 65 Фо, 70 Уо, 75 У, 80 о, 85 9», 90 95, 91 9», 92 95, 93 9, 94 95, 95 95, 96 95, 97 9, 98 95, 99 90 або більше гомологічну ЗЕО

ІО МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, є в значній мірі ідентичним 5ЕО ІО МО:6. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 Зо, 55 9б, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 У, 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 Фо, 96 о, 97 У, 98 95, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:6. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину повнорозмірного людського білка ЕСЕ. У контексті цього документу повнорозмірний білок ЕСЕ зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

Типові нуклеотидні послідовності та амінокислотні послідовності, кодуючі типові білки ЕСЕ, розкриті в публікації США Мо 20040229250, повний зміст якої включений в цей документ в якості посилання.

Клітини, коекспресуючі І25 та ЕСЕ

У цьому винаході вказується на необхідність комерційного виробництва біологічно активного (25 на високому рівні за допомогою системи клітинного культивування. Оскільки велика кількість виробничих чинників може впливати на вибір певної клітини-господаря, молекули нуклеїнових кислот, розкриті в цьому винаході, відносяться до широкого спектру прокаріотичних та еукаріотичних клітин та клітинних ліній, включаючи, без обмежень, клітинні лінії, отримані зі штамів бактерій, штамів дріжджів, клітин комах, клітин тварин, клітин ссавців та клітин людини.

В аспектах цього винаходу також запропоновані експресійні конструкції та генерація рекомбінантних стабільних клітинних ліній, придатних для експресії білків І25 та/або РОЕ, як природного походження, так і модифікованих, які розкриті в цьому винаході. Додатково, в аспектах цього винаходу також запропоновані способи для отримання клітинних ліній, експресуючих 25 та БЕСОЕ, за допомогою розкритих в цьому винаході нуклеотидних послідовностей.

Нуклеїнові кислоти, кодуючі білки І25 та/або ЕСЕ

У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані молекули нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидні послідовності, кодуючі представляючий інтерес рекомбінантний ген (званий в цьому документі трансгеном), такий як білок І25 та/або ЕСЕ, описаний в багатьох наведених в цьому документі варіантах реалізації винаходу. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота, кодуюча трансген, може бути модифікована для того, щоб забезпечити підвищену експресію білку 125 та/або ЕСЕ, який кодується, що також називається кодонною оптимізацією. Наприклад, нуклеїнова кислота, кодуюча трансген, може бути модифікована шляхом зміни відкритої рамки зчитування для кодуючої послідовності. Термін "відкрита рамка зчитування", який використовується в цьому документі, є синонімом "ОРС" та позначає будь-яку

Зо нуклеотидну послідовність, потенційно здатну кодувати білок або частину білку. Відкрита рамка зчитування зазвичай починається зі стартового кодону (представленого в стандартному коді у вигляді, наприклад, АОС для молекули РНК та АТО в молекулі ДНК), складається з кодонів- триплетів та закінчується стоп-кодоном (представленим в стандартному коді у вигляді, наприклад, ШАА, ШОА або ОДОС для молекули РНК та ТАА, ТОА або ТАС в молекулі ДНК).

Термін "кодон", який використовується в цьому документі, позначає послідовність з трьох нуклеотидів в молекулі нуклеїнової кислоти, яка визначає конкретну амінокислоту під час синтезу білку; також його називають триплетом або кодон-триплетом. Наприклад, з 64 можливих кодонів в стандартному генетичному коді два кодони - ЗАА та БАС - кодують амінокислоту глутамін, а кодони ААА ї ААСО відповідають амінокислоті лізину. У стандартному генетичному коді три кодони є стоп-кодонами, які не відповідають жодній амінокислоті. Термін "синонімічний кодон", який використовується в цьому документі, позначає будь-який та будь-які кодони, кодуючі одну амінокислоту. За винятком метіоніну і триптофану амінокислоти кодують від двох до шести синонімічних кодонів. Наприклад, в стандартному генетичному коді чотирма синонімічними кодонами, кодуючими амінокислоту аланін, є ОСА, СС, СО і Су, двома синонімічними кодонами, які визначають глутамін, є СЗАА і БАС, а двома синонімічними кодонами, кодуючими лізин, є ААА і ААО.

У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнову кислоту, кодуючу відкриту рамку зчитування білку І25 та/або ЕСЕ, можна модифікувати за допомогою стандартних способів кодонної оптимізації. Для практичної реалізації цього винаходу доступні та можуть застосовуватися різні комерційні алгоритми кодонної оптимізації. Як правило, кодонна оптимізація не призводить до зміни кодованих амінокислотних послідовностей. У деяких варіантах реалізації винаходу результатом кодонної оптимізації можуть бути такі амінокислотні зміни як заміни, делеції або інсерції. Як правило, такі амінокислотні зміни істотно не впливають на активність білку.

Типові нуклеотидні послідовності, кодуючі білки І25 та ЕСЕ, відповідно, показані нижче як

ЗЕО ІЮО МО:7 та 8.

ЗЕО ІЮ МО:7 Типова нуклеотидна послідовність, кодуюча ідуронат-2-сульфатазу (125)

АтасссссоеаосссесАсссаассасавасстастатаастасасстаатасталасдасСата тасатасоостасаСАдаСпАаАСССАааССААСАаСАССАССаАСасоСстаААсата7астаста 60 АТСсАТСЯсТасСАСОАССТаСОЯСсСсСсСсАасстасастастАсва,асаАСсАдастаастарасАассоо

ААСАТССАССАаССсТавасСАаССАСАа,асСстТа7астатСсСАпААСсассттсасссАаа,асАавча7ассата тасассссСАд,ассасатадасттостаАссс,сассавсассссцпАСАССАСССЯСсСТатАСИ,АС

ТТСААСАССТАСТОСОССОССЯтасАСсассаасСААСТТСАаСАССАТОССССАС,СТАСТТСААдпаАаА

АСсССЯсасСстТАСОСТаАССАТОАХССЯ ТасСО)аСААасСаИтаттоСАСсСсССа,ааСАТСАаСА,СААССАСАССС АСадсАассссСтТАСАаСсТавАастсоСССССтТАССАССССАИ,аСАасСа,АпААаТАСпАСпСААСА

СсСААдаАдсСстассасвсассссєвАСсвИСсвАа,аСстасСАСасСсАасстастатасссссаставАСата ставАдсатассСбаАдсдсасСАсоСстасссаАСАда,аСАпАаСАССаАаСАсасСАтоСАастТаст аапАпААпйАтТаАдАаАсСАаСса,асАа,аооостстостаассатавасСстТАССАСАДасСсСССАСАТ сооссттоСасСстАССССААдсСаАаТоСАсАдастатТАсССССтасАсаААСАТСАСССТОИОСССО сАсССсСсСсОСАСООТтасссаАссаостассоссСса,атааССстТАСААсСсСсСстТасАтТасвАСАТоСсассАС сабсАасаАасатасадаассстаААСАТтСсАа,аСсСатассстАсвсассССАтоссСса,атавАСТТоСАа басСААДВАТтоСасСАаАасСтТАСТТаоСА,аСатаАдаСТАсСтТасАСАсСсСАватавасСасСсСта стадаСсасостапйАСаАсстасХастасССААСАаСАССАТСАТСОаССТТСАССАаСаАССАС састесасостасабвАдасАасса,ассАа,атадвасСсСААдаТтАСАаСААСТТОосАСсатааССАСССА са,атасссстТаАтотсотТАСсСОаВОтТассСсаа,асбасСАсСсаКсСА,состТасссвАа,вассавассАсААасСтТ ат оСоСстТАсСсТавАССССТтТссАсАа,аСса,асСАа,асбАастаадтасАасоСс,ааоСасСАпАасСАТ сзаостастасаастаатавааостатсоссСсАСсСсСТОаССЯаСостТа,асссасста,асАаа,аатас ссссссаеастасссса,атассСАастссАссастасаластатасСсасавАаа,аааСААаААсСТа|астаА дасАстосасттсоСасадсставАда,асАааАССССтТАсСстТассСайСААссссСса,асСаАасСтТаА тсасстТАСАааССАаТАсоооСсасссСАаспАСАТСССССАсСТтасААСсАаСИаАСААдасСсСАасс тТаАДаСАСАТСААСАТСАТОСасСстТАСАаСАТОСОаСАССАТСОСАСТАССОЯСТАСАССЯТОТОаСаИТ сааСТТСААССССаАСссА,аттоСсТаасССААСТТСАаСаАСАТССАСОЯССЯвВаСспсАастТатАСТТО ставАсАдасаАсоооСсТасСАасаАССАСААСАТаТАСААСаАСАасССА,асаСсаспАсСТа,Ттто саа,астастаАТассстАС

ЗБО ІЮО МО:8 Типова нуклеотидна послідовність, кодуюча повнорозмірний формілгліцин- утворюючий фермент-попередник (ЕСЕ) яатасстасассСбасАстаасастаатататасвсАаса,атассстала,аставатстатсстот тастастастастотосстастататасвасаСсаса,аавАаа,асбАс,ссАасасссавАссватаСа сасассссеатоссттаесссапстта,асесаеастаСсасасАасасссСсАаа,асвасстааоаСССАТОаС

Зо сАааттса,аасбАааССасТСАССаАТАСТОСОССОЯСООАасСастТААсастоса,асассєсєатТАсоСацвАСА сбааСААстсасСаСАСТСАААаАтТаатСССАтоСсСсТастасАаТАТТТАСААтТасасСАСАСАТ вАТССТСАСАТААДАдаСАсСадлтассасААаСАССстасцАа,ааАаАаТТАСТАТТаАТасСсСТтТТТТАСАТ саАтТассТтАТЧААаТСАаТААТАСТаААТТТаАСаААаИТттТатТаААСТСААСТОааСТАТТТОАСАСА састаАдаАдАдатт,аасаАстстта|атстттаААлдааСАтТаттадатаАаСААаТаААсСАССААТА тТСсААСАСОасСАааттасаастастоссєстаатааТтТАССтТатаАААс,ааСастТААСтТасАсаАСАСоСо

АаААлсаасстаАСТСТАСТАТТСТаСАСАсСасСацпАТСАТОСАССТТСТоСАТИаТаТоСтТасААТОа

АатассатассСстТАСстТасАсттавсасАа,вавАла,аСссаСта7ассСАСа,асАда,асСстаАатасаААТАСА сстатосАдсаАдаассСстТасСАТААТАЧАСТІ ІПОоСсОоСстТасааСААСАААСтТаТасСсАаСССАААцассСА

ССАТТАТаССААСАТ ТаССАСсОваСса,аАаатттоСааТаАССААСАСТОСТОАа,ааАТааСТТОСАА сапААсТасасстаттаАдТасстСсСссСтТоССААТОСТТАТайСТтТАТАСААСАТАатТавсацсААСаИ

САТаСОаААТаСАСТТСсАСАСТОСТтТасАСТаТтСАТСАТТСТаттаААпАААСаТстТТААСССАААА сатосоостстаайпАААаАССаАаТаААпАААлс,а ТапАТОСтТАСАТатассСАТАааТтсТТАТТ сТТАСАСОСтТАТССОСТИа ТОСТОСТоСО,аАдаССАпСААСАСАССТОаАТАаСстотТастІсСаААТСТОСИ

АтПосастатасда,асСсаАссасстасССАССАТаАСАСТаА

У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеотидна заміна може призводити до зміни синонімічного кодону у відкритій рамці зчитування з метою узгодження з частотою застосування ендогенного кодону, який знаходиться в конкретній гетерологічній клітині, обраної для експресії

І25 та/"або БОБ. В альтернативному або додатковому варіанті нуклеотидна заміна може призводити до зміни вмісту (з-С у відкритій рамці зчитування для того, щоб більше відповідати середньому вмісту (с-С відкритих рамок зчитування, які знаходяться в ендогенних нуклеотидних послідовностях гетерологічної клітини-господаря. Нуклеотидна заміна також може призводити до зміни полімононуклеотидної області або внутрішньої регуляторної або структурної ділянки, яка присутня в послідовності І25 або ЕОЕ. Таким чином, розглядається велика кількість модифікованих або оптимізованих нуклеотидних послідовностей, включаючи, без обмежень, нуклеотидні послідовності, які забезпечують підвищену експресію білків І25 та/або ЕСЕ в прокаріотичній клітині; дріжджовій клітині; клітині комахи та в клітині ссавця.

Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота, кодуюча білок 125, придатний для цілей цього винаходу, має нуклеотидну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 Фо, 65 Фо, 70 90, 75 Уо, 80 о, 85 90, 90 У, 91 90, 92 90, 93 Ус, 94 Уо, 95 90, 96 Фо, 97 Фо, 98 90, 60 99 95 або більш ідентичну ЗЕО ІЮ МО:7. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота, кодуюча білок ЕСЕ, придатний для цілей цього винаходу, має нуклеотидну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 бо, 65 0, 70 У, 75 0, 80 о, 85 0, 90 90, 91 о, 92 Фо, 93 95, 94 95, 95 о, 96 Фо, 97 95, 98 У, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІО МО:8. Як правило, модифікована нуклеїнова кислота кодує білок І25 та/або ЕСЕ з або без змін в амінокислотній послідовності. В разі амінокислотних змін, такі зміни зазвичай не призводять до значної зміни активності білка І25 або ЕСЕ.

Експресійні вектори

Нуклеотидну послідовність, кодуючу білок І25 та/або ЕСЕ, як описано в цій заявці, можна молекулярно клонувати (вносити) у відповідний вектор для розмноження або експресії в клітині- господарі. Для практичної реалізації цього винаходу можна застосовувати велику кількість експресійних векторів, включаючи, без обмежень, прокаріотичний експресійний вектор; експресійний вектор дріжджів; експресійний вектор комах та експресійний вектор ссавців. Типові вектори, придатні для цілей цього винаходу, включають, але не обмежуються цим, вектори на вірусній основі (наприклад, вектори на основі ААВ, вектори на основі ретровірусів, вектори на основі плазмид). У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеотидні послідовності, кодуючі відповідно білки 25 та ЕСЕ, можуть бути внесені до окремих векторів. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеотидні послідовності, кодуючі відповідно білки І25 і ЕСЕ, можуть бути внесені до одного й того ж вектору. Як правило, нуклеїнова кислота, кодуюча білок І25 або ЕСЕ, функціонально зв'язана з різними регуляторними послідовностями або елементами.

Регуляторні послідовності або елементи

Різні регуляторні послідовності або елементи можна включати в експресійний вектор, який підходить для цілей цього винаходу. Типові регуляторні послідовності або елементи включають, але не обмежуються цим, промотори, енхансери, репресори або суппресори, 5" нетрансльовані (або некодуючі) послідовностей, інтрони, 3" нетрансльовані (або некодуючі) послідовності.

За використання в цьому документі "промотор" або "промоторна послідовність" являє собою регуляторну область ДНК, здатну зв'язувати РНК полімеразу в клітині (наприклад, прямо або за допомогою інших зв'язаних з промотором білків або речовин) та ініціювати транскрипцію кодуючої послідовності. Промоторна послідовність в загальному випадку зв'язана з 3" кінцем за допомогою сайту ініціації транскрипції, тягнеться вгору (у напрямку 5") та містить мінімальну

Зо кількість основ або елементів, необхідних для ініціації транскрипції на будь-якому рівні.

Промотор може бути функціонально асоційованим або функціонально зв'язаним з послідовностями, керівниками експресією, включаючи енхансерні або репресорні послідовності, або з нуклеїновою кислотою, яка повинна експресуватися. У деяких варіантах реалізації винаходу промотор може бути індуцибельним. У деяких варіантах реалізації винаходу індуцибельний промотор може бути однонаправленим або двонаправленим. У деяких варіантах реалізації винаходу промотор може бути конститутивним промотором. У деяких варіантах реалізації винаходу промотор може бути гібридним промотором, в якому послідовність, що містить ділянку управління транскрипцією, отримана з одного джерела, а послідовність, що містить ділянку ініціації транскрипції, отримана з другого джерела. Системи для приєднання контрольних елементів до кодуючої послідовності в трансгені добре відомі в цій галузі техніки (загальні методи молекулярної біології та рекомбінантних ДНК описані в Затьгоок, Егії5си, апа

Мапіаїі5, МоїІесшціаг Сіопіпд: А І арогаїюгту Мапиаї, Зесопа Еайоп, Соїд 5ргіпд Натог І арогайгу

Рге55, Соій Зргіпд Нагрог, МУ, 1989, яка включена в цей документ в якості посилання).

Комерційні вектори, придатні для внесення трансгену для експресії в різних клітинах-господарях в різних умовах зростання та індукції, також добре відомі в цій галузі техніки.

У деяких варіантах реалізації винаходу для регулювання експресії трансгену в клітині- господарі ссавця можна застосовувати специфічний промотор, такий як, без обмежень, промотор 5Ка (ТакКкебе еї аї., Моїес. апа СеїІ. Віо. 8:466-472 (1988)), негайно-ранній промотор

СММ людини (Возпагі еї аї!., Сеї! 41:521-530 (1985); РоескКіпу єї аІ., Сепе 45:101-105 (1986)), промотор СММ людини, промотор СММУ5 людини, негайно-ранній промотор СММУ мишей, промотор ЕЕ1-а, гібридний промотор СММ для специфічної експресії в печінці (наприклад, отриманий шляхом кон'югації негайно-раннього промотору СММ з елементами транскрипцій промотору а-1-антитрипсину (НАТ) людини або промотору альбуміну (НА) людини) або промотори для специфічної експресії в гепатомі (наприклад, такі, в яких елементи транскрипцій промотору альбуміну людини (НАЇ; близько 1000 п.о.) або « -1-антитрипсину людини (НАТ, близько 2000 п.о.) з'єднані з енхансерним елементом а -1-мікроглобуліну людини завдовжки 145 і геном попередника бикуніну (АМВР); НАС-АМВР та НАТ-АМВР); рання область промотору

ЗУ40 (Вепоіві аї аї!., Майте 290:304-310 (1981)), негайно-ранній промотор Огдуїа рзецдоїзидаїа, промотор тимідинкінази герпесу (У/адпег аї аї!., Ргос. Маї)Ї. Асад. сі. ОБА 78:1441-1445 (1981)); бо або регуляторні послідовності гену металотионеїну (Вгіпвіег еї аЇ., Майшге 296:39-42 (1982)). У деяких варіантах реалізації винаходу промотор ссавця є конститутивним промотором, таким як, без обмежень, промотор гіпоксантин-фосфорибозилтрансферази (НРТК), промотор аденозиндеамінази, промотор піруваткінази, промотор бета-актину, а також інші конститутивні промотори, відомі фахівцям в цій галузі техніки.

У деяких варіантах реалізації винаходу для регулювання експресії трансгену в прокаріотичній клітині-осподарі можна застосовувати специфічний промотор, такий як, без обмежень, промотор р-лактамази (Мійа-Котагоїй еї аї!., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 75:3727-3731 (1978)); іас-промотор (ОевВоег еї аї!., Ргос. Май. Асад. бсі. ОБА 80:21-25 (1983)); промотор 17, промотор ТЗ, промотор М13 або промотор М16; у дріжджовій клітині-господарі можна застосовувати, без обмежень, промотор САЇ1, ЗА 4 або промотор СА 10, АОН-промотор (промотор алкогольдегідрогенази), РОК-промотор (промотор фосфогліцеролкінази), промотор алкалінфосфатази, промотор гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази ПШ (ТОНЗ), промотор гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази І (ТОН2г), опромотор гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази ЇЇ (ТОНІ), промотор оппіруваткінази (РМК), енолази (ЕМО) або триозофосфатдегідрогенази (ТРІ).

У деяких варіантах реалізації винаходу промотор може бути одним з вірусних промоторів, багато з яких здатні регулювати експресію трансгену в декількох типах клітин-господарів, включаючи клітини ссавців. Вірусні промотори, які виявилися здатними управляти конститутивною експресією кодуючих послідовностей в еукаріотичних клітинах, включають, наприклад, промотори вірусу мавп, промотори вірусу простого герпесу, промотори вірусу папіломи, аденовірусні промотори, промотори вірусу імунодефіциту людини (ВІЧ), промотори вірусу саркоми Рауса, промотори цитомегаловірусу (СММУ) та довгі кінцеві повтори (ДКП) вірусу мишачого лейкозу Молоні та інших ретровірусів, промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу, а також інші вірусні промотори, відомі фахівцям в цій галузі техніки.

У деяких варіантах реалізації винаходу генні регуляторні елементи експресійного вектору можуть також включати 5" нетранскрибуючі та 5" нетрансльовані послідовності, що беруть участь в ініціації відповідно транскрипції та трансляції, такі як ТАТА-бокс, кепируюча послідовність, послідовність СААТ, послідовність Козака і т. п. У деяких випадках можуть застосовуватися енхансерні елементи для підвищення рівнів експресії поліпептиду або білку.

Зо Приклади енхансерних елементів, які продемонстрували свою функціональність в клітинах ссавців, включають енхансер раннього гену 5М40, описаний у біїКкета еї аїІ., ЕМВО .. (1985) 4: 761, та енхансер/промотор, отриманий з довгого кінцевого повтору (ДКП) вірусу саркоми Раусу (ВСР), описаний у Согтап еї аї., Ргос. Майї). Асай. зЗсі. ОБА (19825) 79:6777, а також цитомегаловірус людини, описаний у Во5паг еї аї., СеїЇ (1985) 41:521. Генні регуляторні елементи експресійного вектору можуть також включати 3" нетранскрибуючі та 3" нетрансльовані послідовності, які беруть участь в термінації, відповідно, транскрипції та трансляції, такі як сигнал поліаденілування (полі А) для стабілізації та процесингу 3" кінця

МРНК, яка транскрибується з промотору. Полі А сигнали включають, наприклад, полі А сигнал бета-глобіну кролика, полі А сигнал бичачого гормону зростання, термінаторний/полі А сигнал бета-глобіну курчати або пізню полі А область 5МУ40.

Маркери, що селектуються

Експресійні вектори переважно, але необов'язково, містять щонайменше один маркер, що селектується. У деяких варіантах реалізації винаходу маркер, що селектується, являє собою нуклеотидну послідовність, кодуючу ген стійкості, функціонально зв'язану з одним або більше генетичних регуляторних елементів, що забезпечує можливість клітині-господареві зберігати життєздатність в умовах зростання у присутності цитотоксичних хімічних речовин та лікарських препаратів. У деяких варіантах реалізації винаходу агент, що селектується, можна застосовувати для утримання експресійного вектору всередині клітини-господаря. У деяких варіантах реалізації винаходу агент, що селектується, можна застосовувати для запобігання модифікації (тобто, метилування) та/або виключення трансгенної послідовності в експресійному векторі. У деяких варіантах реалізації винаходу агент, що селектується, застосовують для підтримки епісомної експресії вектору в клітині-господарі. У деяких варіантах реалізації винаходу агент, що селектується, застосовують для того, щоб забезпечити стабільну інтеграцію трансгенної послідовності в геном клітини-господаря. У деяких варіантах реалізації винаходу агент та/або ген стійкості може включати, без обмежень, метотрексат (МТУ), дигідрофолатредуктазу (ОНЕК, патенти США Мо 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампіцилін, неоміцин (5418), зеоміцин, мікофенолову кислоту або глутамінсинтетазу (55, патенти США Мо 5122464; 5770359; 5827739) для еукаріотичної клітини-господаря; тетрациклін, ампіцилін, канаміцин або хлорамфенікол для прокаріотичної клітини-господаря; та 60 ОВАЗ, І 62, НІЗЗ, І 52, НІБЗ4, АОЕ8, СОР або ТЕР для дріжджової клітини-господаря.

Експресійні вектори можуть бути трансфіковані, трансформовані та трансдуковані в клітину- господаря. Терміни "трансфекція", ""рансформація" та "трансдукція", які застосовуються в цьому документі, відносяться до внесення екзогенної нуклеотидної послідовності до клітини- господаря. У деяких варіантах реалізації винаходу експресійні вектори, що містять нуклеотидні послідовності, кодуючі І25 та/або ЕСЕ, трансфікують, трансформують та трансдукують в клітину-господаря одночасно. У деяких варіантах реалізації винаходу експресійні вектори, що містять нуклеотидні послідовності, кодуючі І25 та/або ЕСЕ, трансфікують, трансформують та трансдукують в клітину-господаря послідовно. Наприклад, спочатку можна трансфікувати, трансформувати або трансдукувати в клітину-господаря вектор, кодуючий білок І25, а потім трансфікувати, трансформувати або трансдукувати вектор, кодуючий білок ЕСЕ, та навпаки.

Приклади способів трансформації, трансфекції і трансдукції, які добре відомі в цій галузі техніки, включають ліпосомну доставку, тобто, метод Хоулі-Нельсона із застосуванням ліпофектаміну "м (сіосо ВКІ), Роси 15:73 (1193), електропорацію, спосіб доставки із застосуванням СаРо4

Грехема і Ван дер Еба, Мігоїоду, 52:456-457 (1978), опосередковану для ДЕАЕ-декстран- опосередковану доставку, мікроін'єкцію, біолістичну доставку часток, полібрен-опосредковану доставку, катіон-опосередковану ліпідну доставку, трансдукцію та інфікування вірусами, такими як, наприклад, ретровірус, лентивірус, аденовірус, адено-асоційований вірус та бакуловірус (у випадку клітин комах). Основні аспекти трансформацій клітин-господарів були описані в цій галузі техніки, наприклад у Ахеї! в патенті США Мо 4399216; Затргоок, зирга, розділи 1-4 та 16- 18; А!,зибеї, зирга, розділи 1, 9, 13, 15, і 16. Інформацію про різні способи трансформації клітин ссавців дивіться в Кеом/п еї аї.,, МеїШоа5 іп Еплутоїоду (1989), Кеом/п еї аї., Меїтоа5 іп

Епгуто!оду, 185:527-537 (1990), та Мапзоиг еї а!., Маїиге, 336:348-352 (1988).

Після внесення до клітин експресійні вектори можуть стабільно інтегруватися в геном або існувати у вигляді позахромосомних конструкцій. Також вектори можуть бути ампліфіковані, а їх множинні копії можуть існувати в клітині або інтегруватися в геном. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини згідно з винаходом можуть містити 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 або більше копій нуклеїнових кислот, кодуючих білок І25. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини згідно з винаходом можуть містити 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 або більше копій нуклеїнових кислот, кодуючих білок ЕОЕ. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини згідно з винаходом можуть містити множинні копії (наприклад, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 або більше) нуклеїнових кислот, кодуючих обидва білки, - І25 та БОБ.

Клітини-господарі

Термін "клітини-господарі", які використовуються в цьому документі, відноситься до клітин, які можна застосовувати для отримання рекомбінантного ферменту І25. Зокрема, клітини- господарі придатні для отримання рекомбінантного ферменту І25 у великих масштабах.

Придатні клітки-господарі можуть бути отримані з різних організмів, включаючи, але не обмежуючись цим, ссавців, рослини, птахів (наприклад, пташині системи), комах, дріжджі та бактерії. У деяких варіантах реалізації винаходу клітини-господарі є клітинами ссавців. У деяких варіантах реалізації винаходу придатна клітина-господар не є ендосомальною кислотно- дефіцитною клітиною.

Клітинні лінії ссавців

Відповідно до цього винаходу в якості клітини-господаря можна застосовувати будь-яку клітину або тип клітин ссавців, які можна культивувати і які можуть експресувати поліпептиди.

Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до цього винаходу, включають ембріональні клітини нирок людини 293 (НЕК293), клітини НеїГа; лінію мієломи мишей штаму ВАГ В/с (М5БО/Л, ЕСАСС Мо: 85110503); ретинобласти людини (РЕК.Сб (Сгисеїї,

Ї еідеп, Тпе Меїпепапа5)); ниркову лінію мавп СМ1, трансформовану 5М40 (С6О05-7, АТОС СВІ 1651); ембріональну ниркову лінію людини (клітини 293 або 293, субклоновані для вирощування в суспензійній культурі, Стгапйат еї аїЇ., У. еп Міго!І.,, 36:59 (1977)); клітини нирок новонародженого хом'яка (ВНК, АТСС СС 10); клітини яєчників китайського хом'яка яї7/-ОНЕВ (СНО, Опашь апа Спавіп, Ргос. Май. Асад. Зсі. О5А, 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (ТМА4,

Маїпег", Віо!. Вергоа., 23:243-251 (1980)); клітини нирок мавпи (СМ1 АТСС СС. 70); клітини нирок африканської зеленої мавпи (МЕКО-76, АТС СВІ-1 587); клітини карциноми шийки матки людини (Не а, АТСС СС 2); клітини нирок собаки (МОСК, АТСС СС. 34); клітини печінки сірого щура (ВК. ЗА, АТОС СК. 1442); клітини легенів людини (МУ138, АТСС СС. 75); клітини печінки людини (Нер 2, НВ 8065); пухлина молочної залози миші (ММТ 060562, АТОС СС 51); клітини

ТАВІ (Маїнег єї а!., АппаЇб5 М.У. Асай. 5сі., 383:44-68 (1982)); клітини МКС 5; клітини Е54; та лінію гепатоми людини (Нер 02). У деяких варіантах реалізації винаходу придатна клітина ссавця не є ендосомальною кислотно-дефіцитною клітиною. 60 Додатково, відповідно до цього винаходу можна застосовувати будь-яку кількість комерційно і некомерційно доступних гібридомних клітинних ліній, які експресують поліпептиди або білки.

Для фахівця в цій галузі техніки буде очевидне, що гібридомні клітинні лінії можуть вимагати різних умов живлення та/або можуть вимагати різних умов культивування для оптимального зростання та експресії поліпептиду або білку, і відповідно, він зможе за необхідності модифікувати ці умови.

Клітинні лінії, що не належать ссавцем

Відповідно до цього винаходу в якості клітини-господаря можна застосовувати будь-яку клітину або тип клітин, що не належать ссавцям, які можна культивувати і які можуть експресувати поліпептиди. Необмежуючі приклади клітин-господарів і клітинних ліній, що не належать ссавцями, які можна застосовувати відповідно до цього винаходу, включають клітини та клітинні лінії отримані з Ріспіа равіогі5, Ріспіа теїпапоїїса, Ріспіа апдива,

Ззспігозассспаготусез ротре, Засспаготусеб сегемізіає та Маїтом/а Іроїуїйса для дріжджів; зодоріега їидірегаа, Тгіспоріивзів пі, Огозорпійа теїапдоб5іег та Мапдиса зехіа для комах; та

Езспепісніа соїї, Заітопеїа їурпітигит, Васіїми5 5иБійв, Васійив Іспепітоппів, Васіеєегоїдез ігадіїв,

Сіовігідіа рептіпдепв, Сіовігідіа аїнісіе для бактерій; та Хепориз І аемі5 з амфібій.

Адаптація до адгезивного або суспензійного вирощування

У певних варіантах реалізації винаходу клітину-господаря для генерації клітинної лінії вибирають на підставі певних переважних характеристик або зростання в конкретних умовах, обраних для культивування клітин. Для фахівця в цій галузі техніки буде очевидне, що такі характеристики можна визначити на підставі відомих характеристик та/або ознак стійкої лінії (тобто, комерційно доступної клітинної лінії з відомими характеристиками) або шляхом емпіричної оцінки. У деяких варіантах реалізації винаходу клітинну лінію можна вибирати за її здатністю до зростання на живлячому шарі клітин. У деяких варіантах реалізації винаходу клітинну лінію можна вибирати за її здатністю до зростання в суспензії. У деяких варіантах реалізації винаходу клітинну лінію можна вибирати за її здатностю до росту у вигляді адгезивного моношару клітин. У деяких варіантах реалізації винаходу такі клітини можна застосовувати з будь-якою ємністю для тканинної культури або будь-якою ємністю, покритою придатним адгезійним субстратом. У деяких варіантах реалізації винаходу придатний адгезійний субстрат вибраний з групи, що складається з колагену (наприклад, колагену І, ЇЇ, ЇЇ

Зо або ІМ), желатину, фібронектину, ламініну, вітронектину, фібриногену, ВО Матрігеля ТМ, матриксу базальної мембрани, дерматансульфат протеоглікану, полі-О-лізину та/або їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації винаходу адгезивну клітину-господаря можна вибирати та модифікувати в певних умовах зростання для вирощування в суспензії. Такі способи модифікації адгезивної клітини для вирощування в суспензії відомі в цій галузі техніки.

Наприклад, клітину можна кондиціонувати для вирощування в суспензійній культурі шляхом поступового видалення тваринної сироватки з живильного середовища протягом певного часу.

Вибір та оцінка клітинної лінії

Відповідно до цього винаходу клітини, сконструйовані для експресії рекомбінантного білку

І25, вибирають за їх здатністю виробляти рекомбінантний білок І25 в комерційно прийнятному масштабі. Зокрема, сконструйовані клітини згідно з цим винаходом здатні виробляти рекомбінантний білок І25 на високому рівні та/"або з високою ферментативною активністю. У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини за культивування в умовах клітинного культивування (наприклад, в стандартних суспензійних або адгезивних умовах культивування у великих масштабах) можуть виробляти фермент 125 в кількості рівній або більшій ніж близько 5 пікограмів/клітину/день (наприклад, більшій, ніж близько 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 пікограмів/клітину/день). У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини за культивування в умовах клітинного культивування (наприклад, в стандартних суспензійних або адгезивних умовах культивування у великих масштабах) здатні виробляти фермент 125 в кількості, що знаходиться в діапазоні, який становить близько 5-100 пікограмів/клітину/день (наприклад, близько 5-90 пікограмів/ клітину/день, близько 5-80 пікограмів/ клітину/день, близько 5-70 пікограмів/клітину/день, близько 5-60 пікограмів/клітину/день, близько 5-50 пікограмів/клітину/день, близько 5-40 пікограмів/клітину/день, близько 5-30 пікограмів/клітину/день, близько 10-90 пікограмів/клітину/день, близько 10-80 пікограмів/клітину/день, близько 10-70 пікограмів/клітину/день, близько 10-60 пікограмів/клітину/день, близько 10-50 пікограмів/клітину/день, близько 10-40 пікограмів/клітину/день, близько 10-30 пікограмів/клітину/день, близько 20-90 пікограмів/клітину/день, близько 20-80 пікограмів/клітину/день, близько 20-70 пікограмів/клітину/день, близько 20-60 пікограмів/клітину/день, близько 20-50 пікограмів/клітину/день, близько 20-40 бо пікограмів/клітину/день, близько 20-30 пікограмів/клітину/день).

Як обговорювалося вищим, зазвичай на ферментативну активність 25 впливає посттрансляційна модифікація консервативного цистеїну (наприклад, амінокислоти 59) у формілгліцин. У загальному випадку ця посттрансляційна модифікація відбувається у ендоплазматичному ретикулумі під час синтезу білку та каталізує БОБ. Ферментативна активність 25 зазвичай позитивно корелює зі ступінню формілгліцинової модифікації 125.

Наприклад, препарат І25, що містить відносно велику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно високою специфічною ферментативною активністю; а препарат 125, що містить відносно невелику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно низькою специфічною ферментативною активністю.

Додатково передбачається, що співвідношення між білком 125 і ЕСЕ або мРНК також може впливати на формілгліцинову модифікацію отриманого рекомбінантного білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу 125 і БОБ, які експресуються у придатній клітині, характеризуються різними рівнями експресії білюу та мРНК. У деяких варіантах реалізації винаходу рівень експресії білка або мРНК І25 щонайменше у0,1,0,2,0,3,0,4,0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,1,0,1,5,2,0,2,5, 3,0, 3,5,4,0,4,5,5,0,5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8, 9 або 10 разів вище, ніж рівень білка або мРНК для БОБ. У деяких варіантах реалізації винаходу рівень експресії рекомбінантного білка або мРНК ЕСЕ щонайменше у0,1,0,2,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8, 9 або 10 разів вище, ніж рівень білка або мРНК для 125.

У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини за культивування в умовах клітинного культивування (наприклад, в стандартних суспензійних або адгезивних умовах культивування у великих масштабах) можуть виробляти білок І25, що містить щонайменше близько 50 95 (наприклад, щонайменше близько 55 95, 60 Фо, 65 У, 70 о, 75 Зо, 80 95, 85 Ус, 90 9, 95 Фо, 96 95, 97 Ус, 98 95, 99 95 або 100 95) залишків цистеїну, відповідних Су559 з БЕО ІЮ МОЛ, перетворених у Са-формілгліцин (ЕСІу). У деяких варіантах реалізації винаходу придатні клітини за культивування в умовах клітинного культивування (наприклад, в стандартних суспензійних або адгезивних умовах культивування у великих масштабах) можуть виробляти фермент І25, що містить щонайменше близько 50 95 (наприклад, щонайменше близько 55 95, 60 95, 65 95, 70 90, 75 90, 80 У, 85 95, 90 90, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 9, 99 95 або 100 95) залишків

Зо цистеїну, відповідних Суз59 з БЕО ІЮ МО:1, перетворених у Са-формілгліцин (ЕС1У), і в кількості рівній або більшій ніж близько 5 пікограмів/клітину/день (наприклад, більшій ніж близько 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 пікограмів/клітину/день).

Відсоток конверсії у ЕСІу

Для визначення відсотку конверсії у ЕСІу відомі та можуть бути застосовані різні способи. У загальному випадку відсоток конверсії у формилглицин (90ФГ) можна розрахувати, використовуючи наступну формулу: евФг(25)- Кількістеактивнихмолекуліг5 х100

Загальнакількістідактивних- неактивниу)молекуліг5

Наприклад, 5095 ФГ означає те, що половина очищеного рекомбінантного 125 ферментативно неактивна і не надає терапевтичного ефекту. Для розрахунку 90ФГ можна застосовувати різні способи. Наприклад, можна застосовувати пептидне картування. Коротко, білок І25 можна розщепнути на короткі пептиди за допомогою протеаз (наприклад, трипсину або хімотрипсину). Короткі пептиди можна розділити та отримати їх характеристики за допомогою хроматографії (наприклад, НРІ С) так, щоб можна було визначити природу та кількість кожного пептиду (зокрема, пептиду, до складу якого входить позиція, відповідна позиції 59 зрілого людського 125) порівняно з контролем (наприклад, білком І25 без конверсії у ЕСІу або білка І25 з 100 95 конверсією у ЕСІу). Можна визначити кількість пептидів, що містять ЕСіу (відповідну кількості активних молекул І25), і загальну кількість пептидів, що містять ЕсСіу ї Су5 (відповідну загальній кількості молекул І25), і розрахувати співвідношення, що відображає 95ФгГ.

Специфічна активність

Як обговорювалося вище, зазвичай на ферментативну активність /І25 впливає посттрансляційна модифікація консервативного цистеїну (наприклад, амінокислоти 59) у формілгліцин. Таким чином, ферментативна активність 25 зазвичай позитивно корелює зі ступінню формілгліцинової модифікації І25. Наприклад, препарат І25, що містить відносно велику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно високою специфічною ферментативною активністю; а препарат І25, що містить відносно невелику кількість формілгліцинових модифікацій, зазвичай характеризується відносно низькою специфічною ферментативною активністю.

Для фахівця в цій галузі техніки вочевидь, що ферментативну активність рекомбінантного білку І25, який виробляється клітинами згідно з цим винаходом, можна виміряти різними іп міго та іп мімо методами. У деяких варіантах реалізації винаходу виміряна за допомогою методу визначення іп мійго активності вивільнення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку І25 становить щонайменше близько 20 Е/мг, 30 Е/мг, 40 ЄЕ/мг, 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 ЄЕ/мг, 90

Е/мг або 100 Е/мг. У деяких варіантах реалізації винаходу виміряна за допомогою методу визначення іп міїго активності вивільнення сульфату з застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку 125 знаходиться в діапазоні, який становить близько 20-100 Е/мг (наприклад, близько 20-90 Е/мг, близько 20-80 Е/мг, близько 20-70 Е/мг, близько 20-60 Е/мг, близько 20-50 Е/мг, близько 20-40

Е/мг, близько 20-30 Е/мг, близько 30-100 Е/мг, близько 30-90 Е/мг, близько 30-80 Е/мг, близько 30-70 Е/мг, близько 30-60 Е/мг, близько 30-50 Е/мг, близько 30-40 Е/мг, близько 40-100 Е/мг, близько 40-90 Е/мг, близько 40-80 Е/мг, близько 40-70 Е/мг, близько 40-60 Е/мг, близько 40-50

Е/мг). Типові умови для проведення визначення іп міго активності вивільнення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду наведені нижче. Як правило, в цьому методі визначають здатність І25 вивільняти сульфат-іони з субстрату природного походження -- гепарин дисахариду. Кількість вивільненого сульфату можна визначити за допомогою іонної хроматографії. В деяких випадках іонна хроматографія включає використання детектору з провідності. В якості необмежуючого прикладу можна навести схему, в якій зразкам спочатку замінюють буфер на 10 мМ ацетату Ма, рН 6, для усунення пригнічення фосфат-іонами в буферній суміші. Потім зразки розводять до 0,075 мг/мл реакційним буфером (10 мМ ацетату

Ма, рН 4,4) та інкубують впродовж 2 г за 37(С з гепарин дисахаридом за співвідношення ферменту та субстрату, відповідному 0,3 мкг І25/100 мкг субстрату в 30 мкЛ реакційному об'ємі.

Потім реакцію зупиняють шляхом нагрівання зразків за 100(С впродовж З хв. Аналіз проводять, використовуючи аналітичну колонку Оіопех ІопРас А5БІ18 з передколонкою ІопРас Ас18.

Застосовують ізократичний метод з 30 мМ гідроксиду калію за 1,0 мЛ/хв впродовж 15 хвилин.

Кількість сульфату, вивільненого зразком 125, розраховують, використовуючи лінійно- регресійний аналіз сульфатних проб в діапазоні від 1,7 до 16,0 нмоль. Величину, що фіксується,

Зо виражають в одиницях на мг білку, де 1 одиниця відповідає 1 мкмолю сульфату, що вивільняється за годину, а концентрацію білку визначають за допомогою вимірів А280.

У деяких варіантах реалізації винаходу ферментативну активність рекомбінантного білку

І25, що виробляється клітинами згідно з цим винаходом, можна також визначити за допомогою багатьох інших способів, відомих у цій галузі техніки, таких як, наприклад, аналіз з 4-МОЕ, в якому оцінюють гідроліз 4-метилумбеліферил-сульфату на сульфат і природний флуоресцентний 4-метилумбеліферил (4-МОР). У деяких варіантах реалізації винаходу визначена за допомогою іп мійго аналізу з 4-МОЕ придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку І25 становить щонайменше близько 2 Е/мг, 4 Е/мг, 6 Е/мг, 8

Е/мг, 10 Е/мг, 12 Е/мг, 14 Е/мг, 16 Е/мг, 18 Е/мг або 20 Е/мг. У деяких варіантах реалізації винаходу визначена за допомогою іп міїго аналізу з 4-МОР придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку І25 знаходиться в діапазоні, що становить близько 0-50 Е/мг (наприклад, близько 0-40 Е/мг, близько 0-30 Е/мг, близько 0-20 Е/мг, близько 0-10 ЄЕЄ/мг, близько 2-50 Е/мг, близько 2-40 Е/мг, близько 2-30 Е/мг, близько 2-20 Е/мг, близько 2-10 Е/мг, близько 4- 50 Е/мг, близько 4-40 Е/мг, близько 4-30 Е/мг, близько 4-20 Е/мг, близько 4-10 Е/мг, близько 6-50

Е/мг, близько 6-40 Е/мг, близько 6-30 Е/мг, близько 6-20 Е/мг, близько 6-10 Е/мг). Типові умови для проведення іп міїго аналізу з 4-МОЕ наведені нижче. Як правило, за допомогою аналізу з 4-

МИР визначають здатність білку І25 здійснювати гідроліз 4-метилумбеліферил-сульфату (4-

МИБ-504) на сульфат та природний флуоресцентний 4-метилумбеліферил (4-МОЕ). Одна міліодиниця активності відповідає кількості ферменту, необхідного для перетворення одного наномолю 4-МОЕ-504 в 4-МИОЕ за одну хвилину за 37 "С. Як правило, згенеровані пробними зразками 125 з відомою активністю середні одиниці флуоресценції (СОФ) можна застосовувати для побудови стандартної кривої, яку можна використовувати для розрахунку ферментативної активності зразку, який представляє інтерес.

Середовища та умови для культивування клітин

Для отримання рекомбінантного білку І25 за допомогою сконструйованих клітин згідно з цим винаходом можна застосовувати різні середовища та умови для культивування клітин.

Наприклад, рекомбінантний білок І25 можна отримати в середовищі, що містить сироватку, або безсироватковому середовищі. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок

І25 отримують в безсироватковому середовищі. У деяких варіантах реалізації винаходу бо рекомбінантний білок І25 отримують в нетваринному середовищі, тобто, середовищі, в якому відсутні компоненти тваринного походження. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують в хімічно визначеному середовищі. Термін "хімічно визначене живильне середовище", який використовується в цьому документі, відноситься до середовища, практично всі хімічні компоненти якого відомі. У деяких варіантах реалізації винаходу хімічно визначене живильне середовище не містить компонентів тваринного походження, таких як сироватка, сироваткові білки (наприклад, альбумін або фетуїн) та інші компоненти. В деяких випадках хімічно визначене середовище містить один або більше білків (наприклад, білкові чинники зростання або цитокіни). У деяких випадках хімічно визначене живильне середовище містить один або більше білкового гідролізату. В інших випадках хімічно визначене живильне середовище є безбілюовим середовищем, тобто, безсироватковим середовищем, яке не містить білків, гідролізату або компонентів з невідомим складом.

У деяких варіантах реалізації винаходу хімічно визначене живильне середовище може бути доповнене одним або більше компонентами тваринного походження. Такі компоненти тваринного походження включають, але не обмежуються цим, фетальну телячу сироватку, кінську сироватку, козлину сироватку, ослячу сироватку, людську сироватку та сироваткові білки, такі як альбумін (наприклад, бичачий сироватковий альбумін або людський сироватковий альбумін).

Для отримання рекомбінантних білків І25 у великих масштабах можна застосовувати різні умови клітинного культивування, включаючи, але не обмежуючись цим, культивування в ролерних флаконах, періодичне культивування в біореакторах та культивування з підживленням в біореакторах. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують за допомогою клітин, які культивуються в суспензії. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують за допомогою адгезивних клітин.

Типові середовища для клітин та умови культивування описані в розділі Прикладів.

Додаткові типові способи та композиції для отримання рекомбінантного білку 125 описані в попередній заявці під назвою "Способи та композиції для отримання рекомбінантної ідуронат-2- сульфатази", поданої на реєстрацію одночасно з цим документом, повний зміст якої включений в цей документ в якості посилання.

Очищення білку І25, що експресується

Зо Для очищення або виділення білку І25, отриманого відповідно до різних описаних в цьому документі способів, можна застосовувати різні способи реалізації винаходу. У деяких варіантах реалізації винаходу білок І25, що експресується, секретується в середовищі та, отже, клітини та інші тверді частки можна видалити шляхом, наприклад, центрифугування або фільтрування на першому етапі процесу очищення. В альтернативному або додатковому варіанті білок І25, що експресується, зв'язаний з поверхнею клітини-господаря. У цьому варіанті реалізації винаходу з метою очищення клітин-господарів, що експресують поліпептид або білок, лізують. Лізис клітин- господарів ссавців можна здійснювати будь-яким з багаточисельних способів, добре відомих фахівцям в цій галузі техніки, включаючи фізичне руйнування за допомогою скляних гранул та створення умов з високим рівнем рн.

Білок І25 можна виділяти та очищати за допомогою стандартних способів, включаючи, але не обмежуючись цим, хроматографію (наприклад, іонообмінну, аффинну, ексклюзійну та гідроксиапатитову хроматографію), гель-фільтрацію, центрифугування або диференціальну розчинність, преципітацію етанолом або за допомогою будь-якого іншого доступного способу очищення білків (дивіться, наприклад, 5сорев, Ргоївіп Ригійсайоп Ргіпсіріе5 апа Ргасіїсе 2па

Еайоп, Зргіпдег-Мепіад, Мем Моїк, 1987; Ніддіп5», 5. у. апа Натевзв, В. 0. (едв.), Ргоїєїп Ехргезвіоп:

А Ргасіїса! Арргоаси, Охіога Опім Ргез5, 1999; апа ОецізсНег, М. Р., бітоп, М. І., Абе!івоп, у. М. (ед5.), Сіціде їо Ргоївіп Ригіїісайоп: Меїподе іп ЕпгутоЇоду (Меїподе іп ЕпгутоіЇоду Зегіев5, Мої 182), Асадетіс Ргез5, 1997, які всі включені в цей документ в якості посилання). Зокрема, в разі імуноаффинної хроматографії білок можна виділити шляхом зв'язування його з аффинною колонкою, що містить антитіла, які були отримані проти цього білку та зафіксовані на стаціонарній підкладці. В альтернативному варіанті за допомогою стандартних рекомбінантних способів до білюу можна приєднати аффинні мітки, такі як послідовність зовнішньої оболонки інфлуенції, полі-гістидин або глутатіон-5-трансферазу, для того, щоб полегшити очищення за пропускання через відповідну аффинну колонку. Для того, щоб понизити або виключити деградацію поліпептиду або білку під час процесу очищення на будь-якому його етапі можна додавати інгібітори протеаз, такі як фенілметилсульфоніл фторид (ФМСФ), леупептин або

Апротинін. Інгібітори протеаз особливо необхідні в разі лізувания клітин з метою виділення та очищення поліпептиду або білку, які експресуються.

Типові способи очищення описані в розділі Прикладів. Додаткові способи очищення описані бо в попередній заявці під назвою "Очищення рекомбінантного білку І25", поданої на реєстрацію одночасно з цим документом, повний зміст якої включений в цей документ в якості посилання.

Фармацевтична композиція та введення

Очищений рекомбінантний білок 25 можна вводити пацієнтові з синдромом Хантера відповідно до відомих способів. Наприклад, очищений рекомбінантний білок 25 може бути доставлений внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньом'язовим, парентеральним, трансдермальньїм або трансмукозальним (наприклад, оральним або назальним) шляхом.

У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом внутрішньовенного введення.

У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом інтратекального введення. Термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція", який використовується в цьому документі, відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можна застосовувати різні способи, включаючи, без обмежень, латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через отвір бору або цистернальну або поперекову пункцію і так далі. У деяких варіантах реалізації винаходу "інтратекальне введення" або "Інтратекальна доставка" згідно з цим винаходом відноситься до ІТ введення або доставки через поперекову область або ділянку, тобто, поперекового ІТ введення або доставки. Термін "поперекова область" або "поперекова ділянка", який використовується в цьому документі, відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями та, точніше, до І 2-51 ділянки хребта.

У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом підшкірного (тобто, під шкірний покрив) введення. В цьому випадку препарат можна інжектувти за допомогою шприца. При цьому доступні й інші пристрої для введення препарату, такі як пристрої для ін'єкції (наприклад, пристрої ІШУЕСТ-

ЕАБЗЕТМ і СЕМЖІЕСТТМ); ручки-ін'єктори (такі як сепРепТМ); безголкові пристрої (наприклад,

МеайшесіогТ М і Віоуесіог ТМ); та підшкірні системи доставки на основі пластиру.

У деяких варіантах реалізації винаходу можна застосовувати інтратекальне введення спільно з іншими способами введення (наприклад, внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньом'язовим, парентеральним, трансдермальньвмм або трансмукозальним (наприклад, оральним або назальним)).

Зо У цьому винаході передбачається як одноразове, так і багаторазове введення терапевтично ефективної кількості рекомбінантного І25 або фармацевтичної композиції, що його містить, описаного в цьому документі. Рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, можна вводити через регулярні інтервали залежно від природи, тяжкості та тривалості хворобливого стану суб'єкта (наприклад, лизосомній хвороби накопичення). У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, можна вводити періодично через регулярні інтервали (наприклад, раз на рік, раз на шість місяців, раз на п'ять місяців, раз на три місяці, кожні два місяці (раз на два місяці), щомісячно (раз на місяць), кожні два тижні (раз на два тижні), кожного тижня, щодня або постійно).

Рекомбінантний І25 або фармацевтичну композицію, що його містить, можна змішувати з фізіологічно прийнятним носієм або допоміжною речовиною для отримання фармацевтичної композиції. Носій та терапевтична речовина можуть бути стерильними. Препарат повинен відповідати способу введення.

Фармацевтично прийнятні придатні носії включають, але не обмежуються цим, сольові розчини (наприклад, Масі), фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, спирти, гліцерол, етанол, гуміарабік, рослинні олії, бензилові спирти, полієтиленгліколі, желатин, вуглеводи, такі як лактозу, амілозу або крохмаль, цукри, такі як маніт, цукрозу або інші, декстрозу, стеарат магнію, тальк, кремнієву кислоту, вазелін, парфумерну олію, ефіри жирних кислот, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон і т. п., а також їх комбінації. Фармацевтичні препарати за необхідності можна змішувати з допоміжними речовинами (наприклад, лубрикантами, консервантами, стабілізаторами, змочуючими агентами, емульсифікаторами, солями для зміни осмотичного тиску, буферами, фарбниками, ароматизаторами та/або ароматичними речовинами і т. п.), які не вступають в небажані реакції з активними компонентами або не впливають на їхню активність. У деяких варіантах реалізації винаходу застосовують водорозчинний носій, придатний для внутрішньовенного введення.

Композиція або лікарський препарат за необхідності може також містити невеликі кількості змочуючих та емульсуючих агентів або буферних агентів для зміни рН. Композиція може бути рідким розчином, суспензією, емульсією, пігулкою, пілюлею, капсулою, препаратом сповільненого вивільнення або порошком. Також композиція може бути виготовлена у вигляді суппозиторії з традиційними зв'язуючими речовинами і носіями, такими як тригліцериди. бо Препарат для перорального вживання може містити стандартні носії, такі як фармацевтичного ступеню чистоти маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, полівінілпіролідон, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію і так далі.

Композицію або лікарський препарат можна виготовити відповідно до стандартних процедур у вигляді фармацевтичної композиції, придатної для введення людям. Наприклад, в деяких варіантах реалізації винаходу композиція для внутрішньовенного введення зазвичай є розчином в стерильному ізотонічному водному буфері. За необхідності композиція також може містити розчинник та місцевий анестетик для зниження больових відчуттів в місці ін'єкції. У загальному випадку інгредієнти або додають окремо, або змішують разом в одиничній формі дозування, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично закритому контейнері, такому як ампула або пакет з вказівкою кількості активної речовини.

Якщо композиція призначена для інфузійного введення, її можна розвести в інфузійному флаконі, що містить стерильну фармацевтичного ступеню чистоти воду, сольовий розчин або декстрозу/воду. Якщо композиція призначена для ін'єкційного введення, до неї може додаватися ампула зі стерильною водою для ін'єкції або сольовим розчином так, що інгредієнти можна змішувати перед введенням.

Термін "терапевтично ефективна кількість"? який використовується в цьому документі, визначається, головним чином, на підставі загальної кількості терапевтичної речовини, що міститься у фармацевтичних композиціях згідно з цим винаходом. У загальному випадку терапевтично ефективної кількості вистачає, щоб досягти помітного позитивного ефекту для пацієнта (наприклад, лікування, модуляції, зцілення, запобігання та/або полегшення першопричинного захворювання або хворобливого стану). Наприклад, терапевтично ефективна кількість може бути кількістю, достатньою для досягнення необхідного терапевтичного та/або профілактичного ефекту, такого як кількість, достатня для модуляції лизосомних ферментних рецепторів або їх активності, яка призводить до лікування лизосомної хвороби накопичення або її симптомів (наприклад, зниженню або виключенню появи "пінистих клітин" або клітинної вакуолізації після введення суб'єктові композицій згідно з цим винаходом). У загальному випадку кількість терапевтичної речовини (тобто, рекомбінантного лизосомного фермента), що вводиться суб'єктові, яий потребує цього, залежить від характеристик суб'єкта. Такі характеристики включають хворобливий стан, тяжкість захворювання, загальний стан здоров'я,

Зо вік, стать і масу тіла суб'єкта. Для фахівця в цій галузі техніки не важко буде визначити відповідні дозування залежно від цих та інших чинників. Додатково, для визначення оптимальних діапазонів дозувань можна застосовувати як об'єктивний, так і суб'єктивний аналіз.

Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять в режимі дозування, який може включати множинне дозування. Терапевтично ефективна кількість (та/або відповідне одиничне

З5 дозування в межах ефективного режиму дозування) може варіюватися для кожного конкретного терапевтичного білку, наприклад, залежно від способу введення або від комбінування з іншими фармацевтичними речовинами. Також певна терапевтично ефективна кількість (та/або одиничне дозування) у випадку кожного конкретного пацієнта може залежати від безлічі чинників, включаючи порушення, лікування якого проводиться, і ступінь тяжкості цього порушення; активність певної фармацевтичної речовини, яка застосовується; певна композиція, яка застосовується; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і спосіб харчування пацієнта; час введення, спосіб введення та/або швидкість виведення або метаболізму певного злитого білку, що застосовується; тривалість лікування; і тому подібні чинники, які добре відомі в галузях техніки медицини.

Додаткові типові фармацевтичні композиції та способи введення описані в публікації згідно з

РСТ УМО2011/163649 під назвою "Способи і композиції для ЦНС доставки ідуронат-2- сульфатази" та попередній заявці Мо 61/618,638 під назвою "Підшкірне введення ідуронат-2- сульфатази", поданій на реєстрацію 30 березня 2012 р., повний зміст яких включений у цей документ в якості посилання.

Також слід розуміти, що у випадку кожного конкретного суб'єкта відповідні режими дозування мають бути з часом погоджені відповідно до індивідуальних вимог і професійної оцінки фахівця, який здійснює застосування або контролює застосування ферментозамісної терапії, а наведені в цьому документі діапазони дозувань є лише прикладами та не обмежують об'єму або практичної реалізації винаходу, який заявляється.

Приклади

Приклад 1. Генерація оптимізованої клітинної лінії, яка коекспресує рекомбінантні І25 та

ЕСЕ

В цьому прикладі проілюстрована типова оптимізована клітинна лінія, коекспресуюча рекомбінантні І25 та ЕСЕ, яку можна застосовувати для отримання рекомбінантного білку 125. бо Для фахівця в цій галузі техніки очевидно, що існує велика кількість альтернативних підходів,

експресійних векторів та способів клонування.

Типовою зрілою формою людського ферменту ідуронат-2-сульфатази (125) є 525- амінокислотний глікопротеїн, який для ферментативної активації піддається активному процесингу та посттрансляційній модифікації, такій як глікозилювання або конверсія цистеїну у формілгліцин (Фігура 1). У клітинах ссавців консервативні залишки цистеїну у ферменті 125 (тобто, в амінокислоті 59) перетворяться у формілгліцин за допомогою формілгліцин- утворюючого ферменту (ЕСЕ). Конверсія цистеїну у формілгліцин на активній ділянці ферменту

І25 є важливим етапом утворення активної форми людського ферменту сульфатази. Метою цього експерименту було створення оптимізованої клітинної лінії, коекспресуючої І25 та ЕСЕ, для отримання активного рекомбінантного І25.

На Фігурі 2 наведені типові конструкції для коекспресії І25 та ЕСЕ. Наприклад, експресійні одиниці 25 та ЕСЕ можуть знаходитися на окремих векторах, а окремі вектори можна трансфікувати спільно або окремо (Фігура 2А). В альтернативному варіанті експресійні одиниці (25 та ЕСЕ можуть міститися на одному й тому ж векторі (Фігура 2В). В одній конфігурації І25 та

ЕСЕ можуть міститися на одному й тому ж векторі, але регулюватися окремими промоторами, і називатися окремими цистронами (Фігура 28(1)). В альтернативному варіанті 25 та ЕСЕ можуть бути сконструйовані у вигляді транскрипційно зв'язаних цистронів, що означає, що І25 та ЕСЕ сконструйовані у вигляді відкритої рамки зчитування під управлінням одного промотору (Фігура 28(2)). Як правило, ділянка внутрішньої посадки рибосоми (ІКЕ5) сконструйована так, щоб зробити можливою кеп-незалежну ініціацію трансляції матричною РНК (Фігура 28(2)).

Людську клітинну лінію сконструювали для коекспресії людського білку І25 з амінокислотною послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮ МО:2, і людського формілгліцин-утворюючого ферменту (ЕСЕ) з амінокислотною послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮ МО:6.

ЗЕОІЮ МО: 2 » Повнорозмірний попередник ідуронат-2-сульфатази

МРРРАТаВаИат У СІ МІ 55УСМАЇ ЗЕТОАМЗТТ ВАМ ПМООГ А!АРБІЇ аСМОарКкІ МАЗРМІВО

ГАЗНОІ ГГ ГОМАРАОСАМСАРЗАУЗЕЇ ТавВАРОТТВІ МОЄМУ ВУНАСМЕЗТІРОМЕКЕМС МУ ТММ

СКМЕНРОІЗЗМНТОО5РУБМУЗЕРРУНРОЗЗЕКМЕМТКТОВОаРОСЕЇ НАМИ СРУМОМІ ОМРЕСТІ РОК

О5ТЕОАІОЇ І ЕКМКТЗАЗРЕБАМаМНКРНІРЕВУРКЕРОКІ УРІ ЕМІТ АРОРЕМРОСІ РРУАУМРУУ

Коо) МОІВОВЕОСМОАІ МІЗМРМаРІРМОРОВКІВОЗУГАБЗУБМІ ОТОМОНВІ І ЗА ОО ОЇ АМЗТАБТЗОоНа

МАЇ ЧЕНСЕУМАКУЗМЕОМАТНУР ІЕМУРСВТАБІ РЕАСЕКІ ЕРМІ ОРЕРОБАБОЇ МЕРОВОЗМОЇ МЕ

ЇМ5І ЕРТІ АГ АС ОМРРАСРУРЗЕНМЕЇ СВЕСКМ І КНЕВЕВОГЕЕОРМІ РЕМРАЕПАУБОМРАРБ

БІРОМ/МЗОКРБЇ КОІКІМСОМОІА ТОМ Ам ГММУМИагМРОЕНБ АМЕЗОІНАСЕЇ МЕМОБОРІ ОБНЯМУМО зОсаарі гОГІ МР

ЗЕО ІЮ МО:6

Повнорозмірний попередник людського ЕОБЕ:

МААРАЇ СІ МСЯАСРЕГИа М І БІ СпААлаБОєАдатадсАавзі лаЗСасСатТРОВРОАНИа5

ЗАААНАУЗАЕАМАРИРУРСЕНОЇ АНЗКМУРІРАСМЕТМаТООРОІКОВССЕАРАВАЕМТІСАЄУМОАУ

ЕМ5МТЕРЕКЕУМЗТОаМмІ ТЕАЕКРЯОЗЕМЕЕСМІ БЕОМКТМООАМАААРУЛМІ РУКИАМУУАВНРЕСРО

ЗПІНАРОНРМІ НУБУУМОАМАУСТУМАСКВАВІ РТЕАЕМЕУЗСВОИИІ НМА ЕРИ МКІ ОРКООНУАМІ

МОСЕЕРУТМТаЕрИаРОСТАРМОАЕРРМИамМаИаї УМІМаМАМУ ЕМ ТОМУ ТУННЗМУЕЕТІ МРКаРРЗа

КоОВУККОаЗУМСНАЗУСУВУВСААНЗОМТРОББЗАБМІ СЕВСААОВІ РТМО

Для генерації експресуючої І25 клітинної лінії клітини стабільно трансфікували кодон- оптимізованою нуклеотидною послідовністю (ЗЕО ОО МО. 7), що кодує білок І25 з амінокислотною послідовністю, наведеною у 5ЕО ІЮ МО:2, і нуклеотидной послідовністю (5ЕО

ІО МО. 8), що кодує людський фермент ЕСЕ, наведений у 5ЕО І МО. 6.

ЗЕО ІЮ МО: 7 » Кодон-оптимізована ідуронат-2-сульфатаза (105) Ното заріеп5, варіант транскрипту 1,

МРНК

АтасссссоеаосссесАсссаассасавасстастатаастасасстаатасталасдасСата тасатасссставаСдаСадаАсСсСАаасСсААСАасСАССАССЯАаСсассстаААсатастаста

АТСсСАТСЯТООСАСсСОлССТасСасоссАаасставастастАаСааСаАСААластаатасасСсАасссо

ААСАТСЧАССАаСсТтТОрОСОСсАасССАСсАХаасстастаТтосСАспААс,ессттассСАаасСсАааасСо,Та тасесссссадассасаталасттостадсссассасСассСсСОаАСАССАссСсасстатАСОАС ТТСсААСАОаСтТАСТОССОЯССсОСТасСсАсассавасСААСТТСАаСАССАТОССССАатАСТТСААДааАаА

АссастАсатаАСсСАтТадасатасасАааата САС аасСАТСАВСАаСААССАСАССИ

АСсОАСсАасСссСсСстТАСсАастаавдастоССССсСтТАССАССССАсСАасаАдаААдатАСаАаААСА

СсСААСАССТаССавсвасоссалссвсиасвАаастаСсАСсасСсАадсстастатассссатазАси,та стасвдсатассСаАааааСАсоСстасССаАСААдаСАаАдаСАССаАаСАааасССАТтоСсАс,СсТаст (510) саАдвбААаАдТадАаАсСА,аСсассаасоєттстаассатаасСтТАССАСААассссСАСАТ сооссттоСасСстАССССААдсСаАаТоСАсАдастатТАсССССтасАсаААСАТСАСССТОИОСССО сАсССсСсСсОСАСООТтасссаАссаостассоссСса,атааССстТАСААсСсСсСстТасАтТасвАСАТоСсассАС сабсАасаАасатасаааосстаААСАТтСсАа,аСЯатассстАСса,ааосССАТОСССССТасвАСТТСоСАС басСААДВАТтоСасСАсаАастТАСТттаССА,СстаАаСТАССтасвАСсАсСсСсАватасасСасста стадаСсасостапйАСаАсстасХастасССААСАаСАССАТСАТСОаССТТСАССАаСаАССАС састесасостасабвАдасАасса,ассАа,атадвасСсСААдаТтАСАаСААСТТОосАСсатааССАСССА са,атасссстТаАтотсотТАсстТассссасСбасАсСсасСА,состасссвАасасСа,асовАсААасСтТ ат осоСстТАсСсТавАССССТТСаАСАаа,аСсассаасСсАаастаатавсаа,асосавасСасСАсАасСАТ садостаатасаастастааасстаттососАассставссассостасоссасстасСАааватас ссссссаеастасссса,атассСАастссАссастасаластатасСсасавАаа,аааСААаААсСТа|астаА дасАстосасттсоСасадсСстасаасАааАСоССТАсСстТассСааСААссссСсассвАасСТаА тсасстТАСАааССАаТАсоооСсасссСАаСаАСАТСССССАСТасААсАдасСаАСААассСАаСс тТаАДаСАСАТСААСАТСАТОСасСстТАСАаСАТОСОаСАССАТСОСАСТАССОЯСТАСАССЯТОТОаСаИТ сааСТТСААССССаАСссА,аттоСсТаасССААСТТСАаСаАСАТССАСОЯССЯвВаСспсАастТатАСТТО ставАсАдасаАсоооСсТасСАасаАССАСААСАТИатТАСААСаАСАаССАссИ!СпсасаАсСстатто саа,астастаАТассстАС

ЗЕО ІЮ МО: 8 » Повнорозмірний попередник формілгліцин-утворюючого ферменту (ЕСЕ) Ното заріепв,

МРНК яатасстасассСбасАстаасастаатататасвсАаса,атассстала,аставатстатсстот тастастастастотосестастататаваа,аСсасСсАаа,аа,асАаоСАсвАсасс,аааАссаа,таСа сасасассасстоссттесасапсттесвестассасасассосадасаасстаСсаСССАТОС сАааттса,аасбАааССасТСАССаАТАСТОСОССОЯСООАасСастТААсастоса,асассєсєатТАсоСацвАСА сбааСААстсасСаСАСТСАААаАтТаатСССАтоСсСсТастасАаТАТТТАСААтТасасСАСАСАТ вАТССТСАСАТААДАдаСАсСадлтасапААаСАсстасадасАсАсаТтТАСТАТТОАТаССсСтТТТТАСАТ саАтТассТтАТИААаТСАаТААТАСТаААТТТаАаААаИттТатаААСТСААСТасасСТтТАТТТаАСАСА састаАдаАдАдатт,аасаАстстта|атстттаААлдааСАтТаттадатаАаСААаТаААсСАССААТА тТСсААСАСОасСАааттасаастастоссєстаатааТтТАССтТатаАААс,ааСастТААСтТасАсаАСАСоСо

АаААлсаасстаАСТСТАСТАТТСТасСсАСАСИЯСсСацаАТСАТОСАСТТСТоСАТИаТатоСтТасААТО

Зо АатассатассСстТАСстТасАСсттасасАа,вавАл,аСсаСтассСАСацпААла,асСтаАадатаааААТАСА сстатосАдсаАдаассСстТасСАТААТАЧАСТІ ІПОоСсОоСстТасааСААСАААСтТаТасСсАаСССАААцассСА

ССАТТАТаССААСАТ ТаССАСсОваСса,аАаатттоСааТаАССААСАСТОСТОАа,ааАТааСТТОСАА саААсТасасстаттаАдТасстСсССТоССААТаСТТАТайаСТтТАТАСААСАТАСаТИасСаААСс

САТаСОаААТИаСАСТТСсАСАСТОСТтТасАСТаТтСАТСАТТСТаТтТтаААСАААСасТтТААСССААдДАА сатосоостстаайпАААаАССаАаТаААпАААлс,а ТапАТОСтТАСАТатассСАТАааТтсТТАТТ сТТАСАСОСтТАТССОСТИа ТОСТОСТоСО,аАдаССАпСААСАСАССТОаАТАаСстотТастІсСаААТСТОСИ

АтПосастатасда,асСаАссасстассССАССАТИСАСТОаА

Обидві нуклеотидні послідовності, які кодують І25 та ЕСЕ, регулюються промотором СММ людини. Трансляція І25 мРНК призводить до синтезу 550-амінокислотного повнорозмірного білку І25 (5ЕО ІЮО МО:2), що містить 25-амінокислотний сигнальний пептид. Сигнальний пептид видаляється, та розчинний фермент секретується з клітини.

Кодуючу послідовність неоміцин фосфотрансферази (песо) бактерій та/або ген бластидицин 5 деамінази (850) застосовували для того, щоб зробити можливою селекцію трансфікованих клітин, застосовуючи аналог неоміцину (5418 і бластидицин, відповідно. Додатково, застосовували ген мишачої дигідрофолатредуктази (ОНЕЕК) в І25- та/або ЕСЕ-кодуючому(их) векторі(ах) для того, щоб зробити можливим виділення клітинних ліній, що містять підвищену кількість копій 125- та/або РОЕ-кодуючих послідовностей за допомогою селекції з використанням метотрексату (МТУ).

Клітини, які виробляють І25, виділяли та проводили відбір за чутливістю до лікарського препарату для того, щоб виділити клітини з підвищеною кількістю копій трансфікованих генів І25 та/або ЕСЕ. Кількісний аналіз І25 проводили за допомогою ЕГІЗА.

Клітинну популяцію також піддавали процедурі покрокового відбору в метотрексаті (МТХ) для того, щоб виділити клітини з підвищеним виробленням 125. Вироблення І25 відстежували під час селекції із застосуванням МТХ за допомогою ЕГ ІЗА.

Після декількох циклів культивування декілька виробляючих 125 клонів піддавали суспензійній адаптації в безсироватковому середовищі з покроковим зниженням від ОМЕМ, що містить 1095 телячу сироватку, до безсироваткового хімічно визначеного середовища. За клонування способом серійного розведення було отримано декілька окремих популяцій клонів.

Колонії відбирали за результатами аналізу ферментативної активності 125 і ЕГ І5А. Дві стабільні бо клітинні лінії 20 ї 40 демонстрували високий відсоток виживання та підвищену експресію 125 і були відібрані для додаткового дослідження.

Приклад 2. Оцінка стабільних клітинних ліній, які коекспресують рекомбінантні І25 та ЕСЕ

Проводили додаткові експерименти для отримання характеристик двох клітинних ліній 20 і 4р, які коекспресують 125 та ЕСБЕ.

Специфічна активність

Спочатку оцінювали специфічну активність ферменту І25. Аналіз специфічної активності ферменту І25, що виробляється клітинними лініями 20 і 40, проводили за допомогою флуоресцентного аналізу з 4-МОР. Коротко, в цьому аналізі оцінюють гідроліз субстрату І25 - 4- метилумбеліферил-сульфату (4-МОБ-504). Після розщеплювання субстрату 4-МОР-504 125 молекула перетвориться в сульфат та природний флуоресцентний 4-метилумбеліферил (4-

МИР). В результаті ферментативну активність І25 можна визначити, оцінюючи загальну зміну флуоресцентного сигналу з часом. У цьому експерименті очищений білок І25, отриманий з людських клітинних ліній І25-АЕ 20 і 40, інкубували з розчином 4-метилумбеліферил-сульфату (4А-МОБ-5054), сіллю калію, Зідта Саї. Ж М-7133). Калібрування в поданому аналізі проводили, застосовуючи групи контрольних зразків, що містять комерційно доступний фермент 125, розведений в матковому розчині у співвідношенні 1:100, 1:200 ї 1:20000. Ферментний аналіз проводили за 37 "С за допомогою відкаліброваного флуорометру. Застосовуючи значення флуоресценції, отримані для кожного еталонного зразка, відсотковий коефіцієнт варіації визначали за допомогою наступного виразу:

Стандартневідхиленнявихідногозначення флуоресце щії (М - З «Кв дартневід д флуоресценщ (М-8), Стос,

Середнєзначення флуоресцежщії

Потім відсоткові значення КВ застосовували для розрахунку скоректованої середньої флуоресценції для кожного зразка для того, щоб визначити реєстровану ферментативну активність, виражену в мЕ/мл, за допомогою наступної формули: мМЕ/МЛ- (СЕ Інмоль/ї. 1Лл 21А1мЛ у год 1МЕ (кг) 10ЕФ 10Змл/ 001мл Х бохв Х нмоль

СЕФ - негативна скоректована середня флуоресценція

Зо КР - кратність розведення

Одна міліодиниця активності відповідає кількості ферменту, необхідного для перетворення одного наномоля 4-метилумбеліферил-сульфату в 4-метилумбеліферил за одну хвилину за 37 76.

Відсоток конверсії у формілгліцин

Для визначення відсотка ЕСіу-конверсії можна застосовувати пептидне картирування. Для активації І25 необхідна конверсія цистеїну (відповідного позиції 59 зрілого людського 125) у формілгліцин за допомогою формілгліцин-утворюючого ферменту (ЕСЕ), як показано нижче: (НО її - Ко

НВ Оз М ! форкмиільлини Ї

ХкхХххесувххкикохкхАРа ххх спи ЖхххХХ Су хкхетокухАтухххкхх (ел (Дів) утворюючий фермент (Ав

Отже, відсоток конверсії у формілгліцин (96ФГ) можна розрахувати, використовуючи наступну формулу:

Кількістеактивнихмолекуліг еофФГ(25)-- ількістактивнихмолекуліб //ссу100

Загальнакількістідктивних- неактивниухмолекуліг5

Наприклад, 5095 ФГ означає те, що половина очищеного рекомбінантного 125 ферментативно неактивна та не надає терапевтичного ефекту.

Для розрахунку 96ФГ застосовували пептидне картування. Коротко, рекомбінантний білок

І25 розщеплювали на короткі пептиди за допомогою протеаз (наприклад, трипсину або хімотрипсину). Короткі пептиди розділяли та отримували їхні характеристики за допомогою

НРІ С. Пептид, до складу якого входить позиція, відповідна позиції 59 зрілого людського 125,

вибирали, щоб визначити, чи був Суб у позиції 59 перетворений у ЕСІу, в порівнянні з контролем (наприклад, білком І25 без конверсії у ЕСіІу або білком І25 з 100 95 конверсією у

ЕСІУ). На підставі відповідних пікових площ можна визначити кількість пептидів, що містять ЕСІу (відповідну кількості активних молекул І25), та загальну кількість пептидів, що містять ЕСІу та

Суз (відповідну загальній кількості молекул 125), і розрахувати співвідношення, що відображає 95ФГ.

Кореляція між відсотком конверсії у ЕСІу та специфічною активністю

Типова кореляція між відсотком конверсії у Су та специфічною активністю проілюстрована на Фігурі 3. Як видно, дані показують, що більш високий відсоток конверсії у ЕСІу призводить до більш високої ферментативної активності І25.

Карта гліканів

Проводили визначення композиції гліканів рекомбінантного білку 25, що виробляється клітинними лініями 20 і 40. Кількісну оцінку композиції гліканів проводили за допомогою аніонообмінної хроматографії. Як описано нижче, карта гліканів рекомбінантного І25, отримана в цих умовах, складається з семи пікових груп, які елююються відповідно до зростання кількості негативних зарядів, щонайменше частково належать глікоформам сиалової кислоти та манозо- б-фосфату, отриманих в результаті ферментного розщеплювання. Коротко, очищений рекомбінантний 125, отриманий за застосування безсироваткового способу клітинного культивування (безсироваткова І25-АЕ 20 та безсироваткова І25-АЕ 40), та контрольний рекомбінантний І25 обробляли (1) очищеним ферментом нейрамінідазою (виділеною з

Агіпгобасіег Огеагасієп5 (10 мЕ/мклЛ), Коспе Віоспетісаї (Індіанаполіс, Індіана), Саї. Ж 269 611 (1

ЕЛО0 мкЛ)) для видалення залишків сиалової кислоти, (2) алкалінфосфатазою впродовж 2 годин за 3751 "С для повного вивільнення залишків манозо-6-фосфату, (3) алкалінфосфатазою я- нейрамінідазою або (4) не проводили обробку. Кожне ферментативне розщеплювання аналізували за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з імпульсним амперометричним детектуванням (НРАЕ-РАБ), використовуючи аналітичну колонку СагроРас

РА1 АпаїуйсаІ Соїштп з передколонкою Оіопех СагтбоРас РАї. У кожному аналізі використовували еталонні групи сиалової кислоти та манозо-6-фосфату в діапазоні, що становить від 0,4 до 2,0 нмоль. Застосовували ізократичний спосіб із застосуванням 48 мМ

Зо ацетату натрію в 100 мМ гідроксиду натрію протягом як мінімум 15 хвилин за швидкості потоку 1,0 мЛ/хв за зовнішньої температури колонки для елюювання кожного піку. Дані, отримані для кожного окремого етапу для зразків І25-АЕ та контрольного І25, об'єднували на одній хроматограмі, щоб отримати карту гліканів для кожного відповідного рекомбінантного білку. Як проілюстровано на Фігурі 4, на типовій карті гліканів для І25, що виробляється клітинними лініями 20 і 40, представлені типові елюційні піки (в порядку елюювання), відповідні нейтральним, моно-, дисиальованим, монофосфорильованим, трисиальованим та гібридним (моносиальованим та кепованому манозо-б-фосфату), тетрасиальованим та гібридним (дисиальованим та кепованому манозо-6-фосфату) та дифосфорильованим гліканам.

Приклад 3. Безсироваткове суспензійне клітинне культивування

Цей приклад демонструє те, що можна розробити спосіб безсироваткового суспензійного культивування у великих масштабах для культивування оптимізованої клітинної лінії для отримання рекомбінантного 125.

Система для безсироваткового суспензійного культивування

Коротко, культуру для посіву отримували, застосовуючи клітинну лінію 20 або 40 з

Прикладу 1. Клітини переносили в 250 мл качалку для тканинного культивування, що містить безсироваткове хімічно визначене середовище для розмноження із додаванням МТХ для селекції, доводили бікарбонатом натрію до рН 7,3 і вирощували за 37(С за 5 95 202 впродовж декількох днів. Коли культура досягала достатньої клітинної щільності та життєздатності, вихідну культуру для посіву використовували для інокуляції першої групи для поетапної експансії клітинної культури в 500 мл качалках для тканинного культивування, а потім - в 1 Л качалках для тканинного культивування.

Експансію періодичної культури проводили шляхом перенесення кожної з 1 Л культуру ЛО Л

СепПрад Біогеасіоге (Ууаме Еигоре) та додавання середовища для експансії. Після досягнення достатньої клітинної щільності додавали нове середовище для експансії та вирощували клітини до достатньої щільності. 10 Л СеїЇрад переносили в систему Умаме Біогеасіог (М/аме Еигоре) та модифікували умови культивування, щоб забезпечити можливість зростання за безперервної перфузії середовища. Проводили доставку середовища для зростання та експансії, а зразки збирали для аналізу рн, глутаміну, глутамату, глюкози, амонію, лактату, рСО2 та осмолярності у відсутності метаболитів. бо Після досягнення достатньої клітинної щільності всю 10 Л клітинну культуру переносили у 50

Л М/аме СеїБрад бБіогеасіог?, що містить свіже середовище для експансії, та вирощували до достатньої щільності, використовуючи систему Уламе Бріогеасіого).

Потім проводили експансію клітин, використовуючи 200 Л одноразовий біореактор та центрифужний перфузійний пристрій (Сепішесиеф СЕ І цпії, Рпештаїййс 5саІе Согрогайоп), який було сконструйовано для концентрації клітин та очищення середовища для повторного циклу під час перфузійно-опосередкованого клітинного культивування. Середовище для експансії (доведене до рН 7,10) інокулювали частиною 50 Л культури та вирощували до достатньої клітинної щільності.

Далі частину 200 Л культури використовували для посіву у 2000 Л одноразовий біореактор та центрифужний перфузійний пристрій (Сепішесне СЕ | ІІ цпії, Рпештаїйіс Зсаіе Согрогайоп) в середовище для серійного виробництва (доведену до рН 7,20). Клітини вирощували в умовах для періодичного зростання. Після двох днів вирощування умови коректували з урахуванням безперервної перфузії до досягнення перехідної фази. Клітини вирощували в умовах для перфузійного зростання впродовж 24-годинної перехідної фази.

Для виробничої фази використовували два юніти Сепішесп СЕ І. Виробничу фазу починали приблизно через 24 години після початку перехідної фази та продовжували впродовж необхідного періоду часу, регулюючи швидкість течії.

Хоча певні компоненти, композиції та способи, вказані в цьому документі, були описані відповідно до конкретних варіантів реалізації винаходу, подані приклади слугують виключно для ілюстрації компонентів винаходу та не обмежують його.

Однина за вживання в цьому документі в описі винаходу та у формулі винаходу, якщо чітко не вказане інше, має на увазі також множинні об'єкти. Пункти формули винаходу або опису, які містять "або" між одним або більше членів групи, вважаються задовільними, якщо один, більше ніж один або всі члени групи присутні, задіяні або будь-яким іншим способом пов'язані з цим продуктом або процесом, якщо не вказане зворотнє або інше не очевидне із контексту. Винахід включає варіанти реалізації, в яких лише один член з групи присутній, задіяний або будь-яким іншим способом пов'язаний з цим продуктом або процесом. Винахід також включає варіанти реалізації, в яких більше за один або всі члени групи присутні, задіяні або будь-яким іншим способом пов'язані з цим продуктом або процесом. Крім того, варто розуміти, що винахід

Ко) включає в себе всі варіації, комбінації та перестановки, в яких один або більше обмежень, елементів, пунктів, описових термінів і так далі з одного або більше перерахованих пунктів формули винаходу вставлені в інший пункт, залежний від того ж основного пункту (або, залежно від змісту, від будь-якого іншого пункту), якщо не вказане інше або якщо для фахівця в цій галузі техніки очевидно, що може виникнути суперечність або неузгодженість. Там, де елементи представлені у вигляді списку (наприклад, у вигляді групи Маркуша або в подібному форматі), варто розуміти, що кожна підгрупа елементів також розкривається, а будь-який(ї) елемент(и) можна видалити з групи. Слід розуміти, що, в загальному випадку, там, де йдеться про те, що винахід або аспекти винаходу містить/містять конкретні елементи, ознаки і так далі, певні варіанти реалізації винаходу або аспекти винаходу складаються або переважно складаються з таких елементів, ознак і так далі. Для спрощення в цьому документі такі варіанти реалізації винаходу не були окремо детально описані в кожному з випадків. Також слід розуміти, що будь- який варіант реалізації або аспект винаходу може бути повністю виключений з формули винаходу незалежно від того, присутнє це конкретне виключення в описі винаходу чи ні.

Публікації, вебсайти та інші довідкові матеріали, що згадуються в цьому документі для опису рівня техніки винаходу і додаткових подробиць стосовно його практичної реалізації, включені в цей документ в якості посилання.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«Іо». Воідов, Ретепс

Недпшієт, МІКе Й «1202 КЛІТИНИ ДЛЯ ОТРИМАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГІДУРОНАТ-2-СУЛЬФАТАЗИ «130 ЗО06ББВ50340 «150» 61/866,719 «151» 20120820 «180» 8 «170 Ратепна версія 3.5 «ЦІ 1 «211» 525 «212» Білок «ВІЗ» Нотво зарієте «00» 1 бек Спи Тк дів Аа Аби бек ГГ Те Ар. Аа реч яп Мі Ееи беп І ! 5 юю 15

Не Ше Уа! Ар Аврі го Ате Рго бег Бей Су Су Тук Оу Авр Гук жу За

Ге Узі Аге бет Рго Ап Це Ар Сів Сей Ав обег Ні Бек Бео бен з4а 45

Ре Сп Акп Аа Ріє Аза бів Сп Аїв Уві Сув Аа го бег Ате Уа ко 55 і;

Бег рве Гео Тве слу Ате Атв Ро Ар ТвВг Пи Ат ви Туг Авр РНе 53 7 75 80

Авиа бек ТУ Ттв Ате Уа іпе Ав Су Аква Ра Бсг ТЕН Пе Ро сні 85 90 "95 7 "Тук Ре їв Ов Ав СЇу Тук Ма! Те Меєзег Уа Оу Був Ма Ре 100 105 По

Нів Ре Су. Пе бег Зег Аа Ні Твголяр Авр бот Рго Тує бег Тер

Ту 120 125

Зо зе Рпе Рго Рго Гук Ні Рго зех Зв Сій бух Тут ОТО Ав Тв гук 130 135 140

ТнеСув Аг у Рто Ар СПУ Ов ев Ні Ан Авп ГИ Ген Сук Ріо 145 1250 155 1650

У8і Акр Узі Ге Ар маркою Сів Сіу Ті гбв Рго яр бух Со бе 165 по 175

Тнебіп (ів Аа Не Сіл Гев Бе Сів губ Ме! Гуз ТВ бег Аа Вот 150 1855 о

Рто Ре Ре без Ав Уві СІуУ Тут Бе Бук Рго Нія Пе Рто РаЄ Аг 195 20 205

ТугРга Бу Сім Рпє Сів Був Бей Тут Рго Гей бій Або Не тн Гев «о 215 220

Аа Рто Ако Рто Си Маі Рто А5р Оу Гей Ро Рто Уві Ада Тут ва 230 235 240

Рго Тер. Ме Ар Пе Аге Сп. Агеости Авр Уві Сій Ада ем Ав Пе 244 250 255

Бег Уві Рго Туг Су Ріо Пе Рго Ма! Авро Ре Сп Аг Су Пе Ате 2 265 20

Спо бег Тут Ре Аа бет Уві Бе Тут Сеи Авр к бій Ма сту Ате 275. 28 Ва ев Гео Бех Аіз Гени Ар Авр Твої бій Се Ада Ави ет Ту Пе Пе 29 293 Зю

Аа Ре Тпг бег Ар. Нів Су Ттр Аа Ден Сп у Сяю Піх СУ Ов Тр 305 зо У 320

Аа ув Тут Бех яп Ріе Ахр; Уа! Аа Тго Пів Уа Рго Бен Пе Ре 325 330 335

Гук Уаї Рго Су Аге Тв Ав бег Сеи Рго Сі Ада Су Сб Суб Бей

340 345 350

Рпе Рез Туг Геи Ар Рео РНе Ар бех Ав Яе бій Без Месбім Ро 355 З6О 365

СТУ Ате Сів бег Ме Ар Ге Маг Ой Ген Уві Хег Те Ре Ро Ті

Б 375 380

Гео АВ Оу бен АБУ Сени сій Мві Ра Рг Ате Сув Рго Уді Рго 355 390 395 400 бег ве Ні Узі СЯй Ген Суб Аге Сів Су їде Або Сей Пем Сук Вих 405 мо 415

Рне Ате Ре Ага Аврге СПИ ОБ Авр Рго Тут Бей Ро Ну Ав Ро 420 425 430

Атв Сни Гей Не Ада Тут Бе ОТ Тут Рго Ате Рго ет Авр Не Рго 440 445

Сп Ттр Авй зег Ахр Був Рто Зег Бен Бу Ар Пе був Пе Ме спу 450 455 460

ТукЗег Пе Ато Тім ІВ Аяр Тут Ат Тує Те Маї Ттр Маг бір рве 465 470 474 480

Ав Рго Ар Сім Ре Ге Аа Ап Ре Зет Авр Не Нів Аа Су С 485 490 495

Гео Тує Рве Ма) АкробЗет Авр Рго Сем Сп Авр Ні Ап Меї Тут Ав

ЗО 505 ЗІ

Авр зег Си СПУ Су Авр Гео Ре СЯ ев бен Меї Рго хіх 520 525 «ЛО «211 350 «10 Білок «213» Ното варієне «й» 2

Месвга Рго Рго Аге Твг біу Аге Сх Геи бео Тер бен Сіу Ден Мав

І 5 10 15

Ген зе сег Уа! Суб Ма! Аа еп С1у Бек Си Твг ОП АІЯ Ав вет 20 25 30.

ТВ Тве Ар Аа Ген Аби Маре Сен Пе Не Ма АвроАвзр ен 35 40 45

Ріо зе ев су Суб Буг СПУ. Ахр Бу еп Уаї Атр, бег Рго Ап Не 50 55 0 дер сп ей Аа вет Ні зе Це Ген Ре Св Аби Аа Ре Аа Ой 05 70 75 ВО

Сів Ах Уа! Сує АВ Ріо 5ег Ат Уа! сег РБєЄ Гео Ту СУ Ага Ат 85 ФО 95

РгоАвр тт ТВ Ате Тец Тут АвроРЄ Ав бет ТуУї Тер Аге Ма! Нів 100 ох о

Ав су Авп РБе Бест Неорго бій Тух Ре ев Сн деп біу Тут

З 2О 155

Уа! Ті Мер бег Уа сте Був Уві Рпе Нів Рго Су Це бет Бе? Дей 130 135 140

НІ Тит Акр Аврозет Рго Гут зег Ітр бек Рпе Ргосрго Гук Ніє Рто: 145 159 155 160 аг баг бі був Тук Сн Ав Те Був ТВ Сук Атв Су Ро Ар Су 165 170 не:

СП Гео Ні Аза Ач бен Гео Сук Ро Уві Ар Узі Геи Ар Мі Ро 1855 150

Сі Сіх Твг бен Рго Авр Суб Стій беу ТВт Сі Ов Аза Не Сіп Гей 195 200 205

Геш ой Гуз Меї Гуз Тв бек Аїе Вест Ро Рбе Ріє Бен Аа Уві О1У. мо 215 20

Туг Ніх Бук Ріо Ніх Пе Рго Рпе Атв. Тут Рго Тв Сів Рнє Сп Гук 295 230 25 240

Гев Тут РІО Бебі Лев Це Тр Сез Аа Рго Ар Рго Си Уа Рго 245 250 255

Ар ОУ Сен Рго Рго Маї Ай Тут Авп Рго (тр Ме Авр Пеодте Сів 260 265 270

Ате СЯ Ахр Уа О1а Аа тей АБ Це Зег Уві Бгто Туг Су Рг Це о гай 285

Рго Уа! Акр.РВе ія Атр Гу Пе Атр Сі зег Гук Рре Ада бег Ма 29 ОВ І

Заг Тук Мей Ахротвг На МагсИу Ат бен бе ет Аа Ге Ар Авр 305 з ЗІ5 320

Бе бів ев Аза лепозет ТВ Пебе Аа Раествг вет Ар Ні Ту

ЗА 330 335

Тер Аїа без СПУ бін Ніх Сіу Си Тер Лів бух Туг Зег Ази Рене Авр 340 345 350

Уа АТ Ні Уа Рго Гео Це Рпе Туга Рго Суб Ате Те Ав 335 360 355

Зег Пеп Ро Си Айа СТУ СТй Бу Пен Рре Рго Тут їей АврРго Ре 370 315 ЗВО

Авр бег Аза бек Сіп бен Ме Сім Рго біу Аге Сів ет Ме Ар Цей

ЗКУ з90 395 400

Уа! Стй ен Уві бек Беч Ре Рто Твг Геп Айв СТУ Ген Аа Су Ге 405 дю 5

Сип уві Рго Рго Аге Суво Рго Уві Рго зег Ре Нік Уві бі Ген Сук 420 42 430

Ат ои СТУ бує Ав Сев Сем Гу Ніх Ріє Аг РЕЄ Ате Ар ен СТ 435 440 445 сш Авр Ро Туг беи Рго біу ло Рго Ак См Гео Ше Ада Туг5ет

АБО 455 460 су Бут Ріо Ате Рго-бет Ар Не Рго бів Тр Аа Бе Ар Був Рго 465 НИ 475 450

Бек ен укр Пе Бех Пе Ме Оу тує ее Пе Ате Тве Пе Ар 485 490 495

ТугАте Тут ТНг Уа! Тер Ма! С1У Ріє Ав Его. Ар Си Рпє Ген Аа

З00 Ох хо

Авв Ре ет АЛкр Пе Нів Ада Сіу СТИ ви ТУ РВЕ Маї Абр бег Ар

І 320 525

Рго ев Ов Ар Ні Ака Ме Тут Аби Авр ет ОТ СПУ СТУ Ляр ей 530 535 540

Ре біп бен Бей Ме рт 545 30 «Нв 3 «2» 12 «гій» Вілок «213» Ното варієп «Ох З

Мегего-Рго Рго Аг Ті СЯ у Ате Су Бен Гев Тгр.Цеи СТУ Гео Ма і в. юю ІЗ

Іво Хег ек Уа Су Уві лів Се біу Зет Сій Тк Ото Аз Ал бег

Кі; я 30

ТВЕ ТВ Акр Аа Гей Аза Уа Геи бен Це Пе Маг Ар Аз Ге АТЕ 3 45

Рго-Зег Цен Сіу Суз Ту? СЛУ Ар бух Бен Уві Ага бег Рго Ави Це і лев сів Ген Аа Бех Ні ех Цен Сен Ре Сп Ап Аа Ре Аа си 0 7 75 во

Сів Аїв Узі Сув Аїа Рго бег Аге Уві Зех Ре Ге Тк Сх Атр Аг вх 90 95

Рто Ар ТВ Тнг Ага Бе Тут Авр Рве. дв Бех Тут Ттр Аге. Уві Нів 109 105 по

Аа Сіу Авп Рае ет Ті Це Рго Сп Туг Ре ух ЄП Ав Сі Ту 115 120 125.

Уві Ті Ме бет Уа бі Гу Уві Рре Ні Рго Сіу Пе бег Заг Аки 130 13 150

Ні Тнт Авр Ар бег Рго Тут бег Тр бег Ре Рго Ро Туг Ні Рго 145 150 155 160

Зег Зет Сп Гм Тут Сі Авп Те Мув Те Сув Агв Оу Рго Авр бу 165 тях 15

Сі ем Ніз-Аїв Авп Бо ви Суб. Рго Уві Ар Узі Ген Авр Уві Ріо 150 Ів 190

Сів Оу Тнг Ген Рго Авр Гув бл бег ГВт бів бів Аза Не чо Гео 195 юю 208

Бев Сію уз Ме ух ТТ бе Аа бег Рго Ре Ре еи Аза Уві Су 210 215 290

Туг Ні Гук Рго Ні Не Рго Ре Ате о Туг Рго Був Сім Рлє Сіп Був 225 3 238 40

Ген Туг ро ем бів Аби Пет Гей АТа Рг Авр Рго Сн Ма! Рго 245 БА 235

Авр Сну беж Рго Рго Уаї Ай Туг Аби Ре Ттр Ме Авр Ме Ат С 260 265 270

Ате Сі Авр Уві Сп Аа Ген Аве Пе Бех Узі Рго Гук СОІУ Рго Пе

Зб

215 Бо 25

Рг Маг Азр Ре бі бін Авр бій бек бек ТВ Сіх РБе Аге Гей ув 290 295 00

Твг5ег бог Гог Ага Був Тут Пух 305 3юЮ «05 я «211» 343 «212» Білок «213» Ното варієпе «0» а

Ме Ріє Рго Рго-Ате ТВ СІ Ар Су Без ви Ттр Гео біу Тео Уаї

І 5 10 15

Їеч бег 5ег Маї Сух Уві Ав їеи Оу ет Сі Ті бів Аа Авп бег 20 3 30

Тне ТВг Авр Аа Бео Авп Уві Пец еп Це Це Уаї Авр Ар Гео Ар 35 40 45 рго Зег Гем Сіу Суз Тут біу Авр. ух Без Ма! Ато бек Рго Авп Це 50 55 Бр

Аер'ЄЇй їси Аз Бех Ніх бег Бец Гео Ре СЦе Авп Аа Рае Ада Сів 65 7 7 во

Сів Аа Уві Суз АІа Рго бег. Ате Уа! Бог РНе Гео тік Сіу Аг Ате 55 90 95

Рг Авр ТВ Тіт Аг Теи Ту лер не деп Чет Ту Тур Аа Ма Нів 100 105 Мо

Аа біу-двп Рне Бег Твіт Це Рго бій Туг Рое Бу5 Си Ако СПУ Тут 720 125

У тв Мегбег Ма! Су бує Уві Ре Ніх Ро Сіу Це бег бег Ав 130 135 1340

Нів Енг Авр Ар ех Рго Тут 5ег Ттр вет РНе Рго Рто Тут Ні Ро 145 150 155 160 бек бегби Цує Гук Со Аа Те Був Те Су Ага Су Ро Ар СУ 165 170 175

Са Ген. Пів Аа Аза Тв Гео Су Рго Ма! Азр Уа! Гени Ар Узі Рго 150 155. 190 бін су Те ев Рго Аво Бук Сів ет Те Сів Сп Аа Пе бів Тео 195 Ю 205 їв в Іде МесІ хе ТВ бек Ада беї Ро Рає РВЕ Цей лій Ма Ох 210 218 220

Лук Ні Був Рго Ні Пе Рго Ре Атге ук Рто Б Со Ре сія Бук док 230 235 240 реч Тує Ріо бе Су Ав Пе ГВт Де Айва Рго Дер го бін Уві Ро 245 25 255

Аерсіу ев Рго Рто Ма! Аза Тут Авп Рг Тер. Ме Ахр Пе Аке Сів 260 Рея 270.

Агв біш Авр Ма! бів Ав ї.ео Ах Пе Зег Уві Рго Тут СИу Рто Не 275 250 285

Рто Ма! Ар Рне Сів Агр Гу Пе Аг Са Зег Тут РНе Аа Заг Уві 290 9 Зо бвг Тут Бей Ар г Ой Ма! Оу Атге ви Сео бе Аз ви А яр Авр 305 зі ЗІ 320 еп Спа Пец Аа депо сег ТВТ Не Пе Ах Рлає вт Заг Ар. НІ Су зд 330 335

РБе со Ме Ате ТВ АБИ г

Зо «210» 5 «1іж За

«12» Білок «Вл» Ното варієпа «А» 5 зЗегсів Св А СПУ Тк СИу Аа Сх Ага СИ у Бех Беи Аа СПУ Бе і 5 во. 1х

Сук СПУ Сув СПУ ТЕ Рго Суп Ате Рто СТУ Аа ЕН5 Сіж бе ет Ав 2 2У 30

Аа Ав Ні Аге Тут вег Ася Спів. Аа Авп Аа Рто Су Ро Уа! Рто

СУС Ага Сп Гео Аза Ні зег Був Ме Хар Рто Пе Ро Аа у

Б вЕяи 60

У РЕ Ті Ме Сіу ТТ Авр Ар Рго О1й Пе ув Св Авр Ох СВ 85 70 75 50

Аа Ро Ана Ате Ате Маг Тв Пе Ар Аза Бе Тут Ме Ар Адя Туг 90 че

ОВ Ма) 5ет Ав ТВ Се Рів ОО Тая Рне Ма Авп Бе ТВ Оу Тут 190 1 По

Гео Тв Сни Ай Оп Бу Бе іх Аврозег Ре Уа! Ре бів сту Меї а 128 125 їса вет бів Ся Ма! Був ТВ Ал Пе біо Оп Аза Уві Ав Ада Ай

З 135 140

Рго Тер"Тер бео Ріо Уа Був Сну Аа Аби Тгр.Ате Ні Рго Сів Су 145 150 155 160

Рго Ар Зет Те Не бен Нік Ате Рто Авр. Ні Рго Уві Ге Нів Уві їз 170 175 бек Ттр Аво Акр Ав Уві Аза Тут Сух Твг Тер Аів Су Гу Ав еу хо 185 195

Різ ОТ Аза С Тр Сію Тут ет Суя Ага СПУ Спу Гей Ніх Ап

195 200 2а5 те Геи Ре Рго Тер Оіу Аа Гу Цен Сіл Рго Цух СПУ бій Нів Тут 210 215 220 лів Аби Пе Тер Оу Се рРНЄ Рго Ма Твг Ав Тве СІ» Ото Ар 2 2 аа що

СПу Ріє бів О1у Твг Аа Рго Уа! Авр. Аа Ре Рго Ро Ах Сіу Туг 245 250 з

СУ Ген Туг Ава Не. Уві Су Ав Ада Ттр бів Ттр Твг Зег Ар Тгр 260 265 27

Ттр Тіт Уві Ні Нів бег Уві Си Сб Твг ев Аве Рв Гі Су Бгто 275 о 285.

Рго бег СПУ Ів. АвроАтге Ма! Був Гея СУ Оу. бек Тут Ме Сув Нік 290 295 300 те бег Тук Сх Туг Аг Тує Аго Схв Лів Аа Ате Бех бій леп Те

Мк зо 315 330

Рг Акр бег бет Лів вет Ап Тем Су Ре Аго Сув Аве Аа Ар Ате 325 330 335

Ге Чи Ме Авр

Бе «ах «11 374 «2122» Білок «2135 Мото харієнпе «ах о.

Мег Аа Ав Ро Ав Гев Оу Беца! Сув Су Аге Сух Рго Сі Гев 1 5 10 15

Сіх бе мага Сен Гео бе бев бей бег Безу бен Су Су Аа ів

Сну. жег Сів Сн Аа СТУ ТВ СПУ Ада С1у Ада Су бег їси Аза СУ 35 ТЯ 45 вегсув СТ Сув Сну ТвергО СТ Ате Рто Ну Аа Ні Спу бек чег 50 55 о

Аа Аа Аза Нів Ате Тут Чех Атя бій Аа Ап Аа Ріо СТУ Ріо Уа 55 7 75 о

РІС СОЮ АТ бів Бей АНІ ЗБК ую Ме Уа рго Не Ртв Аза

ЩА 90 95.

Су Ма Ре Те Месоіу ТЬг Ар АвроРго Сп Пе Глув Оіп Авр СУ цю 105 о

Сіш Аз Ро Аа Ате АтЕ Уві Тве Не Авр Аа Рів Тут Меб Авр. Аа 120 125

ТУГО Маї ек Ав Твг сів РВе Сіш бує РВе Маг Ак бег Тї ОЇ; 130 135 130

Ти цев Тем Аке Он їує Ре СПу Авр.беї Ре Ма! РВЕ Си Оу і 150 155 169

Мет ви Бе Сів Сп Уві Її у Твг Аа бе бія Оп Аза уві Аа лів 165 1 175

Аа Рго Тер тр бен го Уві Бук СТУ Аза Ав Тер Атв Ні Рго сів 180 155 190

Су Рго Авр бе Тг Не Гео Біб Аге Рто Ажр Не Рго Уві Ге Ні 195 200 205

Уа! бег Ттр Авп Авр Аа Уві Лія Туг Суя Твг Тер Ав СТУ Гув Аге 21 2і5 220

Мей Рго Тіт Сів Аа Се Ттр Су Тує ет Сук Атв СК СТУ Сей НЕ: да 230 23А Бе

Авпо Ате Ге Рве Рго Ттр сту Ав Був бви Сун. Рго Су СТУ Св Ні 245 280: 235 м

Тут Аіфав Авп Ле Ттр СНв СТУ Св Рве Реб Ма! ву Авп ТВОЇ СІВ 260 263 270

Ар Оу Рве СТОПУ ТВг Ада Рео Маї-Авр Аза Ре Рг Рто Аби СПУ 215 250 285

ТУРУ Бей Тут Ава Ме Ма Су Авп Ай Ттр Си Ітр Тін'бег Ар 290 295 З00

Тер Тер Не Уа! Нів Нів бег Уа бів Си Тег Іву Ап Рео Був СТУ 305 зо зі5 320

Рго Рго 5ет Су Гук АвроАте Маг Єв ув СПУ Му баг Тук Мек Суб 325 3 335 х

Ні А 5еї Гуг Су Тут АтЕ Гук Ате Сує Аа Аа Агро вет Сіп Ап 340 5 350

ТвеРго Авр.вех Зег Аа Бек лхп ет О1у Ре Ага Сув Аа Аа Ар 355 360 365

Аге ви Рго Ті Мег Ар 3 «0» 7 «211» 1653 «125 ДНК «РІЗ» Ното варієне «4005 7 . вірсососве сссесаєсве осрсвесств сівісесіне восбеист варсаюсвія 60 ірсеірвесс і поосавсви расссаррос авсврсасся ссрасрссстявасвірсів 120 сірнісаієє гррасрассї всрссссавс сіреесівсі асерсрасва ссіссівсяс 150 аксессавсв Ісвассайсї вессаресас авостсів і (ссараасвс сисесссан 240 сасресеірі погсссссав ссрєріварс Цесівассе росросеєсссвасассясс 0 сессиласв асисадсає сіасівосес сівсасвосе рсаасисав сассаюссс Зб гарівснса перяраасвр сасвірясс аграрсвіре всвасвіві ссасессвяс 420 аісзесаєвса ассасассез сеаспрсссстасавствяа всбссссоссіассасссе ЯКО авсайсрява звівсванаа сасспарассіросрсресс ссвасоесва всівсасвсс 540 зассірсірі весссвівна сетрсівосас рівссенарр всасосірсссвасаарсяю ОВО авсассравс арессаєся всівсівоар заратвавня ссассессар ссссненес 0 бБО сіпессвіре есіассасза росссасвіс сссцссесі ассссаарра віссарзав 72 сшегасссссівеаввасаї сассотрисс сссвассоставрівсссота срросітсос ВО сестівросіасвасоссцу раїроасвісснссарсрсв асозсевівса пососівнає 840) шісарсвівс сстасррссс сагссссеір васиссанс всварассв осаварсіяс 900 невссавсв наєсівосі красасссав віброссвесірсіврарсясссіврасває 00 сірсарсівєт ссивсавсас спіснпісреє Нсассавср ассасоосів рроосівррє 1020 варсасрисе арівовссва втасаврсвас Псрасвіре ссасссасві восссіваїс 1050

Пстасвтівс ссроссрсас свосавссір сесеарвост всраралостяиссссіяс 110 сіввассссі Ісвасарсевс сарссарсів агетрпосест вссессарав саевассія 300 віднавсіве Інвиссіви ссссасесіє вссрросітце ссвросівса ррірссосос 12650 срствссесе всосарсі ссасеіррае сівіпссвсе ареисаавза ссірсіраає 1320 саснссрсі Тесесвассї снарваноас сосійссівс серрсаасссссрсванстя 1380 псеесаса весаріассс ссвссссарс васаюссоє арірозасав срасавоосс Я зессівпясе асабсаяваї саіееостас песвісовса ссвієраста сенсіасаєт 1500

Вівірерірв рСйсзассс свасвавнс сівессаасі іспесваси ссасвссвро 1560 вавсіріасі ісріввасає свасссосів саррассаса асаготасва сеасавссвк 1620 ввовисваєс ійноснесі пеівагцвссс аю 1655 «-В105 5 «Мі1 НО ; «2155 ДНК «3» Ното зарієпе «МЮз В аінвсівсес сспсасайе есіРео(Рі всасенесс сеавсівАи КІСсССС 000

Песбіесійс осісісрсї всіВІсіней рРСсерсаверо вссанвароссрявносврі 120 всторовпсев втісссирс невИснес весівсвеса сросссарсв восіврсвос 150 саврслен серсавосвс ісассватас іспсрроане сівасесієсверссосяа 240 сеепенвавс ррсаасісрвс всасісавав аіевісссса (сссівсіве аріанійса ЗО аівЕросасан шршссіси епівазесяю вагова сассірсван басарцясї 360 апеаівссі Шасагрра тесстатнаа вісаміааіа сібазніра ваавшви 20 засісзаасів весашвасявавесіває закшввся асіюсттеєсійевавос 480 аівиварів арсваріраа вассавіай Свасарисар Посавствс осів 540 цпассівнха ааррсксійа сірравасас ссарааверео сібасістае аиствсас 600 невесвеще аіссатисі сопіртвісс іовааісаір сернвоста сірсаспре 660 вспрреварс рестроссає рвапествав вроеватса есівісраде авроствсві 720 зашезсні іссссівене садсвавсіє сарссозаве посавсана Гессадевиу 780 івисаррисе ЗеНСсеріІ рассавсасі риірасові вспссаари васірсвсстї ВА онеаівесігоссісссай рн агє Небасваса с асівесвна сосаіврвай 90 тввасисав'асівтврастинсагв страз ззасвсназ сссзаларві 960 сососпст кравариссе артранозаз вегерагссі дсаівтессв авнісни 1 020 пнасавої зісесіртес Ірсісеяаре сараасасас сідагавсіс всневраяі 10807 спвеврапос нсічрспрс свассвсств ессассвіва яса 125

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Клітина, що містить: першу нуклеїнову кислоту, яка кодує біологічно активний білок ідуронат-2-сульфатази (125), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 1; та другу нуклеїнову кислоту, яка кодує біологічно активний білок формілгліцинутворюючого ферменту (ЕСЕ), що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну 5БЕО ІО МО: 5, при цьому перша та/або друга нуклеїнова кислота є екзогенними, а клітина при культивуванні в умовах клітинного культивування виробляє білок І25, що містить щонайменше близько 70 95 залишків цистеїну, які відповідають Субз59 з 5ЕО ІО МО: 1, перетворених у Со-формілгліцин (ЕСІу), причому рівень білка ідуронат-2-сульфатази, який експресує клітина, в 0,3-10 разів вище рівня білка формілгліцинутворюючого ферменту, який експресує ця клітина.

2. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що клітина при культивуванні в умовах клітинної культури виробляє білок 125, в якому щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 95 965, щонайменше близько 97 95 залишків цистеїну, які відповідають Суз59 з БЕО ІО МО: 1, перетворені у Со-формілгліцин (Оу).

3. Клітина за будь-яким із пп. 1-2, яка відрізняється тим, що (а) перша та/або друга нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з промотором НСМУ, та/або (б) перша нуклеїнова кислота кодує білок І25, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 1, та/або (в) перша нуклеїнова кислота кодує білок І25, що має амінокислотну послідовність, ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 1, та/або

(г друга нуклеїнова кислота кодує білок БОЕ, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 5. (д) друга нуклеїнова кислота кодує білок ЕСЕ, що має амінокислотну послідовність, ідентичну ЗЕОІЮО МО: 5.

4. Клітина за будь-яким із пп. 1-3, яка відрізняється тим, що перша нуклеїнова кислота містить послідовність, щонайменше на 70 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 7, та/або друга нуклеїнова кислота містить послідовність, щонайменше на 70 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО: 8.

5. Клітина за будь-яким із пунктів 1-4, яка відрізняється тим, що як перша, так і друга нуклеїнові кислоти є екзогенними.

б. Клітина за будь-яким із пп. 1-5, яка відрізняється тим, що клітина є клітиною ссавця, причому, необов'язково, клітина ссавця є клітиною людини або клітиною СНО.

7. Клітина за будь-яким із пп. 1-6, яка відрізняється тим, що клітина є такою, що адаптується до суспензійної культури.

8. Спосіб одержання рекомбінантного білка ідуронат-2-сульфатази (125), який включає культивування клітини за будь-яким із попередніх пунктів в таких умовах, в яких рекомбінантні білки І25 та ЕСЕ коекспресуються в клітині.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що клітину культивують у великих масштабах.

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що культивування у великих масштабах являє собою процес, який проходить у біореакторі, причому, необов'язково, (1) процес, який проходить у біореакторі, є перфузійним процесом та/або (2) об'єм біореактора вибраний з 10 Л, 200 Л, 500 Л, 1000 Л, 1500 Л або 2000 Л.

11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що культивування у великих масштабах являє собою процес, який проходить в ролерному флаконі.

12. Спосіб за будь-яким із пп. 8-11, який відрізняється тим, що (а) клітину культивують у безсироватковому середовищі, або (б) клітину культивують у суспензії.

13. Спосіб за будь-яким із пп. 8-12, який відрізняється тим, що спосіб додатково включає етап очищення рекомбінантного білка І25. ЯКОЮ Ж ек бі: Тве піб Аіз КфОуй»х во ме йер дія ж: ден Тві фе іже Жіж Кв У«Ї дер Я Зевбе: йко Бо бе: Ме: біб Св Тех ПІ Ав Му б 83 Бе дек Все За Вів Аве 184 тів ців ЗБ; ев Ці те Же Бук ВХ Хек Від беж го Бе Бе Зве Дів ВІ ПУ Тек ЕМ» ТВЖжЖ бо із Гуо дае бхо ді» Уві без Б БІф їв бо йхо і Аів Тву аа ЖІ вуз Тув Неє дер їіФ йхо Піх лев іє йзв Ух бін діа зе КОКО Лів Фех жі рез Те ЗЕ ОЗрК то Г15 реє Уві дев Біє Фій йо цев Ї16 йАхе БІВ Леє бух бе Зіз бек Уві Ех ФігЛА щі бус Жоажіх жа Хв ск и Под. ж с. по Я Я х. х х т ЕН: : ще ших же беж їв ж 2 Житк Дах сах Жах М ах З Машу Жахи Ха СЛ СЛамох ЩІ. од я ІУЖ МЕ ВОМ МЕ УЖ УЮ М ТМ МЕ ШЕ АБ В шо МЕМ вм ЗВ ді я Же Шк.

ЖЖ Ж ДЕ С ЖЕ.

В т а що Я с.

У соя хх у хх хх ЗА Хе ме Ів ті ів ММ б Ка бек Між св ит хх гамі Зак ах ШХ ж їх (їх Ор ТЯ чи ЕХ Хе Жбдоюю онко ЖоЗ да Ка хо хе які ОК се х. х с к. "З ще ж ХХ ба Жде ее жк Же ев МЕ Жі же За За фе барі Ж Щоб бек Ме ех З а МЕМ ЖК МЕ БИ МБ ще М ОБ АТМ МАХ ж М КО БВ ЖЕ ВХ Бк БУ ЖЖ ем Шик ЖІ ЖМашєю Хожуєш.

Жеакок ЖЕ, Сх Ж ж ко ох ої Хом КК, ж ї хх я К х о ух я : Па З ж Са Ж шах тах бак Зак ММ жи Су ХК я ЖЕ Ка Ху З МЕ ОМ Я ЖЕ НЕ КИ ка АЖ ЗАВ ух хе МИ УК ЗБЕ Ма аа Ме МЕ БЕ С ж яЯ Ж Жах І х лоша Ж зжі Жака: У хх У 0 ЖК дя шк дно фак: с.

АХ х. к.

Мат пі КЕ сі сх ВЕ Мі Бех сі доков Ї З зак ее бат Там Ма сла бан ж Жук Я Зк Ба зве І Са З І ЗОМ У ВЕБ біб ОВ ВС Зо» ев Зеї бр Ов Уві ще Коба Ка бек і Зк НИ а НН и жи В СОУ т З р ої М ще ЖЖ ба: 53 ки іа ЖІ ще і А Ж Вже скл ха ко 258 Жежх ЗБ 55 Ме беБ Те зе: бе 5 ев ВІЗ КО бе БІБ З бо бо о Се Бе Ув3 бе КЗ Ха Ха іш Же ОХ Хе схе Фони КВ ММ х З х. г г. сз я Х-ж Ши ла в 82 си жк ек її Ол ла еко ми Змі сажа Ж МБ б ЗМих Бе щі БЖ ГБ ВІ Ба ЗІ ЖЖ ВУЖ БА ИЮ МУЖ БМ МИХ хяе М БА М ЖК БІ АК Ж с й, с Б з Й жк.

М КМ лю ох ХеЖ ІК Ку КЗ ху.

КУ бак ЛІ ожюь СКК с У т сх ж аж баде їж п ау БЮ ВЕ дз: Ша їх Баш Бу кий З: їм» Ж Бо чує а лі ЖІ де МБ і ОБ БІО БО ТУ щем бує Зі ще УМ Бе БО їв ів ВІВ ТК ВХ КВ кож жи соскодх.

Жеших ЖЖ с Ч й ми ах с. с З З бик Бу: Кк бе» бе бе їі ее і Же Бах За й бах ка Же їм бак ок Ж Х Теє Бе дб бо бек о 036 Вко бу Тюв й 5 а5о ще еО Хех З БУВ в це х хх.

Жака СЖ ж.

Ко х. їх.

Ух - хек.

ЛЕ, Ж ч ч 5. з я х й У зе їз Ма іє Же» Са З: 5 Ж ем Же Ха бек Жах У їщ їх хх ма 03 Му з хе бе Боюв ів БбБо бар; БІ Жак ба ам їж т.

Щжи жає фі З з 5 шЕщ ще ЖЕ БЖ В ХК св жах Ма шт Ж Ех ск М: Та Ж Ж сю ше Ма ЕК ЖЯ ЖИ жк ЖК М КИ БЕН АВ ЕМОАТ ЖК УКУ ВЕ ЖЖ АК І ща ЗМ БЕЗ МУК МБ А же Же Ще Ше ба: щі Хе Бі ба Ме бе ХЖек Жак і 3 ік Кк т ж МБО БОЖЕ БЕ БО ес В БО ВІЗ В ЗБ ТУ БА МЕ СО ЦЮ шо ме Ме КЕ сі бах їм Ми вв фу са ей Бе МЕ Мт Є с зх регу ни Я КУ х 7 фкроуекою Ж ЩІ з су ток с й що ж Я х т с с Ж о жок ння со ку - - КщЯ з У Її м ЖНЕВЕ ВЕН ВІН ЕТУВ МОСТОМ Жеашкоооной Що їй Жанжвнй Васізвнтв векепоех Гб та ВИМ пПашмантІн вежксивесм ета ЗОМ Зк их 2 их Ж з ж й сохея З : х : : с, Ж ХО Е КИ х Са З сек ще жи й у ее кує ТИ КИ Експрес слинні: не охоемах векторах с кртраневек я або посвізовке: трансакцій пня З ОВО З МВ оооевюовюсоі і мо отОов аз ЕН и ННННИ

Бкспнейн: охо на сдясомуУ век с ецна травееюцн 1 Єжремі вроховв ! о бромеюю, Кс ЕІ браннов ЦЗ ЗТ ! - тТраяскововнно зв'язані ечове пкт Промотор| 5 их Еш ШЕ НЄ: Ще МО шенні ПЕРОМООВ ЗОМ БНЕЯ 045 00 ЗА пня Фіг2в кореня між еиеанфеною яктвани во та кове хонвеен у верхненіни І Сивоноічна активність 25 та Зномрмнт нн ; шк І що ! Ді а пен нн г | в о Ши а ВД оре ПК) Е А Е КУ и ши й пен І ї : 3 ї ве В рн нині мінні зви нн нини Сип чня активнієть Фіг