CN104583414A

CN104583414A - 产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法

Info

Publication number: CN104583414A
Application number: CN201380042616.9A
Authority: CN
Inventors: C·张; F·博尔戈
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2015-04-29
Also published as: CA2877492A1; IL236324A0; CL2014003569A1; CO7240395A2; WO2014005036A1; SG11201408755TA; PH12014502870A1; US20140004097A1; HK1209790A1; JP2015523074A; AU2013282417A1; CR20140587A; PE20150603A1; EP2867367A4; MX2015000188A; EP2867367A1; IN2014DN11272A; DOP2014000297A; EA201492185A1; KR20150037908A

Abstract

本发明除其它事项以外提供了在无血清培养基中使用哺乳动物细胞的悬浮培养大规模产生重组I2S蛋白的方法和组合物。具体地，本发明使用共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞。

Description

产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请系列号61/666,712的优先权；其完整内容在此通过引用并入。

序列表

在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为“2006685-0339_SEQ_LIST”的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大小为21KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景

粘多糖贮积症II型(MPS II，亨特综合症)是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素切割末端2-O-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大，组织破坏和器官系统功能障碍。

一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严重的、进行性的和限制寿命的。

酶替代疗法(ERT)是用于治疗亨特综合症(MPS II)的批准的疗法，其包括向亨特综合症患者施用外源替代I2S酶。

发明概述

本发明除其它事项以外提供了用于大规模产生重组I2S酶以促进亨特综合症的有效治疗的方法。在本发明之前，使用含血清培养基的滚瓶贴壁培养系统已被成功地开发来大规模产生重组I2S。然而，本申请的发明人开发了这样的系统，该系统能使用无动物组分、化学成分确定的培养基在大规模器皿中有效地悬浮培养共表达I2S和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以高效地产生大量重组I2S酶。出乎意料的是，使用无动物组分悬浮培养系统产生的重组I2S酶还已显著地改善了酶活性，因为以这种方式产生的重组I2S具有异常高水平的C_α-甲酰甘氨酸(FGly)(例如，高于70％和高达100％)，这是I2S的活性所需要的。此外，根据本发明产生的重组I2S酶具有独特的特征，例如唾液酸含量和聚糖图谱，这可以提高重组I2S蛋白的生物利用度。此外，无动物组分培养系统简化了下游纯化工艺，并减少或消除了血清来源的污染物如胎球蛋白。因此，本发明提供了大规模生产系统，该系统是更有效、具有成本效益、可重复的、更安全并产生更有效力的重组I2S。

因此，在一个方面，本发明提供了通过在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中悬浮培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞而用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法。在一些实施方案中，培养步骤包括灌注工艺。

在另一个方面，本发明提供了用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在一定条件下，在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以便所述细胞平均以大于约15皮克/细胞/日的比生产率产生重组I2S蛋白，并且另外地其中产生的重组I2S蛋白平均包含至少约60％的对应于人I2S蛋白的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。在一些实施方案中，培养步骤包括灌注工艺。

在一些实施方案中，灌注工艺具有在约0.5-2体积的新鲜培养基/反应器的工作体积/日(VVD)(例如，约0.5-1.5VVD、约0.75-1.5VVD、约0.75-1.25VVD、约1.0-2.0VVD、约1.0-1.9VVD、约1.0-1.8VVD、约1.0-1.7VVD、约1.0-1.6VVD、约1.0-1.5VVD、约1.0-1.4VVD、约1.0-1.3VVD、约1.0-1.2VVD、约1.0-1.1VVD)的范围内的灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有约0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95或2.0VVD的灌注速率。

在一些实施方案中，灌注工艺具有在约0.05-5纳升每种细胞每日(nL/细胞/日)(例如，约0.05-4nL/细胞/日、约0.05-3nL/细胞/日、约0.05-2nL/细胞/日、约0.05-1nL/细胞/日、约0.1-5nL/细胞/日、约0.1-4nL/细胞/日、约0.1-3nL/细胞/日、约0.1-2nL/细胞/日、约0.1-1nL/细胞/日、约0.15-5nL/细胞/日、约0.15-4nL/细胞/日、约0.15-3nL/细胞/日、约0.15-2nL/细胞/日、约0.15-1nL/细胞/日、约0.2-5nL/细胞/日、约0.2-4nL/细胞/日、约0.2-3nL/细胞/日、约0.2-2nL/细胞/日、约0.2-1nL/细胞/日、约0.25-5nL/细胞/日、约0.25-4nL/细胞/日、约0.25-3nL/细胞/日、约0.25-2nL/细胞/日、约0.25-1nL/细胞/日、约0.3-5nL/细胞/日、约0.3-4nL/细胞/日、约0.3-3nL/细胞/日、约0.3-2nL/细胞/日、约0.3-1nL/细胞/日、约0.35-5nL/细胞/日、约0.35-4nL/细胞/日、约0.35-3nL/细胞/日、约0.35-2nL/细胞/日、约0.35-1nL/细胞/日、约0.4-5nL/细胞/日、约0.4-4nL/细胞/日、约0.4-3nL/细胞/日、约0.4-2nL/细胞/日、约0.4-1nL/细胞/日、约0.45-5nL/细胞/日、约0.45-4nL/细胞/日、约0.45-3nL/细胞/日、约0.45-2nL/细胞/日、约0.45-1nL/细胞/日、约0.5-5nL/细胞/日、约0.5-4nL/细胞/日、约0.5-3nL/细胞/日、约0.5-2nL/细胞/日、约0.5-1nL/细胞/日)的范围内的细胞比灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0nL/细胞/日的细胞比灌注速率。

在一些实施方案中，根据本发明培养的细胞平均以大于约20皮克/细胞/日(例如，大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/日)的比生产率产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，根据本发明培养的细胞以至少6mg每升每日(mg/L/日)(例如，至少8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg/L/日或更多)的平均收获滴度产生重组I2S蛋白。

在一些实施方案中，根据本发明的方法的产生的重组I2S蛋白包含至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的对应于人I2S蛋白的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

在一些实施方案中，适合于本发明的哺乳动物细胞为人细胞。在一些实施方案中，适合于本发明的哺乳动物细胞为CHO细胞。

在一些实施方案中，适合于本发明的大规模培养皿为生物反应器。在一些实施方案中，适合的生物反应器为或大于10L、200L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L的规模。

在一些实施方案中，适合于本发明的培养基缺乏动物来源的组分。在一些实施方案中，适合的培养基是化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，适合的培养基不含蛋白质。

在一些实施方案中，适合于本发明的培养基包含至少一种氧化还原调节剂。在一些实施方案中，适合于本发明的氧化还原调节剂选自谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸、肌肽、鼠尾草酚、萝卜硫素、生育酚、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、硒、2-巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、核黄素、烟酸、叶酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)及其组合。在一些实施方案中，适合的氧化还原调节剂为半胱氨酸。在一些实施方案中，半胱氨酸的浓度在约0.1mg/L至约65mg/L(例如，1-50mg/L、1-40mg/L、1-30mg/l、1-20mg/L、1-10mg/L)的范围内。在一些实施方案中，适合的氧化还原调节剂为2-巯基乙醇。在一些实施方案中，2-巯基乙醇的浓度在约0.001mM至约0.01mM(例如，约0.001-0.008mM、约0.001-0.007mM、约0.001-0.006mM、约0.001-0.005mM、约0.001-0.004mM、约0.001-0.003mM、约0.001-0.002mM)的范围内。在一些实施方案中，适合的氧化还原调节剂为N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的浓度在约3mM至约9mM(例如，约3-8mM、约3-7mM、约3-6mM、约3-5mM、约3-4mM)的范围内。

在一些实施方案中，适合本发明的培养基包含至少一种生长调节剂。在一些实施方案中，适合的生长调节剂为次黄嘌呤。在一些实施方案中，次黄嘌呤的浓度在约0.1mM至约10mM(例如，约0.1-9mM、约0.1-8mM、约0.1-7mM、约0.1-6mM、约0.1-5mM、约0.1-4mM、约0.1-3mM、约0.1-2mM、约0.1-1mM)的范围内。在一些实施方案中，适合的生长调节剂为胸苷。在一些实施方案中，胸苷的浓度在约1mM至约100mM(例如，约1-90mM、约1-80mM、约1-70mM、约1-60mM、约1-50mM、约1-40mM、约1-30mM、约1-20mM、约1-10mM)的范围内。

在一些实施方案中，培养基具有在约6.8–7.5(例如，约6.9-7.4、约6.9-7.3、约6.95-7.3、约6.95-7.25、约7.0-7.3、约7.0-7.25、约7.0-7.2、约7.0-7.15、约7.05-7.3、约7.05-7.25、约7.05-7.15、约7.05-7.20、约7.10-7.3、约7.10-7.25、约7.10-7.20、约7.10-7.15)的范围内的pH。在一些实施方案中，培养基具有约6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5的pH。

在一些实施方案中，本文中描述的各种方法的培养步骤包括生长期和生产期。在一些实施方案中，于在约30-37℃(例如，约31-37℃、约32-37℃、约33-37℃、约34-37℃、约35-37℃、约36-37℃)的范围内的温度下培养哺乳动物细胞。在一些实施方案中，在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃的温度下培养哺乳动物细胞。本文中描述的任何温度可用于生长和/或生产期。在一些实施方案中，在生长期和生产期期间在不同的温度下培养哺乳动物细胞。在一些实施方案中，在生长期和生产期期间在大体上相同的温度下培养哺乳动物细胞。本文中描述的任何培养基pH可用于生长和/或生产期。在一些实施方案中，对于生长期和生产期的培养基pH是不同的。在一些实施方案中，对于生长期和生产期的培养基pH是大体上相同的。

在一些实施方案中，在生产期期间以在约1.0-50X10⁶个活细胞/mL(例如，约1.0-40X10⁶个活细胞/mL、约1.0-30X10⁶个活细胞/mL、约1.0-20X10⁶个活细胞/mL、约1.0-10X10⁶个活细胞/mL、约1.0-5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-4.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-4X10⁶个活细胞/mL、约1.0-3.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-3X10⁶个活细胞/mL、约1.0-2.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-2.0X10⁶个活细胞/mL、约1.0-1.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-10X10⁶个活细胞/mL、约1.5-5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-4.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-4X10⁶个活细胞/mL、约1.5-3.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-3.0X10⁶个活细胞/mL、约1.5-2.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-2.0X10⁶活细胞/mL)的范围内的活细胞密度维持哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，生产期持续约5-90日(例如，约5-80日、约5-70日、约5-60日、约5-50日、约5-40、约5-30日、约5-20日、约5-15日、约5-10日、约10-90日、约10-80日、约10-70日、约10-60日、约10-50日、约10-40日、约10-30日、约10-20日、约15-90日、约15-80日、约15-70日、约15-60日、约15-50日、约15-40日、约15-30日)。在一些实施方案中，生产期持续约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90日。

在各个实施方案中，哺乳动物细胞表达具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的氨基酸序列的重组I2S蛋白。在一些实施方案中，本文中描述的发明方法用于产生具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列的重组I2S蛋白。

在各个实施方案中，哺乳动物细胞表达具有与SEQ ID NO:5具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的氨基酸序列的FGE蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物细胞表达具有与SEQ IDNO:5相同的氨基酸序列的FGE蛋白。

在各个实施方案中，哺乳动物细胞包含一个或多个编码重组I2S蛋白和/或FGE的外源核酸。在一些实施方案中，将一个或多个外源核酸整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，一个或多个外源核酸存在于一个或多个染色体外构建体上。在一些实施方案中，用于本发明的方法的哺乳动物细胞过表达重组I2S蛋白。在一些实施方案中，用于本发明的方法的哺乳动物细胞过表达FGE。

在各个实施方案中，根据本发明的发明方法还包括收获重组I2S蛋白的步骤。

在另一个方面，本发明提供了使用本文中描述的方法产生的重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了重组I2S蛋白的制剂，其中重组I2S蛋白具有至少约70％(例如，至少约77％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，本发明提供了重组I2S蛋白的制剂，其中重组I2S蛋白具有大体100％的对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，本发明提供了重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的制剂，所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有至少约20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg或100U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

除其它事项以外，本发明还提供了一种包含本文中各个实施方案中描述的重组I2S蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，以及通过向需要治疗的受试者施用本文中描述的重组I2S蛋白或包含所述重组I2S蛋白的药物组合物来治疗亨特综合症的方法。

如本文中所用，除非另有明确所指，否则术语“I2S蛋白”、“I2S”、“I2S酶”或语法等同物是指重组I2S蛋白分子的制剂。

如本申请中所用，术语“约”和“大致”可作为等同物使用。具有或不具有约/大致的用于本申请的任何数字旨在涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优势在下面的详细描述中显而易见。然而，应当理解，所述详细描述，虽然表示本发明的实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，而非限制性的。根据所述详细描述，本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图简述

共同地构成附图的以下描述的图仅用于说明目的而不是为了限制。

图1描述了编码人艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，并且指示了蛋白质序列内用于N连接糖基化和半胱氨酸转化的潜在位点。

图2描述了用于共表达I2S和FGE的示例性构建体(即，SUMF1)设计。(A)分开的载体上的表达单位(用于共转染或随后的转染)；(B)相同载体上的表达单位(一次转染)：(1)分隔的顺反子和(2)转录连接的顺反子。

图3显示了相较于I2S参考标准，通过使用在无血清或基于血清的细胞培养条件下生长的细胞系产生的SDS-PAGE显示的全长重组I2S的示例性表达。

图4显示从在无血清培养条件(顶图)下生长的I2S-AF 2D细胞系产生的重组I2S酶相对参考重组I2S酶的示例性肽图谱

图5描述了相较于参考重组I2S酶，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D和4D细胞系产生的重组I2S酶产生的示例性聚糖特征谱。

图6描述了相较于参考重组I2S酶，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D细胞系产生的重组I2S酶产生的示例性电荷特征谱。

定义

为了使本发明更容易被理解，首先定义某些术语。对下列术语和其他术语的附加定义陈述于整个说明书中。

氨基酸：如本文中所用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H₂N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的20种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文中所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰氨基酸，包括但不限于盐，氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代。氨基酸，包括在肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或利用其他化学基团的取代来进行修饰，所述其他化学基团可改变肽的循环半衰期而不会不利地影响它们的活性。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可以包含一种或多种翻译后修饰，例如与一种或多种化学实体(例如，甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等的缔合。在一些实施方案中，可在用于细胞培养的补充培养基中提供本发明的氨基酸，或可将所述氨基酸用于所述补充培养基。在一些实施方案中，提供于或用于补充细胞培养基中的氨基酸可以以盐或水合物的形式提供。

大致：如本文中所用，术语“大致”或“约”，如用于一个或多个目标值，意指与所述参照值相似的值。在某些实施方案中，除非另外指出或另外地根据上下文显而易见的(除其中这样的数值超过可能值的100％外)，否则术语“大致”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参照值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

分批培养：如本文中所用，术语“分批培养”是指培养细胞的方法，在所述方法中在培养过程开始时提供最终将用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文中“培养基”的定义)以及细胞本身。因此，分批培养通常是指允许从接种进展至结束而无需给培养的细胞重新进料新鲜培养基的培养。通常在某一点停止分批培养，随后收获培养基中细胞和/或组分，并且任选地进行纯化。

生物利用度：如本文中所用，术语“生物利用度”通常是指到达受试者的血流的施用剂量的百分比。

生物活性：如本文中所用，短语“生物活性”是指在生物系统(例如，细胞培养物、生物体等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当向生物体施用时对该生物体具有生物作用的物质被认为是有生物活性的。生物活性还可通过体外测定(例如，体外酶促测定如硫酸酯释放测定法)来确定。在具体实施方案中，当蛋白质或多肽具有生物学活性时，共有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分。在一些实施方案中，从细胞培养系统产生和/或纯化蛋白质，当向受试者施用时，所述蛋白质显示生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要进一步加工以变得具有生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于，糖基化(例如，唾液酸化(sialyation))、法尼基化(farnysylation)、切割、折叠、甲酰甘氨酸转化及其组合，以变得具有生物活性。在一些实施方案中，作为前体(proform)形式(即未成熟的形式)产生的蛋白质可能需要额外的修饰来变得具有生物活性。

生物反应器：如本文所用，术语“生物反应器”是指用于宿主细胞培养物生长的容器。生物反应器可具有任何尺寸，只要它对于哺乳动物细胞的培养是有用的。通常情况下，生物反应器将至少为1升，并且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或以上或其间的任何容积。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH值、克分子渗透压浓度、CO₂饱和度、O₂饱和度、温度及其组合，在培养期间通常受到控制。生物反应器可由适合于在本发明的培养条件下在培养基中保持细胞的任何材料(包括玻璃、塑料或金属)组成。在一些实施方案中，生物反应器可用于进行动物细胞培养。在一些实施方案中，生物反应器可用于进行哺乳动物细胞培养。在一些实施方案中，可将生物反应器与来源于这样的生物体的细胞和/或细胞系(例如但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞和人细胞)一起使用。在一些实施方案中，生物反应器可用于大规模细胞培养生产，并且通常为至少100升，并且可以为200、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或以上或其间的任何容。本领域普通技术人员将意识到，并且将能够选择适合的生物反应器用于实施本发明。

细胞密度：如本文中所用，术语“细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的细胞的数目。

细胞培养物或培养物：如本文中所用，这些术语是指在适合于细胞群体存活和/或生长的条件下在培养基中生长的细胞群。如对于本领域普通技术人员将很清楚的，如本文中使用的这些术语可指包含细胞群和所述群于其中生长的培养基的组合。

培养：如本文中所用，术语“培养”或语法等同物是指在有利于生长或存活的条件下维持细胞的过程。术语“培养”和“细胞培养”或任何同义词在本申请中可互换使用。

培养皿：如本文中所用，术语“培养皿”是指可为培养细胞提供无菌环境的任何容器。示例性培养皿包括但不限于玻璃、塑料或金属容器。

剂型：如本文中所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗的患者的治疗性蛋白的物理上分离的单位。每一个单位包含经计算产生期望的疗效的预定量的活性材料。然而，应理解，组合物的总剂量将由健全医学范围内的主治医生来确定。

给药方案：如该术语在本文中所用的，“给药方案”(或“治疗方案”)是向受试者单独施用(通常间隔以时间段)的一组单位剂量(通常超过1个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可包括一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，其每一个剂量彼此间隔相同长度的一段时间；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量和至少两个不同的间隔单个剂量的时间段。

酶替代疗法(ERT)：如本文中所用，术语“酶替代疗法(ERT)”指的是通过提供缺失的酶校正酶缺乏的任何治疗策略。在一些实施方案中，缺失的酶通过鞘内施用提供。在一些实施方案中，缺失的酶通过向血流内的输注提供。一旦施用，酶被细胞吸收并转运至溶酶体，在溶酶体中酶用于消除因酶缺乏而在溶酶体中积累的物质。通常情况下，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗性酶递送至其中表现贮积缺陷的靶组织中适合的细胞中的溶酶体中。

赋形剂：如本文中所用，术语“赋形剂”是指被添加至药物和/或制剂以改善其物理性质(即稠度)、药代动力学性质(即生物利用度)、药效动力学性质及其组合的任何惰性物质。

表达：如本文中所用，核酸序列的“表达”是指下列事件的一个或多个：(1)RNA模板从DNA序列的产生(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)RNA至多肽或蛋白质的翻译；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

补料分批培养：如本文所用，术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，在所述方法中，在培养过程开始后的某个时间给培养物提供额外的组分。所提供的组分通常包括已在培养过程中被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在某个点停止补料分批培养，并且收获培养基中的细胞和/或组分和任选地纯化其。

片段：如本文中所用，术语“片段”是指多肽，并且被定义为给定的多肽的任何分离的部分，所述部分对于该多肽是独特的，或具有该多肽的特征。如本文中所用，该术语还指给定的多肽的保留了全长多肽的至少一部分活性的任何分离的部分。优选地，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少10％。更优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。更优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的100％。如本文中所用，该术语还指包含至少在全长多肽中发现的已建立的序列元件的给定的多肽的任何部分。优选地，序列元件跨越全长多肽的至少4-5，更优选至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。

基因：如本文中所用，术语“基因”是指任何核苷酸序列DNA或RNA，所述核苷酸序列的至少某一部分编码分开的终产物，通常地(但不限于)多肽，所述产物在细胞过程的某一方面起作用。该术语并不意味仅指编码多肽或其它分离的终产物的编码序列，而且还可包括调节基础表达水平的编码序列之前和之后的区域，以及各个编码区段(“外显子”)之间的间插序列(“内含子”)。在一些实施方案中，基因可包括调节序列(例如，启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、终止序列、Kozak序列、TATA盒等)和/或修饰序列。在一些实施方案中，基因可包括对不编码蛋白质但相反地编码功能性RNA分子例如tRNA基因、RNAi诱导剂等的核酸的提及。

基因产物或表达产物：如本文中所用，术语“基因产物”或“表达产物”一般是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

基因控制元件：如本文中所用，术语“基因控制元件”是指调节与其可操作地连接的基因的表达的任何序列元件。基因控制元件可通过升高或降低表达水平来起作用，并且可位于编码序列之前、之内或之后。基因控制元件可通过调节例如转录的起始、延伸或终止、mRNA剪接、mRNA编辑、mRNA稳定性、细胞内mRNA的定位、翻译的起始、延伸或终止而在基因表达的任何阶段起作用或在基因表达的任何其它阶段起作用。基因控制元件可单独地或彼此组合地起作用。

同源性：如本文中所用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，则它们被认为是彼此“同源的”。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的相似性，则它们被认为是彼此“同源的”。

同一性：如本文中所用，“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。两个核酸序列的百分比同一性的计算，例如，可通过为了最佳比较目的而比对两个序列(例如，可在第一和第二核酸序列的一个或两个中引入缺口来进行最佳比对，并且为了比较目的可忽略不相同的序列)来进行。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度为参照序列的长度的至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大体上100％。随后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置上是相同的。通过考虑两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来实现。例如，例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4来测定，所述算法已被整合至ALIGN程序(2.0版)中。或者，可使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。各种其它序列比对程序是可用的，并且可被用来测定序列同一性，例如，Clustal。

提高、增加或减少：如本文中所用，术语“提高”、“增加”或“减少”或语法等同物，指示相对于基线测量，例如在本文中描述的治疗开始之前相同个体中的测量或在本文中描述的治疗不存在的情况下对照个体(或多个对照个体)中的测量的值。“对照个体”是患有与正在治疗的个体相同的溶酶体贮积病形式的个体，所述个体与正在治疗的个体年龄大致相同(以确保被治疗个体与对照个体的疾病分期是可比较的)。

积分活细胞密度：如本文中所用，术语“积分活细胞密度”是指整个培养过程中活细胞的平均密度乘以培养已进行的时间的量。假定产生的多肽或蛋白质的量与整个培养过程中存在的活细胞的数目成正比，则积分活细胞密度是用于估计整个培养过程中产生的多肽和/或蛋白质的量的有用工具。

鞘内施用：如本文中所用，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指至椎管内的注射(围绕脊髓的鞘内空间)。可使用各种技术，包括但不限于，通过钻孔的侧脑室注射或池穿刺或腰椎穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区域或腰部区的IT施用或递送，即腰IT施用或递送。如本文中所用，术语“腰部区”或“腰部区域”指的是第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区域，更包含地，脊椎的L2-S1区。

分离的：如本文中所用，术语“分离的”是指这样的物质和/或实体，所述物质和/或实体(1)已与当最初产生(无论是在自然界中还是在实验环境中)时与其结合的组分的至少一些分离，和/或(2)已通过人的手产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的与它们最初结合的其它组分分离。在一些实施方案中，分离物质具有约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或高于约99％的纯度。如本文中所用，如果物质基本上不含其它组分的话，则它是“纯的”。如本文中所用，分离的物质和/或实体的百分比纯度的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。

培养基：如本文中所用，该术语指包含有素滋养生长细胞的营养物的溶液。通常情况下，这些溶液提供了细胞进行最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。该溶液还可包含增强高于最小速率的生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。在一些实施方案中，将培养基配制为对于细胞存活和增殖是最佳的pH和盐浓度。在一些实施方案中，培养基可以是“化学成分确定的培养基”—不含蛋白质、水解产物或未知组合物的组分的无血清培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物来源的组分并且培养基中的所有组分具有已知的化学结构。在一些实施方案中，培养基可以是“基于血清的培养基”—已补充了动物来源的组分例如但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清和/或其组合的培养基。

代谢废产物：如本文所用，术语“代谢废产物”是指由细胞培养物作为正常或不正常的代谢过程的结果产生的化合物，所述化合物在某种程度上对细胞培养物是有害的，尤其是关乎期望的重组多肽或蛋白质的表达或活性。例如，代谢废产物可对细胞培养物的生长或活力有害，可减少产生的重组多肽或蛋白质的量，可改变表达的多肽或蛋白质的折叠、稳定性、糖基化或其它翻译后修饰，或可以以许多其它方式损害细胞和/或重组多肽或蛋白质的表达。示例性代谢废产物包括乳酸(其由葡萄糖代谢产生)和铵(其由谷氨酰胺代谢产生)。本发明的一个目的是在哺乳动物细胞培养物中减缓代谢废产物的产生，减少或甚至消除代谢废产物。

核酸：如本文中所用，术语“核酸”以其最广泛的意义是指为寡核苷酸链或可被并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是作为寡核苷酸链或可通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文所使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，具有除磷酸二酯骨架外的类似物。例如，所谓的“肽核酸”，其在本领域是已知的并且在骨架中具有肽键而非磷酸二酯键，被认为在本发明的范围之内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可以从天然来源中纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当情况下，例如，在化学合成分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，例如具有经化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'方向显示。术语“核酸区段”在本文中用于指作为更长的核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；嵌入碱基；修饰糖(例如，2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本发明特别针对“未修饰核酸”，意指未经历化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

克分子渗透压浓度和摩尔渗透压浓度：“摩尔渗透压浓度”是水溶液中溶解的溶质粒子的渗透压的量度。溶质粒子包括离子和非电离分子。摩尔渗透压浓度表达为溶解在1kg溶液中的渗透活性粒子的浓度(即，渗透压摩尔)(1mOsm/kg H₂O在38℃相当于19mm Hg的渗透压)。相比之下，"克分子渗透压浓度"是指溶解在1升溶液中的溶质粒子的数目。当在本文中使用时，缩写"mOsm"意指"毫渗透摩尔/kg溶液"。

灌注工艺：如本文中所用，术语“灌注工艺”是指其中在培养过程开始之后将另外的组分连续地或半连续地提供给培养物的培养细胞的方法。所提供的组分通常包括已在培养过程中被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的一部分细胞和/或组分并且任选地对其进行纯化。通常情况下，涉及灌注工艺的细胞培养过程被称为“灌注培养”。通常情况下，在灌注工艺过程中在新鲜培养基中提供营养补充剂。在一些实施方案中，新鲜培养基可与细胞培养过程中使用的基本培养基相同或相似。在一些实施方案中，新鲜的培养基可与基本培养基不同，但包含期望的营养补充剂。在一些实施方案中，新鲜培养基是化学成分确定的培养基。

蛋白质：如本文中所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，至少2个通过肽键彼此连接的氨基酸的串)。蛋白质可包括除氨基酸外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可另外地被加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是如由细胞产生的完整的多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其特征部分。在一些实施方案中，蛋白质有时可包括1个以上的多肽链，例如，通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。在一些实施方案中，多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以包含多种本领域已知的氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括，例如，末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指具有长度少于约100个氨基酸、少于约50个氨基酸、少于20个氨基酸或少于10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

重组蛋白和重组多肽：如本文中所用，这些术语是指从宿主细胞表达的多肽，所述宿主细胞已经被基因工程化以表达该多肽。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于昆虫的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于酵母的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于原核生物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于哺乳动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于人的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，所述重组表达的多肽可与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。在一些实施方案中，重组表达的多肽对于宿主细胞可以是外来的，即对于在宿主细胞中正常表达的肽是异源的。或者，在一些实施方案中，重组表达的多肽可以是嵌合的，因为多肽的部分包含与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主细胞是外来的。

替代酶：如本文中所用，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的疾病中的有缺陷或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的溶酶体贮积症中的有缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型溶酶体酶或经修饰的溶酶体酶并且可使用重组的和合成的方法来产生或从自然来源纯化而来。替代酶可以是重组的、合成的、基因活化的或天然的酶。

接种：如本文中所用，术语“接种”是指给生物反应器或另一个器皿提供细胞培养物以进行大规模细胞培养生产的过程。在一些实施方案中，使用“种子培养物”，其中在接种之前，已在更小的细胞培养皿即组织培养瓶、组织培养平板、组织培养滚瓶等中对细胞进行了增殖。或者，在一些实施方案中，细胞可能已被冷冻，并且解冻后立即将它们提供给生物反应器或器皿。该术语是指任何数目的细胞，包括单个细胞。

受试者：如本文中所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴儿。本发明还涵盖的是药物组合物的施用和/或子宫内治疗的方法的性能。

滴度：如本文中所用，术语“滴度”是指通过细胞培养产生的重组表达的肽或蛋白质的总量除以给定量的培养基体积。

载体：如本文中所用，“载体”指能够运输与其缔合的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体能够在宿主细胞例如真核和/或原核细胞中染色体外复制和/或表达与其连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。

活细胞密度：如本文中所用，术语“活细胞密度”是指每单位体积的活细胞的数目。

发明详述

本发明除其它事项以外提供了用于在无血清培养基中使用哺乳动物细胞的悬浮培养大规模生产重组I2S蛋白的方法和组合物。具体地，本发明使用共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞。

在以下小节中进一步详细地描述了本发明的各个方面。小节的使用并不意味着限制本发明。每一个小节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。

艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)

如本文中所用，I2S蛋白是可取代天然存在的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的至少部分活性或挽救一个或多个与I2S缺乏相关的表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的部分。如本文中所用，术语“I2S酶”和“I2S蛋白”以及语法等同物可互换使用。

通常情况下，人I2S蛋白作为前体形式产生。人I2S的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-25)、原肽(全长前体的氨基酸残基26-33)和一条链(全长前体的残基34-550)，所述链可被进一步加工成42kDa的链(全长前体的残基的34-455)和14kDa的链(全长前体的残基446-550)。通常情况下，前体形式也称为全长前体或全长I2S蛋白，其含有550个氨基酸。已除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和典型野生型或天然存在的人I2S蛋白的全长前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于表1中。信号肽加以下划线。此外，人I2S蛋白同种型a和b前体的氨基酸序列也分别提供于表1中的SEQ ID NO：3和4。

表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶

因此，在一些实施方案中，I2S酶为成熟人I2S蛋白(SEQ IDNO:1)。如本文中公开的，SEQ ID NO:1代表人I2S蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S蛋白可以是因在I2S基因的5’UTR内的可选择起始位点上的转录产生的SEQ ID NO:1的剪接同种型和/或变体。在一些实施方案中，适合的替代酶可以是成熟人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，成熟人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的I2S蛋白(例如，SEQ ID NO:1)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰成熟人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人I2S蛋白(SEQ IDNO:1)大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶包含成熟人I2S蛋白的片段或部分。

或者，I2S酶是全长I2S蛋白。在一些实施方案中，I2S酶可以是全长人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，全长人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的全长I2S蛋白(例如，SEQ ID NO:2)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰全长人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与全长人I2S蛋白(SEQ ID NO:2)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶与SEQ ID NO:2大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶包含全长人I2S蛋白的片段或部分。如本文中所用，全长I2S蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶为人I2S同种型a蛋白。在一些实施方案中，适合的I2S酶可以是人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型a蛋白(例如，SEQ IDNO:3)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型a蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与人I2S同种型a蛋白(SEQ ID NO:3)大体上同源。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S酶与SEQ ID NO:3大体上同一。在一些实施方案中，适用于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适用于本发明的I2S酶包含人I2S同种型a蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型a蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，I2S酶为人I2S同种型b蛋白。在一些实施方案中，I2S酶可以是人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型b蛋白(例如，SEQ ID NO:4)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型b蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与人I2S同种型b蛋白(SEQ ID NO:4)大体上同源。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S酶与SEQ IDNO:4大体上同一。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶包含人I2S同种型b蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型b蛋白通常包含信号肽序列。

人I2S蛋白的同源物或类似物可按照对于本领域普通技术人员来说是已知的用于改变多肽序列的方法，例如见于汇编此类方法的参考资料中的方法来制备。在一些实施方案中，氨基酸的保守取代包括在下列组内的氨基酸间的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方案中，“保守氨基酸取代”是指不改变在其中进行氨基酸取代的蛋白质的相关电荷或大小特征的氨基酸取代。

在一些实施方案中，I2S酶包含结合于细胞表面上的受体以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向的部分。例如，这样的受体可以是不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。此外，CI-MPR也结合其它蛋白质，包括IGF-Ⅱ。适合的溶酶体靶向部分可以是IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括那些具有与野生型成熟人IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列的肽)。在一些实施方案中，M6P残基结合的受体可以是阳离子依赖性的。

甲酰甘氨酸生成酶(FGE)

通常情况下，I2S的酶活性受保守半胱氨酸(例如，对应于成熟人I2S(SEQ ID NO:1)的氨基酸59)至甲酰甘氨酸的翻译后修饰影响，所述甲酰甘氨酸也被称为2-氨基-3-氧代丙酸或氧代-丙氨酸。这种翻译后修饰一般在蛋白质合成过程中发生于内质网中，并且由甲酰甘氨酸生成酶(FGE)催化。I2S的酶比活性通常与I2S具有甲酰甘氨酸修饰所达到的程度正相关。例如，具有相对高的甲酰甘氨酸修饰量的I2S蛋白制剂通常具有相对高的酶比活性；然而具有相对低的甲酰甘氨酸修饰量的I2S蛋白制剂通常具有相对低的酶比活性。

因此，适合于产生根据本发明的重组I2S蛋白的细胞通常表达FGE蛋白。在一些实施方案中，适合的细胞表达内源性蛋白FGE。在一些实施方案中，适合的细胞经工程化以表达与重组I2S组合的外源或重组的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。在一些实施方案中，适合的细胞经改造以激活内源FGE基因以便FGE蛋白的表达水平或活性升高。

通常情况下，人FGE蛋白产生为前体形式。人FGE的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-33)和链(全长前体的残基34-374)。通常情况下，前体形式也称为为全长前体或全长FGE蛋白，其含有374个氨基酸。除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)和典型野生型或天然存在的人FGE蛋白的全长前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)示于表2中。

表2.人甲酰甘氨酸生成酶(FGE)

因此，在一些实施方案中，适合本发明的FGE酶为成熟人FGE蛋白(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，适合的FGE酶可以是成熟人FGE蛋白的同源物或类似物。例如，成熟人FGE蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的FGE蛋白(例如，SEQ IDNO:5)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分FGE蛋白活性的修饰成熟人FGE蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与成熟人FGE蛋白(SEQ ID NO:5)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与成熟人FGE蛋白(SEQ ID NO:5)大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶包含成熟人FGE蛋白的片段或部分。

或者，适合本发明的FGE酶为全长FGE蛋白。在一些实施方案中，FGE酶可以是全长人FGE蛋白的同源物或类似物。例如，全长人FGE蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的全长FGE蛋白(例如，SEQ ID NO:6)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分FGE蛋白活性的修饰全长人FGE蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与全长人FGE蛋白(SEQ ID NO:6)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与SEQ ID NO:6大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶包含全长人FGE蛋白的片段或部分。如本文中所用，全长FGE蛋白通常包含信号肽序列。

编码示例性FGE蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列公开于US公开号20040229250中，其全部内容通过引用并入本文。

宿主细胞

如本文中所用，术语“宿主细胞”指可用于产生重组I2S酶的细胞。具体地，宿主细胞适合于大规模产生重组I2S酶。在一些实施方案中，宿主细胞能够以约5皮克/细胞/日的量或大于5皮克/细胞/日的量(例如，大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/日)产生I2S酶。在一些实施方案中，宿主细胞能够以在约5-100皮克/细胞/日(例如，约5-90皮克/细胞/日、约5-80皮克/细胞/日、约5-70皮克/细胞/日、约5-60皮克/细胞/日、约5-50皮克/细胞/日、约5-40皮克/细胞/日、约5-30皮克/细胞/日、约10-90皮克/细胞/日、约10-80皮克/细胞/日、约10-70皮克/细胞/日、约10-60皮克/细胞/日、约10-50皮克/细胞/日、约10-40皮克/细胞/日、约10-30皮克/细胞/日、约20-90皮克/细胞/日、约20-80皮克/细胞/日、约20-70皮克/细胞/日、约20-60皮克/细胞/日、约20-50皮克/细胞/日、约20-40皮克/细胞/日、约20-30皮克/细胞/日)的范围内的量产生I2S酶。在一些实施方案中，适合的宿主细胞不是内体酸化缺陷型细胞。

适合的宿主细胞可来源于多种生物体，包括但不限于哺乳动物、植物、鸟类(例如，禽系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可按照本发明将易于进行细胞培养和多肽表达的任何哺乳动物细胞用作宿主细胞。可按照本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚胎肾293细胞(HEK293)、HeLa细胞、BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC号：85110503)、人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands))、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人成纤维肉瘤细胞系(例如，HT-1080)、人胚肾系(经亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.,36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、小鼠支持细胞(sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞病毒(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)、人细胞系CAP和AGE1.HN.和Glycotope’小组。

此外，可按照本发明使用任何数目的可得的杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解，杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需要和/或可能需要不同的培养条件来进行最佳生长和多肽或蛋白质表达，并将能够根据需要来修改条件。

在一些实施方案中，宿主细胞是非哺乳动物细胞。适合于本发明的非哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括来源于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosacccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)(对于酵母)；草地夜蛾(Sodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusis ni)、黑腹果蝇(Drosophila melangoster)和烟草天蛾(Manduca sexta)(对于昆虫)；和大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣形芽孢杆菌(Bacillus lichenifonnis)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridia perfringens)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridia difficile)(对于细菌)；和来自两栖动物的非洲爪蟾(Xenopus Laevis)的细胞和细胞系。

载体和核酸构建体

可将各种核酸构建体用于在宿主细胞中表达本文中描述的I2S和/或FGE酶。适合的载体构建体，除了I2S和/或FGE蛋白编码序列(也称为I2S或FGE转基因)以外，通常还包含调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于蛋白质表达和任选地构建体复制的其它适当的序列。通常情况下，将编码区与这些核酸组件中的一个或多个可操作地连接。

“调控序列”通常是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响连接的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、5’非翻译序列、翻译前导序列、内含子和3’非翻译序列例如聚腺苷酸化识别序列。有时，“调控序列”也称为“基因控制序列”。

“启动子”通常是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3'。启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后一元件通常称为增强子。相应地，“增强子”为可刺激启动子活性，并且可以为启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的核苷酸序列。启动子可整体上来源于天然基因或由来源于天然发现的不同启动子的不同元件组成或甚至包含合成核苷酸区段。本领域普通技术人员应理解，不同的启动子可在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件来指导基因的表达。

“3’非编码序列”通常是指位于编码序列下游的核苷酸序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响聚腺苷酸段至mRNA前体的3'末端的添加。

“翻译前导序列”或“5’非编码序列”通常是指位于基因的启动子序列与编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。

通常情况下，术语“可操作地连接的”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的连接，以便一个核酸片段的功能受另一个核酸片段的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义定向可操作地连接于调控序列。

转基因的编码区可包含一个或多个沉默突变来优化用于特定细胞类型的密码子选择。例如，可优化I2S转基因的密码子以用于在脊椎动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化I2S转基因的密码子以用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化I2S转基因的密码子以用于在人细胞中表达。

任选地，构建体可包含另外的组件例如下列组件的一个或多个：剪接位点、增强子序列、在适当的启动子控制下的可选择标记基因、在适当的启动子控制下的可扩增标志基因和基质附着区(MAR)或本领域中已知的其它元件，所述元件增强其所被插入的区域的表达。

一旦转染或转导入宿主细胞后，适合的载体可在染色体外(附加型地)表达或整合进入宿主细胞的基因组。

在一些实施方案中，整合入细胞的基因组的DNA构建体，其需要仅包括转基因核酸序列。在该情况下，通常通过整合位点上的调控序列来控制转基因的表达。任选地，其可包括本文中描述的另外的各种调控序列。

培养基

如本文中所用，术语“培养基”和“培养介质”是指一般种类的包含适合于体外维持和/或生长细胞的营养物质的溶液。通常情况下，培养基溶液提供，但不限于，细胞进行至少最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。在其它实施方案中，培养基可包含来源于本领域已知的任何来源或方法的氨基酸，包括但不限于，来源于单个氨基酸添加或来源于蛋白胨或蛋白质水解产物添加(包括动物或植物来源)的氨基酸。维生素例如但不限于，生物素、泛酸盐、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、维生素B12、硫胺素、腐胺和/或其组合。盐例如但不限于，CaCl₂、KCl、MgCl₂、NaCl、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚硒酸钠、CuSO₄、ZnCl₂及其组合。脂肪酸例如但不限于，花生四烯酸、亚油酸、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸以及甲基-β-环糊精和/或其组合)。在一些实施方案中，培养基包含额外组分如葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠、胰岛素或乙醇胺、保护剂例如Pluronic F68。在一些实施方案中，培养基还可包含使生长和/或存活增强，高于最小速率的组分，包括激素和生长因子。培养基还可包含一种或多种缓冲剂。缓冲剂可被设计和/或选择来在特定pH(例如，生理pH值，(例如，pH 6.8至pH 7.4))下维持培养物。多种适合用于培养细胞的缓冲剂在本领域中是已知的并且可用于所述方法。适合的缓冲剂(例如，碳酸氢盐缓冲剂、HEPES缓冲剂、Good氏缓冲剂等)是指那些具有维持生理pH(尽管存在与细胞呼吸相关的二氧化碳浓度的变化)的能力和效率的缓冲剂。优选将溶液配制成对于细胞存活和增殖是最佳的pH和盐浓度。

在一些实施方案中，培养基可以是化学成分确定的培养基。如本文中所用，术语“化学成分确定的营养培养基”是指大体上全部化学成分都是已知的培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的营养培养基不含动物来源的组分。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如，蛋白生长因子或细胞因子)。在一些情况下，化学成分确定的营养培养基包含一种或多种蛋白质水解产物。在其它情况下，化学成分确定的营养培养基为不含蛋白质的培养基，即不含蛋白质、水解产物或未知组成的组分的无血清培养基。

通常情况下，通过以预定的重量或摩尔百分比或比率组合各种单独的组分例如必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质、盐、缓冲剂和微量元素来制备化学成分确定的培养基。示例性的无血清培养基，特别地化学成分确定的培养基描述于美国公开号2006/0148074中，其公开内容在此通过引用并入。

在一些实施方案中，适合于本发明的化学成分确定的培养基是商购可得的培养基，例如但不限于达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)、DMEM F12(1:1)、Ham营养混合物F-10、洛斯维帕克纪念研究所培养基(Roswell ParkMemorial Institute Medium,RPMI)、MCDB 131、William培养基E、CD CHO培养基CD 293培养基EX-CellCDCHO、Ex-Cell CDCHO Fusion、CD-OptiCHO、CD-FortiCHO、CDM4CHO、CD1000、BalanCD-CHO、IS-CHO-CD、CD杂交瘤、CD-DG44。在一些实施方案中，适合于本发明的化学成分确定的培养基为一种或多种商购可得化学成分确定的培养基的混合物。在各个实施方案中，适合的培养基为2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种商购可得化学成分确定的培养基的混合物。在一些实施方案中，每一种单独的商购可得化学成分确定的培养基(例如，如本文中描述的那些培养基)按重量计构成混合物的1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。每一种单独成分培养基之间的比率可通过存在于混合物中的相对重量百分比来确定。

在一些实施方案中，化学成分确定的培养基可补充以一种或多种动物来源的组分。此类动物来源的组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人血清和血清来源的蛋白质例如白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。

氧化还原调节剂

在一些实施方案中，适合的培养基包含一种或多种氧化还原调节剂。不希望受特定理论束缚，预期氧化还原调节剂可提高I2S的产量和/或活性，从而产生具有高水平的活性酶的重组I2S组合物。如本文中所用，“氧化还原调节剂”为影响混合物中的组分将获得电子并从而被还原的可能性的分子(例如，小分子、多肽等)。氧化还原调节剂可增加或减小混合物中的组分将获得电子并从而被还原的可能性。在一些实施方案中，氧化还原调节剂可以已存在于培养基中，例如，当从商购可得来源获得化学成分确定的培养基或可作为添加剂提供给培养基时。在一些情况下，根据本发明的培养基包含两种或更多种氧化还原调节剂。氧化还原调节剂的非限制性实例包括谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸、肌肽、鼠尾草酚、萝卜硫素、生育酚、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、硒、2-巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、核黄素、烟酸、叶酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、二硫苏糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。其它适当的氧化还原调节剂对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

在一些实施方案中，将半胱氨添加至本发明的培养基中，或其存在于所述培养基中。半胱氨酸可以以不同的浓度存在。在一些实施方案中，培养基中半胱氨酸的浓度在约0.1mg/L至约10mg/L、约1mg/L至约25mg/L、约10mg/L至约50mg/L、约25mg/L至约65mg/L、约10mg/L至约100mg/L或约25mg/L至约250mg/L的范围内。在一些实施方案中，半胱氨酸的浓度的在约0.1mg/L至约65mg/L(例如，1-50mg/L、1-40mg/L、1-30mg/l、1-20mg/L、1-10mg/L)的范围内。在一些情况下，培养基中半胱氨酸的浓度高达约0.1mg/L、约1mg/L、约5mg/L、约10mg/L、约20mg/L、约25mg/L、约50mg/L、约65mg/L、约75mg/L、约100mg/L或更高。

在一些实施方案中，将2-巯基乙醇添加至本发明的培养基中，或其存在于所述培养基中。可使用各种浓度。在一些实施方案中，2-巯基乙醇的浓度在约0.1nM至约0.001mM、约0.001mM至约0.01mM、约0.001mM至约0.1mM、约0.01mM至约0.1mM、约0.01mM至约1mM的范围内。在一些情况下，2-巯基乙醇的浓度高达约0.1nM、约0.001mM、约0.01mM、约0.1mM、约1mM或或更高。在一些实施方案中，2-巯基乙醇的浓度在约0.001mM至约0.01mM(例如，约0.001-0.008mM、约0.001-0.007mM、约0.001-0.006mM、约0.001-0.005mM、约0.001-0.004mM、约0.001-0.003mM、约0.001-0.002mM)的范围内。

在一些实施方案中，将N-乙酰半胱氨酸添加至本发明的培养基中，或其存在于所述培养基中。可使用各种浓度。在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的浓度可在约0.1mM至约1mM、约1mM至约10mM、约3mM至约9mM、约1mM至约50mM或约10mM至约50mM的范围内。在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的浓度在约3mM至约9mM(例如，约3-8mM、约3-7mM、约3-6mM、约3-5mM、约3-4mM)的范围内。在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的浓度可高达约0.1mM、约1mM、约3mM、约9mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM或更高。

生长调节剂

在一些实施方案中，培养基可包含一种或多种生长调节剂来提高I2S的产量。如本文中所用，术语“生长调节剂”是指影响细胞的生长的分子。生长调节剂可通过例如增强或诱导细胞增殖、细胞周期进展来增强细胞生长，或通过例如促进细胞周期停滞来减弱细胞生长。尽管商购可得培养基通常包含多种不同的生长调节剂，但在一些情况下期望向营养培养基提供额外的生长调节剂。因此，在一些实施方案中，向培养基添加一种或多种生长调节剂。

在一些情况下，适合于本发明的生长调节剂包括次黄嘌呤。在一些实施方案中，次黄嘌呤的浓度在约0.01mM至约0.1mM、约0.1mM至约1mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约10mM、约0.1mM至约100mM的范围内。在一些实施方案中，次黄嘌呤的浓度在约0.1mM至约10mM(例如，约0.1-9mM、约0.1-8mM、约0.1-7mM、约0.1-6mM、约0.1-5mM、约0.1-4mM、约0.1-3mM、约0.1-2mM、约0.1-1mM)的范围内。在一些情况下，次黄嘌呤的浓度为约0.01mM、约0.1mM、约1mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM或更高。

在一些情况下，适合于本发明的生长调节剂包括胸苷。在一些实施方案中，胸苷的浓度在约0.01mM至约0.1mM、约0.1mM至约1mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约10mM、约0.1mM至约100mM、约1mM至约100mM的范围内。在一些实施方案中，胸苷的浓度在约1mM至约100mM(例如，约1-90mM、约1-80mM、约1-70mM、约1-60mM、约1-50mM、约1-40mM、约1-30mM、约1-20mM、约1-10mM)的范围内。在一些实施方案中，胸苷的浓度为约0.01mM、约0.1mM、约1mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM或更高。

培养条件

本发明提供了大规模生产重组I2S的方法。用于产生目标重组多肽的常见大规模方法程序包括分批培养和补料分批培养。分批培养法常规地包括用特定细胞密度的种子培养物接种大规模生产培养物，在有益于细胞生长、活力和/或生产率的条件(例如，适合的培养基、pH和温度)下使细胞生长，当细胞达到指定的细胞密度时收获细胞，和纯化表达的多肽。补料分批培养法包括用营养物和在细胞生长过程中被消耗的其它组分补充分批培养物的额外步骤。在一些实施方案中，根据本发明的大规模生产方法使用补料分批培养系统。

培养起始

通常情况下，首先通过本领域普通技术人员公知的多种方法中的任何一种增殖期望的表达I2S蛋白的细胞。通常通过使细胞在对细胞的存活、生长和活力有益的温度下和培养基中生长来增殖所述细胞。初始培养体积可以是任何大小，但通常小于用于最终生产的生产生物反应器的培养体积，并且在接种生产生物反应器之前，通常将细胞以递增的培养体积传代数次。可搅拌或摇动细胞培养物以增强培养基的充氧作用和营养物至细胞的扩散。或者或另外地，可将本领域公知的特殊喷射装置用于增强和控制培养物的充氧作用。

可由本领域普通技术人员选择起始细胞密度。根据本发明，起始细胞密度可低至每培养体积单个细胞。在一些实施方案中，起始细胞密度可在约1X10²个活细胞/mL至约1X10³、1X10⁴、1X10⁵个活细胞/mL或更高的范围内。

可使初始和中间细胞培养物生长至任何期望的密度，随后接种下一个中间或终生产生物反应器。在一些实施方案中，接种生产生物反应器之前的终活力大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大。可以例如通过低速离心从上清液除去细胞。还可期望在接种下一个生物反应器之前用培养基洗涤取出的细胞以除去任何不想要的代谢废产物或培养基组分。培养基可以是先前使细胞在其中生长的培养基，或其可以是由本发明的实施者选择的不同的培养基或洗涤溶液。

随后可将细胞稀释至适当的密度以接种生产生物反应器。在一些实施方案中，将细胞稀释至将用于生产生物反应器的相同培养基中。或者，可将细胞稀释至另一种培养基或溶液中，这取决于本发明的实施者的需要和期望，或适应细胞本身的特殊需要，例如，如果在接种生产生物反应器之前将它们短期贮存的话。

生长期

通常情况下，在已如上所述接种生产生物反应器后，在有益于细胞培养物的存活、生长和活力的条件下在初始生长期维持细胞培养物。根据本发明，生产生物反应器可以是适合用于蛋白质的大规模生产的任何体积。参见下面的“生物反应器”小节。

主要基于细胞保持活力时所处的温度的范围来选择生长期中细胞培养的温度。可将生长期的温度维持在单一恒定的温度上或温度范围内。例如，在生长期期间中可稳定地升高或降低温度。一般地，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃(例如，30℃至40℃、约30℃至37℃、约35℃至40℃)的范围内生长良好。在一些实施方案中，于在约30-37℃(例如，约31-37℃、约32-37℃、约33-37℃、约34-37℃、约35-37℃、约36-37℃)的范围内的温度下培养哺乳动物细胞。通常情况下，在生长期期间中，细胞在约28℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃下生长。

可在初始生长期期间使细胞生长更多或更少量的时间，这取决于实施者的需要和细胞本身的要求。在一个实施方案中，使细胞生长持续足以获得为最大活细胞密度的给定百分比的活细胞密度的一段时间，如果使细胞不受干扰地生长，细胞最终可达到所述最大活细胞密度。例如，可使细胞生长持续足以获得为最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的期望活细胞密度的一段时间。

在一些实施方案中，使细胞生长持续确定的一段时间。例如，取决于细胞培养物的起始浓度、细胞生长所处的温度以及细胞的固有生长速率，可使细胞生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多日。在一些情况下，可使细胞生长一个月或更长时间。

在一些实施方案中，使细胞生长至期望的活细胞密度。例如，生长期结束时期望的活细胞密度大于约1.0X10⁶个活细胞/mL、1.5X10⁶个活细胞/mL、2.0X10⁶个活细胞/mL、2.5X10⁶个活细胞/mL、5X10⁶个活细胞/mL、10X10⁶个活细胞/mL、20X10⁶个活细胞/mL、30X10⁶个活细胞/mL、40X10⁶个活细胞/mL或50X10⁶个活细胞/mL。

可在初始培养期期间搅拌或摇动细胞培养物，以增强充氧作用或营养物至细胞的扩散。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，可有益地在初始生长期期间控制或调节生物反应器的某些内部条件，包括但不限于pH、温度、充氧作用等。例如，pH可通过提供适当量的酸或碱来控制，并且充氧作用可利用本领域公知的喷雾装置来控制。在一些实施方案中，用于生长期的期望的pH在约6.8–7.5(例如，约6.9-7.4、约6.9-7.3、约6.95-7.3、约6.95-7.25、约7.0-7.3、约7.0-7.25、约7.0-7.2、约7.0-7.15、约7.05-7.3、约7.05-7.25、约7.05-7.15、约7.05-7.20、约7.10-7.3、约7.10-7.25、约7.10-7.20、约7.10-7.15)的范围内。在一些实施方案中，用于生长期的期望的pH为约6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。

过渡期

在一些实施方案中，当细胞准备用于生产期时，可改变培养条件以最大化目标重组蛋白的产量。这样的培养条件变化通常在过渡期中发生。在一些实施方案中，这样的变化可以是许多培养条件包括但不限于温度、pH、克分子渗透压浓度和培养基中的一个或多个的偏移。在一个实施方案中，使培养物的pH偏移。例如，从生长期至生产期可增加或减小培养基的pH。在一些实施方案中，pH的该变化是快速的。在一些实施方案中，pH的该变化在长时间中缓慢发生。在一些实施方案中，通过添加碳酸氢钠调节pH的变化。在一些实施方案中，在过渡期开始时起始pH的变化，并在随后的生产期期间维持该pH。

在一个实施方案中，使细胞培养基的葡萄糖浓度偏移。根据本实施方案，在过渡期开始后，将细胞培养中的葡萄糖浓度调整至高于7.5mM的等级。

在一些实施方案中，从生长期至生产期将温度向上或向下偏移。例如，从生长期至生产期使温度向上或向下偏约0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃或更多。

生产期

根据本发明，在细胞培养物达到期望的细胞密度和活力，经历或不经历过渡期后，在有益于细胞培养物的存活和活力并且适合于以商业上足够的水平表达I2S和/或FGE蛋白的条件下，维持细胞培养物进行随后的生产期。

在一些实施方案中，在生产期期间，将培养物维持在低于生长期的温度或温度范围的温度或温度范围。例如，在生产期期间，细胞可在约25℃至35℃(例如，约28℃至35℃、约30℃至35℃、约32℃至35℃)的范围内良好地表达重组I2S和/或FGE蛋白。在一些实施方案中，在生产期期间，细胞可在约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃的温度下良好地表达重组I2S和/或FGE蛋白。在其它实施方案中，在生产期期间，将培养物维持在高于生长期的温度或温度范围的温度或温度范围。

另外地或可选择地，在生产期期间，将培养物维持在与生长期的pH或pH范围不同(更低或更高)的pH或pH范围。在一些实施方案中，用于生产期的培养基具有在约6.8–7.5(例如，约6.9-7.4、约6.9-7.3、约6.95-7.3、约6.95-7.25、约7.0-7.3、约7.0-7.25、约7.0-7.2、约7.0-7.15、约7.05-7.3、约7.05-7.25、约7.05-7.15、约7.05-7.20、约7.10-7.3、约7.10-7.25、约7.10-7.20、约7.10-7.15)的范围内的pH。在一些实施方案中，培养基具有约6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5的pH。

在一些实施方案中，可在整个生产过程中将细胞维持在期望的细胞密度范围内。例如，在细胞培养物的生产期期间，期望的活细胞密度在生产期期间可在约1.0-50X10⁶个活细胞/mL(例如，约1.0-40X10⁶个活细胞/mL、约1.0-30X10⁶个活细胞/mL、约1.0-20X10⁶个活细胞/mL、约1.0-10X10⁶个活细胞/mL、约1.0-5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-4.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-4X10⁶个活细胞/mL、约1.0-3.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-3X10⁶个活细胞/mL、约1.0-2.5X10⁶个活细胞/mL、约1.0-2.0X10⁶个活细胞/mL、约1.0-1.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-10X10⁶个活细胞/mL、约1.5-5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-4.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-4X10⁶个活细胞/mL、约1.5-3.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-3.0X10⁶个活细胞/mL、约1.5-2.5X10⁶个活细胞/mL、约1.5-2.0X10⁶个活细胞/mL)的范围内。

在一些实施方案中，可维持细胞进行足以获得为最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活细胞密度的时间。在一些情况下，可能期望使活细胞密度达到最大。在一些实施方案中，可能期望使活细胞密度达到最大，随后使活细胞密度降至一定程度，随后收获培养物。在一些实施方案中，生产期结束时的总活力低于约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％。

在一些实施方案中，在生产期期间使细胞生长确定的时间段。例如，取决于随后的生长期开始时细胞培养物的浓度、生长细胞时所处的温度和细胞的固有生长速率，可使细胞生长约5-90日(例如，约5-80日、约5-70日、约5-60日、约5-50日、约5-40日、约5-30日、约5-20日、约5-15日、约5-10日、约10-90日、约10-80日、约10-70日、约10-60日、约10-50日、约10-40日、约10-30日、约10-20日、约15-90日、约15-80日、约15-70日、约15-60日、约15-50日、约15-40日、约15-30日)。在一些实施方案中，生产期持续约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90日。

在一些实施方案中，将细胞维持在生产期，直至针对重组I2S蛋白的滴度达到最大。在其它实施方案中，可在该点之前收获培养物。例如，在一些实施方案中，将细胞维持在生产期，直至针对重组I2S蛋白的滴度达到期望的滴度。因此，针对重组I2S蛋白的期望平均收获滴度可以为至少6mg每升每日(mg/L/日)(例如，至少8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg/L/日或更多)。在一些实施方案中，针对重组I2S蛋白的期望平均收获滴度可在约6-500mg/L/日(例如，约6-400mg/L/日、约6-300mg/L/日、约6-200mg/L/日、约6-100mg/L/日、约6-90mg/L/日、约6-80mg/L/日、约6-70mg/L/日、约6-60mg/L/日、约6-50mg/L/日、约6-40mg/L/日、约6-30mg/L/日、约10-500mg/L/日、约10-400mg/L/日、约10-300mg/L/日、约10-200mg/L/日、约10-100mg/L/日、约10-90mg/L/日、约10-80mg/L/日、约10-70mg/L/日、约10-60mg/L/日、约10-50mg/L/日、约10-40mg/L/日、约10-30mg/L/日、约20-500mg/L/日、约20-400mg/L/日、约20-300mg/L/日、约20-200mg/L/日、约20-100mg/L/日、约20-90mg/L/日、约20-80mg/L/日、约20-70mg/L/日、约20-60mg/L/日、约20-50mg/L/日、约20-40mg/L/日、约20-30mg/L/日)的范围内。

另外或可选择地，在一定条件下使细胞维持在生产期，所述条件使得产生的重组I2S蛋白达到期望的C_α-甲酰甘氨酸(FGly)转化百分比。在一些实施方案中，产生的重组I2S蛋白包含至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的对应于人I2S蛋白的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

另外或可选择地，在一定条件下使细胞维持在生产期，所述条件使得产生的重组I2S蛋白达到期望的酶活性。如本领域技术人员可理解的，重组I2S蛋白的酶活性可通过各种体外和体内测定来测量。在一些实施方案中，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸酯释放活性测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性为至少约20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg或100U/mg。在一些实施方案中，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸酯释放活性测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性在约20-100U/mg(例如，约20-90U/mg、约20-80U/mg、约20-70U/mg、约20-60U/mg、约20-50U/mg、约20-40U/mg、约20-30U/mg、约30-100U/mg、约30-90U/mg、约30-80U/mg、约30-70U/mg、约30-60U/mg、约30-50U/mg、约30-40U/mg、约40-100U/mg、约40-90U/mg、约40-80U/mg、约40-70U/mg、约40-60U/mg、约40-50U/mg)的范围内。下文中提供了用于使用肝素二糖作为底物进行体外硫酸酯释放活性测定的示例性条件。通常情况下，该测定测量I2S从天然来源的底物肝素二糖释放硫酸根离子的能力。所释放的硫酸酯可通过离子色谱法来进行定量。在一些情况下，离子色谱法配备有电导率检测器。作为一个非限制性实例，首先将样品缓冲交换至10mM乙酸钠(pH6)，以解除配制缓冲液中磷酸根离子产生的抑制作用。随后用反应缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.4)将样品稀释至0.075mg/ml，并在37℃于30μL反应体积中以0.3μg I2S/100μg底物的酶与底物比与肝素二糖温育2小时。然后通过在100℃加热3分钟来终止反应。使用具有IonPac AG18保护柱的Dionex IonPac AS18分析柱进行分析。以1.0毫升/分钟将等度方法与30mM氢氧化钾一起使用，持续15分钟。从在1.7至16.0纳摩尔的范围内的硫酸酯标准的线性回归分析计算由I2S样品释放的硫酸酯的量。该报告值表达为单位每mg蛋白质，其中1个单位定义为每小时释放的1微摩尔的硫酸酯，并且蛋白质浓度通过A280测量来测定。

在一些实施方案中，还可使用本领域已知的各种其它方法，例如测量4-甲基伞形酮基-硫酸酯至硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的水解的4-MUF测定来测定重组I2S蛋白的酶活性。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性为至少约2U/mg、4U/mg、6U/mg、8U/mg、10U/mg、12U/mg、14U/mg、16U/mg、18U/mg或20U/mg。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性在约0-50U/mg(例如，约0-40U/mg、约0-30U/mg、约0-20U/mg、约0-10U/mg、约2-50U/mg、约2-40U/mg、约2-30U/mg、约2-20U/mg、约2-10U/mg、约4-50U/mg、约4-40U/mg、约4-30U/mg、约4-20U/mg、约4-10U/mg、约6-50U/mg、约6-40U/mg、约6-30U/mg、约6-20U/mg、约6-10U/mg)的范围内。下文中提供了用于进行体外4-MUF测定的示例性条件。通常情况下，4-MUF测定测量I2S蛋白将4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)水解成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的能力。1毫单位的活性被定义为在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-MUF-SO₄转化成4-MUF所需的酶的量。通常情况下，通过具有已知活性的I2S测试样品产生的平均荧光单位(MFU)可用于产生标准曲线，该曲线可被用来计算目标样品的酶活性。

在一些实施方案中，可能有益的或必需的是在生产期期间利用营养物或已被细胞耗尽或代谢的其它培养基组分补充细胞培养物。例如，可能有利的是利用营养物或经观察在细胞培养过程中已被耗尽的其它培养基组分补充细胞培养物。可选择地或另外地，可有益的或必需的是在生产期之前补充细胞培养物。作为非限制性实例，可有益的或必需的是用氧化还原调节剂、生长调节剂(例如，激素和/或其它生长因子)、特定离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其它能量来源补充细胞培养物。

可一次将这些补充组分全部添加至细胞培养物或可以一系列添加中将它们提供给细胞培养物。在一些实施方案中，将补充组分按比例量在多个时间点提供给细胞培养物。在其它实施方案中，用这些补充组分连续供给细胞培养物。通常情况下，该过程称为灌注，并且牵涉灌注的细胞培养称为“灌注培养”。如本文中所用，术语“灌注培养”是指其中在培养过程开始后连续或半连续地给培养物提供额外的组分的培养细胞的方法。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的一部分细胞和/或组分，并且任选地对其进行纯化。

在一些实施方案中，在生产期期间通过灌注工艺连续地交换培养基。通常情况下，每日相对于反应器的工作体积的新鲜培养基的体积(VVD)被定义为灌注速率。可根据本发明使用不同的灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有这样的灌注速率，以便可将添加至细胞培养物的总体积保持在最少量。在一些实施方案中，灌注工艺具有在约0.5-2新鲜培养基的体积/反应器的工作体积/日(VVD)(例如，约0.5-1.5VVD、约0.75-1.5VVD、约0.75-1.25VVD、约1.0-2.0VVD、约1.0-1.9VVD、约1.0-1.8VVD、约1.0-1.7VVD、约1.0-1.6VVD、约1.0-1.5VVD、约1.0-1.4VVD、约1.0-1.3VVD、约1.0-1.2VVD、约1.0-1.1VVD)的范围内的灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有约0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95或2.0VVD的灌注速率。

灌注工艺还可通过每日每种细胞添加的新鲜培养基的体积来表征，其定义为细胞比灌注速率。可使用不同的细胞比灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有在约0.05-5纳升每种细胞每日(nL/细胞/日)(例如，约0.05-4nL/细胞/日、约0.05-3nL/细胞/日、约0.05-2nL/细胞/日、约0.05-1nL/细胞/日、约0.1-5nL/细胞/日、约0.1-4nL/细胞/日、约0.1-3nL/细胞/日、约0.1-2nL/细胞/日、约0.1-1nL/细胞/日、约0.15-5nL/细胞/日、约0.15-4nL/细胞/日、约0.15-3nL/细胞/日、约0.15-2nL/细胞/日、约0.15-1nL/细胞/日、约0.2-5nL/细胞/日、约0.2-4nL/细胞/日、约0.2-3nL/细胞/日、约0.2-2nL/细胞/日、约0.2-1nL/细胞/日、约0.25-5nL/细胞/日、约0.25-4nL/细胞/日、约0.25-3nL/细胞/日、约0.25-2nL/细胞/日、约0.25-1nL/细胞/日、约0.3-5nL/细胞/日、约0.3-4nL/细胞/日、约0.3-3nL/细胞/日、约0.3-2nL/细胞/日、约0.3-1nL/细胞/日、约0.35-5nL/细胞/日、约0.35-4nL/细胞/日、约0.35-3nL/细胞/日、约0.35-2nL/细胞/日、约0.35-1nL/细胞/日、约0.4-5nL/细胞/日、约0.4-4nL/细胞/日、约0.4-3nL/细胞/日、约0.4-2nL/细胞/日、约0.4-1nL/细胞/日、约0.45-5nL/细胞/日、约0.45-4nL/细胞/日、约0.45-3nL/细胞/日、约0.45-2nL/细胞/日、约0.45-1nL/细胞/日、约0.5-5nL/细胞/日、约0.5-4nL/细胞/日、约0.5-3nL/细胞/日、约0.5-2nL/细胞/日、约0.5-1nL/细胞/日)的范围内的细胞比灌注速率。在一些实施方案中，灌注工艺具有约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0nL/细胞/日的细胞比灌注速率。

可在生产期期间搅拌或摇动细胞培养物，以增强充氧作用或营养物至细胞的扩散。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，可有益的是在生长期期间控制或调节生物反应器的某些内部条件，包括但不限于pH、温度、充氧作用等。例如，pH可通过提供适当量的酸或碱来控制，并且充氧作用可利用本领域公知的喷雾装置来控制。还可提供一种或多种消泡剂。

可在整个生产过程(包括生长期、生产期和灌注)中使用相同培养基。在一些实施方案中，在重组I2S的生产中使用至少2种不同的培养基。例如，配制用于细胞生长的营养培养基通常被用来在整个细胞生长期中支持细胞的生长，而配制用于蛋白质生产的营养培养基在生产期期间被用来支持I2S的表达和收获。在任一情况下，营养培养基可以包含或可以不包含血清或其它动物来源的组分(例如，胎球蛋白)。

根据本发明，通常使细胞悬浮生长。然而，可将细胞附着于基质。在一个实例中，可将细胞附着于悬浮于营养培养基中的微珠或粒子。

生物反应器

本发明还提供了用于产生重组艾杜糖2-硫酸酯酶的生物反应器。生物反应器可以例如是灌注、分批、补料分批、重复分批或连续型(例如，连续搅拌釜式反应器型)。通常情况下，生物反应器包括至少一个被设计和配置来装载培养基(例如，化学成分确定的营养培养基)的器皿。器皿通常还包括至少一个被设计和配置来将新鲜营养培养基流入器皿的进口。器皿通常还包括至少一个被设计和配置来将废培养基流出器皿的出口。在一些实施方案中，器皿还可包括至少一个被设计和配置来使器皿中的分离的细胞经由至少一个出口随废培养基泄放的程度最低的过滤器。还可给生物反应器配备一个或多个被设计来维持适合于细胞生长的条件的其它组件。例如，可给生物反应器配备一个或多个被设计和配置来在器皿内循环或混合营养培养基的循环或混合装置。通常情况下，将经工程化表达重组I2S的分离的细胞悬浮于营养培养基中。从而，在一些情况下，循环装置确保分离的细胞悬浮保留在营养培养基中。在一些情况下，将细胞附着于基质。在一些情况下，将细胞附着于一种或多种悬浮于营养培养基中的基质(例如，微珠)。生物反应器可包括一个或多个用于从器皿获得细胞悬浮液的样品的端口。可用一个或多个用于监测和/或控制培养条件的组件来配置生物反应器，所述培养条件包括以下条件诸如气体(例如，空气、氧气、氮气、二氧化碳)含量、流速、温度、pH和溶解氧水平以及搅拌速度/循环速率。

具有任何适当尺寸的器皿可用于生物反应器。通常情况下，器皿尺寸适合用于满足制造重组I2S的生产需要。在一些实施方案中，器皿被设计和配置来包含多达1L、多达10L、多达100L、多达500L、多达1000L、多达1500L、多达2000L或更多的营养培养基。在一些实施方案中，生产生物反应器的体积为至少10L、至少50L,100L、至少200L、至少250L、至少500L、至少1000L、至少1500L、至少2000L、至少2500L、至少5000L、至少8000L、至少10,000L或至少12,000L或更多或其间的任意体积。生产生物反应器可由对细胞生长和活力有益的，不干扰产生的I2S蛋白的表达或稳定性或活性的任意材料构成。示例性材料可包括但不限于玻璃、塑料或金属。

在一些实施方案中，可将细胞培养于装载在生物器的器皿中的化学成分确定的培养基中。培养方法通常包括将新鲜营养培养基通过至少一个进口灌注入器皿和通过至少一个出口将废营养培养基从器皿泄放。泄放以高达约0.1个器皿体积/日、约0.2个器皿体积/日、约0.3个器皿体积/日、约0.4个器皿体积/日、约0.5个器皿体积/日、约1个器皿体积/日、约1.5个器皿体积/日或更高的速率进行。所述方法还包括收获包含重组I2S的营养培养基。收获可以以高达约0.1个器皿体积/日、约0.2个器皿体积/日、约0.3个器皿体积/日、约0.4个器皿体积/日、约0.5个器皿体积/日、约1个器皿体积/日、约1.5个器皿体积/日或更高的速率进行。灌注还通常以等于泄放速率和收获速率的总和的速率进行。例如，灌注速率可大于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0个器皿体积/日。在一些实施方案中，灌注速率少于约5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5个器皿体积/日。示例性灌注速率描述于整个说明书中。

监测培养条件

在本发明的某些实施方案中，实施者可发现有益的或必需的是定期监测使细胞培养物生长的特定条件。监测细胞培养条件允许实施者确定细胞培养物是否正在以次优水平产生重组多肽或蛋白质，或培养物是否将进入次优生产期。为了监测某些细胞培养条件，将有必要取出培养物的小等份试样进行分析。

作为非限制实例，有益的或必需的是监测温度、pH、细胞密度、细胞活力、积分活细胞密度、克分子渗透压浓度或表达的I2S蛋白的滴度或活性。允许本领域普通技术人员测量这些条件的许多技术在本领域是公知的。例如，可使用血细胞计数器、库尔特计数器(Coultercounter)或细胞密度检查(CEDEX)来测量细胞密度。活细胞密度可以通过用台盼蓝(Trypan blue)是培养样品染色来测定。由于只有死细胞吸收台盼蓝，因此活细胞密度可通过计数细胞总数，将吸收染料的细胞数目除以细胞总数，并取倒数来确定。或者，表达的I2S蛋白的水平可通过标准分子生物学技术例如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色、Western印迹、Bradford测定、Lowry测定、Biuret测定和UV吸收来测定。也可能有益地或必需的是监测表达的I2S蛋白的翻译后修饰，包括磷酸化和糖基化。

表达的I2S蛋白的纯化

各种方法可用于纯化或分离根据本文所述的各种方法产生的I2S蛋白。在一些实施方案中，表达的I2S蛋白被分泌至培养基中，从而可以例如通过离心或过滤(例如，作为纯化过程的第一步骤)除去细胞和其他固体。或者或另外地，将表达的I2S蛋白结合在宿主细胞的表面上。在本实施方案中，将表达多肽或蛋白质的宿主细胞(例如，酵母细胞)裂解以进行纯化。宿主细胞例如，酵母细胞)的裂解可以通过本领域普通技术人员公知的许多方法，包括利用玻璃珠进行的物理破碎和对高pH条件的暴露来实现。

可通过标准方法(包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心或差异溶解度、乙醇沉淀)或通过任何其它可获得的用于蛋白质纯化的技术(参见，例如Scopes,Protein Purification Principles and Practice第2版，Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编辑)，Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；和Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编辑)，Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series，第182卷),Academic Press,1997，将所有参考资料通过引用并入本文)分离和纯化I2S蛋白。对于具体地免疫亲和色谱法，可通过将蛋白质结合于包含抗体的亲和柱来使其分离，所述抗体是针对该蛋白质产生的并且被附着至固定载体。或者，可通过标准重组技术将亲和标签例如流感病毒衣壳蛋白序列、多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶连接于蛋白质，以使其通过在适当的亲和柱上通过来容易地纯化。可以在任何或所有阶段添加蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮肽素、胃酶抑素或抑肽酶以在纯化过程中减少或消除所述多肽或蛋白质的降解。当必需裂解细胞以分离和纯化表达的多肽或蛋白质时，特别想要蛋白酶抑制剂。

示例性纯化方法描述于下面的实施例部分中。另外的纯化方法描述于与其同一日提交的标题为“重组I2S蛋白的纯化(Purification ofRecombinant I2S Protein)”的临时申请中，所述临时申请的全部公开内容通过引用并入本文。

药物组合物和施用

可按照已知的方法向亨特综合症患者施用纯化的重组I2S蛋白。例如，可静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))递送纯化的重组I2S蛋白。

在一些实施方案中，可通过静脉内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。

在一些实施方案中，通过鞘内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。如本文中所用的，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指至椎管(围绕脊髓的鞘内空间)内的注射。可使用各种技术，包括但不限于，通过钻孔的侧脑室注射或池穿刺或腰椎穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区或区域的IT施用或递送，即腰IT施用或递送。如本文中所用，术语“腰部区域”或“腰部区”指的是第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区，更包含地，脊椎的L2-S1区域。

在一些实施方案中，通过皮下(即皮肤下方)向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。为此目的，可使用注射器注射制剂。然而，用于该制剂的施用的其它装置是可获得的，例如注射装置(例如，Inject-ease^TM和Genject^TM装置)；注射器笔(例如GenPen^TM)；无针装置(例如，MediJector^TM和BioJector^TM)；和皮下贴片递送系统。

在一些实施方案中，可将鞘内施用与其他施用途径(例如，静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))一起使用。

本发明设想了治疗有效量的本文中描述的重组I2S或包含所述重组I2S的药物组合物的单次以及多次施用。可定期施用重组I2S或包含其的药物组合物，这取决于受试者的病况(例如，溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度。在一些实施方案中，可定期(例如，每年一次，每六个月一次，每五个月一次，每三个月一次，每两月一次(每两个月一次)，每月一次(每个月一次)，每两周一次(每隔两周一次)，每周一次，每日一次或连续地)周期性施用治疗有效的量的重组I2S或包含其的药物组合物。

可用生理上可接受的载体或赋形剂配制重组I2S或包含其的药物组合物以制备药物组合物。载体和治疗剂可以是无菌的。所述制剂应该适合施用模式。

适合的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖例如甘露醇、蔗糖或其他糖、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等及其组合。必要时，可将药物制剂与助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，所述助剂其不与活性化合物产生不利反应或干扰它们的活性。在一些实施方案中，使用适合于静脉内施用的水溶性载体。

必要时，组合物或药剂还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂。还可利用常规粘合剂和载体如甘油三酯将组合物配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可按照常规程序将组合物或药剂配制为适于向人类施用的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，单独地提供成分或以单位剂型将成分混合在一起，例如，作为标明活性剂的量的密闭容器例如安瓿或小袋中的干燥的冻干粉剂或无水浓缩物。当将通过输注施用组合物时，可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶分配所述组合物。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水以便可在施用前混合成分。

如本文中所用，主要基于本发明的药物组合物中包含的治疗剂的总量确定术语“治疗有效量”。通常，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在的疾病或病症)。例如，治疗有效量可以是足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或它们的活性，从而治疗这样的溶酶体贮积病或其症状(例如，在向受试者施用本发明的组合物后减少或消除“斑状体”或细胞空泡形成的存在或发生率)的量。通常地，向需要其的受试者施用的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这样的特征包括受试者的状态、疾病的严重度、一般健康状况、年龄、性别和体重。取决于这些和其他相关因素，本领域普通技术人员将能够容易地确定适当的剂量。此外，可任选地将客观和主观测定用于鉴定最佳剂量范围。

通常在可包括多个单位剂量的给药方案中施用治疗有效量。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如取决于施用途径、取决于与其它药剂的组合而变化。同样地，对于任何特定患者的具体的治疗有效量(和/或单位剂量)还可取决于多种因素，包括被治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或使用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及在医学领域中公知的类似因素。

另外的示例性药物组合物和施用方法描述于标题为“用于艾杜糖-2-硫酸酯酶的CNS递送的方法和组合物(Methods and Compositionsfor CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase)”的PCT公布WO2011/163649；和2012年3月30日提交的标题为“艾杜糖醛酸2硫酸酯酶的皮下施用(Subcutaneous administration of iduronate 2sulfatase)”的临时申请序列号61/618,638，将这两者的全部公开内容通过引用并入本文。

应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和施用或监督酶替代疗法的施用的人的专业判断来随时间调整具体剂量方案，并且本文中所陈述的剂量范围仅是示例性的并且无意限定本发明的范围或实践。

实施例

实施例1.共表达重组I2S和FGE的最优化的细胞系的产生

本实施例举例说明可用于产生重组I2S蛋白的共表达重组I2S和FGE的示例性细胞系。对于本领域技术人员将很明确的是许多替代方法、表达载体和克隆技术是可获得的。

人艾杜糖的2-硫酸酯酶(I2S)的典型成熟形式是525个氨基酸的糖蛋白，其经历大量的加工和翻译后修饰以进行酶的激活，如糖基化和半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化(图1)。在哺乳动物细胞中，I2S酶内的保守半胱氨酸残基(即，在氨基酸59上)通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)被转化为甲酰甘氨酸。I2S酶的活性位点内的半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化是产生人硫酸酯酶的活性形式中的一个重要步骤。本实验的目的是工程化共表达I2S和FEG的最优化人细胞系以用于产生活性重组I2S。

图2举例说明了许多用于共表达I2S和FGE的示例性构建体设计。例如，I2S和FGE的表达单位可以位于单独的载体，并且可共转染或单独转染单独的载体(图2A)。或者，I2S和FGE的表达单位可以位于同一载体(图2B)。在一种配置中，I2S和FGE可以在相同的载体上，但在单独的启动子控制下，也被称为单独的顺反子(图2B(1))。或者，I2S和FGE可以设计为转录连接的顺反子，即，I2S和FGE被设计为在相同启动子控制下的一个开放阅读框(图2B(2))。通常情况下，内部核糖体进入位点(IRES)被设计来允许在信使RNA(mRNA)的中部起始翻译(图2B(2))。

将人细胞系工程化以共表达具有SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列的人I2S蛋白和具有SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的人甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。

SEQ ID NO：2

＞全长前体艾杜糖-2-硫酸酯酶

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVA|YNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP

SEQ ID NO：6

全长人FGE前体：

MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD

通过人CMV启动子控制I2S和FGE表达。I2S mRNA的翻译导致550个氨基酸的全长I2S蛋白(SEQ ID NO:2)的合成，所述蛋白质包含25个氨基酸的信号肽。除去信号肽，并且从细胞分泌可溶性酶。

将细菌新霉素磷酸转移酶(neo)编码序列和/或杀稻瘟菌素S(Blasticidin S)脱氨酶(BSD)基因用于使得能够分别使用新霉素类似物G418和/或杀稻瘟菌素选择转染的细胞。此外，在I2S和/或FGE编码载体上使用小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因以允许通过甲氨蝶呤(MTX)选择来分离包含增加的拷贝的I2S和/或FGE编码序列的细胞系。

分离产生I2S的细胞，并使其经历适当的药物选择来分离具有增加的拷贝数的转染的I2S和/或FGE基因的细胞。通过ELISA进行I2S的定量。

也使细胞群在甲氨蝶呤(MTX)中经历分步选择以分离具有增加的I2S生产率的细胞。在MTX选择期间通过ELISA监控I2S的生产率。

经过多轮扩增后，随后通过从包含10％小牛血清的DMEM逐步减少至无血清的化学成分确定的培养基，使几个产生I2S的克隆在无血清培养基中经历悬浮培养适应。通过有限稀释克隆建立几个单独的克隆群体。通过I2S酶活性测定和ELISA筛选菌落。两个稳定的细胞系2D和4D显示高百分比的活力和I2S的强劲表达，并且被选择用于进一步开发。

实施例2.无血清悬浮细胞培养

本实施例证明可将无血清细胞培养系统用于成功地培养共表达I2S和FGE的细胞系以产生重组I2S。

产生种子培养物

简言之，使用实施例1的2D或4D细胞系建立种子培养物。将细胞转移至250ml装有无血清化学成分确定的扩增培养基(补充有甲氨蝶呤(以用于选择)，用碳酸氢钠调整至pH 7.3)的通风组织培养摇瓶，并在标准条件下生长。

细胞培养扩增

在达到期望的活细胞密度后，将初始种子培养物用于接种由500ml组织培养摇瓶，随后2x 1L组织培养摇瓶组成的一系列分步细胞培养扩增的第一组织培养摇瓶。在每一种情况下，在达到期望的细胞密度后，将先前的细胞培养物以其整体转移来接种随后更大的培养瓶。

通过将每一个2x1L的培养物转移到10L Cellbag(Wave Europe)，并添加扩增培养基至2.5kg的终重量来进行分批培养扩增。在达到期望的细胞密度后，添加新的扩增培养基至5.0kg的终重量，并使细胞生长至期望的密度。将10L Cellbag转移到Wave系统(Wave Europe)，并改变培养条件以允许在连续培养基灌注的条件下生长。以5.0L/日(1.0vvd)的靶重量递送扩增生长培养基，并收集样品以进行pH、谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、铵、乳酸盐、pCO₂和克分子渗透压浓度的离线代谢物分析。

在达到期望的细胞密度后，将整个10L的细胞培养物转移至包含20kg新鲜的扩增培养基的50L Wave Cellbag并再次生长至期望的细胞密度。

生物反应器扩增

随后使用200L的一次性生物反应器和离心灌注装置(CELL II单位，Pneumatic Scale Corporation)进行细胞扩增，所述装置被设计来浓缩细胞和澄清培养基，以在灌注介导的细胞培养过程中再循环。用足以获得期望的细胞密度的50L培养物的一部分接种扩增培养基。

随后，将200L培养物的一部分用于接种2000L一次性生物反应器和离心机灌注装置(CELL II单位，Pneumatic ScaleCorporation)中。使细胞在分批生长条件下生长2天。在为期2天的生长后，调整条件以进行连续灌注，从而开始过渡期的起始。

生物反应器生产

对于生产期，使用2个Centritech CELL II单位。在过渡期开始后约24小时(细胞通常在该时间点已达到期望的细胞密度)开始生产期。通过调节泄放速率来维持细胞密度持续期望的生产时间。

实施例3.无血清细胞培养中产生的重组I2S酶的生理化学和生物学表征

本实施例的目的是进行使用上述无血清细胞培养法产生的重组I2S蛋白的详尽表征。

SDS-PAGE

关于本实验，使用上述方法在两个单独的无血清细胞培养反应中，使用2D和4D人细胞系产生重组I2S蛋白。在生产期期间收集样品，通过SDS-PAGE分析纯化的I2S酶，并用银染处理以使其可视。图3显示，在每一个单独的制造实验中，在无血清条件下从2D和4D细胞系产生的I2S蛋白迁移适当的尺寸(泳道5和6)上，如在与蛋白质分子量标准(泳道1)和商购可得I2S测定对照(泳道2和3)比较后指示的。此外，在无血清条件(泳道5和6)下产生的重组I2S也迁移与I2S参考标准(泳道4)相同的尺寸。

肽图谱

使用在上述无血清培养条件下生长的I2S-AF 2D细胞系产生重组I2S蛋白。将从I2S-AF 2D细胞系产生的分离的重组I2S和参考人I2S的样品各自经历蛋白质水解消化(例如，通过胰蛋白酶)，并且通过HPLC分析进行检查。示例性结果示于图4中。

甲酰甘氨酸转化百分比

肽图谱可用于确定FGly转化百分比。I2S活化需要通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)进行的半胱氨酸(对应于成熟人I2S的位置59)至甲酰甘氨酸的转化，如下文中显示的：

因此，甲酰甘氨酸转化的百分比(％FG)可以使用下列公式计算：

例如，50％FG意指一半纯化的重组I2S无酶活性而没有任何治疗效果。

肽图谱用于计算％FG。简言之，使用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或糜蛋白酶)将重组I2S蛋白消化成短肽。使用HPLC分离和表征短肽。表征包含对应于成熟人I2S的位置59的位置的肽以确定相较于对照(例如，无FGly转化的I2S蛋白或具有100％FGly转化的I2S蛋白)位置59上的Cys是否被转化成FGly。可基于对应的峰面积测定包含FGly的肽的量(对应于活性I2S分子的数目)和具有FGly和Cys的肽的总量(对应于总的I2S分子的数目)，并计算反映％FG的比率。示例性结构示于表4中。

聚糖图谱-甘露糖-6磷酸和唾液酸含量

测定在无血清细胞培养条件下产生的重组I2S蛋白的聚糖和唾液酸组成。使用阴离子交换色谱法进行聚糖组成的定量。如下所述，在这些条件下产生的重组I2S的聚糖图谱由七个峰群组成，根据递增量的负电荷(至少部分地因酶消化而从唾液酸和甘露糖-6-磷酸糖型产生)洗脱。简言之，使用如下方式处理利用无血清细胞培养方法(I2S-AF2D无血清和I2S-AF 4D无血清)获得的纯化的重组I2S和产生的参照重组I2S：(1)使用纯化的神经氨酸酶(分离自产脲节杆菌(ArthrobacterUreafaciens)(10mU/μL)，Roche Biochemical(Indianapolis,IN)，目录号269611(1U/100μL))以除去唾液酸残留物，(2)在37±1℃用碱性磷酸酶处理2小时以完全释放甘露糖-6-磷酸残留物，(3)碱性磷酸酶+神经氨酸酶或(4)无处理。使用配备有Dionex CarboPac PA1保护柱的CarboPac PA1分析柱，通过利用脉冲安培检测(HPAE-PAD)的高效阴离子交换色谱法分析每一种酶消化。对于每一种测定，运行一系列在0.4至2.0纳摩尔的范围内的唾液酸和甘露糖-6-磷酸标准。在环境柱温度下将使用在100mM氢氧化钠中的48mM乙酸钠的等度方法以1.0毫升/分钟的流速运行至少15分钟，以洗脱每个峰。将从每个单独的运行产生的I2S-AF和参照I2S样品的数据分别组合成单个色谱来表示每个相应的重组蛋白的聚糖图谱。如图5中显示的，使用人细胞系无血清法产生的I2S的示例性聚糖图谱显示构成中性、单、双唾液酸化、单磷酸化、三唾液酸化和混合(单唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)、四唾液酸化和混合(双唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)以及二磷酸化聚糖的代表性洗脱峰(按洗脱顺序)。

从唾液酸标准的线性回归分析计算每一个重组I2S样品的平均唾液酸含量(摩尔唾液/摩尔蛋白质)。使用PeakNet 6软件使每一个色谱图运行可见。唾液酸标准和从重组I2S测定对照和测试样品释放的唾液酸显现为单个峰。使用下列公式将I2S的唾液酸(纳摩尔)的量计算为原始值：

其中C为样品或重组I2S测定对照的蛋白质浓度(以mg/ml表示)。

使用下列公式计算每一个测试样品的表示为每摩尔蛋白质的唾液酸的摩尔数的唾液酸的校正值：

表示由I2S-AF 2D或4D细胞系产生的重组I2S上的唾液酸含量的示例性数据示于表4中。

表4:无血清细胞培养物中产生的重组I2S的示例性表征

比活性

使用体外硫酸酯释放测定或4-MUF测定分析在无血清细胞培养条件下使用2D和4D细胞系产生的重组I2S酶的比活性。

体外硫酸酯释放活性测定

体外硫酸酯释放活性测定使用肝素二糖作为底物来进行。具体地，该测定测量I2S从天然来源的底物肝素二糖释放硫酸根离子的能力。释放的硫酸酯可通过配备有电导率检测器的离子色谱来定量。简言之，首先将样品缓冲交换至10mM醋酸钠，pH为6以消除由配制缓冲液中的磷酸根离子产生的抑制。随后用反应缓冲液(10mM醋酸钠，pH值4.4)将样品稀释至0.075mg/ml，并在37℃于30μL反应体积中以0.3μg I2S/100μg底物的酶与底物的比率与肝素二糖一起温育2小时。随后通过在100℃加热样品3分钟来终止反应。使用具有IonPac AG18保护柱的Dionex IonPac AS18分析柱进行分析。以1.0毫升/分钟利用30mM氢氧化钾来使用等度方法，进行15分钟。根据在1.7至16.0纳摩尔的范围内的硫酸酯标准的线性回归分析计算通过I2S样品释放的硫酸酯的量。可报告值表示为每mg蛋白质的单位，其中1个单位被定义为1微尔的每小时释放的硫酸酯，并且通过A280测量来测定蛋白质浓度。示例性结果示于表4中。

4-MUF测定

还可使用基于荧光的4-MUF测定来分析在无血清细胞培养条件下使用2D和4D细胞系产生的重组I2S酶的比活性。简言之，该测定测量了I2S底物4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)的水解。在4-MUF-SO₄底物被I2S切割后，该分子被转化成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)。作为结果，I2S酶活性可以通过评价随时间的荧光信号的整体变化来测定。对于本实验，使从I2S-AF 2D和4D人细胞系产生的纯化的I2S酶与4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄钾盐(Sigma目录号M-7133)温育。使用以1:100、1:200和1:20,000的原液稀释的商购可得的I2S酶，利用一系列对照参照样品进行测定的校准。在37℃运行酶测定，并使用校准的荧光计进行测定。使用对于每个参考标准获得的荧光值，使用下列公式确定变异系数百分比：

随后使用下列公式将百分比CV值用于计算每一个样品的修正平均荧光，以确定以mU/mL表示的报告酶的活性：

CFU＝负修正平均荧光

DF–稀释因子

1毫单位的活性是在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-甲基伞形酮基硫酸酯转化为4-甲基伞形酮所需的酶的量。

电荷特征谱

利用高效液相色谱(HPLC)系统，通过强阴离子交换(SAX)色谱测定每一种纯化的重组I2S的电荷分布。该方法基于表面电荷差异分离样品内的重组I2S变体。在pH 8.00时，带负电荷的物质吸附至SAX柱的固定正电荷上。将递增离子强度的梯度用于以与它们与柱的离子相互作用的强度成比例的方式洗脱每一个蛋白质物质。将100微克的纯化的I2S(从在无血清生长条件下的2D细胞系分离的)或参考重组I2S酶上样至在环境温度下保持的并且被平衡至20mM Tris-HC1，pH8.00的Amersham Biosciences Mini Q PE(4.6x 50mm)柱上。使用20mM Tris-HC1，1.0M氯化钠，pH 8.00的流动相，以0.80毫升/分钟的流速进行梯度洗脱。通过测量样品洗脱液在280nm波长处的吸光度来在运行过程中连续测定蛋白质浓度。示例性结果示于图6中。

虽然本文描述的某些化合物、组合物和方法已经根据某些实施方案进行特定的描述，但是下列实施例仅用于说明本发明的化合物，并且无意对其进行限制。

如本文在说明书中和权利要求书中使用的冠词“一个(a)”和“一种(an)”，除非清楚地表明与之相反，否则应该被理解为包括其复数个指示物。在某组的一个或多个成员之间包括“或者”的权利要求或者描述，被认为:如果一个、多于一个或所有组成员存在、被采用或者以其它方式与给定的产品或过程相关，那么就是符合的；除非指示相反或者以其它方式从上下文中明显可见。本发明包括这样的实施方案:其中所述组的只有一个成员存在、被采用或者以其它方式与给定的产品或过程相关。本发明也包括这样的实施方案:其中多于一个或者整个组成员存在、被采用或者以其他方式与给定的产品或过程相关。而且，应该理解，本发明涵盖来自一条或多条所列出的权利要求所有的变型、组合以及排列，其中一种或多种限制、元素、条款、描述性术语等根据所述相同基础权利要求(或者相关、任意其它权利要求)被引入到另一权利要求，除非以其它方式指出或者除非其对于本领域技术人员将明显地出现矛盾或者不一致。当元素以列表形式呈现(例如，在Markush组中或者类似的形式)时，应该理解，所述元素的每个亚组也被公开，并且任何元素可以从所述组删除。应该理解，一般而言，当本发明、或者本发明的某些方面，被指出包括特定的元素、特征等时，那么本发明或者本发明的方面的某些实施方案由这些元素、特征等组成或基本由其组成。为了鉴定起见，本文没有在每种情形中用过多的词汇明确地陈述那些实施方案。还应该理解，本发明的任何实施方案或者方面可以被明确地从所述权利要求排除，无论所述具体的排除是否在本说明书中叙述。本文所引用的出版物、网址和其它参考材料，为了描述本发明的背景以及提供关于其实践的其它细节，都通过引用并入本文。

Claims

1.一种用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中悬浮培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞。

2.一种用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在一定条件下，在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以便所述细胞平均以大于约15皮克/细胞/日的比生产率产生所述重组I2S蛋白，并且另外地其中所述产生的重组I2S蛋白平均包含至少约60％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养步骤包括灌注工艺。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述灌注工艺具有在约0.5-2体积的新鲜培养基/反应器的工作体积/日(VVD)的范围内的灌注速率。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述灌注工艺具有在约0.05-5纳升每种细胞每日(nL/细胞/日)的范围内的细胞比灌注速率。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞平均以大于约30皮克/细胞/日的比生产率产生所述重组I2S蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞以至少6mg每升每日的平均收获滴度产生所述重组I2S蛋白。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白平均包含至少约70％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白包含至少约80％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白包含至少约97％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大规模培养皿为生物反应器。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物反应器为或大于10L、200L、500L、1000L、1500L或2000L的规模。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基缺乏动物来源的组分。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基为化学成分确定的培养基。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基不含蛋白质。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少一种氧化还原调节剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂选自谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸、肌肽、鼠尾草酚、萝卜硫素、生育酚、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、硒、2-巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、核黄素、烟酸、叶酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂包括半胱氨酸。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述半胱氨酸的浓度在约0.1mg/L至约65mg/L的范围内。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂包括2-巯基乙醇。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述2-巯基乙醇的浓度在约0.001mM至约0.01mM的范围内。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂包括N-乙酰半胱氨酸。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述N-乙酰半胱氨酸的浓度在约3mM至约9mM的范围内。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长调节剂。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一种生长调节剂包括次黄嘌呤。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述次黄嘌呤的浓度在约0.1mM至约10mM的范围内。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种生长调节剂包括胸苷。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胸苷的浓度在约1mM至约100mM的范围内。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基具有在约6.8-7.5的范围内的pH。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述培养基具有在约6.9-7.3的范围内的pH。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养步骤包括生长期和生产期。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中于在30-37℃的范围内的温度下培养所述哺乳动物细胞。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在所述生长期和所述生产期期间在不同的温度下培养所述哺乳动物细胞。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中用于所述生长期和所述生产期的所述培养基具有不同的pH。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中在所述生产期期间以在约1.0-50X 10⁶个活细胞/mL的范围内的活细胞密度维持所述哺乳动物细胞。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述生产期持续约5-90日。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括收获所述重组I2S蛋白的步骤。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述重组I2S蛋白包含与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGE包含与SEQ ID NO:5具有至少70％的同一性的氨基酸序列。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述FGE包含与SEQ IDNO:5相同的氨基酸序列。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞包含一个或多个编码所述重组I2S蛋白和/或所述FGE的外源核酸。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个外源核酸被整合到所述细胞的基因组中。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个外源核酸存在于一个或多个染色体外构建体上。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞过表达所述重组I2S蛋白。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞过表达所述FGE。

49.一种重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白，其利用根据前述权利要求中任一项所述的方法产生。

50.一种重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的制剂，所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列，并且包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

51.根据权利要求50所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含至少约80％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

52.根据权利要求50或51所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含至少约90％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

53.根据权利要求50-52中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含至少约95％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

54.根据权利要求50-53中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含至少约97％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

55.根据权利要求50-54中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白具有至少40U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

56.根据权利要求50-55中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白具有至少60U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

57.根据权利要求50-56中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白具有至少80U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定法所测定的。

58.根据权利要求50-57中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列。

59.根据权利要求50-58中任一项所述的制剂，其中所述重组I2S蛋白包含与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

60.一种药物组合物，其包含根据权利要求50-59中任一项所述的重组I2S蛋白和药学上可接受的载体。

61.一种治疗亨特综合症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用根据权利要求60所述的药物组合物。