KR100762945B1 - 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주 - Google Patents

동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주 Download PDF

Info

Publication number
KR100762945B1
KR100762945B1 KR1020040071531A KR20040071531A KR100762945B1 KR 100762945 B1 KR100762945 B1 KR 100762945B1 KR 1020040071531 A KR1020040071531 A KR 1020040071531A KR 20040071531 A KR20040071531 A KR 20040071531A KR 100762945 B1 KR100762945 B1 KR 100762945B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ids
expression
cell line
sulfatase
cho cell
Prior art date
Application number
KR1020040071531A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040084881A (ko
Inventor
진동규
Original Assignee
진동규
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 진동규 filed Critical 진동규
Priority to KR1020040071531A priority Critical patent/KR100762945B1/ko
Publication of KR20040084881A publication Critical patent/KR20040084881A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100762945B1 publication Critical patent/KR100762945B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 지니는 cDNA를 삽입시킨 형질전환 벡터를 조립하고, 상기 형질전환 벡터로 인티그레이션시킨 형질전환 CHO 세포주(기탁번호: KCTC 10685BP호)를 배양하여 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 이듀로네이트-2-설파타제를 발현 생산하는 방법을 제공한다. 또한 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 삽입시킨 형질전환 벡터(7.2 kb) 및 상기 형질전환 벡터로 인티그레이션시킨 형질전환 CHO 세포주(기탁번호: KCTC 10685BP호)를 제공한다.
Figure 112004040606116-pat00001
이듀로네이트-2-설파타제, 형질전환, 발현, 벡터, CHO, 세포주

Description

동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법 및 그 발현을 위한 세포주{Expression process for Iduronate-2-sulfatase using animal cell and cell line for its expression}
도 1은 본 발명의 IDS 발현용 벡터의 조립을 나타난 모식도이다.
도 2는 CHO7 세포주에서 IDS 발현 분석을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 3은 IDS를 발현하는 CHO 세포주에서 MTX 농도별 IDS 발현양을 나타낸 도표이다.
도 4는 IDS 생산에 NH4Cl이 미치는 영향을 나타낸 도표이다.
도 5는 MTX 농도에 따른 IDS 발현양의 증가를 나타낸 도표이다.
도 6은 각 서브클론별 IDS 발현양을 비교한 도표이다.
도 7은 각각의 서브클론 등의 IDS 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 사진이다.
도 8은 어피니티 크로마토그래피를 통한 IDS의 정제를 나타낸 크로마토그램이다.
도 9는 정제된 머추얼 IDS를 나타낸 전기영동 사진이다.
본 발명은 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법 및 그 발현을 위한 세포주인 형질전환 CHO 세포주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 뮤코다당증 치료에 사용될 수 있는 치료제인 이듀로네이트-설파타제(IDS)의 CHO 세포주를 통한 발현 제조방법 및 그 발현에 필요한 형질전환 CHO 세포주에 관한 것이 다.
즉 본 발명은 뮤코다당증의 치료제로 사용되는 이듀로네이트-2-설파타제(Iduronate-2-sulfatase, IDS)의 대량생산을 위한 형질전환 CHO 세포주를 개발한 것으로, IDS를 세포주에서 발현 생산하여 인체 내에 투여하기 위해서는 인체 내에서 생성되는 IDS와 동일한 서열 및 토폴로지를 지니는 동물세포주에서 발현 생산이 필수적이므로 이를 통한 다량의 IDS 단백질을 생산할 수 있는 CHO 세포주를 개발한 것이다.
뮤코다당증은 유전성 대사질환의 일종으로 리소좀에 존재하는 효소의 결핍으로 유발되는 질환이다. 리소좀은 전자전달(electron transport), 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 및 피르부산, 지방산, 몇몇 아미노산 대사에 관여하는 효소 그리고 다양한 가수분해 효소들을 포함하는 각종 분해 작용에 관여하는 세포 내 기관으로서, 특히 뮤코다당류(mucopolysaccharides), 뮤코지질(mucolipids) 및 스핑고지질(sphingolipids) 등의 분해와 관련이 있다. 이외에도 뮤코다당증과 관련하여 이들의 대사 과정에 많은 효소 결핍 및 유전자 이상이 보고되어 있다.
구체적으로, 뮤코다당증은 임상적으로 골격계, 순환계 및 정신 기능 등에 다양한 증상을 나타내고, 임상적, 유전학적 및 생화학적 기초에서 7가지 부류로 나눌 수 있다. 이는 상기 다당류 대사에 관여하는 효소의 이상으로 황산화된 다당류 (sulfated polysaccharides)인 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 또는 케라탄 설페이트(keratan sulfate) 등이 조직 내 축적됨으로서 증상을 나타낸다.
상기 뮤코다등증 중 타입 Ⅱ인 헌터 증후군은 이듀로네이트-2-설파타제의 결함으로 유발되는 것으로, 헌터 증후군은 어린 시절부터 심한 증상을 보이는 유아형(juvenile form)과 정신지체 등은 보이지 않는 경한 증상의 늦은형(late form)으로 구분된다. 구체적으로 유아형은 정신지체, 신체 이상의 증상이 나타나고 대부분 15세 이전에 사망하며, 늦은형은 난쟁이, 못난 외모, 간비종(hepatosplenomegaly) 등을 나타내고 오래 생존한다. 헌터 증후군은 우리 나라에서 비교적 많이 발견되는 질환으로 X 염색체와 연관된 열성(X-linked recessive) 양식으로 유전되고 있다.
유전성 대사 질환은 매우 다양하고 민족에 따라 질병의 분포가 큰 차이를 보이는데, 따라서 각 나라에서 중점적으로 관심을 가지는 질환이 다르고 각 민족에 따라 특이적으로 많고 연구가 편리한 질환이 많이 연구되고 있다. 헌터 증후군은 특징적인 임상 증상으로 인하여 과거 우리 나라에서 여러 예가 보고되어 있으며 최근 효소 진단 등으로 확진되는 예를 찾아 볼 수 있다. 삼성의료원은 8년 전부터 헌터 증후군의 진단에 관심을 가지면서 한국인에 헌터 증후군이 특히 많음을 확인하고 새로운 뮤코다당증 진단법을 개발하여 질환을 스크리닝하고 효소 진단을 시행 하여 왔다.
따라서 본 발명은 상기 뮤코다당증의 치료제 또는 경감제로서 이듀로네이트-2-설파타제를 생물학적 방법으로 생산하는 방법을 개발한 것으로, 이러한 생물학적 방법에 사용되는 형질전환 CHO 세포주를 개발한 것이다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 뮤코다당증의 치료제 또는 경감제로서 이듀로네이트-2-설파타제를 생물학적 방법으로 생산하는 방법을 발명한 것으로, 이러한 생물학적 방법 및 이에 사용되는 형질전환 CHO 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 지니는 cDNA를 삽입시킨 형질전환 벡터를 조립하고, 상기 형질전환 벡터로 인티그레이션시킨 형질전환 CHO 세포주(기탁번호: KCTC 10685BP호)를 배양하여 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 이듀로네이트-2-설파타제를 발현 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 삽입시킨 형질전환 벡터(7.2 kb)를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 벡터로 인티그레이션시킨 형질전환 CHO 세포주(기탁번호: KCTC 10685BP호)를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
IDS를 CHO 세포주에서 발현하기 위하여 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 cDNA를 벡터에 삽입하여 형질전환 발현 벡터 pjk-dhfr-IDS (7.2 kb)를 제조한다. 발현 벡터를 CHO 세포주에 트랜스펙션시키고 MTX를 포함한 MEM-α배지에서 배양하여 안정적으로 배양되는 CHO 세포주를 선별한다. 선별된 CHO 세포주에 단계적으로 MTX를 처리한 후 유전자 증폭을 유도한다. MTX로 증폭된 형질전환 CHO 세포주를 96 웰 배양 플레이트에 희석하여 서브클론별로 IDS 발현양을 비교하고 과발현 세포주를 선별한다.
선별된 과발현 세포주 CHO-IDS-S4를 생명공학연구원 유전자은행에 2004년 8월 13일 기탁번호 KCTC 10685BP호로 기탁하였다.
상기 CHO 세포주(기탁번호: KCTC 10685BP호)를 배양배지에서 배양한 후 발현 된 IDS를 정제한다. 정제를 위해서는 어피니티 크로마토그래피를 이용하거나 IDS에 커플링되는 단일클론 항체 시스템을 이용한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) IDS 컨스트럭트의 제작
IDS를 CHO-dhfr-결핍 세포주에서 발현하기 위한 발현 벡터를 제작하였다. (주)에이프로젠에서 보유하고 있는 dhfr유전자를 포함하고 있는 pjk-dhfr-벡터의 MCS에 비코딩 구역과 리더 서열(leader sequence)을 포함하는 전체 IDS 유전자(서열번호: 1)를 삽입하였다(도 1). 머추얼(mature) IDS와의 비교를 위하여 전체 IDS 대신 머추얼 IDS 유전자만을 사용한 발현 벡터도 제작하였다. 삽입된 유전자의 서열은 염기서열 분석을 통하여 확인하였다. 제작된 발현 벡터를 형질전환한 대장균에서 트랜스펙션(transfection)용 DNA를 정제하였다. 도 1은 본 발명의 IDS 발현용 벡터의 조립을 나타난 모식도이다.
(실시예 2) IDS 폴리클론(polyclnonal) 항체 제작
ELISA 시스템을 구축하기 위하여 IDS 폴리클론 항체를 제조하였다. 인간n IDS와 쥐과 IDS간에 상동성이 높아 인간 IDS와 쥐과 IDS의 상동성 분석 및 항원성(antigenicity), 소수성 분석을 통하여 아미노산 348-455 부위를 폴리클론 항체 제조의 최적화 부위로 선정하여 PCR을 통해 이 부위를 pGEX4T-1 벡터(Amesham)에 클로닝하였다. 제조된 발현 벡터는 E. coli BL21에 형질전환하여 재조합 IDS348-455를 발현한 후 정제하였다. 정제된 단백질을 완전한 Freund's 애주번트(adjuvant) (1차 면역) 혹은 불완전 Freund's 애주번트(2, 3차 면역)에 에멀젼화하여 Balb/c 마우스에 2주 간격으로 면역하고 최종 면역 7일 후, 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 ELISA와 웨스턴 블롯을 수행하여 IDS에의 반응성을 확인하였다.
(실시예 3) COS-7 일시적 발현(transient expression)
제작된 발현 벡터가 동물세포에서 잘 발현될 수 있고 발현된 IDS가 세포외로 방출되는지 확인하기 위하여 COS-7 세포주에 제작된 발현 벡터를 일시적 발현하여 발현을 확인하였다. COS-7 세포주에 리포펙타민(lipofectamine)(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지침에 의거하여 8 ㎍의 정제된 유전자를 트랜스펙션하였다. 48시간 배양 후 배양 상청액과 세포를 수확하였다. 세포 용해질은 세포용해용액을 이용하여 용해한 후 원심분리하고 상청액을 얻어 세포 용해질로 사용하였다. 샘플에 포함된 IDS의 양이 적을 것으로 예상되어 IDS에 대한 항체를 사용하여 면역침전(Immunoprecipitation)을 수행하였다. 각각의 컨스트럭트를 6 웰 배양 플레이트에 트랜스펙션한 후 배양 상청액을 2 ml 배양한 후 여기에 각각의 항체를 넣 은 후 4℃에서 10시간 정도 반응시킨 후, 단백질 A 아가로스를 각각 50 ㎕씩 넣은 후 4℃에서 2시간 정도 반응시킨 후에 원심 분리하여 얻은 펠렛에 1X PBS 40 ㎕와 5X 표본 완충액 10 ㎕를 넣고 표본을 준비하여 웰 당 12 ㎕ 로딩하여 웨스턴 블롯을 수행하여 검출하였다(도 2).
도 2는 CHO7 세포주에서 IDS 발현 분석을 나타낸 전기영동 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이 음성대조군인 트랜스펙션하지 않은 COS7 세포주에서는 발현된 IDS가 전혀 검출되지 않은 반면, 전체 IDS와 머추얼 IDS 유전자를 트랜스펙션한 세포주에서는 세포 용해질과 세포배양 상청액 모두에서 IDS가 검출됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 제작된 벡터를 통해 동물세포에서 성공적으로 IDS가 발현되며 이들이 세포외로 방출(secretion)됨을 확인할 수 있었다.
(실시예 4) CHO-dhfr 결핍 세포주 트랜스펙션 및 안정적 세포주 제조
대량생산용 CHO 세포주를 제작하기 위하여 제작된 발현 벡터를 COS-7과 동일한 방법으로 트랜스펙션을 수행하였다. 리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 트랜스펙션을 수행한 후 G418 단독 혹은 G418과 1 nM의 MTX를 포함한 MEM-α배지로 교환하여 유전자가 염색체에 삽입된 안정적 세포주를 제조하였다.
(실시예 5) MTX를 이용한 유전자 증폭
다량의 IDS 발현을 위하여 얻어진 안정적 세포주에 여러 단계의 MTX를 단계적으로 처리하여 삽입된 유전자의 증폭을 유도하였다. 최초 20 nM과 80 nM의 MTX를 배지에 첨가하여 유전자증폭을 유도하였고 이후 200 nM, 400 nM, 1 μM의 MTX를 첨가하여 유전자증폭을 시도하였다. 초기 발현양은 미미할 것으로 예상되어 단일클론을 찾는 서브클로닝은 수행하지 않았으며 전체 세포 풀(pool)을 대상으로 유전자 증폭을 수행하였다. 각 단계별로 MTX 개조(adaptation)를 끝낸 세포들은 대상으로 COS-7과 동일한 방법으로 세포 용해질과 세포배양 상청액을 수확하였으며 이들 중에 포함되어 있는 IDS를 검출하기 위하여 ELISA 방법을 사용하였다. 샌드위치(Sandwich) ELISA법을 이용하여 IDS를 검출해 본 결과 용해질과 세포배양액 모두에서 IDS가 검출되었으며 증폭에 사용한 MTX의 농도와 비례하여 발현양이 증가하는 사실을 확인하였다(도 3). 도 3은 IDS를 발현하는 CHO 세포주에서 MTX 농도별 IDS 발현양을 나타낸 도표이다.
또한 특허 상에 기술된 NH4Cl의 IDS의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 세포주 배양시 배지에 10 mM의 NH4Cl을 첨가한 후 IDS의 발현양상을 분석하여 보았다(도 4). 도 4는 IDS 생산에 NH4Cl이 미치는 영향을 나타낸 도표이다. 도 4에 나타난 바와 같이 NH4Cl이 첨가된 경우 미미한 증가가 있는 것처럼 보이나 유의적인 차이는 발견할 수 없었다.
(실시예 6) IDS 과발현 세포주 확립
1 μM MTX로 증폭한 세포주를 이용하여 96 웰 배양 플레이트에 제한 희석(limiting dilution)하여 서브클로닝 수행하였으며 각 서브클론별로 발현양의 비교를 거쳐 3개의 과발현 세포주 S4, S7, S16을 확보하였다. ELISA는 항-IDS 항체를 500 ng/웰로 코팅 한 후 상등액과 세포추출물을 100 ㎕/웰로 결합시킨후 항-IDS 마우스 폴리클론 항체-비오티결합된 항체를 이용하여 결합한 후 이것을 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP을 이용하여 측정하였다.
도 5는 MTX 농도에 따른 IDS 발현양의 증가를 나타낸 도표이다. 또한 도 6은 각 서브클론별 IDS 발현양을 비교한 도표이다.
과발현 세포주로 선별된 클론 CHO-IDS-S4를 생명공학연구원 유전자은행에 2004년 8월 13일 기탁번호 KCTC 10685BP호로 기탁하였다.
각 세포주 서브클론들을 대상으로 웨스턴 블롯을 실시하여 IDS의 발현을 확인하였다. 도 7은 각각의 서브클론 등의 IDS 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 사진이다. 각 서브클론의 배양액을 20 ㎕을 대상으로 항-IDS 단일클론항체를 1 ㎍/㎖의 농도로 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였으며 ECL 키트를 이용하여 검출하 였다. 각 클론 모두 정확한 크기의 전체 크기 IDS를 발현하며 세포배양액으로 잘 분비하고 있음을 웨스턴 블롯을 통해서도 확인할 수 있었다.
(실시예 7) IDS 정제 시도
세포주의 정확한 생산성을 파악하기 위하여 표준물질로 사용할 IDS의 정제를 시도하였다. STR측에서 배양하여 제공한 IDS 단일클론항체를 정제하여 CNBR-activated Sepaharose for fast flow에 결합하여 세포주의 배양액과 용해질을대상으로 정제를 시도하였다. 도 8은 어피니티 크로마토그래피를 통한 IDS의 정제를 나타낸 크로마토그램이다. 세포 용해질에 존재하는 머추얼 IDS의 경우 일부가 정제되었으나 전체 IDS는 정제가 되지 않았다. 현재의 시스템으로는 정제가 불가능한 것으로 판단되며 보다 친화도가 높은 새로운 항체 시스템이나 어피니티 크로마토그래피가 아닌 방법을 통한 정제를 시도해야 할 것으로 판단된다.
도 9는 정제된 머추얼 IDS를 나타낸 전기영동 사진이다.

본 발명의 효과는 뮤코다당증의 치료제 또는 경감제로서 이듀로네이트-2-설파타제를 생물학적 방법으로 생산하는 방법을 발명한 것으로, 이러한 생물학적 방 법 및 이에 사용되는 형질전환 CHO 세포주를 제공하는 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 비코딩 구역, 리더 서열 및 서열번호: 1의 이듀로네이트-2-설파타제 코딩 서열을 삽입시킨 형질전환 벡터(7.2 kb)를 세포 내 염색체에 인티그레이션시킨 형질전환 CHO 세포주에 있어서, 상기 형질전환 CHO 세포주는 1 μM MTX 농도에서 흡광도 분석을 통해 0.4 x 106 세포수/일 이상으로 생장함을 특징으로 하는 이듀로네이트-2-설파타제 과발현 형질전환 CHO 세포주 (기탁번호 KCTC 10685BP호)
KR1020040071531A 2004-09-08 2004-09-08 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주 KR100762945B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040071531A KR100762945B1 (ko) 2004-09-08 2004-09-08 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040071531A KR100762945B1 (ko) 2004-09-08 2004-09-08 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040084881A KR20040084881A (ko) 2004-10-06
KR100762945B1 true KR100762945B1 (ko) 2007-10-04

Family

ID=37368186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040071531A KR100762945B1 (ko) 2004-09-08 2004-09-08 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100762945B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202200007808A1 (it) 2022-04-20 2023-10-20 Luigi Michele Pavone Composizioni terapeutiche per malattie causate da accumulo di eparan solfato

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3101125A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-07 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990073788A (ko) * 1998-03-03 1999-10-05 진동규 헌터 증후군의 유전자 요법에 사용될 수 있는 레트로바이러스벡터
US6541254B1 (en) 1991-11-12 2003-04-01 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541254B1 (en) 1991-11-12 2003-04-01 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase
KR19990073788A (ko) * 1998-03-03 1999-10-05 진동규 헌터 증후군의 유전자 요법에 사용될 수 있는 레트로바이러스벡터

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession No. M58342 Human iduronate 2-sulfatase (1995.03.07. 공개)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202200007808A1 (it) 2022-04-20 2023-10-20 Luigi Michele Pavone Composizioni terapeutiche per malattie causate da accumulo di eparan solfato
WO2023203004A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Pavone Luigi Michele Therapeutic compositions with imino sugars for the treatment of diseases with accumulation of heparan sulfate

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040084881A (ko) 2004-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mattsson et al. Molecular and immunological characterization of Can f 4: a dog dander allergen cross‐reactive with a 23 kDa odorant‐binding protein in cow dander
TWI523946B (zh) 位置特異性整合
BR112014005816A2 (pt) endoglicosidase de streptococcus pyogenes e métodos de uso
CN108265056B (zh) 一种重组户尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用
MXPA01012665A (es) El promotor genetico de la miostatina e inhibicion de la activacion del mismo.
CN112920275B (zh) 可特异性结合sST2的结合蛋白、试剂和试剂盒
AU743300B2 (en) Proteome analysis for characterization of up- and down-regulated proteins in biological samples
EA007813B1 (ru) Секретируемый белок
KR100762945B1 (ko) 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주
WO2004018633A2 (en) Abca13 nucleic acids and proteins, and uses thereof
CN105601750B (zh) 一种基因重组人c肽融合蛋白及其制备方法与应用
CN112512310B (zh) 用于无糖基化抗体产生的转基因小鼠和由此产生的无糖基化抗体的用途
Collombet et al. Eukaryotic DING proteins are endogenous: an immunohistological study in mouse tissues
Sohn et al. Enhanced sialylation and in vivo efficacy of recombinant human α-galactosidase through in vitro glycosylation
KR101962865B1 (ko) 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트
CN109810196B (zh) 一种水稻Cu/Zn-SOD多克隆抗体的制备方法和应用
EP2282768B1 (en) Anti-hmga1 monoclonal antibodies, process for their preparation and their use for the quantitative determination of hmga1
JP4315257B2 (ja) 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
KR20070109347A (ko) 인간 ｃｔｒｐ1을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 및이를 생산하는 하이브리도마 세포
JP5719504B2 (ja) カスパーゼ−１４特異的モノクローナル抗体
US20070087983A1 (en) Novel ubp8rp polypeptides and their use in the treatment of psoriasis
CN114516916A (zh) 一种抗gpr65的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用
JP5029751B2 (ja) 組換えイヌプロラクチンおよびその製造方法
JP4198248B2 (ja) 糖化型ｂｐｇｍアッセイ
CN116813742A (zh) 人gdf-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130531

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140618

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150710

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160629

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170712

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180712

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190718

Year of fee payment: 13