MXPA01012665A - El promotor genetico de la miostatina e inhibicion de la activacion del mismo. - Google Patents

Abstract

La invencion sujeto se refiere a un promotor que induce la expresion del gen de miostatina asi como tambien a los metodos para identificar composiciones utiles en la inhibicion del promotor y tambien a metodos y composiciones utiles en la prevencion de la sintesis, secrecion y funcion de la miostatina. En particular, los inhibidores que previenen la sintesis, secrecion y funcion de la miostatina pueden usarse para prevenir la perdida de masa muscular en humanos y animales.

Description

EL PROMOTOR GENÉTICO DE LA MIOSTATINA E INHIBICIÓN DE LA ACTIVACIÓN DEL MISMO Campo Técnico La invención sujeto se refiere a un promotor, el cual regula la expresión del gen de la miostatina así como también los métodos de inhibición de este promotor y las composiciones usadas para tal inhibición. En particular, los inhibidores del promotor previenen la expresión del gen de la miostatina y de esta manera evitan el agotamiento del músculo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN. La miostatina, o factor 8 de crecimiento/diferenciación (FCD-8), pertenece a la superfamilia del factor-ß de crecimiento de transformación (FCT-ß) (McPherron er al., Nat?re 387:83-90 (1997). El gene humano de la miostatina ha sido clonado (Néstor et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 95:14938-43 (1998)), y esto ha reportado que la inmunoreactividad de la miostatina es detectable en músculo esquelético humano en ambas fibras de tipo 1 y tipo 2. Con respecto a la función, la miostatina puede jugar un papel en la regulación negativa del crecimiento y desarrollo del músculo esquelético (Néstor et al., supra). La primera evidencia de que la miostatina puede jugar un papel esencial de una manera negativa en la regulación del desarrollo del músculo, proviene de un estudio con ratones extractores de miostatina (McPherron et al., Nature 387:83-90 (1997)). En los ratones con miostatina nula, los animales fueron más bien normales excepto que fueron significativamente más grandes que los ratones de tipo silvestre y tuvieron un incremento grande y difundido de masa muscular esquelética. Además, también se determinó que dos crías de ganado vacuno, caracterizadas por el crecimiento de la masa muscular, tienen mutaciones en la secuencia de codificación de la miostatina (McPherron et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 94:12457-61 (1997)). Adicionalmente, debe hacerse notar que el suero y las concentraciones intramusculares de la miostatina inmunoreactiva están incrementadas en hombres infectados con VIH con músculos agotados en comparación con hombres de buena salud, y en relación inversa con el índice de músculo libre de grasa. Está información sostiene la hipótesis de que la miostatina es un regulador negativo del crecimiento de músculo esquelético en hombres adultos y contribuye al agotamiento muscular en hombres infectados por VIH (Néstor et al., supra). En vista de lo antes descubierto, existe una necesidad de alguna manera para regular la expresión de la miostatina, particularmente en individuos quienes experimentan agotamiento muscular como resultado de una condición o estado de enfermedad, como por ejemplo, envejecimiento, Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA), esclerosis Múltiple, y cáncer. La presente invención proporciona métodos y composiciones los cuales pueden ser utilizados para ayudar a individuos con tales condiciones de agotamiento muscular y aportar adicionalmente alguna revelación dentro de la regulación de la expresión genética de la miostatina. Todas las patentes y publicaciones de los E. U. referidas en la presente se incorporan aquí para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención abarca una secuencia de ácido nucleico aislado representado por la figura 2 (SEQ ID NO: 1). Adicionalmente, la presente invención abarca un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita con anterioridad y una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informante. La secuencia del ácido nucleico que codifica la molécula informante está operablemente correlacionada a la secuencia de ácido nucleico representada en la figura 2. La molécula informante puede seleccionarse a partir de un grupo consistente en, por ejemplo, luciferaza, ß-galactosidasa y Acetiltransferasa de cloramfenicol (CAT). Preferentemente, la molécula informante es luciferasa. La presente invención también incluye una célula huésped de elemento que comprende el vector arriba descrito. Adicionalmente, la presente invención incluye un anticuerpo purificado producido en respuesta a la inmunización con la miostatina así como también una composición que comprende este anticuerpo purificado. Además, la presente invención también incluye un método para identificar una composición que inhibe la activación del promotor de la miostatina. Este método comprende las etapas de: a) construir un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico representada por la figura 2 (SEQ ID NO: 1) y una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula informante, enlazándose de manera operable a la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia representada por la figura 2; b) introducir el vector dentro de una célula huésped por un tiempo y bajo condiciones convenientes para la expresión de la miostatina; c)exponer la célula huésped a una composición que puede inhibir la activación del promotor de la miostatina y un substrato específico para la molécula informante; y d) medir la señal generada por reacción de la molécula informante y el substrato el comparación con la producida por una célula huésped de control, una pequeña señal, indicando una señal más pequeña por la célula huésped de (c) indicando que la composición inhibirá la activación del promotor de la miostatina.] También, la presente invención incluye un método de identificación de un compuesto que inhibe la expresión de la miostatina que comprende las etapas de: a) agregar un anticuerpo seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo monoclonal o policlonal producido en contra de la miostatina a una fase sólida; b) agregar concentraciones conocidas de miostatina o una muestra celular que comprende miostatina expuesta a la composición de prueba, a la fase sólida, con objeto de formar un primer complejo entre el anticuerpo y las concentraciones conocidas de la miostatina o la miostatina en dicha muestra celular; c) agregar un segundo anticuerpo al primer complejo, seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policional producido en contra de la miostatina por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un segundo complejo entre el primer complejo y el segundo anticuerpo; d) contactar el segundo complejo con un reactivo indicador que comprende una señal que genera un compuesto anexo a un anticuerpo en contra de dicho anticuerpo de dicho segundo complejo, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un tercer complejo; e) detectar la presencia de una señal mensurable, indicando la ausencia de la señal que la composición inhibe la expresión de la miostatina y la presencia de la señal indica que la composición no inhibe la expresión de la miostatina. Además, la presente invención también incluye un método que identifica una composición que inhibe la expresión de la miostatina que comprende las etapas de: a) revestir una cantidad fija de miostatina en una fase sólida; b) agregar concentraciones conocidas de mioestatina o una muestra celular que comprende mioestatina expuesta a la composición; c) contactar un anticuerpo seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal producido en contra de la miostatina para la miostatina en (a) y (b) por un tiempo bajo condiciones suficientes para formar un primer complejo, en donde la miostatina de (a) compite con la miostatina de (b), en una competencia por el anticuerpo; (d) contactar el complejo con un reactivo indicador que comprende una señal que genera un compuesto anexo a un anticuerpo en contra del anticuerpo del primer complejo, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un segundo complejo; y e) detectar una señal medible, una señal mayor en comparación con un control, indicando que la composición inhibe la expresión de la miostatina. Adicionalmente, la presente invención incluye un método para identificar una composición, en una mezcla de composiciones, que evita que la miostatina se enlace a un receptor de miostatina que comprende las etapas de; a) mezclar la miostatina purificada con la mezcla de las composiciones; b) pasar la mezcla resultante de la etapa (a) a través de un filtro que tiene poros de una dimensión tal que una composición que se acompleja para la miostatina no pasa a través del filtro; y c) determinar la estructura de una composición acomplejada; identificando así una composición que evita que la miostatina se enlace a un receptor de miostatina. También, la presente invención abarca un método para identificar una composición que evita que la miostatina se enlace a un receptor de la miostatina que comprende las etapas de: a) radioetiquetar miostatina recombinante; b) incubar la miostatina radioetiquetada con células o membranas que comprenden un receptor de miostatina; c) contactar la mezcla incubada de la etapa (b) con una composición de interés; d) separar la miostatina radioetiquetada ligada a células o membranas de la miostatina no enlazada; y e) determinar la cantidad de radioactividad en la miostatina ligada, en comparación con un control; indicando un nivel de radioactividad inferior en la miostatina ligada en comparación con dicho control una composición que inhibe que la miostatina se enlace a un receptor. Además, la presente invención incluye un método que evita el agotamiento muscular en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una composición que comprende un ingrediente activo que causa un efecto seleccionado del grupo que consiste en prevenir la activación del promotor de la miostatina, prevenir la síntesis de la miostatina, y evitar que la miostatina se enlace a su receptor objetivo, en una cantidad terapéuticamente eficaz, de tal manera que se evite el agotamiento muscular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa una ilustración conceptual del gen de la miostatina humana. El gen de la miostatina humana contiene tres exones y dos intrones, los cuales codifican 1.1 kb de cADN de la miostatina. Cuando una biblioteca de cromosoma artificial humano derivado de P1 (CAP) se seleccionaba usando una sonda de 740 bp que codifica el exón 1 y 2 de miostatina humana, se identificaba una clona positiva con una inserción de 120 kb. Después de digerir la clona con EcoRi, se aislaron dos subclonas de genoma humano. Uno de las subclonas, Clona C11 , contenía 0.37 kb de exón 1 , 1.53 kb de intrón 1 , y una secuencia de 3.4 kb que contiene la región promotora de la miostatina humana. La figura 2 representa la secuencia de ácido nucleico de la región promotora de la miostatina humana. El factor de transcripción putativo que enlaza regiones se identifica y subraya. La figura 3 representa la detección del mARN de miostatina por muestras de RT-PCR de ARN del músculo esquelético humano, células de rabdomiosarcoma, y células musculares lisas de la próstata que utilizan cargas de inicio específicas de miostatina humana, y para G3PDH mediante el uso de cargas de inicio específicas de G3PDH. El gene de la miostatina amplificado (1.1 kb) fue observado en ambas células del músculo esquelético humano (hilera 1) y células de rabdomiosarcoma (hilera 2), pero no en células musculares lisas en próstata (hilera 3). El gene G3PDH amplificado (0.9 kb) fue observado en el músculo esquelético (hilera 4), células de rabdomiosarcoma (hilera 5), y células musculares lisas en próstata (hilera 6). La figura 4 representa las construcciones informantes de luciferasa. La región promotora de la miostatina humana de 3.4 kb fue clonada dentro de los sitios Xhol y Hindlll de un vector mejorador de pGL3 informante de luciferasa (Promega, Madison, WT), que contenía un gen informante de luciferasa y un elemento mejorador de SV40 para incrementar el grado de transcripción. La figura 5 representa los resultados de un ensayo de luciferasa para la región promotora de la miostatina humana en células del músculo esquelético humanas y células de rabdomiosarcoma.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se mencionó con anterioridad, e la invención sujeto se refiere a la identificación y aislamiento de un promotor que es involucrado en la activación y la regulación en la expresión del gene de la miostatina.

La miostatina regula negativamente el crecimiento y desarrollo del músculo esquelético. En particular, la invención sujeto se refiere a métodos que pueden ser usados para identificar compuestos que inhiben las actividades del promotor de la miostatina. La región promotora de la miostatina o la secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de la miostatina se enlaza al gen informante de luciferasa. De esta manera, si uno es capaz de identificar compuestos que inhiban la actividad de la región promotora de la miostatina para prevenir la expresión de la luciferasa, uno puede entonces evitar que funcione la región promotora, evitando así la expresión de la miostatina. La identificación de compuestos que inhiben la actividad promotora de la miostatina, y la producción de luciferasa, puede ser llevada a cabo por el uso de ensayos de selección de fármacos. Inicialmente un vector es creado comprendiendo una secuencia aislada de ADN que codifica la región promotora de la miostatina, la cual es enlazada al gene informante de la luciferasa. El vector puede ser, por ejemplo, una plásmida, un bacteriófago o una cósmida. El vector es entonces introducido dentro de las células huésped bajo un tiempo y condiciones convenientes para la activación del promotor de la miostatina. Las células huésped pueden ser células procarióticas o eucarióticas. Preferentemente, son utilizadas las células eucarióticas, por ejemplo, células lineales con trazos musculares. Los ejemplos incluyen células musculares esqueléticas humanas, células de rabdomiosarcoma humanas, y células de rata L6 o L8. Las células huésped están entonces expuestas a la prueba de composición ideada para bloquear la activación del promotor de la miostatina y la expresión genética de la luciferasa. Las células son también expuestas a un substrato para la luciferasa. Uno mide entonces la calidad de las señales o luz emitida a partir de la reacción del substrato-luciferasa. Si la cantidad de señales producidas por las células huésped, expuestas a la composición en cuestión, es más baja que la producida por células controladas (es decir, células que no han sido expuestas a la composición), entonces la composición ha inhibido la actividad del promotor de la miostatina, y será útil inhibiendo la expresión del gene de la miostatina. Si la cantidad de señales producidas por las células tratadas es igual a la producida por las células de control, la composición no ha inhibido la actividad del promotor de la miostatina y no evitará la expresión del gene de la miostatina. Una vez que se ha identificado inhibe la actividad del promotor de la miostatina, tales composiciones pueden ser administradas a pacientes que tienen algún tipo de condición involucrada en el agotamiento muscular, por ejemplo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), cáncer, Esclerosis Múltiple y envejecimiento. La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor y un vehículo apropiado, fisiológicamente aceptable (por ejemplo, agua, agua regulada o solución salina). La forma de dosis, en forma de (por ejemplo, suspensión, tableta, cápsula, etc.) y la ruta de administración de la composición farmacéutica (por ejemplo, oral, tópica, intravenosa, subcutánea, etc.) puede ser con facilidad determinada por un médico practicante y puede depender de factores tales como, por ejemplo, la edad, peso, estado inmune, y la salud en general del paciente. Adicionalmente, la presente invención también abarca composiciones que comprenden anticuerpos derivados mediante el uso de proteína de miostatina purificada o una porción de la misma que puede ser administrada con, por ejemplo, un vehículo apropiado (por ejemplo, agua, agua regulada o solución salina). Subsecuentemente a la administración de los anticuerpos, ellos pueden enlazarse a la miostatina expresada en el cuerpo con objeto de formar un complejo, evitando así que la miostatina expresada regule de manera negativa el negativa el desarrollo del músculo. Los anticuerpos por sí mismos, así como también porciones de los mismos, también se abarcan dentro del alcance de la presente * invención, así como también ensayos que comprenden tales anticuerpos o porciones de los mismos. Debe observarse que las composiciones farmacéuticas y anticuerpos anteriores pueden ser utilizados para aplicaciones veterinarias (por ejemplo, para prevenir el agotamiento muscular en animales envejecidos o enfermos) o para aplicaciones de agricultura (por ejemplo, para aumentar la producción de carne en ganado, ya que los animales sin miostatina muestran una masa muscular mucho mayor). Por ejemplo, la composición terapéutica que inhibe la actividad del promotor de la miostatina puede ser administrada a mamíferos tales como, por ejemplo caballos, vacas, cabras, ovejas, gatos, perros y cerdos. La presente invención también cubre dos métodos, que utilizan miostatina purificada y/o anticuerpos de miostatina, los cuales identifican composiciones que inhiben la síntesis y la secreción de la proteína de miostatina. En el método de emparedado, un anticuerpo de mamífero monoclonal y/o policlonal (por ejemplo, conejo o ratón) en contra de la forma madura de la miostatina, es cubierto sobre una superficie sólida (por ejemplo, la placa lmmulon-4 (Dynatech Laboratories INC., Chantilly, VA)). La superficie será manchada por un agente de manchado conocido, por ejemplo, Albúmina de Suero Bovino (ASB), y se enjuaga. Se agregan muestras (por ejemplo, sobrenadantes de células de músculo esquelético humanas tratadas con o sin agentes de prueba) o concentraciones conocidas de forma madura purificada de la miostatina a la superficie (por ejemplo, placa). Después de enlazar la miostatina al' anticuerpo o anticuerpos, la superficie será enjuagada, y después incubada con un anticuerpo mamífero monoclonal y/o policlonal (por ejemplo, cabra, conejo o ratón) en contra de la miostatina. El enlace del segundo anticuerpo de anti-miostatina será detectado por el uso de un reactivo indicador que comprende un anticuerpo conjugado son una señal que genera un compuesto, por ejemplo, una enzima. También se agrega un substrato para la enzima si es utilizada una enzima. Por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (PRP) y puede utilizarse su substrato de hidrocloruro de O-fenilenodiamina (HOF). En particular, la reacción de la enzima-substrato genera una señal o cambio detectable, por ejemplo, el color, el cual puede ser leído, por ejemplo, en un Lector de Microplaca. Ejemplos de señal que genera compuestos, diferentes a una enzima que puede ser utilizada incluyen, por ejemplo, un compuesto luminiscente, un elemento radioactivo, una etiqueta visual y un compuesto quimioluminiscente. Las concentraciones conocidas de miostatina purificada se usan para generar una curva estándar. La concentración de la miostatina en las muestras desconocidas (por ejemplo, células sobrenadantes de células del músculo esquelético humano tratadas con o sin agentes de prueba) pueden ser determinadas usando la curva estándar. Los agentes de prueba que disminuyen la concentración de la miostatina en sobrenadantes son potencialmente útiles en la inhibición de síntesis/secreción de la miostatina. En el método competitivo, una cantidad fija de miostatina humana es recubierta sobre una superficie sólida, por ejemplo, la placa de lmmulon-4. La placa será manchada por, por ejemplo, ASB u otro agente de manchado conocido, y será enjuagada. Se agregan muestras (por ejemplo, sobrenadantes de células de músculo esquelético humano tratadas con o sin agentes de prueba) o concentraciones conocidas de forma madura purificada de la miostatina a la placa junto con un anticuerpo mamífero, monoclonal y/o policlonal (por ejemplo, cabra, conejo o ratón) en contra de la miostatina. La placa será lavada, y posteriormente incubada con un reactivo indicador que comprende un anticuerpo conjugado con un compuesto que genera una señal, por ejemplo, una enzima (o las entidades antes descritas) Si una enzima es usada, un substrato para la enzima es también provisto. La enzima puede ser, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (PRP). El substrato puede ser, por lo tanto, hidrocloruro de O-Fenilenodiamina (HOF). Nuevamente, la reacción de enzima-substrato genera un cambio o señal detectables, por ejemplo, color, el cual puede ser leído en, por ejemplo, un Lector de Microplaca. Las concentraciones conocidas de miostatina purificada pueden ser usadas para generar una curva estándar. La concentración de miostatina en las muestras desconocidas (por ejemplo, sobrenadantes de células de músculo esquelético humano) pueden ser determinadas usando la curva estándar. Los agentes de prueba que disminuyen la concentración de miostatina en sobrenadantes son potencialmente útiles en la inhibición de la síntesis/secreción de miostatina. Las concentraciones conocidas de miostatina, o miostatina en la muestra, compiten con la proteína de miostatina recubierta sobre la placa en el enlace a los anticuerpos de miostatina. Cuando se presenta más miostatina en la muestra, se genera menos señal. Si un agente de prueba es capaz de bloquear la síntesis/secreción de miostatina, la cantidad de miostatina en esa muestra particular será menor que en el control, y la señal en esta muestra será mayor que en el control. Adicionalmente, la presente invención cubre un método por Afinidad-Selección, usando miostatina purificada en un ensayo de filtración, para identificar composiciones que se enlazan a la miostatina para prevenir que la miostatina se enlace a sus receptores, de esta manera se evita que la miostatina funcione. En resumen, la miostatina purificada es mezclada con distintos compuestos de prueba. La mezcla es pasada a través de un filtro que solo permite pasar a moléculas de cierto peso molecular. Las composiciones que se enlazan a la miostatina serán retenidos por el filtro. Los compuestos no enlazados no son retenidos y pueden ser separados de las composiciones enlazadas. Las estructuras de las composiciones que se enlazan a miostatina estás determinadas, por ejemplo, por Espectrometría de Masa. Además, la presente invención también abarca un método de enlace de receptor usando miostatina radioetiquetada para enlazarse a células o membranas preparadas de tejidos o células que contienen receptores de miostatina. De esta manera, uno puede identificar composiciones que bloquean la miostatina desde el enlace a sus receptores, previniendo así que la miostatina funcione. En particular, la proteína de la miostatina recombinante purificada de bacteria, insecto o células mamíferas es radíoetiquetada ([12SI], [3H], [1 C], etc.). La miostatina radioetiquetada es entonces incubada con células o membranas preparadas de tejidos o células que contienen receptores de miostatina en la presencia o ausencia de la composición de prueba. Las células radioetiquetadas y membranas son entonces separadas de las células y membranas no radioetiquetadas para métodos de separación tales como, por ejemplo, filtración y centrifugación. La cantidad de miostatina enlazada a las células o membranas esta determinada por el conteo de radioactividad. Una disminución en la radioactividad en la presencia de una composición de prueba indica que la composición inhibe el enlace de la miostatina, y de esta manera es útil en la inhibición de la función de la miostatina. La presente invención puede ser ilustrada por el uso de los siguientes ejemplos no-limitativos: EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA EL PROMOTOR DE LA MIOSTATINA HUMANA Y REGIONES DE ENLACE DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN POTENCIALES 1. Clonación del cADN de la miostatina humana. El cADN de la miostatina humana fue amplificado a partir de la biblioteca de cADN 5'-plus de músculo esquelético humano (Clontech, Palo Alto, CA) mediante PCR usando cargas de inicio específicas, 5'- ATG CAÁ AAA CTG CAÁ CTC TGT GTT T -3' Y 5'- TCA TGA GCA CCC ACÁ GCG GTC -3'. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCR3.1 de clonación TA eucariótica (Invitrogen, Carlsbad, CA). La inserción fue confirmada por la secuencia de ADN. Clonación de la región promotora de la miostatina humana. Los fragmentos de EcoRI y Hindlll (740 bp) del cADN de la miostatina humana (figura 1), los cuales cubren el exón 1 y 2 del gen de la miostatina humana, fueron enviados a Genome Systems Inc. (St.

Louis, MO) como una prueba para seleccionar la biblioteca del Cromosoma Artificial Humano derivado de P1 (CAP). Una clona positiva con inserción de 120 kb fue identificada y confirmada por Southern blot genómica usando la misma prueba. La inserción de 120 kb fue digerida con enzima de restricción EcoRI, y subclonada en una plásmida pZero (Invitrogen, Carlbad, CA). Dos subclonas positivas con inserciones de 5-7 kb fueron identificadas (figura 1). Los resultados del ordenamiento en secuencia indican que la clona 10 contiene exón 2 y parte de un intrón 1 y 2. La clona 11 (5.3 kb) contiene el exón 1 , parte de un intrón 1 , y una región no traducida de 3.4 kb 5'- la región promotora de la miostatina putativa. El Programa Matlnspector V2.2 (Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig, Alemania) fue investigado para identificar regiones de enlace del factor de transcripción potencial (figura 2).

Matlnspector es un software que permite escanear rápidamente datos de secuencia por motivos de consenso. Matlnspector usa la similitud del núcleo, la similitud de matriz y el vector Ci creado por Matlnd para calcular el índice de similitud. Los sitios de enlace del factor de transcripción potencial se seleccionaron cuando ambas similitud de núcleo y similitud de matriz similares alcanzan 0.95. Los detalles del programa son ilustrados en Quandt er a/., Nucleic Acids Research 23:4878-4884, 1995. Identificación de células musculares esqueléticas humanas u otras líneas celulares de alineación muscular que expresan miostatina. El ARN total de células musculares esqueléticas humanas y células de rabdomiosarcoma fue aislado usando reactivo de Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y usadas co'mo patrón para invertir ia transcripción. El gene de la miostatina fue amplificado por PCR usando las cargas de inicio especificas de miostatina humana, 5' - ATG CAÁ AAA CTG CAÁ CTC TGT GTT T - 3' y 5' - TCA TGA GCA CCC ACÁ GCG . GTC -3'. El ARN total de las células musculares lisas de próstata humanas fueron también examinadas. Las cargas de inicio para el gene endógeno G3 PDH fueron usadas para probar la integridad del ARN total. Los productos de PCR fueron analizados sobre un 1 % de gel de agarosa (figura 3). Los productos de PCR de 1 .1 kb, siendo el tamaño correcto 1 .1 kb para la miostatina, indicaron que ambas células musculares esqueléticas humanas y células de rabdomiosarcoma expresan miostatina.

EJEMPLO II / - —" " •— ~ — •~""— ENSAYO DE LUCIFERASA El ensayo del gene informante de ia luciferaza fue di&eñado para el análisis cuantitativo de la expresión del gene mamífero. La región codificadora para la luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) fue enlazada a la región sin traducción 5' de 3.4 kb (5-UTR) del gene de la miostatina humana. La construcción fue transfectada de manera transitoria dentro de las células musculares esqueléticas humanas o células de rabdomiosarcoma humanas, y después de 48 horas, la actividad de la luciferasa fue medida. Para ensayar la actividad de la luciferasa, se agregaron luciferina y Mg2+-ATP a extractos celulares, y la producción de luz fue monitoreada. La actividad de la luciferasa es incrementada si la región 5'-UTR de 3.4 kb tiene actividad promotora. Por lo tanto, la actividad de la luciferasa puede ser usada como un indicador (informante) de la función de la región promotora corriente arriba. La región no traducida 5' de la miostatina humana de 3.4 kb fue clonada dentro de los sitios Xhol y Hindlil del vector mejorador de pGL3 (Promega, Madison, Wl), enlazado al gen informante de la luciferasa (figura 4). La construcción fue transfectada de manera transitoria dentro de las células musculares esqueléticas humanas o células de rabdomiosarcoma humanas usando reactivos Superefect (Qiagen, Inc., Santa Clarita, CA). Otro gen informante tal como el gene ß-galactosidasa o gene de luciferasa Renilla fue co-transfectado como control para la eficiencia de transfección. Las células experimentaron lisis en regulador de lisis después de 48 horas, y los extractos celulares fueron ensayados respecto a la luciferasa y actividad ß-gal usando un equipo de detección [por ejemplo, LucLite (Packard, Meriden, CT), Equipo II de detección de ß-galactosidasa luminiscente (Clontech, Palo Alto, CA), o sistemas de ensayo informantes de doble-luciferasa (Promega, Madison, Wl)]. El vector parental mejorador de pGL3 fue usado como un control negativo y el vector de control de pGL3 con un promotor de SV40 fue usado como un control positivo para la actividad déla luciferasa. La actividad de la luciferasa se cuantificó sobre un detector dé luz luminiscente tal como un contador o luminómetro MicroBeta (EG & G Life Sciences-Wallac, Turquía, Finlandia) y el resultado fue normalizado por eficiencia de transfección. Hubo aproximadamente un incremento de 5-veces la actividad de la luciferasa para la construcción del promotor de la miostatina humana en comparación con su vector parental en células musculares esqueléticas humanas (figura 5A). En células de rabdomiosarcoma humanas, el incremento de la actividad de la luciferasa fue de aproximadamente 7-veces (figura 5B). Como se esperaba, la actividad de la luciferasa no fue incrementada en células musculares lisas de la próstata humanas (figura 5A), las cuales no expresan miostatina. En vista de los resultados anteriores, la construcción informante de luciferasa que contiene la región promotora de la miostatina humana de 3.4 kb puede ser estable o transitoriamente transfectada en líneas celulares mamíferas, tal como las células musculares esqueléticas humanas transformadas con SV-40 o células de rabdomiosarcoma y otras para una selección de alto rendimiento. La actividad de la iuciferasa puede ser usada como un indicador para seleccionar compuestos que inhiben la expresión del gen de ia miostatina.

EJEMPLO lll ENSAYO INMUNOSORBENTE ENLAZADO A ENZIMA (ELISA) PARA SELECCIÓN DE ALTO RENDIMIENTO El ELISA Competitivo o Emparedado puede ser usado para identificar compuestos que inhiben la síntesis y/o secreción de proteína de miostatina humana. En el ELISA de emparedado, por ejemplo, un conejo o ratón monoclonal y/o anticuerpo policlonal en contra de la forma madura de la miostatina es recubierto sobre la placa lmmulon-4 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA), y la placa es manchada por ASB y se enjuaga. Se agregan a la placa muestras (por ejemplo, sobrenadantes de células musculares esqueléticas humanas tratadas con o sin agentes de prueba) o concentraciones conocidas de forma madura purificada de la miostatina. Después de los enlaces de proteína de la miostatina, la placa es nuevamente enjuagada, y entonces incubada con un anticuerpo de cabra o conejo o ratón monoclonal y/o policlonal en contra de la miostatina. El enlace del segundo anticuerpo de anti-miostatina será detectado por un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (PRP) usando hidrocloruro de O-Fenilenodiamina (HOF) como el substrato.

Las concentraciones conocidas de miostatina son usadas para generar la curva estándar. En el ELISA competitivo, la proteína de la miostatina humana es recubierta sobre la placa lmmulon-4, y la placa es manchada por ASB, y enjuagada. Se agregan a la placa muestras (por ejemplo, sobrenadantes de células musculares esqueléticas humanas tratadas con o sin agentes de prueba) o concentraciones conocidas de forma madura purificada de miostatina o péptidos de miostatina junto con un anticuerpo de cabra o conejo o ratón monoclonal y/o policlonal en contra de la miostatina. La placa es nuevamente enjuagada, y entonces incubada con un anticuerpo combinado con peroxidasa de rábano picante (PRP) usando hidrocloruro de O-Fenilenodiamina (HOF) como el substrato. Las concentraciones conocidas de miostatina son usadas para generar ia curva estándar. Las células musculares esqueléticas humanas u otras líneas celulares de músculos lineales los cuales sintetizan y segregan miostatina, pueden ser usados para examinar compuestos ideados para inhibir la síntesis o secreción de la miostatina. La células son incubadas con compuestos de prueba por un período de tiempo, por ejemplo, de 6-48 horas. La cantidad de miostatina en el medio de las células es entonces determinado por ELISA. Una disminución en la cantidad de la miostatina indica que el compuesto de prueba es efectivo inhibiendo la síntesis y secreción de la miostatina, mientras que un incremento en la cantidad de miostatina o mantenimiento del mismo nivel de miostatina indica que el compuesto de prueba no es efectivo inhibiendo la síntesis y secreción de miostatina.

EJEMPLO IV PRODUCCIÓN DE MIOSTATINA RADIOETIQUETADA PARA USARSE EN ENSAYOS DE ENLACE A RECEPTORES La proteína de la miostatina recombinante purificada a partir de bacterias, insectos o células mamíferas es radioetiquetada ([125l], [3H], [14C], etc.). La miostatina radioetiquetada es entonces incubada con células o membranas preparadas de tejidos o células que contienen receptores de miostatina en la presencia o ausencia de la composición de prueba. La cantidad de miostatina enlazada a membranas está determinada por conteo de radioactividad. Una disminución en la radioactividad en la presencia de una composición de prueba indica que la composición inhibe el enlace de la miostatina, y de esta manera es útil en la inhibición de la función de la miostatina.

EJEMPLO V MISOTATINA PURIFICADA USADA EN LA SELECCIÓN POR AFINIDAD La proteína de la miostatina recombinante purificada a partir de bacterias, insectos o células de mamífero es usada en composiciones de prueba de enlace. En particular, las composiciones de prueba que se unen a la miostatina son retenidas por filtros, y la estructura es determinada por Espectrofotometría de Masa. Una composición de prueba que se une a la miostatina es usada en la inhibición del enlace de la miostatina a su receptor, de esta manera inhiben la función de la miostatina.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Abbott Laboratories » Wu-Wong, Jins yun. R . Wang , Jia ong < 120 > EL PROMOTOR GENÉTICO DE LA MIOSTATINA E INHIBICIÓN DE LA ACTIVACIÓN DEL MISMO <130> 6542. US . Ol <140> US 09/329,685 <141> 1999-06-10 <160> 1 < 170 > Fast SEQ Para Windows Versión 4.0 <210> i <211> 3435 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ttctctaccc actcacceta atgatgcagt actgtcctgt ctccttggtg ataagaactg 60 ccagaactgg gtctccagca gtcagactac attgaagttt cctatagctg gtgagccctt 120 ctattctggg gcctcaggaa ggttgcaate actgccactg gagaaggaat aaaacttact 180 taaatttctt cagttcttct tcacccattc aatactgttc tctagagaag ttgattagat 240 atagtcaatt ctccctattc atagtagtta tgttctataa agtcattgcc aacactgagt 300 tagcaaatat tgaactattg ttcccagggg aaaaacaggg ttagttgagc ctctggtcat 360 aacatttaca tcacccaatc aatatataac cttgttttat gtatgttttt gtttacaaat 420 acattattta atatatattg ttcattcatt aacactgaac tcacagccag cagcactata 480 actcaggcct gaatgatgct tatctagcac atgcattttt tcatgagaac ttttttccct 540 taggcatatc acagcctttt aaaattgtgg taaatataca caacatttag catcttaacc 600 atttttaggt gtacagttcg gtggcattaa gcacattcac actgttgtgt aaccatcacc 660 accattcatc ttcagaaatt tttcatcttc ccagactgaa actctgtatc tatcacacag 720 taactacccc tcagtgcctc acccagtccc tggcaaccac catgctactt tccattgcag 780 ctttcotgtg attaggaaca taggaacacc acgcagcacg tcagcactat gcttggggge 840 catttttaaa aagcaaaatc aataagagga gcaataaaaa aagaagcaca aaatatgtga 900 aaacatggca ctaaatagac gggaaaaagg gaatttgttt atagtatgag agctgaaaca 960 aaaaggcgga accctgcctt gtttgacctc atctgggaac ctgtgcgtca gataggactc 1020 aaattttttg ccgctctgtg aatgccagcg aatgactgaa aaa gctagg aatattgagt 1080 ttcatagata aattttagca agtaggcaaa tttgtgaata cagaaatcat gaataataag 1140 aattgtctgt tagcggaaat gacaaccttt gttcactttt ttccaggtga taagaataaa 1200 gagctggaac atgtcttgta acctggctgc cttagaaaat tttacttgcc tcacaggcct 1260 agaaagtagg ctttgtgaot gataattggc agctatgacc tgaagcagtt ctagttcatg 1320 tggagcataa ttttaagcat aatctcaaac ccttctgcat aaaacaaaga gcaagcactc 1380 aaatgccagt tatcaattac ttactatatg acaggtgcca tattcagcaa tttacatgca 1440 ttattaaatt atatcccccc aaaaccctat gaggaagcta aagtttaggg aagttaagta 1500 tctcatccat tatcacatag ttagaagtgg caaagttgag atttgaactc aggtctatct 1560 gactccagag cctgagttct caattcaact gctatacaat tctaagcata ttaaaaaaaa 1620 agtttgactt acttggaact gtatagatgc atgtgttaca atgatcataa catttgaaag 1680 atttacacat tgaaaaatga atttaccaaa caaataaaac cttagaagcc agatetaata 1740 ttgtcccata acaaagagta tctgaaatcc tcagggcatc éggtttgtgt ctggttttcc 1800 ttaatcttta atgatgagca aatccaatgc attatgtaag gccatttttt tctcaagaga 1860 tgtagatacc tcttaagaat ttgatgaaaa tgcattaact tttcaggcta ctgagttgca 1920 ttttagtgca ccgaggcagt aaattagtgt acagtgtgca aaaatggtag tgactttaaa 1980 aataaatatt tgatatgagc cactgtattc tcttggaaaa aaaaagtaat ggactaaatc 2040 tcttaggaat ccttagcttc ccaaaaagga gtaggaaaaa gaaatctcct ttggcctaga 2100 aatatcttct gtttcttgct ggctatgttt gcttagctct ttaatagttc atttgactag 2160 atcttgtggc tcccaaagct aaggttgaac gtttgatccc tacagaggcc acttaaattt 2220 agagaacaaa aagctctatt ctctgctccc agactttacc ccaaatccct gccaggtgtc 2280 tgccctctgg tcaaaatgag aaattggcaa aggggtgcaa acatatcgca gtattgggaa 2340 acaacaaaag gtcacccctt tatcatgatg ctctttctct tttatgtgct cataatattc 2400 tgatataatt tatagagaat agatactgca ctttttactc tctggatatt tactgctgga 2460 aatctgaggc aaactgtaat aatctctgcc atgccagtta taaaattcat tatcttagtc 2520 tatgttcaga gatttttcta ctagctggca ttaccctctt ggtaataaac aatgaaaaac 2580 acatcttctg agttatgtta atctgcatct ttagaatagg aaataatagc actcagtcaa 2640 aagttcagta taattttcat attaataaaa gacatgaaac tatgtaaaaa taattccatg 2700 cacaatatgt tataataaca atgacttcca atatttacta agaatttagt cagaaaacaa 2760 gtttctcaaa ttatagatga aaattctcaa ctagtatcat aatcttaact tttaattcag 2820 gtcttcctaa tttttatttt cctaattact tggcactaaa aataatttaa tacaacaaat 2880 aaaaatattt tctacttcaa atacttgcct aaacaatata aaatcatttt agtttttgag 2940 gaagtaatat ttcatatttt aaatatgtag tataaattaa aattgactta tttaaattac 3000 aataagagtt gtgtgaggat tagtaagatt taagtacagt ttatattatt gccaacatag 3060 acttttgttt ttcaaatgtc acaaatatct tttattattt gtagatttat ttcttttatg 3120 aagtagtcaa atgaatcagc tcacccttga ctgtaacaaa atactgcttg gtgacttggg 3180 acagacaggg ttttaacctc tgacagcgag attcattgtg gagcaagagc caatcataga 3240 tcctgacgac ac tgtctca tctaagttgg aatataaaaa gccacttgga atacagtata 3300 aaagattcac tggtgtggca agttgtctct cagactgtac atgcattaaa attttgcttg 3360 gcattactca aaagcaaaag aaaagtaaaa ggaagaaaca agaacaagaa aaaagattat 3420 attgatttta aaatc 3435

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de ácido nucleico aislado, representada por la Figura 2 (SEQ ID NO: 1). 2. Un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informante, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula informante se enlaza operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1. 3. El vector según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha molécula informante es seleccionada a partir del grupo consistente en luciferasa, ß-galactosidasa y Cloramfenicol Acetiltransferasa (CAT). 4. El vector según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha molécula informante es luciferasa. 5. Una célula huésped que comprende dicho vector según la reivindicación 3. 6. Un anticuerpo purificado producido en respuesta a la inmunización con miostatina. 7. Una composición que comprende dicho anticuerpo purificado según la reivindicación 6. 8. Un método de identificación de una composición que inhibe la activación del promotor de la miostatina, caracterizado porque comprende las etapas de: a) construir un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico representada por la figura 2 (SEQ ID NO: 1) y una secue?cia de ácido nucleico que codifica una molécula informante, codificando dicha secuencia de ácido nucleico dicha molécula informante que se enlaza operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico representada por la figura 2; b) introducir dicho vector dentro de una célula huésped por un tiempo y bajo condiciones convenientes para la expresión de la miostatina; c) exponer dicha célula huésped a una composición que puede inhibir la activación del promotor de la miostatina y un substrato especifico para dicha molécula informante; y d) medir la señal generada por la reacción de dicha molécula informante y dicho substrato en comparación con la producida por una célula huésped de control, indicando una señal más pequeña por dicha célula huésped de (c) que dicha composición inhibirá la activación de dicho promotor de la miostatina. todo para identificar una composición que inhibe la expresión tina, caracterizado porque comprende las etapas de: a) agregar un anticuerpo seleccionado a partir del grupo consistente en un anticuerpo monoclonal o policlonal producido en contra de la miostatina para una fase sólida; b) agregar concentraciones conocidas de miostatina o una muestra celular que comprende miostatina expuesta a dicha composición de prueba, para dicha fase sólida, con objeto de formar un primer complejo entre dicho anticuerpo y dichas concentraciones conocidas de miostatina o miostatina en dicha muestra celular; c) agregar un segundo anticuerpo a dicho primer complejo, seleccionado a partir del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal producido en contra de la miostatina por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un segundo complejo entre dicho primer complejo y dicho segundo anticuerpo; d) contactar dicho segundo complejo con un reactivo indicador que comprende una señal que genera un compuesto anexo a un anticuerpo en contra de dicho anticuerpo de dicho segundo complejo, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un tercer complejo; y e) detectar la presencia de una señal mensurable, indicando la ausencia de dicha señal que dicha composición inhibe la expresión de la miostatina e indicando la presencia de dicha señal que dicha composición no inhibe la expresión de la miostatina. todo para identificar una composición etapas de: a) recubrir una cantidad fija de miostatina sobre una fase sólida; b) agregar concentraciones conocidas de miostatina o una muestra celular que comprende miostatina, expuesta a dicha composición; c) contactar un anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en un anticuerpo monocional o un anticuerpo policlonal producido en contra de la miostatina para dicha miostatina en (a) y (b) por un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un primer complejo, en donde la miostatina de (a) compite con la miostatina de (b) para dicho anticuerpo monoclonal o policlonal; d) contactar dicho primer complejo con un reactivo indicador que comprende una señal que genera un compuesto anexo a un anticuerpo en contra de dicho anticuerpo de dicho primer complejo, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un segundo complejo; y e) detectar una señal mensurable, indicando una señal mayor en comparación con un control, que dicha composición inhibe la expresión de la miostatina. 11. Un método para identificar una composición, en una mezcla de composiciones, que previene que la miostatina se enlace a un receptor de miostatina, caracterizado porque comprende las etapas de: a) mezclar miostatina purificada con dicha mezcla de composiciones; b) pasar la mezcla resultante de la etapa (a) a través de un filtro que tiene poros de una dimensión tal que una composición que se acompleja a la miostatina no pasa a través de dicho filtro; y c) determinar la estructura de una composición acomplejada, identificando así una composición que previene que la miostatina se enlace a un receptor de miostatina. 12. Un método para identificar una composición que evita que la miostatina se enlace a un receptor de miostatina, caracterizado porque comprende la etapas de: a) radioetiquetar miostatina recombinante; b) incubar dicha miostatina recombinante radioetiquetada con células o membranas que comprenden un receptor de miostatina; c) contactar la mezcla incubada de la etapa (b) con una composición de interés; d) separar la miostatina radioetiquetada ligada a células o membranas de la miostatina no enlazada; y e) determinar la cantidad de radioactividad en la miostatina enlazada, comparada con un control, indicando un nivel inferior de radioactividad en la miostatina enlazada en comparación con dicho control una composición que inhibe que la miostatina se enlace a un receptor. 13. Un método que previene el agotamiento muscular en un mamífero, caracterizado porque comprende la administración a dicho mamífero de una composición que comprende un ingrediente activo que origina un efecto seleccionado dei grupo consistente en prevenir la activación del promotor de la miostatina, prevenir la síntesis de la miostatina, y prevenir que la miostatina se enlace a su receptor objetivo, en una cantidad terapéuticamente eficaz, de tal manera que se evite el agotamiento muscular.