JP2003024070A - 新規なgタンパク質共役型受容体タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents
新規なgタンパク質共役型受容体タンパク質及びその遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】新規なGタンパク質共役型受容体タンパク質及
びその遺伝子の提供。 【解決手段】特定のアミノ酸配列と同一若しくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とするGタンパ
ク質共役型受容体タンパク質及び当該タンパク質コード
する塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。さら
に、このペプチドに対する抗体や、当該ポリヌクレオチ
ドを用いたGタンパク質共役型受容体タンパク質の発現
状態の分析法についても提示する。
びその遺伝子の提供。 【解決手段】特定のアミノ酸配列と同一若しくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とするGタンパ
ク質共役型受容体タンパク質及び当該タンパク質コード
する塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。さら
に、このペプチドに対する抗体や、当該ポリヌクレオチ
ドを用いたGタンパク質共役型受容体タンパク質の発現
状態の分析法についても提示する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なGタンパク
質受容体タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌ
クレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タン
パク質の製造方法等に関する。
質受容体タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌ
クレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タン
パク質の製造方法等に関する。
【0002】
【従来の技術】多くのホルモン、神経伝達物質等の生理
活性物質は、細胞膜に存在する特異的な受容体タンパク
質を通じて生体中の機能を発揮している。これらの受容
体タンパク質中の多くは、7個の膜貫通領域を有する共
通した構造を有しており、GTP結合タンパク質(Gタン
パク質ともいう)の活性化を通じて、細胞内シグナル伝
達を行なうことからGタンパク質共役型受容体(GPCR:
G protein coupled receptor)タンパク質といわれる。
Gタンパク質共役型受容体タンパク質は、生体中に天然
に存在するリガンド(例えば、前記生理活性物質)との
結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナル
により細胞増殖の活性化や抑制等の様々な生体内反応が
惹起される。従って、生体内の各種細胞や臓器における
複雑な機能を調節する物質と、その特異的受容体タンパ
ク質(特にはGタンパク質共役型受容体タンパク質)と
の関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の
生理調節機能を解明し、それら機能と密接に関連した医
薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
活性物質は、細胞膜に存在する特異的な受容体タンパク
質を通じて生体中の機能を発揮している。これらの受容
体タンパク質中の多くは、7個の膜貫通領域を有する共
通した構造を有しており、GTP結合タンパク質(Gタン
パク質ともいう)の活性化を通じて、細胞内シグナル伝
達を行なうことからGタンパク質共役型受容体(GPCR:
G protein coupled receptor)タンパク質といわれる。
Gタンパク質共役型受容体タンパク質は、生体中に天然
に存在するリガンド(例えば、前記生理活性物質)との
結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナル
により細胞増殖の活性化や抑制等の様々な生体内反応が
惹起される。従って、生体内の各種細胞や臓器における
複雑な機能を調節する物質と、その特異的受容体タンパ
ク質(特にはGタンパク質共役型受容体タンパク質)と
の関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の
生理調節機能を解明し、それら機能と密接に関連した医
薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【0003】ところで、ヒトゲノムの97%に及ぶドラフ
ト配列が報告された現在もなお、全遺伝子数の予測数が
議論となることで判るように、ゲノム塩基配列決定と遺
伝子同定とは同義ではなく、異なる作業フェイズであ
る。本発明者らは、数年前から未解析のゲノム塩基配列
からの体系的遺伝子予測と転写・スプライシングレベル
での検証作業を進めてきた。その結果、現在の公共EST
データベースにカタログ化された転写産物は、全転写産
物の3.6〜6.7割程度と見積もられた。すなわち、ESTア
プローチによる遺伝子カタログ化作業の検出限界は、予
想外に高く、転写量の低い遺伝子群の相当数が現時点で
存在すら認識されていないと考えられる。
ト配列が報告された現在もなお、全遺伝子数の予測数が
議論となることで判るように、ゲノム塩基配列決定と遺
伝子同定とは同義ではなく、異なる作業フェイズであ
る。本発明者らは、数年前から未解析のゲノム塩基配列
からの体系的遺伝子予測と転写・スプライシングレベル
での検証作業を進めてきた。その結果、現在の公共EST
データベースにカタログ化された転写産物は、全転写産
物の3.6〜6.7割程度と見積もられた。すなわち、ESTア
プローチによる遺伝子カタログ化作業の検出限界は、予
想外に高く、転写量の低い遺伝子群の相当数が現時点で
存在すら認識されていないと考えられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】Gタンパク質共役型受
容体タンパク質と生体内リガンドとの結合を阻害する物
質(アンタゴニスト)、前記受容体に結合して生体内リ
ガンドと同様なシグナル伝達を引き起こす物質(アゴニ
スト)は、前記受容体が関連する生体機能を調節する医
薬品として利用されてきた。よって、Gタンパク質共役
型受容体タンパク質を新たに見出し、該タンパク質の遺
伝子をクローニングすることは、生体機能を科学的に理
解する上において重要であるばかりでなく、新規の作用
機作を有する効果的な医薬品の開発上、極めて重要であ
る。ところが、生体中に存在する全てのGタンパク質共
役型受容体が同定されているわけではなく、現在もなお
未知のGタンパク質共役型受容体、及び対応するリガン
ドが未同定のいわゆるオーファン受容体が多数存在して
おり、新たなGタンパク質共役型受容体の探索および機
能解明が切望されている。
容体タンパク質と生体内リガンドとの結合を阻害する物
質(アンタゴニスト)、前記受容体に結合して生体内リ
ガンドと同様なシグナル伝達を引き起こす物質(アゴニ
スト)は、前記受容体が関連する生体機能を調節する医
薬品として利用されてきた。よって、Gタンパク質共役
型受容体タンパク質を新たに見出し、該タンパク質の遺
伝子をクローニングすることは、生体機能を科学的に理
解する上において重要であるばかりでなく、新規の作用
機作を有する効果的な医薬品の開発上、極めて重要であ
る。ところが、生体中に存在する全てのGタンパク質共
役型受容体が同定されているわけではなく、現在もなお
未知のGタンパク質共役型受容体、及び対応するリガン
ドが未同定のいわゆるオーファン受容体が多数存在して
おり、新たなGタンパク質共役型受容体の探索および機
能解明が切望されている。
【0005】Gタンパク質共役型受容体は、そのシグナ
ル伝達作用を指標とする、新規生体内リガンドの探索、
該受容体に対するアゴニスト(刺激薬)またはアンタゴ
ニスト(拮抗薬)の探索に有用である。一方、生理的な
リガンドが同定されておらずとも、該受容体遺伝子の破
壊実験(ノックアウト動物)の解析から、前記受容体の
生理作用を解析することによって、該受容体に対するア
ゴニスト又はアンタゴニストを作製することも可能であ
る。そのようにして作製されたアゴニスト又はアンタゴ
ニストは、前記Gタンパク質共役型受容体の機能不全に
起因する疾患の予防、診断又は治療薬として活用するこ
とが期待できる。さらに、Gタンパク質共役型受容体の
遺伝子変異に起因する、生体内での該受容体の機能の昂
進又は低下が、何らかの疾患の原因となっている場合も
ある。この場合には、前記受容体遺伝子の生体内(又は
特定臓器)への導入や、前記受容体遺伝子に対するアン
チセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用すること
もできる。その場合には、前記受容体遺伝子の塩基配列
は、遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために不可欠
な情報であり、該受容体遺伝子は、該受容体の機能不全
に関与する疾患の予防、診断又は治療薬に応用すること
もできる。
ル伝達作用を指標とする、新規生体内リガンドの探索、
該受容体に対するアゴニスト(刺激薬)またはアンタゴ
ニスト(拮抗薬)の探索に有用である。一方、生理的な
リガンドが同定されておらずとも、該受容体遺伝子の破
壊実験(ノックアウト動物)の解析から、前記受容体の
生理作用を解析することによって、該受容体に対するア
ゴニスト又はアンタゴニストを作製することも可能であ
る。そのようにして作製されたアゴニスト又はアンタゴ
ニストは、前記Gタンパク質共役型受容体の機能不全に
起因する疾患の予防、診断又は治療薬として活用するこ
とが期待できる。さらに、Gタンパク質共役型受容体の
遺伝子変異に起因する、生体内での該受容体の機能の昂
進又は低下が、何らかの疾患の原因となっている場合も
ある。この場合には、前記受容体遺伝子の生体内(又は
特定臓器)への導入や、前記受容体遺伝子に対するアン
チセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用すること
もできる。その場合には、前記受容体遺伝子の塩基配列
は、遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために不可欠
な情報であり、該受容体遺伝子は、該受容体の機能不全
に関与する疾患の予防、診断又は治療薬に応用すること
もできる。
【0006】本発明は、上記ように有用な新規なGタン
パク質共役型受容体タンパク質を提供するものである。
すなわち、新規なGタンパク質共役型受容体タンパク質
又はその塩、該タンパク質の部分ペプチド又はその塩、
該Gタンパク質共役型受容体タンパク質又はその部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチド(DNA、RNA又はそ
れらの誘導体)を含有するポリヌクレオチド(DNA、RNA
およびそれらの誘導体)、該ポリヌクレオチドを含有す
る組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転
換体、該Gタンパク質共役型受容体タンパク質またはそ
の塩の製造法、該Gタンパク質共役型受容体タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
該Gタンパク質共役型受容体タンパク質の発現量を変化
させる化合物、該Gタンパク質共役型受容体に対するリ
ガンドの決定方法、リガンドと該Gタンパク質共役型受
容体タンパク質との結合性を変化させる化合物(アンタ
ゴニスト、アゴニスト)またはその塩のスクリーニング
方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方
法もしくはスクリーニングキットを用いて得られるリガ
ンドと該Gタンパク質共役型受容体タンパク質との結合
性を変化させる化合物(アンタゴニスト、アゴニスト)
またはその塩、およびリガンドと該Gタンパク質共役型
受容体タンパク質との結合性を変化させる化合物(アン
タゴニスト、アゴニスト)もしくは該Gタンパク質共役
型受容体タンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩を含有してなる医薬などを提供する。
パク質共役型受容体タンパク質を提供するものである。
すなわち、新規なGタンパク質共役型受容体タンパク質
又はその塩、該タンパク質の部分ペプチド又はその塩、
該Gタンパク質共役型受容体タンパク質又はその部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチド(DNA、RNA又はそ
れらの誘導体)を含有するポリヌクレオチド(DNA、RNA
およびそれらの誘導体)、該ポリヌクレオチドを含有す
る組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転
換体、該Gタンパク質共役型受容体タンパク質またはそ
の塩の製造法、該Gタンパク質共役型受容体タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
該Gタンパク質共役型受容体タンパク質の発現量を変化
させる化合物、該Gタンパク質共役型受容体に対するリ
ガンドの決定方法、リガンドと該Gタンパク質共役型受
容体タンパク質との結合性を変化させる化合物(アンタ
ゴニスト、アゴニスト)またはその塩のスクリーニング
方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方
法もしくはスクリーニングキットを用いて得られるリガ
ンドと該Gタンパク質共役型受容体タンパク質との結合
性を変化させる化合物(アンタゴニスト、アゴニスト)
またはその塩、およびリガンドと該Gタンパク質共役型
受容体タンパク質との結合性を変化させる化合物(アン
タゴニスト、アゴニスト)もしくは該Gタンパク質共役
型受容体タンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩を含有してなる医薬などを提供する。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、VTS(virtualtr
anscribed sequence)アプローチによって、ヒト由来の
新規なGタンパク質共役型受容体タンパク質をコードす
る遺伝子cDNAを取得することに成功し、本発明を完成す
るに至った。
を解決するため鋭意研究を行った結果、VTS(virtualtr
anscribed sequence)アプローチによって、ヒト由来の
新規なGタンパク質共役型受容体タンパク質をコードす
る遺伝子cDNAを取得することに成功し、本発明を完成す
るに至った。
【0008】すなわち、本発明は、以下の(1)〜(26)で
ある。 (1) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列と同一若しく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする
Gタンパク質共役型受容体タンパク質又はその塩。 (2) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質の
部分アミノ酸配列を含むことを特徴とするペプチドまた
はその塩。 (3) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
は上記(2)のペプチドをコードする塩基配列を含むこと
を特徴とするポリヌクレオチド。
ある。 (1) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列と同一若しく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする
Gタンパク質共役型受容体タンパク質又はその塩。 (2) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質の
部分アミノ酸配列を含むことを特徴とするペプチドまた
はその塩。 (3) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
は上記(2)のペプチドをコードする塩基配列を含むこと
を特徴とするポリヌクレオチド。
【0009】(4) ポリヌクレオチドがDNAであることを
特徴とする上記(3)のポリヌクレオチド。 (5) 配列番号1で表される塩基配列又は該塩基配列の一
部を含む上記(3)のポリヌクレオチド。 (6) 上記(3)のポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター。
特徴とする上記(3)のポリヌクレオチド。 (5) 配列番号1で表される塩基配列又は該塩基配列の一
部を含む上記(3)のポリヌクレオチド。 (6) 上記(3)のポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター。
【0010】(7) 上記(6)の組換えベクターで形質転換
させた形質転換体。 (8) 上記(7)の形質転換体を培地に培養し、得られる培
養物から上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク
質を採取することを特徴とする上記(1)のGタンパク質
共役型受容体タンパク質またはその塩の製造方法。 (9) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチドまたはその塩に
対する抗体。
させた形質転換体。 (8) 上記(7)の形質転換体を培地に培養し、得られる培
養物から上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク
質を採取することを特徴とする上記(1)のGタンパク質
共役型受容体タンパク質またはその塩の製造方法。 (9) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチドまたはその塩に
対する抗体。
【0011】(10) 抗体が上記(1)のGタンパク質共役型
受容体タンパク質のシグナル伝達を阻害する活性を有す
るものである上記(9)の抗体。 (11) 上記(9)の抗体を有効成分として含有する薬学的組
成物。 (12) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質に
対するリガンド。
受容体タンパク質のシグナル伝達を阻害する活性を有す
るものである上記(9)の抗体。 (11) 上記(9)の抗体を有効成分として含有する薬学的組
成物。 (12) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質に
対するリガンド。
【0012】(13) 上記(12)のリガンドを有効成分とし
て含有する薬学的組成物。 (14) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチドまたはその塩に
対するリガンド候補物質の特異的結合能を調べる工程を
含むことを特徴とする該受容体タンパク質に対するリガ
ンドの決定方法。 (15) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチド又はその塩を使
用することを特徴とする、リガンドと上記(1)のGタン
パク質共役型受容体タンパク質又はその塩との結合性を
変化させる物質のスクリーニング方法。
て含有する薬学的組成物。 (14) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチドまたはその塩に
対するリガンド候補物質の特異的結合能を調べる工程を
含むことを特徴とする該受容体タンパク質に対するリガ
ンドの決定方法。 (15) 上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質又
はその塩、あるいは上記(2)のペプチド又はその塩を使
用することを特徴とする、リガンドと上記(1)のGタン
パク質共役型受容体タンパク質又はその塩との結合性を
変化させる物質のスクリーニング方法。
【0013】(16) 上記(1)のGタンパク質共役型受容
体タンパク質又はその塩、及び/あるいは上記(2)のペ
プチド又はその塩を構成要素として含むことを特徴とす
る、上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質と
該受容体タンパク質のリガンドとの間の結合性を変化さ
せる物質のスクリーニング用キット。 (17) 上記(15)のスクリーニング方法又は上記(16)のス
クリーニング用キットを使用して得られる、上記(1)の
Gタンパク質共役型受容体タンパク質と該受容体タンパ
ク質のリガンドとの間の結合性を変化させる物質。 (18) 上記(17)の物質を含有する薬学的組成物。
体タンパク質又はその塩、及び/あるいは上記(2)のペ
プチド又はその塩を構成要素として含むことを特徴とす
る、上記(1)のGタンパク質共役型受容体タンパク質と
該受容体タンパク質のリガンドとの間の結合性を変化さ
せる物質のスクリーニング用キット。 (17) 上記(15)のスクリーニング方法又は上記(16)のス
クリーニング用キットを使用して得られる、上記(1)の
Gタンパク質共役型受容体タンパク質と該受容体タンパ
ク質のリガンドとの間の結合性を変化させる物質。 (18) 上記(17)の物質を含有する薬学的組成物。
【0014】(19) 上記(3)のポリヌクレオチドとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチド。 (20) 上記(3)のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列
又は該塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド。 (21) 被検体中のmRNAと上記(20)のポリヌクレオチドと
の間のハイブリダイゼーションの強度を測定する工程を
包含することを特徴とする上記(1)のGタンパク質共役
型受容体タンパク質のmRNAの定量方法。
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチド。 (20) 上記(3)のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列
又は該塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド。 (21) 被検体中のmRNAと上記(20)のポリヌクレオチドと
の間のハイブリダイゼーションの強度を測定する工程を
包含することを特徴とする上記(1)のGタンパク質共役
型受容体タンパク質のmRNAの定量方法。
【0015】(22) 被検体中のタンパク質と上記(9)の
抗体との間の結合の強度を測定する工程を包含すること
を特徴とする上記(1)のGタンパク質共役型受容体タン
パク質の定量方法。 (23) 上記(21)の受容体タンパク質mRNAの定量方法又は
上記(22)の受容体タンパク質の定量方法を用いることを
特徴とする上記(1)のGタンパク質共役型受容体の機能
が関連する疾患の検査方法。 (24) 候補物質を投与又は暴露した被検細胞又は被検動
物における、上記(1)のGタンパク質共役型受容体タン
パク質の発現レベルを、上記(21)の定量方法を用いてmR
NAレベルで、あるいは上記(22)の定量方法を用いてタン
パク質レベルで測定する工程を包含することを特徴とす
る上記(1)のGタンパク質共役型受容体の発現を変化さ
せる物質のスクリーニング方法。
抗体との間の結合の強度を測定する工程を包含すること
を特徴とする上記(1)のGタンパク質共役型受容体タン
パク質の定量方法。 (23) 上記(21)の受容体タンパク質mRNAの定量方法又は
上記(22)の受容体タンパク質の定量方法を用いることを
特徴とする上記(1)のGタンパク質共役型受容体の機能
が関連する疾患の検査方法。 (24) 候補物質を投与又は暴露した被検細胞又は被検動
物における、上記(1)のGタンパク質共役型受容体タン
パク質の発現レベルを、上記(21)の定量方法を用いてmR
NAレベルで、あるいは上記(22)の定量方法を用いてタン
パク質レベルで測定する工程を包含することを特徴とす
る上記(1)のGタンパク質共役型受容体の発現を変化さ
せる物質のスクリーニング方法。
【0016】(25) 上記(24)のスクリーニング方法を用
いて得られる上記(1)のGタンパク質共役型受容体の発
現を変化させる物質。 (26) 上記(25)の物質を有効成分として含む薬学的組成
物。 以下、本発明を詳細に説明する。
いて得られる上記(1)のGタンパク質共役型受容体の発
現を変化させる物質。 (26) 上記(25)の物質を有効成分として含む薬学的組成
物。 以下、本発明を詳細に説明する。
【0017】
【発明の実施の形態】本発明のGタンパク質共役型受容
体タンパク質(受容体タンパク質ともいう)は、配列番
号2で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一
のアミノ酸配列を含有する受容体タンパク質である。本
受容体タンパク質は、以下のようにして得ることができ
る。
体タンパク質(受容体タンパク質ともいう)は、配列番
号2で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一
のアミノ酸配列を含有する受容体タンパク質である。本
受容体タンパク質は、以下のようにして得ることができ
る。
【0018】1. 本発明の受容体タンパク質をコード
する遺伝子のクローニング 本発明の受容体タンパク質をコードする遺伝子は、VTS
(virtual transcribedsequence:仮想転写配列)アプ
ローチによってクローニングすることができる。ここで
「VTSアプローチ」とは、ヒトゲノム配列データか
ら、遺伝子予測プログラムによって遺伝子コード領域を
予測及びリスト化し、ESTとして確認されていないVTS
を、多様なRNA源からRT-PCRによって検出し、検出さ
れた断片の塩基配列を決定することによってスプライシ
ングの有無を確認し、実在遺伝子としての評価を与え
ることによって、実際に発現されている新規遺伝子を同
定する手法をいう。以下、本発明の受容体タンパク質を
コードする遺伝子のクローニング方法を、図1を用いて
具体的に説明する。
する遺伝子のクローニング 本発明の受容体タンパク質をコードする遺伝子は、VTS
(virtual transcribedsequence:仮想転写配列)アプ
ローチによってクローニングすることができる。ここで
「VTSアプローチ」とは、ヒトゲノム配列データか
ら、遺伝子予測プログラムによって遺伝子コード領域を
予測及びリスト化し、ESTとして確認されていないVTS
を、多様なRNA源からRT-PCRによって検出し、検出さ
れた断片の塩基配列を決定することによってスプライシ
ングの有無を確認し、実在遺伝子としての評価を与え
ることによって、実際に発現されている新規遺伝子を同
定する手法をいう。以下、本発明の受容体タンパク質を
コードする遺伝子のクローニング方法を、図1を用いて
具体的に説明する。
【0019】まず、GENESCAN等の遺伝子予測プログラム
によってヒトゲノム配列上に遺伝子コード領域を予測
し、それらをリスト化してVTSデータベースを構築す
る。次いで、仮想転写配列(VTS)群に対して、データ
ベース中から未だESTとして発現が確認されておらず、
Gタンパク質共役型受容体タンパク質をコードすると考
えられるVTSを検索する。ここで、検索には複数のGタ
ンパク質共役型受容体タンパク質中に存在するアミノ酸
配列を、query配列(問合わせ配列)として使用するこ
とができる。
によってヒトゲノム配列上に遺伝子コード領域を予測
し、それらをリスト化してVTSデータベースを構築す
る。次いで、仮想転写配列(VTS)群に対して、データ
ベース中から未だESTとして発現が確認されておらず、
Gタンパク質共役型受容体タンパク質をコードすると考
えられるVTSを検索する。ここで、検索には複数のGタ
ンパク質共役型受容体タンパク質中に存在するアミノ酸
配列を、query配列(問合わせ配列)として使用するこ
とができる。
【0020】得られたVTSの、ゲノム配列上に予測される
エクソン及びイントロンに基づいて、図1(a)のように
1個以上のイントロンを挟むようエクソン上にプライマ
ー配列を設計・合成する。ここで、プライマーの設計
は、OLIGO(National Biosciences社)等の市販のプラ
イマー設計ソフトを用いて行うことができる。設定した
プライマーを用い、多様なRNA源を用いてRT-PCRを行
う。ここで、RNAの供給源としては、ヒト由来のあらゆ
る細胞(例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、骨髄
細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、繊
維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞等)、又はそれら
の細胞が存在するあらゆる組織(例えば、脳、脊髄、下
垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋
等)が挙げられる。前記細胞及び組織は、人工中絶又は
自然流産したヒトから調製することもできる。RNAの調
製は、当該技術分野において通常用いられる手法により
行うことができる。
エクソン及びイントロンに基づいて、図1(a)のように
1個以上のイントロンを挟むようエクソン上にプライマ
ー配列を設計・合成する。ここで、プライマーの設計
は、OLIGO(National Biosciences社)等の市販のプラ
イマー設計ソフトを用いて行うことができる。設定した
プライマーを用い、多様なRNA源を用いてRT-PCRを行
う。ここで、RNAの供給源としては、ヒト由来のあらゆ
る細胞(例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、骨髄
細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、繊
維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞等)、又はそれら
の細胞が存在するあらゆる組織(例えば、脳、脊髄、下
垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋
等)が挙げられる。前記細胞及び組織は、人工中絶又は
自然流産したヒトから調製することもできる。RNAの調
製は、当該技術分野において通常用いられる手法により
行うことができる。
【0021】RT-PCRによって得られるDNA断片〔図1の
(c):実証エキソン配列〕の塩基配列を決定する。これ
により当該DNA断片が、ゲノム配列から予測されるスプ
ライシング物〔図1の(b):予測エキソン配列〕と同一
であることを確認する。次いで、確認された配列に基づ
いて設計したプライマーを用いて5’-RACE及び3’-RACE
を実行する〔図1の(d)〕する。これにより本発明のG
タンパク質共役型受容体タンパク質の全長アミノ酸配列
をコードするcDNAの塩基配列を明らかにすることができ
る〔図1の(e)〕。
(c):実証エキソン配列〕の塩基配列を決定する。これ
により当該DNA断片が、ゲノム配列から予測されるスプ
ライシング物〔図1の(b):予測エキソン配列〕と同一
であることを確認する。次いで、確認された配列に基づ
いて設計したプライマーを用いて5’-RACE及び3’-RACE
を実行する〔図1の(d)〕する。これにより本発明のG
タンパク質共役型受容体タンパク質の全長アミノ酸配列
をコードするcDNAの塩基配列を明らかにすることができ
る〔図1の(e)〕。
【0022】本発明において、ヒトからクローニングさ
れた新規なGタンパク質受容体タンパク質及び該タンパ
ク質をコードする遺伝子cDNAを例示すると以下のように
なる。すなわち、配列番号2は、ヒト由来のGタンパク
質受容体タンパク質GPR97のアミノ酸配列であり、
配列番号1は、当該タンパク質をコードする遺伝子cDNA
の塩基配列である。一旦、本発明の遺伝子cDNAの塩基配
列が確定されると、その後は化学合成によって、あるい
はPCRによって本発明のポリヌクレオチドを得ることが
できる。例えば、本発明のGPR97タンパク質の全長
アミノ酸配列(配列番号2)をコードするDNA(配列番
号1)は、ヒト骨髄由来cDNAを鋳型として、5’-atggcg
acgcccaggggcct-3’(配列番号4)及び5’-ttcttgagatgc
ggagtggg-3’(配列番号5)の塩基配列を有するプライマ
ーを用いることにより、PCRによって容易に調製するこ
とができる。但し、本発明においては、プライマーはこ
れらに限定されるものではない。
れた新規なGタンパク質受容体タンパク質及び該タンパ
ク質をコードする遺伝子cDNAを例示すると以下のように
なる。すなわち、配列番号2は、ヒト由来のGタンパク
質受容体タンパク質GPR97のアミノ酸配列であり、
配列番号1は、当該タンパク質をコードする遺伝子cDNA
の塩基配列である。一旦、本発明の遺伝子cDNAの塩基配
列が確定されると、その後は化学合成によって、あるい
はPCRによって本発明のポリヌクレオチドを得ることが
できる。例えば、本発明のGPR97タンパク質の全長
アミノ酸配列(配列番号2)をコードするDNA(配列番
号1)は、ヒト骨髄由来cDNAを鋳型として、5’-atggcg
acgcccaggggcct-3’(配列番号4)及び5’-ttcttgagatgc
ggagtggg-3’(配列番号5)の塩基配列を有するプライマ
ーを用いることにより、PCRによって容易に調製するこ
とができる。但し、本発明においては、プライマーはこ
れらに限定されるものではない。
【0023】2.本発明の受容体タンパク質及びその部
分ペプチド 本発明の受容体タンパク質は、配列番号2で表わされる
アミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を
含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号2で表わさ
れるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約70%以
上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90
%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するア
ミノ酸配列を含み、且つ配列番号2で表わされるアミノ
酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有する
タンパク質をいう。「実質的に同質の活性」とは、リガ
ンド結合活性、シグナル情報伝達作用等の受容体タンパ
ク質が元来有する生物活性が性質的に同質であることを
いう。より詳細には、リガンド結合活性やシグナル情報
伝達作用等の生物活性が同等(例えば、約0.01〜100
倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2
倍)である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質
と異なっていてもよい。なお、リガンド結合活性やシグ
ナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準
じて行なうことができるが、例えば、後述するリガンド
の決定方法等に従って測定することができる。
分ペプチド 本発明の受容体タンパク質は、配列番号2で表わされる
アミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を
含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号2で表わさ
れるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約70%以
上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90
%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するア
ミノ酸配列を含み、且つ配列番号2で表わされるアミノ
酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有する
タンパク質をいう。「実質的に同質の活性」とは、リガ
ンド結合活性、シグナル情報伝達作用等の受容体タンパ
ク質が元来有する生物活性が性質的に同質であることを
いう。より詳細には、リガンド結合活性やシグナル情報
伝達作用等の生物活性が同等(例えば、約0.01〜100
倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2
倍)である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質
と異なっていてもよい。なお、リガンド結合活性やシグ
ナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準
じて行なうことができるが、例えば、後述するリガンド
の決定方法等に従って測定することができる。
【0024】配列番号2で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、
配列番号2で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以
上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10
個程度、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号2で表わされるアミノ酸配
列に1又は2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より
好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個)
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、並びに配列番号2
で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以上(好まし
くは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さ
らに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられ
る。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、受容体タン
パク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手
法によって、改変することによって行うことができる。
例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット
〔例えば、MutanTM−G(TAKARA社)、MutanTM−K(TAKA
RA社)〕等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公
知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩基の
置換行なうことによって達成することができる。
質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、
配列番号2で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以
上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10
個程度、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号2で表わされるアミノ酸配
列に1又は2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より
好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個)
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、並びに配列番号2
で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以上(好まし
くは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さ
らに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられ
る。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、受容体タン
パク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手
法によって、改変することによって行うことができる。
例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット
〔例えば、MutanTM−G(TAKARA社)、MutanTM−K(TAKA
RA社)〕等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公
知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩基の
置換行なうことによって達成することができる。
【0025】また、本発明の受容体タンパク質のC末端
は、通常カルボキシル基(−COOH)であるが、当該カル
ボキシル基は、アミド(−CONH2)やエステル(−COO
R)等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル
中のRとしては、C1-6アルキル基(例えば、メチル、
エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル)、C3-
8シクロアルキル基(例えば、シクロペンチル、シクロ
ヘキシル)、C6-12アリール基(例えば、フェニル、α
−ナフチル)、フェニル-C1-2アルキル基(例えば、ベ
ンジル、フェネチル)、α−ナフチル−C1-2アルキル
基(例えば、α−ナフチルメチル)等が挙げられる。そ
の他、経口用エステルとして汎用されているピバロイル
オキシメチルエステルとすることも可能である。本発明
の受容体タンパク質がC末端以外にもそのポリペプチド
鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキ
シル基がアミド化又はエステル化されているものも、本
発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとし
ては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明の
受容体タンパク質のN末端は、通常アミノ基(−NH2)
であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等
のC1-6アシル基等で化学修飾されていてもよい。その
他、N端側が生体内で切断され生成したグルタミル基が
ピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側
鎖上の置換基(例えば、−OH、−SH、アミノ基、イミダ
ゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な
官能基(例えば、ホルミル基、アセチル等)で化学修飾
されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のタ
ンパク質に含まれる。
は、通常カルボキシル基(−COOH)であるが、当該カル
ボキシル基は、アミド(−CONH2)やエステル(−COO
R)等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル
中のRとしては、C1-6アルキル基(例えば、メチル、
エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル)、C3-
8シクロアルキル基(例えば、シクロペンチル、シクロ
ヘキシル)、C6-12アリール基(例えば、フェニル、α
−ナフチル)、フェニル-C1-2アルキル基(例えば、ベ
ンジル、フェネチル)、α−ナフチル−C1-2アルキル
基(例えば、α−ナフチルメチル)等が挙げられる。そ
の他、経口用エステルとして汎用されているピバロイル
オキシメチルエステルとすることも可能である。本発明
の受容体タンパク質がC末端以外にもそのポリペプチド
鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキ
シル基がアミド化又はエステル化されているものも、本
発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとし
ては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明の
受容体タンパク質のN末端は、通常アミノ基(−NH2)
であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等
のC1-6アシル基等で化学修飾されていてもよい。その
他、N端側が生体内で切断され生成したグルタミル基が
ピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側
鎖上の置換基(例えば、−OH、−SH、アミノ基、イミダ
ゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な
官能基(例えば、ホルミル基、アセチル等)で化学修飾
されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のタ
ンパク質に含まれる。
【0026】上記いずれかの受容体タンパク質中の部分
アミノ酸配列を含むペプチド(部分ペプチドともいう)
も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部分ペ
プチドは、配列番号2で表されるアミノ酸配列と同一又
は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を
含むものである限り、いずれのものであってもよい。特
に、本発明の部分ペプチドの中でも、受容体タンパク質
が天然に存在する場合に細胞膜の外に露出し、且つリガ
ンド結合活性を保有する部分は、受容体タンパク質のリ
ガンドを決定において特に有用である。そのような部分
ペプチドとしては、配列番号2で表わされるアミノ酸配
列の疎水性プロット解析において、細胞外領域(親水性
部位)と分析される部分が挙げられる。本発明の部分ペ
プチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも10個以上、
好ましくは30個以上、より好ましくは80個以上である。
通常、本発明の部分ペプチドのC末端はカルボキシル基
(−COOH)、N末端はアミノ基(−NH2)であるが、こ
れらは前記受容体タンパク質の場合のように、化学修飾
されていてもよい。
アミノ酸配列を含むペプチド(部分ペプチドともいう)
も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部分ペ
プチドは、配列番号2で表されるアミノ酸配列と同一又
は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を
含むものである限り、いずれのものであってもよい。特
に、本発明の部分ペプチドの中でも、受容体タンパク質
が天然に存在する場合に細胞膜の外に露出し、且つリガ
ンド結合活性を保有する部分は、受容体タンパク質のリ
ガンドを決定において特に有用である。そのような部分
ペプチドとしては、配列番号2で表わされるアミノ酸配
列の疎水性プロット解析において、細胞外領域(親水性
部位)と分析される部分が挙げられる。本発明の部分ペ
プチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも10個以上、
好ましくは30個以上、より好ましくは80個以上である。
通常、本発明の部分ペプチドのC末端はカルボキシル基
(−COOH)、N末端はアミノ基(−NH2)であるが、こ
れらは前記受容体タンパク質の場合のように、化学修飾
されていてもよい。
【0027】本発明の受容体タンパク質又はその部分ペ
プチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的
に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのよう
な塩としては、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水
素酸、硫酸)の塩、有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロ
ピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、
クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸)の塩等が挙げられる。本
発明の受容体タンパク質又はその塩は、本発明の受容体
タンパク質を発現しているヒトや哺乳動物の培養細胞又
は組織からの抽出・分離よって、あるいは後述のように
本発明の受容体タンパク質をコードするDNAを含む形質
転換体を培養することによっても製造することができ
る。ヒトや哺乳動物の組織又は細胞から製造する場合、
ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズ後、酸
等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせる
ことにより単離精製することができる。
プチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的
に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのよう
な塩としては、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水
素酸、硫酸)の塩、有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロ
ピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、
クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸)の塩等が挙げられる。本
発明の受容体タンパク質又はその塩は、本発明の受容体
タンパク質を発現しているヒトや哺乳動物の培養細胞又
は組織からの抽出・分離よって、あるいは後述のように
本発明の受容体タンパク質をコードするDNAを含む形質
転換体を培養することによっても製造することができ
る。ヒトや哺乳動物の組織又は細胞から製造する場合、
ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズ後、酸
等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせる
ことにより単離精製することができる。
【0028】また、本発明の部分ペプチドまたはその塩
は、公知のペプチド合成法又は前記受容体タンパク質を
適当なペプチダーゼ(例えば、トリプシン、キモトリプ
シン、アルギニルエンドペプチダーゼ)で切断すること
によって製造することができる。ペプチド合成法として
は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによって
もよい。すなわち、本発明の受容体タンパク質を構成し
得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合
させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離する
ことにより目的のペプチドを製造することができる。合
成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
単離精製することができる。上記の方法で得られる受容
体タンパク質又はその部分ペプチドが遊離体である場合
は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ
るし、反対に塩で得られた場合は、公知の方法によって
遊離体に変換することができる。
は、公知のペプチド合成法又は前記受容体タンパク質を
適当なペプチダーゼ(例えば、トリプシン、キモトリプ
シン、アルギニルエンドペプチダーゼ)で切断すること
によって製造することができる。ペプチド合成法として
は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによって
もよい。すなわち、本発明の受容体タンパク質を構成し
得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合
させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離する
ことにより目的のペプチドを製造することができる。合
成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
単離精製することができる。上記の方法で得られる受容
体タンパク質又はその部分ペプチドが遊離体である場合
は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ
るし、反対に塩で得られた場合は、公知の方法によって
遊離体に変換することができる。
【0029】3.本発明の受容体タンパク質又はその部
分ペプチドをコードするポリヌクレオチド 本発明の受容体タンパク質又はその部分ペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、上記2の受容体タンパク質
又はその部分ペプチドをコードする塩基配列(DNA又はR
NA)を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。該ポリヌクレオチドとしては、本発明の受容体タン
パク質をコードするDNA、mRNA等のRNAが挙げられ、二本
鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合
は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNAとRNAとのハイブリッ
ドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖(すなわち、コ
ード鎖)であっても、アンチセンス鎖(すなわち、非コ
ード鎖)であってもよい。本発明の受容体タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新PCRとその応用」15(7)、1997記載の方
法またはそれに準じた方法により、本発明の受容体タン
パク質のmRNAを定量することができる。本発明の受容体
タンパク質をコードするDNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNA
ライブラリー、上記1の細胞若しくは組織由来のcDNA、
又は上記1の細胞若しくは組織由来のcDNAライブラリー
から調製したもの、あるいは合成DNAのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオフ
ァージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず
れであってもよい。また、上記1の細胞又は組織から調
製した全RNA又はmRNA画分を用いて直接、RT-PCR法(Rev
erseTranscriptase Polymerase Chain Reaction)によ
って増幅することもできる。具体的には、本発明の受容
体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、
上記1のように配列番号1で表わされる塩基配列を含有
するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらのいずれ
かのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、且つ本発明の受容体タンパク質と実質
的に同質の活性(例えば、リガンド結合活性、シグナル
情報伝達作用)を有する受容体タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドであればいずれのものであってもよ
い。
分ペプチドをコードするポリヌクレオチド 本発明の受容体タンパク質又はその部分ペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、上記2の受容体タンパク質
又はその部分ペプチドをコードする塩基配列(DNA又はR
NA)を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。該ポリヌクレオチドとしては、本発明の受容体タン
パク質をコードするDNA、mRNA等のRNAが挙げられ、二本
鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合
は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNAとRNAとのハイブリッ
ドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖(すなわち、コ
ード鎖)であっても、アンチセンス鎖(すなわち、非コ
ード鎖)であってもよい。本発明の受容体タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新PCRとその応用」15(7)、1997記載の方
法またはそれに準じた方法により、本発明の受容体タン
パク質のmRNAを定量することができる。本発明の受容体
タンパク質をコードするDNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNA
ライブラリー、上記1の細胞若しくは組織由来のcDNA、
又は上記1の細胞若しくは組織由来のcDNAライブラリー
から調製したもの、あるいは合成DNAのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオフ
ァージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず
れであってもよい。また、上記1の細胞又は組織から調
製した全RNA又はmRNA画分を用いて直接、RT-PCR法(Rev
erseTranscriptase Polymerase Chain Reaction)によ
って増幅することもできる。具体的には、本発明の受容
体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、
上記1のように配列番号1で表わされる塩基配列を含有
するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらのいずれ
かのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、且つ本発明の受容体タンパク質と実質
的に同質の活性(例えば、リガンド結合活性、シグナル
情報伝達作用)を有する受容体タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドであればいずれのものであってもよ
い。
【0030】配列番号1で表わされる塩基配列を含有す
るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズできるDNAとしては、配列番号1で表わされ
る塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より
好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相
同性を有する塩基配列を含有するDNA等が挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とはとは、ナトリ
ウム濃度が約20〜40mM、好ましくは約20〜25mM、温度が
約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件をいう。
るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズできるDNAとしては、配列番号1で表わされ
る塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より
好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相
同性を有する塩基配列を含有するDNA等が挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とはとは、ナトリ
ウム濃度が約20〜40mM、好ましくは約20〜25mM、温度が
約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件をいう。
【0031】4.組換えベクター及び形質転換体の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
受容体タンパク質をコードするDNAを連結することによ
り得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するための
ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定
されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げ
られる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラス
ミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、
pUC19、pCBD-C等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpU
B110、pTP5、pC194等)、酵母由来のプラスミド(例えば
YEp13、YEp24、YCp50、YIp30等)などが挙げられ、ファ
ージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、
レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイル
ス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイル
スベクターを用いることもできる。
受容体タンパク質をコードするDNAを連結することによ
り得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するための
ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定
されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げ
られる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラス
ミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、
pUC19、pCBD-C等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpU
B110、pTP5、pC194等)、酵母由来のプラスミド(例えば
YEp13、YEp24、YCp50、YIp30等)などが挙げられ、ファ
ージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、
レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイル
ス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイル
スベクターを用いることもできる。
【0032】ベクターへの本発明の受容体遺伝子の連結
は、上記1においてクローニングされた受容体タンパク
質をコードするDNAをそのまま、又は所望により制限酵
素で消化したり、リンカーを付加し、ベクターDNAの制
限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入するこ
とにより行うことができる。連結するDNAはその5'末端
側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側
には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGA又はTAGを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することも
できる。連結するDNAは、当該DNA中にコードされている
本発明の受容体タンパク質が宿主細胞中で発現されるよ
うにベクターに組み込まれることが必要である。そこ
で、本発明の組換えベクターには、受容体タンパク質コ
ード配列の以外にも、プロモーター、選択マーカー、タ
ーミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナ
ル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列(SD配
列)などを連結することができる。
は、上記1においてクローニングされた受容体タンパク
質をコードするDNAをそのまま、又は所望により制限酵
素で消化したり、リンカーを付加し、ベクターDNAの制
限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入するこ
とにより行うことができる。連結するDNAはその5'末端
側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側
には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGA又はTAGを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することも
できる。連結するDNAは、当該DNA中にコードされている
本発明の受容体タンパク質が宿主細胞中で発現されるよ
うにベクターに組み込まれることが必要である。そこ
で、本発明の組換えベクターには、受容体タンパク質コ
ード配列の以外にも、プロモーター、選択マーカー、タ
ーミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナ
ル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列(SD配
列)などを連結することができる。
【0033】ここで、本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであれば特に限定されない。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、CM
Vプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、
HSV-TKプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌であ
る場合には、trpプロモーター、lacプロモーター、recA
プロモーター、λP Lプロモーター、lppプロモーター等
が、宿主が枯草菌である場合には、SPO1プロモーター、
SPO2プロモーター、penPプロモーター等が、宿主が酵母
である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモータ
ー、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が挙げられ
る。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、P10プロモーターなどが好ましい。なお、選択
マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイ
シン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げ
られる。
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであれば特に限定されない。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、CM
Vプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、
HSV-TKプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌であ
る場合には、trpプロモーター、lacプロモーター、recA
プロモーター、λP Lプロモーター、lppプロモーター等
が、宿主が枯草菌である場合には、SPO1プロモーター、
SPO2プロモーター、penPプロモーター等が、宿主が酵母
である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモータ
ー、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が挙げられ
る。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、P10プロモーターなどが好ましい。なお、選択
マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイ
シン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げ
られる。
【0034】(2) 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
DNAを発現できるものであれば特に限定されるものでは
ない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエシェ
リヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudom
onas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メ
リロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属
する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyce
s cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo
saccharomyces pombe)等の酵母、サル細胞COS-7、Ver
o、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウ
スL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等の動物細胞、あるいは
Sf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
DNAを発現できるものであれば特に限定されるものでは
ない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエシェ
リヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudom
onas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メ
リロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属
する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyce
s cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo
saccharomyces pombe)等の酵母、サル細胞COS-7、Ver
o、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウ
スL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等の動物細胞、あるいは
Sf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
【0035】大腸菌への組換えベクターの導入方法とし
ては、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et
al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110(197
2)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母
への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポ
レーション法[Becker, D.M. et al.:Methods. Enzymo
l.,194: 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.
et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929(19
78)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.:J. Bacteriol.,153:
163(1983)]等が挙げられる。動物細胞への組換えベクタ
ーの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リ
ン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられ
る。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、
例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレ
クトロポレーション法等が挙げられる。
ては、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et
al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110(197
2)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母
への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポ
レーション法[Becker, D.M. et al.:Methods. Enzymo
l.,194: 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.
et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929(19
78)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.:J. Bacteriol.,153:
163(1983)]等が挙げられる。動物細胞への組換えベクタ
ーの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リ
ン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられ
る。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、
例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレ
クトロポレーション法等が挙げられる。
【0036】5.本発明の受容体タンパク質の製造
本発明の受容体タンパク質は、上記4において得られる
形質転換体を培養し、その培養物から採取することによ
り製造することができる。「培養物」とは、培養上清、
あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌
体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の
形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる
通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生
物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地とし
ては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができ
る培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いて
もよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン
酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモ
ニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無
機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カ
ルシウム等が用いられる。
形質転換体を培養し、その培養物から採取することによ
り製造することができる。「培養物」とは、培養上清、
あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌
体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の
形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる
通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生
物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地とし
ては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができ
る培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いて
もよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン
酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモ
ニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無
機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カ
ルシウム等が用いられる。
【0037】培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、LB培地、
M9培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率
よく働かせるために、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラ
クトシド、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を
加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約15
〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通
常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。酵母培養するための培地と
しては、SD培地、YPD培地があげられる。培地のpHは
約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜
35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を
加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を
培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆
虫培地等が挙げられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整す
るのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行
ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細
胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例え
ば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地、DMEM培
地、RPMI 1640培地等が用いられる。pHは約6〜8であ
るのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時
間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のよ
うにして、形質転換体の細胞膜等に本発明の受容体タン
パク質を生成させることができる。上記培養物から本発
明の受容体タンパク質を分離精製するには、例えば、下
記の方法により行なうことができる。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、LB培地、
M9培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率
よく働かせるために、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラ
クトシド、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を
加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約15
〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通
常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。酵母培養するための培地と
しては、SD培地、YPD培地があげられる。培地のpHは
約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜
35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を
加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を
培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆
虫培地等が挙げられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整す
るのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行
ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細
胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例え
ば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地、DMEM培
地、RPMI 1640培地等が用いられる。pHは約6〜8であ
るのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時
間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のよ
うにして、形質転換体の細胞膜等に本発明の受容体タン
パク質を生成させることができる。上記培養物から本発
明の受容体タンパク質を分離精製するには、例えば、下
記の方法により行なうことができる。
【0038】本発明の受容体タンパク質を培養菌体ある
いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法
で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁
し、超音波、リゾチーム及び/又は凍結融解などによっ
て菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過に
より受容体タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜
用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタ
ンパク質変性剤や、トリトンX-100などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養液中に受容体タンパク質が分
泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で
菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。こ
のようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる
受容体タンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切
に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及び
SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法
で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁
し、超音波、リゾチーム及び/又は凍結融解などによっ
て菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過に
より受容体タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜
用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタ
ンパク質変性剤や、トリトンX-100などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養液中に受容体タンパク質が分
泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で
菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。こ
のようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる
受容体タンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切
に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及び
SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0039】6.本発明のアンチセンスポリヌクレオチ
ド 本発明の受容体タンパク質をコードする遺伝子の複製又
は発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレ
オチドを、上記1においてクローニングした受容体タン
パク質をコードするDNAの塩基配列情報に基づいて、設
計・合成することができる。具体的には、本発明のアン
チセンスポリヌクレオチドとしては、配列番号2で表さ
れるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含むGタンパク質受容体タンパク質又は該タン
パク質の部分ペプチドをコードする塩基配列と相補的で
あるか、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズすることができるポリヌクレオチドが挙げられ
る。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発
明の受容体タンパク質遺伝子のmRNAの少なくとも一部に
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、当
該mRNAにハイブリダイズすることによって、当該受容体
タンパク質遺伝子の発現を調節又は制御することができ
る。前記アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の受
容体タンパク質の発現の調節又は制御以外にも、本発明
の受容体遺伝子が関連する疾患の治療又は診断に有用で
ある。
ド 本発明の受容体タンパク質をコードする遺伝子の複製又
は発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレ
オチドを、上記1においてクローニングした受容体タン
パク質をコードするDNAの塩基配列情報に基づいて、設
計・合成することができる。具体的には、本発明のアン
チセンスポリヌクレオチドとしては、配列番号2で表さ
れるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含むGタンパク質受容体タンパク質又は該タン
パク質の部分ペプチドをコードする塩基配列と相補的で
あるか、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズすることができるポリヌクレオチドが挙げられ
る。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発
明の受容体タンパク質遺伝子のmRNAの少なくとも一部に
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、当
該mRNAにハイブリダイズすることによって、当該受容体
タンパク質遺伝子の発現を調節又は制御することができ
る。前記アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の受
容体タンパク質の発現の調節又は制御以外にも、本発明
の受容体遺伝子が関連する疾患の治療又は診断に有用で
ある。
【0040】前記アンチセンスポリヌクレオチドは、2-
デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボ
ヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌク
レオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドで
あるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌ
クレオチド骨格を有するその他のポリマー(例えば、市
販のペプチド核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー)
又は特殊な結合を含有するその他のポリマー(ただし、
該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペア
リングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチド
を含有する)等が挙げられる。それらは、二本鎖DNA、
一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、さらにDNAとRNAと
のハイブリッドであり得、さらに非修飾ポリヌクレオチ
ド(又は非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の
修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識
のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたも
の、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した
もの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非
荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持
つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合(例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持
つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアー
ゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチ
ド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカ
ライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インター
カレント化合物(例えば、アクリジン、プソラレンな
ど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射
活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有す
るもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合
を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であり
得る。
デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボ
ヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌク
レオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドで
あるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌ
クレオチド骨格を有するその他のポリマー(例えば、市
販のペプチド核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー)
又は特殊な結合を含有するその他のポリマー(ただし、
該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペア
リングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチド
を含有する)等が挙げられる。それらは、二本鎖DNA、
一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、さらにDNAとRNAと
のハイブリッドであり得、さらに非修飾ポリヌクレオチ
ド(又は非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の
修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識
のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたも
の、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した
もの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非
荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持
つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合(例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持
つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアー
ゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチ
ド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカ
ライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インター
カレント化合物(例えば、アクリジン、プソラレンな
ど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射
活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有す
るもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合
を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であり
得る。
【0041】本発明のアンチセンスポリヌクレチドは、
リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与
されたり、特定の化合物や修飾基を結合させた形態で与
えられることができうる。具体的には、アンチセンスポ
リヌクレオチドに結合させる物質としては、アンチセン
スポリヌクレオチドがDNAである場合、のリン酸基骨格
の電荷を中和するように働くポリリジン等のポリカチオ
ン体、アンチセンスポリヌクレオチと細胞膜との相互作
用を高め、細胞内へのアンチセンスポリヌクレオチの取
込みを増大させるホスホリッピドやコレステロール等の
粗水性物質、ヌクレアーゼによるアンチセンスポリヌク
レオチドの分解を阻止するポリエチレングリコール、テ
トラエチレングリコール等のグリコール化合物が挙げら
れるが、それに限定されるものではない。
リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与
されたり、特定の化合物や修飾基を結合させた形態で与
えられることができうる。具体的には、アンチセンスポ
リヌクレオチドに結合させる物質としては、アンチセン
スポリヌクレオチドがDNAである場合、のリン酸基骨格
の電荷を中和するように働くポリリジン等のポリカチオ
ン体、アンチセンスポリヌクレオチと細胞膜との相互作
用を高め、細胞内へのアンチセンスポリヌクレオチの取
込みを増大させるホスホリッピドやコレステロール等の
粗水性物質、ヌクレアーゼによるアンチセンスポリヌク
レオチドの分解を阻止するポリエチレングリコール、テ
トラエチレングリコール等のグリコール化合物が挙げら
れるが、それに限定されるものではない。
【0042】なお、本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チドの、受容体タンパク質遺伝子の発現阻害活性は、本
発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発
現系、あるいは本発明の受容体タンパク質の生体内や生
体外の翻訳系を用いて調べることができる。
チドの、受容体タンパク質遺伝子の発現阻害活性は、本
発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発
現系、あるいは本発明の受容体タンパク質の生体内や生
体外の翻訳系を用いて調べることができる。
【0043】7.本発明の受容体タンパク質に対するリ
ガンドの決定方法 本発明のリガンド決定方法においては、本発明の受容体
タンパク質又はその部分ペプチドと候補物質(試験物
質)とを接触させた場合の、該受容体タンパク質又は該
部分ペプチドに対する候補物質の結合量や、細胞刺激活
性などを測定することを特徴とする。より具体的には、
本発明は、標識した試験化合物を、本発明の受容体タ
ンパク質若しくはその塩、又は本発明の部分ペプチド若
しくはその塩に接触させた場合における、標識した候補
物質の前記受容体タンパク質若しくはその塩、又は該部
分ペプチド若しくはその塩に対する結合量を測定するこ
とを特徴とする本発明の受容体タンパク質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、標識した候補物質を、
本発明の受容体タンパク質を含有する細胞または該細胞
の膜画分に接触させた場合における、標識した候補物質
の該細胞又は該膜画分に対する結合量を測定することを
特徴とする本発明の受容体タンパク質又はその塩に対す
るリガンドの決定方法、標識した候補物質を、本発明
の受容体タンパク質をコードするDNAを含有する形質転
換体を培養することによって細胞膜上に発現した受容体
タンパク質に接触させた場合における、標識した候補物
質の該受容体タンパク質又はその塩に対する結合量を測
定しすることを特徴とする本発明の受容体タンパク質に
対するリガンドの決定方法、候補物質を、本発明の受
容体タンパク質を含有する細胞に接触させた場合におけ
る、受容体タンパク質を介した細胞刺激活性(例えば、
細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパ
ク質のリン酸化、pHの低下などを促進する活性または抑
制する活性等)を測定することを特徴とする本発明の受
容体タンパク質又はその塩に対するリガンドの決定方
法、並びに候補物質を、本発明の受容体タンパク質を
コードするDNAを含有する形質転換体を培養することに
よってその細胞膜上に発現した受容体タンパク質に接触
させた場合における、受容体タンパク質を介する細胞刺
激活性(例えば、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細
胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、pHの低下などを促進
する活性または抑制する活性など)を測定することを特
徴とする本発明の受容体タンパク質又はその塩に対する
リガンドの決定方法を提供する。
ガンドの決定方法 本発明のリガンド決定方法においては、本発明の受容体
タンパク質又はその部分ペプチドと候補物質(試験物
質)とを接触させた場合の、該受容体タンパク質又は該
部分ペプチドに対する候補物質の結合量や、細胞刺激活
性などを測定することを特徴とする。より具体的には、
本発明は、標識した試験化合物を、本発明の受容体タ
ンパク質若しくはその塩、又は本発明の部分ペプチド若
しくはその塩に接触させた場合における、標識した候補
物質の前記受容体タンパク質若しくはその塩、又は該部
分ペプチド若しくはその塩に対する結合量を測定するこ
とを特徴とする本発明の受容体タンパク質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、標識した候補物質を、
本発明の受容体タンパク質を含有する細胞または該細胞
の膜画分に接触させた場合における、標識した候補物質
の該細胞又は該膜画分に対する結合量を測定することを
特徴とする本発明の受容体タンパク質又はその塩に対す
るリガンドの決定方法、標識した候補物質を、本発明
の受容体タンパク質をコードするDNAを含有する形質転
換体を培養することによって細胞膜上に発現した受容体
タンパク質に接触させた場合における、標識した候補物
質の該受容体タンパク質又はその塩に対する結合量を測
定しすることを特徴とする本発明の受容体タンパク質に
対するリガンドの決定方法、候補物質を、本発明の受
容体タンパク質を含有する細胞に接触させた場合におけ
る、受容体タンパク質を介した細胞刺激活性(例えば、
細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパ
ク質のリン酸化、pHの低下などを促進する活性または抑
制する活性等)を測定することを特徴とする本発明の受
容体タンパク質又はその塩に対するリガンドの決定方
法、並びに候補物質を、本発明の受容体タンパク質を
コードするDNAを含有する形質転換体を培養することに
よってその細胞膜上に発現した受容体タンパク質に接触
させた場合における、受容体タンパク質を介する細胞刺
激活性(例えば、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細
胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、pHの低下などを促進
する活性または抑制する活性など)を測定することを特
徴とする本発明の受容体タンパク質又はその塩に対する
リガンドの決定方法を提供する。
【0044】本発明のリガンド決定方法に用いる受容体
タンパク質としては、前記の本発明の受容体タンパク質
又は本発明の部分ペプチドを含有するものであればいず
れであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させた
受容体タンパク質が特に好ましい。
タンパク質としては、前記の本発明の受容体タンパク質
又は本発明の部分ペプチドを含有するものであればいず
れであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させた
受容体タンパク質が特に好ましい。
【0045】8.本発明の受容体タンパク質に対する抗
体 本発明の抗体は、配列番号2で表されるアミノ酸配列と
同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むGタン
パク質共役型受容体タンパク質又はその塩、あるいは該
受容体タンパク質の部分アミノ酸配列を含むペプチド又
はその塩に対する抗体である。本発明の抗体は、本発明
の受容体タンパク質又はその部分ペプチドを認識し得る
抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の何れであってもよい。本発明の抗体は、本発明の受
容体タンパク質又はその部分ペプチド等を抗原として用
い、当該技術分野で公知の抗体または抗血清の製造法に
従って製造することができる。
体 本発明の抗体は、配列番号2で表されるアミノ酸配列と
同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むGタン
パク質共役型受容体タンパク質又はその塩、あるいは該
受容体タンパク質の部分アミノ酸配列を含むペプチド又
はその塩に対する抗体である。本発明の抗体は、本発明
の受容体タンパク質又はその部分ペプチドを認識し得る
抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の何れであってもよい。本発明の抗体は、本発明の受
容体タンパク質又はその部分ペプチド等を抗原として用
い、当該技術分野で公知の抗体または抗血清の製造法に
従って製造することができる。
【0046】(1) モノクローナル抗体の作製
(i) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体タンパク質等は、哺乳動物に対して投与
により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜
6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いら
れる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、
モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられ
るが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノ
クローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫
された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。
により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜
6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いら
れる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、
モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられ
るが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノ
クローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫
された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。
【0047】抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記
の標識化受容体タンパク質等と抗血清とを反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより
行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、
ケーラーとミルスタインの方法[Nature, 256, 495(197
5)]に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダ
イウィルスなどがあげられるが、好ましくはPEGが用
いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、
SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PE
G(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の
濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30℃〜37℃
で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、例えば、受容体タンパク質等抗原を直接あるいは担
体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵
素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用
いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン
抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に
結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グ
ロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素など
で標識した受容体タンパク質等を加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHA
T(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI
1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光
純薬工業(株))またはハイブリドーマ培養用無血清培
地(SFM-101、日水製薬(株))などを用いることがで
きる。培養温度は、通常20℃〜40℃、好ましくは約37
℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは
1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で
行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。
の標識化受容体タンパク質等と抗血清とを反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより
行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、
ケーラーとミルスタインの方法[Nature, 256, 495(197
5)]に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダ
イウィルスなどがあげられるが、好ましくはPEGが用
いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、
SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PE
G(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の
濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30℃〜37℃
で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、例えば、受容体タンパク質等抗原を直接あるいは担
体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵
素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用
いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン
抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に
結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グ
ロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素など
で標識した受容体タンパク質等を加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHA
T(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI
1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光
純薬工業(株))またはハイブリドーマ培養用無血清培
地(SFM-101、日水製薬(株))などを用いることがで
きる。培養温度は、通常20℃〜40℃、好ましくは約37
℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは
1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で
行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。
【0048】(ii) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
(例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲル
ろ過法、抗原結合固相またはプロテインAあるいはプロ
テインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法)に従って行な
うことができる。
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
(例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲル
ろ過法、抗原結合固相またはプロテインAあるいはプロ
テインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法)に従って行な
うことができる。
【0049】(2) ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいは
それに準じる方法に従って製造することができる。例え
ば、免疫抗原(例えば、受容体タンパク質)とキャリア
ータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナ
ル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免
疫動物から本発明の受容体タンパク質等に対する抗体含
有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製
造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリア
ータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混
合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対
して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な
比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミ
ン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・
ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜2
0、好ましくは約1〜5の割合でカップルさせる方法が
用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリン
グには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタ
ルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステ
ル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エス
テル試薬等が用いられる。縮合生成物は、哺乳動物に対
して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約
2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
それに準じる方法に従って製造することができる。例え
ば、免疫抗原(例えば、受容体タンパク質)とキャリア
ータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナ
ル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免
疫動物から本発明の受容体タンパク質等に対する抗体含
有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製
造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリア
ータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混
合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対
して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な
比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミ
ン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・
ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜2
0、好ましくは約1〜5の割合でカップルさせる方法が
用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリン
グには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタ
ルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステ
ル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エス
テル試薬等が用いられる。縮合生成物は、哺乳動物に対
して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約
2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
【0050】9.本発明の受容体タンパク質及びその部
分ペプチドのその他の医学薬学的応用 本発明の受容体タンパク質及びその部分ペプチド又はそ
れらの塩、並びにそれらをコードするポリヌクレオチド
は、本発明の受容体タンパク質に対するリガンド(ア
ゴニスト)の決定、本発明の受容体タンパク質の機能
不全に関連する疾患の予防及び/又は治療剤、遺伝子
診断剤、本発明の受容体タンパク質に対するリガンド
の定量、本発明の受容体タンパク質とリガンドとの結
合性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト
など)のスクリーニング、本発明の受容体タンパク質
とリガンドとの結合性を変化させる化合物(アゴニス
ト、アンタゴニスト)を含有する各種疾病の予防及び/
又は治療剤、本発明の受容体タンパク質又はその部分
ペプチドの定量、本発明の受容体タンパク質又はその
部分ペプチドに対する抗体による中和、本発明の受容
体タンパク質をコードする遺伝子を有する非ヒト動物の
作製などに用いることができる。特に、本発明の組換え
型受容体タンパク質の発現系を用いた受容体結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な
受容体タンパク質に対するリガンドの結合性を変化させ
る物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト)をスク
リーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタ
ゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用する
ことができる。
分ペプチドのその他の医学薬学的応用 本発明の受容体タンパク質及びその部分ペプチド又はそ
れらの塩、並びにそれらをコードするポリヌクレオチド
は、本発明の受容体タンパク質に対するリガンド(ア
ゴニスト)の決定、本発明の受容体タンパク質の機能
不全に関連する疾患の予防及び/又は治療剤、遺伝子
診断剤、本発明の受容体タンパク質に対するリガンド
の定量、本発明の受容体タンパク質とリガンドとの結
合性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト
など)のスクリーニング、本発明の受容体タンパク質
とリガンドとの結合性を変化させる化合物(アゴニス
ト、アンタゴニスト)を含有する各種疾病の予防及び/
又は治療剤、本発明の受容体タンパク質又はその部分
ペプチドの定量、本発明の受容体タンパク質又はその
部分ペプチドに対する抗体による中和、本発明の受容
体タンパク質をコードする遺伝子を有する非ヒト動物の
作製などに用いることができる。特に、本発明の組換え
型受容体タンパク質の発現系を用いた受容体結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な
受容体タンパク質に対するリガンドの結合性を変化させ
る物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト)をスク
リーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタ
ゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用する
ことができる。
【0051】具体的には、本発明の受容体タンパク質若
しくはその部分ペプチド、又はそれら塩は、本発明の受
容体タンパク質に対するリガンド(アゴニスト)又はア
ンタゴニストを探索(スクリーニング)し、または決定
するための試薬として有用である。これらの試薬は、本
発明の受容体タンパク質に対するリガンドの結合性を変
化させる物質のスクリーニング用キットの構成要素とす
ることが可能である。以上より、本発明は、本発明の受
容体タンパク質若しくはその部分ペプチド、又はそれら
の塩と、試験物質とを接触させることを特徴とする本発
明の受容体タンパク質に対するリガンド(アゴニスト)
又はアンタゴニストの決定方法を提供する。試験物質と
しては、ヒトまたは哺乳動物(例えば、マウス、ラッ
ト、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど)の組織抽出物、細
胞培養上清、人工的に合成した化合物等が挙げられる。
しくはその部分ペプチド、又はそれら塩は、本発明の受
容体タンパク質に対するリガンド(アゴニスト)又はア
ンタゴニストを探索(スクリーニング)し、または決定
するための試薬として有用である。これらの試薬は、本
発明の受容体タンパク質に対するリガンドの結合性を変
化させる物質のスクリーニング用キットの構成要素とす
ることが可能である。以上より、本発明は、本発明の受
容体タンパク質若しくはその部分ペプチド、又はそれら
の塩と、試験物質とを接触させることを特徴とする本発
明の受容体タンパク質に対するリガンド(アゴニスト)
又はアンタゴニストの決定方法を提供する。試験物質と
しては、ヒトまたは哺乳動物(例えば、マウス、ラッ
ト、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど)の組織抽出物、細
胞培養上清、人工的に合成した化合物等が挙げられる。
【0052】本発明の受容体タンパク質またはその塩に
対するリガンドを決定する方法を実施するためには、適
当な受容体タンパク質画分と、標識した試験物質が用い
られる。受容体タンパク質画分としては、天然の受容体
タンパク質画分、またはそれと同等の活性を有する組換
え型受容体タンパク質画分等が好ましい。例えば、本発
明の受容体タンパク質又はその塩に対するリガンドの決
定を行なうには、まず本発明の受容体タンパク質を含有
する細胞または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッ
ファーに懸濁することにより受容体標品を調製する。バ
ッファーとしては、リン酸バッファー、トリス-塩酸バ
ッファーなどのリガンドと受容体タンパク質との結合を
阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、
非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80、
デオキシコレートなどの界面活性剤や、ウシ血清アルブ
ミンやゼラチン等のタンパク質をバッファーに加えるこ
ともできる。受容体タンパク質を含む溶液に、一定量の
放射性標識した試験物質を共存させる。非特異的結合量
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は約4〜50℃、好ましくは約
4℃〜37℃で、約10分〜24時間、望ましくは約30分〜
3時間行なう。反応後、濾過し、適量の同バッファーで
洗浄した後、濾紙に残存する放射活性を液体シンチレー
ションカウンター等で計測する。全結合量から非特異的
結合量を引いたカウントが0cpmを越える試験物質を本
発明の受容体タンパク質又はその塩に対するリガンド
(アゴニスト)として選択することができる。
対するリガンドを決定する方法を実施するためには、適
当な受容体タンパク質画分と、標識した試験物質が用い
られる。受容体タンパク質画分としては、天然の受容体
タンパク質画分、またはそれと同等の活性を有する組換
え型受容体タンパク質画分等が好ましい。例えば、本発
明の受容体タンパク質又はその塩に対するリガンドの決
定を行なうには、まず本発明の受容体タンパク質を含有
する細胞または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッ
ファーに懸濁することにより受容体標品を調製する。バ
ッファーとしては、リン酸バッファー、トリス-塩酸バ
ッファーなどのリガンドと受容体タンパク質との結合を
阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、
非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80、
デオキシコレートなどの界面活性剤や、ウシ血清アルブ
ミンやゼラチン等のタンパク質をバッファーに加えるこ
ともできる。受容体タンパク質を含む溶液に、一定量の
放射性標識した試験物質を共存させる。非特異的結合量
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は約4〜50℃、好ましくは約
4℃〜37℃で、約10分〜24時間、望ましくは約30分〜
3時間行なう。反応後、濾過し、適量の同バッファーで
洗浄した後、濾紙に残存する放射活性を液体シンチレー
ションカウンター等で計測する。全結合量から非特異的
結合量を引いたカウントが0cpmを越える試験物質を本
発明の受容体タンパク質又はその塩に対するリガンド
(アゴニスト)として選択することができる。
【0053】本発明の受容体タンパク質に対するリガン
ドが明らかになれば、該リガンドが有する作用に応じ
て、本発明の受容体タンパク質又は当該受容体タンパク
質をコードするポリヌクレオチドを、本発明の受容体タ
ンパク質の機能不全に関連する疾患の予防及び/又は治
療剤などの医薬として使用することができる。
ドが明らかになれば、該リガンドが有する作用に応じ
て、本発明の受容体タンパク質又は当該受容体タンパク
質をコードするポリヌクレオチドを、本発明の受容体タ
ンパク質の機能不全に関連する疾患の予防及び/又は治
療剤などの医薬として使用することができる。
【0054】
【実施例】以下に、本発明の実施例を示して具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。 〔実施例1〕 本発明のGタンパク質共役型受容体タン
パク質をコードする遺伝子cDNAのクローニング 以下のようにして、本発明のGタンパク質共役型受容体
タンパク質をコードする遺伝子cDNAをクローニングし
た。すなわち、まず、遺伝子予測プログラムGENESCANを
用いて、公知のヒトゲノム配列から広範囲に遺伝子候
補、すなわち仮想転写配列(VTS)をリスト化した。次
いで、リスト化した配列と公知の遺伝子配列とのホモロ
ジー比較を行った。得られたホモロジーレポートのトッ
プヒットのコメントをキーワード対象としてVTS群をデ
ータベース化し、当該データベース中にキーワード「G
タンパク質共役型受容体」を検索した。その結果、公知
のGタンパク質共役型受容体タンパク質のアミノ酸配列
と有意な類似を示す1つのVTSが得られた。
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。 〔実施例1〕 本発明のGタンパク質共役型受容体タン
パク質をコードする遺伝子cDNAのクローニング 以下のようにして、本発明のGタンパク質共役型受容体
タンパク質をコードする遺伝子cDNAをクローニングし
た。すなわち、まず、遺伝子予測プログラムGENESCANを
用いて、公知のヒトゲノム配列から広範囲に遺伝子候
補、すなわち仮想転写配列(VTS)をリスト化した。次
いで、リスト化した配列と公知の遺伝子配列とのホモロ
ジー比較を行った。得られたホモロジーレポートのトッ
プヒットのコメントをキーワード対象としてVTS群をデ
ータベース化し、当該データベース中にキーワード「G
タンパク質共役型受容体」を検索した。その結果、公知
のGタンパク質共役型受容体タンパク質のアミノ酸配列
と有意な類似を示す1つのVTSが得られた。
【0055】得られたVTSの、ゲノム配列上に予測される
エクソン及びイントロンに基づいて、推定イントロンを
挟むよう推定エクソン上に、上流側プライマー5’-actt
cctgctctgtgccttca-3’(配列番号6)及び下流側プラ
イマー5’-gcaaagatgtagacggtggag-3’(配列番号7)
配列を設計・合成した。これらのプライマーを用い、ヒ
トの種々の臓器(脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結腸、
肺、小腸、筋、胃、精巣、胎盤、唾液腺、甲状腺、膵
臓、副腎腺、卵巣、子宮、前立腺、皮膚、末梢血リンパ
球、骨髄、胎児脳、胎児肝)由来のRNAを用いて、最初9
5℃で1分間処理後、95℃20秒間及び66℃1分間を1サ
イクルとして、RT-PCRを合計30サイクル行った。その結
果、図2に示したように、骨髄由来のRNAを用いた場合
に発現が観察された。得られたPCR断片の塩基配列を決
定したところ、想定されるスプライシング後の想定され
るmRNAの配列と一致することが判明し、生体内で、上記
VTSが、実際に発現していることが判った。
エクソン及びイントロンに基づいて、推定イントロンを
挟むよう推定エクソン上に、上流側プライマー5’-actt
cctgctctgtgccttca-3’(配列番号6)及び下流側プラ
イマー5’-gcaaagatgtagacggtggag-3’(配列番号7)
配列を設計・合成した。これらのプライマーを用い、ヒ
トの種々の臓器(脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結腸、
肺、小腸、筋、胃、精巣、胎盤、唾液腺、甲状腺、膵
臓、副腎腺、卵巣、子宮、前立腺、皮膚、末梢血リンパ
球、骨髄、胎児脳、胎児肝)由来のRNAを用いて、最初9
5℃で1分間処理後、95℃20秒間及び66℃1分間を1サ
イクルとして、RT-PCRを合計30サイクル行った。その結
果、図2に示したように、骨髄由来のRNAを用いた場合
に発現が観察された。得られたPCR断片の塩基配列を決
定したところ、想定されるスプライシング後の想定され
るmRNAの配列と一致することが判明し、生体内で、上記
VTSが、実際に発現していることが判った。
【0056】次いで、確認された配列をに基づいて、
5’-RACE及び3’-RACE用の特異的オリゴヌクレオチドプ
ライマーを設計・合成し、これらを用いて常法に従い
5’-RACE及び3’-RACEを行った。先に得られたDNA断片
の上流側及び下流側の塩基配列を決定した。上記一連の
操作により決定した塩基配列を配列番号3に示した。当
該塩基配列中には、新規のGタンパク質共役型受容体タ
ンパク質GPR97(配列番号2)をコードする領域が
見出された。前記のように、当該遺伝子は、骨髄中で特
異的に発現することより、幼若血液系細胞特異的機能又
は造血系組織特異的機能に関与するものと考えられる。
5’-RACE及び3’-RACE用の特異的オリゴヌクレオチドプ
ライマーを設計・合成し、これらを用いて常法に従い
5’-RACE及び3’-RACEを行った。先に得られたDNA断片
の上流側及び下流側の塩基配列を決定した。上記一連の
操作により決定した塩基配列を配列番号3に示した。当
該塩基配列中には、新規のGタンパク質共役型受容体タ
ンパク質GPR97(配列番号2)をコードする領域が
見出された。前記のように、当該遺伝子は、骨髄中で特
異的に発現することより、幼若血液系細胞特異的機能又
は造血系組織特異的機能に関与するものと考えられる。
【0057】
【発明の効果】本発明によって、新規なGタンパク質受
容体タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレ
オチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクタ
ー、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タンパ
ク質の製造方法等が提供される。上記タンパク質等は、
新規な医薬品等の開発に有用である。
容体タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレ
オチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクタ
ー、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タンパ
ク質の製造方法等が提供される。上記タンパク質等は、
新規な医薬品等の開発に有用である。
【0058】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> PharmaDesign,Inc.
<120> A gene coding for nobel G protein coupled receptor GPR97
<130> PDP-0004
<160> 7
<210> 1
<211> 1647
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1647)
<400> 1
atg gcg acg ccc agg ggc ctg ggg gcc ctg ctc ctg ctc ctc ctg ctc 48
Met Ala Thr Pro Arg Gly Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
ccg acc tca ggt cag gaa aag ccc acc gaa ggg cca aga aac acc tgc 96
Pro Thr Ser Gly Gln Glu Lys Pro Thr Glu Gly Pro Arg Asn Thr Cys
20 25 30
ctg ggg agc aac aac atg tac gac atc ttc aac ttg aat gac aag gct 144
Leu Gly Ser Asn Asn Met Tyr Asp Ile Phe Asn Leu Asn Asp Lys Ala
35 40 45
ttg tgc ttc acc aag tgc agg cag tcg ggc agc gac tcc tgc aat gtg 192
Leu Cys Phe Thr Lys Cys Arg Gln Ser Gly Ser Asp Ser Cys Asn Val
50 55 60
gaa aac ttg cag aga tac tgg cta aac tac gag gcc cat ctg atg aag 240
Glu Asn Leu Gln Arg Tyr Trp Leu Asn Tyr Glu Ala His Leu Met Lys
65 70 75 80
gaa ggt ttg acg cag aag gtg aac acg cct ttc ctg aag gct ttg gtc 288
Glu Gly Leu Thr Gln Lys Val Asn Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Val
85 90 95
cag aac ctc agc acc aac act gca gaa gac ttc tat ttc tct ctg gag 336
Gln Asn Leu Ser Thr Asn Thr Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Ser Leu Glu
100 105 110
ccc tct cag gtt ccg agg cag gtg atg aag gac gag gac aag ccc cct 384
Pro Ser Gln Val Pro Arg Gln Val Met Lys Asp Glu Asp Lys Pro Pro
115 120 125
gac aga gtg cga ctt ccc aag agc ctt ttt cga tcc ctg cca ggc aac 432
Asp Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Leu Phe Arg Ser Leu Pro Gly Asn
130 135 140
agg tct gtg gtc cgc ttg gcc gtc acc att ctg gac att ggt cca ggg 480
Arg Ser Val Val Arg Leu Ala Val Thr Ile Leu Asp Ile Gly Pro Gly
145 150 155 160
act ctc ttc aag ggc ccc cgg ctc ggc ctg gga gat ggc agc ggc gtg 528
Thr Leu Phe Lys Gly Pro Arg Leu Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Val
165 170 175
ttg aac aat cgc ctg gtg ggt ttg agt gtg gga caa atg cat gtc acc 576
Leu Asn Asn Arg Leu Val Gly Leu Ser Val Gly Gln Met His Val Thr
180 185 190
aag ctg gct gag cct ctg gag atc gtc ttc tct cac cag cga ccg ccc 624
Lys Leu Ala Glu Pro Leu Glu Ile Val Phe Ser His Gln Arg Pro Pro
195 200 205
cct aac atg acc ctc acc tgt gta ttc tgg gat gtg act aaa ggg acc 672
Pro Asn Met Thr Leu Thr Cys Val Phe Trp Asp Val Thr Lys Gly Thr
210 215 220
act gga gac tgg tct tct gag ggc tgc tcc acg gag gtc aga cct gag 720
Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Gly Cys Ser Thr Glu Val Arg Pro Glu
225 230 235 240
ggg acc gtg tgc tgc tgt gac cac ctg acc ttt ttc gcc ctg ctc ctg 768
Gly Thr Val Cys Cys Cys Asp His Leu Thr Phe Phe Ala Leu Leu Leu
245 250 255
aga ccc acc ttg gac cag tcc acg gtg cat atc ctc aca cgc atc tcc 816
Arg Pro Thr Leu Asp Gln Ser Thr Val His Ile Leu Thr Arg Ile Ser
260 265 270
cag gcg ggc tgt ggg gtc tcc atg atc ttc ctg gcc ttc acc att att 864
Gln Ala Gly Cys Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Phe Thr Ile Ile
275 280 285
ctt tat gcc ttt ctg agg ctt tcc cgg gag agg ttc aag tca gaa gat 912
Leu Tyr Ala Phe Leu Arg Leu Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Glu Asp
290 295 300
gcc cca aag atc cac gtg gcc ctg ggt ggc agc ctg ttc ctc ctg aat 960
Ala Pro Lys Ile His Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Leu Leu Asn
305 310 315 320
ctg gcc ttc ttg gtc aat gtg ggg agt ggc tca aag ggg tct gat gct 1008
Leu Ala Phe Leu Val Asn Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ala
325 330 335
gcc tgc tgg gcc cgg ggg gct gtc ttc cac tac ttc ctg ctc tgt gcc 1056
Ala Cys Trp Ala Arg Gly Ala Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Cys Ala
340 345 350
ttc acc tgg atg ggc ctt gaa gcc ttc cac ctc tac ctg ctc gct gtc 1104
Phe Thr Trp Met Gly Leu Glu Ala Phe His Leu Tyr Leu Leu Ala Val
355 360 365
agg gtc ttc aac acc tac ttc ggg cac tac ttc ctg aag ctg agc ctg 1152
Arg Val Phe Asn Thr Tyr Phe Gly His Tyr Phe Leu Lys Leu Ser Leu
370 375 380
gtg ggc tgg ggc ctg ccc gcc ctg atg gtc atc ggc act ggg agt gcc 1200
Val Gly Trp Gly Leu Pro Ala Leu Met Val Ile Gly Thr Gly Ser Ala
385 390 395 400
aac agc tac ggc ctc tac acc atc cgt gat agg gag aac cgc acc tct 1248
Asn Ser Tyr Gly Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Glu Asn Arg Thr Ser
405 410 415
ctg gag cta tgc tgg ttc cgt gaa ggg aca acc atg tac gcc ctc tat 1296
Leu Glu Leu Cys Trp Phe Arg Glu Gly Thr Thr Met Tyr Ala Leu Tyr
420 425 430
atc acc gtc cac ggc tac ttc ctc atc acc ttc ctc ttt ggc atg gtg 1344
Ile Thr Val His Gly Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Leu Phe Gly Met Val
435 440 445
gtc ctg gcc ctg gtg gtc tgg aag atc ttc acc ctg tcc cgt gct aca 1392
Val Leu Ala Leu Val Val Trp Lys Ile Phe Thr Leu Ser Arg Ala Thr
450 455 460
gcg gtc aag gag cgg ggg aag aac cgg aag aag gtg ctc acc ctg ctg 1440
Ala Val Lys Glu Arg Gly Lys Asn Arg Lys Lys Val Leu Thr Leu Leu
465 470 475 480
ggc ctc tcg agc ctg gtg ggt gtg aca tgg ggg ttg gcc atc ttc acc 1488
Gly Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Thr Trp Gly Leu Ala Ile Phe Thr
485 490 495
ccg ttg ggc ctc tcc acc gtc tac atc ttt gca ctt ttc aac tcc ttg 1536
Pro Leu Gly Leu Ser Thr Val Tyr Ile Phe Ala Leu Phe Asn Ser Leu
500 505 510
caa ggt gtc ttc atc tgc tgc tgg ttc acc atc ctt tac ctc cca agt 1584
Gln Gly Val Phe Ile Cys Cys Trp Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Pro Ser
515 520 525
cag agc acc aca gtc tcc tcc tct act gca aga ttg gac cag gcc cac 1632
Gln Ser Thr Thr Val Ser Ser Ser Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ala His
530 535 540
tcc gca tct caa gaa 1647
Ser Ala Ser Gln Glu
545
<210> 2
<211> 549
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Thr Pro Arg Gly Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Thr Ser Gly Gln Glu Lys Pro Thr Glu Gly Pro Arg Asn Thr Cys
20 25 30
Leu Gly Ser Asn Asn Met Tyr Asp Ile Phe Asn Leu Asn Asp Lys Ala
35 40 45
Leu Cys Phe Thr Lys Cys Arg Gln Ser Gly Ser Asp Ser Cys Asn Val
50 55 60
Glu Asn Leu Gln Arg Tyr Trp Leu Asn Tyr Glu Ala His Leu Met Lys
65 70 75 80
Glu Gly Leu Thr Gln Lys Val Asn Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Val
85 90 95
Gln Asn Leu Ser Thr Asn Thr Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Ser Leu Glu
100 105 110
Pro Ser Gln Val Pro Arg Gln Val Met Lys Asp Glu Asp Lys Pro Pro
115 120 125
Asp Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Leu Phe Arg Ser Leu Pro Gly Asn
130 135 140
Arg Ser Val Val Arg Leu Ala Val Thr Ile Leu Asp Ile Gly Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Phe Lys Gly Pro Arg Leu Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Val
165 170 175
Leu Asn Asn Arg Leu Val Gly Leu Ser Val Gly Gln Met His Val Thr
180 185 190
Lys Leu Ala Glu Pro Leu Glu Ile Val Phe Ser His Gln Arg Pro Pro
195 200 205
Pro Asn Met Thr Leu Thr Cys Val Phe Trp Asp Val Thr Lys Gly Thr
210 215 220
Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Gly Cys Ser Thr Glu Val Arg Pro Glu
225 230 235 240
Gly Thr Val Cys Cys Cys Asp His Leu Thr Phe Phe Ala Leu Leu Leu
245 250 255
Arg Pro Thr Leu Asp Gln Ser Thr Val His Ile Leu Thr Arg Ile Ser
260 265 270
Gln Ala Gly Cys Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Phe Thr Ile Ile
275 280 285
Leu Tyr Ala Phe Leu Arg Leu Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Glu Asp
290 295 300
Ala Pro Lys Ile His Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Leu Leu Asn
305 310 315 320
Leu Ala Phe Leu Val Asn Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ala
325 330 335
Ala Cys Trp Ala Arg Gly Ala Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Cys Ala
340 345 350
Phe Thr Trp Met Gly Leu Glu Ala Phe His Leu Tyr Leu Leu Ala Val
355 360 365
Arg Val Phe Asn Thr Tyr Phe Gly His Tyr Phe Leu Lys Leu Ser Leu
370 375 380
Val Gly Trp Gly Leu Pro Ala Leu Met Val Ile Gly Thr Gly Ser Ala
385 390 395 400
Asn Ser Tyr Gly Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Glu Asn Arg Thr Ser
405 410 415
Leu Glu Leu Cys Trp Phe Arg Glu Gly Thr Thr Met Tyr Ala Leu Tyr
420 425 430
Ile Thr Val His Gly Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Leu Phe Gly Met Val
435 440 445
Val Leu Ala Leu Val Val Trp Lys Ile Phe Thr Leu Ser Arg Ala Thr
450 455 460
Ala Val Lys Glu Arg Gly Lys Asn Arg Lys Lys Val Leu Thr Leu Leu
465 470 475 480
Gly Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Thr Trp Gly Leu Ala Ile Phe Thr
485 490 495
Pro Leu Gly Leu Ser Thr Val Tyr Ile Phe Ala Leu Phe Asn Ser Leu
500 505 510
Gln Gly Val Phe Ile Cys Cys Trp Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Pro Ser
515 520 525
Gln Ser Thr Thr Val Ser Ser Ser Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ala His
530 535 540
Ser Ala Ser Gln Glu
545
<210> 3
<211> 1696
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (47)..(1693)
<400> 3
ggccagacag ccacagagct cctggcgtgg gcaaggctgg ccaagg atg gcg acg 55
Met Ala Thr
1
ccc agg ggc ctg ggg gcc ctg ctc ctg ctc ctc ctg ctc ccg acc tca 103
Pro Arg Gly Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr Ser
5 10 15
ggt cag gaa aag ccc acc gaa ggg cca aga aac acc tgc ctg ggg agc 151
Gly Gln Glu Lys Pro Thr Glu Gly Pro Arg Asn Thr Cys Leu Gly Ser
20 25 30 35
aac aac atg tac gac atc ttc aac ttg aat gac aag gct ttg tgc ttc 199
Asn Asn Met Tyr Asp Ile Phe Asn Leu Asn Asp Lys Ala Leu Cys Phe
40 45 50
acc aag tgc agg cag tcg ggc agc gac tcc tgc aat gtg gaa aac ttg 247
Thr Lys Cys Arg Gln Ser Gly Ser Asp Ser Cys Asn Val Glu Asn Leu
55 60 65
cag aga tac tgg cta aac tac gag gcc cat ctg atg aag gaa ggt ttg 295
Gln Arg Tyr Trp Leu Asn Tyr Glu Ala His Leu Met Lys Glu Gly Leu
70 75 80
acg cag aag gtg aac acg cct ttc ctg aag gct ttg gtc cag aac ctc 343
Thr Gln Lys Val Asn Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Val Gln Asn Leu
85 90 95
agc acc aac act gca gaa gac ttc tat ttc tct ctg gag ccc tct cag 391
Ser Thr Asn Thr Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Ser Leu Glu Pro Ser Gln
100 105 110 115
gtt ccg agg cag gtg atg aag gac gag gac aag ccc cct gac aga gtg 439
Val Pro Arg Gln Val Met Lys Asp Glu Asp Lys Pro Pro Asp Arg Val
120 125 130
cga ctt ccc aag agc ctt ttt cga tcc ctg cca ggc aac agg tct gtg 487
Arg Leu Pro Lys Ser Leu Phe Arg Ser Leu Pro Gly Asn Arg Ser Val
135 140 145
gtc cgc ttg gcc gtc acc att ctg gac att ggt cca ggg act ctc ttc 535
Val Arg Leu Ala Val Thr Ile Leu Asp Ile Gly Pro Gly Thr Leu Phe
150 155 160
aag ggc ccc cgg ctc ggc ctg gga gat ggc agc ggc gtg ttg aac aat 583
Lys Gly Pro Arg Leu Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Val Leu Asn Asn
165 170 175
cgc ctg gtg ggt ttg agt gtg gga caa atg cat gtc acc aag ctg gct 631
Arg Leu Val Gly Leu Ser Val Gly Gln Met His Val Thr Lys Leu Ala
180 185 190 195
gag cct ctg gag atc gtc ttc tct cac cag cga ccg ccc cct aac atg 679
Glu Pro Leu Glu Ile Val Phe Ser His Gln Arg Pro Pro Pro Asn Met
200 205 210
acc ctc acc tgt gta ttc tgg gat gtg act aaa ggg acc act gga gac 727
Thr Leu Thr Cys Val Phe Trp Asp Val Thr Lys Gly Thr Thr Gly Asp
215 220 225
tgg tct tct gag ggc tgc tcc acg gag gtc aga cct gag ggg acc gtg 775
Trp Ser Ser Glu Gly Cys Ser Thr Glu Val Arg Pro Glu Gly Thr Val
230 235 240
tgc tgc tgt gac cac ctg acc ttt ttc gcc ctg ctc ctg aga ccc acc 823
Cys Cys Cys Asp His Leu Thr Phe Phe Ala Leu Leu Leu Arg Pro Thr
245 250 255
ttg gac cag tcc acg gtg cat atc ctc aca cgc atc tcc cag gcg ggc 871
Leu Asp Gln Ser Thr Val His Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gln Ala Gly
260 265 270 275
tgt ggg gtc tcc atg atc ttc ctg gcc ttc acc att att ctt tat gcc 919
Cys Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Phe Thr Ile Ile Leu Tyr Ala
280 285 290
ttt ctg agg ctt tcc cgg gag agg ttc aag tca gaa gat gcc cca aag 967
Phe Leu Arg Leu Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Glu Asp Ala Pro Lys
295 300 305
atc cac gtg gcc ctg ggt ggc agc ctg ttc ctc ctg aat ctg gcc ttc 1015
Ile His Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Leu Leu Asn Leu Ala Phe
310 315 320
ttg gtc aat gtg ggg agt ggc tca aag ggg tct gat gct gcc tgc tgg 1063
Leu Val Asn Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ala Ala Cys Trp
325 330 335
gcc cgg ggg gct gtc ttc cac tac ttc ctg ctc tgt gcc ttc acc tgg 1111
Ala Arg Gly Ala Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Cys Ala Phe Thr Trp
340 345 350 355
atg ggc ctt gaa gcc ttc cac ctc tac ctg ctc gct gtc agg gtc ttc 1159
Met Gly Leu Glu Ala Phe His Leu Tyr Leu Leu Ala Val Arg Val Phe
360 365 370
aac acc tac ttc ggg cac tac ttc ctg aag ctg agc ctg gtg ggc tgg 1207
Asn Thr Tyr Phe Gly His Tyr Phe Leu Lys Leu Ser Leu Val Gly Trp
375 380 385
ggc ctg ccc gcc ctg atg gtc atc ggc act ggg agt gcc aac agc tac 1255
Gly Leu Pro Ala Leu Met Val Ile Gly Thr Gly Ser Ala Asn Ser Tyr
390 395 400
ggc ctc tac acc atc cgt gat agg gag aac cgc acc tct ctg gag cta 1303
Gly Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Glu Asn Arg Thr Ser Leu Glu Leu
405 410 415
tgc tgg ttc cgt gaa ggg aca acc atg tac gcc ctc tat atc acc gtc 1351
Cys Trp Phe Arg Glu Gly Thr Thr Met Tyr Ala Leu Tyr Ile Thr Val
420 425 430 435
cac ggc tac ttc ctc atc acc ttc ctc ttt ggc atg gtg gtc ctg gcc 1399
His Gly Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Leu Phe Gly Met Val Val Leu Ala
440 445 450
ctg gtg gtc tgg aag atc ttc acc ctg tcc cgt gct aca gcg gtc aag 1447
Leu Val Val Trp Lys Ile Phe Thr Leu Ser Arg Ala Thr Ala Val Lys
455 460 465
gag cgg ggg aag aac cgg aag aag gtg ctc acc ctg ctg ggc ctc tcg 1495
Glu Arg Gly Lys Asn Arg Lys Lys Val Leu Thr Leu Leu Gly Leu Ser
470 475 480
agc ctg gtg ggt gtg aca tgg ggg ttg gcc atc ttc acc ccg ttg ggc 1543
Ser Leu Val Gly Val Thr Trp Gly Leu Ala Ile Phe Thr Pro Leu Gly
485 490 495
ctc tcc acc gtc tac atc ttt gca ctt ttc aac tcc ttg caa ggt gtc 1591
Leu Ser Thr Val Tyr Ile Phe Ala Leu Phe Asn Ser Leu Gln Gly Val
500 505 510 515
ttc atc tgc tgc tgg ttc acc atc ctt tac ctc cca agt cag agc acc 1639
Phe Ile Cys Cys Trp Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Pro Ser Gln Ser Thr
520 525 530
aca gtc tcc tcc tct act gca aga ttg gac cag gcc cac tcc gca tct 1687
Thr Val Ser Ser Ser Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ala His Ser Ala Ser
535 540 545
caa gaa tag 1696
Gln Glu
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 4
atggcgacgc ccaggggcct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 5
ttcttgagat gcggagtggg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 6
acttcctgct ctgtgccttc a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 7
gcaaagatgt agacggtgga g 21
【配列表フリーテキスト】配列番号4:合成DNA
配列番号5:合成DNA
配列番号6:合成DNA
配列番号7:合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図1】VTSアプローチによる新規遺伝子クローニング
の概要を示す図である。
の概要を示す図である。
【図2】各種臓器由来のRNAを鋳型として用いた場合のR
T-PCRの結果を示した写真である。
T-PCRの結果を示した写真である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C07K 14/705 C07K 16/28
16/28 C12N 1/15
C12N 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 C12P 21/02 C
5/10 C12Q 1/68 A
C12P 21/02 G01N 33/15 Z
C12Q 1/68 33/50 Z
G01N 33/15 33/53 D
33/50 M
33/53 33/566
C12N 15/00 ZNAA
33/566 5/00 A
Claims (26)
- 【請求項1】 配列番号2で表わされるアミノ酸配列と
同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを
特徴とするGタンパク質共役型受容体タンパク質又はそ
の塩。 - 【請求項2】 請求項1記載のGタンパク質共役型受容
体タンパク質の部分アミノ酸配列を含むことを特徴とす
るペプチドまたはその塩。 - 【請求項3】 請求項1記載のGタンパク質共役型受容
体タンパク質又は請求項2記載のペプチドをコードする
塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 ポリヌクレオチドがDNAであることを特
徴とする請求項3記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 配列番号1で表される塩基配列又は該塩
基配列の一部を含む請求項3記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項6】 請求項3記載のポリヌクレオチドを含有
する組換えベクター。 - 【請求項7】 請求項6記載の組換えベクターで形質転
換させた形質転換体。 - 【請求項8】 請求項7記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物から請求項1記載のGタンパク質共
役型受容体タンパク質を採取することを特徴とする請求
項1記載のGタンパク質共役型受容体タンパク質または
その塩の製造方法。 - 【請求項9】 請求項1記載のGタンパク質共役型受容
体タンパク質又はその塩、あるいは請求項2記載のペプ
チドまたはその塩に対する抗体。 - 【請求項10】 抗体が請求項1記載のGタンパク質共
役型受容体タンパク質のシグナル伝達を阻害する活性を
有するものである請求項9記載の抗体。 - 【請求項11】 請求項9記載の抗体を有効成分として
含有する薬学的組成物。 - 【請求項12】 請求項1記載のGタンパク質共役型受
容体タンパク質に対するリガンド。 - 【請求項13】 請求項12記載のリガンドを有効成分
として含有する薬学的組成物。 - 【請求項14】 請求項1記載のGタンパク質共役型受
容体タンパク質又はその塩、あるいは請求項2記載のペ
プチドまたはその塩に対するリガンド候補物質の特異的
結合能を調べる工程を含むことを特徴とする該受容体タ
ンパク質に対するリガンドの決定方法。 - 【請求項15】 請求項1記載のGタンパク質共役型受
容体タンパク質又はその塩、あるいは請求項2記載のペ
プチド又はその塩を使用することを特徴とする、リガン
ドと請求項1記載のGタンパク質共役型受容体タンパク
質又はその塩との結合性を変化させる物質のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項16】 請求項1記載のGタンパク質共役型受
容体タンパク質又はその塩、及び/あるいは請求項2記
載のペプチド又はその塩を構成要素として含むことを特
徴とする、請求項1記載のGタンパク質共役型受容体タ
ンパク質と該受容体タンパク質のリガンドとの間の結合
性を変化させる物質のスクリーニング用キット。 - 【請求項17】 請求項15記載のスクリーニング方法
又は請求項16記載のスクリーニング用キットを使用し
て得られる、請求項1記載のGタンパク質共役型受容体
タンパク質と該受容体タンパク質のリガンドとの間の結
合性を変化させる物質。 - 【請求項18】 請求項17記載の物質を含有する薬学
的組成物。 - 【請求項19】 請求項3記載のポリヌクレオチドとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌク
レオチド。 - 【請求項20】 請求項3記載のポリヌクレオチドと相
補的な塩基配列又は該塩基配列の一部を含むポリヌクレ
オチド。 - 【請求項21】 被検体中のmRNAと請求項20記載のポ
リヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの強度
を測定する工程を包含することを特徴とする請求項1記
載のGタンパク質共役型受容体タンパク質のmRNAの定量
方法。 - 【請求項22】 被検体中のタンパク質と請求項9記載
の抗体との間の結合の強度を測定する工程を包含するこ
とを特徴とする請求項1記載のGタンパク質共役型受容
体タンパク質の定量方法。 - 【請求項23】 請求項21記載の受容体タンパク質mR
NAの定量方法又は請求項22記載の受容体タンパク質の
定量方法を用いることを特徴とする請求項1記載のGタ
ンパク質共役型受容体の機能が関連する疾患の検査方
法。 - 【請求項24】 候補物質を投与又は暴露した被検細胞
又は被検動物における、請求項1記載のGタンパク質共
役型受容体タンパク質の発現レベルを、請求項21記載
の定量方法を用いてmRNAレベルで、あるいは請求項22
記載の定量方法を用いてタンパク質レベルで測定する工
程を包含することを特徴とする請求項1記載のGタンパ
ク質共役型受容体の発現を変化させる物質のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項25】 請求項24記載のスクリーニング方法
を用いて得られる請求項1記載のGタンパク質共役型受
容体の発現を変化させる物質。 - 【請求項26】 請求項25記載の物質を有効成分とし
て含む薬学的組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001169344A JP2003024070A (ja) | 2001-06-05 | 2001-06-05 | 新規なgタンパク質共役型受容体タンパク質及びその遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2001169344A JP2003024070A (ja) | 2001-06-05 | 2001-06-05 | 新規なgタンパク質共役型受容体タンパク質及びその遺伝子 |
Publications (1)
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---|---|
JP2003024070A true JP2003024070A (ja) | 2003-01-28 |
Family
ID=19011432
Family Applications (1)
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JP2001169344A Pending JP2003024070A (ja) | 2001-06-05 | 2001-06-05 | 新規なgタンパク質共役型受容体タンパク質及びその遺伝子 |
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Country | Link |
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JP (1) | JP2003024070A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004097411A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 新規スクリーニング方法 |
JP2004340957A (ja) * | 2003-04-25 | 2004-12-02 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規スクリーニング方法 |
-
2001
- 2001-06-05 JP JP2001169344A patent/JP2003024070A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004097411A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 新規スクリーニング方法 |
JP2004340957A (ja) * | 2003-04-25 | 2004-12-02 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規スクリーニング方法 |
JP4542810B2 (ja) * | 2003-04-25 | 2010-09-15 | 武田薬品工業株式会社 | 新規スクリーニング方法 |
US7972800B2 (en) | 2003-04-25 | 2011-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Screening method for binding property or signal transduction alterations |
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