JPH08266280A - 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その製
造法および用途の提供。 【構成】ウサギ胃幽門部平滑筋由来のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質またはその塩、該Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の部分ペプチド、該Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡ、該Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の製造法、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対するリガンドの決定方法、リガンドと該Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物のス
クリーニング方法またはスクリーニング用キット、該ス
クリーニング方法またはスクリーニング用キットで得ら
れる化合物またはその塩、該化合物またはその塩を含有
する医薬組成物、該蛋白質共役型レセプター蛋白質また
はその部分ペプチドに対する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウサギ胃幽門部平滑筋
由来の新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、該蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の製造方法、および該蛋白質なら
びにＤＮＡの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機
能を調節している。これらのレセプター蛋白質の多くは
共役している guanine nucleotide-binding protein
（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通
じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通
領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセ
プター蛋白質と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、
それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば
ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的と
して非常に重要な役割を担っている。

【０００３】胃や小腸などの消化器官では、多くのホル
モン・ホルモン様物質・神経伝達物質あるいは生理活性
物質などによる調節のもとで、種々の消化液が分泌さ
れ、食物の消化・吸収が行われている。これらの物質
は、胃や小腸などに存在する、それぞれに対応するレセ
プターによってその分泌が制御されていると考えられて
いる。特に、消化管ホルモンと呼ばれるセクレチン，ガ
ストリン，コレシストキニン，バソアクティブ・インテ
スティナル・ポリペプチド，モチリン，サブスタンス
Ｐ，ソマトスタチン，ニューロテンシンなどは、消化管
内腔からの物理的・化学的刺激あるいは神経性の刺激に
反応して分泌されるが、その真の生理作用は不明な点も
多い。また、モチリンはレセプター蛋白質ｃＤＮＡの構
造に関する知見は、これまでに報告されていない。さら
に、未知のレセプター蛋白質やレセプター蛋白質サブタ
イプが存在するかどうかについても分かっていなかっ
た。

【０００４】胃や小腸の複雑な機能を調節する物質とそ
の特異的レセプターとの関係を明らかにすることは、医
薬品開発に非常に重要な手段である。そして胃や小腸の
機能を調節するためのレセプター蛋白質に対するアゴニ
スト／アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医
薬品を開発するためには、レセプター蛋白質の遺伝子の
機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させること
が必要であった。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すこと
を利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称す
る）法によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを探索する方法が行われるようになった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウサギ胃幽
門部平滑筋由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質、該蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の製造方法、および該
蛋白質ならびにＤＮＡの用途を提供することを目的とす
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをより効率的
に単離するための合成ＤＮＡプライマーを用いてウサギ
胃幽門部平滑筋由来のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する
ことに成功し、その解析を進めた。その結果、本発明者
らは、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るウサギ由来のｃＤＮＡを単離し、その部分的な構造を
決定することに成功した。そして、このｃＤＮＡは、公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とＤＮＡおよびア
ミノ酸配列の部分的な相同性が認められたことから、ウ
サギの胃で発現機能している新規なＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードしているＤＮＡであることを見い
だした。本発明者らは、これらの知見から、これらのＤ
ＮＡを用いれば、完全長の翻訳枠を持つｃＤＮＡを入手
することができ、該レセプター蛋白質を製造することも
できることを見いだした。さらに、本発明者らは、該Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを
適当な手段で発現させた該レセプター蛋白質を用いれ
ば、レセプター結合実験または細胞内セカンドメッセン
ジャーの測定等を指標に、生体内あるいは天然・非天然
の化合物から該レセプター蛋白質に対するリガンドをス
クリーニングすることができ、さらには、リガンドとレ
セプター蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニ
ングを行なうこともできることを見いだした。

【０００７】より具体的には、本発明者らは、〔図１お
よび図２〕に示すウサギ胃幽門部平滑筋由来の新規なｃ
ＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、プラスミドベク
ターにサブクローニングした（ｐＭＮ１２８）。その部
分配列の解析から、該ｃＤＮＡが新規レセプター蛋白質
をコードしていることを明らかになった。この配列をア
ミノ酸配列に翻訳したところ〔図１および図２〕、第
２、第３、第４、第５、第６および第７膜貫通領域が疎
水性プロット上で確認された〔図３〕。また、増幅され
たｃＤＮＡのサイズも、公知のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質の第２膜貫通領域と第７膜貫通領域の間の塩基
数と比較して同程度の約０.８ｋｂであった。Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質はそのアミノ酸配列にある程度
の共通性を示し、一つの蛋白質ファミリーを形成してい
る。そこで、本件の新規レセプター蛋白質ＤＮＡ（ｐＭ
Ｎ１２８に含まれるｃＤＮＡ）によってコードされるア
ミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行なったところ、
公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるハムスタ
ー由来β₂−アドレナリンレセプター蛋白質（Ａ０３１
５９）、ラット由来ブラジキニンレセプター（タイプＢ
₂）蛋白質（Ａ４１２８３）、ヒト由来ドーパミンＤ₁レ
セプター蛋白質（Ｓ１１３７７）およびヒト由来青色感
受性オプシン蛋白質（Ａ０３１５６）とアミノ酸で、そ
れぞれ２７％、２０％、２４％および２３％のホモロジ
ーを有する全く新規なレセプター蛋白質であることが判
明した。また本件の新規レセプター蛋白質ＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列を用いて疎水性プロットを
作成した結果、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に特徴
的な疎水性ドメインの存在が明らかとなった。これらの
ことから、本発明の新規レセプター蛋白質がＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質ファミリーに属するものであるこ
とがわかる。上記の（ ）内の略語は、NBRF-PIRにデー
タとして登録される際の整理番号であり、通常Accessio
n Numberと呼ばれるものである。

【０００８】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその塩、（２）第（１）項記載のいずれ
かのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドま
たはその塩、（３）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを
含有するＤＮＡ、（４）配列番号：２で表わされる塩基
配列で表される塩基配列を有する第（３）項記載のＤＮ
Ａ、（５）第（３）項記載のいずれかのＤＮＡを含有す
ることを特徴とするベクター、（６）第（５）項記載の
ベクターを保持する形質転換体、（７）第（６）項記載
の形質転換体を培養し、形質転換体の細胞膜にＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を生成せしめることを特徴とす
る第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ま
たはその塩の製造方法、（８）第（１）項記載のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または第
（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩と、試験化
合物とを接触させることを特徴とする特徴とする第
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドの決定方法、

【０００９】（９）（ｉ）第（１）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質もしくはその塩または第（２）項
記載の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触
させた場合と（ii）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質もしくはその塩または第（２）項記載の
部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化
合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
るリガンドと第（１）項記載のいずれかのＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物またはそ
の塩をスクリーニングする方法、（１０）第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩を含
有することを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング用キット、および（１
１）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
もしくはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドも
しくはその塩に対する抗体を提供する。

【００１０】より具体的には、（１２）蛋白質が、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸
が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、あるいは配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または
その塩。（１３）リガンドがアンギオテンシン、ボンベ
シン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、
セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオ
イド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ
（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイ
テッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モ
チリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシト
ニンジーンリレーティッドペプチド）、アドレノメジュ
リン、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタ
グランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリ
ン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、Ｇ
ＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ
４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、Ｍ
ＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、Ｒ
ＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリ
ン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレ
アティックポリペプタイドまたはガラニンである第
（８）項記載のリガンドの決定方法、

【００１１】（１４）標識したリガンドを第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接
触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドまたは
その塩に接触させた場合における、標識したリガンドの
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドもしく
はその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴
とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、（１５）標識したリガンドを第
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有
する細胞に接触させた場合と、標識したリガンドおよび
試験化合物を第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、標
識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（１６）標識した
リガンドを第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、標
識したリガンドおよび試験化合物を第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分
に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞
の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴
とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、

【００１２】（１７）標識したリガンドを第（６）項記
載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の
細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接
触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を
第（６）項記載の形質転換体を培養することによって該
形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質に接触させた場合における、標識したリガンド
の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を
測定し、比較することを特徴とするリガンドと第（１）
項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻
害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（１
８）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を活性化する化合物を第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活
性化する化合物および試験化合物を第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触さ
せた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング方法、（１９）第（１）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を活性化する化合物を第（６）項
記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体
の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
接触させた場合と、第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を
第（６）項記載の形質転換体を培養することによって該
形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、比較す
ることを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、

【００１３】（２０）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を活性化する化合物がアンギオテンシ
ン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グ
ルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチド
Ｙ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシ
ン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アン
ド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドー
パミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ
（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、アド
レノメジュリン、ロイコトリエン、パンクレアスタチ
ン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシ
ン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−
８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮ
Ａ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−
１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エ
ンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、Ｔ
ＲＨ、パンクレアティックポリペプタイドまたはガラニ
ンである第（１８）項または第（１９）項記載のスクリ
ーニング方法、（２１）第（９）項、第（１４）項〜第
（２０）項記載のスクリーニング方法で得られる化合物
またはその塩、（２２）第（２１）項記載の化合物また
はその塩を含有することを特徴とする医薬組成物、

【００１４】（２３）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴
とする第（１０）項記載のスクリーニング用キット、
（２４）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とす
る第（１０）項記載のスクリーニング用キット、（２
５）第（１０）項、第（２３）項または第（２４）項記
載のスクリーニング用キットを用いて得られる化合物ま
たはその塩、（２６）第（２５）項記載の化合物または
その塩を含有することを特徴とする医薬組成物、および
（２７）第（１１）項記載の抗体と、第（１）項記載の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または
第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩とを接触
させることを特徴とする第（１）項記載のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質もしくはその塩または第（２）項記
載の部分ペプチドもしくはその塩の定量法を提供する。

【００１５】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
としては、温血動物（例えば、トリ、モルモット、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、ヒト
など）のあらゆる組織（例えば、胃、下垂体、膵臓、
脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または
細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質で
あって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば何なる
ものであってもよい。すなわち、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質としては、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％
の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に
同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に
同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナ
ル情報伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガ
ンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。し
たがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプ
ター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。

【００１６】より具体的には、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質としては、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を含有するウサギ胃幽門部平滑筋由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げられる。ま
た、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質として
は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１また
は２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白
質なども挙げられる。さらに、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で
切断され、該Ｇｌｕがピログルタミン化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質
などの複合蛋白質なども含まれる。本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の塩としては、とりわけ生理学的
に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いら
れる。

【００１７】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
またはその塩は、温血動物の組織または細胞から自体公
知の蛋白質の精製方法によって製造することもできる
し、後述するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっ
ても製造することができる。また、後述のペプチド合成
法に準じて製造することもできる。本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例え
ば、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質分子のう
ち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。
具体的には、〔図２〕で示される本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞
外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析さ
れた部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrop
hobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いること
ができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い
得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドで
も良い。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容され
る酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無
機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００１８】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの
合成法に従って、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても
良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプ
チドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物
が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目
的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法
や保護基の脱離としてはたとえば、以下の〜に記載
された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。

【００１９】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１の
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
また、ヒトゲノムＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ー、ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、ヒト組織・細胞由
来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファ
ージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれ
であってもよい。また、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分を
調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Poly
merase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称す
る。）によって増幅することもできる。より具体的に
は、配列番号：１のアミノ酸配列を含有するウサギ胃平
滑筋由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２０】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分塩基配列を
有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
をヒトＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部あるいは
全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて
標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別
する。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molec
ular Cloning ２nd（ed.；J. Sambrook et al., Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに
従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。ク
ローン化されたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用
することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開
始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加する
こともできる。

【００２１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現ベ
クターは、例えば、（イ）本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ
断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベク
ター中のプロモーターの下流に連結することにより製造
することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
１８，ｐＵＣ１１９）、枯草菌由来のプラスミド（例、
ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラ
スミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージな
どのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニア
ウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが
用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。

【００２２】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ利
用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的で
ある。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のＮ端末側に付加
する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリ
フォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配
列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミ
ラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列な
どが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクタ
ーα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリ
ン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配
列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築されたＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用い
て、形質転換体を製造する。

【００２３】宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・
ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１
６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３
０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal ofMolecular Biol
ogy）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。

【００２４】酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコ
の幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Natur
e），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞として
は、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），
マウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７
９)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転
換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），
７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行な
われる。

【００２５】昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバ
イオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(198
8)）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を
形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なわれる。このようにして、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど
が挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子
などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望まし
い。

【００２６】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２７】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化
した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが
用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整する
のが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえ
ば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，Ｄ
ＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６
(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Jounal of the American Medical Association）
１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メディスン（Proceeding of the Society fo
r the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２８】上記培養物からＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法により行
なうことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過によりＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液
の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、
トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略する
ことがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよ
い。培養液中にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が分泌
される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌
体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。この
ようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含ま
れるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の精製は、自体公
知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことがで
きる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶
媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ
過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。

【００２９】かくして得られるＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法
あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することが
でき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるい
はそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換
することができる。なお、組換え体が産生するＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモ
トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイ
ンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくし
て生成するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の活性は標
識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエ
ンザイムイムノアッセイなどにより測定することができ
る。

【００３０】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡおよびＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの決定方法、抗体および抗血清の入
手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同
発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬
品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリ
ガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザ
インの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプ
ライマーの作成、遺伝子治療等に用いることができ
る。特に、本発明の組み替え型Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系に
よって、ヒトなどの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役型
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリー
ニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニ
ストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用すること
ができる。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、
部分ペプチド、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡおよび抗体の用途について、以下により具
体的に説明する。

【００３１】（１）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの決定方法本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部
分ペプチドもしくはその塩は、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対するリガンドを探索しまたは決定
するための試薬として有用である。すなわち、本発明
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩と、
試験化合物とを接触させることを特徴とする本発明のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定
方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガンド
（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイ
ド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラ
トニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バ
ソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアクティブ
インテスティナル アンド リレイテッド ペプチ
ド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリ
ン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレ
ーティッドペプチド）、アドレノメジュリン、ロイコト
リエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、ト
ロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ
−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯ
γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、Ｇ
ＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３
０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳな
ど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニンなど）の他に、例えば温血動物
（例えば、トリ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツ
ジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清など
が用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清な
どを本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に添加
し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に
単一のリガンドを得ることができる。

【００３２】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を
用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を
構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を
用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓ活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖
などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合
物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を決定する
方法である。本発明のリガンド決定方法においては、本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または本発明の
部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、例え
ば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該部分ペプ
チドに対する試験化合物の結合量、細胞刺激活性などを
測定することを特徴とする。

【００３３】より具体的には、本発明は、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチ
ドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した
試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、または該部分ペ
プチドもしくはその塩に対する結合量を測定することを
特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接
触させた場合における、標識した試験化合物の該細胞ま
たは該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とす
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの
決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体
を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、標識
した試験化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対する結合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、

【００３４】試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合にお
ける、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する
活性または抑制する活性など）を測定することを特徴と
するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
の決定方法、および 試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の
活性化などを促進する活性または抑制する活性など）を
測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に対するリガンドの決定方法を提供する。

【００３５】本発明のリガンド決定方法の具体的な説明
を以下にする。まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質としては、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質または本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれ
ば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量
発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、
前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行う
ことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相
補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるも
のではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いて
もよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく
発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とする
バキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclea
r polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモ
ーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒト
ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプ
ロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込む
のが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそ
れ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。

【００３６】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するも
のとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含
有する細胞の膜画分を用いてもよい。本発明のリガンド
決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒ
ド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は
それ自体公知の方法に従って行うことができる。Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をい
うが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆
虫細胞、動物細胞などが挙げられる。

【００３７】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画
分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−El
vehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリ
ングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による
破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧し
ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕
などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と
して用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒ
ｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜
１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であ
るのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当た
りのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。

【００３８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識
した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画
分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白
質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等
の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識
した試験化合物としては、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したアンギオテンシン、
モンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタ
ミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、
オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、
ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド
リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミ
ン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カ
ルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、アドレノ
メジュリン、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プ
ロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アド
レナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯ
α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、
ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１
４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１
β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガス
トリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パン
クレアティックポリペプタイド、ガラニンなどが好適で
ある。

【００３９】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバ
ッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
によるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭ
ＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
あるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−Ｎ
ＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドとして選択
することができる。

【００４０】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す
ることができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート
等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前も
って新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバ
ッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間
インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回
収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す
る。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキド
ン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって
検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加し
てアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制
などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基
礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作
用として検出することができる。

【００４１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンド決定用キットは、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有するものである。本
発明のリガンド決定用キットの例としては、次のものが
挙げられる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂９５％ａｉｒで２日間培養したもの。

【００４２】標識試験化合物 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難
溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミ
ド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。 ２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した 標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶
解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と
混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。

【００４３】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合することができるリガンドとしては、例えば脳、
下垂体、膵臓などに特異的に存在する物質などが挙げら
れ、具体的にはアンギオテンシン、モンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアク
ティブ インテスティナル アンド リレイテッド ペ
プチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、ア
ミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーン
リレーティッドペプチド）、アドレノメジュリン、ロイ
コトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αお
よびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、
ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１
０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、
Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ
など）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニンなどが挙げられる。

【００４４】（２）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質欠乏症の予防・治療剤 上記（１）の方法において、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に体するリガンドが明らかになれば、該
リガンドが有する作用に応じて、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤として使用す
ることができる。例えば、生体内において本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質が減少しているためにリガ
ンドの生理作用が期待できない患者がいる場合に、
（イ）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによっ
て、あるいは（ロ）脳細胞などに本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現さ
せた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによっ
て、該患者の脳細胞におけるＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮さ
せることができる。したがって、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒
性な本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の
予防・治療剤などとして用いることができる。

【００４５】本発明のＤＮＡを上記治療剤として使用す
る場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。例
えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、
あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と
の無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経
口的に使用できる。例えば、本発明のＤＮＡを生理学的
に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤
実施に要求される単位用量形態で混和することによって
製造することができる。これら製剤における有効成分量
は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするも
のである。錠剤、カプセル剤などに混和することができ
る添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、
トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セル
ロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、ア
ルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウ
ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのよ
うな甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー
のような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプ
セルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂の
ような液状担体を含有することができる。注射のための
無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、
胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解
または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処
方することができる。

【００４６】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえ
ばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール
（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベー
ト８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に
対して投与することができる。該ＤＮＡの投与量は、症
状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。

【００４７】（３）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩は、リガ
ンドに対して結合性を有しているので、生体内における
リガンド濃度を感度良く定量することができる。本発明
の定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって
用いることができる。すなわち、被検体を本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、またはＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくは
その塩と接触させることによって被検体中のリガンド濃
度を測定することができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００４８】（４）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質とリガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニ
ング方法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を用い
るか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築
し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との結合を阻害する化合物（例えば、ペプチド、
蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など）またはその塩をスクリーニングすることができ
る。このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセプター
を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ
の活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖な
どを促進する活性または抑制する活性など）を有する化
合物（いわゆる、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターア
ゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆ
る、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニス
ト）などが含まれる。

【００４９】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または本発
明の部分ペプチドもしくはその塩に、該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対するリガンドを接触させた場合と
（ii）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしく
はその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩
に、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガン
ドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩
のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニ
ング方法においては、（ｉ）本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質または本発明の部分ペプチドに、リガン
ドを接触させた場合と（ii）本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質または本発明の部分ペプチドに、リガン
ドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該部分ペプチ
ドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定
して、比較することを特徴とする。

【００５０】より具体的には、本発明は、 標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標
識したリガンドの該蛋白質もしくはその塩、または該部
分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、 標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞
または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識
したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を
測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法、

【００５１】標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、
標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合にお
ける、標識したリガンドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴と
するリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化す
る化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドなど）を本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合
と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、
Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋
白質の活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制
する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および

【００５２】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活
性化する化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドなど）を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合
と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白
質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の
活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制する活
性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提
供する。

【００５３】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
が得られる以前は、Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、ま
ずラットなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む
細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合物を
得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合物が
実際にヒトのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガン
ドとの結合を阻害するか否かを確認する試験（二次スク
リーニング）が必要であった。細胞、組織または細胞膜
画分をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質も混在す
るために、目的とするレセプター蛋白質に対するアゴニ
ストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングする
ことは困難であった。しかしながら、本発明のヒト由来
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を用いることによっ
て、一次スクリーニングの必要がなくなり、リガンドと
Ｇ蛋白質共役型レセプターとの結合を阻害する化合物を
効率良くスクリーニングすることができる。さらに、ス
クリーニングされた化合物がＧ蛋白質共役型レセプター
アゴニストかＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト
かを評価することができる。本発明のスクリーニング方
法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明のスクリ
ーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
としては、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ま
たはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを
含有するものであれば何れのものであってもよいが、温
血動物の臓器の膜画分が好適である。しかし、特にヒト
由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニ
ングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量
発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。

【００５４】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造す
るには、前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコード
するＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することに
より行うことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断
片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約
されるものではない。例えば遺伝子断片や合成ＤＮＡを
用いてもよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効
率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主
とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリ
ンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウ
イルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に
組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の
検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例え
ば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,1
9555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うこと
ができる。したがって、本発明のスクリーニング方法に
おいて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するも
のとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含
有する細胞の膜画分を用いてもよい。

【００５５】本発明のスクリーニング方法において、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に
従って行うことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞とし
ては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など
が挙げられる。膜画分としては、細胞を破砕した後、そ
れ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分
のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elve
hjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリン
グブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破
砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しな
がら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕な
どが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や
密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主とし
て用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐ
ｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜
１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であ
るのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当た
りのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。

【００５６】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする前
記の〜を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型
レセプター画分と、標識したリガンドが必要である。Ｇ
蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白
質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を
有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望
ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合
活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識した
リガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用い
られる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、
〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用すること
ができる。具体的には、リガンドとＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニン
グを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに
適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品
を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましく
はｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッ
ファーなどのリガンドＸとレセプターとの結合を阻害し
ないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異
的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−
８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコ
レートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで
きる。

【００５７】さらに、プロテアーゼによるレセプターや
リガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチ
ン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなど
のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０
１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５００
０ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを
添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10 Ｍの試験化合物を共
存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過
剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意す
る。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃
で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行
う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッ
ファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活
性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウン
ターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント
(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント
（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量
（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を
拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。

【００５８】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物スクリーニングす
る前記の〜の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の
活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制する活
性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用い
て測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェル
プレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあた
っては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さな
い適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加し
て一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは
上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従
って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。細胞刺激
活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞が必要で
ある。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現
した細胞としては、天然型の本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を有する細胞株（例えば、マウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６など）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質発現細胞株などが望ましい。試験化合
物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽
出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は
新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であって
もよい。

【００５９】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング用キットは、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、本発明の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、ある
いは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞の膜画分を含有するものである。本発明のスクリ
ーニング用キットの例としては、次のものが挙げられ
る。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。

【００６０】Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識リガンド 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したリガンド 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。

【００６１】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０^-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent of Maximum Bindi
ng（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【００６２】

【数１】 ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００６３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプターとの
結合を阻害する化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役
型レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物また
はその塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニス
ト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる
Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）である。該
化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化
合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら
化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニス
トは、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドが有する生理活性と同様の作用を有している
ので、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬組成
物として有用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプター
アンタゴニストは、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドが有する生理活性を抑制するこ
とができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒
性な医薬組成物として有用である。

【００６４】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣
を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカ
プセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸
濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、ア
ラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような
賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの
ような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油
などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させ
るなどの通常の製剤実施にしたがって処方することがで
きる。

【００６５】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコー
ル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に
対して投与することができる。該化合物またはその塩の
投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非
経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例
えば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好まし
くは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１
〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。

【００６６】（５）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する
抗体または抗血清の製造 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩に対する抗体（例えば、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドもしくはその塩を抗原として用い、自体
公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造すること
ができる。例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法
に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩（以下、Ｇ蛋白質共役型レセ
プターと略称する場合がある）は、温血動物に対して投
与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用
いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。

【００６７】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
Ｇ蛋白質共役型レセプターと抗血清とを反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより
なされる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーと
ミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495
(1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが
挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫
細胞としては例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／
０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく
用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と
骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度
であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６
０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキ
ュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき
る。

【００６８】抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
るが、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター抗原を直接あ
るいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレ
ート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性
物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞
融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グ
ロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加
え、固相に結合した抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＧ蛋
白質共役型レセプターを加え、固相に結合した抗Ｇ蛋白
質共役型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法
などがあげられる。抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノク
ローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる
方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物
細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地として
は、ハイビリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培
地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いるこ
とができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましく
は約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好
ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸
ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体
価の測定と同様にして測定できる。

【００６９】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離
精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免
疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈
殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、
ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗
原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ
などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離
させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以
上の（１）および（２）の方法に従って製造させる本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体は、Ｇ蛋白質共役型
レセプターを特異的に認識することができるので、被検
液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量、特にサンドイ
ッチ免疫測定法による定量などに使用することができ
る。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプターに反応する抗体と、被検液および
標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターとを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化Ｇ蛋白質共役型レセプター
の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧ蛋白質
共役型レセプターの定量法、 （２）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化さ
れた抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする
被検液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量法におい
て、一方の抗体がＧ蛋白質共役型レセプターのＮ端部を
認識する抗体で、他方の抗体がＧ蛋白質共役型レセプタ
ーのＣ端部に反応する抗体であることを特徴とする被検
液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量法を提供する。

【００７０】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを認識
するモノクローナル抗体（以下、抗Ｇ蛋白質共役型レセ
プター抗体と称する場合がある）を用いてＧ蛋白質共役
型レセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による
検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分
子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限される
べきものではなく、被測定液中の抗原量（例えばＧ蛋白
質共役型レセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測
定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測
定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵
素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位
元素としては、例えば〔^{12 5}Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、
〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光
物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソ
チオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
がそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００７１】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体に被検液を反応さ
せ（１次反応）、さらに標識化抗Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧ蛋白
質共役型レセプター量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法によるＧ蛋白質共役型レセプター
の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる
抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はＧ蛋白質共役型レセ
プターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら
れる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体
は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、Ｇ蛋白質共
役型レセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用
いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部
を認識する抗体が用いられる。

【００７２】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体を
サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、
イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用い
ることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗
原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の
標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを
分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定
し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体
として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレング
リコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相
法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あ
るいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として
固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメ
トリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定
量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を
分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識
化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標
識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離す
る。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗
原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あ
るいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降
物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量
の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用
するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００７３】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧ蛋
白質共役型レセプターの測定系を構築すればよい。これ
らの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書な
どを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジ
オイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江
寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４
年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書
院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定
法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄
治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和
６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immu
nochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immu
nochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immu
nochemical Techniques(PartD:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体
を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプターを感
度良く定量することができる。

【００７４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸

【００７５】 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸

【００７６】Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００７７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ｐＭＮ１２８に含まれるウサギ胃幽門
部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片にコードされるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ｐＭＮ１２８に含まれるウサギ胃幽門
部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。後述の実施例３で得られた
形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) Ｊ
Ｍ１０９／ｐＭＮ１２８は、平成７年３月１７日から通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３９として寄託さ
れており、また平成７年３月２２日から財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５８１０として寄託されて
いる。

【００７８】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００７９】

【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒト由来ガラニンレセプター（ＨＵＭＧＡＬＡＲ
ＥＣ）、ラット由来α−１Ｂ−アドレナジックレセプタ
ー（ＲＡＴＡＤＲ１Ｂ）、ヒト由来β−１−アドレナジ
ックレセプター（ＨＵＭＡＤＲＢ１）、ウサギ由来ＩＬ
−８レセプター（ＲＡＢＩＬ８ＲＳＢ）、ヒト由来オピ
オイドレセプター（ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）、ウシ由来
サブスタンスＫレセプター（ＢＴＳＫＲ）、ヒト由来ソ
マトスタチンレセプター−２（ＨＵＭＳＲＩ２Ａ）、ヒ
ト由来ソマトスタチンレセプター−３（ＨＵＭＳＳＴＲ
３Ｙ）、ヒト由来ガストリンレセプター（ＨＵＭＧＡＲ
Ｅ）、ヒト由来コレシストキニンＡレセプター（ＨＵＭ
ＣＣＫＡＲ）、ヒト由来ドパミンレセプター−Ｄ５（Ｈ
ＵＭＤ１Ｂ）、ヒト由来セロトニンレセプター５ＨＴ１
Ｅ（ＨＵＭ５ＨＴ１Ｅ）、ヒト由来ドパミンレセプター
Ｄ４（ＨＵＭＤ４Ｃ）、マウス由来セロトニンレセプタ
ー−２（ＭＭＳＥＲＯ）、ラット由来α−１Ａ−アドレ
ナジックレセプター（ＲＡＴＡＤＲＡ１Ａ）およびラッ
ト由来ヒスタミンＨ２レセプター（Ｓ５７５６５）の第
２膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。

【００８０】また、公知のヒト由来ガラニンレセプター
（ＨＵＭＧＡＬＡＲＥＣ）、ラット由来Ａ１アデノシン
レセプター（ＲＡＴ１ＡＤＲＥＣ）、ブタ由来アンジオ
テンシンレセプター（ＰＩＧＡ２Ｒ）、ラット由来セロ
トニンレセプター（ＲＡＴ５ＨＴＲＴＣ）、ヒト由来ド
パミンレセプター（Ｓ５８５４１）、ヒト由来ガストリ
ンリリーシングペプチドレセプター（ＨＵＭＧＲＰ
Ｒ）、マウス由来ＧＲＰ／ボンベシンレセプター（ＭＵ
ＳＧＲＰＢＯＭ）、ラット由来バスキュラータイプ１ア
ンジオテンシンレセプター（ＲＲＶＴ１ＡＩＩＲ）、ヒ
ト由来ムスカリニックアセチルコリンレセプター（ＨＳ
ＨＭ４）、ヒト由来β−１アドレナジックレセプター
（ＨＵＭＤＲＢ１）、ヒト由来ガストリンレセプター
（ＨＵＭＧＡＲＥ）、ラット由来コレシストキニンレセ
プター（ＲＡＴＣＣＫＡＲ）、ラット由来リガンド不明
レセプター（Ｓ５９７４８）、ヒト由来ソマトスタチン
レセプター（ＨＵＭＳＳＴ２８Ａ）、ラット由来リガン
ド不明レセプター（ＲＮＧＰＲＯＣＲ）、マウス由来ソ
マトスタチンレセプター１（ＭＵＳＳＲＩ１Ａ）、ヒト
由来α−Ａ１−アドレナジックレセプター（ＨＵＭＡ１
ＡＡＤＲ）、マウス由来デルタオピオイドレセプター
（Ｓ６６１８１）およびヒト由来ソマトスタチンレセプ
ター−３（ＨＵＭＳＳＴＲ３Ｙ）の第７膜貫通領域付近
のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較
し、類似性の高い部分を見いだした。

【００８１】上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Prot
einシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、通常
エントリーネームと呼ばれるものである。特に、多くの
レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩基
部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多く
のレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために混
合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通する
塩基配列に相補的である配列番号：３または配列番号：
４で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作成
した。 ５'−ＧＹＣＡＣＣＡＡＣＮＷＳＴＴＣＡＴＣＣＴＳＷＮＨＣＴＧ−３' 〔ＳはＧまたはＣを示し、ＹはＣまたはＴを示し、ＷはＡまたはＴを示し、Ｈは Ａ、ＣまたはＴを示し、ＮはＩを示す。〕 （配列番号：３） ５'−ＡＳＮＳＡＮＲＡＡＧＳＡＲＴＡＧＡＮＧＡＮＲＧＧＲＴＴ−３' 〔ＲはＡまたはＧを示し、ＳはＧまたはＣを示し、ＮはＩを示す。〕 （配列番号：４） Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、ＲおよびＳは、合成時に複数の塩基に
混合して合成する。

【００８２】

【実施例１】ウサギ胃幽門部平滑筋からのpoly(Ａ)⁺Ｒ
ＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 ウサギ胃幽門部平滑筋よりグアニジンイソチオシアネー
ト法により Total ＲＮＡを調製後（Kaplan B.B. et a
l., Biochem. J. 183, 181-184 (1979)）、ｍＲＮＡ精
製キット（ファルマシア社）を用いて、poly(Ａ)⁺ＲＮ
Ａ画分を調製した。次に、poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの逆転写酵
素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補Ｄ
ＮＡを合成した。反応後の産物はフェノール：クロロホ
ルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿を行なった
後、３０μｌのＴＥに溶解した。

【００８３】

【実施例２】ウサギ胃幽門部平滑筋由来ｃＤＮＡを用い
たＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決
定 実施例１でウサギ胃幽門部平滑筋より調製したｃＤＮＡ
１μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成したＤＮ
Ａプライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行なった。反
応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５'プラ
イマー配列および３'プライマー配列）各１００ｐＭ、
０.２５mM ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡpolymerase １
μｌおよび酵素に付属のバッファー１０μｌで、総反応
溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイクルはサ
ーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９
６℃・３０秒、４５℃・１分、６０℃・３分のサイクル
を２５回繰り返した。増幅産物の確認は１.２％アガロ
ースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によっ
て行なった。

【００８４】

【実施例３】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター候補クローンの選択 実施例２で行なったＰＣＲ後の反応産物は１.４％のア
ガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリ
で切り出した後、エレクトロエリューション、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。Ｔ
Ａクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従
い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへ
サブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９ compe
tent cell（宝酒造株式会社）に導入して形質転換した
のち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で
選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を
用いて分離し、形質転換体を１００クローン得た。個々
のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養
し、自動プラスミド抽出装置ＰＩ−１００（クラボウ）
を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ
の一部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入され
ているｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡ
の一部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフ
ォルム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。

【００８５】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。得
られた塩基配列を基に、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエ
ンジニアリング社）を用いてホモロジー検索を行なった
結果、形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichiacol
i) ＪＭ１０９／ｐＭＮ１２８の保有するプラスミドに
挿入されたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードすることが分かった。該ｃＤＮＡ断片
の塩基配列を〔図１および図２〕に示した。さらに確認
するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリ
ング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した後
〔図１および図２〕、疎水性プロット〔図３〕を行なっ
た結果、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質であることを
示す疎水性ドメインが存在することが確認された。ま
た、アミノ酸配列に基づくホモロジー検索を行なった結
果、例えば、ハムスター由来β₂−アドレナリンレセプ
ター蛋白質（Ａ０３１５９）と２７％、ラット由来ブラ
ジキニンレセプター（タイプＢ₂）蛋白質（Ａ４１２８
３）と２０％、ヒト由来ドーパミンＤ₁レセプター蛋白
質（Ｓ１１３７７）と２４％、ヒト由来青色感受性オプ
シン蛋白質（Ａ０３１５６）と２３％のホモロジーを有
する新規なレセプター蛋白質であることが判明した。上
記の（ ）内の略語は、ＮＢＲＦ−ＰＩＲにデータとし
て登録される際の整理番号であり、通常Accession Numb
er と呼ばれるものである。

【００８６】

【発明の効果】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質および該蛋白質をコードするＤＮＡは、リガンドの
決定、抗体および抗血清の入手、組み替え型レセプ
ター蛋白質の発現系の構築、同発現系を用いたレセプ
ター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ
ーニング、構造的に類似したリガンド・レセプターと
の比較にもとづいたドラッグデザインの実施、遺伝子
診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作成、遺
伝子治療等に用いることができる。特に、Ｇ蛋白質共役
型のレセプターの構造・性質の解明はこれらの系に作用
するユニークな医薬品の開発につながる。

【００８７】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：２６３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys Val Ile 20 25 30 Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Val Val Leu Thr Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His Pro Leu Leu Phe 50 55 60 Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile Leu Gly Ile Trp Ala 65 70 75 80 Val Ser Leu Ala Val Met Val Pro Gln Ala Ala Val Met Glu Cys Ser 85 90 95 Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg Thr Arg Leu Leu Ser Val Cys 100 105 110 Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys 115 120 125 Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala 130 135 140 Tyr Phe Gln Ile Phe Arg Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ser Ala Leu Val Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Asp 165 170 175 Asp Gln Gly Gln Gly Leu Ser Ser Glu Pro Gln Pro Arg Ala Arg Ala 180 185 190 Phe Leu Ala Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys 195 200 205 Met Leu Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile 210 215 220 Ser Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala 225 230 235 240 Ser Asp Arg Glu Ala Ile Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp Leu 245 250 255 Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala 260

【００８８】

【配列番号：２】 配列の長さ：７８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCCGATGTGC TGGTGACAGC CATCTGCCTG CCGGCCAGTC TGCTGGTAGA CATCACGGAA 60 TCCTGGCTCT TTGGCCATGC CCTCTGCAAG GTCATCCCCT ATCTACAGGC CGTGTCCGTG 120 TCAGTGGTCG TGCTGACTCT CAGCTCCATC GCCCTGGACC GCTGGTACGC CATCTGCCAC 180 CCGCTGTTGT TCAAGAGCAC TGCCCGGCGC GCCCGCGGCT CCATCCTCGG CATCTGGGCG 240 GTGTCGCTGG CTGTCATGGT GCCTCAGGCT GCTGTCATGG AGTGTAGCAG CGTGCTGCCC 300 GAGCTGGCCA ACCGCACCCG CCTCCTGTCT GTCTGTGATG AGCGCTGGGC AGACGACCTG 360 TACCCCAAGA TCTACCACAG CTGCTTCTTC ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC 420 ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATCTTCCGC AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC 480 ACCTCGGCCC TGGTGCGCAA CTGGAAGCGG CCCTCAGACC AGCTGGACGA CCAGGGCCAG 540 GGCCTGAGCT CAGAGCCCCA GCCCCGGGCC CGCGCCTTCC TGGCCGAGGT GAAACAGATG 600 CGAGCCCGGA GGAAGACGGC CAAGATGCTG ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC 660 TACCTGCCCA TCAGTGTCCT CAACGTCCTC AAGAGGGTCT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC 720 AGCGACCGAG AGGCCATCTA CGCCTGCTTC ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC 780 AGCGCCGCC 789

【００８９】

【配列番号：３】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 GYCACCAACN WSTTCATCCT SWNHCTG 27

【００９０】

【配列番号：４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 ＡＳＮＳＡＮＲＡＡＧ ＳＡＲＴＡＧＡＮＧＡ ＮＲＧ
ＧＲＴＴ ２７

【００９１】

【図面の簡単な説明】

【図１】ウサギ胃幽門部平滑筋よりＰＣＲ増幅によって
得た新規レセプター蛋白質ｃＤＮＡクローンｐＭＮ１２
８に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列（第１番目〜
第５４０番目）およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。塩基配列の５’端に示した下線部分は、ＰＣＲ
増幅に用いた合成プライマーに相当する。

【図２】ウサギ胃幽門部平滑筋よりＰＣＲ増幅によって
得た新規レセプター蛋白質ｃＤＮＡクローンｐＭＮ１２
８に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列（第５４１番
目〜第８４３番目）およびそれにコードされるアミノ酸
配列を示す。塩基配列の３'端に示した下線部分は、Ｐ
ＣＲ増幅に用いた合成プライマーに相当する。

【図３】図１および図２に示したアミノ酸配列をもとに
作成した、ｐＭＮ１２８に含まれるウサギ胃幽門部平滑
筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片に
コードされる蛋白質の疎水性プロットを示す。この図か
らＴＭ２〜ＴＭ７で示す疎水性ドメインの存在が示唆さ
れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 39/395 48/00 48/00 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
   実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とす
   るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
2. 【請求項２】請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター
   蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3. 【請求項３】請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター
   蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号：２で表される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項３記載のＤＮＡを含有することを特
   徴とするベクター。
6. 【請求項６】請求項５記載のベクターを保持する形質転
   換体。
7. 【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、形質
   転換体の細胞膜にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を生
   成せしめることを特徴とする請求項１記載のＧ蛋白質共
   役型レセプター蛋白質またはその塩の製造方法。
8. 【請求項８】請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター
   蛋白質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプチ
   ドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させることを
   特徴とする請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
   白質に対するリガンドの決定方法。
9. 【請求項９】（ｉ）請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセ
   プター蛋白質もしくはその塩または請求項２記載の部分
   ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させた場合
   と（ii）請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
   質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプチドも
   しくはその塩に、リガンドおよび試験化合物を接触させ
   た場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと請
   求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合
   を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
10. 【請求項１０】請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
    ー蛋白質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプ
    チドもしくはその塩を含有することを特徴とするリガン
    ドと請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と
    の結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
    用キット。
11. 【請求項１１】請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
    ー蛋白質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプ
    チドもしくはその塩に対する抗体。