DE60019586T2 - Myostatin genpromoter und inhibierung dessen aktivierung - Google Patents

Myostatin genpromoter und inhibierung dessen aktivierung Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promoter, welcher die Expression des Myostatin-Gens reguliert, sowie Verfahren zur Identifizierung einer Zusammensetzung, welche die Aktivierung dieses Promoters hemmt. Insbesondere verhindern Inhibitoren des Promoters die Expression des Myostatin-Gens und verhindern somit Muskel-Abbau.
  • Hintergrundinformation
  • Myostatin oder Wachstums/Differenzierungs-Faktor 8 (growth differentiation factor 8, GDF-8) gehört zur Großfamilie des transformierenden Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor TGF-β), (McPherron et al., Nature 387:83–90 (1997)). Das menschliche Myostatin-Gen wurde geklont (Nestor et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14938–43 (1998)) und es wurde berichtet, dass die Immuno-Reaktivität von Myostatin nachweisbar ist im menschlichen Skelett-Muskel, sowohl in Typ 1- als auch in Typ 2-Fasern. Unter Berücksichtigung der Funktion kann Myostatin eine Rolle spielen bei der negativen Regulierung des Wachstums und der Entwicklung von Skelett-Muskel (Nestor et al., supra).
  • Der erste Hinweis, dass Myostatin eine Schlüsselrolle bei der negativen Regulierung von Muskel-Entwicklung spielen kann, kam aus einer Studie mit Myostatin Knock-Out-Mäusen (McPherron et al., Nature 387:83–90 (1997)). Bei der Myostatin Null Maus waren die Tiere eher normal, außer dass sie signifikant größer waren als Wild-Typ-Mäuse und hatten einen großen und umfassenden Zuwachs der Skelett-Muskelmasse. Weiterhin wurde ebenfalls bestimmt, dass zwei Arten von Rindstieren, die sich durch eine erhöhte Muskelmasse auszeichnen, Mutationen in der Myostatinkodierenden Sequenz haben (McPherron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12457–61 (1997)). Weiterhin sollte angemerkt werden, dass die Konzentrationen von immuno-reaktivem Myostatin im Serum und im Muskel bei Männern mit HIV mit Muskel-Abbau im Vergleich zu gesunden Männern erhöht sind, und umgekehrt mit dem Fettfreie Masse-Index korrelieren. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass Myostatin ein negativer Regulator des Skelett-Muskel-Wachstums bei erwachsenen Männern ist und zum Muskel-Abbau bei HIV infizierten Männern beiträgt (Nestor et al., supra).
  • Im Hinblick auf die obigen Erkenntnisse besteht ein Bedürfnis nach einer Art und Weise zur Regulierung der Myostatin-Expression, insbesondere bei Individuen, die einen Muskel-Abbau erfahren als ein Ergebnis eines Zustandes oder eines Erkrankungsstadiums wie beispielsweise Alterung, Autoimmun-Diffizienz-Syndrom (AIDS), Multipler Sklerose und Krebs. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, welche verwendet werden können, um Individuen mit solchen Muskel-Abbau-Zuständen zu helfen und liefert weitere Einsicht in die Regulierung der Myostation-Gen-Expression.
  • Sämtliche US-Patente und Veröffentlichungen, auf die hierin Bezug genommen wird, werden hiermit durch die Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine isolierte Nukleinsäure-Sequenz, dargestellt durch 2 (Sequenz-ID-Nummer: 1).
  • Zusätzlich umfasst die vorliegende Erfindung einen Vektor, der die oben beschriebene Nukleinsäure-Sequenz umfasst, und eine Nukleinsäure-Sequenz, welche ein Reporter-Molekül kodiert. die Nukleinsäure-Sequenz, die das Reporter-Molekül kodiert, ist operativ verknüpft mit der Nukleinsäure-Sequenz, die durch 2 dargestellt ist. Das Reporter-Molekül kann gewählt werden aus der Gruppe bestehend aus beispielsweise Luciferase, β-Galactosidase und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT).
  • Vorzugsweise ist das Reporter-Molekül Luciferase.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls eine Wirtszelle ein, die den oben beschriebenen Vektor umfasst.
  • Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung einer Zusammensetzung, die die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: a) Konstruieren eines Vektors, der eine Nukleinsäure-Sequenz dargestellt durch 2 (Sequenz-ID-Nummer: 1) und eine Nukleinsäure-Sequenz, die ein Reporter-Molekül kodiert, umfasst, wobei die Nukleinsäure-Sequenz, die das Reporter-Molekül kodiert, operativ verknüpft ist mit der Nukleinsäure-Sequenz, die die Sequenz kodiert, die durch 2 dargestellt ist; b) Einführen des Vektors in eine Wirtszelle für einen Zeitraum und unter Bedingungen, welche für die Expression von Myostatin geeignet sind; c) Aussetzen der Wirtszelle gegenüber einer Zusammensetzung, welche die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmen kann, und einem Substrat spezifisch für das Reporter-Molekül; und d) Messen des erzeugten Signals durch Reaktion des Reporter-Moleküls und des Substrats im Vergleich zu demjenigen, welches durch eine Kontroll-Wirtszelle erzeugt wird, wobei ein geringeres Signal durch die Wirtszelle von (c) anzeigt, dass die Zusammensetzung die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmen wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine Konzept-Darstellung des menschlichen Myostatin-Gens. Das menschliche Myostatin-Gen enthält drei Exons und zwei Introns, welche 1,1 kb Myostatin cDNA kodieren. Als eine menschliche P1-abgeleitete künstliche Chromosomen (PAC)-Bibliothek unter Verwendung einer 740 bp Sonde, die das menschliche Myostatin-Exon 1 und 2 kodiert, gescreent wurde, wurde ein positiver Klon mit einem 120 kb Insert identifiziert. Nach der Verdauung des Klons mit EcoRI wurden zwei menschliche genomische Subklone isoliert. Einer der Subklone, Klon C11, enthielt 0, 37 kb von Exon 1, 1,53 kb von Intron 1 und eine 3,4 kb Sequenz, welche die menschliche Myostatin-Promoter-Region enthielt.
  • 2 zeigt die Nukleinsäure-Sequenz der menschlichen Myostatin-Promoter-Region. Die möglichen Transkriptions-Faktor-Bindungsregionen sind identifiziert und unterstrichen.
  • 3 zeigt die Detektion von Myostatin mRNA durch RT-PCR von RNA-Proben aus menschlichem Skelett-Muskel, Rhabdomyosarcom-Zellen und glatten Muskel-Zellen der Prostata, unter Verwendung menschlicher Myostatin-spezifischer Primer, und für G3PDH unter Verwendung von G3PDH-spezifischen Primern. Amplifiziertes Myostatin-Gen (1,1 kb) wurde sowohl in menschlichen Skelett-Muskel-Zellen (Bahn 1) als auch in Rhabdomyosarcom-Zellen (Bahn 2) beobachtet, jedoch nicht in glatten Muskel-Zellen der Prostata (Bahn 3). Amplifiziertes G3PDH-Gen (0,9 kb) wurde in Skelett-Muskeln beobachtet (Bahn 4), in Rhabdomyosarcom-Zellen (Bahn 5) und in glatten Muskel-Zellen der Prostata (Bahn 6).
  • 4 zeigt die Luciferase-Reporter-Konstrukte. Die 3,4 kb menschliche Myostatin-Promoter-Region wurde in die XhoI und HindIII Stellen eines Luciferase-Reporter pGL3-Verstärker-Vektors (Promega, Madison, WI) kloniert, welcher ein Luciferase-Reporter-Gen und ein SV40-Verstärker-Element zur Erhöhung des Transkriptions-Niveaus enthielt.
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines Luciferase-Assays für die menschliche Myostatin-Promoter-Region in menschlichen Skelett-Muskel-Zellen und Rhabdomyosarcom-Zellen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Wie oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Isolierung eines Promoters, welcher in die Aktivierung oder Steuerung der Expression des Myostatin-Gens involviert ist. Myostatin reguliert negativ das Wachstum und die Entwicklung von Skelett-Muskel.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, welche verwendet werden können, um Verbindungen zu identifizieren, die die Myostatin-Promoter Aktivitäten hemmen. Die Myostatin-Promoter-Region oder die Nukleinsäure-Sequenz, welche die Expression von Myostatin reguliert, ist an das Luciferase-Reporter-Gen geknüpft. Falls man in der Lage ist, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität der Myostatin-Promoter-Region hemmen, um die Expression von Luciferase zu verhindern, kann man somit dann verhindern, dass die Promoter-Region arbeitet, wodurch die Expression von Myostatin verhindert wird.
  • Die Identifikation von Verbindungen, welche die Myostatin-Promoter-Aktivität und die Luciferase-Produktion hemmen, kann durch Anwendung von Medikamenten-Screening-Assays durchgeführt werden. Zu Beginn wird ein Vektor erzeugt, der eine isolierte DNA-Sequenz umfasst, die die Promoter-Region von Myostatin kodiert, welche an das Luciferase-Reporter-Gen angeknüpft ist. Der Vektor kann beispielsweise ein Plasmid, Bakteriophage oder ein Cosmid sein. Der Vektor wird dann in Wirtszellen eingeführt, unter Zeit und Bedingungen,. welche geeignet sind für die Aktivierung des Myostatin-Promoters. Die Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein. Vorzugsweise werden eukaryotische Zellen verwendet, beispielsweise Zell-Linien mit Muskel-abstammung. Beispiele schließen menschliche Skelett-Muskel-Zellen, menschliche Rhabdomyosarcom-Zellen und Ratten L6- oder L8-Zellen ein. Die Wirtszellen werden dann der Test-Zusammensetzung ausgesetzt, von der angenommen wird, dass sie die Aktivierung des Myostatin-Promoters und der Luciferase-Gen-Expression blockiert. Die Zellen werden ebenfalls einem Substrat für Luciferase ausgesetzt. Man mißt dann die Quantität von (die Menge an) Signalen oder Licht, die aus der Luciferase-Substrat-Reaktion emittiert werden. Falls die Menge der Signale, die durch die Wirtszellen erzeugt werden, die der in Frage stehenden Zusammensetzung ausgesetzt sind, niedriger ist als jene, die durch Kontroll-Zellen produziert werden (das heißt, Zellen, welche nicht der Zusammensetzung ausgesetzt waren), hat die Zusammensetzung die Aktivität des Myostatin-Promoters gehemmt und wird nützlich sein bei der Hemmung der Expression des Myostatin-Gens. Falls die Menge an Signalen, die durch die behandelten Zellen erzeugt wird, gleich ist mit jener, die durch die Kontroll-Zellen erzeugt wird, hat die Zusammensetzung die Aktivität des Myostatin-Promoters nicht gehemmt und wird die Myostatin-Gen-Expression nicht verhindern.
  • Sobald Zusammensetzungen identifiziert wurden, welche die Aktivität des Myostatin-Promoters hemmen, können solche Zusammensetzungen Patienten verabreicht werden, die jegliche Art von Zustand haben, der einen Muskel-Abbau involviert, zum Beispiel erworbenes Immun-Schwäche-Syndrom (AIDS), Krebs, Multiple Sklerose und Alterung. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann eine therapeutisch wirksame Menge des Inhibitors und einen geeigneten physiologisch verträglichen Träger (zum Beispiel Wasser, gepuffertes Wasser oder Salzlösung) umfassen. Die Dosierform (zum Beispiel Suspension, Tablette, Kapsel usw.) und der Verabreichungsweg der pharmazeutischen Zusammensetzung (zum Beispiel, oral, tropisch, intravenös, subkutan etc.) kann leicht bestimmt werden durch einen Arzt und kann abhängig sein von Faktoren wie beispielsweise dem Alter des Patienten, dem Gewicht, dem Immun-Status und dem allgemeinen Gesundheitszustand.
  • Es sollte angemerkt werden, dass die obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen für veterinär-medizinische Anwendungen verwendet werden können (zum Beispiel zur Verhinderung von Muskel-Abbau bei alternden oder erkrankten Tieren) oder für Anwendungen in der Landwirtschaft (zum Beispiel für die Erhöhung der Fleisch-Produktion beim Vieh, da Tiere ohne Myostatin eine wesentlich größere Muskel-Masse zeigen). Zum Beispiel kann die therapeutische Zusammensetzung, welche die Aktivität des Myostatin-Promoters hemmt, an Säugetiere, wie zum Beispiel Pferde, Kühe, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde und Schweine verabreicht werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann durch die Verwendung der folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht werden:
  • BEISPIEL 1
  • Identifikation der Nukleotid-Sequenz, die den menschlichen Myostatin-Promoter kodiert, und potenzielle Transkriptions-Faktoren bindende Regionen
  • 1. Klonierung von menschlicher Myostatin cDNA.
  • Menschliche Myostatin cDNA wurde amplifiziert aus menschlicher Skelett-Muskel-5'-plus cDNA Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) durch PCR, unter Verwendung spezifischer Primer, 5'- ATG CAA AAA CTG CAA CTC TGT GTT T -3' und 5'- TCA TGA GCA CCC ACA GCG GTC -3'. PCR-Produkte wurden in den eukaryotischen TA-Klonierungs-Vektor pCR3.1 kloniert (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die Insertion wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • 2. Klonierung der menschlichen Myostation-Promoter-Region.
  • Das EcoRI- und HindIII-Fragment (740 bp) von menschlicher Myostation cDNA (1), welche Exon 1 und Exon 2 des menschlichen Myostatin-Gens abdeckt, wurde zu GenomSystems Inc. (St. Louis, MO) gesandt als eine Sonde, um die menschliche P1-abgeleitete künstliche Chromosom (PAC)-Bibliothek zu screenen. Ein positiver Klon mit 120 kb-Einsatz wurde identifiziert und durch genomischen Southern-Blot bestätigt unter Verwendung der gleichen Sonde. Das 120 kb-Insert wurde mit EcoRI-Restriktions-Enzym verdaut und in das Plasmid pZero subkloniert (Invitrogen, Carlbad, CA). Zwei positive Subklone mit 5 bis 7 kb-Insert wurden identifiziert (1). Die Ergebnisse der Sequenzierung zeigen, dass der Klon 10 das Exon 2 und einen Teil von Intron 1 und 2 enthält. Klon 11 (5,3 kb) enthält Exon 1, einen Teil von Intron 1 und einen 3,4 kb 5'-nicht translatierten Bereich – den vermeintlichen Myostatin-Promoter-Bereich. Das Programm MatInspector V2.2 (Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig, Deutschland) wurde durchsucht zur Identifikation von möglichen Transkriptions-Faktor-Bindungsregionen (2). MatInspector ist eine Software, die eine schnelle Untersuchung von Sequenz-Daten für Konsens-Motive gestattet. MatInspector verwendet die Kern-Ähnlichkeit, die Matrix-Ähnlichkeit und den Ci-Vektor, der von MatInd entwickelt wurde, zur Berechnung eines Ähnlichkeits-Index. Die vermeintlichen Transkriptions-Faktor-Bindungsstellen wurden gewählt, wenn sowohl die Kern-Ähnlichkeit als auch die Matrix-Ähnlichkeit 0,95 erreichten. Die Details des Programms sind dargestellt in Quandt et al., Nucleic Acids Research 23:4878-4884, 1995.
  • 3. Identifizierung von menschlichen Skelett-Muskel-Zellen oder anderen Zell-Linien der Muskel-Abstammung, welche Myostatin exprimieren.
  • Die gesamte RNA von menschlichen Skelett-Muskel-Zellen und Rhabdomyosarcom-Zellen wurde isoliert unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Life Technologies, Gaithersburg, MD) und als Matrizen verwendet für die reverse Transkription. Das Myostatin-Gen wurde durch PCR amplifiziert, unter Verwendung von menschlichen Myostatin-spezifischen Primern, 5'- ATG CAA AAA CTG CAA CTC TGT GTT T -3' und 5'- TCA TGA GCA CCC ACA GCG GTC -3'. Die gesamte RNA von menschlichen glatten Muskel-Zellen der Prostata wurde ebenfalls untersucht. Primer für endogenes G3PDH-Gen wurden verwendet, um die Integrität der gesamten RNA zu testen. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel analysiert (3). Die 1,1 kb PCR-Produkte, wobei 1,1 kb die korrekte Größe für Myostatin ist, zeigten, dass sowohl menschliche Skelett-Muskel-Zellen als auch Rhabdomyosarcom-Zellen Myostatin exprimieren.
  • BEISPIEL II
  • Luciferase-Assay
  • Der Luciferase-Reporter-Gen-Assay wurde entwickelt zur quantitativen Analyse der Gen-Expression in Säugetieren. Die kodierende Region für Feuerfliegen (Photinus pyralis)-Luciferase wurde verknüpft mit der 3,4 kb 5'-untranslatierten Region (5'-UTR) des menschlichen Myostatin-Gens. Das Konstrukt wurde zwischenzeitlich in menschliche Skelettmuskel-Zellen oder menschliche Rhabdomyosarcom-Zellen transfiziert und nach 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität gemessen. Um die Luciferase-Aktivität in einem Assay zu untersuchen, wurden Luciferin und Mg2+-ATP zu zellulären Extrakten hinzugefügt und die Produktion von Licht wurde überwacht. Die Luciferase-Aktivität ist erhöht wenn die 3,4 kb 5'-UTR-Region Promoter-Aktivität besitzt. Daher kann die Luciferase-Aktivität als ein Indikator (Reporter) der Funktion der Strom-aufwärts gelegenen Promoter-Region verwendet werden.
  • Der 3,4 kb menschliche Myostatin-5' untranslatierte Bereich wurde in XhoI- und HindIII-Stellen des pGL3-Verstärker-Vektors (Promega, Madison, WI) kloniert, angehängt an das Luciferase-Reporter-Gen (4). Das Konstrukt wurde zwischenzeitlich in menschliche Skelett-Muskel-Zellen oder Rhabdomyosarcom-Zellen transfiziert, unter Verwendung von Superfect Reagenzien (Qiagen, Inc., Santa Clarita, CA). Ein weiteres Reporter-Gen, wie das β -Galactosidase-Gen oder Renilla-Luciferase-Gen, wurde als Kontrolle für die Transfektions-Wirksamkeit ko-transfiziert. Die Zellen wurden in Lyse-Puffer nach 48 Stunden lysiert und die zellulären Extrakte wurden einem Assay für Luciferase- und β -Gal-Aktivität unterworfen, unter Verwendung eines Nachweis-Kits [zum Beispiel LucLite (Packard, Meriden, CT), lumineszentem β -Galactosidase-Nachweis-Kit II (Clontech, Palo Alto, CA) oder dualer Luciferase-Reporter-Assay-Systeme (Promega, Madison, WI)]. Der pGL-3-Verstärker-Stamm-Vektor wurde als eine negative Kontrolle verwendet und der pGL-3-Kontroll-Vektor mit SV40-Promoter wurde als eine positive Kontrolle für die Luciferase-Aktivität verwendet. Die Luciferase-Aktivität wurde auf einem Lumineszenz-Licht-Detektor gezählt, wie zum Beispiel einem MicroBeta-Zähler oder einem Luminometer (EG & G Life Sciences-Wallac, Turku, Finnland) und das Ergebnis wurde durch Transfektions-Effizienz normalisiert. Es gab eine etwa 5-fache Erhöhung der Luciferase-Aktivität für das menschliche Myostatin- Promoter-Konstrukt im Vergleich zu seinem Stamm-Vektor in menschlichen Skelett-Muskel-Zellen (5A). In menschlichen Rhabdomyosarcom-Zellen war die Erhöhung der Luciferase-Aktivität etwa 7-fach (5B). Wie erwartet, war die Luciferase-Aktivität nicht erhöht in menschlichen glatten Muskel-Zellen der Prostata (5A), welche Myostatin nicht exprimieren.
  • Hinsichtlich der obigen Ergebnisse kann das Luciferase-Reporter-Konstrukt, welches die 3,4 kb menschliche Myostatin-Promoter-Region enthält, stabil oder zwischenzeitlich in Säugetier-Zell-Linien transfiziert werden, wie zum Beispiel SV-40 transformierte menschliche Skelett-Muskel-Zellen oder Rhabdomyosarcom-Zellen und andere, für ein Screening mit hohem Durchlauf. Die Luciferase-Aktivität kann als ein Indikator zur Auswahl von Verbindungen verwendet werden, welche die Expression des Myostatin-Gens hemmen.

Claims (6)

  1. Eine isolierte Nukleinsäure-Sequenz, dargestellt durch Sequenz-ID-Nummer: 1.
  2. Ein Vektor, der die Nukleinsäure-Sequenz aus Anspruch 1 und eine Nukleinsäure-Sequenz, die ein Reporter-Molekül kodiert, umfasst, wobei die Nukleinsäure-Sequenz das Reporter-Molekül kodiert, das operativ an die Nukleinsäure-Sequenz aus Anspruch 1 angeknüpft ist.
  3. Der Vektor gemäß Anspruch 2, worin das Reporter-Molekül gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, Beta-Galactosidase und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT).
  4. Der Vektor gemäß Anspruch 3, worin das Reporter-Molekül Luciferase ist.
  5. Eine Wirtszelle, die den Vektor von Anspruch 3 umfasst.
  6. Ein Verfahren zur Identifizierung einer Zusammensetzung, welche die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Konstruieren eines Vektors, der eine Nukleinsäure-Sequenz umfasst, die dargestellt ist durch Sequenz-ID-Nummer: 1, und eine Nukeinsäure-Sequenz, die ein Reporter-Molekül kodiert, wobei die Nukleinsäure-Sequenz, die das Reporter-Molekül kodiert, operativ verknüpft ist mit der Nukleinsäure-Sequenz, die durch Sequenz-ID-Nummer: 1 dargestellt ist; b) Einbringen des Vektors in eine Wirtszelle für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Expression von Myostatin geeignet sind; c) Exponieren der Wirtszelle gegenüber einer Zusammensetzung, welche die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmen kann, und einem Substrat, welches für das Reporter-Molekül spezifisch ist; und d) Messen des Signals, welches erzeugt wird durch die Reaktion des Reporter-Moleküls und des Substrats, im Vergleich zu jenem, welches durch eine Kontroll-Wirtszelle erzeugt wird, wobei ein geringeres Signal durch die Wirtszelle von (c) anzeigt, dass die Zusammensetzung die Aktivierung des Myostatin-Promoters hemmen wird.
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