ES2240108T3 - Promotor del gen de la miostatina y metodo que puede inhibir la activacion de dicho promotor. - Google Patents
Promotor del gen de la miostatina y metodo que puede inhibir la activacion de dicho promotor.Info
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Abstract
La presente invención abarca una secuencia de ácido nucleico aislada representada por la Figura 2 (ID SEC Nº: 1). Adicionalmente, la presente invención abarca un vector constando de la secuencia de ácido nucleico descrita arriba y de una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informadora. La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula informadora está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico representada por la Figura 2. La molécula informadora se puede seleccionar del grupo que se compone de, por ejemplo, luciferasa, - galactosidasa y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Preferentemente, la molécula informadora es luciferasa.
Description
Promotor del gen de la miostatina y método que
puede inhibir la activación de dicho promotor.
La invención en cuestión se refiere a un promotor
que regula la expresión del gen de la miostatina, así como a
métodos para identificar una composición que inhiba la activación
de este promotor, En particular, los inhibidores del promotor evitan
la expresión del gen miostatina y, de este modo, previenen el
debilitamiento muscular.
La miostatina, o factor 8 de crecimiento y
diferenciación (GDF-8), pertenece a la superfamilia
del factor-\beta de crecimiento transformador
(TGF-\beta) [McPherron y col., Nature 387:
83-90 (1997)]. El gen de la miostatina humana ha
sido clonado [Nestor y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:
14.938-43 (1998)], y se ha informado que la
inmunorreactividad de la miostatina es detectable en el músculo
esquelético humano, en ambas fibras tipo 1 y tipo 2. Con respecto a
la función, la miostatina puede jugar un papel al regular
negativamente el crecimiento y desarrollo del músculo esquelético
(Nestor y col., arriba).
La primera evidencia de que la miostatina puede
jugar un papel clave al regular negativamente el desarrollo
muscular vino de un estudio con ratones knock-out
para miostatina [McPherron y col., Nature 387:
83-90 (1997)]. En los ratones deficientes en
miostatina, los animales eran más bien normales excepto que eran
significativamente más grandes que los ratones salvajes y tenían un
gran y extenso aumento en masa muscular esquelética. Además,
también se determinó que dos razas de ganado vacuno, caracterizadas
por su masa muscular aumentada, tienen mutaciones en la secuencia
codificadora para miostatina [McPherron y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. 94: 12.457-61 (1997)].
Adicionalmente, se debería observar que las concentraciones en suero
e intramusculares de miostatina inmunorreactiva están incrementadas
en los hombres infectados por VIH con debilitamiento muscular
comparados con hombres sanos, e inversamente correlacionadas con el
índice de masa magra. Estos datos soportan la hipótesis de que la
miostatina es un regulador negativo del crecimiento muscular
esquelético en hombres adultos, y contribuye al debilitamiento
muscular en hombres infectados por VIH (Nestor y col., arriba).
En vista de los descubrimientos anteriores,
existe la necesidad de regular, de alguna manera, la expresión de
miostatina, particularmente en individuos que experimenten un
debilitamiento muscular a consecuencia de una condición o estado de
enfermedad tal como, por ejemplo, envejecimiento, Síndrome de
Deficiencia Autoinmune (SIDA), esclerosis múltiple, y cáncer. La
presente invención proporciona métodos y composiciones que se
pueden utilizar para ayudar a individuos con tales estados de
debilitamiento muscular, y proporciona además una nueva percepción
en la regulación de la expresión del gen de la miostatina.
Todas las patentes U.S. y publicaciones
mencionadas aquí están incorporadas, por este medio, por referencia
en su totalidad.
La presente invención abarca una secuencia de
ácido nucleico aislada representada por la Figura 2 (ID SEC Nº:
1).
Adicionalmente, la presente invención abarca un
vector constando de la secuencia de ácido nucleico descrita arriba y
de una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula
informadora. La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula
informadora está operativamente unida a la secuencia de ácido
nucleico representada por la Figura 2. La molécula informadora se
puede seleccionar del grupo que se compone de, por ejemplo,
luciferasa, \beta-galactosidasa y cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT). Preferentemente, la molécula informadora
es luciferasa.
La presente invención también incluye una célula
huésped constando del vector anteriormente descrito.
Además, la presente invención incluye también un
método para identificar una composición que inhiba la activación del
promotor de la miostatina. Este método comprende las etapas de: a)
construir un vector que conste de una secuencia de ácido nucleico,
representada por la Figura 2 (ID SEC Nº: 1), y de una secuencia de
ácido nucleico que codifica una molécula informadora, la secuencia
de ácido nucleico que codifica la molécula informadora estando
operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que codifica
la secuencia representada por la Figura 2; b) introducir el vector
en una célula huésped, durante un tiempo y bajo condiciones
apropiadas, para la expresión de miostatina; c) exponer la célula
huésped a una composición que puede inhibir la activación del
promotor de la miostatina, y a un sustrato específico para la
molécula informadora; y d) medir la señal generada mediante
reacción de la molécula informadora y el sustrato, comparándola con
la producida mediante una célula huésped de control, una señal más
pequeña por la célula huésped de c) indicando que la composición
inhibirá la activación del promotor de la
miostatina.
miostatina.
La Figura 1 representa una ilustración conceptual
del gen de la miostatina humana. El gen de la miostatina humana
contiene tres exones y dos intrones, los cuales codifican 1'1 kb de
ADNc de miostatina. Cuando una genoteca humana de cromosomas
artificiales derivados de P1 (PAC) fue escrutada utilizando una
sonda de 740 pb que codifica los exones 1 y 2 de la miostatina
humana, se identificó un clon positivo con una inserción de 120 kb.
Después de digerir el clon con EcoRI, se aislaron dos subclones
genómicos humanos. Uno de los subclones, el clon C11, contenía 0'37
kb de exón 1, 1'53 kb de intrón 1, y una secuencia de 3'4 kb
conteniendo la región del promotor de la miostatina humana.
La Figura 2 representa la secuencia de ácido
nucleico de la región del promotor de la miostatina humana. Las
supuestas regiones de unión de los factores de transcripción están
identificadas y subrayadas.
La Figura 3 representa la detección de ARNm de
miostatina mediante RT-PCR de muestras de ARN de
músculo esquelético humano, células de rabdomiosarcoma, y células
de músculo liso de próstata, utilizando cebadores específicos para
miostatina humana, y para G3PDH utilizando cebadores específicos
para G3PDH. Se observó el gen amplificado (1'1 kb) de la miostatina
en ambas células de músculo esquelético (banda 1) y células de
rabdomiosarcoma humanas (banda 2), pero no en las células de músculo
liso de próstata (banda 3). Se observó el gen amplificado de la
G3PDH (0'9 kb) en el músculo esquelético (banda 4), células de
rabdomiosarcoma (banda 5), y células de músculo liso de próstata
(banda 6).
La Figura 4 representa las construcciones
informadoras de luciferasa. La región del promotor de la miostatina
humana de 3'4 kb fue clonada en los sitios XhoI y HindIII de un
vector pGL3-Enhancer informador de luciferasa
(Promega, Madison, WI), el cual contenía un gen informador de la
luciferasa y un elemento potenciador de SV40 para aumentar el nivel
de transcripción.
La Figura 5 representa los resultados de un
ensayo de luciferasa para la región del promotor de la miostatina
humana en células de músculo esquelético y células de
rabdomiosarcoma humanas.
Como se advirtió antes, la invención en cuestión
tiene que ver con la identificación y aislamiento de un promotor
que está implicado en activar o regular la expresión del gen de la
miostatina. La miostatina regula negativamente el crecimiento y
desarrollo del músculo esquelético.
En particular, la invención en cuestión se
refiere a métodos que se pueden utilizar para identificar
compuestos que inhiban las actividades del promotor de la
miostatina. La región del promotor de la miostatina, o secuencia de
ácido nucleico que regula la expresión de miostatina, está unida al
gen informador de la luciferasa. De este modo, si uno es capaz de
identificar compuestos que inhiban la actividad de la región del
promotor de la miostatina, para prevenir la expresión de
luciferasa, entonces uno puede evitar que funcione la región del
promotor, evitando de ese modo la expresión de miostatina.
La identificación de compuestos que inhiban la
actividad del promotor de miostatina y la producción de luciferasa
puede ser llevada a cabo mediante el empleo de ensayos de
escrutinio de fármacos. Inicialmente, se crea un vector que conste
de una secuencia de ADN aislada que codifica la región del promotor
de miostatina, la cual está unida al gen informador de la
luciferasa. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un
bacteriófago o un cósmido. Después se introduce el vector en células
huésped, bajo tiempo y condiciones apropiadas para la activación del
promotor de la miostatina. Las células huésped pueden ser células
procariotas o eucariotas. Preferentemente, se utilizan células
eucariotas, por ejemplo, líneas celulares con linaje muscular. Los
ejemplos incluyen células de músculo esquelético humanas, células
de rabdomiosarcoma humanas, y células L6 o L8 de rata. Después, las
células huésped son expuestas a la composición de ensayo pensada
para bloquear la activación del promotor de miostatina y la
expresión del gen de la luciferasa. Las células son también
expuestas a un sustrato para luciferasa. Entonces, se mide la
cantidad de señales o luz emitida a partir de la reacción
luciferasa-sustrato. Si la cantidad de señales
producidas por las células huésped, expuestas a la composición en
cuestión, es inferior a la producida por las células de control
(esto es, células que no han sido expuestas a la composición),
entonces la composición ha inhibido la actividad del promotor de
miostatina, y será útil para inhibir la expresión del gen de la
miostatina. Si la cantidad de señales producidas por las células
tratadas es igual a la producida por las células de control, la
composición no ha inhibido la actividad del promotor de miostatina,
y no evitará la expresión del gen de la miostatina.
Una vez que hayan sido identificadas las
composiciones que inhiben la actividad del promotor de miostatina,
tales composiciones pueden ser administradas a pacientes que tengan
cualquier tipo de estado que implique debilitamiento muscular, por
ejemplo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), cáncer,
esclerosis múltiple, y envejecimiento. La composición farmacéutica
puede constar de una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor,
y de un soporte apropiado fisiológicamente admisible (por ejemplo,
agua, agua o salino tamponados). La dosificación, forma (por
ejemplo, suspensión, comprimido, cápsula, etc.), y ruta de
administración de la composición farmacéutica (por ejemplo, oral,
tópica, intravenosa, subcutánea, etc.) pueden ser fácilmente
determinadas por un médico general, y pueden depender de factores
tales como, por ejemplo, la edad, peso, situación inmune, y salud
general del
paciente.
paciente.
Se debería observar que las anteriores
composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas para aplicaciones
veterinarias (por ejemplo, para prevenir el debilitamiento muscular
en animales que envejecen o enfermos) o para aplicaciones agrícolas
(por ejemplo, para aumentar la producción de carne en ganadería,
puesto que los animales sin miostatina exhiben una masa muscular
mucho más grande. Por ejemplo, la composición terapéutica que
inhiba la actividad del promotor de miostatina puede ser
administrada a mamíferos tales como, por ejemplo, caballos, vacas,
ovejas, cabras, gatos, perros y cerdos.
La presente invención puede ser ilustrada
mediante el empleo de los siguientes ejemplos no limitantes:
1. Clonación de ADNc de miostatina humana.
Se amplificó ADNc de miostatina humana de la genoteca de ADNc
5'-Plus de músculo esquelético humano (Clontech,
Palo Alto, CA) mediante PCR utilizando cebadores específicos, 5'-
ATG CAA AAA CTG CAA CTC TGT GTT T -3' y 5'- TCA TGA GCA CCC ACA GCG
GTC -3'. Los productos PCR fueron clonados en el vector eucariota
pCR3.1 por TA-cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA).
La inserción fue confirmada mediante secuenciación del ADN.
2. Clonación de la región del promotor de
miostatina humana. El fragmento EcoRI y HindIII (740 pb) de
ADNc de miostatina humana (Figura 1), que incluye los exones 1 y 2
del gen de la miostatina humana, fue enviado a GenomeSystems Inc.
(St. Louis, MO) como sonda para escrutar la genoteca humana de
cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC). Se identificó y
confirmó un clon positivo, con una inserción de 120 kb, mediante
southern blot genómico utilizando la misma sonda. La inserción de
120 kb fue digerida con enzima de restricción EcoRI, y subclonado
en el plásmido pZero (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se identificaron
dos subclones positivos con una inserción de 5-7 kb
(Figura 1). Los resultados de la secuenciación indican que el clon
10 contiene el exón 2 y parte de los intrones 1 y 2. El clon 11
(5'3 kb) contiene el exón 1, parte del intrón 1, y una región 5' no
traducida de 3'4 kb, la supuesta región del promotor de miostatina.
Se examinó el programa MatInspector V2.2 (Gesellschaft fur
Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig, Alemania) para
identificar potenciales regiones de unión para factores de
transcripción (Figura 2). El MatInspector es un software que permite
la rápida exploración de los datos de la secuencia para motivos de
consenso. El MatInspector utiliza la similitud de núcleo, la
similitud de matriz y el vector Ci, creado por MatInd, para calcular
el índice de similitud. Los potenciales sitios de unión para
factores de transcripción fueron seleccionados cuando la similitud
de núcleo y la similitud de matriz alcanzaron el 0'95. Los detalles
del programa están ilustrados en Quandt y col., Nucleic Acids
Research 23: 4.878-4.884, 1995.
3. Identificación de células de músculo
esquelético humanas u otras líneas celulares de linaje muscular que
expresen miostatina. Se aisló ARN total de células de músculo
esquelético y células de rabdomiosarcoma humanas utilizando reactivo
Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD), y se utilizó como
plantillas para transcripción inversa. El gen de la miostatina fue
amplificado mediante PCR, utilizando cebadores específicos para
miostatina humana, 5'- ATG CAA AAA CTG CAA CTC TGT GTT T - 3' y 5'-
TCA TGA GCA CCC ACA GCG GTC -3'. También se ensayó ARN total de
células de músculo esquelético de próstata humanas. Para ensayar la
integridad del ARN total, se utilizaron cebadores para el gen
endógeno de G3PDH. Los productos PCR fueron analizados en un gel de
azarosa al 1% (Figura 3). Los productos PCR de 1'1 kb, siendo 1'1
kb el tamaño correcto para la miostatina, indicaron que ambas
células de músculo esquelético y células de rabdomiosarcoma humanas
expresan miostatina.
Se ideó el ensayo del gen informador de la
luciferasa para el análisis cuantitativo de la expresión del gen
mamífero. La región codificadora para luciferasa de luciérnaga
(Photinus pyralis) fue unida a la región 5' no traducida de
3'4 kb (5'-UTR) del gen de la miostatina humana. La
construcción fue transfectada transitoriamente en células de
músculo esquelético humanas o células de rabdomiosarcoma humanas y,
después de 48 horas, se midió la actividad de la luciferasa. Para
ensayar la actividad de la luciferasa, se añadieron luciferina y
Mg^{2+}-ATP a los extractos celulares, y se
supervisó la producción. La actividad de la luciferasa aumenta si
la región 5'-UTR de 3'4 kb tiene actividad
promotora. Por lo tanto, la actividad de la luciferasa puede ser
utilizada como un indicador (informador) de la función de la región
del promotor corriente arriba.
La región 5' no traducida de 3'4 kb de la
miostatina humana fue clonada en los sitios XhoI y HindIII del
vector pGL3-Enhancer (Promega, Madison, WI), unido
al gen informador de la luciferasa (Figura 4). La construcción fue
transfectada transitoriamente en células de músculo esquelético
humanas o en células de rabdomiosarcoma humanas, utilizando
reactivos Superfect (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA). Otro gen
informador, tal como el gen de la
\beta-galactosidasa o el gen de la luciferasa de
renilla, fue co-transfectado como control para la
eficacia de transfección. Las células fueron lisadas en tampón de
lisis después de 48 horas, y se ensayaron los extractos celulares
para actividad de la luciferasa y \beta-gal
utilizando un equipo de detección [por ejemplo, LucLite (Packard,
Meriden, CT), Equipo de detección II luminiscente para
\beta-galactosidasa (Clontech, Palo Alto, CA), o
los sistemas duales de ensayo del reportero luciferasa (Promega,
Madison, WI)]. Se utilizó el vector parental
pGL3-Enhancer como control negativo, y se utilizó el
vector pGL3-Control con promotor SV40 como control
positivo para la actividad de la luciferasa. La actividad de
luciferasa fue contada en un detector de luz luminiscente tal como
un contador MicroBeta o un luminómetro (EG & G Life
Sciences-Wallac, Turku, Finlandia), y el resultado
fue normalizado mediante la eficacia de transfección. Había un
incremento de actividad de la luciferasa de unas 5 veces para la
construcción del promotor de miostatina humana, en comparación con
su vector parental, en células de músculo esquelético humanas
(Figura 5A). En células de rabdomiosarcoma humanas, el incremento de
actividad de la luciferasa fue de aproximadamente 7 veces (Figura
5B). Como se esperaba, la actividad de la luciferasa no aumentó en
células de músculo liso de próstata (Figura 5A), las cuales no
expresan miostatina.
En vista de los resultados anteriores, la
construcción informadora de luciferasa, conteniendo la región del
promotor de la miostatina humana de 3'4 kb, puede ser estable o
transitoriamente transfectada en líneas celulares mamíferas tales
como células de músculo esquelético o células de rabdomiosarcoma
humanas transformadas con SV-40, u otras, para
escrutinio de alto rendimiento. La actividad de la luciferasa se
puede utilizar como indicador para seleccionar compuestos que
inhiban la expresión del gen de la miostatina.
Claims (6)
1. Una secuencia de ácido nucleico aislada,
representada por la ID SEC Nº: 1.
2. Un vector que consta de dicha secuencia de
ácido nucleico de la Reivindicación 1 y de una secuencia de ácido
nucleico que codifica una molécula informadora, dicha secuencia de
ácido nucleico que codifica dicha molécula informadora estando
operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico de la
Reivindicación 1.
3. El vector de la Reivindicación 2, en donde
dicha molécula informadora es seleccionada del grupo que se compone
de luciferasa, beta-galactosidasa y cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT).
4. El vector de la Reivindicación 3, en donde
dicha molécula informadora es luciferasa.
5. Una célula huésped constando de dicho vector
de la Reivindicación 3.
6. Un método para identificar una composición que
inhiba la activación del promotor de la miostatina, comprendiendo
las etapas de:
a) construir un vector que conste de una
secuencia de ácido nucleico, representada por la ID SEC Nº: 1, y de
una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula
informadora, dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha
molécula informadora estando operativamente unida a dicha secuencia
de ácido nucleico representada por la ID SEC Nº: 1;
b) introducir dicho vector en una célula huésped,
durante un tiempo y bajo condiciones apropiadas, para la expresión
de miostatina;
c) exponer dicha célula huésped a una composición
que pueda inhibir la activación del promotor de la miostatina, y a
un sustrato específico para dicha molécula informadora; y
d) medir la señal generada mediante reacción de
dicha molécula informadora y dicho sustrato, en comparación a la
producida mediante una célula huésped de control, una señal más
pequeña por dicha célula huésped de c) indicando que dicha
composición inhibirá la activación del promotor de la
miostatina.
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