JP2003528574A - ミオスタチン遺伝子プロモータおよびその活性化阻害 - Google Patents
ミオスタチン遺伝子プロモータおよびその活性化阻害Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ミオスタチン遺伝子の発現を誘導するプロモータ、ならびに前記プロモータの阻害に有用な組成物を同定するための方法に関し、そしてミオスタチンの合成、分泌および機能を妨げることに有用な方法および組成物にも関する。特に、ミオスタチンの合成、分泌および機能を妨げる阻害剤は、ヒトおよび哺乳動物における筋肉量の喪失を妨げるために使用することができる。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ミオスタチン遺伝子の発現を調節するプロモータ、ならびにこのプ
ロモータを阻害する方法、およびそのような阻害のために使用される組成物に関
する。特に、プロモータの阻害剤は、ミオスタチン遺伝子の発現を妨げ、従って
筋肉消耗を妨げる。
ロモータを阻害する方法、およびそのような阻害のために使用される組成物に関
する。特に、プロモータの阻害剤は、ミオスタチン遺伝子の発現を妨げ、従って
筋肉消耗を妨げる。
【０００２】
（背景情報）
ミオスタチンまたは増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）は、トランスフォーミン
グ増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属している（ＭｃＰｈｅｒ
ｒｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０（１９９７））。ヒトのミオスタ
チン遺伝子がクローニングされており（Ｎｅｓｔｏｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４９３８〜４３（１９９８））、そしてミオスタチ
ンの免疫反応性がヒト骨格筋において１型線維および２型線維の両方で検出され
得ることが報告されている。機能に関して、ミオスタチンは、骨格筋の増殖およ
び発達を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられる（Ｎｅｓｔ
ｏｒ他、上記）。
グ増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属している（ＭｃＰｈｅｒ
ｒｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０（１９９７））。ヒトのミオスタ
チン遺伝子がクローニングされており（Ｎｅｓｔｏｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４９３８〜４３（１９９８））、そしてミオスタチ
ンの免疫反応性がヒト骨格筋において１型線維および２型線維の両方で検出され
得ることが報告されている。機能に関して、ミオスタチンは、骨格筋の増殖およ
び発達を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられる（Ｎｅｓｔ
ｏｒ他、上記）。
【０００３】
筋肉発達を負に調節することにおいてミオスタチンが重要な役割を果たし得る
という最初の証拠が、ミオスタチンのノックアウトマウスを用いた研究からもた
らされた（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０（１９９
７））。ミオスタチンヌルマウスにおいて、この動物は、野生型マウスよりも著
しく大きく、そして骨格筋の量が大きく広範囲に増大していることを除いてかな
り正常であった。さらに、増大した筋肉量を特徴とする２系統のウシはミオスタ
チンのコード配列に変異を有することもまた明らかにされた（ＭｃＰｈｅｒｒｏ
ｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４、１２４５７〜６１（１９
９７））。さらに、免疫反応性ミオスタチンの血清濃度および筋肉内濃度は、健
康者と比較して、筋肉消耗を伴うＨＩＶ感染者では増大しており、そして脂肪を
含まないマスインデックスと負の相関を有することに留意しなければならない。
これらのデータは、ミオスタチンが成人における骨格筋増殖の負の調節因子であ
り、ＨＩＶ感染者における筋肉消耗に寄与しているという仮説を支持している（
Ｎｅｓｔｏｒ他、上記）。
という最初の証拠が、ミオスタチンのノックアウトマウスを用いた研究からもた
らされた（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０（１９９
７））。ミオスタチンヌルマウスにおいて、この動物は、野生型マウスよりも著
しく大きく、そして骨格筋の量が大きく広範囲に増大していることを除いてかな
り正常であった。さらに、増大した筋肉量を特徴とする２系統のウシはミオスタ
チンのコード配列に変異を有することもまた明らかにされた（ＭｃＰｈｅｒｒｏ
ｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４、１２４５７〜６１（１９
９７））。さらに、免疫反応性ミオスタチンの血清濃度および筋肉内濃度は、健
康者と比較して、筋肉消耗を伴うＨＩＶ感染者では増大しており、そして脂肪を
含まないマスインデックスと負の相関を有することに留意しなければならない。
これらのデータは、ミオスタチンが成人における骨格筋増殖の負の調節因子であ
り、ＨＩＶ感染者における筋肉消耗に寄与しているという仮説を支持している（
Ｎｅｓｔｏｒ他、上記）。
【０００４】
上記の知見を考慮すれば、特に、例えば、老化、自己免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）、多発性硬化症およびガンなどの状態または疾患状態の結果としての筋肉消
耗を受けている個体においてミオスタチンの発現を調節する方法が求められてい
る。本発明は、そのような筋肉消耗状態の個体を助けるために用いることができ
る方法および組成物を提供し、そしてミオスタチンの遺伝子発現の調節に対する
さらなる洞察を提供する。
Ｓ）、多発性硬化症およびガンなどの状態または疾患状態の結果としての筋肉消
耗を受けている個体においてミオスタチンの発現を調節する方法が求められてい
る。本発明は、そのような筋肉消耗状態の個体を助けるために用いることができ
る方法および組成物を提供し、そしてミオスタチンの遺伝子発現の調節に対する
さらなる洞察を提供する。
【０００５】
本明細書中において参照されているすべての米国特許および刊行物は、これら
により参考としてその全体が組み込まれる。
により参考としてその全体が組み込まれる。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、図２（配列番号１）によって表される単離された核酸配列を包含す
る。
る。
【０００７】
さらに、本発明は、上記の核酸配列と、レポーター分子をコードする核酸配列
とを含むベクターを包含する。レポーター分子をコードする核酸配列は、図２に
よって表される核酸配列に機能的に連結されている。レポーター分子は、例えば
、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群から選択され得る。好ましくは、レポ
ーター分子はルシフェラーゼである。本発明はまた、上記のベクターを含む宿主
細胞を包含する。
とを含むベクターを包含する。レポーター分子をコードする核酸配列は、図２に
よって表される核酸配列に機能的に連結されている。レポーター分子は、例えば
、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群から選択され得る。好ましくは、レポ
ーター分子はルシフェラーゼである。本発明はまた、上記のベクターを含む宿主
細胞を包含する。
【０００８】
さらに、本発明は、ミオスタチンによる免疫感作に応答して産生される精製さ
れた抗体、ならびにこの精製された抗体を含む組成物を包含する。
れた抗体、ならびにこの精製された抗体を含む組成物を包含する。
【０００９】
さらに、本発明はまた、ミオスタチンプロモータの活性化を阻害する組成物を
同定する方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）図２（配列番号１
）によって表される核酸配列と、レポーター分子をコードする核酸配列とを含む
ベクターを構築する工程であって、レポーター分子をコードする核酸配列は、図
２によって表される配列をコードする核酸配列に機能的に連結されている工程；
ｂ）ミオスタチンの発現に好適な時間および条件のもとでベクターを宿主細胞に
導入する工程；ｃ）ミオスタチンプロモータの活性化を阻害し得る組成物と、レ
ポーター分子に特異的な基質とに宿主細胞をさらす工程；およびｄ）レポーター
分子と基質との反応によって生じるシグナルを、コントロールの宿主細胞によっ
て産生されるシグナルと比較して測定する工程であって、（ｃ）の宿主細胞によ
るシグナルの方が小さいことにより、組成物がミオスタチンプロモータの活性化
を阻害することが示される工程。
同定する方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）図２（配列番号１
）によって表される核酸配列と、レポーター分子をコードする核酸配列とを含む
ベクターを構築する工程であって、レポーター分子をコードする核酸配列は、図
２によって表される配列をコードする核酸配列に機能的に連結されている工程；
ｂ）ミオスタチンの発現に好適な時間および条件のもとでベクターを宿主細胞に
導入する工程；ｃ）ミオスタチンプロモータの活性化を阻害し得る組成物と、レ
ポーター分子に特異的な基質とに宿主細胞をさらす工程；およびｄ）レポーター
分子と基質との反応によって生じるシグナルを、コントロールの宿主細胞によっ
て産生されるシグナルと比較して測定する工程であって、（ｃ）の宿主細胞によ
るシグナルの方が小さいことにより、組成物がミオスタチンプロモータの活性化
を阻害することが示される工程。
【００１０】
また、本発明は、ミオスタチンの発現を阻害する組成物を同定する方法を包含
する。この方法は下記の工程を含む：ａ）ミオスタチンに対して産生されたモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体からなる群から選択される抗体を固相
に加える工程；ｂ）既知濃度のミオスタチン、または試験組成物にさらされたミ
オスタチン含有細胞サンプルを、抗体と既知濃度のミオスタチンまたは細胞サン
プル内のミオスタチンとの間での第１の複合体を形成させるために固相に加える
工程；ｃ）ミオスタチンに対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体からなる群から選択される第２の抗体を、第１の複合体と第２の抗体
との間での第２の複合体が形成されるのに十分な時間および条件のもとで第１の
複合体に加える工程；ｄ）第２の複合体を、前記第２の複合体の前記抗体に対す
る抗体に結合させたシグナル生成化合物を含む指示試薬と、第３の複合体が形成
されるのに十分な時間および条件のもとで接触させる工程：ｅ）測定可能なシグ
ナルの存在を検出する工程であって、シグナルが存在しないことにより、組成物
がミオスタチンの発現を阻害することが示され、そしてシグナルが存在すること
により、組成物がミオスタチンの発現を阻害しないことが示される工程。
する。この方法は下記の工程を含む：ａ）ミオスタチンに対して産生されたモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体からなる群から選択される抗体を固相
に加える工程；ｂ）既知濃度のミオスタチン、または試験組成物にさらされたミ
オスタチン含有細胞サンプルを、抗体と既知濃度のミオスタチンまたは細胞サン
プル内のミオスタチンとの間での第１の複合体を形成させるために固相に加える
工程；ｃ）ミオスタチンに対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体からなる群から選択される第２の抗体を、第１の複合体と第２の抗体
との間での第２の複合体が形成されるのに十分な時間および条件のもとで第１の
複合体に加える工程；ｄ）第２の複合体を、前記第２の複合体の前記抗体に対す
る抗体に結合させたシグナル生成化合物を含む指示試薬と、第３の複合体が形成
されるのに十分な時間および条件のもとで接触させる工程：ｅ）測定可能なシグ
ナルの存在を検出する工程であって、シグナルが存在しないことにより、組成物
がミオスタチンの発現を阻害することが示され、そしてシグナルが存在すること
により、組成物がミオスタチンの発現を阻害しないことが示される工程。
【００１１】
さらに、本発明はまた、ミオスタチンの発現を阻害する組成物を同定する方法
を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）一定量のミオスタチンを固相に
コーティングする工程；ｂ）既知濃度のミオスタチン、または組成物にさらされ
たミオスタチン含有細胞サンプルを加える工程；ｃ）ミオスタチンに対して産生
されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からなる群から選択される
抗体を、第１の複合体を形成させるのに十分な時間および条件のもと、（ａ）お
よび（ｂ）におけるミオスタチンに接触させる工程であって、（ａ）のミオスタ
チンは、抗体に対する競合において、（ｂ）のミオスタチンと競合する工程；ｄ
）前記複合体を、第１の複合体の抗体に対する抗体に結合させたシグナル生成化
合物を含む指示試薬と、第２の複合体を形成させるのに十分な時間および条件の
もとで接触させる工程：および（ｅ）測定可能なシグナルを検出する工程であっ
て、コントロールと比較してシグナルがより大きいことにより、組成物がミオス
タチンの発現を阻害することが示される工程。
を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）一定量のミオスタチンを固相に
コーティングする工程；ｂ）既知濃度のミオスタチン、または組成物にさらされ
たミオスタチン含有細胞サンプルを加える工程；ｃ）ミオスタチンに対して産生
されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からなる群から選択される
抗体を、第１の複合体を形成させるのに十分な時間および条件のもと、（ａ）お
よび（ｂ）におけるミオスタチンに接触させる工程であって、（ａ）のミオスタ
チンは、抗体に対する競合において、（ｂ）のミオスタチンと競合する工程；ｄ
）前記複合体を、第１の複合体の抗体に対する抗体に結合させたシグナル生成化
合物を含む指示試薬と、第２の複合体を形成させるのに十分な時間および条件の
もとで接触させる工程：および（ｅ）測定可能なシグナルを検出する工程であっ
て、コントロールと比較してシグナルがより大きいことにより、組成物がミオス
タチンの発現を阻害することが示される工程。
【００１２】
さらに、本発明は、ミオスタチンがミオスタチン受容体に結合することを阻害
する組成物を組成物の混合物の中から同定する方法を包含する。この方法は下記
の工程を含む：ａ）精製したミオスタチンを組成物の混合物と混合する工程；ｂ
）工程（ａ）の得られた混合物を、ミオスタチンと複合体化した組成物がフィル
ターを通り抜けないようなサイズの細孔を有するフィルターに通す工程；および
ｃ）複合体化した組成物の構造を明らかにし、それによってミオスタチンがミオ
スタチン受容体に結合することを阻害する組成物を同定する工程。
する組成物を組成物の混合物の中から同定する方法を包含する。この方法は下記
の工程を含む：ａ）精製したミオスタチンを組成物の混合物と混合する工程；ｂ
）工程（ａ）の得られた混合物を、ミオスタチンと複合体化した組成物がフィル
ターを通り抜けないようなサイズの細孔を有するフィルターに通す工程；および
ｃ）複合体化した組成物の構造を明らかにし、それによってミオスタチンがミオ
スタチン受容体に結合することを阻害する組成物を同定する工程。
【００１３】
また、本発明は、ミオスタチンがミオスタチン受容体に結合することを阻害す
る組成物を同定する方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）組換え
ミオスタチンを放射能標識する工程；ｂ）放射能標識された組換えミオスタチン
を、ミオスタチン受容体を含む細胞または膜と一緒にインキュベーションする工
程；ｃ）工程（ｂ）でインキュベーションした混合物を目的とする組成物と接触
させる工程；ｄ）細胞または膜に結合した放射能標識ミオスタチンを非結合ミオ
スタチンから分離する工程；およびｅ）コントロールと比較して、結合ミオスタ
チンにおける放射能の量を測定する工程であって、コントロールと比較して結合
ミオスタチンにおける放射能のレベルがより低いことにより、ミオスタチンが受
容体に結合することを阻害する組成物が示される工程。
る組成物を同定する方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：ａ）組換え
ミオスタチンを放射能標識する工程；ｂ）放射能標識された組換えミオスタチン
を、ミオスタチン受容体を含む細胞または膜と一緒にインキュベーションする工
程；ｃ）工程（ｂ）でインキュベーションした混合物を目的とする組成物と接触
させる工程；ｄ）細胞または膜に結合した放射能標識ミオスタチンを非結合ミオ
スタチンから分離する工程；およびｅ）コントロールと比較して、結合ミオスタ
チンにおける放射能の量を測定する工程であって、コントロールと比較して結合
ミオスタチンにおける放射能のレベルがより低いことにより、ミオスタチンが受
容体に結合することを阻害する組成物が示される工程。
【００１４】
さらに、本発明は、哺乳動物における筋肉消耗を防止する方法を包含する。こ
の方法は、筋肉消耗が防止されるように、ミオスタチンプロモータの活性化を防
げること、ミオスタチンの合成を妨げること、およびミオスタチンがその標的受
容体に結合することを妨げることからなる群から選択される作用を引き起こす有
効成分を治療効果的な量で含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。
の方法は、筋肉消耗が防止されるように、ミオスタチンプロモータの活性化を防
げること、ミオスタチンの合成を妨げること、およびミオスタチンがその標的受
容体に結合することを妨げることからなる群から選択される作用を引き起こす有
効成分を治療効果的な量で含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ヒトミオスタチン遺伝子の概念図を表す。ヒトミオスタチン遺伝子は
３つのエキソンと２つのイントロンとを含み、これらが、１．１ｋｂのミオスタ
チンｃＤＮＡにコードされる。ヒトＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリー
を、ヒトミオスタチンのエキソン１およびエキソン２をコードする７４０ｂｐの
プローブを使用してスクリーニングしたとき、１２０ｋｂのインサートを有する
１個の陽性クローンが同定された。このクローンをＥｃｏＲＩで消化した後、２
つのヒトゲノムサブクローンが単離された。このサブクローンの一方（クローン
Ｃ１１）は、０．３７ｋｂのエキソン１、１．５３ｋｂのイントロン１、および
ヒトミオスタチンプロモータ領域を含有する３．４ｋｂの配列を含有していた。
３つのエキソンと２つのイントロンとを含み、これらが、１．１ｋｂのミオスタ
チンｃＤＮＡにコードされる。ヒトＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリー
を、ヒトミオスタチンのエキソン１およびエキソン２をコードする７４０ｂｐの
プローブを使用してスクリーニングしたとき、１２０ｋｂのインサートを有する
１個の陽性クローンが同定された。このクローンをＥｃｏＲＩで消化した後、２
つのヒトゲノムサブクローンが単離された。このサブクローンの一方（クローン
Ｃ１１）は、０．３７ｋｂのエキソン１、１．５３ｋｂのイントロン１、および
ヒトミオスタチンプロモータ領域を含有する３．４ｋｂの配列を含有していた。
【００１６】
図２は、ヒトミオスタチンプロモータ領域の核酸配列を表す。転写因子の結合
領域と推定される領域がいくつか同定され、下線が引かれている。
領域と推定される領域がいくつか同定され、下線が引かれている。
【００１７】
図３は、ヒトの骨格筋、横紋筋肉腫細胞および前立腺平滑筋細胞から得られた
ＲＮＡサンプルの、ヒトミオスタチンに特異的なプライマーを使用したＲＴ−Ｐ
ＣＲによるミオスタチンｍＲＮＡの検出を表す。Ｇ３ＰＤＨにはＧ３ＰＤＨに特
異的なプライマーが使用される。増幅されたミオスタチン遺伝子（１．１ｋｂ）
は、ヒトの骨格筋細胞（レーン１）および横紋筋肉腫細胞（レーン２）の両方で
認められたが、前立腺平滑筋細胞（レーン３）では認められなかった。増幅され
たＧ３ＰＤＨ遺伝子（０．９ｋｂ）は、骨格筋細胞（レーン４）、横紋筋肉腫細
胞（レーン５）および前立腺平滑筋細胞（レーン６）で認められた。
ＲＮＡサンプルの、ヒトミオスタチンに特異的なプライマーを使用したＲＴ−Ｐ
ＣＲによるミオスタチンｍＲＮＡの検出を表す。Ｇ３ＰＤＨにはＧ３ＰＤＨに特
異的なプライマーが使用される。増幅されたミオスタチン遺伝子（１．１ｋｂ）
は、ヒトの骨格筋細胞（レーン１）および横紋筋肉腫細胞（レーン２）の両方で
認められたが、前立腺平滑筋細胞（レーン３）では認められなかった。増幅され
たＧ３ＰＤＨ遺伝子（０．９ｋｂ）は、骨格筋細胞（レーン４）、横紋筋肉腫細
胞（レーン５）および前立腺平滑筋細胞（レーン６）で認められた。
【００１８】
図４は、ルシフェラーゼレポーター構築物を表す。３．４ｋｂのヒトミオスタ
チンプロモータ領域を、ルシフェラーゼをレポーターとするｐＧＬ３−エンハン
サーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このベクターは、ルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子と、転写レベルを増大させるためのＳＶ４０エンハンサーエレメン
トとを含有した。
チンプロモータ領域を、ルシフェラーゼをレポーターとするｐＧＬ３−エンハン
サーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このベクターは、ルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子と、転写レベルを増大させるためのＳＶ４０エンハンサーエレメン
トとを含有した。
【００１９】
図５は、ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫細胞におけるヒトミオスタチン
プロモータ領域に対するルシフェラーゼアッセイから得られた結果を表す。
プロモータ領域に対するルシフェラーゼアッセイから得られた結果を表す。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
上記に記されているように、本発明は、ミオスタチン遺伝子の発現の活性化、
または調節に関与するプロモータの同定および単離に関する。ミオスタチンは、
骨格筋の増殖および発達を負に調節する。
または調節に関与するプロモータの同定および単離に関する。ミオスタチンは、
骨格筋の増殖および発達を負に調節する。
【００２１】
特に、本発明は、ミオスタチンのプロモータ活性を阻害する化合物を同定する
ために使用され得る方法に関する。ミオスタチンの発現を調節するミオスタチン
プロモータ領域または核酸配列は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結され
る。従って、ルシフェラーゼの発現を妨げるミオスタチンプロモータ領域の活性
を阻害する化合物が同定できる場合、プロモータ領域の機能発現が妨げられ、そ
れによってミオスタチンの発現を妨げることができる。
ために使用され得る方法に関する。ミオスタチンの発現を調節するミオスタチン
プロモータ領域または核酸配列は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結され
る。従って、ルシフェラーゼの発現を妨げるミオスタチンプロモータ領域の活性
を阻害する化合物が同定できる場合、プロモータ領域の機能発現が妨げられ、そ
れによってミオスタチンの発現を妨げることができる。
【００２２】
ミオスタチンプロモータ活性およびルシフェラーゼ産生を阻害する化合物の同
定は、薬物スクリーニングアッセイを使用することにより行うことができる。最
初に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結されたミオスタチンのプロモータ
領域をコードする単離されたＤＮＡ配列を含むベクターが作製される。ベクター
としては、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドがあり得る
。その後、ベクターは、ミオスタチンプロモータの活性化に好適な時間および条
件のもとで宿主細胞に導入される。宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細
胞であり得る。好ましくは、真核生物細胞（例えば、筋肉系の細胞株）が利用さ
れる。例には、ヒト骨格筋細胞、ヒト横紋筋肉腫細胞、ならびにラットのＬ６細
胞およびＬ８細胞が含まれる。その後、宿主細胞は、ミオスタチンプロモータの
活性化およびルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻止すると考えられる試験組成物に
さらされる。細胞はルシフェラーゼの基質にもさらされる。その後、ルシフェラ
ーゼ−基質の反応から発するシグナルまたは光の量を測定する。問題とする組成
物にさらされた宿主細胞によって産生されるシグナルの量が、コントロールの細
胞（すなわち、組成物にさらされていない細胞）によって産生されるシグナルの
量よりも少ない場合、その組成物は、ミオスタチンプロモータの活性を阻害して
おり、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害することにおいて有用である。処理され
た細胞によって産生されるシグナルの量がコントロールの細胞によって産生され
るシグナルの量に等しい場合、その組成物は、ミオスタチンプロモータの活性を
阻害しておらず、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害しない。
定は、薬物スクリーニングアッセイを使用することにより行うことができる。最
初に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結されたミオスタチンのプロモータ
領域をコードする単離されたＤＮＡ配列を含むベクターが作製される。ベクター
としては、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドがあり得る
。その後、ベクターは、ミオスタチンプロモータの活性化に好適な時間および条
件のもとで宿主細胞に導入される。宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細
胞であり得る。好ましくは、真核生物細胞（例えば、筋肉系の細胞株）が利用さ
れる。例には、ヒト骨格筋細胞、ヒト横紋筋肉腫細胞、ならびにラットのＬ６細
胞およびＬ８細胞が含まれる。その後、宿主細胞は、ミオスタチンプロモータの
活性化およびルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻止すると考えられる試験組成物に
さらされる。細胞はルシフェラーゼの基質にもさらされる。その後、ルシフェラ
ーゼ−基質の反応から発するシグナルまたは光の量を測定する。問題とする組成
物にさらされた宿主細胞によって産生されるシグナルの量が、コントロールの細
胞（すなわち、組成物にさらされていない細胞）によって産生されるシグナルの
量よりも少ない場合、その組成物は、ミオスタチンプロモータの活性を阻害して
おり、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害することにおいて有用である。処理され
た細胞によって産生されるシグナルの量がコントロールの細胞によって産生され
るシグナルの量に等しい場合、その組成物は、ミオスタチンプロモータの活性を
阻害しておらず、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害しない。
【００２３】
ミオスタチンプロモータの活性を阻害する組成物が同定されると、そのような
組成物は、筋肉消耗を含む任意のタイプの状態、例えば、後天的免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）、ガン、多発性硬化症および老化を伴う患者に投与することができ
る。そのような薬学的組成物は、治療有効量の阻害剤および適切な生理学的に受
容可能なキャリア（例えば、水、緩衝液または生理食塩水）を含むことができる
。薬学的組成物の投薬量、形態（例えば、懸濁物、錠剤、カプセルなど）および
投与経路（例えば、経口的、局所的、静脈内、皮下など）は、医師によって容易
に決定することができ、例えば、患者の年齢、体重、免疫状態および全体的な健
康状態のような様々な要因に依存し得る。
組成物は、筋肉消耗を含む任意のタイプの状態、例えば、後天的免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）、ガン、多発性硬化症および老化を伴う患者に投与することができ
る。そのような薬学的組成物は、治療有効量の阻害剤および適切な生理学的に受
容可能なキャリア（例えば、水、緩衝液または生理食塩水）を含むことができる
。薬学的組成物の投薬量、形態（例えば、懸濁物、錠剤、カプセルなど）および
投与経路（例えば、経口的、局所的、静脈内、皮下など）は、医師によって容易
に決定することができ、例えば、患者の年齢、体重、免疫状態および全体的な健
康状態のような様々な要因に依存し得る。
【００２４】
さらに、本発明はまた、例えば、適切なキャリア（例えば、水、緩衝液または
生理食塩水）とともに投与され得る精製されたミオスタチンタンパク質またはそ
の一部を使用して得られる抗体を含む組成物を包含する。抗体が投与された後、
抗体は体内の発現ミオスタチンに結合して、複合体を形成し、それによって、発
現したミオスタチンが筋肉の発達を負に調節することを妨げることができる。抗
体自体ならびにその一部もまた、そのような抗体またはその一部を含むアッセイ
と同様に本発明の範囲に包含される。
生理食塩水）とともに投与され得る精製されたミオスタチンタンパク質またはそ
の一部を使用して得られる抗体を含む組成物を包含する。抗体が投与された後、
抗体は体内の発現ミオスタチンに結合して、複合体を形成し、それによって、発
現したミオスタチンが筋肉の発達を負に調節することを妨げることができる。抗
体自体ならびにその一部もまた、そのような抗体またはその一部を含むアッセイ
と同様に本発明の範囲に包含される。
【００２５】
上記の薬学的組成物および抗体は、獣医学的適用のために（例えば、老化また
は疾患動物における筋肉消耗を防止するために）、あるいは農業的適用のために
（例えば、ミオスタチンを有しない動物ははるかに多くの筋肉量を示すので、家
畜における食肉生産を増大させるために）用いられ得ることに留意しなければな
らない。例えば、ミオスタチンプロモータの活性を阻害する治療組成物は、例え
ば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌおよびブタなどの哺乳動物に投与す
ることができる。
は疾患動物における筋肉消耗を防止するために）、あるいは農業的適用のために
（例えば、ミオスタチンを有しない動物ははるかに多くの筋肉量を示すので、家
畜における食肉生産を増大させるために）用いられ得ることに留意しなければな
らない。例えば、ミオスタチンプロモータの活性を阻害する治療組成物は、例え
ば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌおよびブタなどの哺乳動物に投与す
ることができる。
【００２６】
本発明はまた、精製されたミオスタチンおよび／またはミオスタチン抗体を使
用する方法で、ミオスタチンタンパク質の合成および分泌を阻害する組成物を同
定する２つの方法を包含する。サンドイッチ法では、成熟型のミオスタチンに対
する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体（ウサギ
またはマウス）を、固体表面（例えば、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）
にコーティングする。表面は、既知のブロッティング剤、例えば、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）でブロッティングし、洗浄する。サンプル（例えば、試薬の存
在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）または既知濃
度の精製された成熟型ミオスタチンを表面（例えば、プレート）に加える。ミオ
スタチンを抗体（１つまたは２つ以上）に結合させた後、表面を洗浄し、その後
、ミオスタチンに対する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクロ
ーナル抗体（例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス）と一緒にインキュベーション
する。第２の抗ミオスタチン抗体の結合が、シグナル生成化合物（例えば、酵素
）と結合した抗体を含む指示試薬の使用により検出される。酵素に対する基質も
また、酵素を使用した場合に加える。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）およびその基質Ｏ−フェニレンジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を用いることが
できる。特に、酵素−基質の反応は、例えば、マイクロプレートリーダーで読み
取ることができる検出可能なシグナルまたは変化（例えば、発色）を生じさせる
。利用され得る酵素以外のシグナル生成化合物の例には、例えば、発光性化合物
、放射活性元素、視覚的標識および化学発光化合物が含まれる。既知濃度の精製
されたミオスタチンは、標準曲線を作製するために使用される。未知サンプル（
例えば、試薬の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上
清）におけるミオスタチンの濃度は、この標準曲線を使用して決定することがで
きる。上清中のミオスタチン濃度を低下させる試験剤は、ミオスタチンの合成お
よび／または分泌を阻害することに関して有用な可能性がある。
用する方法で、ミオスタチンタンパク質の合成および分泌を阻害する組成物を同
定する２つの方法を包含する。サンドイッチ法では、成熟型のミオスタチンに対
する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体（ウサギ
またはマウス）を、固体表面（例えば、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）
にコーティングする。表面は、既知のブロッティング剤、例えば、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）でブロッティングし、洗浄する。サンプル（例えば、試薬の存
在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）または既知濃
度の精製された成熟型ミオスタチンを表面（例えば、プレート）に加える。ミオ
スタチンを抗体（１つまたは２つ以上）に結合させた後、表面を洗浄し、その後
、ミオスタチンに対する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクロ
ーナル抗体（例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス）と一緒にインキュベーション
する。第２の抗ミオスタチン抗体の結合が、シグナル生成化合物（例えば、酵素
）と結合した抗体を含む指示試薬の使用により検出される。酵素に対する基質も
また、酵素を使用した場合に加える。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）およびその基質Ｏ−フェニレンジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を用いることが
できる。特に、酵素−基質の反応は、例えば、マイクロプレートリーダーで読み
取ることができる検出可能なシグナルまたは変化（例えば、発色）を生じさせる
。利用され得る酵素以外のシグナル生成化合物の例には、例えば、発光性化合物
、放射活性元素、視覚的標識および化学発光化合物が含まれる。既知濃度の精製
されたミオスタチンは、標準曲線を作製するために使用される。未知サンプル（
例えば、試薬の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上
清）におけるミオスタチンの濃度は、この標準曲線を使用して決定することがで
きる。上清中のミオスタチン濃度を低下させる試験剤は、ミオスタチンの合成お
よび／または分泌を阻害することに関して有用な可能性がある。
【００２７】
競合的方法では、一定量のヒトミオスタチンを固体表面（例えば、Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ−４プレート）にコーティングする。プレートを、例えば、ＢＳＡまたは別
の既知のブロッティング剤によってブロッティングし、そして洗浄する。サンプ
ル（例えば、例えば、試験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細
胞に由来する上清）または既知濃度の精製された成熟型ミオスタチンを、ミオス
タチンに対する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗
体（例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス）とともにプレートに加える。プレート
を洗浄し、その後、シグナル生成化合物、例えば、酵素（または上記に記載され
た成分）と結合した抗体を含む指示試薬と一緒にインキュベーションする。酵素
を使用した場合は、酵素に対する基質もまた供給する。酵素は、例えば、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。従って、基質はＯ−フェニレンジ
アミン塩酸塩（ＯＰＤ）であり得る。再度ではあるが、酵素−基質の反応は、例
えば、マイクロプレートリーダーで読み取ることができる検出可能なシグナルま
たは変化（例えば、発色）を生じさせる。既知濃度の精製されたミオスタチンは
、標準曲線を作製するために使用することができる。未知サンプル（例えば、試
験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）にお
けるミオスタチンの濃度は、この標準曲線を使用して決定することができる。上
清中のミオスタチン濃度を低下させる試験剤は、ミオスタチンの合成および／ま
たは分泌を阻害することに関して潜在的に有用である。既知濃度のミオスタチン
またはサンプル中のミオスタチンは、ミオスタチン抗体に対する結合において、
プレートにコーティングされたミオスタチンタンパク質と競合する。より多くの
ミオスタチンがサンプル中に存在する場合、より少ないシグナルが生じる。試験
剤がミオスタチンの合成／分泌を阻止できる場合、その特定のサンプルにおける
ミオスタチンの量はコントロールよりも少なくなり、そのサンプルにおけるシグ
ナルはコントロールよりも多くなる。
ｏｎ−４プレート）にコーティングする。プレートを、例えば、ＢＳＡまたは別
の既知のブロッティング剤によってブロッティングし、そして洗浄する。サンプ
ル（例えば、例えば、試験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細
胞に由来する上清）または既知濃度の精製された成熟型ミオスタチンを、ミオス
タチンに対する哺乳動物のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗
体（例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス）とともにプレートに加える。プレート
を洗浄し、その後、シグナル生成化合物、例えば、酵素（または上記に記載され
た成分）と結合した抗体を含む指示試薬と一緒にインキュベーションする。酵素
を使用した場合は、酵素に対する基質もまた供給する。酵素は、例えば、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。従って、基質はＯ−フェニレンジ
アミン塩酸塩（ＯＰＤ）であり得る。再度ではあるが、酵素−基質の反応は、例
えば、マイクロプレートリーダーで読み取ることができる検出可能なシグナルま
たは変化（例えば、発色）を生じさせる。既知濃度の精製されたミオスタチンは
、標準曲線を作製するために使用することができる。未知サンプル（例えば、試
験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）にお
けるミオスタチンの濃度は、この標準曲線を使用して決定することができる。上
清中のミオスタチン濃度を低下させる試験剤は、ミオスタチンの合成および／ま
たは分泌を阻害することに関して潜在的に有用である。既知濃度のミオスタチン
またはサンプル中のミオスタチンは、ミオスタチン抗体に対する結合において、
プレートにコーティングされたミオスタチンタンパク質と競合する。より多くの
ミオスタチンがサンプル中に存在する場合、より少ないシグナルが生じる。試験
剤がミオスタチンの合成／分泌を阻止できる場合、その特定のサンプルにおける
ミオスタチンの量はコントロールよりも少なくなり、そのサンプルにおけるシグ
ナルはコントロールよりも多くなる。
【００２８】
さらに、本発明は、ミオスタチンに結合して、ミオスタチンがその受容体に結
合することを妨げ、それによってミオスタチンの機能発現を妨げる組成物を同定
するために、ろ過アッセイにおいて精製ミオスタチンを使用するアフィニティー
選択法を包含する。簡単に記載すると、精製されたミオスタチンを、いくつかの
試験化合物と混合する。この混合物を、特定分子量の分子のみが通過することが
できるフィルターに通す。ミオスタチンに結合した組成物は、フィルターによっ
て保持される。結合していない化合物は保持されず、結合した組成物から分離さ
れ得る。ミオスタチンに結合した組成物の構造は、例えば、質量分析法によって
決定される。
合することを妨げ、それによってミオスタチンの機能発現を妨げる組成物を同定
するために、ろ過アッセイにおいて精製ミオスタチンを使用するアフィニティー
選択法を包含する。簡単に記載すると、精製されたミオスタチンを、いくつかの
試験化合物と混合する。この混合物を、特定分子量の分子のみが通過することが
できるフィルターに通す。ミオスタチンに結合した組成物は、フィルターによっ
て保持される。結合していない化合物は保持されず、結合した組成物から分離さ
れ得る。ミオスタチンに結合した組成物の構造は、例えば、質量分析法によって
決定される。
【００２９】
さらに、本発明はまた、ミオスタチン受容体を含む組織または細胞から調製さ
れた細胞または膜に結合する放射能標識されたミオスタチンを使用する受容体結
合法を包含する。この方法では、ミオスタチンがその受容体に結合することを阻
止し、従って、ミオスタチンの機能発現を阻害する組成物を同定することができ
る。特に、細菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞に由来する精製された組換え
ミオスタチンタンパク質を放射能標識する（［１２５Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ
］など）。その後、放射能標識されたミオスタチンを、ミオスタチン受容体を含
有する組織または細胞から調製された細胞または膜と一緒に試験組成物の存在下
または非存在下でインキュベーションする。放射能標識された細胞および膜を、
その後、放射能標識されていない細胞および膜から、例えば、ろ過および遠心分
離などの分離方法により分離する。細胞または膜に結合しているミオスタチンの
量は、放射能を計測することによって決定される。試験組成物の存在下で放射能
が減少することにより、その組成物がミオスタチンの結合を阻害していること、
従ってミオスタチンの機能を阻害することにおいて有用であることが示される。
れた細胞または膜に結合する放射能標識されたミオスタチンを使用する受容体結
合法を包含する。この方法では、ミオスタチンがその受容体に結合することを阻
止し、従って、ミオスタチンの機能発現を阻害する組成物を同定することができ
る。特に、細菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞に由来する精製された組換え
ミオスタチンタンパク質を放射能標識する（［１２５Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ
］など）。その後、放射能標識されたミオスタチンを、ミオスタチン受容体を含
有する組織または細胞から調製された細胞または膜と一緒に試験組成物の存在下
または非存在下でインキュベーションする。放射能標識された細胞および膜を、
その後、放射能標識されていない細胞および膜から、例えば、ろ過および遠心分
離などの分離方法により分離する。細胞または膜に結合しているミオスタチンの
量は、放射能を計測することによって決定される。試験組成物の存在下で放射能
が減少することにより、その組成物がミオスタチンの結合を阻害していること、
従ってミオスタチンの機能を阻害することにおいて有用であることが示される。
【００３０】
本発明は、下記の非限定的な実施例の使用によって例示され得る。
【００３１】
実施例Ｉ
ヒトミオスタチンプロモータをコードするヌクレオチド配列および有用な転写因
子結合領域の同定 １．ヒトミオスタチンｃＤＮＡのクローニング。ヒトミオスタチンｃＤＮＡを
、ヒト骨格筋の５’−ｐｌｕｓ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、下記の特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲ
により増幅した：５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴ
−３’および５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣ−３’。ＰＣ
Ｒ産物を真核生物ＴＡクローニングベクターのｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。ＤＮＡを配列決定するこ
とによってインサートを確認した。
子結合領域の同定 １．ヒトミオスタチンｃＤＮＡのクローニング。ヒトミオスタチンｃＤＮＡを
、ヒト骨格筋の５’−ｐｌｕｓ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、下記の特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲ
により増幅した：５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴ
−３’および５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣ−３’。ＰＣ
Ｒ産物を真核生物ＴＡクローニングベクターのｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。ＤＮＡを配列決定するこ
とによってインサートを確認した。
【００３２】
２．ヒトミオスタチンプロモータ領域のクローニング。ヒトミオスタチン遺伝
子のエキソン１およびエキソン２を含むヒトミオスタチンｃＤＮＡ（図１）のＥ
ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのフラグメント（７４０ｂｐ）を、ヒトＰ１由来
人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に送った。
１２０ｋｂのインサートを有する１個の陽性クローンが、同じプローブを使用す
るゲノムサザンブロットによって同定され、確認された。この１２０ｋｂのイン
サートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、プラスミドｐＺｅｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）にサブクローニングした。５ｋｂ〜７ｋｂの
インサートを有する２つの陽性サブクローンが同定された（図１）。配列決定の
結果は、クローン１０がエキソン２とイントロン１およびイントロン２の一部と
を含有することを示している。クローン１１（５．３ｋｂ）は、エキソン１、イ
ントロン１の一部、および３．４ｋｂの５’非翻訳領域（すなわち、推定的なミ
オスタチンプロモータ領域）を含有する。プログラムＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ
Ｖ２．２（Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）
による検索が行われ、潜在的な転写因子結合領域がいくつか同定された（図２）
。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒは、コンセンサスモチーフに対する配列データの迅
速な走査を可能にするソフトウエアである。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒは、類似
性インデックスを計算するためにＭａｔＩｎｄによって作製されるコア類似性、
マトリックス類似性およびＣｉベクトルを使用する。潜在的な転写因子結合部位
は、コア類似性およびマトリックス類似性の両方が０．９５に達するときに選択
された。プログラムの詳細は、Ｑｕａｎｄｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：４８７８〜４８８４、１９９５に説明されている。
子のエキソン１およびエキソン２を含むヒトミオスタチンｃＤＮＡ（図１）のＥ
ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのフラグメント（７４０ｂｐ）を、ヒトＰ１由来
人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に送った。
１２０ｋｂのインサートを有する１個の陽性クローンが、同じプローブを使用す
るゲノムサザンブロットによって同定され、確認された。この１２０ｋｂのイン
サートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、プラスミドｐＺｅｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）にサブクローニングした。５ｋｂ〜７ｋｂの
インサートを有する２つの陽性サブクローンが同定された（図１）。配列決定の
結果は、クローン１０がエキソン２とイントロン１およびイントロン２の一部と
を含有することを示している。クローン１１（５．３ｋｂ）は、エキソン１、イ
ントロン１の一部、および３．４ｋｂの５’非翻訳領域（すなわち、推定的なミ
オスタチンプロモータ領域）を含有する。プログラムＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ
Ｖ２．２（Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）
による検索が行われ、潜在的な転写因子結合領域がいくつか同定された（図２）
。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒは、コンセンサスモチーフに対する配列データの迅
速な走査を可能にするソフトウエアである。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒは、類似
性インデックスを計算するためにＭａｔＩｎｄによって作製されるコア類似性、
マトリックス類似性およびＣｉベクトルを使用する。潜在的な転写因子結合部位
は、コア類似性およびマトリックス類似性の両方が０．９５に達するときに選択
された。プログラムの詳細は、Ｑｕａｎｄｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：４８７８〜４８８４、１９９５に説明されている。
【００３３】
３．ミオスタチンを発現するヒト骨格筋細胞または筋肉系統の他の細胞株の同
定。ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫細胞に由来する全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏ
ｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ
Ｄ）を使用して単離し、逆転写用のテンプレートとして使用した。ミオスタチン
遺伝子を、ヒトミオスタチンに特異的な下記のプライマーを使用してＰＣＲによ
り増幅した：５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴ−３
’および５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣ−３’。ヒト前立
腺平滑筋細胞に由来する全ＲＮＡも同様に試験した。内因性のＧ３ＰＤＨ遺伝子
に対するプライマーを使用して、全ＲＮＡの完全性を調べた。ＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルで分析した（図３）。１．１ｋｂのＰＣＲ産物（１．１ｋｂはミ
オスタチンの正しいサイズである）により、ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫
細胞の両方がミオスタチンを発現していることが示される。
定。ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫細胞に由来する全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏ
ｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ
Ｄ）を使用して単離し、逆転写用のテンプレートとして使用した。ミオスタチン
遺伝子を、ヒトミオスタチンに特異的な下記のプライマーを使用してＰＣＲによ
り増幅した：５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴ−３
’および５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣ−３’。ヒト前立
腺平滑筋細胞に由来する全ＲＮＡも同様に試験した。内因性のＧ３ＰＤＨ遺伝子
に対するプライマーを使用して、全ＲＮＡの完全性を調べた。ＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルで分析した（図３）。１．１ｋｂのＰＣＲ産物（１．１ｋｂはミ
オスタチンの正しいサイズである）により、ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫
細胞の両方がミオスタチンを発現していることが示される。
【００３４】
実施例ＩＩ
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを、哺乳動物遺伝子発現の定量的分
析のために設計した。ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラ
ーゼのコード領域を、ヒトミオスタチン遺伝子の３．４ｋｂの５’非翻訳領域（
５’−ＵＴＲ）に連結した。この構築物をヒト骨格筋細胞またはヒト横紋筋肉腫
細胞に一過性トランスフェクションして、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測
定した。ルシフェラーゼ活性を分析するために、ルシフェリンおよびＭｇ２＋−
ＡＴＰを細胞抽出物に加え、光の生成をモニターした。３．４ｋｂの５’−ＵＴ
Ｒ領域がプロモータ活性を有する場合、ルシフェラーゼ活性は増大する。従って
、ルシフェラーゼ活性は、上流のプロモータ領域の機能の指標（レポーター）と
して使用することができる。
析のために設計した。ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラ
ーゼのコード領域を、ヒトミオスタチン遺伝子の３．４ｋｂの５’非翻訳領域（
５’−ＵＴＲ）に連結した。この構築物をヒト骨格筋細胞またはヒト横紋筋肉腫
細胞に一過性トランスフェクションして、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測
定した。ルシフェラーゼ活性を分析するために、ルシフェリンおよびＭｇ２＋−
ＡＴＰを細胞抽出物に加え、光の生成をモニターした。３．４ｋｂの５’−ＵＴ
Ｒ領域がプロモータ活性を有する場合、ルシフェラーゼ活性は増大する。従って
、ルシフェラーゼ活性は、上流のプロモータ領域の機能の指標（レポーター）と
して使用することができる。
【００３５】
３．４ｋｂのヒトミオスタチンの５’非翻訳領域を、ｐＧＬ３−エンハンサー
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位およびＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結した
（図４）。この構築物を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、
Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用してヒト骨格筋細胞またはヒト横紋
筋肉腫細胞に一過性トランスフェクションした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子ま
たはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子などの別のレポータ
ー遺伝子を、トランスフェクション効率のためのコントロールとして同時にトラ
ンスフェクションした。細胞を４８時間後に溶解緩衝液中で溶解し、細胞抽出物
を、検出キット［例えば、ＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、
ＣＴ）、発光β−ガラクトシダーゼ検出キットＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、または二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム
（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）］を使用してルシフェラーゼ活性お
よびβ−ｇａｌ活性について分析した。ｐＧＬ３−エンハンサー親ベクターをネ
ガティブコントールとして使用し、ＳＶ４０プロモータを有するｐＧＬ３コント
ロールベクターをルシフェラーゼ活性のポジティブコントロールとして使用した
。ルシフェラーゼ活性は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａカウンターまたはＬｕｍｉｎｏｍ
ｅｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ
、フィンランド）などの発光光検出器で計数し、結果はトランスフェクション効
率により標準化した。ヒトミオスタチンプロモータ構築物のルシフェラーゼ活性
は、その親ベクターと比較して、ヒト骨格筋細胞では約５倍増大していた（図５
Ａ）。ヒト横紋筋肉腫細胞では、ルシフェラーゼ活性の増大は約７倍であった（
図５Ｂ）。予想されるように、ルシフェラーゼ活性は、ミオスタチンを発現して
いないヒト前立腺平滑筋細胞では増大しなかった（図５Ａ）。
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位およびＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結した
（図４）。この構築物を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、
Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用してヒト骨格筋細胞またはヒト横紋
筋肉腫細胞に一過性トランスフェクションした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子ま
たはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子などの別のレポータ
ー遺伝子を、トランスフェクション効率のためのコントロールとして同時にトラ
ンスフェクションした。細胞を４８時間後に溶解緩衝液中で溶解し、細胞抽出物
を、検出キット［例えば、ＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、
ＣＴ）、発光β−ガラクトシダーゼ検出キットＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、または二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム
（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）］を使用してルシフェラーゼ活性お
よびβ−ｇａｌ活性について分析した。ｐＧＬ３−エンハンサー親ベクターをネ
ガティブコントールとして使用し、ＳＶ４０プロモータを有するｐＧＬ３コント
ロールベクターをルシフェラーゼ活性のポジティブコントロールとして使用した
。ルシフェラーゼ活性は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａカウンターまたはＬｕｍｉｎｏｍ
ｅｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ
、フィンランド）などの発光光検出器で計数し、結果はトランスフェクション効
率により標準化した。ヒトミオスタチンプロモータ構築物のルシフェラーゼ活性
は、その親ベクターと比較して、ヒト骨格筋細胞では約５倍増大していた（図５
Ａ）。ヒト横紋筋肉腫細胞では、ルシフェラーゼ活性の増大は約７倍であった（
図５Ｂ）。予想されるように、ルシフェラーゼ活性は、ミオスタチンを発現して
いないヒト前立腺平滑筋細胞では増大しなかった（図５Ａ）。
【００３６】
上記の結果を考慮すると、３．４ｋｂのヒトミオスタチンプロモータ領域を含
有するルシフェラーゼレポーター構築物は、高処理能スクリーニングのために、
ＳＶ−４０で形質転換されたヒト骨格筋細胞または横紋筋肉腫細胞などの哺乳動
物細胞株に安定的または一過性にトランスフェクションすることができる。ルシ
フェラーゼ活性は、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害する化合物を選択するため
の指標として使用することができる。
有するルシフェラーゼレポーター構築物は、高処理能スクリーニングのために、
ＳＶ−４０で形質転換されたヒト骨格筋細胞または横紋筋肉腫細胞などの哺乳動
物細胞株に安定的または一過性にトランスフェクションすることができる。ルシ
フェラーゼ活性は、ミオスタチン遺伝子の発現を阻害する化合物を選択するため
の指標として使用することができる。
【００３７】
実施例ＩＩＩ
高処理能スクリーニングのための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
サンドイッチ法ＥＬＩＳＡまたは競合的ＥＬＩＳＡを、ヒトミオスタチンタン
パク質の合成および／または分泌を阻害する化合物を同定するために使用するこ
とができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、成熟型のミオスタチンに対
するウサギまたはマウスのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗
体をＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）にコーティングし、そしてプレート
をＢＳＡによってブロッティングし、洗浄する。サンプル（例えば、試験剤の存
在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）または既知濃
度の精製された成熟型ミオスタチンをプレートに加える。ミオスタチンタンパク
質を結合させた後、プレートを再び洗浄し、その後、ミオスタチンに対するウサ
ギまたはマウスのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体と一緒
にインキュベーションする。第２の抗ミオスタチン抗体の結合が、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗体によって、基質としてｏ−フェニレン
ジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を使用して検出される。既知濃度のミオスタチンは、
標準曲線を作製するために使用される。
パク質の合成および／または分泌を阻害する化合物を同定するために使用するこ
とができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、成熟型のミオスタチンに対
するウサギまたはマウスのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗
体をＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）にコーティングし、そしてプレート
をＢＳＡによってブロッティングし、洗浄する。サンプル（例えば、試験剤の存
在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋細胞に由来する上清）または既知濃
度の精製された成熟型ミオスタチンをプレートに加える。ミオスタチンタンパク
質を結合させた後、プレートを再び洗浄し、その後、ミオスタチンに対するウサ
ギまたはマウスのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体と一緒
にインキュベーションする。第２の抗ミオスタチン抗体の結合が、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗体によって、基質としてｏ−フェニレン
ジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を使用して検出される。既知濃度のミオスタチンは、
標準曲線を作製するために使用される。
【００３８】
競合的ＥＬＩＳＡでは、ヒトミオスタチンタンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ−４プ
レートにコーティングし、そしてプレートをＢＳＡでブロッティングし、洗浄す
る。サンプル（例えば、試験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋
細胞に由来する上清）または既知濃度の精製された成熟型ミオスタチンまたはミ
オスタチンペプチドを、ミオスタチンに対するヤギまたはウサギまたはマウスの
モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体とともにプレートに加え
る。プレートを再び洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と
結合した抗体とともに、基質としてｏ−フェニレンジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を
使用してインキュベーションする。既知濃度のミオスタチンは、標準曲線を作製
するために使用する。
レートにコーティングし、そしてプレートをＢＳＡでブロッティングし、洗浄す
る。サンプル（例えば、試験剤の存在下または非存在下で処理されたヒト骨格筋
細胞に由来する上清）または既知濃度の精製された成熟型ミオスタチンまたはミ
オスタチンペプチドを、ミオスタチンに対するヤギまたはウサギまたはマウスの
モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体とともにプレートに加え
る。プレートを再び洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と
結合した抗体とともに、基質としてｏ−フェニレンジアミン塩酸塩（ＯＰＤ）を
使用してインキュベーションする。既知濃度のミオスタチンは、標準曲線を作製
するために使用する。
【００３９】
ミオスタチンを合成して分泌するヒト骨格筋細胞または筋肉系統の他の細胞株
は、ミオスタチンの合成または分泌を阻害すると考えられる化合物を試験するた
めに使用することができる。細胞は、所定の時間、例えば、６時間〜４８時間試
験化合物と一緒にインキュベーションする。その後、細胞培地におけるミオスタ
チンの量をＥＬＩＳＡによって測定する。ミオスタチン量の減少により、試験化
合物がミオスタチンの合成および分泌を阻害することにおいて効果的であること
、これに対して、ミオスタチン量の増大またはミオスタチンの同じレベルの維持
により、試験化合物がミオスタチンの合成および分泌を阻害することにおいて効
果的でないことが示される。
は、ミオスタチンの合成または分泌を阻害すると考えられる化合物を試験するた
めに使用することができる。細胞は、所定の時間、例えば、６時間〜４８時間試
験化合物と一緒にインキュベーションする。その後、細胞培地におけるミオスタ
チンの量をＥＬＩＳＡによって測定する。ミオスタチン量の減少により、試験化
合物がミオスタチンの合成および分泌を阻害することにおいて効果的であること
、これに対して、ミオスタチン量の増大またはミオスタチンの同じレベルの維持
により、試験化合物がミオスタチンの合成および分泌を阻害することにおいて効
果的でないことが示される。
【００４０】
実施例ＩＶ
受容体結合アッセイにおいて使用される放射能標識されたミオスタチンの作製
細菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞に由来する精製された組換えミオスタ
チンタンパク質が放射能標識される（［１２５Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］など
）。その後、放射能標識されたミオスタチンは、ミオスタチン受容体を含有する
組織または細胞から調製された細胞または膜とともに試験組成物の存在下または
非存在下でインキュベーションされる。膜に結合しているミオスタチンの量は、
放射能を計測することによって決定される。試験組成物の存在下で放射能が減少
することにより、その組成物がミオスタチンの結合を阻害していること、従って
ミオスタチンの機能を阻害することにおいて有用であることが示される。
チンタンパク質が放射能標識される（［１２５Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］など
）。その後、放射能標識されたミオスタチンは、ミオスタチン受容体を含有する
組織または細胞から調製された細胞または膜とともに試験組成物の存在下または
非存在下でインキュベーションされる。膜に結合しているミオスタチンの量は、
放射能を計測することによって決定される。試験組成物の存在下で放射能が減少
することにより、その組成物がミオスタチンの結合を阻害していること、従って
ミオスタチンの機能を阻害することにおいて有用であることが示される。
【００４１】
実施例Ｖ
アフィニティー選択において使用される精製されたミオスタチン
細菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞に由来する精製された組換えミオスタ
チンタンパク質は、試験組成物との結合において使用される。特に、ミオスタチ
ンに結合した試験組成物はフィルターに保持され、そしてその構造が質量分析法
によって決定される。ミオスタチンに結合する試験組成物は、ミオスタチンがそ
の受容体に結合することを阻害することにおいて、従ってミオスタチンの機能を
阻害することにおいて有用である。
チンタンパク質は、試験組成物との結合において使用される。特に、ミオスタチ
ンに結合した試験組成物はフィルターに保持され、そしてその構造が質量分析法
によって決定される。ミオスタチンに結合する試験組成物は、ミオスタチンがそ
の受容体に結合することを阻害することにおいて、従ってミオスタチンの機能を
阻害することにおいて有用である。
【図１】
図１は、ヒトミオスタチン遺伝子の概念図を表す。ヒトミオスタチン遺伝子は
３つのエキソンと２つのイントロンとを含み、これらにより、１．１ｋｂのミオ
スタチンｃＤＮＡがコードされる。ヒトＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラ
リーを、ヒトミオスタチンのエキソン１およびエキソン２をコードする７４０ｂ
ｐのプローブを使用してスクリーニングしたとき、１２０ｋｂのインサートを有
する１個の陽性クローンが同定された。このクローンをＥｃｏＲＩで消化した後
、２つのヒトゲノムサブクローンが単離された。このサブクローンの一方（クロ
ーンＣ１１）が、０．３７ｋｂのエキソン１、１．５３ｋｂのイントロン１、お
よびヒトミオスタチンプロモータ領域を含有する３．４ｋｂの配列を含有した。
３つのエキソンと２つのイントロンとを含み、これらにより、１．１ｋｂのミオ
スタチンｃＤＮＡがコードされる。ヒトＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラ
リーを、ヒトミオスタチンのエキソン１およびエキソン２をコードする７４０ｂ
ｐのプローブを使用してスクリーニングしたとき、１２０ｋｂのインサートを有
する１個の陽性クローンが同定された。このクローンをＥｃｏＲＩで消化した後
、２つのヒトゲノムサブクローンが単離された。このサブクローンの一方（クロ
ーンＣ１１）が、０．３７ｋｂのエキソン１、１．５３ｋｂのイントロン１、お
よびヒトミオスタチンプロモータ領域を含有する３．４ｋｂの配列を含有した。
【図２】
図２は、ヒトミオスタチンプロモータ領域の核酸配列を表す。推定的な転写因
子結合領域がいくつか同定され、下線が引かれている。
子結合領域がいくつか同定され、下線が引かれている。
【図３】
図３は、ヒトの骨格筋、横紋筋肉腫細胞および前立腺平滑筋細胞から得られた
ＲＮＡサンプルの、ヒトミオスタチンに特異的なプライマーを使用したＲＴ−Ｐ
ＣＲによるミオスタチンｍＲＮＡの検出を表す。Ｇ３ＰＤＨにはＧ３ＰＤＨに特
異的なプライマーが使用される。増幅されたミオスタチン遺伝子（１．１ｋｂ）
が、ヒトの骨格筋細胞（レーン１）および横紋筋肉腫細胞（レーン２）の両方で
認められたが、前立腺平滑筋細胞（レーン３）では認められなかった。増幅され
たＧ３ＰＤＨ遺伝子（０．９ｋｂ）が、骨格筋細胞（レーン４）、横紋筋肉腫細
胞（レーン５）および前立腺平滑筋細胞（レーン６）で認められた。
ＲＮＡサンプルの、ヒトミオスタチンに特異的なプライマーを使用したＲＴ−Ｐ
ＣＲによるミオスタチンｍＲＮＡの検出を表す。Ｇ３ＰＤＨにはＧ３ＰＤＨに特
異的なプライマーが使用される。増幅されたミオスタチン遺伝子（１．１ｋｂ）
が、ヒトの骨格筋細胞（レーン１）および横紋筋肉腫細胞（レーン２）の両方で
認められたが、前立腺平滑筋細胞（レーン３）では認められなかった。増幅され
たＧ３ＰＤＨ遺伝子（０．９ｋｂ）が、骨格筋細胞（レーン４）、横紋筋肉腫細
胞（レーン５）および前立腺平滑筋細胞（レーン６）で認められた。
【図４】
図４は、ルシフェラーゼレポーター構築物を表す。３．４ｋｂのヒトミオスタ
チンプロモータ領域を、ルシフェラーゼをレポーターとするｐＧＬ３−エンハン
サーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。このベクターは、ルシフェラーゼレポー
ター遺伝子と、転写レベルを増大させるためのＳＶ４０エンハンサーエレメント
とを含有した。
チンプロモータ領域を、ルシフェラーゼをレポーターとするｐＧＬ３−エンハン
サーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。このベクターは、ルシフェラーゼレポー
ター遺伝子と、転写レベルを増大させるためのＳＶ４０エンハンサーエレメント
とを含有した。
【図５】
図５は、ヒトの骨格筋細胞および横紋筋肉腫細胞におけるヒトミオスタチンプ
ロモータ領域に対するルシフェラーゼアッセイから得られた結果を表す。
ロモータ領域に対するルシフェラーゼアッセイから得られた結果を表す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/24
Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02
5/10 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
1/68 33/536 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ
33/536 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/00 Ａ
(72)発明者 ワン，チヤホン
アメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノー
スブルツク、エイ・１、セーラム・ウオー
ク・3638
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 DA02
EA04 FA10 GA11 HA11 HA12
HA15
4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ43 QR32
QR48 QR55 QR62 QS03 QS07
QS34
4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02
CA24 CA44 CA46
4C084 AA16 DC50 NA14 ZA02 ZA94
ZB26 ZC52 ZC55
4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40
DA01 EA22 EA28 FA74
Claims (13)
- 【請求項１】 図２（配列番号１）によって表される単離された核酸配列。
- 【請求項２】 請求項１に記載される前記核酸配列と、レポーター分子をコ
ードする核酸配列とを含むベクターであって、前記レポーター分子をコードする
前記核酸配列は請求項１に記載される前記核酸配列に機能的に連結しているベク
ター。 - 【請求項３】 前記レポーター分子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からな
る群から選択される、請求項２に記載のベクター。 - 【請求項４】 前記レポーター分子はルシフェラーゼである、請求項３に記
載のベクター。 - 【請求項５】 請求項３に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項６】 ミオスタチンによる免疫感作に応答して産生される精製され
た抗体。 - 【請求項７】 請求項６に記載される前記精製抗体を含む組成物。
- 【請求項８】 ミオスタチンプロモータの活性化を阻害する組成物を同定す
る方法であって、 ａ）図２（配列番号１）によって表される核酸配列と、レポーター分子をコー
ドする核酸配列とを含むベクターを構築する工程であって、前記レポーター分子
をコードする前記核酸配列は、図２によって表される前記配列をコードする前記
核酸配列に機能的に連結されている工程； ｂ）ミオスタチンの発現に好適な時間および条件のもとで前記ベクターを宿主
細胞に導入する工程； ｃ）ミオスタチンプロモータの活性化を阻害し得る組成物と、前記レポーター
分子に特異的な基質とに前記宿主細胞をさらす工程；および ｄ）前記レポーター分子と前記基質との反応によって生じるシグナルを、コン
トロールの宿主細胞によって産生されるシグナルと比較して測定する工程であっ
て、（ｃ）の前記宿主細胞によるシグナルの方が小さいことにより、前記組成物
が前記ミオスタチンプロモータの活性化を阻害することが示される工程 を含む方法。 - 【請求項９】 ミオスタチンの発現を阻害する組成物を同定する方法であっ
て、 ａ）ミオスタチンに対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体からなる群から選択される抗体を固相に加える工程； ｂ）既知濃度のミオスタチン、または前記試験組成物にさらされたミオスタチ
ン含有細胞サンプルを、前記抗体と前記既知濃度のミオスタチンまたは前記細胞
サンプル内のミオスタチンとの間での第１の複合体を形成させるために前記固相
に加える工程； ｃ）ミオスタチンに対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体からなる群から選択される第２の抗体を、前記第１の複合体と前記第２の
抗体との間での第２の複合体が形成されるのに十分な時間および条件のもとで前
記第１の複合体に加える工程； ｄ）前記第２の複合体を、前記第２の複合体の前記抗体に対する抗体に結合さ
せたシグナル生成化合物を含む指示試薬と、第３の複合体が形成されるのに十分
な時間および条件のもとで接触させる工程；および ｅ）測定可能なシグナルの存在を検出する工程であって、前記シグナルが存在
しないことにより、前記組成物がミオスタチンの発現を阻害することが示され、
そして前記シグナルが存在することにより、前記組成物がミオスタチンの発現を
阻害しないことが示される工程 を含む方法。 - 【請求項１０】 ミオスタチンの発現を阻害する組成物を同定する方法であ
って、 ａ）一定量のミオスタチンを固相にコーティングする工程； ｂ）既知濃度のミオスタチン、または前記組成物にさらされたミオスタチン含
有細胞サンプルを加える工程； ｃ）ミオスタチンに対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体からなる群から選択される抗体を、第１の複合体を形成させるのに十分な
時間および条件のもと、（ａ）および（ｂ）における前記ミオスタチンに接触さ
せる工程であって、（ａ）のミオスタチンは前記モノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体に対して（ｂ）のミオスタチンと競合する工程； ｄ）前記第１の複合体を、前記第１の複合体の前記抗体に対する抗体に結合さ
せたシグナル生成化合物を含む指示試薬と、第２の複合体が形成されるのに十分
な時間および条件のもとで接触させる工程：および （ｅ）測定可能なシグナルを検出する工程であって、コントロールと比較して
シグナルがより大きいことにより、前記組成物がミオスタチンの発現を阻害する
ことが示される工程 を含む方法。 - 【請求項１１】 ミオスタチンがミオスタチン受容体に結合することを阻害
する組成物を組成物の混合物中において同定する方法であって、 ａ）精製されたミオスタチンを組成物の前記混合物と混合する工程； ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を、ミオスタチンと複合体化した組成物がフ
ィルターを通過できないようなサイズの細孔を有するフィルターに通す工程；お
よび ｃ）複合体化した組成物の構造を明らかにし、それによってミオスタチンがミ
オスタチン受容体に結合することを阻害する組成物を同定する工程 を含む方法。 - 【請求項１２】 ミオスタチンがミオスタチン受容体に結合することを阻害
する組成物を同定する方法であって、 ａ）組換えミオスタチンを放射能標識する工程； ｂ）前記放射能標識された組換えミオスタチンを、ミオスタチン受容体を含む
細胞または膜とともにインキュベーションする工程； ｃ）工程（ｂ）のインキュベーション混合物を目的とする組成物と接触させる
工程； ｄ）細胞または膜に結合した放射能標識ミオスタチンを非結合ミオスタチンか
ら分離する工程；および ｅ）コントロールと比較して、結合ミオスタチンにおける放射能の量を測定す
る工程であって、前記コントロールと比較して結合ミオスタチンにおける放射能
のレベルがより少ないことにより、ミオスタチンが受容体に結合することを阻害
する組成物が示される工程 を含む方法。 - 【請求項１３】 哺乳動物における筋肉消耗を防止する方法であって、筋肉
消耗が防止されるように、ミオスタチンプロモータの活性化を防止すること、ミ
オスタチンの合成を妨げること、およびミオスタチンがその標的受容体に結合す
ることを妨げることからなる群から選択される作用を引き起こす有効成分を治療
効果的な量で含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/329,685 US6284882B1 (en) | 1999-06-10 | 1999-06-10 | Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof |
| US09/329,685 | 1999-06-10 | ||
| PCT/US2000/015868 WO2000077206A2 (en) | 1999-06-10 | 2000-06-09 | The myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003528574A true JP2003528574A (ja) | 2003-09-30 |
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Family
ID=23286552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001503650A Expired - Fee Related JP4625602B2 (ja) | 1999-06-10 | 2000-06-09 | ミオスタチン遺伝子プロモータおよびその活性化阻害 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6284882B1 (ja) |
| EP (1) | EP1185649B1 (ja) |
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