JP2002529053A - Ｌｄｌ関連タンパク質およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、TANGO 136核酸分子と称する単離された核酸分子を提供し、該核酸分子はタンパク質のLDL受容体ファミリーのメンバーに対する相同性を有する膜貫通タンパク質をコードする。本発明はまた、アンチセンス核酸分子、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入されている宿主細胞、および本発明の核酸分子が導入されているかまたは破壊されている非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明はさらに、単離されたポリペプチド、融合ポリペプチド、抗原性ペプチドおよび抗体を提供する。本発明の組成物を利用した診断、スクリーニングおよび治療方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 低密度リポタンパク質(LDL)受容体遺伝子ファミリーのメンバーには、LDL受容
体、超低密度リポタンパク質(VLDL)受容体、LDL受容体関連タンパク質2(LRP-2/
メガリン/gp330)、LDL受容体関連タンパク質3(LRP-3/LRP-105)、LDL受容体関連
タンパク質5(LRP-5)、LDL受容体関連タンパク質6(LRP-6)およびLR8Bが含まれる
。

【０００２】 LDL受容体ファミリーの多くのメンバーに共通していることは、リガンドのエ
ンドサイトーシスによる取込みである。LDL受容体ファミリーのメンバーによっ
て結合されるリガンドは多岐にわたっている。例えば、LDL受容体はapoBまたはa
poEを含むリポタンパク質と結合すると考えられており、VLDL受容体はapoEを含
むリポタンパク質と結合すると考えられており、LRP-2はapoE含有リポタンパク
質、プラスミノーゲン、ラクトフェリンおよびリポタンパク質リパーゼと結合す
ると考えられている。重要なことは、LRP-2がクラステリン/ApoJの複合体および
アミロイドβタンパク質の取込みも媒介すると考えられることである。

【０００３】発明の概要 本発明は、少なくとも一部には、Ｉ型膜タンパク質であるTANGO 136をコード
するcDNA分子の発見に基づいている。ヒトとマウスの両方のTANGO 136をコード
するcDNA分子を以下に記載する。かかるタンパク質、それらの断片、誘導体また
は変異体をまとめて「本発明のポリペプチド」または「本発明のタンパク質」と
いう。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子をまとめて「本発明の核酸」
という。

【０００４】 本発明の核酸およびポリペプチドは、さまざまな細胞プロセスを調節する際の
モジュレーターとして有用である。したがって、一態様において、本発明は、本
発明のポリペプチドまたはその生理活性部分をコードする単離された核酸分子を
提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を検出するた
めのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして有用な核酸分子を
提供する。

【０００５】 本発明はさらに、配列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、または
ATCCに受託番号98880として寄託されたクローンのcDNA挿入物のヌクレオチド配
列（「ATCC 98880のcDNA」）、またはその相補体に対して少なくとも45％（また
は55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一である核酸分子を特徴とす
る。

【０００６】 本発明はさらに、配列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、または
ATCC受託番号98880のcDNAのヌクレオチド配列、またはその相補体の少なくとも3
00（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、100
0または1200）ヌクレオチドの断片を含む核酸分子を特徴とする。

【０００７】 本発明はまた、配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCC受託番号98
880のcDNAもしくはその相補体によりコードされるアミノ酸配列に対して少なく
とも45％（または55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一であるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を特
徴とする。

【０００８】 種々の実施形態において、前記核酸分子は配列番号１、３、４もしくは６のヌ
クレオチド配列、またはATCC受託番号98880のcDNAのヌクレオチド配列を有する
。

【０００９】 また、配列番号２もしくは５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片であ
って、配列番号２もしくは５またはATCC受託番号98880のcDNAによりコードされ
るアミノ酸配列の少なくとも15（25、30、50、100、150、300または400）個連続
しているアミノ酸を含む該断片をコードする核酸分子も本発明に含まれる。

【００１０】 本発明は、配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCC受託番号98880
のcDNAによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子
変異体をコードする核酸分子であって、配列番号２もしくは５をコードする核酸
配列またはその相補体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイ
ズする該核酸分子を特徴とする。

【００１１】 また、配列番号２または５のアミノ酸配列に対して少なくとも約65％、好まし
くは75％、85％、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離された
ポリペプチドまたはタンパク質も本発明に含まれる。

【００１２】 さらに、配列番号２または５をコードする核酸配列に対して少なくとも約65％
、好ましくは75％、85％、または95％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸
分子によりコードされる単離されたポリペプチドまたはタンパク質、ならびに配
列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号98880のc
DNAの非コード鎖またはその相補体を有する核酸分子とストリンジェント条件下
でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる単
離されたポリペプチドまたはタンパク質も本発明に含まれる。

【００１３】 また、配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCC受託番号98880のcDN
Aによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子変異
体であるポリペプチドであって、配列番号１、３、４もしくは６またはその相補
体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によ
りコードされる該ポリペプチドも本発明に含まれる。

【００１４】 本発明はまた、配列番号１、３、４もしくは６、またはATCC受託番号98880のc
DNA、またはその相補体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダ
イズする核酸分子を特徴とする。他の実施形態において、前記核酸分子は少なく
とも300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900
、1000または1200）ヌクレオチド長であり、かつストリンジェント条件下で配列
番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号98880のcDN
A、またはその相補体を含む核酸分子とハイブリダイズする。

【００１５】 他の実施形態において、単離された核酸分子は本発明のポリペプチドの１以上
のドメイン、例えば、細胞質ドメイン（配列番号11または18）、膜貫通ドメイン
（配列番号10または17）、または細胞外ドメイン（配列番号９または16）をコー
ドする。別の実施形態において、本発明は本発明の核酸のコード鎖に対してアン
チセンスである単離された核酸分子を提供する。

【００１６】 本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含有するベクター、例えば組換え発
現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、かかるベクターを含有す
る宿主細胞を提供する。本発明はまた、組換え発現ベクターを含有する本発明の
宿主細胞を適切な培地で培養して、ポリペプチドが産生されるようにすることを
含んでなる、本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。

【００１７】 本発明の別の態様は、本発明の単離されたまたは組換え体のタンパク質および
ポリペプチドを特徴とする。好適なタンパク質およびポリペプチドは、対応する
天然のヒト・ポリペプチドが保有する少なくとも１つの生物学的活性をもつもの
である。本発明のポリペプチドの活性、生理活性、生物学的活性および機能的活
性は、標準的な技法によりin vivoまたはin vitroで測定したとき、本発明のタ
ンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子が応答細胞に対して発揮する活性をさす
。このような活性は、第２タンパク質との結合または第２タンパク質に対する酵
素活性などの直接的活性、または該タンパク質と第２タンパク質との相互作用に
より媒介される細胞シグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。したがっ
て、この種の活性としては、例えば、(1) 天然のポリペプチドのシグナル伝達経
路に存在するタンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力、(2
) 天然のポリペプチドのリガンドと結合する能力、(3) 天然のポリペプチドの細
胞内標的と結合する能力、が挙げられる。その他の活性として、(1) 細胞増殖を
モジュレート（調節）する能力、(2) 細胞分化をモジュレートする能力、(3) 細
胞死をモジュレートする能力などがある。

【００１８】 一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの同
定されたドメインに対して十分に同一であるアミノ酸配列を有する。本明細書中
で用いる「十分に同一である」とは、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列が
第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して同一もしくは等価の（例えば、
類似の側鎖をもつ）アミノ酸残基またはヌクレオチドを十分数または最小数含み
、その結果として第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構
造ドメインおよび／または共通の機能的活性をもつようにすることを意味する。
例えば、約65％の同一性、好ましくは75％の同一性、より好ましくは85％、95％
または98％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオ
チド配列は、本明細書中では十分に同一であると定義される。

【００１９】 一実施形態においては、単離されたポリペプチドは膜貫通ドメインと細胞質ド
メインを両方とも欠失している。別の実施形態では、該ポリペプチドは膜貫通ド
メインと細胞質ドメインを両方とも欠失していて、生理的条件下で可溶性である
。

【００２０】 本発明のポリペプチドまたはその生理活性部分は、融合タンパク質を形成する
ことを目的として、異種アミノ酸配列に機能的に結合させることができる。本発
明はさらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のような、本発明のポリ
ペプチドと特異的に結合する抗体を特徴とする。さらに、本発明のポリペプチド
またはその生理活性部分は医薬組成物中に配合することができ、この医薬組成物
には製薬上許容される担体を加えてもよい。

【００２１】 別の態様において、本発明は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドの
活性または発現の存在を検出する方法であって、生物学的サンプルに、活性の指
示体を検出できる薬剤を接触させて、活性の存在が該生物学的サンプルにおいて
検出されるようにすることを含んでなる方法を提供する。

【００２２】 別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの活性をモジュレートす
る方法であって、細胞に、本発明のポリペプチドの活性または発現をモジュレー
トする（抑制または促進する）薬剤を接触させて、該細胞における活性または発
現がモジュレートされるようにすることを含んでなる方法を提供する。一実施形
態において、該薬剤は本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体である。

【００２３】 別の実施形態においては、該薬剤は本発明のポリペプチドをコードするmRNAの
転写、スプライシングまたは翻訳をモジュレートすることによって本発明のポリ
ペプチドの発現をモジュレートするものである。さらに別の実施形態では、該薬
剤は本発明のポリペプチドをコードするmRNAのコード鎖に対してアンチセンスで
あるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。

【００２４】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの異常な活性または本発明の核酸の異常
な発現により特徴づけられる疾患を有する被験者を治療する方法であって、本発
明のポリペプチドの活性のモジュレーターまたは本発明の核酸の発現のモジュレ
ーターである薬剤を該被験者に投与することを含んでなる方法を提供する。一実
施形態において、該モジュレーターは本発明のタンパク質である。別の実施形態
では、該モジュレーターは本発明の核酸である。他の実施形態では、該モジュレ
ーターはペプチド、ペプチドミメチック、または他の小さい分子である。

【００２５】 本発明はまた、(i) 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾ま
たは突然変異、(ii)本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の誤った調節、お
よび(iii) 本発明のポリペプチドの異常な翻訳後修飾（ただし、野性型の遺伝子
が本発明のポリペプチドの活性を有するタンパク質をコードする）のうち少なく
とも１つにより特徴づけられる遺伝子損傷または突然変異の存在または不存在を
同定するための診断アッセイを提供する。

【００２６】 別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドと結合するまたはその活
性をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。一般に、この方法は、試験
化合物の存在下および不存在下で該ポリペプチドの生物学的活性を測定し、該ポ
リペプチドの活性を改変する化合物を同定することを含む。

【００２７】 本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現をモジュレートする化
合物の同定方法であって、該化合物の存在下および不存在下で該ポリペプチドま
たは核酸の発現を測定することを含んでなる方法を特徴とする。

【００２８】 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明
らかになるであろう。

【００２９】発明の詳細な説明 本発明は、膜貫通タンパク質であるマウスおよびヒトTANGO 136をコードするc
DNA分子の発見に基づくものである。マウスおよびヒトTANGO 136の様々な特徴を
以下に要約する。

【００３０】マウスTANGO 136 マウスTANGO 136の一部をコードするcDNAは、分泌タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列を選択するスクリーニング法によって同定された。「シグナルト
ラッピング(signal trapping)」と呼ばれるこの方法の詳細な説明は、1998年５
月28日に公開されたPCT公開公報第WO98/22491号に記載されている。簡単に言う
と、リポ多糖で刺激したマウスのマクロファージより抽出したmRNAから作製した
cDNAを用いて、ランダムプライミングによるcDNAライブラリーを作製した。この
ライブラリーを作製するために、哺乳動物発現ベクターpMEAPの、分泌シグナル
を欠く胎盤アルカリホスファターゼをコードするcDNAの隣へこのcDNAを挿入した
。次に、このcDNAライブラリーを細菌中で増幅させた。次いで増幅したcDNAを単
離し、ヒト293T細胞へトランスフェクトした。28時間後、細胞上清を回収してア
ルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。トランスフェクト細胞の上清
中に検出可能なアルカリホスファターゼ活性をもたらすクローンを単離して配列
決定によってさらに分析し、新規なクローンをさらなる配列決定にかけた。

【００３１】 このようなクローンが得られれば、マウスTANGO 136が同定されたことになる
。このクローンは、1813個のヌクレオチドからなるcDNAを含む(図１、配列番号
１)。このcDNAのオープンリーディングフレーム(即ち、ヌクレオチド89〜1813(
配列番号３))は、I型膜タンパク質と推定される575個のアミノ酸をコードする(
図１、配列番号２)。翻訳停止コドンがオープンリーディングフレームの末端に
存在しないため、このcDNAは、マウスTANGO 136のカルボキシ末端部分のほとん
どをコードしていない部分的なcDNAの可能性がある。

【００３２】 シグナルペプチド予測プログラムSIGNALP (Nielsenら(1997) Protein Enginee
ring 10:1-6)より、マウスTANGO 136が、558個のアミノ酸からなる(部分)成熟タ
ンパク質(約アミノ酸18〜アミノ酸575；配列番号８)に先行する17個のアミノ酸
からなるシグナルペプチド(配列番号２のアミノ酸１〜約アミノ酸17；配列番号
７)を含むことが予測された。成熟マウスTANGO 136は、細胞外ドメイン(配列番
号２のアミノ酸18〜441；配列番号９)、膜貫通ドメイン(配列番号２のアミノ酸4
42〜462；配列番号10)、および細胞質側ドメイン(配列番号２のアミノ酸463〜57
5；配列番号11)を有する。

【００３３】 マウスTANGO 136の細胞外領域は、２つのCUB様ドメイン(配列番号２のアミノ
酸32〜86およびアミノ酸193〜306)を含む。CUBドメインは、多様な機能を有する
発生調節されたタンパク質に見られる細胞外ドメインであり、例えば、背-腹パ
ターン形成タンパク質トロイド(dorsal-ventral patterning protein tolloid)
、骨形態形成タンパク質１、精子付着因子(spermadhesin)のファミリー、補体サ
ブコンポーネントC1s/C1rおよび神経認識分子A5が挙げられる。CUBドメインの多
くは４つの保存されたシステインを含み、これらのシステインは２つのジスルフ
ィド架橋(C1-C2およびC3-C4)を形成すると考えられる(Borkら(1993) J. Mol. Bi
ol. 231:539-545)。マウスTANGO 136の第１CUB様ドメイン(アミノ酸32〜86)は２
つのシステインを含み、マウスTANGO 136の第２CUB様ドメイン(アミノ酸193〜30
6)は２つのシステインを含む。マウスTANGO 136のCUB様ドメインとCUBドメイン
のコンセンサス配列とのアライメントを図８に示す。

【００３４】 図２には、マウスTANGO 136の一部のヒドロパシープロットを示す。比較的疎
水性の残基は水平線の上方に位置し、比較的親水性の残基は水平線の下方に位置
する。システイン残基(cys)と潜在的なN-グリコシル化部位(Ngly)は、ヒドロパ
シートレースの真下に短い垂直線で示す。

【００３５】ヒトTANGO 136 上述のマウスTANGO 136 cDNAを使用してヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリー
ニングし、TANGO 136をコードするヒト・クローンを同定した。このスクリーニ
ングによって同定された１個のクローンを完全に配列決定した。このヒトTANGO
136 cDNA(図４；配列番号４)は、713個のアミノ酸からなる推定I型膜貫通タンパ
ク質(図４；配列番号５)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号
４のヌクレオチド541〜2679；配列番号６)を含む。

【００３６】 シグナルペプチド予測プログラムSIGNALP(Nielsenら(1997) Protein Engineer
ing 10:1-6)より、ヒトTANGO 136が、697個のアミノ酸からなる成熟タンパク質(
配列番号５の約アミノ酸17〜アミノ酸713；配列番号15)に先行する16個のアミノ
酸からなるシグナルペプチド(配列番号５のアミノ酸１〜約アミノ酸16；配列番
号14)を含むことが予測された。ヒトTANGO 136は、細胞外ドメイン(配列番号５
のアミノ酸17〜440；配列番号16)、膜貫通ドメイン(配列番号５のアミノ酸441〜
461；配列番号17)、および細胞質側ドメイン(配列番号５のアミノ酸462〜713；
配列番号18)を有する。

【００３７】 ヒトTANGO 136をコードするクローンであるpT136を、American Type Culture
Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)へ1998年
９月11日付けで寄託し、受託番号98880を受けた。この寄託は、特許手続上の微
生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約で規定される期間維持されるもの
である。この寄託は、当業者に対する利便性を考慮して行われたに過ぎず、35 U
.S.C.§112によって寄託が要求されることを認めるものではない。

【００３８】 ヒトTANGO 136の細胞外領域は、２つのCUB様ドメイン(配列番号５のアミノ酸3
1〜136およびアミノ酸192〜305)を含む。ヒトTANGO 136のCUB様ドメインは双方
とも、２つのシステインを含む。ヒトTANGO 136のCUB様ドメインとCUBドメイン
のコンセンサス配列とのアライメントを図９に示す。

【００３９】 ヒトTANGO 136の細胞外領域には、４つのLDL受容体クラスＡドメイン(配列番
号５のアミノ酸138〜176、アミノ酸328〜355、アミノ酸380〜398、およびアミノ
酸399〜435)も含まれる。LDL受容体クラスＡドメインは、約40個のアミノ酸から
なるシステインに富むドメインであり、LDL受容体およびLDL受容体ファミリーの
他のメンバーに見られる。このドメインの反復は、リガンドの結合に関与すると
考えられる(Yamamotoら(1984) Cell 39:27-38;およびFassら(1997) Nature 388:
691-693)。ヒトTANGO 136のアミノ酸380〜398にわたるLDL受容体クラスＡドメイ
ンは、他の３つのLDL受容体クラスＡドメインに比べて、コンセンサスLDL受容体
Ａ型ドメインに対して比較的弱い相同性を有する。ヒトTANGO 136のLDL受容体ク
ラスＡドメインとLDL受容体クラスＡドメインのコンセンサス配列とのアライメ
ントを図10に示す。

【００４０】 図４には、ヒトTANGO 136のヒドロパシープロットを示す。比較的疎水性の残
基は水平線の上方に位置し、比較的親水性の残基は水平線の下方に位置する。シ
ステイン残基(cys)と潜在的なN-グリコシル化部位(Ngly)は、ヒドロパシートレ
ースの真下に短い垂直線で示す。

【００４１】 成熟ヒトTANGO 136の推定分子量(MW)は76.7kDaであり(未成熟ヒトTANGO 136の
場合には78.4kDa)、翻訳後修飾は含まない。

【００４２】 ヒトTANGO 136は14番染色体のD14S283の近くに位置する。

【００４３】 ヒトTANGO 136に対して相同性を有するタンパク質を同定するために、ヒトTAN
GO 136のアミノ酸配列(配列番号５)を使用して、公共のデータベースを検索した
(BLASTPを利用；Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。この分析によ
って、マウスおよびヒトの双方のTANGO 136が、ヒトLDL受容体関連タンパク質LR
p105/LRP-3に対してかなりの相同性を有することが判明した(Ishiiら(1998) Gen
omics 51:132-135)。図５には、マウスTANGO 136、ヒトTANGO 136、ヒトLRp105/
LRP-3、およびラットLrp105/LRP-3のアミノ酸配列のアライメントを示す。

【００４４】 MyersおよびMillerのアルゴリズム((1988) CABIOS 4:11-17; PAM120スコア行
列、-12ギャップ開始ペナルティ、-4ギャップ延長ペナルティ)を使用して比較を
行うと、マウスTANGO 136はヒトLRp105/LRP-3に対して34.4％同一であり、ラッ
トLRp105/LRP-3に対して34％同一であり、ヒトTANGO 136はヒトLRp105/LRP-3に
対して38％同一であり、ラットLrp105/LRP-3に対して37.6％同一であり、ヒトTA
NGO 136はマウスTANGO 136に対して72.6％同一である。

【００４５】 完全長ヒトTANGO 136ヌクレオチド配列は、マウスTANGO 136部分ヌクレオチド
配列に対して86.1％同一である(FASTAバージョン2.0u53；Pearson and Lipman (
1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444-2448)(図６)。完全長ヒトTANGO 136
アミノ酸配列は、マウスTANGO 136部分アミノ酸配列に対して90.8％同一である(
FASTAバージョン2.0u53；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl Acad. Sci. U
SA 85:2444-2448)(図７)。図７に示すように、タンパク質ドメイン構造(上述)は
ヒトおよびマウスのタンパク質間で高度に保存されている。

【００４６】 レーン当たり２μgのポリA＋RNAを含むヒト多重組織ノーザン(multiple tissu
e northern; MTN)ブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を、マウスTANGO 136 cDN
Aプローブを用いて検出した。この分析より、TANGO 136 mRNAが、脾臓、前立腺
、子宮、末梢血白血球、心臓、胎盤、腎臓および膵臓で比較的高度に発現される
ことが判明した。この分析からは、TANGO 136 mRNAが、レベルは若干低いものの
、胸腺、精巣、結腸、肺、肝臓および骨格筋で発現されることも判明した。TANG
O 136核酸、TANGO 136ポリペプチド、TANGO 136アゴニスト、およびTANGO 136ア
ンタゴニストを使用して、TANGO 136が発現される組織の活動をモジュレートす
ることができ、その結果これらの組織の障害を治療することができる。例えば、
TANGO 136は前立腺および精巣で発現されるため、精子形成に関与する可能性が
ある。

【００４７】TANGO 136核酸、TANGO 136ポリペプチド、およびTANGO 136アゴニストまたはア
ンタゴニストの使用 TANGO 136とLRp105/LRP-3との相同性のため、TANGO 136は、低密度リポタンパ
ク質受容体ファミリーのメンバーであると推定され、このファミリーにはLDLR、
LRP-2(megalin/gp330)、LRP-3(LRp105)、LRP-5、LRP-6およびLR8Bが含まれる。
このファミリーのメンバーは、血液循環および細胞外腔からリガンドを結合およ
びインターナリゼーションする細胞内取込み受容体(endocytic receptor)である
。TANGO 136は低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーであると推定
されるため、低密度リポタンパク質受容体ファミリーの他のメンバーと同様の機
能を果たすことができる。

【００４８】 LDLRは、表面上にアポリポタンパク質Ｂ-100(アポＢ-100)またはアポＥを含む
血漿リポタンパク質と結合する。LDLRは、これらのリポタンパク質の取込みにと
って重要であり、LDLRに突然変異が起これば、家族性高コレステロール血症(コ
レステロールに富むLDLが血漿中に高レベルで含まれることを特徴とする障害)の
原因となる。家族性高コレステロール血症に罹患した患者の血漿コレステロール
レベルの上昇は、アテローム性動脈硬化に至り、心筋梗塞の危険性が高くなる。
TANGO 136は、リポタンパク質の代謝および輸送の異常、例えば、アテローム性
動脈硬化等の心血管疾患において作用する。従って、TANGO 136核酸、TANGO 136
ポリペプチド並びにTANGO 136アンタゴニストおよびアゴニストは、リポタンパ
ク質の代謝および輸送の異常、例えば、アテローム性動脈硬化等の心血管疾患を
治療するのに有用である。

【００４９】 in vitroでの研究では、LRP-2が、アポＥに富む超低密度リポタンパク質(Will
nowら(1992) J. Biol. Chem. 267:26172-26180)、ウロキナーゼプラスミノーゲ
ンアクチベーターとプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1との複合体
(tPA:PAI-1；Willnowら,前掲)、リポタンパク質リパーゼ(Willnowら,前掲)およ
びラクトフェリンを含む多数の異なるリガンドを結合し、これらの細胞内取込み
を媒介し得ることが判明している。RAPとして知られる受容体関連タンパク質(Or
landoら(1992) Proc. Natl Acad. Sci. 89:6698-6702)は、これらのリガンドがL
RP-2へ結合するのを阻害する。これらのリガンドの一部または全部がTANGO 136
と結合し得る。従って、TANGO 136核酸、TANGO 136ポリペプチド、TANGO 136ア
ンタゴニストおよびTANGO 136アゴニストは、凝固障害の治療、例えば、血栓形
成の抑制または血栓の溶解に有用である。

【００５０】 LRP-2に対する生理学的に関連のある特定のリガンドのいくつかが同定されて
おり、以下のものが挙げられる：アポリポタンパク質Ｊ(アポＪ)／クラスタリン
(Kounnasら(1995) J. Biol. Chem. 22:13070-13075)およびチログロブリン(Zhen
gら(1998) Endocrinology 139:1462-1465)。アポＪは、アルツハイマー前駆体タ
ンパク質のβA4ペプチド、高密度リポタンパク質のサブクラス、および補体膜傷
害性複合体C5-C9(Kounnasら,前掲)といった複数のタンパク質に結合すると報告
されている。これらおよび他の分子と複合体化したアポＪのクリアランスは、LR
P-2を介して生じるものと予想される。従って、LRP-2は、これらの複合体のクリ
アランスにおいて機能上重要な役割を果たす可能性がある。例えば、LRP-2は、
クリアランスの標的であるリポタンパク質に対して機能したり、アポＪ／C5b-C9
複合体のクリアランスによって補体膜C5b-C9の細胞溶解活性を阻害したりするこ
とが可能である。LRP-2がアポＪ／アミロイドβ複合体に結合できるという事実
からは、LRP-2がアルツハイマー病の病理学的な発生過程の調節に関与している
可能性が示唆される。アルツハイマー病におけるLRP-2の役割は、アポＪ／アミ
ロイドβ複合体の血液脳関門を通過する輸送にLRP-2が関与している可能性を示
す他の研究によっても裏付けられる(Zlokovicら(1996) Proc. Natl Acad. Sci.
93:4229-4234)。従って、TANGO 136核酸、TANGO 136タンパク質、TANGO 136アゴ
ニスト、およびTANGO 136アンタゴニストは、アルツハイマー病や他の神経変性
障害、例えば、ハンティングトン病およびパーキンソン病の治療に有用である。

【００５１】 LRP-2は、甲状腺ホルモンの放出をもたらすチログロブリンのエンドサイトー
シスに関与している(Zhengら(1998) Endocrinolgy 139:1462-65)。TANGO 136も
また、甲状腺ホルモンの放出調節に関与している可能性がある。従って、TANGO
136核酸、TANGO 136タンパク質、TANGO 136アゴニスト、およびTANGO 136アンタ
ゴニストは、甲状腺疾患、例えば、甲状腺ホルモンの放出異常の治療に有用であ
る。

【００５２】 LRP-2はまた、薬剤受容体として作用すると推定され、多塩基薬剤(例えば、ア
プロチニン、アミノ配糖体およびポリミキシンＢ)の取込みに関与すると考えら
れる。多塩基薬剤の取込みは毒性が強い場合があり、例えば、アミノ配糖体の投
与では腎毒性や聴器毒性を伴うことが多い。TANGO 136もまた、多塩基薬剤の取
込みを媒介し得、TANGO 136核酸、TANGO 136タンパク質、TANGO 136アゴニスト
、およびTANGO 136アンタゴニストはこのような薬剤の取込みをモジュレートす
るのに有用である。TANGO 136を使用して、このような薬剤の毒性を減じたもの
を設計することもできる。

【００５３】 さらに、LRP-2は、ヒト膜性ネフロパシーに似た、自己免疫性糸球体疾患であ
るヘイマン腎炎ネフロパシー(HN)の病理学的な発生過程に関与する。LRP-2は、
主要な病原性抗原であり、糸球体基底膜と糸球体上皮細胞の足突起（foot proce
ss)との間で抗原-抗体複合体を形成すると考えられる。抗原-抗体複合体が存在
すると、基底膜が大規模に損傷され、蛋白尿症となる(Farquharら(1994) Ann. N
.Y. Acad. Sci. 97-106)。LRP-2と同様、TANGO 136も、自己免疫性糸球体疾患に
おいて病因として作用する可能性がある。従って、TANGO 136核酸、TANGO 136タ
ンパク質、TANGO 136アゴニスト、およびTANGO 136アンタゴニストは、自己免疫
性糸球体疾患の治療に有用である。

【００５４】 LRP-5およびLRP-6は、エンドサイトーシスにおいて機能すると考えられる。遺
伝的な証拠に基づくと、LRP-5およびおそらくLRP-6は、I型糖尿病の分子病理学
的な発生過程において作用すると考えられる(Brownら(1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 248:879-888)。TANGO 136もまた、Ｉ型糖尿病において作用する可
能性がある。従って、TANGO 136核酸、TANGO 136タンパク質、TANGO 136アゴニ
スト、およびTANGO 136アンタゴニストはＩ型糖尿病の治療に有用である。

【００５５】 LR8Bは脳で発現され、脳特異的脂質輸送に関与する可能性がある。脳特異的脂
質輸送は、アルツハイマー病に関連するアポE4を伴う可能性がある。TANGO 136
もまた、脳特異的脂質輸送に関与する可能性があり、TANGO 136核酸、TANGO 136
タンパク質、TANGO 136アゴニスト、およびTANGO 136アンタゴニストは、アルツ
ハイマー病の治療に有用である。

【００５６】 一般に、TANGO 136核酸、TANGO 136タンパク質、TANGO 136アゴニスト、およ
びTANGO 136アンタゴニストは、神経障害、例えば、神経変性障害や神経精神障
害の治療に有用で有り得る。神経変性障害の例としては、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、およびハンティングトン病が挙げられる。神経精神障害の例とし
ては、精神分裂病、注意欠陥障害、単極性(unipolar)情動障害、双極性(bipolar
)情動障害(例えば、重症な双極性情動障害(BP-I)および軽躁病と大鬱病を伴う双
極性情動障害(BP-II))、並びに分裂情動性障害が挙げられる。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【表２】

【００５９】 以下の小節では、本発明の各種態様をさらに詳細に説明する。

【００６０】Ｉ．単離された核酸分子 本発明の態様の１つは、本発明のポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性
な部分をコードする単離された核酸分子と、それに加えて、ハイブリダイゼーシ
ョン・プローブとして用いて本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定
するのに十分な核酸分子、およびそのような核酸の断片であって核酸分子の増幅
または突然変異のために PCRプライマーとして用いるのに適する断片に関する。
本明細書で用いられる場合、「核酸分子」という用語はDNA分子（例えば、cDNA
またはゲノムDNA）およびRNA分子（例えば、mRNA）並びにヌクレオチド類似体を
用いて生成される、DNAまたはRNAの類似体を含むことが意図されている。この核
酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAであ
る。

【００６１】 「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然起源中に存在する他の核酸分子か
ら分離されているものである。「単離された」核酸分子は、その核酸分子が由来
する生物のゲノムDNAにおいて、その核酸分子に自然状態で隣接する配列（好ま
しくはタンパク質をコードする配列）（すなわち、その核酸の5’および3’末端
に位置する配列）を伴わない。例えば、様々な実施形態において、単離された核
酸分子は、その核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいて、その核酸分子に
自然状態で隣接するヌクレオチド配列を約5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kBまた
は0.1kB未満含むことができる。さらに、「単離された」核酸分子、例えばcDNA
分子は、組換え技術によって産生された場合には他の細胞形質成分もしくは培養
培地を実質的に伴わず、化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の
化学物質を実質的に伴わない。

【００６２】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列
またはATCC 98880のcDNA、またはそれらの相補体を含む核酸分子は、標準的な分
子生物学的技術および本明細書に提供される配列情報を用いて単離することがで
きる。配列番号1、3、4、もしくは6の核酸配列またはATCC 98880のcDNAの全ても
しくは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いることで、標準的なハ
イブリダイゼーションおよびクローン化技術（例えば、Sambrookら編、 Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spiring Harbor Laboratory
, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY, 1989 に記
載されるもの）を用いて本発明の核酸分子を単離することができる。

【００６３】 本発明の核酸分子は、テンプレートとしてのcDNA、mRNAまたはゲノムDNAおよ
び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的なPCR増幅技術に従って
増幅することができる。そのようにして増幅した核酸は、適切なベクターにクロ
ーン化し、DNA配列分析によって特性評価することができる。さらに、標準的な
合成技術により、例えば、自動DNA合成装置を用いて、本発明の核酸分子の全て
または一部に相当するオリゴヌクレオチドを作製することができる。

【００６４】 別の実施形態においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1、3、4
、もしくは6のヌクレオチド配列、またはATCC 98880のcDNA、またはそれらの一
部の相補体である核酸分子を含む。所定のヌクレオチド配列に相補的である核酸
分子とは、その所定のヌクレオチド配列に対して十分に相補的で、所定のヌクレ
オチド配列にハイブリダイズして、それにより安定な二重らせんを形成すること
が可能であるものである。

【００６５】 さらに、本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸
配列の一部、例えば、プローブもしくはプライマーとして用いることができる断
片、または本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする断片のみ
を含んでいてもよい。ある遺伝子をクローン化することから決定されるヌクレオ
チド配列は、他の細胞型（例えば他の組織に由来する）における相同体はもちろ
ん、他の哺乳動物に由来する相同体の同定および／またはクローン化において用
いるために設計されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。このプロ
ーブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含
む。このオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号1、3、4、もしくは6、ま
たはATCC 98880のcDNA、あるいは配列番号1、3、4、もしくは6またはATCC 98880
のcDNAの天然変異体、のセンスもしくはアンチセンス配列の少なくとも12個、好
ましくは約25個、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、30
0、350もしくは400個の連続ヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。

【００６６】 本発明の核酸分子の配列に基づくプローブは、選択された核酸分子によってコ
ードされるものと同じタンパク質分子をコードする、転写体またはゲノム配列の
検出に用いることができる。このプローブは、それに結合する標識基、例えば、
放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含む。このようなプロー
ブは、例えば、被験者に由来する細胞サンプルにおけるそのタンパク質をコード
する核酸分子の濃度を測定することにより、例えば、mRNAの濃度を検出するか、
またはそのタンパク質をコードする遺伝子が変異を受けたり欠失したりしている
かどうかを決定することにより、タンパク質を誤って発現する（mis-express）
細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いることができ
る。

【００６７】 本発明のポリペプチドの「生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号3もしくは6の一部、ま
たはATCC 98880のcDNAのヌクレオチド配列を単離し、そのポリペプチドタンパク
質のコードされた部分を発現させ（例えば、in vitroでの組換え発現により）、
ポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することによって調製することが
できる。

【００６８】 本発明は、さらに、遺伝子暗号の縮重のために配列番号1、3、4、もしくは6の
ヌクレオチド配列またはATCC 98880のcDNAとは異なり、したがって、配列番号3
もしくは6のヌクレオチド配列またはATCC 98880のcDNAによってコードされるも
のと同じタンパク質をコードする核酸分子を包含する。

【００６９】 配列番号3および6のヌクレオチド配列並びにATCC 98880のcDNAに存在するヌク
レオチド配列に加えて、アミノ酸配列の変化につながるDNA配列の多型が、ある
集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを当業者は認めるであろう。この
ような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子変異のために特定の集団内の個体間に存
在し得る。対立遺伝子は所定の遺伝子座で代わりに生じる遺伝子群のうちの1つ
である。本明細書で用いられる場合、「対立遺伝子変異体”という用語は、所定
の遺伝子座に生じるヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列によってコー
ドされるポリペプチドを指す。本明細書で用いられる場合、「遺伝子」および「
組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープン・リ
ーディング・フレームを含む核酸分子を指す。このような天然の対立遺伝子変異
は、典型的には、所定の遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％の変化を生じ得る。
他の対立遺伝子は、幾体かの異なる個体において目的の遺伝子の配列を決定する
ことによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブ
を用いて様々な個体において同じ遺伝子座を同定することによって容易に行うこ
とができる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、かつ機能的活性を変化させる
ことがない、そのようなヌクレオチド変異およびその結果生じるアミノ酸多型も
しくは変異の全てが本発明の範囲内にあることが意図される。

【００７０】 さらに、他の種（同族）に由来する本発明のタンパク質をコードし、本明細書
に記載されるヒトタンパク質とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が、
本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のcDNAの天然の対立遺伝子変異
体および相同体に相当する核酸分子を、本明細書に開示されるヒト核酸分子との
それらの同一性に基づき、ヒトcDNAまたはそれらの一部をハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用い、標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ストリ
ンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で単離することができる。例えば、
本発明の膜結合タンパク質の可溶性形態をコードするcDNAが、膜結合形態の全て
または一部をコードする核酸分子へのそのハイブリダイゼーションに基づいて単
離された。同様に、膜結合形態をコードするcDNAを、可溶性形態の全てまたは一
部をコードする核酸分子へのそのハイブリダイゼーションに基づいて単離するこ
とができる。

【００７１】 したがって、別の実施形態においては、本発明の単離された核酸分子は少なく
ともヌクレオチド300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、7
00、800、900、1000、もしくは1290）個の長さであり、ストリンジェント条件下
で、配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列、好ましくはコーディング
配列、またはATCC 98880のcDNA、またはそれらの相補体を含む核酸分子にハイブ
リダイズする。

【００７２】 本明細書で用いられる場合、「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする
」という用語は、互いに少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75％）同一で
あるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄の条件を述べることが意図されている。そのようなストリン
ジェント条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology
, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 に見出すことができる。スト
リンジェント・ハイブリダイゼーション条件の非制限定的な例は、6×塩化ナト
リウム／クエン酸ナトリウム（SSC）における約45℃でのハイブリダイゼーショ
ン、次いで0.2×SSC、0.1％SDSでの50〜65℃での1回以上の洗浄である。好まし
くは、ストリンジェント条件下で配列番号1、3、4、もしくは6の配列、またはAT
CC 98880のcDNA、またはそれらの相補体にハイブリダイズする本発明の単離され
た核酸分子は、天然に生じる核酸分子に相当する。本明細書で用いられる場合、
「天然に生じる」核酸分子は自然状態で生じるヌクレオチド配列を有する（例え
ば、天然タンパク質をコードする）RNAまたはDNA分子を指す。

【００７３】 集団内に存在し得る本発明の配列の核酸分子の天然に生じる対立遺伝子変異体
に加えて、突然変異によって変異を導入し、それによりコードされるタンパク質
のアミノ酸配列にそのタンパク質の生物学的活性を変更させることなく変化を導
くことが可能であることを、当業者はさらに理解するであろう。例えば、「非必
須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながる、ヌクレオチド置換を行うことが
できる。「非必須」アミノ酸残基は生物学的活性を変更することなく野生型配列
から変更することができる残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基は生
物学的活性に必要である。例えば、様々な種の間で保存されることがなく、また
は半保存される（semi-conserved）のみであるアミノ酸残基は活性にとって非必
須である可能性があり、したがって、適当な変更の標的となる。あるいは、様々
な種（例えば、マウスおよびヒト）の相同体の間で保存されるアミノ酸残基は活
性に必須である可能性があり、したがって、適当な変更の標的とはならない。

【００７４】 したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基に変化を
有する本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなポリペ
プチドはアミノ酸配列が配列番号2、5、8、もしくは15とは異なるものの、生物
学的活性を保持する。ある実施形態において、単離された核酸分子には、配列番
号2、5、8、もしくは15のアミノ酸配列と少なくとも約45％同一、65％、75％、8
5％、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列が含まれる。

【００７５】 変異体タンパク質をコードする単離された核酸分子を、1つ以上のアミノ酸の
置換、追加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、１つ以上
のヌクレオチドの置換、追加または欠失を配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレ
オチド配列、またはATCC 98880のcDNAに導入することによって作製することがで
きる。突然変異は標準技術、例えば、部位特異的突然変異誘発およびPCR介在突
然変異誘発によって導入することができる。好ましくは、保存性のアミノ酸置換
を１つ以上の推定非必須アミノ酸残基で行う。「保存性のアミノ酸置換」は、該
アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸で置換されるものである。類似の側
鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。
これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン
、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側
鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、
チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸
が含まれる。あるいは、例えば飽和突然変異誘発（saturation mutagenesis）に
より、変異をコーディング配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入すること
ができ、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持
する変異体を同定することができる。突然変異誘発に続いて、コードされるタン
パク質を組換え法により発現させることができ、そのタンパク質の活性を決定す
ることができる。

【００７６】 ある実施形態においては、本発明のポリペプチドの変異体である変異体ポリペ
プチドを、（1）本発明のポリペプチドのシグナル伝達経路におけるタンパク質
とタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（2）本発明のポリペプチ
ドのリガンドを結合する能力；または（3）本発明のポリペプチドの細胞内標的
タンパク質に結合する能力についてアッセイすることができる。さらに別の実施
形態においては、この変異体ポリペプチドを、細胞増殖または細胞分化をモジュ
レートする能力についてアッセイすることができる。

【００７７】 本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のポリペプチドをコード
するセンス核酸に対して相補的である分子、例えば、二本鎖cDNA分子のコーディ
ング鎖に対して相補的であり、またはmRNA配列に対して相補的である分子を包含
する。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる
。アンチセンス核酸は、コーディング鎖全体に対して、またはそれらの一部だけ
に対して、例えば、タンパク質コーディング領域（すなわち、オープン・リーデ
ィング・フレーム）の全てまたは一部に対して相補的であり得る。アンチセンス
核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディン
グ鎖の非コーディング領域の全てまたは一部に対してアンチセンスであり得る。
これらの非コーディング領域（「5’および3’非翻訳領域”）はコーディング領
域に隣接する5’および3’配列であり、アミノ酸には翻訳されない。

【００７８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約5、10、15、20、25、3
0、35、40、45または50ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は
、当該技術分野において公知の手順を用いる化学合成および酵素ライゲーション
反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アン
チセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、またはその分子の生物
学的安定性を高めるように、もしくはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成
される二重鎖の物理学的安定性を高めるように設計される、様々に修飾されたヌ
クレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオ酸誘導
体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸
の生成に用いることができる修飾ヌクレオチドの例には、5−フルオロウラシル
、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチ
ン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−（カルボキシヒドロキシルメチル）
ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキ
シメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルキュ
ーオシン(beta-D-galactocylqueosine)、イノシン、N6−イソペンテニルアデニ
ン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2，2−ジメチルグアニン、2−メ
チルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N
6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキ
シアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン、5’−メ
トキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−
イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン（
wybutoxosine）、シュードウラシル（pseudouracil）、キューオシン、2−チオ
シトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、
5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−
オキシ酢酸（v）、5−メチル−2−チオウラシル、3−（3−アミノ−3−Ｎ−2−
カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、および2，6−ジアミノプリンが含
まれる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクロー
ン化されている発現ベクターを用いて生物学的に生成させることができる（すな
わち、挿入された核酸から転写されたRNAが目的の標的核酸に対してアンチセン
ス方向のものである。以下の分節でさらに説明）。

【００７９】 本発明のアンチセンス核酸分子を、典型的には、選択された本発明のポリペプ
チドをコードする細胞mRNAおよび／またはゲノムDNAとそれらがハイブリダイズ
もしくは結合させることにより、例えば転写および／または翻訳を阻害すること
によって発現を阻害するように被験体に投与するか、またはin situで生成させ
る。このハイブリダイゼーションは安定な二重鎖を形成する通常のヌクレオチド
相補性によるものであってもよく、または、例えば、DNA二重鎖に結合するアン
チセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主な溝における特異的相互作用によ
るものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には組織
部位での直接注射が含まれる。あるいは、選択された細胞を標的とするようにア
ンチセンス核酸分子を修飾し、その後全身投与することもできる。例えば全身投
与のために、アンチセンス分子を、それらが選択された細胞の表面に発現する受
容体または抗原に特異的に結合するように、例えば、そのアンチセンス核酸分子
を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させること
によって修飾することができる。また、これらのアンチセンス核酸分子は本明細
書に記載されるベクターを用いて細胞に送達することもできる。これらのアンチ
センス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強
力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に配置されているようなベクタ
ー構築物が好ましい。

【００８０】 本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子であってよい。α-アノ
マー核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは
、普通のβ-ユニットとは反対に、鎖は互いに平行に延びている(Gaultierら、(1
987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチ
ルリボヌクレオチド(Inoueら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)また
はキメラRNA-DNA類似体(Inoueら、(1987) FEBS Lett. 215:327-330)からなって
いてもよい。

【００８１】 本発明はリボザイムをも包含する。リボザイムはリボヌクレアーゼ活性を有す
る触媒RNA分子であって、これらと相補的な領域を有する一本鎖核酸、たとえばm
RNAを切断することができる。このように、リボザイム（たとえば、ハンマーヘ
ッドリボザイム(HaselhoffおよびGerlach (1988) Nature 334:585-591に記載さ
れている)）を用いてmRNA転写物を触媒的に切断することにより、mRNAによりコ
ードされたタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明のポリペプチドを
コードする核酸分子に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されたcDNA
のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。たとえば、活性部位のヌ
クレオチド配列が、Cechらの米国特許第4,987,071号およびCechらの米国特許第5
,116,742号において切断されたヌクレオチド配列と相補的であるような、テトラ
ヒメナL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。あるいは、本発明のポリ
ペプチドをコードするmRNAは、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活
性を有する触媒RNAを選択するために用いることができる。たとえば、Bartelお
よびSzostak (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。

【００８２】 本発明は、三重らせん構造を形成する核酸分子をも包含する。たとえば、本発
明のポリペプチドの発現を、そのポリペプチド（たとえば、プロモーターおよび
/またはエンハンサー）をコードする遺伝子の調節領域に相補的なヌクレオチド
配列を標的として標的細胞における遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成
することによって阻害することができる。一般的には、Helene (1991) Anticanc
er Drug Des. 6(6):569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36;
およびMaher (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照されたい。

【００８３】 さまざまな実施形態において、本発明の核酸分子は、たとえば安定性、ハイブ
リダイゼーション、または分子の溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分ま
たはリン酸骨核を修飾することができる。たとえば、核酸のデオキシリボースリ
ン酸骨核をペプチド核酸を生成するように修飾することができる（Hyrupら、(19
96) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23)参照）。本明細書において
、「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、核酸擬似物、たとえば、デオ
キシリボースリン酸骨核が擬ペプチド骨核によって置き換えられ、４つの天然の
核塩基のみが残ったDNA擬似物を指す。PNAの中性の骨核は、イオン強度が低い条
件下において、DNAおよびRNAに対する特異的なハイブリダイゼーションを可能に
することが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら、(1996) 前掲、Per
ry-O'Keefeら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載される
ような標準的な固相ペプチド合成のプロトコールを用いておこなうことができる
。

【００８４】 PNAは治療および診断に利用することができる。たとえば、PNAは、たとえば転
写あるいは翻訳停止の誘導または複製の阻害により、遺伝子の発現の配列特異的
調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン試薬として用いることができる。
PNAはまた、たとえば、PNAに向けたPCRクランピング(clamping)等による遺伝子
中の一塩基対変異の分析に、他の酵素、たとえばS1ヌクレアーゼ（Hyrup (1996)
、前掲）と組み合わせて用いる場合の人工制限酵素として、またはDNA配列およ
びハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup (1996)、
前掲、Perry-O'Keefeら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675)用
いることができる。

【００８５】 別の実施形態において、PNAは、たとえばその安定性または細胞への取り込み
を増大させるために、親油性のあるいは他の補助基をPNAにつけることにより、P
NA-DNAキメラを形成することにより、またはリポソームあるいは他の当業者に公
知の薬物送達技術を用いることにより、修飾することができる。たとえば、PNA-
DNAキメラは、PNAとDNAの有益な性質を合わせ持つように生成させることができ
る。このようなキメラはDNA認識酵素、たとえばRNAアーゼHおよびDNAポリメラー
ゼにDNA部分との相互作用を可能にする一方で、PNA部分は高い結合親和性および
特異性を与える。PNA-DNAキメラは、塩基の積み重ね、核塩基の間の結合の数、
および配向の観点から選択された適当な長さのリンカーを用いて連鎖することが
できる(Hyrup (1996)、前掲)。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup (1996)、前掲、
およびFinnら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:3357-63の記載に従って実施する
ことができる。たとえば、DNA鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化
学および修飾されたヌクレオシド類似物を用いて固体の支持体上で合成すること
ができる。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダ
イトのような化合物を、PNAとDNAの5'末端の間の連結に用いることができる(Mag
ら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88)。次いで、PNAモノマーを１つずつ
結合させて、5' PNAセグメントおよび3' DNAセグメントを有するキメラ分子を製
造する(Finnら、(1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63)。あるいは、キメ
ラ分子は、5' DNAセグメントおよび3' PNAセグメントを有するように合成するこ
ともできる(Peterserら、(1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)
。

【００８６】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（たとえば、in viv
oで宿主細胞の受容体を標的とするために）、または細胞膜(たとえば、Letsinge
rら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitreら、(1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT公開番号WO 88/09810参照)あるい
は血液-脳関門(たとえば、PCT公開番号 WO 89/10134参照）を通過する輸送を促
進する試薬のような他の付加基を含んでいてよい。さらに、オリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーションに誘発される切断試薬（たとえば、Krolら、(1988)
Bio/Techniques 6:958-976参照）または挿入剤（たとえば、Zon (1988) Pharm.
Res. 5:539-549参照）によって修飾されてもよい。この末端において、オリゴ
ヌクレオチドは別の分子、たとえばペプチド、ハイブリダイゼーションに誘発さ
れる架橋試薬、輸送試薬、ハイブリダイゼーションに誘発される切断試薬等とコ
ンジュゲートしていてもよい。

【００８７】II. 単離されたタンパク質および抗体 本発明の１つの態様は、単離されたタンパク質およびその生物活性部分、およ
び本発明のポリペプチドに対する抗体を作る免疫原としての使用に適したポリペ
プチド断片に関する。１つの実施形態において、標準的なタンパク質精製技術を
用いた適当な精製スキームによって、材料となる細胞または組織から天然のポリ
ペプチドを単離することができる。別の実施形態において、本発明のポリペプチ
ドは組換えDNA技術によって製造される。組換え体の発現に代えて、本発明のポ
リペプチドは標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することもできる
。

【００８８】 「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物活性部分は、
このタンパク質を取り出した材料の細胞あるいは組織に由来する細胞物質または
他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学的に合成された場合には化
学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まな
い」という表現は、タンパク質を単離または組換えにより製造するために用いた
細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているようなタンパク質標品を含む。
ここで、細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、異種タンパク質（本明細
書において「混入タンパク質」と呼ぶこともある）を約30%、20%、10%、または5
%未満（乾燥時の重量で）含むタンパク質標品が含まれる。タンパク質またはそ
の生物活性部分が組換えにより製造された場合にも、実質的に培地を含まない、
すなわち、培地がタンパク質標品の体積の約20%、10%、または5%未満しか含まれ
ないことが好ましい。タンパク質が化学合成によって製造された場合には、化学
前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に
関与した化学前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。し
たがって、このようなタンパク質標品は、化学前駆体または目的とするポリペプ
チド以外の化合物を約30%、20%、10%、5%未満の量で（乾燥時の重量で）含む。

【００８９】 本発明のポリペプチドの生物活性部分には、完全な長さのタンパク質よりも少
ないアミノ酸を含み、対応する完全な長さのタンパク質の活性の少なくとも１つ
を示す、タンパク質のアミノ酸配列（たとえば、配列番号：２、５、８、および
15のいずれかに示すアミノ酸配列）に十分な同一性を示す、またはこれに由来す
るアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。生物活性部分は、典型的には
、対応するタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフ
からなる。本発明のタンパク質の生物活性部分は、たとえば、10、25、50、100
またはそれ以上のアミノ酸の長さを有するポリペプチドであってよい。さらに、
タンパク質の他の領域が欠失した他の生物活性部分は、組換え技術によって調製
することができ、本発明のポリペプチドの天然型の機能活性の１つ以上を有する
と考えられる。

【００９０】 ポリペプチドは、配列番号：２、５、7-11、または14-18のアミノ酸配列を有
していてよい。他の有用なタンパク質は、配列番号：2、5、7-11、または14-18
のいずれかと実質的に同一で（たとえば、少なくとも約45%、好ましくは55%、65
%、75%、85%、95%、または99%）、対応する天然のタンパク質の機能活性を残し
ているが、アミノ酸配列は天然の対立変異または変異誘発のために異なっている
。

【００９１】 ２つのアミノ酸配列または二つの核酸の同一性のパーセンテージを決定するた
めに、最適の比較を目的とした配列のアライメントをおこなう（たとえば、第２
のアミノ酸または核酸配列との最適のアライメントのために第１のアミノ酸また
は核酸配列の配列中にギャップを導入する）。次に、対応するアミノ酸位または
ヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のあ
る位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドに
よって占められている場合、分子はその位置において同一である。二つの配列の
間の同一性のパーセンテージは、同一の位置の数を配列全体で割った関数である
（すなわち、同一性% = 同一の位置の数 / 位置の総数（たとえば重なり合う位
置）× 100）。一つの実施形態において、二つの配列は同じ長さである。

【００９２】 二つの配列の間の同一性のパーセンテージの決定を、数学的アルゴリズムを用
いておこなうことができる。二つの配列を比較するために利用される数学的アル
ゴリズムの好ましい例は、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87:2264-2268に記載されるアルゴリズムを、KarlinおよびAltschul (199
3) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877にしたがって修正したものである
が、これに限定されない。このようなアルゴリズムはAltschulら、(1990) J. Mo
l. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに包含される。BLASTヌ
クレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア = 100、単語の長さ(word length
) = 12を用いておこない、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るこ
とができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア = 50、単語の
長さ(word length) = 3を用いておこない、本発明のタンパク質分子と相同なア
ミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップを入れたアライメントを
得るためには、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載さ
れるように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、分子間の離れた
関係を検出する反復検索をおこなうためにPSI-Blastを用いることができる。同
上。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞ
れのプログラムのデフォールトパラメーター（たとえば、XBLASTおよびNBLAST）
を用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配列の
比較に利用される数学的アルゴリズムの他の好ましい例は、MyersおよびMiller
、(1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムであるが、これに限定されない。この
ようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウエアパッケージの一部で
あるALIGNプログラム（バージョン2.0）に包含される。アミノ酸配列を比較する
ためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120重量残基表、12のギャップ長
さペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いることができる。

【００９３】 二つの配列の間の同一性のパーセンテージを、上に記載されたものと同様の技
術を用いて、ギャップを考慮してまたは考慮せずに、決定することができる。同
一性のパーセンテージを計算する際には、正確な一致のみを数える。

【００９４】 本発明はまた、キメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において、
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわ
ち、本発明のポリペプチドと同じもの以外のポリペプチド）に作動可能に連鎖し
た本発明のポリペプチドの全体または一部（好ましくは生物活性）からなる。融
合タンパク質の中で「作動可能に連鎖した」とは、本発明のポリペプチドおよび
異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを指すこととする。
異種ポリペプチドは本発明のポリペプチドのN-末端またはC-末端に融合すること
ができる。一つの有用な融合タンパク質は、本発明のポリペプチドがGST配列のC
-末端に融合したGST融合タンパク質である。このような融合タンパク質は本発明
の組換えポリペプチドの精製を促進することができる。

【００９５】 別のの実施形態において、融合タンパク質はそのN-末端に異種シグナル配列を
含む。たとえば、本発明のポリペプチドの天然のシグナル配列を取り除き、別の
タンパク質のシグナル配列で置き換えることができる。たとえば、バキュロウイ
ルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を、異種シグナル配列として用いる
ことができる(「分子生物学における最近のプロトコール」(Current Protocols
in Molecular Biology)、Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1992)。真核生物の
異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファター
ゼ(Stratagene; La Jolla, California)の分泌配列が含まれる。さらに別の例に
おいて、有用な原核生物の異種シグナル配列には、phoA分泌シグナル（Sambrook
ら、前掲）およびタンパク質A分泌シグナル(Pharmacia Biotech; Piscataway, N
ew Jersey)が含まれる。

【００９６】 さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの全
体または一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列
と融合した免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合
タンパク質は、医薬組成物に配合し、被験体に投与して、リガンド（可溶性また
は膜結合）と細胞表面上のタンパク質（受容体）の間の相互作用を阻害し、これ
によりin vivoでのシグナル導入を抑制することができる。免疫グロブリン融合
タンパク質は、本発明のポリペプチドの同族リガンドのバイオアベイラビリティ
ーに影響を与えるために用いることができる。リガンド/受容体相互作用の阻害
は、増殖性および分化性の障害の治療、および細胞の生存の調節（たとえば、促
進または阻害）の両方に、治療上有用である。さらに、本発明の免疫グロブリン
融合タンパク質は、被験体中での本発明のポリペプチドに対する抗体の生産、リ
ガンドの精製、およびリガンドと受容体の相互作用を阻害する分子の同定のため
のスクリーニングアッセイにおいて、免疫原として用いることができる。

【００９７】 本発明のキメラおよび融合タンパク質は標準的な組換えDNA技術によって製造
することができる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含
む通常の技術によって合成することができる。あるいは、二つの連続的な遺伝子
断片の間に相補的オーバーハングを作り出すアンカープライマーを用いて遺伝子
断片のPCR増幅を実施し、これに続いて、上記のアンカープライマーをアニール
し、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成させることができる（たとえば、Ausube
lら、前掲）。さらに、すでに融合部分（たとえば、GSTポリペプチド）をコード
している多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。本発明のポリペプチド
をコードした核酸は、融合部分が本発明のポリペプチドにインフレームに結合す
るように、発現ベクターにクローン化することができる。

【００９８】 本発明のポリペプチドのシグナル配列（配列番号７または１４）を使用して、
該分泌タンパク質または他の目的のタンパク質の分泌および単離を容易にするこ
とができる。シグナル配列は、典型的には、１回以上の切断で分泌中に成熟タン
パク質から一般に切断される、疎水性アミノ酸のコアにより特徴つけられる。こ
のようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過するときに成熟タンパク質からの
シグナル配列の切断を可能とするプロセッシング部位を含む。このように、本発
明は、シグナル配列を有する上記ポリペプチド、ならび該シグナル配列自体およ
び該シグナル配列の不在下における該ポリペプチド（すなわち切断産物）に関す
る。１つの実施形態において、本発明のシグナル配列をコードする核酸配列は、
発現ベクターにおいて目的のタンパク質（例えば、本来は分泌されないタンパク
質または単離することが難しいタンパク質）に機能し得る形で結合されることが
できる。該シグナル配列は、例えば、あるタンパク質の発現ベクターを形質導入
した真核生物宿主からの該タンパク質の分泌を指令し、その後またはそれと同時
に、該シグナル配列は切断される。つぎにこのタンパク質は、細胞外培地から従
来法により簡単に精製することができる。あるいは、該シグナル配列は、精製を
容易にする配列（例えばGSTドメインを有する配列など）を用いて目的のタンパ
ク質に結合させることができる。

【００９９】 他の実施形態において、本発明のシグナル配列を使用して、調節配列（例えば
プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）を同定することができる。シ
グナル配列はペプチドの最もアミノ末端側の配列であるため、そのアミノ末端側
のシグナル配列をフランキングする核酸は、転写に影響を及ぼす調節配列である
と思われる。従って、シグナル配列の全てまたは一部をコードする核酸配列をプ
ローブとして使用して、シグナル配列およびそれらのフランキング領域を同定お
よび単離することができ、そしてこれらのフランキング領域を研究してその中の
調節要素を同定することができる。

【０１００】 また、本発明は本発明のポリペプチドの変異体にも関する。このような変異体
は、アゴニスト（模倣体（mimetics））またはアンタゴニストとして機能するこ
とができる改変されたアミノ酸配列を有する。変異体は、突然変異誘発（例えば
不連続の点突然変異またはトランケーション）により生成することができる。ア
ゴニストは、天然形の該タンパク質の生物学的活性とほぼ同じものまたはそのサ
ブセットを保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば目的
のタンパク質を含む細胞シグナルカスケードの下流または上流のメンバーに競合
的に結合することにより、天然形の該タンパク質の活性のうちの１以上を阻害す
ることができる。このように機能が制限された変異体を用いた治療により、特定
の生物学的効果を引き出すことができる。天然形の該タンパク質の生物学的活性
のサブセットを有する変異体を用いた対象の治療は、天然形の該タンパク質を用
いた治療に比べて対象に副作用を起こす可能性が低い。

【０１０１】 アゴニスト（模倣体）またはアンタゴニストとして機能する本発明のタンパク
質の変異体は、本発明のタンパク質の、例えばトランケーション変異体などの突
然変異体の組み合わせライブラリーを、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に
ついてスクリーニングすることにより、同定することができる。１つの実施形態
において、多様な変異体のライブラリーは、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発
により生成され、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。多様な変異体
のライブラリーは、例えば酵素で合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列
にライゲートして、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチド
として、或いはより大きな融合タンパク質（例えばファージディスプレイ（for
phage display））のセットとして発現可能となるように生成することができる
。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの可能性のある変異体
のライブラリーを生成するために、様々な方法を使用することができる。縮重オ
リゴヌクレオチドの合成方法は、当分野では公知である（例えばNarang(1983),
Tetrahedron 39:3; Itakura ら. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakur
a ら. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:
477を参照）。

【０１０２】 さらに、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを使用して
、変異体のスクリーニングおよびその後の選択に用いる多様なポリペプチドの集
団を作成することができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、１分子
当たりニッキングが約１回だけおこるような条件下でヌクレアーゼを用いて、目
的のコード配列の二本鎖PCR断片を処理し、この二本鎖DNAを変性させ、このDNA
を再結合して、異なるニッキング産物に由来するセンス/アンチセンス対を含み
得る二本鎖DNAを形成し、再形成された二本鎖からS1ヌクレアーゼで処理するこ
とにより一本鎖部分を除去し、そして得られた断片ライブラリーを発現ベクター
へとライゲートすることにより、作成することができる。この方法により、目的
のタンパク質の様々なサイズのN末端断片および内部断片をコードする発現ライ
ブラリーを得ることができる。

【０１０３】 当分野において、点突然変異またはトランケーションにより作成された組合せ
ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする技法、および選択された特性を
有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングする技法が幾つか
知られている。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スルー
プット分析に従った最も広く使用されている技法では、典型的に、該遺伝子ライ
ブラリーを複製可能発現ベクター中にクローニングし、この得られたベクターの
ライブラリーで適当な細胞を形質転換し、そして所望の活性の検出によりその産
物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でこの組
合せ遺伝子を発現させる。そのライブラリーの中の機能的変異体の頻度を増加さ
せる技法である再帰的集団突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis, RE
M）を該スクリーニングアッセイと共に用いて、本発明のタンパク質の変異体を
同定することができる（Arkins and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89: 7811-7815; Delgrave ら. (1993) Protein Engineering 6: 327-331）。

【０１０４】 本発明の単離したポリペプチドまたはその断片を免疫原として使用し、ポリク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体の標準的な調製法を用いて、抗体を作成
することができる。全長ポリペプチドまたはタンパク質を使用することができる
。あるいは、本発明は、免疫原として使用する抗原性ペプチド断片を提供する。
本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号２または５のアミノ酸配列の
うちの少なくとも８個（好ましくは10、15、20、または30個）のアミノ酸残基を
含み、および、該ペプチドに対して生成した抗体が該タンパク質と共に特異的な
免疫複合体を形成するように、該タンパク質のエピトープを含む。

【０１０５】 該抗原性ペプチドにより含まれる好適なエピトープは、該タンパク質の表面上
に位置する領域（例えば親水性領域）である。図２および図４は、本発明のタン
パク質の疎水性のプロットである。これらのプロットまたは同様の分析を用いて
、親水性領域を同定することができる。

【０１０６】 免疫原は典型的には、好適な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の
哺乳動物）を免疫することにより抗体を調製するために使用される。適当な免疫
原の調製物は、例えば組換え発現したポリペプチドまたは化学合成したポリペプ
チドを含み得る。該調製物は、フロイントの完全アジュバントや不完全アジュバ
ントなどのアジュバント、または同様の免疫促進剤をさらに含むことができる。

【０１０７】 従って、本発明の他の態様は、本発明のポリペプチドに対する抗体に関する。
本明細書中において使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子お
よびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、例えば本発明の
ポリペプチドなどの抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。
本発明の所与のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドに結合
するが、天然に該ポリペプチドを含むサンプル（例えば生物学的サンプルなど）
中の他の分子には殆ど結合しない分子である。イムノグロブリン分子の免疫学的
に活性な部分の例としては、該抗体をペプシンなどの酵素で処理することにより
生成することができるF(ab)断片およびF(ab’)₂断片が含まれる。本発明は、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書中で使用する
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特
定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を１種類だけ含む抗体
分子の集団を指す。

【０１０８】 ポリクローナル抗体は、上記のように、本発明のポリペプチドを免疫原として
用いて好適な対象を免疫することにより、調製することができる。免疫したその
対象中の抗体力価は、標準法（例えば固定化したポリペプチドを用いた固相酵素
免疫検定法（ELISA）などを使用する方法）により時間経過ごとにモニタリング
することができる。望ましい場合であれば、抗体分子を哺乳動物（たとえばその
血液）から単離し、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどの周知技法によりさら
に精製して、IgG画分を得ることができる。免疫後の適当な時間で、例えば特定
の抗体力価がもっとも高くなった時点で、抗体産生細胞をその対象から回収し、
例えばハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497
に最初に記載された）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor ら. (1983) Imm
unol. Today 4:72）、EBV-ハイブリドーマ技法（Cole ら. (1985), Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）、またはト
リオーマ技法（trioma technique）などの標準法により、モノクローナル抗体を
調製するために、抗体産生細胞は使用することができる。ハイブリドーマの産生
方法は、周知である（一般にはCurrent Protocols in Immunology (1994) Colig
an ら., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照）。本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッ
セイを用いて、目的のポリペプチドに結合する抗体について該ハイブリドーマ培
養上清をスクリーニングすることにより、検出される。

【０１０９】 モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、本発明の
ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、目的のポリペプチドを用いて組換
え組合せイムノグロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライ
ブラリーなど）をスクリーニングすることにより、同定および単離することがで
きる。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするため
のキットは、市販されている（例えばファルマシア社の組換えファージ抗体系、
カタログ＃27-9400-01；およびストラタジーン社のSurfZAP（商品名）ファージ
ディスプレイキット、カタログ＃240612など）。さらに、抗体ディスプレイライ
ブラリーの生成およびスクリーニングに使用するために特に適した方法および試
薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号；国際特許出願公開番号WO92/18619；
国際特許出願公開番号；WO91/17271；国際特許出願公開番号WO92/20791；国際特
許出願公開番号WO92/15679；国際特許出願公開番号WO93/01288；国際特許出願公
開番号WO92/01047；国際特許出願公開番号WO92/09690；国際特許出願公開番号WO
90/02809；Fuchs ら.（1991）Bio/Technology 9:1370-1372；Hay ら.（1992） H
um. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse ら. (1989) Science 246: 1275-1281;
Griffiths ら. (1993) EMBO J. 12:725-734に記載されている。

【０１１０】 さらに、標準的な組換DNA法を用いて作成することができる、ヒト部分と非ヒ
ト部分とを両方含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は
、本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は
、当分野で公知の組換DNA法により作成することができる。例えば、国際特許出
願公開番号WO87/02671；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；
欧州特許出願第173,494号；国際特許出願公開番号WO86/01533；米国特許第4,816
,567号；欧州特許出願第125,023号；Betterら. (1988) Science 240:1041-1043l
；Liu ら. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu ら. (1987
) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun ら. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4:214-218; Nishimura ら. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Woodら. (1985) N
ature 314:446-449;およびShawら. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-155
9; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi ら． (1986) Bio/Techniques
4:214;米国特許第5,225,539号；Janes ら. (1986) Nature 321:552-525; Verhoe
yan ら. (1988) Science 239:1534;およびBeidler ら. (1988) J. Immunol. 141
:4053-4060に記載された方法を使用することができる。

【０１１１】 ヒト患者を治療する場合は特に、完全なヒト抗体が望ましい。このような抗体
は、内因性イムノグロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができない
がヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウス
を用いて、作成することができる。このトランスジェニックマウスは、選択され
た抗原（例えば本発明のポリペプチド全体またはその一部）で通常の方法で免疫
される。この抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技法を
用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するこのヒトイムノ
グロブリン導入遺伝子は、B細胞の分化中に再配列したあと、クラススイッチお
よび体細胞突然変異を受ける。このように、このような技法を用いて、治療上有
用なIgG、IgAおよびIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を生成する
ためのこの技法の概説については、Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immu
nol.13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成
するためのこの技法、ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコールの
詳細な説明については、例えば米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号
；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,80
6号を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.(カリフォルニア州フリーモント)な
どの企業は、上記方法に似た技法を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提
供することに携わっている。

【０１１２】 選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択法（guided s
election）」と呼ばれる技法を用いて生成することができる。この方法では、選
択された非ヒトモノクローナル抗体（例えばネズミ抗体など）を使用して、同じ
エピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する（Jespers ら. (1994) B
io/technology 12:899-903）。

【０１１３】 本発明のポリペプチドに対する抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して
、例えばアフィニティークロマトグラフィーや免疫沈降法等の標準法により該ポ
リペプチドを単離することができる。さらに、該ポリペプチドの発現量および発
現パターンを評価するために、このような抗体を用いて（例えば細胞ライゼート
または細胞上清中の）該タンパク質を検出することができる。また該抗体は、臨
床検査処置、例えば所与の治療法の効力を測定するため、の一部として、組織中
のタンパク質レベルをモニターするために診断で使用することもできる。検出可
能な物質に抗体を結合させることにより、検出を容易にすることができる。検出
可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光
物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、セイヨウワサビ・ぺ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセ
チルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプ
トアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例に
は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、
ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドま
たはフィコエリトリンが含まれ、発光物質の例にはルミノールが含まれ、生物発
光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、好適
な放射性物質の例には、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓまたは³Ｈが含まれる。

【０１１４】 III．組換え発現ベクターおよび宿主細胞 本発明のもう１つの態様は、本発明のポリペプチド（またはその部分）をコー
ドする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で用
いる場合、用語「ベクター」は、それが連結されているもう１つの核酸を運搬で
きる核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは
追加的なDNAセグメントがその中に連結され得る、環状２本鎖DNAループをいう。
ベクターのもう１つのタイプは、追加的なDNAセグメントがそのウイルスゲノム
中に連結され得るウイルスベクターである。あるベクターは、それらが導入され
た宿主細胞中で自発的に複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベ
クターおよび哺乳動物のエピソーム性（episomal）ベクター）。他のベクター（
例えば、哺乳動物の非エピソーム性ベクター）は、宿主細胞中に導入されるとき
に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製され
る。さらに、あるベクター、発現ベクターは、それが作動可能に連結された遺伝
子の発現を指令できる。一般に、組換えDNA技術において利用可能な発現ベクタ
ーは、しばしばプラスミド（ベクター）の形態をとる。しかしながら、本発明は
、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよび
アデノ随伴ウイルス）などの、同等の機能を提供する、そのような他の形態の発
現ベクターを含むことを意図している。

【０１１５】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態で本発
明の核酸を含む。これは、該組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞
に基づいて選択された１以上の調節配列を含み、そしてそれは発現される核酸配
列に作動可能に連結されていることを意味する。組換え発現ベクター内で、「作
動可能に連結されている」ということは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌク
レオチド配列が発現されるように（例えば、in vitro転写／翻訳系で、またはそ
のベクターが宿主細胞中に導入される場合にはその宿主細胞中で）調節配列に連
結されていることを意味することを意図している。用語「調節配列」は、プロモ
ーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化
シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節配列は、例えば、Goed
del, 遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）：酵素学における方法185
（Methods in Enzymology 185）、Academic Press発行, San Diego, CA (1990)
に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列
の構成的発現を指令するもの、および特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列
の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの
設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現濃度などの因
子に依存し得ることは、当業者には十分理解されるであろう。本発明の発現ベク
ターは、宿主細胞中に導入され、それによって、本明細書中に記載された核酸に
よってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質または
ペプチドを産生できる。

【０１１６】 本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中、例えば、大腸菌
などの細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）昆虫細胞、酵母細
胞または哺乳動物細胞中で、本発明のポリペプチドを発現するように設計できる
。好適な宿主細胞は、前記のGoddelによりさらに検討されている。あるいは、組
換え発現ベクターは、in vitroで、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリ
メラーゼを用いて、転写され、翻訳され得る。

【０１１７】 原核細胞でのタンパク質の発現は、大腸菌中で、融合または非融合タンパク質
のいずれかの発現を指令する構成的または誘導的プロモーターを含むベクターを
用いて最もしばしば行われている。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中
にコードされるタンパク質（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端）に付加す
る。そのような融合ベクターは、一般に、1)組換えタンパク質の発現を増加させ
る、2)組換えタンパク質の溶解性を増加させる、および3)アフィニティー精製に
おけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助ける、
という3つの目的の役に立つ。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分
解開裂部位が、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク
質の精製に続いて融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのよ
うな酵素、およびそれらのコグネイト(cognate)認識配列は、Xa因子、トロンビ
ンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、それぞれ、グ
ルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、また
はプロテインAを標的組換えタンパク質に融合する、pGEX（Pharmacia Biotech I
nc社製；SmithおよびJohnson (1988), Gene 67:31-40）、pMAL（New England Bi
olabs社製、Beverly, MA）およびpRIT5（Pharmacia社製、Piscataway, NJ）を含
む。

【０１１８】 好適な誘導的非融合大腸菌発現ベクターの例は、pTrc（Amannら, (1988) Gene
69:301-315）およびpET 11d（Studierら, 遺伝子発現技術（Gene Expression T
echnology）：酵素学における方法185（Methods in Enzymology 185）, Academi
c Press発行, San Diego, California (1990) 60-89）を含む。pTrcベクターか
らの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポ
リメラーゼ転写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、同時発
現されたウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gnl）によって仲介されるT7 gnl0-lac融
合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、lacUV
5プロモーターの転写制御下にT7 gnl遺伝子を持つレジデント（resident）λプ
ロファージ由来の宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)によって供給される。

【０１１９】 大腸菌での組換えタンパク質発現を最大化する１つのストラテジーは、タンパ
ク質分解的に組換えタンパク質を開裂する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパ
ク質を発現させることである（Gottesman, 遺伝子発現技術（Gene Expression T
echnology）：酵素学における方法185（Methods in Enzymology 185）, Academi
c Press発行, San Diego, California (1990) 119-128）。もう１つのストラテ
ジーは、発現ベクター中に挿入する核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々
のコドンが、大腸菌中で優先的に利用されるコドンであるように改変することで
ある（Wadaら (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明の核酸配列
のそのような改変は、標準的なDNA合成技術によって行うことができる。

【０１２０】 もう１つの実施形態では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.
セレビシエ（S. cerivisae）中での発現のためのベクターの例は、pYepSecl（Ba
ldariら (1987) EMBO J. 6:229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz, (1982)
Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら (1987) Gene 54:113-123）、pYES2（I
nvitrogen Corporation社製, San Diego, CA）、およびpPicZ（Invitrogen Corp
oration社製, San Diego, CA）を含む。

【０１２１】 あるいは、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養され
た昆虫細胞（例えば、Sf 9細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロ
ウイルスベクターは、pAcシリーズ（Smithら (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2
165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers (1989) Virology 170:31-39）
を含む。

【０１２２】 またもう１つの実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用い
て哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、pCDM8（Seed (1
987) Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら (1987) EMBO J. 6:187-195）
を含む。哺乳動物細胞中で使用するときは、発現ベクターの制御機能は、しばし
ばウイルス性調節エレメントによって提供される。例えば、一般に用いられるプ
ロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシ
ミアンウイルス40から誘導される。原核細胞および真核細胞の両者に好適な他の
発現系に関しては、前記Sambrookらの第16および17章を参照されたい。

【０１２３】 もう１つの実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優
先的にその核酸の発現を指令できる（例えば、組織特異的調節エレメントは、そ
の核酸を発現させるのに使用される）。組織特異的調節エレメントは、当分野で
公知である。好適な組織特異的プロモーターの非制限的な（non-limiting）例は
、アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkertら (1987) Genes Dev. 1:268-27
7）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton (1988) Adv. Immunol.
43:235-275）、特にT細胞レセプターのプロモーター（WinotoおよびBaltimore (
1989) EMBO J. 8:729-733）および免疫グロブリン（Banerjiら (1983) Cell 33:
729-740；QueenおよびBaltimore (1983) Cell 33:741-748）、ニューロン特異的
プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle (1
989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵特異的プロモーター（Ed
lundら (1985) Science 230:912-916）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例
えば、ミルク乳漿プロモーター；米国特許第4,873,316号公報および欧州出願公
開第264,166号公報）を含む。発生的に調節された（developmentally regulated
）プロモーターもまた含まれ、例えば、マウスhoxプロモーター（KesselおよびG
russ (1990) Science 249:374-379）およびα−フェトプロテインプロモーター
（CampesおよびTilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546）である。

【０１２４】 本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローニングされた本
発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子が、本
発明のポリペプチドをコードするmRNAに対するアンチセンスであるRNA分子を（
そのDNA分子を転写することによって）発現させるように、調節配列に作動可能
に連結されている。多様な細胞型でのアンチセンスRNA分子の連続的な発現を指
令する、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結されてい
る調節配列を選択することができ、例えば、アンチセンスRNAの構成的、組織特
異的もしくは細胞型特異的発現を指令するウイルスプロモーターおよび／または
エンハンサーまたは調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクタ
ーは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下に製造され、その活性が、ベ
クターが導入される細胞型によって決定され得る組換えプラスミド、ファージミ
ドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子
発現の調節に関する議論については、Weintraubら（総説−遺伝学の趨勢（Revie
ws - Trends in Genetics）, Vol. 1(1) 1986）を参照されたい。

【０１２５】 本発明のもう１つの態様は、本発明の組換え発現ベクターがその中に導入され
た宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書
中で交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞に対してのみで
なく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫に対してもいうと理解すべきで
ある。ある修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって、続く世代で
生じ得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではあり得ないが、
それでも、本明細書中で用いる用語の範囲内には含まれる。

【０１２６】 宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または任意の真核細胞（例え
ば、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）であり得る。

【０１２７】 ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原
核細胞または真核細胞中に導入できる。本明細書中で用いる、用語「形質転換」
および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム
共沈、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、また
は電気穿孔法を含む、外来の核酸を宿主細胞中に導入するための多様な当分野で
認知されている技術をいうことが意図されている。宿主細胞を形質転換またはト
ランスフェクトする好適な方法は、Sambrookら（前記）、および他の実験室マニ
ュアル中に見出すことができる。

【０１２８】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、用いる発現ベクターお
よびトランスフェクション技術によって、細胞の小さな画分のみが、外来DNAを
それらのゲノム中に組み込むことができることは公知である。これらの組込み体
（integrants）を同定し、選択するためには、一般に、選択マーカー（例えば、
抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞
中に導入する。好ましい選択マーカーは、G418、ハイグロマイシンおよびメトト
レキセートなどの薬物に対する耐性を付与するものを含む。導入された核酸によ
って安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定できる（例え
ば、選択マーカーが組み入れられた細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する）。

【０１２９】 培養物中の原核または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明のポリ
ペプチドを製造するのに使用できる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細
胞を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。１つの実施形態で
は、この方法は、ポリペプチドが製造されるように、（本発明のポリペプチドを
コードする組換え発現ベクターがその中に導入された）本発明の宿主細胞を、好
適な培地中で培養することを含む。もう１つの実施形態では、前記方法はさらに
、前記培地または前記宿主細胞からポリペプチドを単離することを含む。

【０１３０】 本発明の宿主細胞は、非ヒト・トランスジェニック動物を製造するのにも使用
できる。例えば、１つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプ
チドをコードする配列がその中に導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である
。そして、そのような宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする外因性の
配列が、（本発明のポリペプチドをコードする内因性の配列がその中で改変され
ている）それらのゲノムまたは相同的組換え動物中に導入された、非ヒトトラン
スジェニック動物を作り出すのに使用できる。そのような動物は、ポリペプチド
の機能および／または活性を研究するためおよびポリペプチド活性の同定および
／またはそのモジュレーターを評価するために有用である。本明細書中で用いる
、「トランスジェニック動物」は、1以上のその動物の細胞がその中に導入遺伝
子を含んでいる、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまた
はマウスなどの齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長
類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、
トランスジェニック動物がそれから発生し、その成熟動物のゲノム中に残ってい
る細胞のゲノム中に組み込まれており、それによって、トランスジェニック動物
の1以上の細胞型または組織中でのコードされた遺伝子産物の発現を指令する、
外因性DNAである。本明細書中で用いる、「相同的組換え動物」は、その動物の
中で、内因性遺伝子が、内因性遺伝子と、その動物の細胞（例えば、その動物の
発生前の、その動物の胚細胞）中に導入された外因性DNA分子との間の相同的組
換えによって改変されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは
マウスである。

【０１３１】 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸
（またはその相同体）を、受精卵母細胞の雄性前核中に（例えば、マイクロイン
ジェクション、レトロウイルス感染により）導入し、その卵母細胞を偽妊娠雌親
動物中で発生させることによって作り出すことができる。イントロン性（intron
ic）配列およびポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の発現効率を増加させる
、その導入遺伝子中にも含まれ得る。組織特異的調節配列は、特定細胞に対して
本発明のポリペプチドの発現を指令する導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
特にマウスなどの動物での、胚操作およびマイクロインジェクションによるトラ
ンスジェニック動物の作製方法は、当分野で一般的になっており、例えば、米国
特許第4,736,866号および第4,870,009号公報、米国特許第4,873,191号公報中な
らびにHogan, マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）,（Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press発行, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）中に記載
されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の製造に用いられる。
トランスジェニック創始（founder）動物は、そのゲノム中の導入遺伝子の存在
および／またはその動物の組織または細胞中の導入遺伝子をコードするmRNAの発
現に基づいて同定できる。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子
を有するさらなる動物を繁殖させるのに使用できる。さらに、導入遺伝子を有す
るトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジ
ェニック動物へと繁殖され得る。

【０１３２】 相同的組換え動物を作り出すためには、欠失、付加または置換がその中に導入
され、それによって、その遺伝子を改変する（例えば、機能的に中断させる）、
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調
製する。好ましい実施形態では、ベクターは、相同的組換え時に、内因性遺伝子
が機能的に中断される（すなわち、最早機能性タンパク質をコードしない；「ノ
ックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計される。あるいは、ベクターは
、相同的組換え時に、内因性遺伝子が突然変異されるか、さもなければ改変され
るが、未だ機能性タンパク質をコードするように設計できる（例えば、上流の調
節領域が改変され、それによって内因性タンパク質の発現が改変できる）。相同
的組換えベクターでは、遺伝子の改変された部分は、その5'および3'末端で、相
同的組換えが、そのベクターによって運搬される外因性遺伝子と胚幹細胞中の内
因性遺伝子との間の相同的組換えを起こさせる遺伝子の付加的な核酸に隣接され
ている。この付加的な隣接核酸配列は、内因性遺伝子による相同的組換えをうま
く行うのに充分な長さである。一般的には、数キロベースの（その5'および3'末
端の両方の）隣接DNAは、そのベクター中に含まれる（例えば、相同的組換えベ
クター類の記述に関する、ThomasおよびCapecchi (1987) Cell 51:503を参照さ
れたい）。ベクターは、（例えば、電気穿孔法によって）胚幹細胞株中に導入さ
れ、導入された遺伝子が、その中で内因性遺伝子によって相同的に組み換えられ
ている細胞が選択される（例えば、Liら (1992) Cell 69:915を参照されたい）
。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞（blastocyst）
中に注入され、集合体（aggregation）キメラを形成する（例えば、Bradley、奇
形癌および胚幹細胞：実際的アプローチ（Teratocarcinomas and Embryonic Ste
m Cells: A Practical Approach）, Robertson編集（IRL発行, Oxford, 1987）p
p. 113-152を参照されたい）。そして、キメラ胚は、好適な偽妊娠雌養育動物に
移植でき、胚は、出産間近の状態まで至る。それらの生殖細胞中に相同的に組み
換えられたDNAを担持する子孫は、その動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖
細胞系の伝達によって相同的に組み換えられたDNAをその中に含む動物を繁殖さ
せるのに使用できる。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法
は、Bradley (1991) バイオテクノロジーにおける最近の見解（Current Opinion
in Bio/Technology） 2:823-829ならびにPCT公開第WO90/11354号、第WO91/0114
0号、第WO92/0968号および第WO93/04169号公報にさらに記載されている。

【０１３３】 もう１つの実施形態では、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択系を
含む、トランスジェニック非ヒト動物を製造することができる。そのような系の
１つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/lo
xPリコンビナーゼ系の説明に関しては、例えば、Lakosoら (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼ系のもう１つの
例は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)のFLPリコンビ
ナーゼ系である（O'Gormanら (1991) Science 251:1351-1355）。cre/loxPリコ
ンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合には、Creリコンビナー
ゼおよび選択されたタンパク質の両者をコードする導入遺伝子を含む動物が必要
である。そのような動物は、「二重（double）」トランスジェニック動物の構築
（例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は
リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む、2種のトランスジェニック動物
を交尾させることによる）によって提供できる。

【０１３４】 Wilmutら (1997) Nature 385:810-813ならびにPCT公開第WO97/07668号およびW
O97/07669号公報に記載された方法に従って、本明細書中に記載された非ヒトト
ランスジェニック動物のクローンを製造することもできる。

【０１３５】 IV．医薬組成物 本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体（本明細書中で「活性化合物」と
も呼ぶ）は、投与に好適な医薬組成物中に組み込むことができる。そのような組
成物は、通常、核酸分子、タンパク質、または抗体と、製薬上許容可能な担体を
含む。本明細書中で用いる、用語「製薬上許容可能な担体」は、医薬投与に適合
する、幾つかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗
真菌剤、等張および吸収遅延化剤などを含むことが意図されている。医薬的に活
性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当分野で周知である。任意
の慣用的な媒体または試薬が活性化合物と不適合な場合以外は、組成物中でのそ
れらの使用が意図される。補助的な活性化合物を前記組成物中に組み込むことも
できる。

【０１３６】 本発明は、本発明のポリペプチドもしくは核酸の発現または活性をモジュレー
トする医薬組成物の製造方法を含む。そのような方法は、医薬的に許容可能な担
体と本発明のポリペプチドもしくは核酸の発現または活性をモジュレートする試
薬とを配合することを含む。そのような組成物は、追加的な活性試薬をさらに含
むことができる。このように、本発明は、医薬的に許容可能な担体と、本発明の
ポリペプチドもしくは核酸の発現または活性をモジュレートする試薬および1以
上の追加的な活性化合物とを配合することによる医薬組成物の製造方法をさらに
含む。

【０１３７】 本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように配合される
。投与経路の例は、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸
入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸適用を含む。非経口、経皮、もしく
は皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、次の成分を含む：注射用の水、生
理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレン
グリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメ
チルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗
酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩また
はリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど
の張度調整剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基によっ
て調整できる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い
捨て注射筒または複数回用量バイアル中に封入できる。

【０１３８】 注射可能な用途に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または
滅菌水性分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末を
含む。静脈内投与に関しては、好適な担体は、生理食塩水、静菌性水、Cremopho
r EL（商標）（BASF社製、Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS
）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に
注入できる程度の流動性を有するべきである。それは、製造および保存の条件下
で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染活動に対して保護
されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例
えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコー
ルなど）ならびにそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。
適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液
の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって
、維持することができる。微生物の活動の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌
剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメ
ロサールなど）によって達成できる。多くの場合、等張化剤（例えば、糖類、マ
ンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を組成物中
に含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収は、組成物中に吸収を遅延させ
る試薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませるこ
とによって延長することができる。

【０１３９】 滅菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を、必
要な量で、上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適当な溶媒中
に入れ、必要に応じて、濾過滅菌することによって調製できる。一般に、分散液
は活性化合物を、塩基性分散媒および上記で列挙されたもののうち必要な他の成
分を含む滅菌媒体中に入れることによって調製する。滅菌注射可能溶液の調製の
ための滅菌粉末の場合に、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液か
らの任意の所望の追加的成分を加えた活性成分の粉末を与える真空乾燥および凍
結乾燥である。

【０１４０】 経口用組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用の担体を含む。それらは
、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投
与の目的には、活性化合物を賦形剤と共に組み込んで、錠剤、トローチ、または
カプセルの形態で使用できる。経口用組成物は、うがい薬として使用するための
液体担体を用いて調製することもでき、液体担体中の化合物は、経口的に適用さ
れ、うがいされ（swished）、吐き出されるかまたは飲み込まれる。

【０１４１】 製薬上適合性のある結合剤および/またはアジュバント物質が、組成物の一部
として含まれても良い。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の任意の
成分または類似した性質の化合物を含むことができる。すなわち、微結晶セルロ
ース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラク
トースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)もしくはトウモロコシ
デンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート(Sterote
)などの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤(glidant)、スクロー
スもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルも
しくはオレンジ香味などの香味料。

【０１４２】 吸入による投与の場合、化合物は、適切な推進剤(例えば、二酸化炭素などの
気体)を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエーロ
ゾルスプレー形態で送達される。

【０１４３】 経粘膜的または経皮的手段によって全身投与もできる。経粘膜投与または経皮
投与の場合、透過するバリアに適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸
透剤は当該分野で一般的に公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、界面活
性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻へのス
プレーまたは坐薬を使用して行うことができる。経皮投与のためには、活性化合
物を、当該分野において一般的に知られている軟膏(ointment)、膏薬(salve)、
ゲル、またはクリームに製剤化する。

【０１４４】 また、上記化合物は、直腸送達のために、坐薬形態として(例えば、カカオ脂
および他のグリセリドなどの従来の坐薬用基剤とともに)、または停留浣腸とし
ても調製できる。

【０１４５】 一実施形態では、上記活性化合物を、化合物が身体から速い速度で排除される
のを防ぐキャリアを用いて、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含
む放出制御された製剤などとして調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物
、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの
生分解性かつ生物適合性のポリマーが使用できる。このような製剤の調製方法は
、当業者には明らかである。上記物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmac
euticals, Inc.から購入することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に
対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的化したリポソームを含む)も、
製薬上許容可能なキャリアとして使用できる。これらは、米国特許第4,522,811
号に記載されているような当業者に公知の方法により調製できる。

【０１４６】 投与の容易性および用量の均等性のために、経口または非経口組成物を投薬単
位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する投薬単位剤形と
は、治療すべき被験者に対する１回量として適した物理的に離散した投薬単位を
指す。各投薬単位は、必要とされる製薬上のキャリアと共に所望の治療効果をも
たらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位剤形の明
細事項については、活性化合物の固有の性質および得られる特定の治療効果、な
らびに個体を治療するためにそのような活性化合物を配合する技術上の制限に依
拠する。

【０１４７】 抗体については、好ましい用量は0.1mg/kg〜100mg/kg体重(一般的に、10mg/kg
〜20mg/kg)である。抗体が脳内で作用する場合は、50mg/kg〜100mg/kgの用量が
通常適している。一般的に、特にヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体より
もヒト体内において長い半減期を有する。従って、低用量および少ない回数での
投与が可能である場合が多い。リピド化などの修飾も、抗体を安定化し、取込み
および組織浸透(例えば、脳への)を向上するために使用できる。抗体のリピド化
法は、Cruikshankら((1997) J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Hum
an Retrovitology 14:193)に記載されている。

【０１４８】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用し
てもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局部投与(米国特許第5,3
28,470号)または定位注射(例えば、Chenら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:3054-3057を参照のこと)などにより被験者に送達できる。遺伝子治療ベクタ
ーの医薬製剤は、許容可能な希釈剤に遺伝子治療ベクターを含んでもよいし、ま
たは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでもよい。あ
るいはまた、完全遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生産できる場合
(例えば、レトロウイルスベクター)、医薬製剤は、遺伝子送達系を生産する細胞
を１つ以上含むことができる。

【０１４９】 医薬組成物は、投与説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサーに入
れることができる。

【０１５０】Ｖ．本発明の使用および方法 本明細書に記載する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体および抗体は、
以下の方法の１つ以上において使用できる。すなわち、a)スクリーニングアッセ
イ、b)検出アッセイ(例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医学生物
学)、c)予知医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床治験
、および薬理ゲノム学(pharmacogenomics))、ならびにd)治療方法(例えば、治療
的および予防的)。例えば、本発明のポリペプチドは、(i)細胞増殖の調節、(ii)
細胞分化の調節、および(iii)細胞生存の調節に使用できる。本発明の単離核酸
分子は、(例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組換え発現ベクターを
介して)タンパク質を発現するために、(例えば、生物学的サンプル中の)mRNAま
たは遺伝的病変を検出するために、および本発明のポリペプチドの活性を調節す
るために使用できる。さらに、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチド
の活性または発現を調節する薬剤または化合物をスクリーニングするために、な
らびに本発明のタンパク質の不十分または過剰な産生、または野生型タンパク質
と比較して活性が低いもしくは異常な形態の本発明のタンパク質の産生に特徴付
けられる障害を治療するために使用できる。また、本発明の抗体は、本発明のタ
ンパク質を検出および単離するために、ならびに本発明のタンパク質の活性を調
節するために使用できる。

【０１５１】 さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤、
ならびに本明細書に記載するような治療のためにそれらを使用することに関する
。

【０１５２】Ａ．スクリーニングアッセイ 本発明は、モジュレーター、すなわち本発明のポリペプチドと結合するかまた
は例えば本発明のポリペプチドの発現もしくは活性を刺激もしくは阻害する効果
を有する候補もしくは試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチド模倣
体、小分子、もしくは他の薬物)の同定方法(本明細書においては「スクリーニン
グアッセイ」ともいう)を提供する。

【０１５３】 一実施形態において、本発明は、本発明の膜結合型ポリペプチドもしくはその
生物活性部分に結合するかもしくはその活性を調節する候補もしくは試験化合物
をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該
分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意
のものを使用して得られる。これには、生物学的ライブラリー、位置特定が可能
な(spatially addressable)平行固相または溶液相ライブラリー、デコンボリュ
ーション(deconvolution)を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物
(one-bead one-compound)」ライブラリー法、ならびにアフィニティークロマトグ
ラリー選択を使用する合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学的ライブラリ
ーアプローチはペプチドライブラリーに限定されているが、他の４つのアプロー
チは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適
用できる(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。

【０１５４】 分子ライブラリーの合成方法の例は、当該分野において、例えば、DeWittら (
1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909；Erbら(1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:11422；Zuckermannら (1994).J. Med. Chem. 37:2678；Choら(1993
) Science 261:1303；Carrellら(1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；
Carrellら(1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；ならびにGallopら(199
4) J. Med. Chem. 37:1233に記載されている。

【０１５５】 化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten(1992) Bio/Techniques 1
3:412-421)に提示されてもよいし、またはビーズ(Lam(1991) Nature 354:82-84)
、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(米国特許第5,223,409号)、
胞子(spores)(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号および同第5,223,409号
)、プラスミド(Cullら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)もし
くはファージ(ScottおよびSmith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990)
Science 249:404-406；Cwirlaら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-
6382；およびFelici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)の上に提示されてもよ
い。

【０１５６】 一実施形態において、アッセイは、膜結合型の本発明のポリペプチドまたはそ
の生物活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、試験化合物と接触させて、試験
化合物がポリペプチドに結合する能力について判定する、細胞に基づくアッセイ
である。細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物由来の細胞でありうる。試験
化合物がポリペプチドに結合する能力を判定するには、例えば、試験化合物を放
射性同位体または酵素標識と結合させて、複合体中の標識化合物を検出すること
により、試験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に結合するか判定で
きるようにすることによって行う。例えば、試験化合物は、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴Cもし
くは³Hにより直接的もしくは間接的に標識できる。そして、放射性発光(radioem
mission)の直接計数、またはシンチレーション計数によって放射性同位体を検出
できる。あるいはまた、試験化合物を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼなどにより酵素的に標識できる。そ
して、適切な基質の生成物への変換を測定することによって酵素標識を検出でき
る。好適な実施形態において、アッセイは、膜結合型の本発明のポリペプチドま
たはその生物活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、ポリペプチドと結合して
アッセイ混合物を形成する公知の化合物と接触させること、該アッセイ混合物を
試験化合物と接触させること、ならびに試験化合物がポリペプチドと相互作用す
る能力について判定することを含む。試験化合物がポリペプチドと相互作用する
能力について判定することは、公知の化合物と比較して試験化合物がポリペプチ
ドまたはその生物活性部分と優先的に結合する能力について判定することを含む
。

【０１５７】 別の実施形態において、アッセイは、膜結合型の本発明のポリペプチドまたは
その生物活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、試験化合物と接触させること
、ならびに該試験化合物がポリペプチドもしくはその生物活性部分の活性を調節
(例えば、刺激または阻害)する能力について判定することを含む、細胞に基づく
アッセイである。試験化合物がポリペプチドもしくはその生物活性部分の活性を
調節する能力について判定することは、例えば、ポリペプチドタンパク質が標的
分子と結合または相互作用する能力について判定することにより行える。

【０１５８】 本発明のポリペプチドが標的分子と結合または相互作用する能力について判定
することは、上述した直接結合の判定方法の１つにより行える。本明細書で使用
する「標的分子」とは、選択したポリペプチド(例えば、本発明のポリペプチド)が
実際に結合または相互作用する分子を指し、例えば選択したタンパク質を発現す
る細胞の表面上の分子、第２の細胞の表面上の分子、細胞外環境にある分子、細
胞膜の内部表面と会合した分子、または細胞質分子が挙げられる。標的分子は、
本発明のポリペプチドでもよいし、または他のポリペプチドまたはタンパク質で
もよい。例えば、標的分子は、細胞膜を介した細胞内への細胞外シグナル(例え
ば、化合物が本発明のポリペプチドに結合することによって生成されるシグナル
)の伝達を容易にするシグナル伝達経路の一成分、触媒活性を有する第２の細胞
内タンパク質、または下流のシグナル伝達分子と本発明のポリペプチドとの会合
を容易にするタンパク質でありうる。本発明のポリペプチドが標的分子と結合ま
たは相互作用する能力について判定することは、標的分子の活性を判定すること
により行える。例えば、標的の細胞性二次メッセンジャー(例えば、細胞内Ca²⁺
、ジアシルグリセロール、IP3など)の誘導を検出すること、適切な基質上で標的
の触媒/酵素活性を検出すること、リポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼな
どの検出マーカーをコードする核酸に作動可能に結合した、本発明のポリペプチ
ドに応答する調節エレメント)の誘導を検出すること、または例えば細胞分化も
しくは細胞増殖などの細胞応答を検出することにより、標的分子の活性を判定で
きる。

【０１５９】 さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、本発明のポリペプチドま
たはその生物活性部分を試験化合物と接触させること、および試験化合物がポリ
ペプチドまたはその生物活性部分と結合する能力について判定することを含む、
無細胞アッセイである。試験化合物のポリペプチドとの結合は、上述したように
直接的または間接的に判定できる。好適な実施形態において、アッセイは、本発
明のポリペプチドまたはその生物活性部分を、ポリペプチドと結合してアッセイ
混合物を形成する公知化合物と接触させること、該アッセイ混合物を試験化合物
と接触させること、ならびに試験化合物がポリペプチドと相互作用する能力につ
いて判定することを含む。試験化合物がポリペプチドと結合する能力について判
定することは、公知化合物と比較して試験化合物がポリペプチドまたはその生物
活性部分と優先的に結合する能力について判定することを含む。

【０１６０】 別の実施形態において、アッセイは、本発明のポリペプチドまたはその生物活
性部分を試験化合物と接触させること、および試験化合物がポリペプチドまたは
その生物活性部分の活性を調節(例えば、刺激または阻害)する能力について判定
することを含む、無細胞アッセイである。試験化合物がポリペプチドの活性を調
節する能力について判定することは、例えば、上述した直接結合の判定方法の１
つにより、ポリペプチドが標的分子に結合する能力について判定することにより
行える。代替的な実施形態においては、試験化合物がポリペプチドの活性を調節
する能力について判定することは、本発明のポリペプチドが標的分子をさらに調
節する能力について判定することにより行える。例えば、適切な基質上での標的
分子の触媒/酵素活性を上述したように判定できる。

【０１６１】 さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、本発明のポリペプチドまた
はその生物活性部分を、ポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する公知
化合物と接触させること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、な
らびに試験化合物がポリペプチドと相互作用する能力について判定することを含
む。試験化合物がポリペプチドと結合する能力について判定することは、公知化
合物と比較して試験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分と優先的に結
合する能力について判定することを含む。

【０１６２】 本発明の無細胞アッセイは、本発明の可溶性または膜結合型ポリペプチドの両
方の使用に適している。膜結合型ポリペプチドを含む無細胞アッセイの場合、可
溶化剤を利用して、膜結合型ポリペプチドを溶解状態に維持することが望ましい
かもしれない。このような可溶化剤の例としては、ｎ-オクチルグルコシド、ｎ-
ドデシルグルコシド、ｎ-オクチルマルトシド、オクタノイル-Ｎ-メチルグルカ
ミド、デカノイル-Ｎ-メチルグルカミド、Triton X-100、Triton X-114、テジッ
ト(Thesit)、イソトリデシポリ(Isotridecypoly)(エチレングリコールエーテル)
ｎ、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)
、3-[(3-クロアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンス
ルホネート(CHAPSO)、またはＮ-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパ
ンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【０１６３】 本発明の上記のアッセイ法の1以上の実施形態において、一方または両方のタ
ンパク質の非複合形態から複合形態を分離しやすいように、ならびに該アッセイ
を自動化するために、本発明のポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固
定化することが望ましい。試験化合物の該ポリペプチドへの結合、または候補化
合物の存在下また不在下における該ポリペプチドの標的分子との相互作用は、反
応物を入れるのに適するどんな容器のなかででも達成できる。このような容器の
例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心分離管が挙げら
れる。ある実施形態では、一方または両方のタンパク質のマトリックスへの結合
を可能にするドメインが加わった融合タンパク質を供給することができる。例え
ば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファ
ロースビーズ（Sigma Chemical；St. Lois、MO)またはグルタチオン誘導体化マ
イクロタイタープレート上に吸着させることができ、続いて試験化合物または試
験化合物および吸着されていない標的タンパク質または本発明のポリペプチドの
いずれかと混合し、混合物を複合体の形成へと導く条件（例えば、塩およびpHの
生理的条件）下でインキュベートする。インキュベーションの後、該ビーズまた
はマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、未結合の成分をすべて取り除き、
複合体形成を直接的にまたは間接的に、例えば、上記のように測定する。あるい
は、該複合体をマトリックスから解離させることができ、本発明のポリペプチド
の結合または活性のレベルを、標準的な技術を用いて測定できる。

【０１６４】 タンパク質をマトリックス上に固定化するその他の技術を、本発明のスクリー
ニングアッセイにおいて用いることもできる。例えば、本発明のポリペプチドま
たはその標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲート形成を利
用して固定化できる。ビオチン化した本発明のポリペプチドまた標的分子は当技
術分野で公知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals; Rockford
,IL)を用いて、ビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製でき、
ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート（Pierce Chemical)の
ウェルに固定化できる。あるいは、本発明のポリペプチドまたは標的分子と反応
性であるが、本発明のポリペプチドのその標的分子への結合を阻害しない抗体を
、該プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合の標的または本発明の
ポリペプチドを抗体とのコンジュゲートの形成によりウェル内に捕獲することが
できる。このような複合体を検出する方法として、GST固定化複合体のための上
記の検出法に加えて、本発明のポリペプチドまたは標的分子と反応性の抗体を用
いる複合体の免疫検出、ならびに本発明のポリペプチドまたは標的分子に結合さ
せた酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが挙げられる。

【０１６５】 別の実施形態においては、本発明のポリペプチド発現のモジュレーターを同定
するにあたって、細胞を候補化合物と接触させ、選択したmRNAまたはタンパク質
（すなわち、本発明のポリペプチドまたは核酸に対応するmRNAまたはタンパク質
）の該細胞内における発現を測定する方法により同定する。候補化合物存在下に
おける選択したmRNAまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物不在下におけ
る選択したmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する。そしてこの比較に基
づき、該候補化合物を本発明のポリペプチド発現のモジュレーターとして同定で
きる。例えば、選択したmRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下に
おいて不在の場合よりも多かったとき（統計上有意に多いとき）、該候補化合物
を、選択したmRNAまたはタンパク質の発現の促進物質であると同定する。あるい
は、選択したmRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下において不在
の場合よりも少なかったとき（統計上有意に少ないとき）、該候補化合物を、選
択したmRNAまたはタンパク質の発現の阻害物質であると同定する。該細胞内にお
ける選択したmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載した方法に
よって測定できる。

【０１６６】 本発明のまた別の態様においては、本発明のポリペプチドをツーハイブリッド
アッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト・タンパク質（ba
it protein)」として用いて（例えば、米国特許第5,283,317号；Zervosら、(199
3) Cell 72:223-232 ; Maduraら、(1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Ba
rtelら、（1993）Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchiら、(1993) Oncogene 8
:1693-1696;およびPCT公開番号WO94/10300参照)、本発明のポリペプチドと結合
または相互作用して本発明のポリペプチドの活性を調節するその他のタンパク質
を同定することができる。このような結合タンパク質は、例えば、本発明のポリ
ペプチドを含むシグナル伝達経路の上流または下流エレメントとして、本発明の
ポリペプチドによるシグナル伝達にも関与している可能性がある。

【０１６７】 本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤お
よび本明細書に記載の治療のためのそれらの使用に関する。

【０１６８】Ｂ．検出アッセイ 本明細書で同定したcDNA配列の部分または断片（および対応する遺伝子配列の
全部）をポリヌクレオチド試薬として多方面で使用できる。例えばこれらの配列
を、(i)染色体上に各遺伝子をマッピングすることによる、遺伝病に関連する遺
伝子領域の位置決定、（ii）微小な生体試料からの個体の同定（組織タイピング
）、および（iii）生体試料の法医学的同定の促進、に使用できる。これらの応
用例について、以下の分節に記載する。

【０１６９】１．染色体マッピング 一度、遺伝子配列（または配列の一部）を単離すれば、この配列を用いて該遺
伝子の染色体上における位置をマッピングできる。従って、本明細書に記載の核
酸分子またはその断片を使用して、対応する遺伝子の位置を染色体上にマッピン
グできる。該配列の染色体上へのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する
遺伝子に相関させる際の重要な第1ステップである。

【０１７０】 簡単に述べると、本発明の遺伝子の配列からPCRプライマー（好ましくは、長
さが15〜25 bp）を調製することにより、遺伝子を染色体上にマッピングできる
。本発明の遺伝子の配列をコンピューター解析して、ゲノムDNA中の２以上のエ
キソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、増幅プロセスを複雑にしない
ようにすることができる。これらのプライマーを、個人のヒト染色体を含む体細
胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用できる。該遺伝子配列に対応するヒ
ト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅された断片を産生するであろ
う。この技術の概説は、D'Eustachioら（（1983）Science 220：919-924）を参
照されたい。

【０１７１】 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当
てるための迅速な方法である。１個の熱サイクルラーを用いて、1日に3つ以上の
配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため
に本発明の核酸配列を使用すると、特定の染色体由来の断片のパネルによりさら
なる位置決定を行うことができる。遺伝子をその染色体上にマッピングするのに
同様に用いることができるその他のマッピングストラテジーとして、in situ ハ
イブリダイゼーション（Fanら、（1990）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：6223-27
）、標識したフロー選別（flow-sorted)染色体（CITE)を用いる前スクリーニン
グ、および染色体特異的cDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションによる前
選択、が挙げられる。さらにDNA配列の分裂中期染色体の広がりへの蛍光in situ
ハイブリダイゼーション（FISH）を用いて、1ステップで正確な染色体上の位置
決定ができる。この技術についてはVermaら（Human Chromosomes : A Manual of
Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988))に概説されている。

【０１７２】 染色体マッピングのための試薬を個別に用いて、一本の染色体またはその染色
体上の一つの部位をマークすることができ、また試薬のパネルを用いて複数の部
位および/または複数の染色体をマークすることができる。該遺伝子の非コード
領域に対応する試薬は、実際に、マッピングの目的にとって好ましい。コード配
列は遺伝子ファミリー内に保存されている可能性が高く、これが染色体マッピン
グ中の交差反応の機会を増やしている。

【０１７３】 ひとたび配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、配列の染色体上に
おける物理的な位置を遺伝子マップデータに相関させることができる(このよう
なデータは例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man中に見ることが
でき、 Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンライン
で入手できる）。次に同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の関係は
、例えばEgelandら、記載（Nature 325:783-787（1987））の連鎖解析（物理的
に隣接する遺伝子の共遺伝）によって同定できる。

【０１７４】 さらに、本発明の遺伝子に関連する疾患に罹患した個体と罹患していない個体
間のDNA配列の差異を決定できる。ある突然変異が疾患に罹患した個体の一部ま
たはすべてに見られ、罹患していない個体に全く見られない場合、その突然変異
が特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個
体との比較として、通常第一に、欠失や転座のような染色体内の構造的変化の探
索を行う。このような変化は染色体の伸張により可視化されるか、またはそのDN
A配列に基づくPCRを用いて検出できる。最終的にいくつかの個体から得た遺伝子
を完全に配列決定して、突然変異の有無を確かめ、多型と突然変異とを識別する
ことができる。

【０１７５】２．組織型決定（tissue typing） 本発明の核酸配列はまた、微小の生物学的サンプルから個人を同定するために
使うことができる。例えば、米国軍隊は、個人の同定のために、制限断片長多形
（restriction fragment length polymorphism）（RFLP）の使用を検討中である
。この技術では、個人のゲノムDNAを１種以上の制限酵素を用いて消化し、サザ
ンブロット上で釣り上げることにより、同定のためのユニークなバンドを得る。
この方法は、失ったり、切替えられたり、または盗まれる可能性がある「認識票
」がポジティブな同定を困難にしている現行の制限を受けることがない。本発明
の配列は、（米国特許第5,272,057号に記載された）RFLPの追加のDNAマーカーと
して有用である。

【０１７６】 さらに、本発明の配列を使って、個人のゲノムの選定した部分の実際の塩基1
つずつのDNA配列を決定する代替技術を提供することができる。つまり、本明細
書に記載の核酸配列を使って、該配列の5'および3'末端から２つのPCRプライマ
ーを調製することができる。その後、これらのプライマーを使って、個人のDNA
を増幅し、続いてその配列を決定することができる。

【０１７７】 個人はそれぞれ対立遺伝子の差によるユニークなこのようなDNA配列のセット
を有するので、この方法で調製した個人由来の対応DNA配列パネルは、ユニーク
な個人の同定を可能とし得る。本発明の配列を使って、個人からおよび組織から
このような同定用配列を得ることができる。本発明の核酸配列は、ユニークにヒ
トゲノムの部分を表す。対立遺伝子間の違いは、これらの配列のコード領域に若
干の程度で、そして非コード領域にもっと大きな程度で存在する。個々のヒトの
間での対立遺伝子間の違いは、各500塩基当たり約１回の頻度で起こると見積も
られる。本明細書に記載の配列のそれぞれは、同定目的のために個人由来のDNA
をそれに対して比較することができる標準として、ある程度使うことができる。
非コード領域ではもっと多数の多形が起こるので、個人を区別するために、より
少ない配列しか必要でない。配列番号１または４の非コード配列は、恐らくは、
それぞれ100塩基の非コード増幅配列を与える10から1000プライマーのパネルに
よるポジティブな個人同定を容易に提供することができる。配列番号３または６
に見られるような、予測コード配列を使うのであれば、ポジティブな個人同定の
ためのより適当なプライマーの数は、500-2,000であろう。

【０１７８】 本明細書に記載の核酸配列から得た試薬のパネルを使って個人のユニークな同
定用データベースを作ると、その後、この同じ試薬を使ってその個人由来の組織
を同定することができる。ユニークな同定データベースを使い、個人、生存者ま
たは死者のポジティブな同定を、極めて小さい組織サンプルから行うことができ
る。

【０１７９】３．法生物学における部分遺伝子配列の使用 DNAに基づく同定技術はまた、法生物学（forensic biology）において使うこ
ともできる。法生物学は、犯罪現場で見出された生物学的証拠の遺伝型決定（ge
netic typing）を、例えば、犯罪の犯人をポジティブに同定する手段として用い
る科学分野である。このような同定をするために、PCR技術を使って、犯罪現場
で見出された組織、例えば髪もしくは皮膚、または体液、例えば血液、唾液もし
くは精液のような、非常に小さい生物学的サンプルからとったDNA配列を増幅す
ることができる。その後、増幅した配列を標準と比較し、それによって生物学的
サンプルの起源を同定をすることができる。

【０１８０】 本発明の配列を使って、ポリヌクレオチド試薬、例えばヒトゲノム中の特定の
遺伝子座を標的とするPCRプライマーを提供することができ、これは、例えば、
他の「同定マーカー」（すなわち、特定の個人にユニークである他のDNA配列）
を与えることによってDNAに基づく法廷的同定の信頼性を向上することができる
。以上述べたように、実際の塩基配列情報を、制限酵素で作製した断片により形
成されるパターンの正確な代替物として、同定のために使うことができる。非コ
ード領域には多数の多形が存在するので、非コード領域を標的とする配列はこの
用途に特に適しており、この技術を使うことによって個人を区別することがより
容易になる。ポリヌクレオチド試薬の例としては、本発明の核酸配列またはその
部分、例えば、少なくとも20または30塩基長を有する非コード領域から得られる
断片が挙げられる。

【０１８１】 さらに、本明細書に記載の核酸配列を使って、ポリヌクレオチド試薬、例えば
、脳組織等の特定組織を同定するための、例えばin situハイブリダイゼーショ
ン技術に使うことができる、標識したまたは標識可能なプローブを提供すること
ができる。これは、法病理学者が起源未知の組織を提示された場合に、非常に有
用でありうる。このようなプローブのパネルを使って、組織を、種によりおよび
／または器官型により同定することができる。

【０１８２】 C.予測医学 本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理遺伝学（pharmacogenomics
）、および臨床経過のモニタリングを予後（予測）の目的のために使い、それに
よって個人を予防的に処置する予測医学の分野に関係する。したがって、本発明
の１つの様態は、一連の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）
について、本発明のポリペプチドもしくは核酸の発現および／または本発明のポ
リペプチドの活性を測定して、個人が疾患もしくは障害に罹っているか、または
本発明のポリペプチドの異常な発現もしくは活性に関わる障害を発症するリスク
をもつかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個人が本発明
のポリペプチドの異常な発現もしくは活性に関わる障害を発症するリスクを有す
るかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、本発明
の遺伝子の変異を、生物学的サンプル中でアッセイすることができる。このよう
なアッセイは予後または予測の目的で使うことができ、それによって本発明のポ
リペプチドの異常な発現または活性を特徴とするもしくはそれらに関わる障害の
発症前に、個人を予防的に処置することができる。

【０１８３】 本発明の他の様態は、個人における本発明の核酸もしくはポリペプチドの発現
または本発明のポリペプチドの活性のための方法を提供して、それによってその
個人に適当な治療用または予防用の薬剤を選定する（本明細書では「薬理遺伝学
（pharmacogenomics）」と呼ぶ）。薬理遺伝学は、個人の遺伝型（例えば、特定
薬剤に応答する個人の能力を決定するために試験した個人の遺伝型）に基づく個
人の治療または予防の処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。

【０１８４】 本発明のさらに他の様態は、臨床経過における本発明のポリペプチドの発現ま
たは活性に対する、薬剤（例えば、薬物または他の化合物）の影響のモニタリン
グに関する。これらおよび他の薬剤を、さらに詳細に以下の節で記載する。

【０１８５】 １．診断アッセイ 生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドまたは核酸の存在または不在を検
出する方法の例は、被験者から生物学的サンプルを採取し、該生物学的サンプル
を、本発明のポリペプチドまたは核酸（例えば、mRNA、ゲノムDNA）を検出する
能力のある化合物もしくは薬剤に接触させて生物学的サンプル中の本発明のポリ
ペプチドまたは核酸の存在を検出することを含む。本発明のポリペプチドをコー
ドするmRNAまたはゲノムDNAを検出するための好ましい薬剤は、本発明のポリペ
プチドをコードするmRNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズする能力のある標識
核酸プローブである。例えば、該核酸プローブは、配列番号１，３，４もしくは
６の核酸などの全長cDNA、またはそれらの部分であって、少なくとも15、30、50
、100、250もしくは500ヌクレオチドの長さを有し、かつ、ストリンジェント条
件で本発明のポリペプチドをコードするmRNAまたはゲノムDNAと特異的にハイブ
リダイズするに足りるオリゴヌクレオチドのような前記部分であることができる
。本発明の診断アッセイに使うための他の適切なプローブを本明細書に記載する
。

【０１８６】 本発明のポリペプチドを検出するための好ましい薬剤は、本発明のポリペプチ
ドと結合する能力のある抗体であり、好ましくは、検出可能な標識をもつ抗体で
ある。抗体はポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであるこ
とができる。完全体の抗体、またはそのフラグメント（例えば、FabまたはF(ab'
)₂）を使うことができる。プローブまたは抗体についての用語「標識した」は、
検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合させる（すなわち物理的に連結する
）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識した他試薬との
反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含むことを意図する。間接標識の
例としては、蛍光標識二次抗体を使う一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプ
トアビジンにより検出することができるビオチンによるDNAプローブの末端標識
が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験者から単離した組織、細胞お
よび生物学的液体、ならびに被験者内に存在する組織、細胞および生物学的液体
を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法を使って、生物学的サンプ
ル中のmRNA、タンパク質、またはゲノムDNAをin vitroならびにin vivoで検出す
ることができる。例えば、mRNAの検出のためのin vitro技術としては、ノーザン
ハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。
本発明のポリペプチドの検出のためのin vitro技術としては、固相酵素免疫検定
法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ゲ
ノムDNAの検出のためのin vitro技術としては、サザンハイブリダイゼーション
が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドの検出のためのin vivo技術とし
ては、該ポリペプチドに対する標識抗体を被験者中に導入することが挙げられる
。例えば、該抗体を放射性マーカーを用いて標識し、被験者中のその存在および
位置を標準の画像化技術により検出することができる。

【０１８７】 １つの実施形態では、生物学的サンプルは、被験者からのタンパク質分子を含
有する。あるいは、生物学的サンプルは、被験者からのmRNA分子または被験者か
らのゲノムDNA分子を含有することができる。好ましい生物学的サンプルは、被
験者から通常の方法により単離された末梢血白血球サンプルである。

【０１８８】 他の実施形態では、該方法は、さらに対照被験者から対照生物学的サンプルを
得て、該対照サンプルを本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコ
ードするmRNAもしくはゲノムDNAを検出する能力のある化合物または薬剤に接触
させ、生物学的サンプル中の該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする
mRNAもしくはゲノムDNAの存在を検出し、対照サンプル中の該ポリペプチドまた
は該ポリペプチドをコードするmRNAもしくはゲノムDNAの存在を試験サンプル中
の該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAもしくはゲノムDNAの
存在と比較することを含む。

【０１８９】 本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中の本発明のポリペプチド
または核酸の存在を検出するキットを包含する。このようなキットを使って、被
験者が本発明のポリペプチドの異常な発現に関わる障害（例えば、脂質代謝また
は輸送の障害）に罹っているかまたは発症するリスクが増加しているかを決定す
ることができる。例えば、該キットは、生物学的サンプル中の該ポリペプチドま
たは該ポリペプチドをコードするmRNAを検出する能力のある標識した化合物また
は薬剤、および該サンプル中の該ポリペプチドまたはmRNAの量を決定する手段（
例えば、該ポリペプチドと結合する抗体または該ポリペプチドをコードするDNA
またはmRNAと結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含んでなることができる
。キットはまた、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするmRNAの量が
正常なレベルを超えるか達しないかによって、被験者が該ポリペプチドの異常な
発現に関わる障害に罹っているかまたは発症するリスクをもつかを観察するため
の指示書を含むことができる。

【０１９０】 抗体に基づくキットでは、該キットは、例えば、(1)本発明のポリペプチドと
結合する（例えば、固体支持体に結合した）第１の抗体；および、場合によって
は、(2)該ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかと結合し、かつ、検出可能
な薬剤とコンジュゲートしている第２の、異なる抗体を含んでなることができる
。

【０１９１】 オリゴヌクレオチドに基づくキットでは、該キットは、例えば、(1)本発明の
ポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
例えば、検出可能な標識オリゴヌクレオチド、または、(2)本発明のポリペプチ
ドをコードする核酸分子を増幅するために有用な１対のプライマーを含んでなる
ことができる。

【０１９２】 キットはまた、例えば、バッファー剤、保存剤、またはタンパク質安定剤を含
んでなることができる。キットはまた、検出可能な薬剤（例えば、酵素または基
質）を検出するのに必要な成分を含んでなることができる。該キットはまた、ア
ッセイし、含有される試験サンプルと比較することができる対照サンプルまたは
一連の対照サンプルを含有することができる。キットの各成分は、通常、個別の
容器内に封入され、様々な容器は全て、１つのパッケージ内に、被験者が該ポリ
ペプチドの異常な発現に関わる障害に罹っているかまたは発症するリスクをもつ
かを観察するための指示書と共に収められる。

【０１９３】 ２．予後アッセイ 本明細書に記載の方法は、さらに診断または予後アッセイとして、該ポリペプ
チドの異常な発現または活性に関わる疾患または障害を有するかまたは発症する
リスクをもつ被験者を同定するために利用することができる。例えば、前述の診
断アッセイまたは以下のアッセイのような、本明細書に記載のアッセイを利用し
て、該ポリペプチドの異常な発現または活性に関わる障害を有するかまたは発症
するリスクを有する被験者を同定することができる。あるいは、予後アッセイを
利用して、このような疾患または障害を有するかまたは発症するリスクをもつ被
験者を同定することができる。したがって、本発明は、試験サンプルを被験者か
ら得て、本発明のポリペプチドまたは核酸（例えば、mRNA、ゲノムDNA）を検出
し、ここに、該ポリペプチドまたは核酸が存在すると、被験者は該ポリペプチド
の異常な発現または活性に関わる疾患または障害を有するかまたは発症するリス
クをもつと診断する方法を提供する。本明細書に使われる「試験サンプル」は、
対象とする被験者から得た生物学的サンプルを意味する。例えば、試験サンプル
は、生物学的液体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であることがで
きる。

【０１９４】 さらに、本明細書に記載の予後アッセイを使って、被験者にある薬剤（例えば
、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似体、タンパク質、ペプチド、核酸
、小分子、または他の候補薬物）を投与して、本発明のポリペプチドの異常な発
現または活性に関わる疾患または障害を治療することができるかを決定すること
ができる。例えば、このような方法を使って、被験者を特定の薬剤または薬剤の
クラス（例えば、該ポリペプチドの活性を低下させるタイプの薬剤）を用いて効
果的に治療できるかを決定することができる。したがって、本発明は、本発明の
ポリペプチドの異常な発現または活性に関わる障害に対する薬剤を用いて、被験
者を効果的に治療することができるかを決定する方法を提供し、該方法では、試
験サンプルを得て、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を検
出する（例えば、ここで、該ポリペプチドまたは核酸が存在すると、被験者は該
ポリペプチドの異常な発現または活性に関わる障害を治療する薬剤を投与するこ
とができると診断する）。

【０１９５】 本発明の方法はまた、本発明の遺伝子中の遺伝子損傷または変異を検出し、そ
れによって、損傷遺伝子をもつ被験者が本発明のポリペプチドの異常な発現また
は活性で特徴づけられる障害のリスクをもつかを決定するために使うことができ
る。好ましい実施形態では、該方法は、被験者から得た細胞のサンプル中に、本
発明のポリペプチドをコードする遺伝子の成分に影響を与える少なくとも１つの
変更、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の誤発現により特徴づけ
られる、遺伝子損傷または変異の存在または不在を検出することを含む。例えば
、そのような遺伝子損傷または変異は、1)該遺伝子からの１以上のヌクレオチド
の欠失；2)該遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加；3)該遺伝子の１以上のヌ
クレオチドの置換；4)該遺伝子の染色体の再配置；5)該遺伝子のメッセンジャー
RNA転写レベルの変更；6)ゲノムDNAのメチル化パターンのような、該遺伝子の異
常な修飾；7)該遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパ
ターンの存在；8)該遺伝子によりコードされるタンパク質の非野生型レベル；9)
該遺伝子の対立遺伝子損失；および10)該遺伝子によりコードされるタンパク質
の不適当な翻訳後の改変；の少なくとも１つの存在を確かめることによって検出
することができる。本明細書に記載のように、当業界には、遺伝子損傷を検出す
るために使うことができる多数のアッセイ技術がある。

【０１９６】 ある特定の実施形態では、損傷の検出は、アンカーPCRもしくはRACE PCRのよ
うなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（米国特許第4,683,195号および第4,683,202
号を参照）、または、あるいは、ライゲーション連鎖反応（LCR）（例えば、Lan
degranら, (1988) Science 241:1077-1080；およびNakazawaら, (1994) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 91:360-364を参照）におけるプローブ／プライマーの使用
を含み、後者のLCRは、特に遺伝子の点突然変異を検出するのに有用である（例
えば、Abravayaら, (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682を参照）。この方法
は、患者から細胞のサンプルを採集し、該サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲ
ノム、mRNAまたは両方）を単離し、該核酸サンプルを、遺伝子（もし存在すれば
）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で選定した遺伝子と特異
的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させ、そして増幅産物の存在
もしくは不在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出して対照サンプルと
その長さを比較する工程を含むことができる。PCRおよび／またはLCRを、本明細
書に記載の変異を検出するために使われる任意の技術と一緒に、予備増幅工程と
して使うことが望ましいであろうと考えられる。

【０１９７】 別の増幅法は、自己持続配列複製（Guatelliら, (1990) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwohら, (1989) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86:1173-1177）、Q-β レプリカーゼ (Lizardiら, (1988) Bio/Tec
hnology 6:1197）、または他の核酸増幅法を含み、続いて、当業者に周知の技術
を使って増幅分子を検出する。このような分子が非常に少数しか存在しない場合
、これらの検出スキームは核酸分子の検出に特に有用である。

【０１９８】 別の実施形態では、サンプル細胞由来の選定遺伝子の変異は、制限酵素切断パ
ターンの変化により同定することができる。例えば、サンプルおよび対照DNAを
単離し、（場合によっては）増幅し、１種以上の制限酵素を用いて消化し、そし
て断片長サイズをゲル電気泳動により決定して比較する。サンプルと対照DNAの
間の断片長サイズの相違は、サンプルDNAの変異を示す。さらに、配列特異的リ
ボザイムの使用（例えば米国特許第5,498,531号を参照）を用いて、リボザイム
切断部位の発生または消失によって特定の変異の存在をスコアすることができる
。

【０１９９】 他の実施形態では、遺伝子変異は、サンプルと対照核酸、例えばDNAまたはRNA
を、数百もしくは数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイと
ハイブリダイズさせることによって同定することができる（Croninら, (1996) H
uman Mutation 7:244-255；Kozalら, (1996) Nature Medicine 2:753-759）。例
えば、遺伝子変異を、クローニンら（Croninら, 前掲）の記載のように軽く作製
した（light-generated）DNAプローブを含有する二次元アレイで同定することが
できる。簡単に説明すると、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを
使ってサンプル中および対照中の長いDNAの伸展部を走査し、連続オーバーラッ
ププローブの線形アレイを作って配列間の塩基変化を同定することができる。こ
のステップにより点突然変異を同定することができる。このステップに続いて第
２のハイブリダイゼーションアレイにより、検出された全ての変異体または変異
に相補的なもっと小さい特殊化したプローブアレイを使って、特定の変異の特性
決定を行うことができる。各変異アレイは、平行なプローブセットから構成され
、１つは野生型遺伝子に相補的であり、そして他は変異遺伝子に相補的である。

【０２００】 さらに他の実施形態では、当業界で公知の様々な配列決定反応のいずれかを使
って、選定した遺伝子の直接配列決定をし、該サンプル核酸の配列を対応する野
生型（対照）配列と比較することによって変異を検出することができる。配列決
定反応の例としては、マキシムおよびギルバート（MaximおよびGilbert, (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560）またはサンガー（Sanger, (1977) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74:5463）により開発された技術に基づくものが挙げら
れる。診断アッセイを実施するときに、質量分析計による配列決定（例えば、PC
T公開第WO94/16101号；Cohenら, (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162；および
Griffinら, (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159を参照）を含む、
様々な自動配列決定方法のいずれかを利用できることも考えられる（(1995) Bio
/Technique 19:448）。

【０２０１】 選定した遺伝子の変異を検出する他の方法としては、開裂剤から保護すること
によって、RNA／RNAまたはRNA／DNAへテロ二重らせん中のミスマッチ塩基を検出
する方法（Myersら, (1985) Science 230:1242）が挙げられる。一般的に、「ミ
スマッチ開裂」の技術には、野生型配列を含有する（標識した）RNAもしくはDNA
を組織サンプルから得た潜在的変異RNAもしくはDNAとハイブリダイズさせて形成
されるヘテロ二重らせんを得ることが必要である。２本鎖の二重らせんを、対照
とサンプル鎖の間の塩基対ミスマッチによって存在するような二重らせん中の１
本鎖領域を開裂する薬剤で処理する。RNA／DNA二重らせんは、RNアーゼで処理し
てミスマッチ領域を消化することができ、DNA／DNAハイブリッドは、S1ヌクレア
ーゼで処理してミスマッチ領域を消化することができる。他の実施形態では、ミ
スマッチ領域を消化する目的で、DNA／DNAまたはRNA／DNA二重らせんをヒドロキ
シルアミンもしくはオスミウムテトロキシドによりおよびピペリジンにより処理
することができる。ミスマッチ領域の消化後、得た物質を、その後、変性ポリア
クリルアミドゲル上でサイズにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、
Cottonら, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397；Saleebaら, (1992) M
ethods Enzymol. 217:286-295を参照されたい。好ましい実施形態では、対照DNA
またはRNAに検出のための標識を付することができる。

【０２０２】 さらに他の実施形態では、細胞サンプルから得たcDNA中の点突然変異を検出し
てマッピングするための規定された系において、ミスマッチ開裂反応では、２本
鎖DNA中のミスマッチ塩基対を認識する１種以上のタンパク質（「DNAミスマッチ
修復」酵素と呼ばれる）を用いる。例えば、大腸菌（E.coli)のmutY酵素はG/Aミ
スマッチのAを開裂し、HeLa細胞由来のチミジン-DNAグリコシラーゼはG/Tミスマ
ッチのTを開裂する（Hsuら, (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662）。例示の実
施形態によると、選定した配列、例えば野生型配列に基づくプローブを、試験細
胞由来のcDNAまたは他のDNA産物とハイブリダイズさせる。該二重らせんをDNAミ
スマッチ修復酵素で処理し、もし存在すれば、開裂産物を電気泳動プロトコル等
から検出することができる。米国特許第5,459,039号を参照されたい。

【０２０３】 他の実施形態では、電気泳動移動度の変化を使って、遺伝子の変異を同定する
ことができる。例えば、１本鎖コンフォメーション多形（SSCP）を使って変異型
および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出することができる（Oritaら,
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766；Cotton (1993) Mutat. Res. 28
5:125-144；Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79）。サンプルお
よび対照核酸の１本鎖DNA断片を変性させ、再生させる。１本鎖核酸の二次構造
は配列によって異なり、得られる電気泳動移動度の変化により単一塩基の変化で
すら検出が可能である。DNA断片は、標識してもよいし、または標識プローブに
より検出することができる。アッセイの感度は、（DNAよりむしろ）二次構造が
配列の変化に対して感度の高いRNAを使って向上させることができる。好ましい
実施形態では、対象の方法において、ヘテロ二重らせん分析を用いて、電気泳動
移動度の変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重らせん分子を分離する（Keenら, (1
991) Trends Genet. 7:5）。

【０２０４】 さらに他の実施形態では、変性剤濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲル中
での変異型または野生型断片の移動を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturi
ng gradient gel electrophoresis）（DGGE）を使ってアッセイする（Myersら,
(1985) Nature 313:495）。DGGEを分析法として使うときは、DNAが完全に変性し
ないように、例えば、PCRにより約40bpの高融点GCリッチDNAの'GCクランプを加
えて、DNAを改変する。さらなる実施形態では、変性剤濃度勾配の代わりに温度
勾配を使って対照とサンプルDNAの移動度の差を同定する（RosenbaumおよびReis
sner (1987) Biophys. Chem. 265:12753）。

【０２０５】 点突然変異を検出する他の技術の例としては、限定されるものでないが、選択
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プラ
イマー伸長が挙げられる。例えば、既知の変異を中央に配置したオリゴヌクレオ
チドプライマーを調製し、その後、完全マッチであるときにのみハイブリダイゼ
ーションが可能な条件のもとで、標的DNAとハイブリダイズさせる（Saikiら, (1
986) Nature 324:163）；Saikiら, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:623
0）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオ
チドがハイブリダイジングメンブランに結合しかつ標識した標的DNAとハイブリ
ダイズしているときに、PCR増幅した標的DNAまたは複数の異なる変異体とハイブ
リダイズさせる。

【０２０６】 あるいは、選択的PCR増幅に依る対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と一緒
に使うことができる。特異的増幅用プライマーとして使うオリゴヌクレオチドは
、対象の変異を、分子の中央（増幅が差別的ハイブリダイゼーションに依るよう
に）（Gibbsら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448）か、または適当な
条件のもとでミスマッチがポリメラーゼ伸長を防ぐかまたは低減し得る１つのプ
ライマーの3'末端に（Prossner (1993) Tibtech 11:238）保有することができる
。さらに、変異の領域に新規の制限酵素切断部位を導入して、開裂に基づく検出
ができるようにすることが望ましい（Gaspariniら, (1992) Mol. Cell Probes 6
:1）。ある特定の実施形態では、増幅はまた、増幅用Taqリガーゼを使って行う
ことが考えられている（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189）
。このような場合、3'末端で5'配列の完全マッチがあるときにのみ連結反応が起
こり、増幅の存在または不在を探すことによって特定部位での既知の変異の存在
を検出することが可能となる。

【０２０７】 本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の少なくとも１種のプロー
ブ核酸もしくは抗体試薬を含んでなるプレパック診断キットを用いて実施するこ
とができ、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の関与する疾患ま
たは病気の症状または家族履歴を示す患者を診断する臨床の場において、都合よ
く使うことができる。さらに、本発明のポリペプチドが発現されている任意の細
胞型または組織、好ましくは末梢血白血球を、本明細書に記載の予後アッセイに
用いることができる。

【０２０８】 ３．薬理遺伝学 本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定される本発明のポリペプ
チドの活性または発現に対して刺激または阻害効果を有する薬剤、またはモジュ
レーターを個人に投与して、該ポリペプチドの異常な活性に関わる障害を（予防
としてまたは治療として）処置することができる。このような処置と一緒に、個
人の薬理遺伝学（すなわち、個人の遺伝型とその個人の外来化合物または薬物に
対する応答との間の関係の研究）を考慮することができる。治療薬の代謝の差は
、薬理活性のある薬物の用量と血中濃度の間の関係を変えることにより、重篤な
毒性または治療の失敗を起こし得る。したがって、個人の薬理遺伝学により、個
人の遺伝型の考慮に基づく、予防または治療のための効果的な薬剤（例えば、薬
物）の選択が可能となる。さらに、このような薬理遺伝学を使って、適当な用量
および治療体制を決定することができる。したがって、個人における、本発明の
ポリペプチドの活性、本発明の核酸の発現、または本発明の遺伝子の変異含量を
決定して、それによって個人の治療または予防処置のための適当な薬剤を選定す
ることができる。

【０２０９】 薬理遺伝学は、患者の変化した薬物素質および異常作用に因る薬物に対する応
答の臨床的に有意な遺伝的変異を扱う。例えば、Linder (1997) Clin. Chem. 43
(2):254-266を参照されたい。一般的に、２つの型の薬理遺伝学的条件を区別す
ることができる。薬物が身体に作用する方法を変える単一因子として伝えられた
遺伝条件は「変化した薬物作用（altered drug action）」と呼ばれる。身体が
薬物に作用する方法を変える単一因子として伝えられた遺伝条件は、「変化した
薬物代謝（altered drug metabolism）」と呼ばれる。これらの薬理遺伝学的条
件は、稀な欠陥としてまたは多形として起こりうる。例えば、グルコース-6-リ
ン酸デヒドロゲナーゼ不全症（G6PD）は一般的な遺伝性酵素異常症であり、主な
臨床複合症はオキシダント薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニト
ロフラン）摂取および黄せんマメ（fava beans）消費後の溶血である。

【０２１０】 説明のための実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および
時間の両方の主要決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、N-アセチルトランス
フェラーゼ2（NAT2）ならびにチトクロムP450酵素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝
多形の発見により、或る患者が何故期待の薬物効果を得られないか、または、何
故標準で安全な用量の薬物摂取後に過剰な薬物応答および重篤な毒性を示すかを
説明することができる。これらの多形は、集団中に２つの表現型、迅速代謝型（
extensive metabolizer）（EM)および貧代謝型（poor metabolizer）（PM）で発
現される。集団が異なると、PMの発症率は異なる。例えば、CYP2D6をコードする
遺伝子は高度に多形性であり、複数の変異がPMにおいて同定されており、その全
てで機能的CYP2D6が不在となっている。CYP2D6およびCYP2C19の貧代謝型は、標
準用量を受けると、高い頻度で過剰の薬物応答および副作用を経験する。もし代
謝産物が活性治療成分であれば、CYP2D6生成代謝産物モルヒネが介在するコデイ
ンの鎮痛効果で実証されるように、PMは治療応答を示さない。他の極端な例は、
いわゆる超迅速代謝型であり、標準用量に応答しない。最近、超迅速代謝産物の
分子基本形は、CYP2D6遺伝子増幅によることが同定された。

【０２１１】 したがって、個人における、本発明のポリペプチドの活性、該ポリペプチドを
コードする核酸の発現、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の変異含量を
決定して、それにより、個人の治療および予防処置のために適切な薬剤を選択す
ることができる。さらに、薬理遺伝学的研究を使って、薬物代謝酵素をコードす
る多形性対立遺伝子の遺伝型決定を、個人の薬物応答表現型の同定に応用するこ
とができる。この知識を、本明細書に記載した例示のスクリーニングアッセイの
１つにより同定したモジュレーターのような該ポリペプチドの活性または発現の
モジュレーターをもつ患者を治療するときに、用量決定または薬物選択に応用す
ると、有害な反応または治療失敗を回避し、治療または予防効果を向上すること
ができる。

【０２１２】 ４．臨床試験中の効果のモニタリング 本発明のポリペプチドの発現または活性（例えば、異常細胞増殖および／また
は分化をモジュレートする能力）に対する、薬剤（例えば、薬物、化合物）の影
響のモニタリングは、基本的スクリーニングアッセイのみでなく、臨床試験にも
応用することができる。例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによ
り決定された、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を増加させ
る薬剤の有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベル、またはタンパク質活性の低
下を示す被験者の臨床試験でモニターすることができる。あるいは、スクリーニ
ングアッセイにより決定された、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク
質活性を減少させる薬剤の有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベル、またはタ
ンパク質活性の増加を示す被験者の臨床試験でモニターすることができる。

【０２１３】 例えば、限定するものではないが、（例えば、本明細書に記載のスクリーニン
グアッセイで同定された）本発明のポリペプチドの発現または活性をモジュレー
トする薬剤（例えば、化合物、薬物または小分子）を用いる治療により細胞中で
モジュレートされた、本発明の遺伝子などの遺伝子を同定することができる。し
たがって、薬剤の細胞増殖障害に対する効果を研究するために、例えば、臨床試
験で、細胞を単離し、RNAを調製し、そして本発明の遺伝子および該障害に関わ
る他の遺伝子の発現レベルを分析することができる。遺伝子の発現レベル（すな
わち、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載のようにノーザンブロット分析
またはRT-PCRにより、あるいは本明細書に記載の方法の１つによって、産生され
るタンパク質の量を測定することにより、または本発明の遺伝子または他の遺伝
子の活性のレベルを測定することにより定量することができる。この方法で、遺
伝子発現パターンは、細胞の該薬剤に対する生理学的応答を示すマーカーの役割
を果たす。したがって、この応答状態を、該薬剤を用いる個人の治療の前、およ
び治療中の様々な時点で測定することができる。

【０２１４】 好ましい実施形態では、本発明は、ある薬剤（例えば、本明細書に記載のスク
リーニングアッセイにより同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類
似体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の候補薬物）を用いる被
験者の治療の有効性をモニターする方法であって、(i)薬剤投与の前に被験者か
ら投与前サンプルを得ること；(ii)投与前サンプル中の本発明のポリペプチドま
たは核酸のレベルを検出すること；(iii)被験者から１以上の投与後サンプルを
得ること；(iv)投与後サンプル中の本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルを
検出すること；(v)投与前サンプル中の本発明のポリペプチドまたは核酸のレベ
ルと、投与後サンプル中の本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルとを比較す
ること；および(vi)それによって、被験者への薬剤の投与を変更すること；の各
ステップを含んでなる前記方法を提供する。例えば、薬剤の投与増加は、該ポリ
ペプチドの発現または活性を検出したより高いレベルに増加させるため、すなわ
ち薬剤の効果を増加させるために望ましいであろう。あるいは、薬剤の投与減少
は、該ポリペプチドの発現または活性を検出したより低いレベルに減少させるた
め、すなわち薬剤の効果を減少させるために望ましいであろう。

【０２１５】 C.治療法 本発明は、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性に関わる障害のリス
クがあるか（もしくは、感受性があるか）または該障害を有する被験者を処置す
る、予防および治療の両方の方法を提供する。このような障害は、例えば、リポ
タンパク質代謝の障害、リポタンパク質輸送の障害、神経変性障害、神経精神医
学的障害および凝固障害を含むことができる。

【０２１６】 １．予防法 １つの様態では、本発明は、被験者における本発明のポリペプチドの異常な発
現または活性に関わる疾患または症状を、該ポリペプチドの発現または少なくと
も１つの活性をモジュレートする薬剤を該被験者に投与することにより、予防す
る方法を提供する。本発明のポリペプチドの異常な発現または活性により引き起
こされるかまたはそれらを一因とする疾患のリスクがある被験者は、例えば、本
明細書に記載した任意のまたは組合わせの診断または予後アッセイにより同定す
ることができる。予防薬剤の投与を異常の特徴である症候の発現前に行い、それ
により疾患または障害を予防するか、または代わりに、その進行を遅らせること
ができる。異常の型に依って、例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト剤を被
験者の治療に使うことができる。適当な薬剤は、本明細書に記載のスクリーニン
グアッセイに基づいて決定することができる。

【０２１７】 2．治療法 本発明の他の様態は、治療目的のために、本発明のポリペプチドの発現または
活性をモジュレートする方法に関わる。本発明のモジュレート方法は、細胞を、
該ポリペプチドの１以上の活性をモジュレートする薬剤と接触させることに関わ
る。活性をモジュレートする薬剤は、核酸またはタンパク質、該ポリペプチドの
天然のコグネイトリガンド、ペプチド、ペプチド類似体、または他の小分子のよ
うな、本明細書に記載の薬剤であることができる。１つの実施形態では、薬剤は
、該ポリペプチドの１以上の活性を刺激する。このような刺激薬剤は、細胞中に
導入された本発明の活性ポリペプチドおよび本発明のポリペプチドをコードする
核酸分子を含む。他の実施形態では、薬剤は本発明のポリペプチドの１以上の生
物学的活性を阻害する。このような阻害薬剤は、アンチセンス核酸分子および抗
体を含む。これらのモジュレート方法は、in vitroで（例えば前記細胞を前記薬
剤とともに培養することにより）、あるいは、in vivoで（例えば、前記薬剤を
被験者に投与することにより）実施することができる。このように、本発明は、
本発明のポリペプチドの異常な発現または活性により特徴づけられる疾患または
障害に罹った個人を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、該方法は、
発現または活性をモジュレートする（例えば、上方調節するかまたは下方調節す
る）薬剤（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定された
薬剤）または薬剤の組合わせを投与することを含む。他の実施形態では、該方法
は、前記ポリペプチドの低下したまたは異常な発現または活性を補うための治療
法として、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸分子を投与することに関わ
る。

【０２１８】 活性の刺激は、活性または発現が異常に低いかまたは下方調節され、および／
または、活性の増加が恐らくは有益な効果をもつ状況において望ましい。逆に、
活性の阻害は、活性または発現が異常に高いかまたは上方調節され、および／ま
たは、活性の減少が恐らくは有益な効果をもつ状況において望ましい。

【０２１９】 本発明を、さらに以下の実施例により説明するが、これらは限定として理解さ
れてはならない。本出願書を通じて引用された全ての参照文献、特許および公告
された特許出願は、本明細書に参照により組み入れられる。

【０２２０】等価物 当業者であれば、日常実験以上のものを使うことなく、本明細書に記載した本
発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確かめることが可能
であろう。このような等価物は、特許請求の範囲に含まれると意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、マウスTANGO 136の部分cDNA配列(配列番号１)と推定部分アミノ酸配
列(配列番号２)を示す。配列番号１のオープンリーディングフレームは、ヌクレ
オチド89〜ヌクレオチド1813にわたる(配列番号３)。

【図２】 図２は、マウスTANGO 136の一部のヒドロパシープロットを示す。比較的疎水
性の残基は水平線よりも上方に位置し、比較的親水性の残基は水平線よりも下方
に位置する。システイン残基(cys)と潜在的なN-グリコシル化部位(Ngly)は、ヒ
ドロパシートレースの真下に短い垂直線で示す。

【図３】 図３は、ヒトTANGO 136のcDNA配列(配列番号４)と推定アミノ酸配列(配列番号
５)を示す。配列番号４のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド541〜
2679にわたる(配列番号６)。

【図４】 図４は、ヒトTANGO 136のヒドロパシープロットを示す。比較的疎水性の残
基は水平線よりも上方に位置し、比較的親水性の残基は水平線よりも下方に位置
する。システイン残基(cys)と潜在的なN-グリコシル化部位(Ngly)は、ヒドロパ
シートレースの真下に短い垂直線で示す。

【図５】 図５は、マウスTANGO 136(部分配列；配列番号２)、ヒトTANGO 136(配列番号
５)、ヒトLRp105(配列番号11)およびラットLRp105(配列番号13)のアミノ酸配列
のアライメントを示す。

【図６】 図６は、マウスTANGO 136(部分配列；配列番号１)およびヒトTANGO 136(配列
番号４)の核酸配列のアライメントを示す。

【図７】 図７は、マウスTANGO 136(部分配列；配列番号２)およびヒトTANGO 136(配列
番号５)のアミノ酸配列のアライメントを示す。

【図８】 図８は、マウスTANGO 136のCUB様ドメインとコンセンサスCUBドメインとのア
ライメントを示す。これらのアライメント中、２つの配列間で大文字の活字は正
確な一致を示し、「＋」は類似を示す。

【図９】 図９は、ヒトTANGO 136のCUB様ドメインとコンセンサスCUBドメインとのアラ
イメントを示す。これらのアライメント中、２つの配列間で大文字の活字は正確
な一致を示し、「＋」は類似を示す。

【図１０】 図１０は、ヒトTANGO 136のLDLクラスＡドメインとコンセンサスLDLクラスＡ
ドメインとのアライメントを示す。これらのアライメント中、２つの配列間で大
文字の活字は正確な一致を示し、「＋」は類似を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/50 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ａ６１Ｐ 3/10 5/16 33/566 7/02 // Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 5/16 13/12 7/02 25/14 9/10 25/16 13/12 25/18 25/14 25/24 25/16 25/28 25/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 25/24 Ａ６１Ｋ 37/02 25/28 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA64 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 BA65 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ53 QR32 QR55 QS34 4B065 AA90X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA07 CA53 ZA12 ZA16 ZA18 ZA22 ZA45 ZA54 ZA81 ZC06 ZC35 4C086 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA02 ZA06 ZA12 ZA16 ZA18 ZA22 ZA45 ZA54 ZA81 ZC06 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA01 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の核酸分子： a) 配列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、ATCCに受託番号9888
   0として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物、またはその相補体に対して少なく
   とも55％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、 b) 配列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、ATCCに受託番号9888
   0として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物、またはその相補体の少なくとも300
   ヌクレオチドの断片を含む核酸分子、 c) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
   て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドをコードする核酸分子、 d) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはATCCに
   受託番号98880として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるポ
   リペプチドの断片であって、配列番号２もしくは５、またはATCCに受託番号9888
   0として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるポリペプチドの
   少なくとも15個連続しているアミノ酸を含む該断片をコードする核酸分子、およ
   び e) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
   て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドの天然の対立遺伝子変異体をコードし、配列番号３もしくは６または
   その相補体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸
   分子、 からなる群より選択される単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 次の核酸分子： a) 配列番号１、３、４もしくは６のヌクレオチド配列、ATCCに受託番号9888
   0として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物、またはその相補体を含む核酸分子
   、および b) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
   て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドをコードする核酸分子、 からなる群より選択される、請求項１記載の単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 ベクター核酸配列をさらに含む、請求項１記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求
   項１記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項１記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
6. 【請求項６】 哺乳動物宿主細胞である、請求項５記載の宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１記載の核酸分子を含有する非ヒト哺乳動物宿主細胞
   。
8. 【請求項８】 次のポリペプチド： a) 配列番号２または５のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、
   配列番号２または５の少なくとも15個連続しているアミノ酸を含む該断片、 b) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
   て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドの天然の対立遺伝子変異体であって、配列番号１もしくは４またはそ
   の相補体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分
   子によりコードされるポリペプチド、および c) 配列番号１もしくは４のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分
   子に対して少なくとも55％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子に
   よりコードされるポリペプチド、 からなる群より選択される単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番
   号98880として寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸
   配列を含む、請求項８記載の単離されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項８記載のポリペプ
    チド。
11. 【請求項１１】 請求項８記載のポリペプチドと選択的に結合する抗体。
12. 【請求項１２】 次のポリペプチド： a) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
    て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
    リペプチド、 b) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
    て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列の断片で
    あって、配列番号２もしくは５、またはATCCに受託番号98880として寄託された
    プラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも15個連続
    しているアミノ酸を含む該断片からなるポリペプチド、 c) 配列番号２もしくは５のアミノ酸配列、またはATCCに受託番号98880とし
    て寄託されたプラスミドのcDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を含むポ
    リペプチドの天然の対立遺伝子変異体であって、配列番号１もしくは４またはそ
    の相補体を含む核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分
    子によりコードされるポリペプチド、 からなる群より選択されるポリペプチドを生産する方法であって、請求項５記載
    の宿主細胞を、該核酸分子が発現される条件下で培養することを含んでなる方法
    。
13. 【請求項１３】 サンプル中の請求項８記載のポリペプチドの存在を検出す
    る方法であって、 a) サンプルに、請求項８記載のポリペプチドと選択的に結合する化合物を接
    触させ、 b) 該化合物がサンプル中の該ポリペプチドと結合するか否かを判定する、 ことを含んでなる方法。
14. 【請求項１４】 前記ポリペプチドと結合する前記化合物が抗体である、請
    求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項８記載のポリペプチドと選択的に結合する化合物、
    およびその使用説明書を含んでなるキット。
16. 【請求項１６】 サンプル中の請求項１記載の核酸分子の存在を検出する方
    法であって、 a) サンプルに、該核酸分子と選択的にハイブリダイズする核酸プローブまた
    はプライマーを接触させ、 b) 該核酸プローブまたはプライマーがサンプル中の核酸分子と結合するか否
    かを判定する、 ことを含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 前記サンプルがmRNA分子を含み、該サンプルに核酸プロー
    ブを接触させる、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 請求項１記載の核酸分子と選択的にハイブリダイズする化
    合物およびその使用説明書を含んでなるキット。
19. 【請求項１９】 請求項８記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する
    方法であって、 a) 請求項８記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現している細胞に
    試験化合物を接触させ、 b) 該ポリペプチドが試験化合物と結合するか否かを判定する、 ことを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 前記試験化合物とポリペプチドとの結合が、 a) 試験化合物／ポリペプチド結合の直接検出による結合の検出、 b) 競合結合アッセイを用いる結合の検出、 c) TANGO 136-介在シグナル伝達についてのアッセイを用いる結合の検出、 からなる群より選択される方法で検出される、請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項８記載のポリペプチドの活性をモジュレートする方
    法であって、請求項８記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現している
    細胞に、該ポリペプチドの活性をモジュレートするのに十分な濃度の、該ポリペ
    プチドと結合する化合物を接触させることを含んでなる方法。
22. 【請求項２２】 請求項８記載のポリペプチドの活性をモジュレートする化
    合物の同定方法であって、 a) 請求項８記載のポリペプチドに試験化合物を接触させ、 b) 該ポリペプチドの活性に及ぼす該試験化合物の作用を調べ、それにより該
    ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定する、 ことを含んでなる方法。