KR20040088072A - Ｇ-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 핵산 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 염증 및 생리학적 면역 반응에 관한 시그날 전달과 관련하여 신규하고 유용한 G-단백질 결합된 수용체를 제공한다. 또한, 수용체를 이용하여 수용체 활성을 조절할 수 있는 분자를 스크리닝하는 방법도 제공한다. 이와 같은 분자는 염증 과다 및 면역 관련 질환 및 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

Ｇ-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 핵산 및 이의 용도{A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof}

발명의 배경

G 단백질 결합된 수용체(GPCR)는 세포 시그날 전달과 관련된 막에 결합된 거대한 군의 통합 막 단백질이다. GPCR들은 신경전달물질, 호르몬, 방취제, 빛 등을 포함하는 다양한 세포 외부 시그날에 반응하여, 시그날을 전달시키는 능력을 보유하여, 세포내에 제2 메신져 반응이 시작될 수 있도록 한다. 염증, 기관지 확장, 심박율, 혈관확장, 엔도크린 방출, 연동운동을 포함하는 많은 다양한 생리학적 반응을 이와 같은 수용체가 중재하고 있기 때문에, GPCR은 많은 치료 약물의 표적이 된다.

GPCR은 세포외 도메인, 7개의 막관통 도메인, 세포내 도메인으로 구성된 특징이 있다. 리간드에 결합하거나, G 단백질과 상호작용 하는 등의 수용체에 의해 실행되는 기능 중 일부는 중요 위치에 존재하는 특정 아미노산과 관련있다. 예를 들면, 각종 연구에서 보여준 바와 같이, GPCR의 아미노산 서열이 달라지면 자연 리간드 또는 소분자 효능제 또는 길항제에 대한 친화력이 달라진다. 즉 환언하면, 서열에서의 작은 차이가 결합 친화력 및 활성 차이의 원인이 될 수 있다(Meng 등., J Bio Chem (1996) 271(50):32016-20; Burd 등., J Bio Chem (1998) 273(51):34488-95; Hurley 등., J Neurochem (1999) 72(l):413-21). 특히, 연구에 따르면 제3 세포내 도메인에서 아미노산 서열 차이로 인하여 활성이 달라진다. Myburgh등은 고나도트로핀 방출 호르몬의 세포내 3번 루프의 261번 알라닌이 G 단백질 결합 및 수용체 내재화(internalization)에 중요하다는 것을 밝혔다(Biochem J (1998) 33l(Part 3):8936). Wonerow 등은 티로트로핀 수용체에 대해 연구하였는데, 제3세포내 루프에 결손이 생기면 구성 수용체 활성이 야기된다고 설명한다(J Bio Chem (1998)273(14):7900-5).

일반적으로, 수용체에 내생 리간드가 결합하면 수용체의 세포내 도메인(들) 입체 구조가 변형되어, G 단백질의 세포내 성분과 세포내 도메인(들) 간에 결합이 형성된다. 몇 가지 G단백질이 존재하는데, 가령 Gq, Gs, Gi, Gz, Go (Dessauer 등., Clin Sci (Colch) (1996) 91(5):527-37 참고)등이 있다. IC-3 루프뿐만 아니라 수용체의 카르복시 말단도 G 단백질과 상호작용한다(Pauwels 등., Mol Neurobiol (1998) 17(13):109-135; Wonerow 등, 상기 참조). 일부 GPCR는 G 단백질에 관하여 “불규칙적”인 데 즉, GPCR는 한 개 이상 종류의 G 단백질과 상호작용할 수 있다(Kenakin, Life Sciences (1988) 43:1095).

리간드는 GPCR를 활성화시켜 G 단백질과 결합하도록 함으로써, 시그날 전달 연속 (cascade) 반응을 시작한다(이하 “시그날 전달”이라고 통칭함). 이와 같은 시그날 전달 과정으로 세포를 활성화시키거나 세포를 저해시킨다.

GPCR는 “활성”과 “비활성” 상태의 두 가지 상이한 형태 사이에 균형을 이루면서 세포막에 존재한다. 비활성 상태의 수용체는 생물학적 반응을 유도하는 세포내 시그날 전달 경로에 연결될 수 없다(예외적으로 형질 도입된 세포에서 수용체가 과다 발현되는 경우가 있다, 참조예: www.creighton,edu/phamacology/inverse.htm) . 활성 상태로 모양이 조절되면, 전달 경로(G 단백질을 경유하여)에 연결되어 생물학적 반응이 일어난다. 효능제가 결합하면 활성 상태 모양으로 더 잘 만들 수도 있다. 그러나, 때때로 임의 효능제 없이도 상당한 반응이 있다면 이와 같은 수용체는 구성적으로 활성화되었다고 말하는 경우도 있다(즉, 이미 활성 형태이거나 리간드에 대해 독립적이거나 또는 자가 활성 상태일 수 있다). 이와 같은 시스템에 효능제가 추가되는 경우에 보편적으로 강화된 반응이 관찰된다. 그러나, 전통적인 길항제가 추가되는 경우에, 이와 같은 분자가 결합되어도 영향이 없다. 한편 일부 길항제는 수용체의 구성 활성을 저해하는 원인이 되는데, 약물의 경우 기술적으로는 길항제가 아니지만, 음성적 고유 활성을 가지는 효능제임을 시사한다. 이와 같은 약물을 “역 효능제”라고한다참조예: www.creighton,edu/phamacology/inverse.htm).

수용체에 대한 통상적인 연구는 길항제 및 다른 수용체 효능 인자 분자를 발견하기 전에 내생 리간드가 우선적으로 확인된다는 전제로부터 진행되어 왔다. 길항제가 먼저 발견되었더라도 독단적인 반응으로 내생 리간드를 확인한다(WO 00/22131). 그러나, 스크리닝을 목적으로 하는 분석 경우에 활성 상태가 가장 유용하기 때문에, 구성 수용체, 특히 GPCR를 수득하면 내생 리간드에 관한 정보 없이도 효능제, 부분 효능제, 역 효능제 및 길항제를 쉽게 분리할 수 있다. 또한, 수용체 활성 장애로 인한 질병인 경우에, 자가 활성 상태에 있는 수용체를 이용하면 구성 활성을 저해시키는 약물 또는 좀더 구체적으로 활성화된 수용체의 효과 농도를 감소시키는 약물을 바로 발견할 수 있었을 것이다. 예를 들면, 질병을 치료하기 위해 환자에게 형질 감염될 수 있는 수용체의 경우에, 이와 같은 수용체의 활성을 상기 분석에 의해 발견될 수 있는 역 효능제로 세밀히 조정할 수 있다.

천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염 (RA)과 같은 질환은 일반적으로 T 헬퍼 세포, 단세포 대식세포, 호산구가 연관된 염증 병인을 가지는 것으로 보고 있다. 코르티코스테로이드를 이용한 현재 항 염증 치료법은 천식에는 효과가 있으나, 대사적 부작용 및 엔도크린 부작용이 연루된다. 폐 또는 비강 점막을 통하여 흡수될 수 있는 흡입된 조제물의 경우에도 같을 것으로 보고 있다. RA 또는 COPD 치료용으로 현재 만족할만한 경구 치료법은 없다.

호산구는 알레르기 및 천식에서 많은 기도 기능장애를 중재한다. 인터루킨-5 (IL-5)는 호산구 생장 및 활성화시키는 사이토킨이다. 연구에 따르면 조직의 호산구백혈구 증가증 및 기도-기능항진증으로 발전되는 호산구-중재된 조직 손상에 IL-5가 필수적인 것으로 나타났다(Chang 등., J Allergy Clin Immunol (1996) 98(5 pt1):922-931 및 Duez 등., Am J Respir Crit Care Med (2000) 161(1):200-206). 아토피성 천식에 노출된 알레르겐(예를 들면 집먼지 진드기 항원)에 의해 T-헬퍼-2-세포(Th2)에 의해 IL5가 만들어진다.

병변 활막에서 활성화된 대식세포 누적으로 인하여 RA가 나타나는 것으로 보고있다. 인터페론γ (IFNγ)는 수많은 선염증성 성질을 가지는 T헬퍼1 (Th1) 세포에 의해 유도되는 사이토킨이다. 인터페론은 대식세포를 활성화시키는 가장 강력한 사이토킨이고, MHC 클래스 II 유전자 전사를 유도하여 수지상 세포-유사 표현형에 기여한다.

리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성 세균 세포 벽의 한 성분으로써, 종양 괴사 인자 α (TNFα) 방출 등을 포함하는 염증 반응을 유도한다. RA에서 정맥내 항TNFα 치료법의 효능을 임상적으로 설명한 바 있다. 폐에 대식세포가 누적되어 COPD가 발생되는 것으로 보고있으며, 대식세포는 호중구 화학물질 유인제(예를 들면, IL8: de Boer 등., J Pathol (2000) 190(5):619-626)를 만든다. 대식세포와 호중구 모두는 기포 벽의 붕괴 원인이 되는 카텝신을 방출한다. 염증성 세포 화학 유인물질 및 다른 염증성 세포 활성화 물질의 중요한 공급원은 폐 상피인 것으로 보고 있다(예로써 Thomas 등., J Virol (2000) 74(18):8425-8433; Lamkhioued 등., Am J Respir Crit Care Med (2000) 162(2 Pt. 1):723-732; Sekiya 등., J Immunol (2000) 165(4):2205-2213을 참고).

질병에서 GPCR가 하는 역할 및 GPCR의 활성을 조절함으로써 질병을 치료하는 능력이 있다면, 아직까지 미확인된 GPCR를 동정하고, 특징을 확인하면, GPCR 활성과 연관된 질병을 치료할 수 있는 신규한 조성물 및 그 치유 방법 개발에 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 필요한 것은 미지의 GPCR 을 암호화하는 유용하고 신규한 핵산 분자를 발견하고, 분리하여, 그 특징을 밝히는 것이다.

미지의 GPCR를 이용하여 특정 GCPR 의 잠재적인 효능제 또는 길항제로 작용할 수 있는 분자를 확인하는 분석이 필요하다. 이와 같은 분자들은 생체내(in vivo)에서 GPCR 활성을 조절하는 치료제로 응용하여, GPCR 활성과 연관된 적혈구과다증을 치료한다.

여기에서, 문헌 인용이, 당해 문헌을 본 발명 이전의 “선행기술”로 이용할 수 있다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

발명의 요약

본 발명은 구성적으로 활성을 가지는 뮤린(murine)의 GPCR인 신규한 활성 GAVE19 발현을 확인하고, 특징을 조사하고, 관련 질환 확인 및 치료에 이용할 수 있는 방법 및 그 조성물을 제공한다.

따라서, 넓은 의미로, 본 발명에는 도 1의 DNA 서열(이하 ”서열 1”)로 구성된 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 유도체 및 유사체까지 포함시킬 수 있다. 이와 같은 본 발명의 변이체에는 대립형질 변이체, 축퇴성(degenerate) 변이체, 또는 서열에 축퇴성 변화를 유도하게 되는 대립형질 변이체가 포함 될 수도 있다.

또한, 본 발명은 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건 하에서 서열 1의 분리된 핵산 분자에 하이드리드될 수 있는 분리된 핵산, 이의 변이체까지도 포함된다. 또한, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열 1의 서열에 상보적인 분리된 핵산 분자에 하이드리드될 수 있는 분리된 핵산도 포함된다. 엄격한 하이브리드화 반응 조건은 하기에서 설명한다.

또한, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자도 포함된다.

상기한 바와 같은 본 발명의 분리된 핵산 분자에는 검출 가능한 표지가 부착될 수도 있다. 여기에서 사용할 수 있는 검출 가능한 표지로는 효소, 방사능 동위원소 또는 형광 화학물질이 포함되나, 이에 국한시키지는 않는다. 검출 가능한 표지의 특정 예는 다음에서 설명하고 있다.

본 발명에는 특정 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들면, 본 발명에는 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 정제된 폴리펩티드와 이의 보존성 변이체 또는 유사체 및 유도체도 포함된다. 임의로, 본 발명의 폴리펩티드에는 검출 가능한 표지가 부착될 수도 있다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드가 항체를 생산하는데 이용되는 면역원이 될 수 있어, 항체까지 포함된다. 이와 같은 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있다. 또한, 항체들은 “키메라” 형태가 될 수 있는데, 가령, 다른 종에서 본 발명의 정제된 폴리펩티드에 대항하여 형성된 항체의 단백질 도메인으로 구성될 수도 있다. 본 발명의 항체에는 검출 가능한 표지가 부착될수도 있다. 이용할 수 있는 특정 검출 가능한 표지에 대해서는 하기에서 설명하고있다.

본 발명에는 발현 조절 요소과 작용이 되도록 연합된, 서열 1의 DNA 서열로구성된 핵산 분자, 이의 변이체, 유사체 또는 유도체, 단편로 이루어진 발현 벡터도 포함된다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 발현 조절 요소과 작동 가능하도록 연합된 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산에 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 또는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자에 상보적인 하이브리드화 프로브에 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 핵산 분자로 구성될 수도 있고, 이때, 하이브리드화 프로브는 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 연합되어 있다. 여기에서 이용할 수 있는 발현 조절 요소의 구체적 예를 든다면 프로모터가 된다. 본 발명에 이용할 수 있는 특정 프로모터로는 hCMV 어얼리 프로모터, SV40 어얼리 프로모터, 아데노바이러스 어얼리 프로모터, 우두 어얼리 바이러스, 폴리오마(polyoma) 어얼리 프로모터, SV40 레이트 프로모터, 아데노바이러스 레이트 프로모터, 우두 레이트 프로모터, 폴리오마 레이트 프로모터,lac시스템,trp시스템,TAC시스템,TRC시스템, 파아지 람다의 주요 작동인자 및 프로모터 부분, fd 피복 단백질의 조절 부분, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 산 포스파타제 프로모터, 효모 α 교배 인자의 프로모터 등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

본 발명의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질감염시켜, 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 만들 수 있다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포가 될 수 있다. 여기에서 이용할 수 있는 단세포 숙주로는 대장균(E. coli), 슈도모나스(Pseudonomas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 효모(yeast), CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40,BMT10, Sf9 세포등이 포함된다.

또한, 본 발명에는 서열 2의 아미노산 서열를 포함하는 정제된 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 단편을 만드는 방법도 포함된다. 이와 같은 방법은 정제될 폴리펩티드가 발현할 수 있는 조건 하에서, 본 발명의 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; 및 단세포 숙주 또는 숙주 세포의 주변 배양물 또는 양쪽으로부터 정제된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에는 GAVE19 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 분석도 포함된다. 이와 같은 화합물은 GAVE19의 효능제, 길항제 또는 역 효능제가 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 내생 리간드 존재하에서 GAVE19를 발현시키는 세포와 잠재적인 효능제를 접촉시키는 단계; 및, GAVE19 의 시그날 전달 활성이 잠재적인 효능제가 없는 상태에서의 GAVE19 시그날 전달 활성과 비교하였을 때, 잠재적인 효능제가 존재하는 상태에서 GAVE19 시그날 전달 활성이 증가되었는지를 결정하는 단계를 포함하는 GAVE19의 효능제를 확인하는 방법도 포함된다.

유사하게, 본 발명에는 GAVE19의 역 효능제를 확인하는 방법도 포함된다. 이와 같은 방법은 GAVE19를 발현하는 세포를 잠재적인 역 효능제와 접촉시키는 단계, 잠재적인 역 효능제, 내생 리간드 또는 효능제가 있을 경우에, GAVE19의 시그날 전달 활성이 내생 리간드 또는 효능제는 있으나, 잠재적인 역 효능제가 없는 조건에서의 GAVE19 시그날 전달 활성과 비교하여 감소되었는지 여부와, 내생 리간드 또는 효능제 존재하에서 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함한다.

자연적으로, 본 발명은 GAVE19의 길항제를 확인하는 방법도 포함된다. 이 방법은 GAVE19를 발현하는 세포를 잠재적인 길항제와 접촉시키는 단계, 및 내생 리간드 또는 효능제가 있을 경우 GAVE19의 시그날 전달 활성과 비교하여, 잠재적인 길항제 존재하에 GAVE19 시그날 전달 활성이 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함한다.

따라서, 본 발명의 목적은 GAVE19 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 제공하는 것이다.

서열 1의 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자의 변이체 또는 엄격한 조건하에서 서열 1에 하이브리드화 할 수 있는 DNA 분자를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.

본 발명에서는 GAVE19의 아미노산 서열과 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체의 아미노산 서열을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 GAVE19, 이의 변이체, 단편 또는 유도체 및 유사체를 암호화하는 DNA 서열로 구성된 발현 벡터를 제공하는 것으로 이때, DNA 서열은 발현 조절 요소와 작동 가능하도록 연합되어 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 GAVE19, 이의 변이체, 단편 또는 유도체 및 유사체를 면역원으로 하는 항체를 제공한다.

또한 본 발명에서는 GAVE19 단백질 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이와 같은 조절물질은 GAVE19의 길항제, GAVE19의 효능제 또는 GAVE19의 역 효능제가 될 수 있다. 또한, 마우스에서 GAVE19의 발현 또는 활성을 조절하는 화합물들은 각종 염증 질환, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환 등의 다혈증 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 언급된 목적 및 다른 여러 가지 측면들은 첨부 도면과 상세한 설명을 참고로 하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.

발명의 분야

본 발명은 지금까지 알려지지 않은 G 단백질 결합된 수용체인 GAVE19를 암호화하는 신규 핵산 분자와 이러한 핵산 분자 및 GAVE19의 용도와 관련된 발명이다.

도 1: GAVE19을 암호화하는 DNA 서열(서열 1)

도 2: GAVE19의 아미노산 서열(서열 2)

도 3: MPD1.1.2 상의 GAVE19 발현 프로필

도 4: GAVE19(서열 2)의 아미노산 서열과 사람 정형체(ortholog) GAVE18(서열 7)의 비교

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명은 GAVE19라고 칭한 미지의 G 단백질-결합된 수용체를 암호화하는 지금까지 공지되지 않은 쥐의 핵산 분자를 놀랍고도 예상치 않게 발견한 것에 기초한다. 특히, GAVE19가 신장, 간, 소장과 같은 면역 조직 또는 기관에서 발현된다는 것을 알아내었다. 또한, GAVE19는 천식, 류마티스 관절염, COPD등과 같은 다양한 염증질환을 치료하기 위한 약학 조성물 개발에 표적으로 용이하게 사용될 수 있다.

본 발명을 설명하는 명세서 및 특허 청구범위를 통하여 사용된 다양한 용어들은 다음에서 정의하는 바와 같다.

여기에서 사용된 바와 같이, “조절물질(modulator)”이란 GAVE19 활성을 조절할 수 있는 잔기(리간드, 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)를 말한다. 본 발명의 조절물질은 GAVE19의 길항제, GAVE19의 효능제, 부분 효능제 또는 GAVE19의 역 효능제가 될 수 있다.

여기에서 언급되는 “효능제”이란 수용체에 결합되었을 때 세포내 반응을 활성화 시키는 또는 막에 GTP결합을 강화시키는 잔기(리간드 또는 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다)를 의미한다.

여기에서 언급되는 “부분 효능제”는 수용체에 결합되었을 때, 효능제에 의해 유도되는 것보다는 다소 적은 정도로 세포 반응을 유도하거나 효능제에 의해 유도되는 것보다는 다소 작은 정도로 GTP가 막에 결합되도록 강화시키는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않음)를 의미한다.

여기에서 언급되는 “길항제”란 효능제가 수용체에 결합하는 동일한 부위에 수용체와 경쟁적으로 결합하는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않음)를 의미한다. 그러나, 길항제는 수용체가 활성화 상태가 됨으로써 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지는 않으며, 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포 반응을 저해할 수 있다. 관련 측면에서, 길항제는 효능제 또는 부분 효능제 없이도 기저수준의 세포 내 반응을 감소시키지는 않는다

여기에서 언급되는 “역 효능제”란 구성 활성 수용체에 결합하여 기저 세포 반응을 저해하는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나 이에 국한되지는 않음)를 말한다. 기저 반응은 효능제 또는 부분 효능제없이 관찰되는 정상적인 기저 활성 수준 이하에서 활성 수용체에 의해 개시되거나 막에 GTP 가 결합되는 것을 감소시킨다.

여기에서 언급되는 “후보 화합물”이란 선별 기술에 사용할 수 있는 잔기(가령, 화학적 화합물이 될 수 있으나 이에 국한되지는 않음)을 의미한다. 한 구체예에서, GAVE19의 효능제, 부분 효능제, 역 효능제, 길항제로 구성된 군에서 선택될 수 있는 공지된 화합물은 포함되지 않는다. 수용체에 특이적인 내생 리간드를 확인하고/하거나 수용체에 대항하는 후보 물질을 스크리닝하는 것(이때, 스크리닝은 효과를 평가하기 위해 경쟁 분석을 해야 한다)과 연관된 전통적인 약물 발견 공정을 이용하여 이와 같은 화합물을 확인할 수 있다.

여기에서 언급되는 “구성적으로 활성화된 수용체” 또는 “자가 활성화되는 수용체”란 리간드 없이 활성화될 수 있는 수용체를 의미하며, 이 두 가지 용어는 상호 교환적으로 이용할 수 있다. 이와 같은 구성적으로 활성화된 수용체는 내생 (가령, GAVE19) 또는 비내생적인 것이 예를 들면, 재조합 기술을 이용하여 GPCR를 변형시켜 야생형 GPCR의 돌연변이형을 만들 수도 있다.(참고 EP 1071701; WO 00/22129; WO 00/22131; 미국 특허 제6,150,393호; 미국 특허 제6,140,509호 참고문헌으로 첨부됨).

여기에서 언급되는 “구성적 수용체 활성화”란 수용체에 내생 리간드 또는 이의 화학적 등가체의 결합 이외의 방법으로 활성 상태의 수용체를 안정화시킨다는 것을 의미하는 것이다.

여기에서 언급되는 “리간드”란 다른 분자에 결합하는 잔기를 말하며, 이러한 잔기는 호르몬 또는 신경 전달 물질 등이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않으며, 또한 이 잔기는 입체 선택적으로 수용체에 결합된다.

본 발명의 핵산 분자 또는 단백질을 언급할 때, 사용한 “군(family)”이란 외양적으로 공통의 구조적 도메인을 가지고, 여기에서 정의하고 있는 충분한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열과 충분한 상동성을 가지는 두 가지 이상의 단백질 및 핵산 분자를 말하는 것이다. 동일한 또는 상이한 종에서 이와 같은 군은 자연적으로 발생할 수 있다. 예를 들면, 사람에서 기인된 제1 단백질과 쥐에서 기인된 동일한 상동성을 가지는 단백질이 포함될 뿐만 아니라 사람에서 기인된 다른 별개의 제2 단백질 및 쥐에서 기인된 동일한 별개의 제2 단백질도 포함될 수 있다. 일 군의 구성원들은 공통의 기능적 특징을 가질 수 있다.

여기에서 상호 교환적으로 언급하는 것과 같이, “GAVE19 활성,” “GAVE19의 생물학적 활성” 또는 “GAVE19의 기능적 활성”이란 용어는 표준 기술에 따라, 생체내(in vivo)또는 시험관내(in vitro)에서 측정하였을 때, GAVE19 반응성 세포상에 GAVE19 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 나타나는 활성을 말하는 것이다. GAVE19 활성은 제2 단백질상의 효소 활성 또는 그와 연합하는 방식으로 직접적으로 활성을 가질 수도 있고, 제 2 단백질과 GAVE19 단백질의 상호작용에 의해 중개되는 세포 시그날 전달 활성과 같은 간접적인 활성을 가질 수도 있다. 적절한 구체예에서, GAVE19 활성은 i) GAVE19 시그날 전달 과정 상에 단백질과 상호 작용할 수 있는 능력; ii) GAVE19 리간드와 상호작용할 수 있는 능력; 및 iii) 세포내 표적 단백질과 상호작용할 수 있는 능력중 어느 한 가지 이상의 활성을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따라, 당분야내에 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있고, 이와 같은 기술들은 다음의 문헌에서 상세하게 기재되어 있다. Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (이하 "Sambrook 등., 1989"으로 칭함);DNA Cloning: A Practical Approach,Volume I 및II (D.N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];Transcription and Translation[B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)];Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)];Immobilized Cells and Enzymes[IRL Press, (1986)]; B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel 등. (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

다음의 용어는 하기에서 정의된 의미로 사용되었다.

"벡터"는 다른 DNA 단편을 이에 부착시켜, 부착된 단편을 복제할 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 리플리콘(replicon)등을 말하나 이에 국한시키지는 않는다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제를 자체적으로 할 수 있는 임의 유전 물질(가령, 플라스미드, 염색체, 바이러스)로써, 자체적 단위로 조절하면서 복제할 수 있는 능력이 있다. 벡터의 특정 예는 하기에서 설명한다

"카세트(cassette)"는 벡터내 특정 제한 부위로 삽입될 수 있는 DNA 단편을 말하는 것이다. DNA 단편에는 관심 대상이 되는 폴리펩티드가 암호화되어 있고,전사 및 해독을 위한 적절한 판독 프레임내에 카세트 및 제한 효소 부위가 삽입될 수 있도록 고안한다.

이와 같은 관심 대상 DNA 가 세포내로 유입될 때, 외생 또는 이종성 DNA 에 의해 세포가 “형질감염”되었다고 한다. 형질감염된 DNA가 표현형 변화에 영향을 주는 경우에는 외생 또는 이종성 DNA에 의해 세포가 “형질전환”되었다고 한다. 적절하게는 형질전환된 DNA가 염색체 DNA에 결합되어(공유적으로 연결), 세포의 게놈으로 구성될 수도 있다.

"이종성" DNA라는 것은 세포내에 또는 세포의 염색체 내에 자연적으로 존재하지 않는 것을 말한다. 적절하게는 이종성 DNA에는 세포에 대해 외부 물질이 되는 유전자가 포함된다.

“상동성 재조합”은 염색체 내에서 벡터의 외부 DNA 서열을 삽입하는 것을 말한다. 특히, 벡터는 상동성 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정 상동성 재조합의 경우에, 벡터에는 염색체 서열에 상동성인 충분한 길이를 가진 부분이 있어, 염색체내로 상보적인 결합 및 혼입이 허용될 수 있다. 더 긴 상동성 부분과 서열 상동성이 더 큰 경우에, 상동성 재조합 효능이 증대될 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산 분자

한 구체예에서, 본 발명에는 도1의 DNA 서열(서열 1)로 구성된 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 유사체 또는 유도체까지 포함된다.

“핵산 분자” 는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘: “RNA 분자”) 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 데옥시시티딘: “DNA 분자”)의 포스페이트 에스테르 고분자형 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 임의 포스포에스테르 유사체로 된 일본쇄 또는 이본쇄 나선형을 말한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 나선형도 가능하다. 핵산 분자, 특히, DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조를 말하는 것이나, 임의 특정 3차 형에도 한정시키지는 않는다. 따라서, 핵산 분자 용어에는 선형 또는 원형 DNA 분자내에서 발견되는 이본쇄 DNA(가령, 제한효소 처리된 단편), 플라스미드, 염색체 등도 포함된다. 특정 이본쇄 DNA 분자 구조를 논의함에 있어서, DNA의 전사안된 쇄(mRNA에 상동성인 서열을 가지는 쇄)와 함께 5’에서 3’방향으로 서열이 통상적 협약에 따라 제공된다고 보면 된다. “재조합 DNA 분자"는 생물학적으로 조작된 DNA 분자를 말한다.

“분리된” 핵산이란 천연 핵산 원료에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 것을 말하는 것이다. 특히, “분리된” 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에 있는 GAVE19를 암호화하는 핵산에 자연적으로 인접한 서열(예를 들면, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없는 것을 말한다. 다양한 구체예에서, 분리된 GAVE19 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA 에 있는 핵산 분자에 자연적으로 인접한 뉴클레오티드 서열의 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb보다 적을 수 있다. 또한, 분리된 핵산 분자 예를 들면, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 세포내 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 포함하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우, 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명의 핵산 분자 예를 들면, 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자 또는 이들 뉴클레오티드 핵산 서열의 단편 또는 상보체 또는 유사체 및 유도체를 표준 분자 생물학 기술 또는 여기에서 제공하는 서열 정보를 이용하여 분리해 낼 수 있다. 하이브리드화 반응의 프로브로써 서열 1의 핵산 서열의 일부 또는 전부를 이용하여, 표준 하이브리드화 반응 및 클로닝 기술(Sambrook 등.,에서 설명하는 것과 같이)을 이용하고, GAVE19 핵산 분자를 분리해낼 수 있다.

표준 PCR 증폭 기술에 따라, 주형으로 cDNA, mRNA, 게놈DNA를 이용하고, 적절한 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 본 발명의 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 이와 같은 프라이머는 서열 1의 정보를 이용하고, 통상적인 실험실에서 이용하는 기술을 사용하여 용이하게 만들 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터 내에 클로닝시키고, DNA 서열 분석을 통하여, 특징을 조사할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 등과 같은 표준 합성 기술을 이용하여 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 만들 수도 있다.

GAVE19 DNA에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 분자

본 발명에는 GAVE19 DNA에 하이브리드화 할 수 있거나; 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 GAVE19 DNA에 상보적인 하이브리드화 프로브에 하이브리드화 할 수 있거나; 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 상기 모두에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 분자가 포함된다. 특히, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에서 서열 1의 DNA 서열로 구성된 핵산 분자 또는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자에 상보적인 프로브에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산이 포함된다

온도 및 용액 이온 강도(Sambrook 등.,상기 참조)와 같은 적절한 조건하에서 일본쇄 핵산 분자가 다른 핵산 분자 즉, cDNA, 게놈 DNA, RNA와 같은 다른 핵산 분자에 어닐링될 수 있는 경우에, 이 핵산 분자는 “하이브리드화 할 수” 있다고 한다. 온도 및 이온 강도가 하이브리드화 반응의 “엄격성"(stringency)을 결정한다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝을 위해, Tm이 55 C와 같은 엄격성이 낮은 하이브리드화 반응 조건을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 포름아미드 없음; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS가 낮은 엄격성 조건이다. Tm이 더 높은 경우에는 중간 정도의 엄격성을 가지는 하이브리드화 반응으로, 예를 들면, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 사용한다. 최고의 Tm을 이용하는 경우에 매우 엄격한 하이브리드화 조건이라고 하고, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 이용한다. 하이브리드화 반응은 하이브리드화 반응의 엄격성 조건에 따라 달라지긴 하지만, 두 핵산에 상보적인 서열이 있어야 하나, 염기 간에 미스매치(mismatches)도 가능하다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적절한 엄격성 정도는 핵산 길이, 상보성 정도 및 당분야에 공지된 변수들에 따라 달라진다. 두 뉴클레오티드 서열간에 유사성 또는 상보성 정도가 클수록, 이들 서열로 구성된 핵산의 하이브르드를 위한 Tm 값이 커진다. 핵산의 하이브리드화에 대한 상대적인 안정성(더 높은 Tm에 상응하는)은 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA 순으로 감소된다. 길이가 100이상의 뉴클레오티드의 하이브리드화 경우에, Tm 을 계산하는 계산식이 유도되어 있다(Sambrook 등.,상기 참조, 9.50-0.51). 더 짧은 핵산의 하이브리드화 경우, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 경우에, 미스매치 위치가 더 중요하고, 올리고뉴클레오티드 길이가 그의 특이성을 결정짓게 된다(Sambrook 등.,상기 참조, 11.7-11.8). 하이브리드화 가능한 핵산 분자의 길이는 최소 적어도 20개 뉴클레오티드 정도는 되어야 하고, 특히, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드, 또 50개 뉴클레오티드 이상도 가능하며, 60개 정도의 뉴클레오티드도 가능하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 하이브리드화 가능한 핵산 분자는 길이가 적어도 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100개 뉴클레오티드이고, 서열 1의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 암호화 서열 또는 이의 상보체 또는 이의 단편으로 구성된 핵산 분자에 엄격한 조건하 에서 하이브리드화 할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, “엄격한 조건하에서 하이브리드화”는, 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 적어도 55%, 60%, 65%, 70% 바람직하게는 75% 또는 그 이상이 하이브리드화 반응 및 세척시에 하이브리드화된 상태로 유지되는 조건을 말하는 것이다. 이와 같은 엄격한 조건은 당업자에게 잘 알려진 것으로, 문헌[참조:“Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.]를 참고할 수 있다. 엄격한 조건의 적절한 예는 6X 염화나트/구연산 나트륨(SSC)에서 45℃상에서 하이브리드화 시킨 후에, 50-65℃ 에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에 1~2회 세척하는 것이나, 이에 국한시키지는 않는다. 엄격한 조건하에서 서열 1의 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 여기에서 사용된 것과 같이, “자연발생적인” 핵산 분자는 자연에서 생성 되는 뉴클레오티드 서열(자연 단백질을암호화하는)을 가지는 RNA 또는 DNA 분자를 말한다. 당업자는 서열특이적 변수(가령, 길이, G-C 함량 등)를 고려하여, 조건을 수정할 수도 있다.

본 발명은 유사한 성질을 가지는 GAVE19유사 분자 진단에 GAVE19 핵산 단편을 포함한다. 진단학적 단편은 인접 서열을 포함하는 GAVE19 유전자의 일부에서 생성될 수도 있다. 단편은 공지 방법을 사용하는 라이브러리(library) 프로브로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 분자는 GAVE19를 암호화하는 핵산 서열의 일부분만으로 구성될 수도 있는데, 예를 들면, GAVE 19의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 단편 또는 프로브 또는 프라이머로 이용될 수 있는 단편을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 이와 같은 단편은 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 14를 암호화하는 부분으로 구성될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 인체의 GAVE19 유전자 클로닝으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열로 다른 세포 가령, 다른 조직에 있는 상동성 GAVE19를 확인하거나 클로닝할 뿐만 아니라 다른 포유류에 상동성 GAVE19를 확인하거나 클로닝하기 위한 프로브 및 프라이머를 만들 수 있다. 프로브/프라이머는 통상 실제 순수 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 통상적으로 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 서열 1 의 센스 또는 안티센스 서열의 또는 서열 1 의 자연 발생적 돌연변이의 센스 또는 안티센스 서열의 적어도 12개, 바람직하게는 약 25개, 좀더 바람직하게는 약50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 구성 뉴클레오티드에 하이브리드화 할 수 있는 뉴클레오티드 서열 부분으로 구성된다. 사람의 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 기초한 프로브를 이용하여 유사한또는 동일한 단백질을 암호화하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출할 수 있다.

여기에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 분리된 핵산의 “단편” 또는 “일부분”은 적어도 12개, 바람직하게는 약 25개, 좀더 바람직하게는 약 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 구성 뉴클레오티드로 구성된다. 결론적으로, 본 발명의 분리된 핵산의 “단편”은 한 두개(1개 또는 2개) 뉴클레오티드만을 말하는 것이 아니다.

유사하게, 본 발명의 “일부” 또는 “단편” 폴리펩티드는 적어도 9개의 연속 아미노산 잔기로 구성된다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 특정 예는 GAVE19 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 에피토프를 포함한다.

GAVE19 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 서열 1의 일부분을 분리시키고, GAVE19 단백질의 암호화된 부분을 발현시키고(가령, 시험관내 재조합 발현에 의해), GAVE19 암호화된 부분의 활성을 평가하여, “생물학적으로 활성을 가지는 GAVE19 부분”을 암호화하는 핵산 단편을 만들 수 있다. 본 발명은 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 서열 1의 뉴클레오티드 서열과는 상이하나, 서열 1에 나타난 핵산 서열에 의해 암호화되는 동일한 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.

상동성 핵산 분자

본 발명에는 GAVE19 DNA 분자에 상동성인 분리된 핵산 분자가 포함되는데, 예를 들면, 서열 1의 DNA 서열을 가지는 분리된 핵산 분자에 상동성인 핵산 분자를 말한다. 두개 DNA 서열이 한정된 길이 범위의 DNA 서열에서 뉴클레오티드의 적어도50%(적절하게는 75%, 좀더 바람직하게는 약 90% 또는 95%가 일치되는 경우에, 두 DNA 서열은 “실질적으로 상동성이 있다” 또는 “실질적으로 유사”하다고 한다. 디폴트 변수를 사용한 서열 데이터 뱅크에서 구한 표준 소프트 웨어를 이용하여, 서열을 비교하거나 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 하이브리드화 반응 실험에서 이용할 수 있는 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교함으로써 실질적으로 상동성 서열을 확인할 수 있다. 적절한 하이브리드화 반응 조건은 당업자가 아는 범위에서 한정시킬 수 있다(Maniatis 등.,상기 참조; DNA Cloning, Vols. I & II,상기 참조; Nucleic Acid Hybridization,상기 참조.) 또한, 사람의 GAVE19와 상이한 뉴클레오티드 서열과 다른 종(GAVE19 상동체)에서 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 분자도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 분리된 핵산 분자 변이체

본 발명에는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자 변이체까지 포함된다. 이와 같은 변이체는 축퇴성, 대립형질 또는 이의 복합체가 될 수 있다.

엄격한 하이브리드화 반응 조건하에서 표준 하이브리드화 반응 기술에 따라 쥐(murine)의 cDNA 또는 이의 일부를 하이브리드화 프로브로 이용하여, 여기에서 설명하고 있는 쥐의 GAVE19 핵산과의 상동성에 근거하여, 본 발명의 GAVE19 cDNA 의 상동체 및 자연 대립 형질 변이체에 상응하는 핵산 분자를 분리해낼 수 있다.

여기에서 설명하고 있는 "상응하는"이란 의미는 정확한 위치에서 유사성 또는 상동성을 측정받는 대상 분자와 동일한지 또는 유사한지를 결정하는 경우에, 유사한 또는 상동성 서열을 의미한다. 따라서, “상응하는”은 서열의 유사성을 말하는 것이지 아미노산 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 말하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 GAVE19 단백질의 유전자 코드에서 코돈의 축퇴성으로 인하여, 여러가지 형태의 분리된 핵산 분자에 의해 본 발명의 GAVE19 단백질을 암호화할 수 있다. "축퇴성”은 유전자 코드에 따라 특정 아미노산을 명시하는 세 가지 문자로된 상이한 코돈을 이용할 때 나오는 용어이다. 당업자는 각 특정 아미노산에 대한 코드로 다음의 코돈들이 상호교환적으로 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

페닐알라닌(Phe 또는 F) UUU 또는 UUC

루이신(Leu 또는 L) UUA 또는 UUG 또는 CUU 또는 CUC 또는 CUA 또는 CUG

이소루이신(Ile 또는 I) AUU 또는 AUC 또는 AUA

메티오닌(Met 또는 M) AUG

발린(Val 또는 V) GUU 또는 GUC 또는 GUA 또는 GUG

세린(Ser 또는 S) UCU 또는 UCC 또는 UCA 또는 UCG 또는 AGU 또는 AGC

프롤린(Pro 또는 P) CCU 또는 CCC 또는 CCA 또는 CCG

트레오닌(Thr 또는 T) ACU 또는 ACC 또는 ACA 또는 ACG

알라닌(Ala 또는 A) GCU 또는 GCG 또는 GCA 또는 GCG

티로신(Tyr 또는 Y) UAU 또는 UAC

히스티딘(His 또는 H) CAU 또는 CAC

글루타민(Gln 또는 Q) CAA 또는 CAG

아스파라진(Asn 또는 N) AAU 또는 AAC

리신(Lys 또는 K) AAA 또는 AAG

아스파르트산(Asp 또는 D)GAU 또는 GAC

글루탐산(Glu 또는 E) GAA 또는 GAG

시스테인(Cys 또는 C) UGU 또는 UGC

아르기닌(Arg 또는 R) CGU 또는 CGC 또는 CGA 또는 CGG 또는 AGA 또는 AGG

글리신(Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG

트립토판(Trp 또는 W) UGG

종료 코돈 UAA (ochre) 또는 UAG (amber) 또는 UGA (opal)

상기 명기된 코돈은 RNA 서열용 코돈임을 인지할 것이다. DNA에 상응하는 코돈은 U대신에 T가 된다.

서열 1에서 볼 수 있는 것과 같은 뮤린의 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 추가하여, GAVE19 아미노산 서열에 변화를 유도할 수 있는 DNA 서열 다형성도 본 집단에 포함된다는 것을 인지할 것이다. 자연 대립형질 변이 때문에 GAVE19 유전자에 있는 그러한 유전적 다형성이 개인간에도 존재할 수 있다. 대립형질은 주어진 유전자 위치에서 대안으로 발생할 수 있는 유전자 집단중에 하나이다. 여기에서 사용된 바와 같이, “유전자” 및 “재조합 유전자”는 GAVE19 단백질 적절하게는 포유류 GAVE19 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임으로 구성된 핵산 분자를 말한다. 여기에서 사용된 바와 같이, “대립형질 변이체”는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 GAVE19 위치에서 발생할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 여러 다른 개체에서 관심 대상이 되는 유전자를 서열화시켜, 대안 대립형질을 확인할 수 있다. 하이브리드화 반응 프로브를 이용하면 다양한 개체에서 동일한 유전자 위치를 바로 확인할 수 있다. GAVE19의 기능적인 활성에 변화를 주지않으면서 자연적인 대립 형질 변이체 결과로 인한 GAVE19 에 생성된 임의 또는 모든 뉴클레오티드 변이체 및 생성된 아미노산 다형성은 본 발명의 범위에 속한다.

또한, 본 발명의 분리된 핵산 분자 변이체는 부위 지시된 돌연변이와 같은 통상의 실험실에서 사용하는 기술을 이용하여 당업자가 바로 만들 수 있다.

안티센스 뉴클레오티드 서열

본 발명에는 단백질을 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 분자, 가령, 이본쇄 cDNA 분자의 암호화 쇄에 상보적인 또는 mRNA 서열에 상보적인 안티센스(antisense) 핵산 분자도 포함된다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 또는 일부 GAVE19 암호화 쇄, 가령, 단백질 암호화 부분 또는 개방 판독 프레임의 전부(또는 일부)에 상보적이 될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 GAVE19를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 쇄의 비암호화(noncoding)부분에 안티센스될 수 있다. 비암호화 부분 (“5' 및 3' 해독안된 부분”)은 아미노산으로 해독되지 않고, 암호화 부분에 인접한 5' 및 3' 서열이다.

여기에서 나타낸 GAVE19를 암호화하는 암호화 쇄 서열이 제공되면(서열 1), Watson & Crick 의 염기쌍 형성 규칙에 준하여 본 발명의 안티센스 핵산을 고안할 수도 있다. 안티센스(antisense) 핵산 분자는 GAVE19 mRNA의 전체 암호화 부분에상보적이 될 수 있으나, GAVE19 mRNA의 비암호화 또는 암호화 부분에만 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 좀더 바람직하다. 예를 들면, GAVE19 mRNA 의 해독부분 주변에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 될 수도 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 뉴클레오티드이다. 당분야에 공지된 공정을 이용하여 화학적 합성 반응 및 효소 연결 반응을 통하여 본 발명의 안티센스 핵산을 작제할 수 있다. 예를 들면, 분자의 생물학적 안정성이 증가되도록 또는 안티센스 및 센스 핵산간에 형성된 이본쇄의 물리적인 안정성을 증가시키기 위해 자연발생 또는 다양하게 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (가령, 포스포로티오에이트 유도체, 포스포네이트 유도체, 아크리딘치환된 뉴클레오티드)를 이용하여, 안티센스 핵산(예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 합성시킬 수 있다.

안티센스 핵산을 만드는데 이용할 수 있는 변형된 뉴클레오티드에는 5-플로오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, β-D-갈락토실퀴노신, 이노신, N-6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N⁶-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실퀴노신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N⁶-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 퀴에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 2,6-디아미노퓨린 등이 포함된다. 다른 방법으로는 안티센스 방향으로 핵산이 서브클론된 발현 벡터를 이용하여 생물학적으로 안티센스 핵산을 생산할 수 있다(가령, 삽입된 핵산에서 전사된 RNA는 소요의 표적 핵산에 대해 안티센스 방향이 된다).

일반적으로 본 발명의 안티센스 핵산 분자를 개체에 투여하거나 자체에서 생성되도록 하여, GAVE19 단백질이 암호화되는 세포 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화되거나 결합하여 예를들면, 전사 및 해독 저해를 통하여 단백질 발현을 저해시킨다. 하이브리드화 반응은 안정적인 이중나선을 형성하기 위해 통상의 뉴클레오티드 상보성에 의한 것인데, 예를 들면, 이중 나선의 주요 홈에서 특이적인 상호작용을 통하여 DNA 이중나선에 결합하거나 또는 GAVE19의 조절 부위에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 하이브리드화 반응이 된다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자 투여 경로는 조직 부위에 직접 주사하는 것이 포함된다. 또 다른 방법으로는 안티센스 핵산 분자가 선택된 세포에 표적이 되도록 변형시키고, 전신으로 투여하는 것이다. 예를 들면, 전신 투여 경우에, 안티센스 분자를 변형시켜, 선택된 세포 표면상에 발현되는 수용체 또는 항원에 분자가 특이적으로 결합되도록 하는데, 예를 들면, 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 연결시키는 것이다. 여기에서 설명하는 벡터를 이용하여 세포로 안티센스 핵산 분자를 운반시킬 수 있다. 세포내의 안티센스 분자의 농도를 충분히 확보하기 위해, 안티센스 핵산 분자가 포함된 벡터 구조체를 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터가 선호하는 조건하에 둔다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특정한 이본쇄 하이브리드화를 형성하는데, 형성된 이본쇄는 서로 평행하다 (Gaultier 등., Nucleic Acids Res (1987)15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 메틸리보뉴클레오티드로 구성되거나(Inoue 등., Nucleic Acids Res (1987) 15:6131-6148) 또는 키메라 RNADNA 유사체로 구성된다 (Inoue 등., FEBS Lett (1987) 215:327-330).

리보자임

본 발명에는 리보자임도 포함된다. 리보자임은 리보자임이 하이브리드화되어 일본쇄의 핵산 가령, mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 가지고 있는 촉매성 RNA 분자다. 따라서 GAVE19 mRNA 전사를 촉매적으로 절단하여, GAVE19 mRNA 의 해독을 저해시키는데 리보자임을 이용할 수 있다 (가령, 망치머리모양의 리보좀(Haselhoff 등., Nature (1988) 334:585-591)에서 설명). 여기에서 설명하고 있는 GAVE19 cDNA 의 뉴클레오티드 서열(서열 1)에 근거하여 GAVE19를 암호화하는 핵산에 대해 특이성을 가지는 리보좀을 만들 수 있다. 예를 들면, Tetrahymena L19 IVS RNA 유도체를 작제할 수 있는데, 이때 활성 부분의 뉴클레오티드 서열은 GAVE19를 암호화하는 mRNA에서 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이다.(참고 미국 특허 4,987,071 및 미국 특허 5,116,742). 다른 방법으로, GAVE19 mRNA를 이용하여RNA 분자 모음으로부터 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 가지는 촉매성 RNA을 선별할 수도 있다(Bartel 등., Science (1993) 261:1411-1418).

본 발명의 삼중나선 핵산 분자 및 펩티드 핵산

본 발명에는 삼중나선 구조물을 형성하는 핵산 분자도 포함된다. 예를 들면, GAVE19의 조절 부분(가령 GAVE19 프로모터 또는 인핸서)에 상보적인 핵산 서열을 표적화시켜, 3중 나선 구조를 만들고, 표적 세포에서 GAVE19 유전자의 전사를 방해함으로써 GAVE19 유전자 발현을 저해시킬 수도 있다. (Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6(6):569; Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660:27; Maher, Bioassays (1992) 14(12):807).

적절한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자의 염기 부분, 당 부분 또는 인산염 기본 구조 부위를 변형시켜, 분자의 안정성, 하이브리드화 반응성 또는 용해도를 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산의 디옥시리보스 포스페이트 기본구조를 변형시켜 펩티드 핵산을 만들 수도 있다(참고 Hyrup 등., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5). 여기에서 언급되는 “펩티드 핵산” 또는 “PNAs”는 핵산 모방물질, 예를 들면, DNA 모방물질 즉, 데옥시리보스 인산염 기본구조를 슈도(pseudo)펩티드 기본구조로 대체시킨 것으로, 단 4가지 천연 뉴클레오염기는 남아 있는 것을 말한다. PNAs의 중성 기본구조로 하여금 낮은 이온 강도 조건 하에서도 DNA 및 RNA 에 특이적으로 하이브리드화 반응을 할 수 있게 한다. Hyrup 등. (1996) 상기 참조; PerryO’Keefe 등., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:14670에서 설명된 것과 같이 표준 고형상 펩티드 합성 과정에 따라, PNA 올리고머를 합성할 수 있다.

치료요법적 분야 및 진단 분야에 GAVE19의 PNA를 이용할 수 있다. 예를 들면, 유전자 발현을 전사 또는 해독 저지를 유도하거나 복제를 저해하는 것과 같이 서열 특이적인 방식으로 조절시에, 안티센스 또는 안티진 물질로 PNA를 이용할 수도 있다. GAVE19의 PNA를 이용할 수도 있다. 가령, 유전자에서 단일 염기 쌍 돌연변이 분석시, 즉, PNA-직접적인 PCR 클램핑에 PNA를 이용하고; S1 뉴클레아제(Hyrup 등. (1996) 상기 참조)와 같은 다른 효소와 복합하여 사용하는 경우에 인위적인 제한 효소로 이용하고, DNA 서열 및 하이브리드화 반응에서의 프로브 또는 프라이머로 사용한다 (Hyrup 등. (1996) 상기 참조; Perry-O’Keefe 등. (1996) 상기 참조).

또 다른 구체예에서, GAVE19의 PNA를 변형시켜, 안정성, 특이성 또는 세포의 수취(uptake)등을 강화시킬 수 있는데, 예를 들면 PNA에 친지성 또는 다른 도우미 기를 부착시키거나 PNA-DNA 키메라를 형성시키거나 당분야에 공지된 약물 운반 기술 또는 리포좀을 이용할 수도 있다. PNA-DNA 키메라 합성은 Hyrup 등 (1996) 상기 참조, Finn 등., Nucleic Acids Res (1996) 24(17):3357-63, Mag 등., Nucleic Acids Res (1989) 17:5973; Peterser 등., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119에서 설명하는 방법으로 만들 수 있다.

GAVE19 단백질

또한, 본 발명에는 도 2의 아미노산 서열(서열 2)로 구성된 분리된 폴리펩티드, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 유사체 및 유도체까지 포함된다.

서열 2와는 상이한 서열을 가지는 GAVE19 단백질(가령, 변이체)을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 서열 1의 뉴클레오티드 서열내로 한 가지 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결손시켜, 암호화된 단백질내에 한 가지 이상의 아미노산 치환, 결손 또는 추가를 유도하여 만들 수 있다.

특정 구체예에서, GAVE19 돌연변이 단백질에 대해 (1) GAVE19 시그날 전달 과정에서 단백질과 단백질:단백질 상호작용을 하는 능력; (2) GAVE19 리간드에 결합하는 능력; 또는 (3) 세포내 표적 단백질에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 또 다른 적절한 구체예에서, 세포내 증식 또는 세포 분화를 조절하는 능력에 대해 GAVE19 돌연변이체를 분석하였다.

표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적절한 정제 계획에 따라 세포 또는 조직원에서 고유 GAVE19단백질을 분리해낼 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 GAVE19 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명에 포함되는 재조합 발현의 대안으로, 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여, GAVE19 단백질 또는 폴리펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다.

“분리된” 또는 “정제된” 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분은 GAVE19 단백질이 유도되는 세포 또는 조직원으로부터 실제 세포 물질 또는 다른 오염 단백질 없는 상태 또는 화학적으로 합성되는 경우에 실제 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 없는 상태의 단백질을 말한다. “실질적으로 세포 물질 없이”란 단백질이 분리되거나 또는 재조합에 의해 합성이 되는 세포의 세포 성분으로부터 GAVE19 단백질을 분리한 단백질 준비물이 된다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 포함안된 GAVE19 단백질에는 GAVE19이외의 단백질이 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 미만(건조 중량)의 양이 포함된 GAVE19 단백질 준비물이 된다. GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분이 제조합에 의해 생산되는 경우에, 배양 배지를 포함시키지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면, 배양 배지는 단백질 준비물 중량의 20%, 10%, 5% 또는 이보다 더 적게 한다. GAVE19 단백질을 화학적 합성 방법으로 합성하는 경우에, 화학 전구물질 또는 다른 화학물질을 포함시키지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면, 단백질 합성 과정에 연루된 화학 전구물질 또는 다른 화학물질로부터 분리되어야 한다. 따라서, 이와 같은 GAVE19 단백질 준비물에는 화학 전구물질 또는 GAVE19 이외 화학물질이 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하(건조 중량 기준)로 포함된다.

GAVE19 단백질의 생물학적 활성 부분 또는 단편에는 GAVE19 단백질의 아미노산 서열 (서열 2에 나타난 아미노산 서열)로부터 유도된 또는 이와 동일한 아미노산 서열로 구성된 펩티드가 포함되는데, 이들 펩티드들은 GAVE19 전장 단백질보다는 아미노산 수가 적지만, GAVE19 단백질의 여러 활성 중 적어도 한 가지 활성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적으로 활성을 가지는 부분은 GAVE19 단백질의 적어도 한 가지 활성을 가지는 도메인 또는 모티프로 구성된다. GAVE 19 단백질의 생물학적으로 활성을 가지는 부분은 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가지는 폴리펩티드이다. 생물학적으로 활성을 가지는 적절한 폴리펩티드에는 한 개이상의 확인된 GAVE19 구조 도메인이 포함된다.

또한, 재조합 기술을 이용하여 단백질의 다른 부분이 결손된 생물학적으로활성을 가지는 다른 부분을 만들고, 고유 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 기능상 활성에 대해 평가하였다.

실제 서열 2와 동일하고, 서열 2의 단백질의 기능상 활성을 보유하나 자연적인 대립형질 변이 및 돌연변이로 인하여, 아미노산 서열에서는 차이가 있는 다른 유용한 GAVE19 단백질도 있다. 예를 들면, 이와 같은 GAVE19 단백질 및 폴리펩티드는 여기에서 설명하고 있는 생물학적 활성중 적어도 한 가지를 보유한다.

따라서, 유용한 GAVE19 단백질은 서열 2의 아미노산 서열에 적어도 약 45%, 적절하게는 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, 100% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 서열 2의 GAVE19 단백질의 기능상 활성을 보유하는 단백질이다. 특정 구체예에서, GAVE19 단백질은 서열 2의 GAVE19 단백질의 기능상 활성을 보유한다.

두 핵산에 상응하는 두가지 아미노산 서열의 상동성 비율을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열을 배열시킨다(제 2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적하게 배열시키기 위해, 제 1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭을 만들 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기를 비교하였다. 제 1 서열의 특정 위치에 상응하는 제 2 서열의 위치에 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기가 차지하고 있다면, 분자는 그 위치에서 동일한 것으로 간주한다. 두 서열간에 상동성 비율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 대한 함수로 나타낸다(상동성 비율=동일한 위치 수/총 위치 수(겹쳐지는 위치)X100). 한 구체예에서, 이 두 서열은 동일한 길이를 가진다.

두 서열간에 상동성 비율을 결정하는 방법은 수학 알고리즘을 이용할 수 있다. 두 서열을 비교하는데 이용하는 수학 알고리즘의 적절한 예가 Karlin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264; Karlin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:5873-877(변형)에 기재되어 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 알고리즘을 NBLAST 및 XBLAST 프로그램과 결합시킨다(Altschul 등., J Mol Bio (1990) 215:403). BLAST 뉴클레오티드 서치를 NBLAST 프로그램, 숫자=100, 단어길이=12으로 실행하여, 본 발명의 GAVE19 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수도 있다. BLAST 단백질 서치를 XBLAST 프로그램, 숫자=50, 단어길이=3으로 실행하여, 본 발명의 GAVE19 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수도 있다. 비교 목적으로 갭을 만든 배열의 경우, Altschul 등., Nucleic Acids Res (1997) 25:3389에서 설명하는 Gapped BLAST를 이용할 수도 있다. 다른 방법으로, 분자간에 거리 관계를 확인하기 위한 반복 서치를 실행하는데 PSIBlast를 이용 할 수도 있다(Altschul 등. (1997)상기 참조). BLAST, Gapped BLAST 및 PSIBlast 프로그램을 이용하는 경우에, 각 프로그램의 디폴트 변수(가령, XBLAST 및 NBLAST) 을 이용할 수도 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참고.

서열을 비교하는데 사용될 수 있는 수학 알고리즘의 적절한 예로써 Myers 등., CABIOS (1988) 4:11-17의 알고리즘을 이용하는 것이나, 이에 국한되지 않는다. 이와 같은 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 패키지의 일부분인 ALIGN 프로그램(version 2.0)에 결합시킨다. 아미노산 서열 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12, 갭 패널티 4를 이용할 수 있다.

2개의 서열 간에 상동성 비율은 상기에서 설명된 것과 유사한 기술을 이용하여 갭을 허용하거나 또는 허용하지 않으면서 결정 할 수 있다. 상동성 비율을 계산할 때, 정확하게 짝을 이루는 것만 계산한다.

본 발명은 또한 GAVE19 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 여기에서 사용되는 것과 같이, GAVE19 “키메라 단백질” 또는 “융합 단백질”은 GAVE19가 아닌 폴리펩티드에 연결된 GAVE19 폴리펩티드로 구성된다. “GAVE19 폴리펩티드”는 GAVE19에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말한다. “GAVE19가 아닌 폴리펩티드(비GAVE19 폴리펩티드)”는 GAVE19 단백질과는 실제 동일하지 않은 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 가령, GAVE19 단백질과는 상이한 단백질, 동일한 또는 상이한 유기체에서 유도된 단백질이 된다. GAVE19 융합 단백질내에서, GAVE19 폴리펩티드는 GAVE19 단백질의 전부 또는 일부분에 상응할 수 있는데, 적절하게는GAVE19 단백질의 적어도 한가지 생물학적으로 활성 부분에 상응한다. 융합 단백질내에서, “작동 가능하게 연결된”이란 GAVE19 폴리펩티드와 비GAVE19 폴리펩티드가 프레임 내에 서로 융합되어 있다는 것을 나타내는 것이다. 비GAVE19 폴리펩티드는 GAVE19 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있다. 한 가지 유용한 융합 단백질로 GSTGAVE19가 될 수 있는데, 이는 GAVE19 서열이 글루타치온S전이효소(GST)의 C-말단에 융합되어 있는 것이다. 이와 같은 융합 단백질로 재조합 GAVE19를 정제할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질에는 GAVE19 전부 또는 일부를 면역글로블린 단백질 족(family)의 구성원에서 유도한 서열에 융합한 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질도 포함된다. 본 발명의 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 약학 조성물에 포집시키고, 개체에 투여하여, 세포 표면상에서 GAVE19 리간드와 GAVE19 단백질간에 상호작용을 방해하여 생체내 상에서 GAVE19중개된 시그날 변환을 억제하게 된다. GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 이용하여 GAVE19 동족 리간드의 생체이용성에 영향을 줄 수 있다. 증식성 및 분화성 질환을 치료하거나 세포 생존을 조절하는데(예를 들면 촉진 또는 저해) 치료요법적으로 GAVE19 리간드-GAVE19 상호작용 저해가 유용할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 면역원으로 이용하여 개체에서 항-GAVE19 항체를 만들수 있어, GAVE19리간드를 정제하고, GAVE19 리간드와 GAVE19의 상호작용하는 것을 저해하는 분자를 확인하는 스크리닝 분석을 할 수 있다.

특정 구체예에서, 적절하게는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여, 본 발명의 GAVE19 키메라 또는 융합 단백질을 만들 수 있다. 통상의 기술, 예를 들면, 연결용 평활 말단 또는 점착성 말단을 이용하거나, 제한효소 절단을 통하여 적절한 말단을 만들어주고, 적당한 점착성 말단으로 채우고, 알칼리 포스포타제로 처리하여, 불필요한 결합 및 효소 연결을 막는 등의 기술을 이용하여, 상이한 폴리펩티드 서열을 코드하는 DNA 단편들을 프레임내 연결시킨다. 또 다른 구체예에서, 자가 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술을 이용하여 융합 유전자를 만들 수 있다. 대안으로, 키메라 유전자 서열을 만들기 위해 실제 어닐되고, 재증폭되는 두 가지 구성 유전자 단편 간에 상보적 돌기(overhangs)를 만드는 앵커(anchor) 프라이머를 이용하여, 유전자 단편을 PCR 증폭시킨다(Ausubel 등., 상기 참조). 또한, 융합 부분(가령,GST 폴리펩티드)을 이미 암호화한 시판되는 많은 발현 벡터를 이용할 수도 있다. GAVE19를 암호화하는 핵산을 발현 벡터내로 클로닝시켜, 융합 부분이 프레임내 상태로 GAVE19 단백질에 연결되게 한다.

변이체

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명에는 GAVE19 단백질의 변이체도 포함된다. 예를 들면, 부위 지시된 돌연변이 생성 및 PCR중개된 돌연변이 형성과 같은 표준 기술을 이용하여 돌연변이를 서열 2의 아미노산 서열내로 도입시킬 수 있다. 또한, 한 군데 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 보존형 아미노산 치환을 만들 수 있다. “보존형 아미노산 치환”은 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가지는 다른 아미노산으로 치환시킨다는 것이다. 예를 들면, 1개 이상의 아미노산은 등가의 기능을 하는 유사한 극성을 가지는 또 다른 아미노산에 의해 치환되어 침묵(silent)변화를 만들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 아미노산 치환은 아미노산이 속하는 군의 다른 구성 아미노산중에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌이 포함된다. 방향족 환 구조를 포함하는 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민이 포함된다. 양 전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성)를 가지는 아미노산에는 아스파르트산, 글루탐산이 포함된다. 이와 같은 변화는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점등으로 측정할 수 있는 겉보기 분자량에는 영향을 주지 않을 것으로 보인다.

특별히 적절한 치환은 다음과 같다;

- 양전하를 유지할 수 있는 Arg의 경우 Lys(그 역도 성립)로 치환

- 음전하를 유지할 수 있는 Asp의 경우 Glu(그 역도 성립)로 치환

- 자유- OH기를 유지할 수 있는 Thr의 경우 Ser로 치환

- 자유 NH₂를 유지할 수 있는 Asn의 경우 Gln로 치환

또한, 특별히 선호하는 성질을 가지는 아미노산을 대체하기 위해 아미노산 치환이 도입될 수도 있다. 예를 들면, 또 다른 Cys와 이황화결합을 할 수 있는 가능 부위에 Cys를 도입시킬 수도 있다. His를 특정 “촉매” 부위(His는 산성 또는 염기성으로 작용할 수 있기 때문에, 생화학 촉매 분석에서 가장 흔한 아미노산이다)로 도입시킬 수도 있다. Pro는 특수한 평면 구조 때문에, 단백질 구조에 β-턴(turns)을 유도하기 위해 도입될 수 있다.

포화 돌연변이(saturation mutagenesis)와 같은 방법으로 GAVE19 암호화 서열의 전부 또는 일부분에 돌연변이를 도입시키고, 생성된 돌연변이가 활성을 보유하고 있는 것을 확인하기 위해 GAVE19 생물학적 활성에 대해 생성된 돌연변이를 스크리닝한다. 돌연변이 형성 후에, 암호화된 단백질을 재조합적으로 발현시키고, 단백질의 활성을 측정한다.

본 발명의 변이체들은 GAVE19 효능제(모방체) 또는 GAVE19 길항제로 기능을 할 수 있다. 돌연변이 생성을 통하여, GAVE19 단백질 변이체를 만들 수 있는데, 예를 들면, GAVE19 단백질의 별개의 점돌연변이 또는 절단 등을 통하여 변이체를 만들 수 있다. GAVE19 단백질 효능제는 자연발생 GAVE19 단백질의 생물학적 활성과 실제 동일한 또는 부분 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, GAVE19 단백질을 포함하는 세포 시그날 전달 연속 반응의 하향 또는 상향 원소에 경쟁적으로 결합시켜, GAVE19 단백질의 길항제가 자연 발생 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 활성을 저해한다. 따라서, 제한된 기능의 변이체로 처리하여 특정 생물학적 효과를 유도할 수도 있다. 자연 발생 형태 단백질의 생물학적 활성중 일부분을 가지는 변이체로 개체를 치료하면 자연 발생형 GAVE19 단백질로 치료한 개체에서 나타나는 것보다 부작용을 더 줄일 수도 있다.

GAVE19 효능제(모방체) 또는 길항제로 기능을 하는 GAVE19 단백질 변이체는 복합 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하여 확인할 수 있는데, 가령, GAVE19 효능제 또는 길항제 활성을 가지는 GAVE19 단백질의 절단형 돌연변이 등을 스크리닝할 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 수준에서 복합 돌연변이 생성으로 다양한 GAVE19 변이체의 다변화된 라이브러리를 만들 수 있고, 이들 변이체들은 다변화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. GAVE19 변이체의 다변화된 라이브러리를 합성된 올리고뉴클레오티드 혼합물을 효소를 이용하여 유전자 서열에 연결시켜 만들면, 잠재적인 GAVE19 서열의 중첩 세트는 개별 폴리펩티드로 발현되고, 또는 내부에 GAVE19 서열 세트를 포함하는 더 큰 융합 단백질 세트(가령, 파아지 디스플레이용)로 발현된다. 다양한 방법을 사용하여 중첩성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 GAVE19 변이체 라이브러리를 만든다. 자동화된 DNA합성기를 이용하여 중첩 유전자 서열을화학적으로 합성할 수 있고, 합성된 유전자를 적절한 발현 벡터에 연결시킨다. 한 혼합물에서 유전자의 중첩 세트를 이용하면 잠재적인 GAVE19 서열 세트를 암호화하는 모든 서열을 만들 수 있다. 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.(Narang, Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura 등., Ann Rev Biochem (1984) 53:323; Itakura 등., Science (1984) 198:1056; Ike 등., Nucleic Acid Res (1983) 11:477).

또한, GAVE19 단백질 암호화 서열의 단편 라이브러리를 이용하여 GAVE19 단백질 변이체의 스크리닝 및 연속적인 선별에 사용할 수 있는 GAVE19 단편의 다변화 개체 군을 만들 수 있다. 한 구체예에서, GAVE19 암호화 서열의 이본쇄 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하여 암호화 서열 단편 라이브러리를 만드는데, 이때 조건은 분자 하나당 니크(nick)한 번만 일어나고, 이본쇄 DNA를 변성시키고, DNA를 다시 환원시켜, 다르게 니크된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함하는 이본쇄 DNA를 만든 후에, 다시 형성된 이본쇄로부터 일본쇄 부분을 제거하기 위해 S1 뉴클레아제로 처리하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 연결시키는 것이다. 이와 같은 방법에 의해, 다양한 크기의 GAVE19 단백질 내부 단편과 N-말단을 암호화하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다

점 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어지는 복합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하는데 선별된 성질을 가지는 유전자 생성물의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 몇 가지 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이와 같은 기술을 GAVE19 단백질의 복합 돌연변이 생성에 의해 만들어지는 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에도 적용할 수 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다량의 처리 분석에도 이용할 수 있는 가장 널이 이용되는 기술은 일반적으로 복제가능한 발현 벡터내로 유전자 라이브러리를 클로닝시키고, 적절한 세포에 생성된 라이브러리 벡터를 형질도입시키고, 적정 조건하에 복합 유전자를 발현시키는데, 이때 조건은 원하는 활성을 검출하여, 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하고 있는 벡터를 분리하는 것이다. 순환 전체 돌연변이 생성(Recursive ensemble mutagenesis(REM))은 라이브러리내에 있는 기능적 돌연변이의 빈도를 증가시키는 기술로써, GAVE19 변이체를 확인하는 스크리닝 분석와 복합하여 사용할 수 있다(Arkin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave 등., Protein Engineering (1993) 6(3):327-331).

GAVE19의 유사체 및 유도체

또한, 본 발명에는 화학적 변형으로 유도된 GAVE19 유도체 및 유사체도 포함된다. 단백질 부분에 한 가지 이상의 화학기를 부착시켜, 본 발명의 GAVE19 단백질을 유도할 수도 있다.

유도를 위한 화학기.수용성 고분자중에서 유도화 반응에 적절한 화학 기를 선택하여 GAVE19 유사체 또는 유도체가 생리학적 환경과 같은 수용성 환경에 관여하지 않도록 한다. 선택적으로 고분자는 약학적으로 사용 가능한 것이어야 한다. 당업자는 고분자/성분 결합물질이 치료요법적으로 사용할 수 있는지에 근거하여 바람직한 고분자를 선택할 수 있고, 그리고 약학적으로 적합하다면, 바람직한 투여량, 순환시간, 단백질 분해에 대한 저항성 및 다른 고려사항을 근거하여 선택할 수도 있다. GAVE19의 경우에 여기에서 설명하는 분석을 이용하면 확실하게 할 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적절한 수용성 고분자로는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오즈, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종 공중합체 또는 무작위 혼성중합체), 덱스트란, 폴리(n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종공중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 또는 폴리비닐 알코올 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에 안정하기 때문에 제조시에 유리하다.

고분자는 임의 분자량을 가진 분지쇄 또는 직쇄일 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우에, 적절한 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100kDa("약"이란 의미는 폴리에틸렌 글리콜을 만드는데 있어서, 일부 분자에 언급된 분자량에서 다소 증감이 있을 수 있다는 것을 나타낸다)이다. 원하는 치료 프로필(가령, 지연 방출 기간, 생물학적 활성에 대한 영향, 취급 용이성, 항원성 정도 및 항원성 부족, 치료 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지 효과 등)에 따라 다양한 분자크기를 이용할 수도 있다.

GAVE19에 부착시킬 수 있는 고분자의 수는 매우 다양한데, 당업자는 기능에 미치는 효과를 확인할 수 있을 것이다. 당업자는 동일한 또는 상이한 화학기(가령, 상이한 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자를 이용)를 이용하여, 모노, 디-, 트리-, 테트라 유도체 또는 다른 조합으로 유도화 반응을 시킬 수 있을것이다. GAVE19 분자에 대해 고분자의 비율도 매우 다양하게 할 수 있고, 반응 혼합물에서 이들의 농도도 다양하게 변화시킬 수 있다. 일반적으로 원하는 유도화 정도(가령, 모노, 디, 트리 등), 선택된 고분자의 분자량, 고분자가 직쇄인지 또는 분지쇄인지, 반응 조건 등과 같은 인자를 고려하여 최적의 비율(반응 효과 측면에서, 반응안된 성분 또는 고분자가 많이 없도록)을 결정할 수 있을 것이다.

GAVE19에 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학기)가 부착될 경우에 GAVE19의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려해야 한다. 당업자가 이용할 수 있는 몇 가지 부착 방법이 있는데, 예를 들면, EP 0 401 384(참고문헌으로 첨부)에서 설명하는 PEG를 G-CSF에 결합시키는 것과, Malik 등., 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035에서 설명하는 염화 트레실을 이용한 GM-CSF 페글리에이션(peglyation) 등이 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 자유 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기를 통하여 아미노산 잔기에 공유적으로 결합될 수 있다. 반응기는 활성을 가진 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합할 수 있는 기를 말한다. 자유 아미노기를 가지는 아미노산 잔기에는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기가 있고, 자유 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기에는 아스파르트산, 글루탐산, C-말단 아미노산 잔기가 포함된다. SH기는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키기 위한 반응기로도 이용할 수 있다. 치료 목적으로 적절한 것은 N-말단 또는 리신기와 같은 아미노기에 결합시키는 것이다.

특별히 N-말단이 화학적으로 변형된 GAVE19를 원할 수도 있다. 본 발명의 조성물로써 설명된 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 당업자는 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지쇄 등), 반응 혼합물에서 GAVE19 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 비율, 실행되는 페글리에이션(pegylation) 반응 타입, 선별된 N-말단 페글리에이션화된 단백질 분자를 얻는 방법 등에서 선택할 수 있을 것이다. N-말단 페글리에이션화된 조제물을 수득하는 방법(가령, 필요에 따라 다른 모노페글리에이션화된 부분에서 분리시키는 방법)은 페글리에이션화된 단백질 분자군으로부터 N-말단 페글리에이션화된 물질을 정제하는 것이다. GAVE19에서 유도화 반응에 이용할 수 있는 다른 타입의 1차 아미노기(리신 대 N-말단)의 차등적인 반응성을 이용하는 환원성 알킬화반응으로 선택적-N-말단 화학적 변형시킬 수 있다. 적절한 반응 조건하에 고분자를 포함하는 카르보닐기와 N-말단에서 선택적인 GAVE19 유도화 반응을 실시할 수 있다. 예를 들면, 리신 잔기의 ε아미노기와 GAVE19의 N-말단 잔기의 α아미노기의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 반응시켜, 선택적으로 N-말단을 페글리에이션(pegylate)시킬 수 있다. 이와 같은 선택적 유도화 반응에 의해, GAVE19에 수용성 고분자가 부착 되는 것을 조절할 수 있다. GAVE19의 N-말단에서 고분자와의 결합이 주로 일어나고, 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기는 크게 변형되지 않는다. 환원성 알킬화반응을 이용하여, 수용성 고분자는 상기에서 설명하는 것과 같은 것이 될 수 있으며, GAVE19에 결합하기 위해 단일 반응성 알데히드기를 가질 수 있다. 한 개의 반응기 알데히드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 프로프리온알데히드를 이용할 수도 있다.

GAVE19의 항체, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 유사체 및 유도체

폴리클로날 및 모노클로날 항체를 만드는데 이용되는 표준 기술에 따라 분리된GAVE19 단백질 또는 이의 일부 또는 이의 단편을 면역원으로 이용하여, GAVE19에 결합하는 항체를 만들 수 있다. 여기에서 사용되는 “항체”는 면역글로블린 분자 및 이의 면역학적 활성 부분, 가령, GAVE19와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원결합 부분을 가지는 분자 또는 이의 단편을 의미한다. GAVE19에 특이적으로 결합하는 분자는 GAVE19에 결합하나 시료에 있는 다른 분자, 예를 들면, GAVE19 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 있는 다른 분자에는 실제 결합하지 않는 분자가 된다. 면역글로블린 분자의 면역학적으로 활성을 가진 부분은 예로 들면, F_(ab)및 F_(ab')2단편이 될 수 있는데, 펩신과 같은 효소로 항체를 처리하여 생성되는 단편들이다. 본 발명은 GAVE19에 결합할 수 있는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 키메라항체, 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체를 면역원으로 제공한다.

전장 GAVE19 단백질을 면역원으로 사용할 수 도 있고, 대안으로 GAVE19의 항원성 펩티드 단편을 면역원으로 제공할 수 있다. GAVE19의 항원성 펩티드는 서열 2 에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 8개 (적절하게는 10개, 15개, 20개, 30개 또는 그 이상) 아미노산 잔기로 구성되고, GAVE19의 에피토프를 포함하여, 펩티드에 대해 생성되는 항체가 GAVE19와 특이적인 면역 복합체를 형성한다.

GAVE19 면역원을 일반 적정한 개체(가령, 토끼, 염소, 쥐 또는 다른 포유류)에 면역주사하여 항체를 만든다. 가령, 적절한 면역원 준비물에는 재조합에 의해 발현되는 GAVE19 단백질 또는 화학적으로 합성되는 GAVE19 폴리펩티드가 포함된다. 준비물에는 프룬트(Freund) 완전한 백신보조제 또는 불완전한 백신 보조제 또는 유사한 면역자극제가 추가 포함된다. 면역원성 GAVE19 준비물을 적절한 개체에 예방주사하면 폴리클로날 항 GAVE19 항체 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메라 항체가 될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같은 “모노클로날 항체” 또는 “모노클로날 항체조성물”이란 GAVE19의 특정 에피토프와 면역작용을 할 수 있는 한 종류의 항원결합 부위만을 가지는 항체 분자 군을 의미한다. 따라서, 모노클로날 항체 조성물은 일반적으로 특정 GAVE19 단백질 에티토프에 단일 결합 친화성을 나타낸다.

GAVE19 면역원을 적절한 개체에 예방주사 처리하여 상기에서 설명하는 것과 같은 폴리클로날 항GAVE19 항체를 만들 수 있다. 고정된 GAVE19를 이용한 효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA)를 이용하는 등의 표준 방법에 따라 예방주사를 맞은 개체에서 시간 경과에 따른 항GAVE19 항체 역가를 모니터할 수 있다. 원하는 경우에, 포유류로부터(주로 혈액으로부터) GAVE19에 대한 항체 분자를 분리해내고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 따라 추가 정제시켜 IgG 부분을 얻을 수 있다. 예방주사후 적절한 시간때, 가령, 항GAVE19 항체 역가가 최고치에 있을 때, 만든 항체-생성 세포를 개체로부터 수득하여, Kohler 등., Nature(1975) 256:495497 에서 설명하는 하이브리도마 기술; 사람 B 세포 하이브리도마 기술(Kohler 등., Immunol Today (1983) 4:72); EBV 하이브리도마 기술(Cole 등., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 7796); 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 따라 모노클로날 항체를 준비한다. 하이브리도마를 만드는 기술은 공지된 것이다(Current Protocols in Immunology (1994)Coligan 등., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 간략하게 설명하면, 상기에서 설명한 것과 같이, GAVE19 면역원으로 예방주사 맞은 포유류에서 취한 임파세포(주로 지라세포)에 불멸 세포주(일반적으로 골수종)를 융합시킨 다음 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝하여, GAVE19에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인한다.

임파세포와 불멸화된 세포주를 융합시키는 많은 공지의 프로토콜중 임의의 것을 항GAVE19 모노클로날 항체를 생성시키는 목적에 이용할 수도 있다(Current Protocols in Immunology, 상기 참조; Galfre 등., Nature (1977) 266:550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); 및 Lerner, Yale J Biol Med (1981) 54:387-402). 또한, 당업자는 이와 같은 방법을 다양하게 변화시켜 유용하게 이용할 수 있을 것이다. 일반적으로 불멸 세포주(가령, 골수종 세포주)는 임파세포와 같은 동일한 포유류에서 취한다. 예를 들면, 불멸화된 마우스 세포주 가령, 하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함하는 배양 배지(“HAT 배지”)에 민감한 골수종 세포주와 본 발명의 면역학적 준비물로 예방주사를 맞은 마우스의 임파세포를 융합시켜, 뮤린(murine) 하이브리도마를 만들 수 있다. 표준 기술에 따라 융합 짝으로 임의 골수종 세포주를 이용할 수 있는데, 예를 들면, P3-NS1/l-Ag4-1, P3x63-Ag8.653, Sp2/O-Agl4 골수종 세포를 이용할 수 있다. 골수종 세포주는 ATCC 에서 구할 수 있다. 일반적으로 HAT 민감성 마우스 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜(“PEG”)를 이용하여 마우스 지라세포에 융합시킨다. 융합안된 세포 및 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 죽이는(융합안된 지라세포는 형질전환되지 않았기 때문에 몇일 후에 죽는다) HAT 배지를 이용하여, 융합으로 생성된 하이브리도마 세포만 골라낸다. 표준 ELISA 분석 방법을 이용하여, GAVE19에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝하여, 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 검출한다.

모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 만드는 또 다른 방법은 GAVE19로 재조합 복합 면역글로블린 라이브러리(가령, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 모노클로날 항GAVE19 항체를 확인 및 분리하여, GAVE19에 결합할 수 있는 면역글로블린을 분리한다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 키트도 시판되고 있다(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 279-400-01; Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog 240612).

또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는데 이용할 수 있는 방법 및 시약들은 다음의 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 미국 특허 5,223,409; PCT 공보 WO 92/18619; PCT 공보 WO 91/17271; PCT 공보 WO 92/20791; PCT 공보 WO 92/15679; PCT 공보 WO 93/01288; PCT 공보 WO 92/01047; PCT 공보 WO 92/09690; PCT 공보 WO 90/02809; Fuchs 등., Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay 등., Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:81-85; Huse 등., Science (1989) 246:1275-1281; Griffiths 등., EMBO J (1993) 25(12):725-734.

또한, 키메라 및 모노클로날 항체와 같은 재조합 항GAVE19 항체는 인체에서유도된 부분과 아닌 부분으로 구성되는데, 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다. 키메라 및 모노클로날 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있는데, 예를 들면, 다음에서 설명하는 기술을 이용할 수 있다. PCT 공보WO 87/02671; 유럽 특허출원 184,187; 유럽특허출원 171,496; 유럽특허출원 173,494; PCT 공보 WO 86/01533; 미국 특허 4,816,567; 유럽특허출원 125,023; Better 등., Science (1988) 240:1041-1043; Liu 등., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443; Lin 등., J Immunol (1987) 139:3521-3526; Sun 등., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218; Nishimura 등., Canc Res (1987) 47:999-1005; Wood 등., Nature (1985) 314:446-449; Shaw 등., J Natl Cancer Inst (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi 등., Bio/Techniques (1986) 4:214; 미국 특허5,225,539; Jones 등., Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan 등., Science (1988) 239:1534; Beidler 등., J Immunol (1988) 141:4053-4060.

친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 GAVE19를 분리하는데 항GAVE19 항체(모노클로날 항체)를 이용할 수 있다. 세포로부터 천연 GAVE19를 정제 및 숙주세포에서 발현된 재조합에 의해 생산된 GAVE19를 정제할 때 항GAVE19 항체를 실행할 수 있다. 또한, GAVE19 단백질의 풍부성 및 패턴을 평가하기 위해 (세포 용해물질 또는 세포 상청액내에) 항GAVE19 항체를 이용하여 GAVE19 단백질을 검출한다. 임상적인 테스트 과정 예를 들면, 주어진 치료 과정의 효과를 평가하는 일부 과정으로 단백질 수준을 모니터하는데 진단학적으로 항GAVE19 항체를 이용할 수 있다. 항체에 검출 가능한 물질(하기에서 설명하는)을 결합시켜 검출할 수 있다.

검출 가능한 표지

임의로, 본 발명의 분리된 핵산 분자, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 항체 및 이들 분자 단편에 검출 가능한 표지를 선택적으로 결합시킬 수도 있다. 적절한 표지에는 효소, 형광발색단(가령, 플루오로레신 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 자유 또는 킬레이트화된 란타니드 시리즈 염, 특히, Eu3+, 발색단, 방사능동위원소, 킬레이팅제, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자, 리간드(바이오틴), 생발광 물질, 화학적 발광물질 등이 포함된다. 기준 물질도 마커를 하는 경우 수용체 및 기준 물질에 동일한 또는 다른 표지를 이용할 수 있다.

방사능활성 표지 가령, 동위원소,³H,¹⁴C,³²P,³⁵S,³⁶Cl,⁵¹Cr,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁹⁰Y,¹³¹I,¹²⁵I,¹⁸⁶Re를 이용하는 경우, 현재 공지의 이용가능한 카운팅 과정을 이용한다. 효소를 표지로 사용하는 경우, 당분야에 공지된 현재 이용할 수 있는 발색, 분광광도계, 형광광도계, 전류검출, 가스검출 기술을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명에 따라서 이용할 수 있는 표지화 방법중 한 가지 방법이 직접 표지시키는 것이다. 직접 표지화하는 것은 전문에서 정의된 바와 같이, 자연상태에서 육안으로 또는 광학 필터 또는 자극을 통하여 바로 확인할 수 있는 것을 말하는데,예를 들면, UV광으로 형광을 촉진시키는 것을 말한다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 색을 가지는 표지에는 Leuvering (미국 특허 4,313,734)에서 설명하는 금으로된 졸(sole) 입자와 같은 금속성 졸 입자; Gribnau 등.(미국 특허 4,373,932)와 May 등. (WO 88/08534)에서 설명하는 염료 졸 입자; May,상기 참조, Snyder (EPA 0 280 559; 0 281 327)에서 설명하는 염색된 라텍스; Campbell 등. (미국 특허4,703,017)에서 설명된 리포좀에 포집된 염료등이 포함될 수 있다. 이외의 다른 직접 표지화에는 방사능 뉴클레오티드, 형광 기 또는 발광 기등이 포함된다. 이와 같은 직접 표지 디바이스들에 추가하여, 효소로 구성된 간접 표지화를 본 발명에서 이용할 수도 있다. 당분야에는 다양한 형태의 효소 연결된 면역분석이 공지되어 있는데, 예를 들자면, 알칼리 포스포타제, 양고추냉이 과산화효소, 라이소자임, 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로게나제, 락테이트 디하이드로게나제, 우레아제 및 다른 효소 등이 Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT inMethods in Enzymology,70. 419-439, 1980; 미국 특허 4,857,453에서 상세하게 설명되고 있다.

본 발명에 이용할 수 있는 다른 표지로는 자성 비드 또는 자성 공명 영상 표지들이 포함된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 본 발명의 항체, 이의 단편에 인산화 반응 부위를 만들어³²P로 표지시킨다. (예: 유럽 특허 0372707 또는 미국 특허5,459,240(Foxwell 등의 이름으로 1995년 10월 17일 등록)에서 설명하였음).

여기에서 예시한 바와 같이, 대사적 표지를 이용하여 항체를 포함한 단백질에 표지시킬 수 있다. 대사적 표지란 [³⁵S] 메티오닌 또는 [³²P]오르토포스페이트 등의 대사적 표지가 보충된 배양 배지에서 단백질을 발현시키는 세포를 시험관내 배양시키는 동안 생성되는 표지이다. [³⁵S] 메티오닌을 이용한 대사적(또는 생합성) 표지에 추가하여, 본 발명에서는 [¹⁴C] 아미노산 및 [³H] 아미노산(안정적 위치에서 3중수소로 치환된)으로 표지시키는 것도 고려할 수 있다.

재조합 발현벡터 및 숙주 세포

본 발명의 다른 측면에는 벡터, 바람직하게는 GAVE19(또는 이의 일부분)을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 벡터의 한 가지 형태는 “플라스미드”로써 추가 DNA 단편이 연결된 루프 모양의 이본쇄 DNA를 말한다. 또 다른 형태의 벡터는 바이러스성 벡터로써 추가 DNA 단편이 바이러스성 게놈에 연결되어 있다. 특정 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(가령, 세균 벡터는 세균성 복제 오리진 및 에피좀성 포유류 벡터를 가진다). 다른 벡터(가령, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈에 결합하여, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 발현 벡터는 유전자 발현이 작동 가능하게 연결되도록 할 수 있다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 플라스미드(벡터) 형태가 유용한 발현 벡터이다. 그러나, 본 발명에는 다른 발현 예를 들면, 등가의 기능을 할 수 있는 바이러스성 벡터(복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스) 등도 포함된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 적절히 발현될 수 있는 형태의 핵산으로 구성된다. 본 발명의 재조합 발현 벡터에는 숙주 세포에 근거하여 선별된 한 가지 이상의 조절 서열이 포함되어 발현될 핵산에 실시가능 하도록 연결되어 있다. 재조합 발현 벡터내에 “ 작동 가능하게 연결된”이란 소요의 뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 연결되어, 뉴클레오티드 서열이 발현(가령, 시헌관내전사/해독 시스템 또는 숙주세포내로 벡터가 도입되었을 때 숙주 세포내에서 발현)되는 것을 말한다. “조절 서열”은 프로모터, 인핸서, 다른 발현 조절 요소(가령, 폴리아데닐화 시그날 등)를 말한다. 이와 같은 조절 서열은 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명하고 있다. 조절 서열은 다양한 형태의 숙주세포(가령, 조직 특이적인 조절 서열)에서 핵산 서열의 직접적인 구성 발현에 관계한다. 당업자는 형질전환되는 숙주 세포, 소요 단백질의 발현 수준 등의 선택 인자에 따라 발현 벡터의 양상이 달라진다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 본 발명의 발현 벡터가 숙주 세포내로 유도되어, 상기한 바의 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드(가령, GAVE19 단백질, GAVE19의 돌연변이형, 융합 단백질 등)가 생산된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 진핵세포 또는 원핵세포 가령, 대장균(E. coli), 곤충 세포(베큘로바이러스 발현 벡터이용)와 같은 세균 세포, 효모 세포, 포유류 세포에서 GAVE19가 발현될 수 있도록 만들어질 수 있다. 적절한 숙주 세포는 Goeddel, 상기 참조에 기재되어 있다. 대안으로, T7 프로모터 또는 T7 폴리메라제와 같은 파아지 조절 요소 및 단백질을 이용하여시험관내에서 재조합 발현 벡터가 전사 및 해독된다.

원핵세포에서의 단백질 발현은 대부분의 경우에 융합 또는 비융합 단백질을 발현시키는 구성 또는 유도 프로모터를 포함하고 있는 벡터에 의해 대장균(E. coli)에서 실시한다. 융합 벡터는 벡터내에 암호화되어 있는 단백질에 재조합 단백질의 주로 아미노 말단에 다수의 아미노산을 추가시킨다. 이와 같은 융합 벡터는 일반적으로 세 가지 목적으로 이용되는데 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 3) 친화성 정제시 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는 목적으로 이용된다. 또한, 융합 발현 벡터에서, 원핵성 절단 부위를 융합 부분과 재조합 부분이 만나는 위치에 도입시켜, 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있도록 하여, 융합 단백질로부터 재조합 단백질을 정제시킬 수 있다. 이와 같은 효소 및 동족 인지 서열에는 Factor Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 등이 포함된다. 전형적인 융합 발현 벡터에는 표적 재조합 단백질에 대해 글루타티온-5-트란스퍼라제 (GST)를 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 등., Gene (1988) 67:3140), 표적 단백질에 말토즈 E결합 단백질을 융합시키는 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), 표적 단백질에 단백질 A를 융합시키는 pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ)등이 포함된다.

적절한 유도성 비융합E. coli발현 벡터에는 pTrc (Amann 등., Gene (1988) 69:301-315); pET 11d (Studier 등., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:6089)등이 포함된다. 하이브리드화 trplac 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 폴리메라제 전사에 따라 pTrc 벡터로부터 표적 유전자 발현 정도가 달라진다.

대장균(E. coli)에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키는 한 가지 방법은 재조합 단백질을 분해 절단시키는 능력이 손상된 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 것이다.(Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:119-128). 또 다른 방법은 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산 분자의 핵산 서열을 변경시켜, 각 아미노산의 개별 코돈을 대장균(E. coli)에서 선호적으로 이용하도록 하는 것이다(Wada 등., Nucleic Acids Res (1992) 20:2111-2118). 표준 DNA 합성 기술을 이용하여 본 발명의 핵산 서열을 변경시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, GAVE19 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 사카로마이세스 세르비시에(S. cerevisiae)와 같은 효모에서의 발현 벡터에는 pYepSecl (Baldari 등., EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등이 포함된다.

대안으로, 베큘로바이러스 벡터를 이용하여 곤충세포에서 GAVE19를 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (Sf 9 세포)에서 단백질 발현에 이용될 수 있는 베큘로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈(Smith 등., Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow 등., Virology (1989) 170:31-39)가 포함된다.

또 다른 구체예에서, 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현시킬 수도 있다. 포유류 발현 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 등., EMBO J (1987) 6:187195)이 포함되지만, 이것으로만 국한되지 않는다. 포유류 세포를 이용하는 경우에, 발현 벡터의 조절 기능이 바이러스 조절 요소에 의해 제공되는 경우도 있다. 예를 들면, 통상적으로 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 원숭이 바이러스 40등에서 유도된 것들이다. 진핵 및 원핵 세포에 적절한 다른 발현 시스템으로는 상기 언급된 Sambrook 등., chapters 16 및 17 를 참고하면 된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 형을 선호하는 핵산 발현을 지시할 수 있다(가령, 핵산을 발현시키는데 조직 특이적인 조절 요소들이 이용된다). 조직 특이적인 조절 요소들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 적절한 조직 특이적인 프로모터에는 알부민 프로모터(간 특이적 프로모터; Pinkert 등., Genes Dev (1987) 1:268-277), 임파구 특이적 프로모터(Calame 등., Adv Immunol (1988) 43:235-275), 특히, T 세포 수용체 프로모터(Winoto 등., EMBO J (1989) 8:729-733) 및 면역글로블린(Banerji 등., Cell (1983) 33:729-740; Queen 등., Cell (1983) 33:741-748), 신경 특이적인 프로모터(신경필라멘트 프로모터; Byrne 등., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:5473-5477), 췌장 특이적인 프로모터 (Edlund 등., Science (1985) 230:912-916) 및 유선 특이적인 프로모터(우유 유장 프로모터; 미국 특허 4,873,316; 유럽 출원 264,166)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 발생학적으로 조절된 프로모터 또한 포함되는데, 예를 들면,쥐의 hox 프로모터 (Kessel 등., Science (1990) 249:374-379) 및 α태아단백질 프로모터(Campes 등., Genes Dev (1989) 3:537-546)등이 포함된다.

본 발명에는 또한 안티센스 방향으로 발현 벡터에 클론된 본 발명의 DNA 분자로 구성된 재조합 발현 벡터를 포함한다. 즉, DNA 분자는 GAVE19 mRNA에 안티센스인 RNA 분자가 발현 되도록(가령, DNA 분자의 전사에 의해) 하는 방식으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클론된 핵산에 연결된 조절 서열은 다양한 세포형에서 안티센스 RNA 분자를 지속적으로 발현시킬 수 있도록 선택된다. 예를 들면, 구성, 조직특이적인 또는 세포형특이적인 안티센스RNA 발현을 지시할 수 있는 바이러스성 프로모터 또는 인핸서 또는 조절 서열이 선택된다. 안티센스 발현 벡터는 고 효율 조절 부분의 조절하에서 안티센스 핵산이 만들어 질 수 있도록 재조합 플라스미드, 파아지미드 또는 감쇠된 바이러스형태가 될 수 있고, 이들의 활성은 벡터가 도입되는 세포의 형태에 따라 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 이용한 유전자 발현 조절에 대해서는 Weintraub 등. (ReviewsTrends in Genetics, Vol. 1(1)1986)을 참고한다.

본 발명의 또 다른 측면에는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포를 포함한다. “숙주세포” 또는 “재조합 숙주 세포”는 서로 상호교환적으로 이용할 수 있다. 이 용어는 특정 개체 세포 뿐만 아니라, 이와 같은 세포의 후손 및 잠재적인 후손도 포함된다는 것을 인지할 것이다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인하여, 후대에 변화가 있을 수 있고 후계 세포가 반드시 선조 세포와 동일하지는 않지만, 여기에서 사용된 영역에는 후계세포가 포함된다.

숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포가 될 수 있다. 예를 들면, 대장균(E.coli)과 같은 세균 세포, 곤충세포, 효모 또는 포유류 세포(Chinese hamster ovary cells (CHO), 293 세포 또는 COS 세포)와 같은 세포에서 GAVE19 단백질이 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있다. 벡터 DNA를 통상의 형질도입 또는 형질감염 기술을 이용하여 진핵 또는 원핵 세포내로 도입시킬 수 있다. 여기에서 사용되는 “형질도입” 및 “형질 감염”은 숙주 세포로 외부 핵산(DNA)를 도입시키는 다양한 당분야에 인지된 기술을 말하는 것으로 예를 들면, 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침전, 유도, DEAE덱스트란 중개된 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공 등이 포함된다.

포유류 세포의 안정한 형질 감염을 위해서는 발현 벡터 및 이용된 형질 감염 기술에 따라, 세포의 일부분만이 게놈에 외부 DNA를 결합시킨다. 결합체를 확인하고, 선별하기 위해, 선택적 마커(항생제 저항성 등과 같은)을 암호화하는 유전자를 소요의 유전자와 함께 숙주 세포로 도입시킨다. 적절한 선택성 마커에는 약물 저항성, 예를 들면, G418, 하이그로마이신(hygromycin), 메토트렉세이트(methotrexate)등이 포함된다. 적절한 선택적 마커를 암호화하는 핵산을 GAVE19를 암호화하는 동일한 벡터를 이용하여 숙주 세포로 도입시키거나 별도의 벡터를 이용하여 도입시킬 수도 있다. 도입된 핵산에 의해 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별성을 이용하여 확인할 수 있다(선택성 마커가 결합된 세포는 생존하고, 다른 세포 즉, 마커 유전자가 도입안된 세포는 죽게된다)

배양물에서 진핵 또는 원핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여, GAVE19 단백질을 생산(발현)시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주세포를 이용하여 GAVE19 단백질을 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 본 발명의 숙주 세포(GAVE19를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입된)를 적절한 배지에서 생장시켜, GAVE19 단백질을 생산한다. 또 다른 구체예에서, 본 방법에는 배지 또는 숙주 세포로부터 GAVE19를 분리하는 방법도 포함된다.

또 다른 구체예에서, GAVE 19는 변형된 발현 벡터에 서브클론된 다른 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위한 유도성 발현 시스템으로 구성된다. 예를 들면, 돌연변이된 G 단백질(효모 세포, Y2 부신피질 세포 및cyc S49, 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허5,739,029; 미국 특허 5,482,835; Mitchell 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89(19):893-337; Katada 등., J Biol Chem (1984) 259(6):358-695)을 포함하는 숙주 세포에 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 가지는 제 1 발현 벡터를 형질도입시키고, 이때, 숙주 세포에서 GAVE19가 기능을 하도록 발현된다. 비록, 발현된 GAVE19가 구성적으로 활성이 있더라도, 돌연변이가 시그날 전달을 나타내는 것은 아니다. 즉, G단백질의 활성이 없는 연속 반응이 일어난다(가령, 아데닐일 사이클라제 활성화반응이 없음). 연속하여 제 2 발현 벡터를 이용하여, GAVE19를 가지는 숙주 세포내로 연속하여 형질도입시킨다. 제 2 벡터는 유도성 시스템에 의해 발현되는 소요 유전자에 추가하여, 숙주 세포의 G 단백질 돌연변이에 상보적인 구조 유전자로 구성된다(가령, 기능을 가지는 포유류 또는 효모 Gs, Gi, Go, Gq(참고 PCT 공보WO 97/48820; 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허 5,739,029; 미국 특허 5,482,835). 제 2 벡터의 상보적인 구조 유전자는 상보적인구조 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 활성화시키는 외부에서 추가된 성분(테트라사이클린, IPTG, 소분자 Sambrook 등. 상기 참조)의 조절하에서 유도성을 가진다. 유도인자에 추가하여, 상보적인 구조 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 기능적으로 발현되어, 구성적으로 활성을 가지는 GAVE19는 복합체(제2 메신져 형성)를 형성하여, 적절한 하향 경로가 활성화되도록 유도한다. 제 2 벡터로 구성된 소요 유전자는 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가지는데, 이 프로모터는 적절한 제 2 메신져(CREB, AP1 요소)에 의해 활성화된다. 따라서, 제2메신져가 누적되면, 소요의 유전자 상향에 있는 프로모터가 활성화되어, 유전자 생성물이 발현된다. 유도인자가 없는 경우에, 소요 유전자 발현이 중단된다.

특정 구체예에서, 유도성 발현 시스템용 숙주 세포에는 S49 (cyc) 세포를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 세포주가 G단백질 돌연변이로 구성된 것으로 판단되는 경우에, 인위적으로 적절한 돌연변이를 만든다/작제한다 (효모 세포용으로는 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허 5,739,029; 미국 특허 5,482,835을 참조한다).

관련 측면에서, 서열 2에서 제시하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA에 작동 가능하게 연결된 벡터를 세포로 형질도입시킨다. 이와 같은 시스템으로 구성된 제 1 및 제2 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840); pMT2PC (Kaufman 등., EMBO J (1987) 6:187-195), pYepSecl (Baldari 등., EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ(Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등을 고려할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다.

관련 측면에서, 적절한 수단을 이용하여 숙주 세포에 형질 감염시킬 수 있는데, 이때, 형질 감염에 의해 기능을 가지는 GAVE19 단백질이 발현된다(e.g., Sambrook 등., 상기 참조, and Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990). 이와 같은 “기능을 하는 단백질”이란 일단 발현되면, G-단백질과 복합체를 형성하는 단백질을 포함하나 이에 국한시키지 않으며, 이때 G-단백질이 제 2 메신져 형성을 조절한다. 여기에서 이용할 수 있는 숙주 세포를 형질감염시키는 다른 방법으로는 형질 감염(transfection), 전기천공(electroporation), 마이크로인젝션 (microinjection), 형질 도입(transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산 칼슘 침전, 리포펙션(라이소자임 융합), 유전자 총(gene gun) 이용, DNA 벡터 운반자( Wu 등., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut 등., 캐나다 특허 출원 2,012,311, 1990년 3월 15일에 출원)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.

본 발명은 매우 다양한 프로모터를 이용한다. 또한, 당분야에 공지된 임의 프로모터/인핸서 요소등을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 발현을 조절할 수 있으나, 이와 같은 조절 요소들은 반드시 선택된 숙주에서 발현 기능을 할 수 있어야 한다. GAVE19 발현 조절에 이용될 수 있는 프로모터로는 SV40 어얼리 프로모터 부분(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스(Roussarcoma virus)의 3’ 긴 말단 반복체에 포함된 프로모터(Yamamoto, 등., 1980, Cell 22:787-797), 허피스(herpes) 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster 등., 1982, Nature 296:3942); β락타메이즈 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터(VillaKamaroff, 등., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731),tac프로모터(DeBoer, 등., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2125); “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242:7494; 조직 특이성을 나타내고 유전자 전이 동물에서 이용할 수 있는Gal 4 프로모터, ADC(알코올 디하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리 포스포타제 프로모터와 같은 효모 또는 다른 곰팡이의 프로모터 요소; 그리고 췌장 샘포 세포에서 활성을 가지는 엘라스타제 I 유전자 조절 부분(Swift 등., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz 등., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성을 가지는 인슐린 조절 부분 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 임파 세포에서 활성을 가지는 면역글로블린 유전자 조절 부분(Grosschedl 등., 1984, Cell 38:647-658; Adames 등., 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 임파 및 유선 세포에서 활성을 가지는 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부분 (Leder 등., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성을 가지는 알부민 유전자 조절 부분(Pinkert 등., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성을 가지는 알파페토단백질 유전자 조절 부분(Krumlauf 등., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등., 1987, Science 235:53-58), 간에서 활성을 가지는 알파 1안티트립신 유전자 조절 부분(Kelsey 등., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성을 가지는 베타글로빈 유전자 조절 부분(Mogram 등., 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등., 1986, Cell 46:89-94), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성을 가지는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부분 (Readhead 등., 1987, Cell 48:703-712), 골근육에서 활성을 가지는 미오신 경쇄2 유전자 조절 부분(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 시상하부에서 활성을 가지는 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 부분(Mason 등., 1986, Science 234:1372-1378)과 같은 조직 특이성을 나타내고, 유전자 전이 동물에 이용되었던 동물의 전사 조절 부위 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.

본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 다음 4가지 일반적인 방법으로 확인가능하다: (a) 원하는 플라스미드 DNA 또는 특정 mRNA의 PCR 증폭 (b) 핵산 하이브리드화 반응, (c) 선택성 마커 유전자 기능의 존부, (d) 삽입된 서열의 발현. 첫번째 방법으로, 증폭된 생성물을 검출하기 위해, PCR을 통하여 핵산을 증폭시킬 수 있다. 두번째 방법으로, 삽입된 마커 유전자에 상동성 서열로 구성된 프로브를 이용하여, 핵산을 하이브리드화 시키는 방법을 통하여 발현 벡터내에 삽입된 외부 유전자를 검출할 수 있다. 세번째 방법으로, 벡터에 외부 유전자가 삽입됨으로써 특정“선택성 마커” 유전자 기능의 존부(가령, β갈락토시다제 활성, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 저항성, 형질전환 표현형의 베큘로바이러스에 폐색 체 형성 등)에 근거하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 확인하고 선별할 수 있다. 또 다른 예를 들면, GAVE19 단백질, 이의 변이체, 이의 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산이 벡터의 “선택성 마커 유전자”내에 삽입되는 경우에, 삽입체를 포함하는 재조합체의 경우는 GAVE19 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 네번째 방법으로, 발현된 단백질이 기능적으로 활성 모양인 경우에, 재조합에 의해 발현되는 유전자 생성물의 활성, 생화학적, 면역학적 특징을 분석하여, 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열 발현에 매우 다양한 형태의 숙주/발현 벡터 조합을 이용할 수 있다. 예를 들어, 유용한 발현 벡터는 염색체 부분 단편, 비염색체 부분 단편 및 합성 DNA 서열 부분 단편으로 구성된다. 적절한 벡터에는 SV40 유도체 및 공지의 세균성 플라스미드 가령, 대장균(E. coli) 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMalC2, pET, pGEX (Smith등., 1988, Gene 67:3140), pMB9 및 이의 유도체들, RP4 플라스미드; 파아지 DNA(phage λ의 많은 유도체 가령, NM989, 및 다른 파아지 DNA가령 M13, 필라멘트성 일본쇄 파아지 DNA); 2μ 플라스미드 및 이의 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파아지 DNA 복합체에서 유도된 벡터, 가령, 플라스미드를 변형시켜, 파아지 DNA를 이용하게 하거나 또는 다른 발현 조절 서열등을 이용하게 한 유도 벡터등이 포함된다.

예를 들어, 베큘로바이러스 발현 시스템에서는 비융합 전달 벡터 및 융합 전달 벡터를 모두 이용할 수 있는데, 이때 비융합 전달 벡터로는 pVL941(BamH1 클로닝 부위; Summers), pVL1393(BamH1,SmaI,XbaI,EcoR1,NotI,XmaIII,BglII,PstI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392(BglII,PstI,NotI,XmaIII,EcoRI,XbaI,SmaI,BamH1 클로닝 부위; Summers and Invitrogen), pBlueBacIII (BamH1,BglII,PstI,NcoI,HindIII 클로닝 부위와 blue/white 재조합 스크리닝 가능; Invitrogen)을 포함하나 이에 한정시키지 않으며; 융합 전달 벡터로는 pAc700(BamH1 및KpnI 클로닝 부위, 이때BamH1 인지는 개시 코돈에서 시작됨; Summers), pAc701, pAc702(pAc700와 동일, 단, 상이한 판독 프레임을 가짐), pAc360(BamH1 클로닝 부위는 폴리헤드린 개시 코돈의 하류 36개 염기쌍임; Invitrogen(195)), pBlueBacHisA, B, C(세 가지 상이한 판독 프레임,BamH1,BglII,PstI,NcoI,HindIII 클로닝 부위, ProBond 정제를 위한 N-말단 펩티드, blue/white 재조합 플락 스크리닝; Invitrogen (220))을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

본 발명에 이용할 수 있는 포유류 발현 벡터에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 가지는 벡터가 포함되는데, 가령,DHFR발현벡터를 가지는 임의 발현 벡터나 클론된 유전자와DHFR를 모두 발현시키는 벡터와 pED(클로닝 부위는PstI,SalI,SbaI,SmaI,EcoRI이다)의DHFR/메토트렉세이트 공-증폭 벡터 등이 포함될 수 있다(Kaufman,Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). 대안으로, pEE14(클로닝 부위는HindIII,XbaI,SmaI,SbaI,EcoRI,BclI이다 이때 벡터는 글루타민 합성효소와 클론된 유전자를 발현시킴)와 같은 글루타민 합성효소/메티오닌 설폭시민 공증폭 벡터를 이용할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, Epstein Barr Virus (EBV) 조절하에 에피좀 발현에 관계하는 벡터를 이용할 수도 있는데, 예를 들면, pREP4 (클로닝 부위는BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII,KpnI이다. 구성 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커; Invitrogen), pCEP4(클로닝 부위는BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII,KpnI이다 구성 hCMV 이메디에이트 어얼리 유전자, 하이그로마이신 선택성 마커; Invitrogen), pMEP4(클로닝 부위는KpnI,PvuI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI,BamH1이다, 유도성 메탈로티오닌 Iia 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커: Invitrogen), pREP8(클로닝 부위는BamH1,XhoI,NotI,HindIII,NheI,KpnI이다, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선택성 마커; Invitrogen), pREP9(클로닝 부위는KpnI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI, BamHI이다, RSVLTR 프로모터, G418 선택성 마커; Invitrogen), pEBVHis(RSVLTR 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커, ProBond 수지와 엔테로키나제 절단을 통하여, N-말단 펩티드 정제가능; Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명에서 이용할 수 있는 선택가능한 포유류 발현 벡터에는 pRc/CMV(클로닝 부위는HindIII,BstXI,NotI,SbaI,ApaI이다, G418 선택: Invitrogen), pRc/RSV(클로닝 부위는HindIII,SpeI,BstXI,NotI,XbaI이다, G418 selection; Invitrogen) 및 기타 다른 것등이 포함된다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 우두 바이러스 포유류 발현 벡터(Kaufman, 1991,상기 참조) 에는 pSC11 (SmaI 클로닝 부위이다, TK 및 βgal 선택성), pMJ601(클로닝 부위는SalI,SmaI,AflI,NarI,BspMII,BamHI,ApaI,NheI,SacII,KpnI,HindIII이다; TK 및 βgal 선택성), pTKgptF1S (클로닝부위는EcoRI,PstI,SalI,AccI,HindII,SbaI,BamHI, Hpa이다, TK 또는 XPRT 선별)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.

효모균 발현 시스템을 이용하여 본 발명에 따른 GAVE19 단백질, 이의 변이체 또는 유도체 및 유사체를 발현시킨다. 예를 들면, 비융합된 pYES2 벡터(클로닝 부위는XbaI,SphI,ShoI,NotI,GstXI,EcoRI,BstXI,BamH1,SacI,Kpn1,HindIII 이다; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C(클로닝 부위는XbaI,SphI,ShoI,NotI,BstXI,EcoRI,BamH1,SacI,KpnI,HindIII이다, ProBond 수지와 엔테로키나제 절단을 통하여, N-말단 펩티드 정제가능; Invitrogen) 등이 본 발명에 이용될 수 있다.

특정 재조합 DNA 분자를 확인하고, 분리한 후에, 당분야에 공지된 몇 가지 방법으로 이를 증식시킬 수 있다. 적절한 숙주 시스템 및 생장 조건이 정립되면, 재조합 발현 벡터를 증식시켜 다량 준비할 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 이용할 수 있는 발현 벡터에는 다음의 벡터 또는 이의 유도체가 포함된다: 우두 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 베큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파아지 벡터(예를 들면, 람다), 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터 등이 있으나 이에 한정시키지 않는다.

또한, 삽입된 서열 발현을 조절하는, 적절한 숙주 세포 주를 선택하여 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 또는 진행시킬 수 있다. 여러가지 다른 숙주 세포는 단백질의 전사 및 전사후 프로세싱 과정 및 변형(가령, 글리코실화반응, 시그날 서열의 절단 등)등 특징적이고, 독특한 기작을 가진다. 발현된 외부 단백질을 원하는 방식으로 변형 및 프로세싱시키기 위해 적절한 세포 주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 예를 들면, 글리코실화안된 코어 단백질 생성물을 만들기 위해 세균 시스템에서 발현을 이용할 수도 있다.

유전자 전이 동물

본 발명의 숙주 세포를 이용하여 사람이 아닌 유전자 전이된 동물을 만들 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포이고, 이들 세포내로 GAVE19를 암호화하는 서열이 도입된다. 이와 같은 숙주 세포를 이용하여, 사람이 아닌 유전자 전이 동물을 만들고, 게놈 또는 상동성 재조합 동물에 외부 GAVE19 서열을 도입시키고, 내생 GAVE19 서열이 변경된다. GAVE19의 기능 및 활성 연구에 그러한 유전자 전이 동물이 유용하고, GAVE19 활성 조절 물질을 확인하고 평가하는데 이용할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, “유전자 전이 동물”은 사람이 아닌 동물, 적절하게는 포유류, 좀더 바람직하게는 마우스 또는 들쥐 등의 설치류가 되고, 동물의 하나 이상의 세포에 전이 유전자를 포함하고 있다. 유전자 전이 동물의 다른 예로는 사람이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등이 포함된다.

여기에서 사용된 바와 같이, “전이 유전자”는 유전자 전이 동물이 발생되는 세포의 게놈에 결합되어, 성숙한 동물의 게놈에 유지되는 외부 DNA를 말한다. 전이 유전자는 유전자 전이 동물의 한 가지 이상의 세포 형에서 암호화된 유전자 생성물의 발현에 관계한다. 여기에서 사용된 것과 같은 “상동성 재조합 동물”은 사람이 아닌 동물, 적절하게는 포유류, 좀더 바람직하게는 마우스가 되고, 이때 내생 GAVE19 유전자는 상동성 재조합에 의해 변경된다. 이는 동물의 세포로 도입되는 외생 DNA 분자와 내생 유전자간에 이루어지는데, 예를 들면, 동물이 발생되기 전에 동물의 배아 세포에서 이루어진다.

상기에서 설명하는 형질 감염 방법중 한 가지를 이용하여, GAVE19를 암호화하는 핵산 분자를 수정된 난모세포의 수컷 전핵으로 도입시켜, 본 발명의 유전자 전이 동물이 만들어지는 것이다. 난모세포가 가상 임신한 암컷 부양 동물에서 발생된다. GAVE19 cDNA 서열, 즉, 서열 l을 전이유전자로 사람이 아닌 동물의 게놈으로 도입시킬 수 있다. 대안으로, 마우스 GAVE19 유전자와 같은 사람의 GAVE19를 가지는 비-사람 상동성 유전자를 사람 GAVE19 cDNA에 대한 하이브리드화 반응에 근거하여 분리할 수 있고, 전이유전자로 이용할 수 있다. 전이 유전자의 발현 효율을 증가시키기 위해 인트론 서열 및 폴리아데닐화 반응 시그날이 전이 유전자에 포함될 수도 있다. 조직-특이적인 조절 서열(들)이 GAVE19 전이 유전자에 작동 가능하게 연결되어, 특정 세포에서 GAVE19 단백질을 발현시킨다. 배아 조절 및 마이크로인젝션을 통한 유전자 전이 동물을 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 미국 특허 4,736,866; 미국 특허4,870,009, 미국 특허 4,873,191)을 참고하면 된다. 동물의 조직 또는 세포에 GAVE19 mRNA 의 발현 및 게놈에 전이 유전자를 가지는 다른 유전자 전이 동물을 만드는 유사한 방법을 이용할 수 있다. 그 다음 유전자 전이된 최초 동물을 이용하여 전이 유전자를 가지는 추가 동물을 낳을 수 있다. 또한, GAVE19를 암호화하는 전이 유전자를 가지는 유전자 전이 동물을 번식시켜, 다른 전이 유전자를 가지는 유전자 전이 동물을 만들 수도 있다

상동성 재조합 동물을 창조하기 위해, GAVE19 유전자의 일부분(GAVE19 유전자의 사람 또는 사람이 아닌 상동체, 즉, 뮤린 GAVE19 유전자)이 결손, 추가, 치환되어 기능적으로 GAVE19 유전자의 기능을 방해하는 유전자를 포함하는 벡터를 만든다. 적절한 구체예에서, 벡터에는 상동성 재조합시에 내생 GAVE19 유전자가 기능적으로 파괴되도록 벡터를 만든다(즉, 기능을 하는 단백질이 암호화되어 있지 않는 것으로써, 이러한 벡터를 “녹아웃(“knock out”) 벡터라고 한다).

대안으로, 상동성 재조합시에, 내생 GAVE19 유전자를 돌연변이시키거나 기능은 있으나 변형된 형태가 되도록 벡터를 만든다(즉, 상향 조절 부분을 변경시켜, 내생 GAVE19 단백질 발현이 변경되도록 한다).

상동성 재조합에서, GAVE19 유전자의 추가 핵산에 의해GAVE19 유전자의 변경된 부분이 5' 및3' 말단에 인접하도록 하여, 벡터가 운반하는 외생 GAVE19 유전자와 배아 줄기 세포에 있는 내생 GAVE19 세포 사이에서 상동성 재조합이 발생되도록 한다. 추가 인접 GAVE19 핵산 서열이 내생 유전자와 상동성 재조합을 성공적으로 실시하는데 충분한 길이를 가진다. 일반적으로, 인접한 DNA 수 kb(5’ 및 3’ 말단)가 벡터내에 포함된다 (상동성 재조합 벡터에 대한 설명은 Thomas 등., Cell (1987) 51:503을 참고한다).

벡터를 배아 줄기 세포(가령, 전기천공에 의해) 및 세포로 도입시키고, 도입된 GAVE19 유전자와 내생 GAVE19가 상동성 재조합된 것을 선별한다(Li 등., Cell (1992) 69:915). 그 다음 선별된 세포를 동물(마우스)의 낭포로 주사하여, 응집 키메라(Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A PracticalApproach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113l52)를 만든다. 그 다음 키메라 배아를 적절한 가상 임신한 부양 동물에 이식시키고, 임신 기한동안 둔다. 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 가지는 후손을 이용하여 동물을 번식시키는데, 이때 동물의 모든 세포에는 전이 유전자의 생식선 전달에 의해 상동성 재조합된 DNA를 가지고 있다.

상동성 재조합 벡터 및 상동성 재조합 동물을 작제하는 방법은 Bradley, Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829; PCT 공보 WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968; WO 93/04169에서 상세하게 설명하고 있다.

또 다른 구체예에서, 전이 유전자의 발현을 조절할 수 있는 선택된 시스템을 가지고 있는 유전자 전이된 사람이 아닌 동물을 만들 수 있다. 이와 같은 시스템의 한 예는 박테리오파아지 P1의 cre/loxP 리콤비나제 시스템이다. cre/loxP 리콤비나제 시스템의 추가 설명은 Lakso 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:6232-6236을 참고한다. 리콤비나제 시스템의 또 다른 예는 사카로마이세스 세르비시에(S. cerevisiae)의 FLP 리콤비나제 시스템이다(O'Gorrnan 등., Science (1991) 251:1351-1355). cre/loxP 리콤비나제 시스템을 이용하여 전이 유전자의 발현을 조절할 수 있다면, 리콤비나제 및 선택된 단백질을 모두 암호화하는 전이 유전자를 가지는 동물이 필요하다. 이와 같은 동물은 “이중” 유전자 전이 동물, 가령, 하나는 선택된 단백질을 암호화하는 전이 유전자를 가지는 것이고, 다른 하나는 리콤비나제를 암호화하는 전이 유전자를 가지는 것인 두 가지 유전자 전이 동물을 짝지어 만들수 있다.

여기에서 설명하고 있는 사람이 아닌 유전자 전이 동물의 클론은 Wilmut 등., Nature (1997) 385:810-813; PCT 공보 WO 97/07668; WO 97/07669에서 설명하는 방법에 따라 만들 수 있다. 간략하게 설명하면, 유전자 전이 동물의 체세포를 분리하여, 생장 과정에서 빠져나와, G₀단계로 들어가도록 유도하였다. 그 다음 정지 세포가 분리된 동일한 동물로부터 핵을 빼낸 난모세포에 정지상태의 세포를 전기 자극을 통하여 융합시킬 수 있다. 재구성된 난모세포를 배양시켜, 상실배 또는 배반세포로 발생시키고, 그 다음 가상 임신한 암컷 부양 동물로 옮긴다. 암컷 부양 동물의 후손이 체세포가 분리된 동물의 클론이 된다.

본 발명의 용도 및 방법

여기에서 설명하고 있는 핵산 분자, 단백질, 단백질 상사체 및 항체 및 이들의 단편들을 다음의 한 가지 이상 방법에 이용할 수 있다 a) 스크리닝 분석; b) 검출 분석(가령, 염색체 매핑, 조직 타이핑, 법의학); c) 예측 약물(가령, 진단 분석, 예후 분석, 임상적 시도 모니터링 및 약리 유전체학(pharmacogenomics)); d) 치료 방법(가령, 치료 및 예방). GAVE19 단백질이 다른 세포 단백질과 상호작용하기 때문에: (i) 세포 증식 조절 (ii) 세포 분화 조절 (iii) 세포 생존 조절에 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산을 이용하여 GAVE19 단백질을 발현시켜(가령, 유전자 치료법에서 숙주세포내에 재조합 발현 벡터를 통한 발현), GAVE19 mRNA(생물학적 시료내에 있는)를 검출하거나 또는 GAVE19 유전자에 있는 유전적 병소를 검출하거나 GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 또한, GAVE19 단백질을 이용하여 GAVE19활성 또는 발현을 조절하고, GAVE19 단백질의 과다 생산 또는 부족으로 인한 질환을 치료할 수 있는 약물 또는 화합물을 선별하거나 또는 GAVE19 야생형 단백질과 비교하였을 때, 감소된 또는 변종 활성을 가지는 GAVE19 단백질 형을 만들 수 있다. 또한 본 발명의 항GAVE19 항체를 이용하여 GAVE19 단백질을 검출 및 분리시키고, GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 설명한 스크리닝에 의해 확인된 신규한 물질을 포함하고, 여기에서 설명하고 있는 것을 이용하는 것도 포함한다.

스크리닝 분석

내생 리간드 존재하에서 G 단백질이 활성화되면 G 단백질 수용체 복합체가 형성되어, GTP가 G 단백질에 결합하게 된다. G 단백질의 GTPase 도메인이 서서히 GTP를 GDP로 가수분해시켜, 정상적인 조건하에서 수용체 비활성화를 유도하게 된다. 그러나, 구성적으로 활성화된 수용체는 GDP를 GTP로 계속 가수분해한다.

G 단백질의 가수분해되지 않은 기질인 [³⁵S]GTPγS를 이용하여 구성적으로 활성화되는 수용체를 발현시키는 막에 결합되는 것이 강화되는지를 모니터한다. Traynor and Nahorski는 [³⁵S]GTPγS 를 이용하여 리간드의 존부시에, 막에 G 단백질이 결합되는지를 모니터하였다고 보고한 바 있다(Traynor 등., Mol Pharmacol (1995) 47(4):848-54). 수용체에 결합하는 특정 G 단백질 없이 모든 G 단백질-결합된 수용체에 일반적으로 이와 같은 시스템을 이용할 수 있기 때문에 후보 화합물의 초기 스크리닝에도 이러한 분석 시스템을 적절하게 사용할 수 있다.

G_s20는 효소 아데닐 사이클라제를 자극하고, Gi 및 Go는 이 효소를 저해한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 아데닐 사이클라제는 ATP가 cAMP로 전환되는 것을 촉매하여, Gs 단백질에 결합하는 구성적으로 활성화된 GPCRs가 세포에서의 증가된 cAMP 수준과 연관이 있다. 대안으로, Gi (또는 Go) 단백질에 결합할 수 있는 구성적으로 활성화된 GCPRs는 세포내 감소된 cAMP 수준과 연관된다.“Indirect Mechanism of Synaptic Transmission,” Chpt. 8, from Neuron to Brain (3rd Ed.), Nichols 등. eds., Sinauer Associates, Inc., 1992참고. 따라서, cAMP를 검출하는 분석을 이용하여 후보 화합물이 수용체에 역 효능제인지를 결정할 수 있다. cAMP를 측정하는 당분야에 다양하게 공지된 방법을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 항cAMP 항체를 ELISA포멧에 이용하였다. 한 구체예에서는 전체 세포 제 2 메신져 리포터 시스템을 고려하였다(PCT 공보 WO 00/22131).

관련 측면에서, cyclic AMP는 cAMP반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자(CREB) 결합을 촉진시키고, 따라서 cAMP반응성 요소라고 불리는 특정 위치에서 프로모터에 결합되어 유전자 발현을 유도하게 된다. 따라서, β-갈락토시다제 또는 루시페라제와 같은 리포터 유전자 앞에 다중 cAMP 반응 요소를 포함하는 프로모터가 위치하도록 리포터 시스템을 구성한다. 또한, 구성적으로 활성화된 Gs 연결된 리포터는 cAMP가 누적되게 하기 때문에, 유전자를 활성화시키고, 리포터 단백질을 발현시킨다. β갈락토시다제 또는 루시페라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학적 분석법을 이용하여 검출할 수 있다(PCT 공보 WO 00/22131).

Go 및 Gq와 같은 다른 G 단백질은 포스포리파제 C 효소의 활성화에 연관있는데, 이 효소는 인지질 PIP2를 가수분해시켜, 두 가지 세포내 메신져 즉, 디아실글리세롤(DAG) 과 이노시톨1,4,5삼인산염(IP3)을 방출한다. IP3 누적이 증가되는 것은 Gq 연합된 수용체 및 Go 연합된 수용체의 활성화와 연관 있다(PCT 공보 WO 00/22131). IP3 누적을 검출하는 분석을 이용하여 후보 화합물이 Gq 연합된 수용체 또는 Go연합된 수용체에 대해 역 효능제인지를 결정할 수 있다. Gq 연합된 수용체는 AP1 리포터 분석을 이용하여 분석할 수 있는데, 이 분석법은 Gq의존성 포스포리파제 C가 AP1 요소를 포함하는 유전자를 활성화시키는 원인인지를 분석한다. 따라서, 활성화된 Gq연합된 수용체는 이와 같은 유전자의 발현이 증가되었다는 것을 설명하고, 이에 따라 역 효능제는 이와 같은 발현에서 감소된다는 것을 설명한다.

또한, 본 발명은 후보 물질 또는 GAVE19 단백질에 결합하는 또는 GAVE19 발현 또는 GAVE19 활성에 자극 또는 저해 효과를 가지는 후보 또는 시험 화합물 또는 물질(펩티드, 펩티드 모방체, 소분자 또는 다른 약물)을 확인하는 방법(이하 “스크리닝 방법”이라 통칭함)을 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 GAVE19 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 막-결합된 형의 활성을 조절하거나 이에 결합할 수 있는 후보물질 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 당분야에 공지된 복합 라이브러리 방법에 이용할 수 있는 다양한 접근 방식으로 수득할 수 있는데, 예를 들면, 생물학적 라이브러리; 공간적으로 접근가능한 평행 고형상 또는 액상 라이브러리; 풀림(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; “한 개 비드한 개 화합물” 라이브러리 방법; 친화력 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법등이 포함된다. 생물학적 라이브러리 접근 방법은 펩티드 라이브러리에 한정하고, 다른 네가지 접근 방법은 펩티드, 펩티드가 아닌 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에도 적용할 수 있다(Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12:145).

분자 라이브러리 합성 방법은 당분야에서 실예를 찾을 수 있다: DeWitt 등., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:6909; Erb 등., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:11422; Zuckermann 등., J Med Chem (1994) 37:2678; Cho 등., Science (1993) 261:1303; Carrell 등., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059; Carell 등., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2061; and Gallop 등., J Med Chem (1994) 37:1233.

화합물 라이브러리는 용액(예를들면 Houghten Bio/Techniques (1992) 또는 비드(Lam, Nature (1991) 354:82-84); 칩(Fodor, Nature (1993) 364:555-556), 세균(미국 특허 5,223,409), 포자(미국 특허 5,571,698; 미국 특허5,403,484; 미국 특허 5,223,409), 플라스미드(Cull 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:1865-1869) , 파아지(Scott 등., Science (1990) 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6378-6382; Felici, J Mol Biol (1991) 222:301-310)상에 제공할 수 있다.

특정 구체예에서, 분석 방법은 세포 근거한 방법인데, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분의 막 결합된 형을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, GAVE19 단백질에 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정한다. 예를 들면, 세포는 효모균 세포 또는 포유류 기원의 세포가 될 수 있다. GAVE19 단백질에 결합할 수 있는 테스트 화합물의 결합 능력은 방사능 동위원소 표지된 또는 효소적으로 표지된 테스트 화합물을 결합시키고, 복합물내에 있는 표지된 화합물을 검출하여 GAVE19 단백질 또는 이 단백질의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 테스트 화합물이 결합되었는 지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 화합물에는¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C,³H를 직간접적으로 표지시켜, 방사능 방출량을 직접적으로 헤아리거나 또는 신틸레이션 카운팅을 이용하여 방사능 동위원소를 검출한다. 대안으로, 테스트 화합물을 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제 또는 루시페라제를 이용하여 표지화하고, 적절한 기질이 생성물로 전환되는 양을 결정한다. 특정 구체예에서, 분석 방법은 세포상에 세포막에 결합된 형태의 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분 단백질을 발현시키는 세포를 GAVE19 단백질과 결합하여 분석 혼합물을 형성하는 공지의 화합물과 접촉시키고, 분석 혼합물을 테스트 화합물과 접촉시켜, GAVE19 단백질과 상호작용할 수 있는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것으로 구성되는데, 이때 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정하는 방법은 공지의 화합물과 비교하였을 때, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 선호적으로 결합할 수 있는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것으로 구성된다.

또 다른 구체예에서, 분석 방법은 세포를 기초한 분석 방법으로, 이 방법은 세포막에 결합된 형태의 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분단백질을 발현시키는 세포를 그 세포 표면 상에서 테스트 화합물과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절(자극 또는 저해)하는 능력을 결정하는 것으로 구성된다. GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력은 GAVE19 단백질이 GAVE19 표적 분자와 결합하는 능력 또는 표적분자와 상호작용하는 능력을 결정하여 이루어진다. 여기에서 사용된 것과 같이, “표적 분자”는 자연에서 GAVE19 단백질이 결합하는 또는 상호작용하는 분자를 말하는데, 예를 들면, GAVE19 단백질을 발현시키는 세포의 표면에 있는 분자, 제 2 세포의 표면상에 있는 분자, 세포외 매트릭스상에 분자, 세포 막 내면 또는 세포질 분자와 연합하는 분자등이 된다. GAVE19 표적 분자는 GAVE19 이 아닌 분자 또는 본 발명의 GAVE19 단백질 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 한 구체예에서, GAVE19 표적 분자는 세포 막을 통하여 세포외 시그날을 세포로 유도할 수 있는 시그날 유도 경로의 성분(가령, 막에 결합된 GAVE19 분자에 화합물이 결합되어 발생되는 시그날)이 될 수 있다. 예를 들면, 표적은 촉매 활성을 가지는 제 2 세포 단백질 또는 GAVE19와 하향 시그날 분자와 연합될 수 있는 단백질이 될 수 있다.

GAVE19 표적 분자에 결합할 수 있는 또는 상호작용할 수 있는 GAVE19 단백질의 능력은 직접적인 결합을 결정하는 상기에서 설명하는 한 가지 방법에 의해 이루어진다. 적절한 구체예에서, GAVE19 표적 분자에 결합할 수 있는 또는 상호작용할 수 있는 GAVE19 단백질의 능력을 결정하는 방법은 표적 분자의 활성을 결정하는 것으로 이루어진다. 예를 들면, 표적 분자의 활성은 표적의 세포 제 2 메신져 유도를검출하여(가령, 세포내 Ca²⁺, 디아실글리세롤, IP3등), 적절한 기질상에 표적의 촉매적/효소적 활성을 검출하고(예를 들면, 루시페라제와 같은 검출 가능한 마커를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 GAVE19 반응성 조절 원소), 세포 분화 또는 세포 증식과 같은 세포 반응을 검출하는 것으로 결정된다.

본 발명은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 테스트 화합물에 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분과 결합하는 능력을 측정하는 것으로 구성된 무세포 분석을 포함한다. GAVE19 단백질에 테스트 화합물이 결합하는 정도는 상기에서 설명하는 것과 같이 직간접적으로 결정할 수 있다. 적절한 구체예에서, 분석법에는 GAVE19에 결합하는 공지 화합물을 GAVE19 단백질 또는 생물학적으로 활성을 가지는 부분과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정하고, 이때 GAVE19 단백질이 테스트 화합물에 결합하는 능력을 공지 화합물의 능력과 비교하여, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 테스트 화합물이 결합하는 능력을 결정하는 것으로 구성된다.

본 발명의 또다른 무세포 분석 방법은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 테스트 화합물과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절하는 능력(예를 들면, 자극 또는 저해)을 결정하는 것으로 구성된다. GAVE19 의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 방법은 직접 결합하는 정도를 결정하기 위해 상기에서언급하는 방법중 한 가지를 이용하여 GAVE19 표적 분자에 결합하는 GAVE19의 활성을 결정하는 것이다. 또 다른 구체예에서, GAVE19 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력은 추가로 GAVE19 표적 분자를 조절하는 GAVE19 단백질의 능력을 결정하는 것이다. 예를 들면, 적절한 기질상에 표적 분자의 촉매/효소 활성은 이미 언급한 것과 같이 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 무세포 분석 방법은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 공지 화합물(GAVE19 단백질과 접촉하여 혼합물을 형성하는 것으로 공지된)과 접촉시키고, 분석 혼합물과 테스트 혼합물을 접촉시켜, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정한다. GAVE19 단백질과 분석 화합물의 상호작용을 결정하는 단계는 GAVE19 단백질이 GAVE19 표적 분자에 선호적으로 결합하는지 또는 표적 분자의 활성을 조절하는지를 결정하는 것으로 구성된다.

수용체는 리간드가 아닌 분자에 의해 활성이 조절되는데, 비리간드 분자가 리간드 결합을 반드시 저해하는 것은 아니지만, 수용체내에 구조적 변화를 유도하여, G 단백질 결합 또는 수용체 응집, 이량체화 또는 군집화되도록 하여 활성화의 원인이 될 수도 있다. 예를 들면, 세포 표면상에 누출된 다양한 GAVE19 부분에 대한 항체가 생성될 수 있다. 이들 항체는 표준 분석 가령, cAMP 수준 또는 세포내 Ca⁺²수준을 모니터하는 등의 방법으로 결정하였을 때, G 단백질 연속 반응을 통하여 세포를 활성화시킨다. 분자 매핑, 특히 에피토프 매핑이 관련되기 때문에, 모노클로날 항체가 적합할 것이다. 세포 표면상에서 발현되는 고유 수용체 및 세포 표면에서 형성되는 것으로 공지된 펩티드 모두에 대해 모노클로날 항체를 만들 수 있다. 다수의 관련 펩티드를 수득하기 위해 Geysen 등., 미국 특허 5,998,577 방법을 실시할 수도 있다. GAVE19를 활성화시키는 것으로 밝혀진 항체를 변형시켜, 상보적 고정과 같은 GAVE19 활성화에 대한 외생 활성을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 항체를 절단 또는 돌연변이시켜 GAVE19 활성화이외의 활성을 최소화 또는 제거할 수 있다. 예를 들면, 특정 항체 경우에, 항원결합 부분만 필요하다. 따라서, 항체의 Fc 부분을 제거할 수 있다.

GAVE19를 발현시키는 세포를 항체에 노출시켜, GAVE19를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 세포에 다양한 분자를 노출시켜, 어떤 분자가 활성의 상승 또는 감소와 같은 수용체 활성을 조절하는지를 확인한다. 활성화가 안된 세포상에서 항체의 효과를 관찰하기 위해 항체 없이 GAVE19를 발현시키는 세포상에서 이러한 목적을 가진 분자를 테스트하였다. 그 다음 표적분자는 공지 기술을 이용하여 GAVE19 대사가 변경된 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 후보 물질로써 테스트 및 변형시킨다.

본 발명의 무세포 분석은 가용성 형태 및 막결합된 형태의 GAVE19에 모두 이용할 수 있다. 막결합된 GAVE19로 구성된 무세포 분석 경우에, 가용제를 이용하여 막결합된 GAVE19 형을 용액내에 유지시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 가용화제를 예로 들면, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥탄오일-N-메틸글루코시드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤 X100, 트리톤 X114,THESIT , 이소트리데실폴리(에틸렌 글리콜 에테스)n, 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-아미노-1-프로판 설포네이트와 같은 비-이온성 계면활성제를 이용한다.

본 발명의 상기 분석 방법의 한 가지 이상의 구체예에서, GAVE19 또는 이의 표적분자를 고정시켜 한 가지 또는 두 가지 단백질이 복합된 형을 복합안된 형으로부터 분리시키고, 자동화된 분석을 실행할 수 있다. 테스트 화합물이 GAVE19 단백질에 결합 또는 후보 테스트 화합물 유무하에 GAVE19와 이의 표적 분자의 상호작용이 있는지를 분석하는 것은 반응물질을 포함하는 임의 용기내에서 실행할 수 있다. 이와 같은 용기로는 미량적정 플레이트, 시험관, 마이크로 원심분리 튜브등이 포함된다. 한 구체예에서, 한 가지 또는 두 가지 단백질 모두다 매트릭스에 결합을 허용하는 도메인을 융합 단백질을 추가 제공할 수도 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스퍼라제/GAVE19 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제 /표적 단백질을 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO)상에 흡착시킨다. 대안으로 글루타치온-유도된 미량 적정판은 시험 화합물과 복합된다. 순차로, 비흡착된 표적 단백질 또는 GAVE19 단백질 복합체 형성을 유도하는 조건(가령, 염, pH에 대해 생리학적 조건에서)에서 배양된다. 배양 후에, 비드 또는 미량적정 플레이트를 세척하여 결합안된 임의 성분을 씻어내고, 상기에서 설명한 것과 같이 복합체가 형성된 것을 직간접적으로 측정할 수 있다. 대안으로, 복합체는 매트릭스로부터 분리되어, 표준 기술을 이용하여 GAVE19 결합 또는 활성 레벨을 결정할 수 있다.

단백질을 매트릭스에 고정시키는 다른 기술을 본 발명의 스크리닝 분석에 이용할 수 있다. 예를 들면, GAVE19 또는 이의 표적 분자를 바이오틴 및 스트렙타아비딘을 복합 사용하여 고정시킬 수 있다. 당분야에 공지된 기술(바이오티닐화 반응 키드, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 이용하여 바이오틴-NHS(N-하이드록시숙시니미드)로부터 바이오티닐화된 GAVE19 또는 이의 표적분자를 준비할 수 있고, 스트렙타아비딘피복된 96웰 플레이트(Pierce Chemicals)에 고정시킨다. 대안으로 GAVE19 또는 이의 표적 분자와 반응성이 있으나, GAVE19 단백질이 이의 표적 분자에 결합하는 것을 방해하지는 않는항체를 플레이트의 웰로부터 유도할 수 있다. 배양시에 결합안된 표적 또는 GAVE19는 항체 결합에 의해 웰에 갇히게 된다. GST고정된 복합체에 대해 상기에서 설명하는 것에 추가하여, 이와 같은 복합체를 검출하는 방법에는 GAVE19 또는 이의 표적 분자와 반응성이 있는 항체를 이용한 복합체의 면역검출 뿐만 아니라, GAVE19 또는 표적 분자와 연합된 효소 활성을 검출하는 것에 효소-연결된 분석을 이용하는 것이 포함된다.

또 다른 구체예에서, GAVE19 발현 조절물질을 확인할 수 있는데, 이때 확인하는 방법은 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 세포에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질이 발현되었는지를 결정한다. 후보 화합물 존재하에 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물이 없는 상태에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 비교한 것을 기초하여 후보 화합물이 GAVE19 발현 조절물질 인지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 후보화합물이 없을 때 보다 후보 화합물이 있을 때, GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현이 더 큰 경우(통계학적으로 유의성이 더 큰), 후보 화합물은 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현의 자극물질 또는 효능제라고 할 수 있다. 대안으로, 후보 화합물이 없을 경우보다 있는 경우 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 정도가 적다면(통계상으로 유의성이 적은 경우), 후보 화합물은 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현의 저해물질 또는 길항제라고 할 수 있다. GAVE19 활성이 리간드 또는 효능제가 있는 상태에서 활성이 감소된다면 또는 구성 GAVE19에서 기저 수준 이하인 경우에, 후보 화합물은 역 효능제라고 할 수 있다. GAVE19 mRNA 또는 단백질을 검출용으로 설명된 방법으로 세포에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, GAVE19 단백질을 이중-하이브리드화 분석 또는 삼중-하이브리드화 분석에서 “미끼 단백질”로 이용하여, GAVE19 단백질에 결합하는 또는 상호작용하는 다른 단백질(“GAVE19결합 단백질” 또는 “GAVE19bp”) 을 확인할 수 있고(미국 특허 5,283,317; Zervos 등., Cell (1993) 72:223-232; Madura 등., J Biol Chem (1993) 268:12046-12054; Bartel 등., Bio/Techniques (1993) 14:920-924; Iwabuchi 등., Oncogene (1993) 8:1693-1696; PCT 공보 WO 94/10300), GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 이와 같은 GAVE19 결합 단백질은 GAVE19 경로의 상행 또는 하행 요소등의 GAVE19 단백질에의한 시그날 전달에 연관이 되는 것으로 보인다.

본원 발명으로 인하여 다량의 순수 GAVE19가 만들어지는 경우에, 이상적인 약물 디자인을 위해, 기능을 하는 것으로 보이는 부위의 모양에 대한 물리적인 특징을 조정할 수 있다. 분자의 IC3 부분과 EC 도메인이 특히 관심을 끄는 부분이다.일단 부위의 모양 및 이온성 특징이 확인되면, 이들 부위와 상호작용할 있는 후보 약물을 만들고, 고유 세포, 동물 및 환자에서 테스트한다. 3D 구조 정보와 같은 정보를 끌어낼 수 있는 방법은 X선 결정학, NMR 분광기, 분자 모델링 등이 포함된다. 3D 구조로 공지 약물에 존재하는 공지 단백질에서 유사 모양을 확인할 수 있다. 이들 약물 및 유도체는 류마티스 관절염 또는 COPD와 같은 염증 질환 또는 질병 및 다른 여러질환을 치료하는데 이용 될 수도 있다.

본 발명은 또한 상기에서 설명하는 스크리닝 분석에의해 확인된 신규 물질 및 여기에서 설명하는 치료 용도에 이 물질을 이용하는 것이 포함된다.

본 발명의 분석

검출 분석

본 발명의DNA 서열 일부 또는 단편을 폴리뉴클레오티드 시약으로써 다양한 곳에 이용할 수 있다. 예를 들면 (i) 염색체상에 각 유전자를 매핑하고, 유전자 질환과 연관된 유전자 부위를 찾고; (ii) 작은 생물학적 시료(조직 타이핑)에서 개별 샘플을 확인하고 (iii) 생물학적 시료의 법의학적인 확인 때 서열을 사용할 수 있다. 이용 부분은 하기에서 설명한다.

염색체 매핑

일단 유전자 서열(또는 서열의 일부)이 분리되면, 그 서열을 이용하여 염색체상에 GAVE19 유전자 위치를 매핑할 수 있다. 따라서, 여기에서 설명하는 GAVE19 핵산 분자 또는 이의 단편을 이용하여, 게놈 상에 GAVE19 위치를 매핑할 수 있다.게놈 내의 GAVE19 서열의 매핑은 질병과 유전자 서열의 관계를 확인할 때 중요한 단계이다.

간략하게 설명하면, GAVE19유전자는 GAVE19 서열에서 PCR프라이머(바람직하게는 1525bp 길이)를 준비하여 게놈 내에 매핑한다. 프라이머는 개별 뮤린 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드화 PCR 스크리닝에 이용된다. GAVE19 서열에 상응하는 뮤린 유전자를 포함하는 하이브리드화만 증폭된 단편을 생산한다.

특정 방법에는 쥐의 염색체를 변성시키고, 엄격한 조건하에서 검출 가능한 표지된 GAVE19 DNA 분자와 접촉시키는 것이 포함되나 이에 한정시키지는 않는다. 하이브리드화 반응과 연속하여 검출 가능하게 표지된 GAVE19 DNA 분자 검출로 쥐의 염색체 상에 GAVE19 위치를 확인할 수 있다. 이와 같은원위치하이브리드화 반응 기술 (Fan 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6223-27에서 상술되어 있음)에서, 표지된 유동 선별된 염색체를 이용한 사전스크리닝 및 염색체 특이적인 cDNA 라이브러리에 하이브리드화 반응에 의한 사전 선별등이 포함된다. 유사분열 중기 염색체 스프레드에 DNA 서열의 형광원위치하이브리드화 반응(FISH)을 이용하여 단일 단계에서 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 유사분열 스핀들을 파괴하는 화학물질 예로 콜세미드(colcemid)에 의해 분열이 중기에서 차단된 세포를 이용하여, 염색체 스프레드를 만들 수 있다. 염색체를 트립신으로 간단하게 처리한 후에 Giemsa로 착색한다. 각 염색체상에 명암 패턴이 나타나기 때문에 염색체를 개별적으로 확인할 수 있다. FISH 기술은 길이가 500 또는 600bp로 짧은 DNA 서열에 이용할 수 있다. 그러나, 1,000bp이상의 긴 클론은 간단하게 검출할 수 있는 독특한 염색체 위치에 더 잘 결합할 수 있다. 바람직하게는 1,000개 염기, 더 바람직하게는 2,000개 염기 정도면 적절한 시간내에 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 기술에 대해서는 Verma 등. (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988))에서 확인할 수 있다. 염색체 매핑은 컴퓨터 시뮬레이션으로 추정할 수 있는데, 로드 스코어 또는 메어 근접성과 같은 통계학적 변수를 이용할 수 있다.

염색체 매핑에 이용되는 시약을 개별적으로 이용하여 염색체를 표시한다. 또한, 시약 패널을 이용하여 다중위치 또는 다중 염색체를 표시할 수 있다. GAVE19 유전자의 인접 부분에 상응하는 시약을 사용하는 것이 매핑에 적절하다. 암호화 서열은 유전자 족내에서 보존되어, 염색체 매핑동안에 교차 하이브리드화 반응의 기회가 늘어난다.

서열을 일단 정확한 염색체에 매핑한 후에, 염색체 상에 서열의 물리적인 위치를 유전자 지도 데이터와 연관시킬 수 있다. 동일한 염색체 부분에 매핑된 유전자와 질병과의 상관관계는 연결 분석을 통하여 확인할 수 있다(물리적으로 인접한 유전자의 공통유전)Egeland 등., Nature (1987) 325:783-787.

또한, GAVE19 과 연관된 질병이 있는 개체와 질병이 없는 개체 간에 DNA 서열의 차이를 결정할 수 있다. 질병이 있는 개체의 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰되나, 질병이 없는 개체에서는 관찰되지 않는다면, 돌연변이는 특정 질환의 원인 인자가 될 가능성이 있다. 질병이 있는 개체와 질병이 없는 개체와의 비교는 일반적으로 염색체 스프레드에서 육안으로 확인되거나 DNA 서열에 기초한 PCR을 이용하여 검출 가능한 결손 또는 전치와 같은 염색체 상의 구조적 변화를 우선 찾는다. 궁극적으로는 몇 몇 개체의 유전자의 완전한 서열로 다형성과 구별하여, 돌연변이가 있는지를 확인하는 것이다

1. 진단학적 분석

생물학적 시료내에 GAVE19의 존부를 검출하는 방법은 시험 개체로부터 생물학적 시료를 얻고, GAVE19 단백질 또는 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 (mRNA 또는 게놈 DNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질을 생물학적 시료에 접촉시켜, 시료내에 GAVE19가 존재하는지를 검출하는 것으로 구성된다. GAVE19 mRNA 또는 게놈 DNA 검출에 적절한 물질은 GAVE19 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화 할 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 서열 1의 핵산 등의 전장 GAVE19 핵산 또는 이의 일부분이 핵산 프로브가 될 수 있는데, 일부분이란 엄격한 조건하에서 GAVE19 mRNA 또는 게놈DNA에 하이브리드화 할 수 있을 정도의 충분한 길이 즉, 적어도 15, 30, 50, 100, 250, 500개 또는 그 이상의 길이가 될 수 있다. 진단 분석에 이용할 수 있는 다른 적절한 프로브도 여기에서 설명한다.

GAVE19 단백질을 검출하는 특정 시약은 GAVE19 단백질에 결합할 수 있는 항체, 예를 들면, 검출 가능한 표지가 있는 항체가 된다. 항체는 폴리클로날 항체, 키메라항체 또는 바람직하게는 모노클로날 항체가 된다. 고유 항체 또는 이의 단편(Fab 또는 F(ab')2) 을 이용할 수 있다. “생물학적 시료”는 개체에서 분리할 수 있는 조직, 세포, 생물학적 유체 및 개체내에 있는 조직, 세포 유체도 포함된다. 본 발명의 검출 방법을 이용하여,시험관내및생체내에서 생물학적 시료내에GAVE19 mRNA, 단백질, 게놈 DNA를 검출한다. 예를 들면, GAVE19 mRNA검출용시험관내기술에는 노던(Northern) 하이브리드화 반응 및원위치하이브리드화 반응이 포함된다. GAVE19 단백질을 검출하는시험관내기술에는 ELISA, 웨스턴 블랏, 면역 침전 및 면역형광법등이 포함된다. GAVE19 게놈 DNA를 검출하는생체내기술에는 서던(southern) 하이브리드화 반응이 포함된다. 또한, GAVE19를 검출하는생체내기술에는 개체내로 표지된 항GAVE19 항체를 도입시키는 것도 포함된다. 예를 들면, 항체는 방사능 활성 마커로 표지될 수 있어, 표준 이미지 기술을 이용하면 개체내에서 그의 존부 및 위치를 확인할 수 있다.

한 구체예에서, 생물학적 시료에는 시험 개체로부터 얻은 단백질 분자가 포함된다. 대안으로, 생물학적 시료에는 시험 개체에서 얻은 mRNA 분자 또는 게놈 DNA 분자가 포함된다. 통상의 방법을 이용하여 개체로부터 분리한 말초 혈액 백혈구세포가 여기에서 이용되는 용도에 가장 적절한 시료이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한, 기준 개체에서 생물학적 시료를 얻고, GAVE19 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 시약에 시료를 접촉시켜, 생물학적 시료 내에 있는 GAVE19 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 및 그 양을 검출하고, 기준 시료에 있는 GAVE19 단백질, mRNA, 게놈 DNA와 테스트 시료에 있는 GAVE19 단백질, mRNA, 게놈 DNA양을 비교하여 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하는 화합물이 있는지를 결정한다.

화학적 라이브러리 고처리량 분석

GAVE19 활성을 조절할 수 있는 화합물을 분석하는 임의 방법을 고처리량 스크리닝에 이용할 수 있다. 고처리량 스크리닝 시스템은 시판되는 것을 이용할 수 있다(Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA,등). 이와 같은 시스템은 일반적으로 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간을 정한 배양, 분석에 적합한 미량플레이트의 최종 판독 등을 포함하는 전 공정이 자동화되어 있다. 이와 같은 환경설정을 변경시킬수 있는 시스템으로 고처리량, 신속한 개시, 고도의 유연성 및 맞춤화가 가능하다. 이와 같은 시스템의 제조업자는 다양한 고처리량의 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, Zymark Corp와 같은 업자는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조절을 검출하는 스크리닝 기술을 설명하는 기술 보고서도 제공한다.

키트

본 발명에는 또한 생물학적 시료(테스트 시료)내에 GAVE19 존부를 검출하는 키트를 포함한다. 이와 같은 키트를 이용하여 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하는 특정 화합물이 존재하는지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 키트에는 시료내에 GAVE19 단백질 또는 mRNA 를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 물질과 포함되어 있고, 시료내에 GAVE19양을 결정하는 수단(예를 들면, 서열 1 과 같이 GAVE19를 암호화하는 DNA 에 결합하는 항GAVE19 항체 또는 올리고뉴클레오티드 프로브)를 포함되어 있다.

항체를 이용한 키트에서, 키트는 (1) GAVE19 단백질에 결합하는 제1항체(고형상에 부착된); (2) 선택적으로 GAVE19 단백질에 결합하거나 또는 제1항체에 결합하여 검출 가능한 물질로 결합되는 제 2 항체의 항체가 포함된다. 제 2 항체가 존재하기 않는 경우에 제1항체에 결합할 수 있고, 표지화 할 수 있는 다른 분자 또는 표지를 한 제 1 항체를 이용할 수도 있다. 어느 경우에든, 당분야에 공지된 것과 같은 검출 가능한 리포터 분자로 작용할 표지된 결합 부분이 포함된다.

올리고뉴클레오티드 기초한 키트에는 (1) 올리고뉴클레오티드, 가령, GAVE19 핵산 서열에 하이브리드화 할 수 있는 검출 가능한 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) GAVE19 핵산 분자를 증폭하는데 이용될 수 있는 한쌍의 프라이머가 포함된다.

키트에는 또한 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제가 포함된다. 또한 키트에는 검출 가능한 물질(가령, 효소 또는 기질)을 검출하는데 필수적인 성분이 포함된다. 또한, 키트에는 시험 시료와 비교하여 분석하게 될 한 가지 기준 시료 또는 일련의 기준 시료도 포함되어 있다. 키트의 각 성분은 통상 개별 용기에 포함되어 있고, 모든 다양한 용기들은 단일 포장되어있다.

약리유전체학

여기에서 설명하고 있는 것과 같이, 활성화된 또는 염증 상태 세포에서 GAVE19 발현이 조절된다. 염증과 연관된 질환에는 과민성 상태, 결장염, 크론(Crohn) 질환, 부종 상태, 접촉성 과민성, 알레르기 및 다른 형태의 관절염, 수막염, 맥관 팽창, 열, 세포 및 유체가 부위에 모임으로써 팽창등과 같은 손상에 대해 면역 반응이 작용하는 다른 질환등이 포함된다. 따라서, 여기에서 설명하고 있는선별 분석에 의해 확인된 것과 같이, GAVE19 활성(GAVE19 유전자 발현) 저해 또는 자극 효과를 가지는 물질 또는 조절 물질을 GAVE19 활성과 연관이 있는 질환(가령, 천식관련 염증, 만성 폐색성 폐질환, 류마티스 관절염)을 치료(또는 예방)하기 위해 개체로 투여할 수 있다. 이와 같은 치료에 결합시켜, 개인의 약리유전체학(개인의 유전자 형과 약물 또는 외부 화합물에 대해 개인이 나타내는 반응간에 상관 관계를 연구하는 학문)을 고려할 수 있다. 약학적으로 활성 약물의 투여량 및 혈중 농도간에 상관 관계를 변화시키면, 치료요법제 대사과정이 달라지게 되고 이로 인하여 심각한 독성 또는 치료 실패로 이어질 수 있다. 따라서, 개인의 약리 유전학을 이용하여 개인의 유전자형을 고려한 예방 또는 치료에 효과적인 물질(약물)을 선택할 수 있다. 이와 같은 약리 유전학을 이용하여 적절한 투여량 및 치료 섭생을 결정할 수도 있다.

약물유전체학은 질병이 있는 환자의 변경된 약물처리 및 비정상적인 작용에 반응하여 약물에 대한 임상적으로 심각한 유전학적 변화를 다루는 학문이다 (Linder, Clin Chem (1997) 43(2):254-266). 일반적으로 약리 유전학에서는 두가지 질환으로 구분지을 수 있다. 신체상에 약물이 작용하는 방식을 변경시키는 하나의 요인으로써 유전되는 유전적 질환을 “변경된 약물 작용”이라 한다. 약물에 신체가 반응하는 방식을 변경시키는 하나의 요인으로써 유전되는 유전적 질환을 “변경된 약물 대사과정”이라고 한다. 약리 유전학 질환은 매우 희귀한 결함으로 또는 다형현상으로 나타난다. 예를 들면, 글루코즈6포스페이트 디하이드로게나제 결핍(G6PD)은 가장 흔히 유전되는 효소관련 질환으로써 임상적으로 나타나는 주요 합병증은 산성 약물(항말라리아제, 설폰아미드, 진통제, 니트로퓨란) 및 누에콩을 복용후에 나타나는 용혈현상이다.

예시적인 구체예로써, 약물을 대사시키는 효소 활성이 약물 작용의 강도 및 지구성의 주요 결정인자가 된다. 약물을 대사시키는 효소(N아세틸트란스퍼라제 2(NAT2), 사이토크롬 P450 효소, CYP2D6, CYP2Cl 9)의 유전적 다형현상이 발견됨으로써 왜 일부 환자에서는 예상되는 약물효과가 나타나지 않는지 또는 과도한 약물 반응이 나타나는지 그리고, 약물의 기준 또는 표준 안전 투여량 복용후에도 심각한 독성이 나타나는지에 대해 설명을 할 수 있게 되었다. 다형현상은 집단에서 두 가지 표현형 즉, 대사가 정상적으로 잘 되는 개체군(extensive metabolizer (EM)) 과 대사가 잘되지 않는 개체군(poor metabolizer (PM))으로 나눌 수 있다. PM 정도는 집단마다 다르게 나타난다. 예를 들면, CYP2D6를 코드하는 유전자는 상당한 다형성으로 PM에 몇 가지 돌연변이가 확인되었고, 이들 모두는 CYP2D6의 기능이 사라지도록 한다. CYP2D6 및 CYP2Cl 9 의 대사가 잘 되지 않는 경우는 과도한 약물 반응에서 자주 나타나는 것으로 표준 투여량을 복용하였을 경우에도 부작용이 나타난다. 대사물질이 활성이 있는 치료요법제라면, PM은 치료요법적 반응을 보이지 않을 것인데, 이는 CYP2D6형성된 대사물질, 몰핀에 의해 중개되는 코데인의 마취 효과에서 설명된다. 다른 극단적인 예로는 표준 투여량에도 반응을 하지 않는 소위 초속 대사군이다. 최근에, CYP2D6 유전자 증폭으로 인하여 초속 대사과정의 분자원리가 확인되었다.

개체에서 GAVE19 단백질 동족체의 활성, GAVE19 핵산 동족체인 DNA 분자의발현 정도를 결정하여, 치료요법적 또는 예방차원의 개인 치료에 적합한 물질을 선별할 수 있다. 또한, 약물유전체학을 이용하여 개인의 약물 반응표현형을 확인하기 위해 약물을 대사시키는 효소를 암호화하는 다형성 대립형질의 유전자형을 확인할 수 있다. 약물 또는 투여량 선택에 이와 같은 지식을 이용하면 부작용 또는 치료 실패를 피할 수 있고, 여기에서 설명하는 예시적인 스크리닝 분석에 의해 확인된 조절 물질과 같은 GAVE19 조절물질로 개체를 치료할 경우에 치료 또는 예방효과를 강화시킬 수 있다.

D.치료 방법

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명에는 마우스에서 GAVE19 발현을 조절하는 약물 또는 물질을 확인하는 방법도 포함된다. 정상적인 지라에서 GAVE19가 상당하게 발현되는 등 GAVE19 발현 프로필이 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) RA 마우스 지라에서 정상 지라에서 볼 수 있는 수준과 비교하였을 때 2배 증가된 발현 수준을 보유하고, 정상 폐와 비교하였을 때 CIA RA 마우스 폐에서 발현 수준이 5배이상 상승되었기 때문에, 이와 같은 약물 및 물질은 염증성 질환(가령, 천식), 만성 폐색성 폐 질환, 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환 치료에 바로 이용될 수 있을 것이다.

예방 방법

한 측면에서 본 발명은 개체에서 상기 언급된 질환을 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 GAVE19 발현 또는 GAVE19의 적어도 한 가지 활성을 조절할 수 있는 물질을 개체에 투여하는 것이다. 당업자에게 공지된 진단 또는 예후 분석을임의 복합하여 이와 같은 치료를 통하여 유익한 효과를 얻을 수 있는 개체를 확인한다. GAVE19 이상 발현 또는 활성 증상이 명백하게 나타나기 전에 예방 물질을 투여하여, 발병을 방지하거나 발병을 지연시킬 수도 있다.

2. 치료요법적 방법

마우스에서 GAVE19 단백질 활성을 조절하는 것으로 발견된 것과 같은 염증 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 물질은 여기에서 설명하는 것과 같은 GAVE19의 핵산, 단백질, GAVE19의 자연 발생 동족 리간드, 펩티드, GAVE19 펩티드 모방체, 다른 소분자등이 될 수 있다. 한 구체예에서, 이와 같은 물질이 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 활성을 자극하는 물질에는 세포로 유입된 GAVE19를 암호화하는 핵산 분자 및 활성 GAVE19 단백질이 포함된다. 다른 예에서는 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 저해하는 물질도 있다. 이와 같은 저해성 물질에는 안티센스 GAVE19 핵산 분자 및 항GAVE19 항체가 포함된다. 조절 방법은시험관내에서 조절할 수도 있고 (가령, 세포를 물질로 배양시키는 방법) 또는생체내에서 조절할 수도 있다(가령, 개체에 물질을 투여하는 방법). 이와 같은 경우에, 본 발명은 상기에서 설명하는 질환을 앓는 개체를 치료는 방법을 지공하는데, 그 방법도 마우스에서 GAVE19 활성 또는 발현을 조절하는(하향 또는 상향조절)하는 것으로 확인된 물질(가령, 상기에서 설명하는 스크리닝 방법에 의해 확인된 물질) 또는 물질들을 복합시켜 투여하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 GAVE19 단백질 또는 핵산 분자를 투여하는 방법을 포함한다.

본 발명은 다음의 실시예로 더 자세하게 설명되나, 이에 한정하지는 않는다.다음의 실시예는 본 발명의 적절한 구체예를 충분하게 설명하기 위해 제공하는 것이다. 그러나, 본 발명의 범위를 이에 한정하는 것은 아니다.

현재 치료 약물 시장의 표적의 50% 이상이 상당수의 G-단백질 결합된 수용체등이다. 펩티드, 신경전달물질, 호르몬, 생장인자, 아민, 지질, 지방산, 취기 분자 및 빛을 포함하는 상당히 다양한 리간드에 의해 GPCR등이 활성화된다. GPCR 기능이 불안해지면 많은 병리학적 결과를 초래한다. 정상 지라에서 상당히 발현되는 사람의GAVE18의 정형체(ortholog)인 GAVE19는 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) RA 마우스 지라에서는 정상적인 지라에서의 수준과 비교하였을 때 약 2배 증가된 발현 수준을 가지고, 정상 폐와 비교하였을 때, CIA RA 마우스 폐에서는 5배 이상의 발현 수준을 가진다. 따라서, GAVE19는 염증 질환(가령, 천식), 만성 폐색성 폐질환, 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환을 치료하는 새로운 표적 약물 또는 물질을 제공한다.

GAVE19 확인 및 클로닝으로 "데-오파닝"(de-orphaning)이라고 하는 공정을 통하여 내생 리간드를 발견하는 기회를 제공할 수 있다. 천연 리간드 또는 데-오파닝을 통하여 확인된 대체 리간드는 수용체 시그날 전달을 활성화시키거나 차단시키는 일부 분자를 스크리닝하는 도구를 제공하여, 세포의 생리학적 그리고 세포 기능을 변화시킨다.

재료 및 방법

GAVE19의 동정 및 클로닝.마우스 게놈 DNA 데이터베이스를 얻기 위해 사람 GAVE18 DNA 서열을 이용하여도 마우스 상동성 DNA 서열이 나타나지 않았다. 그 다음 암호화 부분을 포함하는 사람 GAVE18 DNA를 프로브로 이용하여 Research Genetics 마우스 게놈 BAC 라이브러리를 스크리닝하였다. 사람 GAVE18 서열에 따라 고안된 다중 DNA 프라이머를 이용하여 포지티브 마우스 BAC를 서열화시켰다. 프라이머 5' GGC TTC CCC CAA AGA CAA AG 3’ (서열 3)만이 마우스GAVE19 DNA 서열 데이터를 제공하였다. 그 다음 다중 마우스 DNA 서열 프라이머를 마우스 GAVE19 암호화 부분을 서열화시키는 워킹 프라이머로 고안하였다.

마우스 질환 모델 및 RNA 분리. 다른 조직 및 기관으로부터 분리시킨 마우스 tRNA을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 GIBCO BLR사의 Trizol 시약으로 실시하였다. ABI사의 Multiscribe RT-PCR 키트(ABI)를 이용하여 tRNAs를 cDNAs로 변환시켰다.

TaqMan 분석. TaqMan 반응은 마우스 조직 cDNA를 이용하여 2회 실시하고, GAPDH 유전자를 내부 기준으로 이용한다. TaqMan 결과는 상대적인 발현으로 계산한다. 상대적인 발현은 (2^(0-ddCt))*1000와 같은데, 이때, ddCT는(GAVE19 평균Cts- GAPDH 평균 Cts)-(GAVE19 평균 NTC Cts-GAPDH 평균 NTC Cts)과 같다. TaqMan 프로브는 Operon Technologies에서 주문 합성하였다. TaqMan 프라이머 서열 1: 5’ CTGTTCTTGCTGGTGAAAATGAA 3’(서열 4)과 서열2: 5’ CCATGAACCACCACGAGGTT 3’ (서열 5). TaqMan 프로브 서열: 5’ (Fam)-TCACGTTCAGTGACCACCATGGCTG-(Tet) 3’ (서열 6). TaqMan 반응은 96-웰 플레이트 MicroAmp 광학 튜브(PE)에서 실행하였다.

결과 설명

TaqMan 발현 프로필에서는 정상 조절된 샘플에서 RA 등급 4까지 CIA RA 모델의 관절에서 GAVE19 의 발현 수준이 점진적으로 증가되었다는 것을 보여준다. 관절에서 RA 등급이 높을수록 GAVE19 발현이 높다는 것이다. 정상적인 폐 및 지라와 비교하였을 때 CIA RA 폐 및 지라에서 GAVE19발현 수준이 상당히 증가되었다는 것을 볼 수 있다. 다발성 경색을 가진 마우스 EAE(실험적으로 알레르기성 뇌척수염)에서, 임상단계전에 뇌에서 발현된GAVE19 수준과 비교하였을 때, EAE 절정 단계에서 뇌에서 발현되는 수준이 상당히 증가되었다는 것을 볼 수 있다.

마우스 조직에서 GAVE19의 TaqMan 발현 프로필을 정리한 표

도 3에는 발현 프로필 데이터를 도시하였다. 모든 데이터를 근거할 때 염증관련 질환에 GAVE 19가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 볼 수 있다.

토의

사람 GAVE18 의 정형체(orthlog)인 신규한 마우스 G-단백질 결합된 수용체인 GAVE19를 확인하고, 클론하였다. DNA의 암호화 부분의 전장(Full-length)과 이의아미노산 서열을 확인하였다. 정상적으로 조절된 마우스와 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) 마우스에서 RT-PCR (TaqMan) 분석을 통하여 수용체의 조직 분포를 분석하였다. GAVE19 발현 프로필에서 GAVE18(사람 정형체)에 유사하고, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환에서 이의 역할이 분명하게 나타났다. 여기에서 설명하는 다양한 분석법을 이용하여, GAVE19는 천식, RA, COPD 등의 염증 질환에 신규한 약물 표적을 제공한다. 또한, 마우스에서 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하기 위해 본 발명의 분석법에서 발견된 화합물 및 물질을 이와 같은 질환 치료에 바로 이용할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기에서 설명하는 실시예를 통하여 상세하게 설명되었으나, 당업자는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한 다양한 변화를 만들 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 이와 같은 변형 또한, 다음의 청구범위에만 속한다.

또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 중량치는 어림치이며, 설명을 위해 예시되었음을 인지할 것이다.

본 출원에 언급된 모든 특허 및 공보는 전문을 참고문헌으로 첨부한다.

<110> Aventis Pharmaceuticals Inc. <120 A NUCLEIC ACID ENCODING A G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR, AND USES THEREOF <130> 5-2002-007191-8 <140> PCT/US2003/04350 <141> 2003-02-13 <150> US 60/356,686 <151> 2002-02-14 <150> GB 0219574.1 <151> 2002-08-22 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggatggat ataatacctc tgagaattcc tcttgtgacc ctatactggc acaccactta 60 acatcgattt acttcatagt gctcattgga ggactggtag gtctcatctc catcctgttc 120 ttgctggtga aaatgaactc acgttcagtg accaccatgg ctgtcatcaa cctcgtggtg 180 gttcatgggg tcttcctact gacggtgcct ttccgcttgg catacctcat caaagggact 240 tggacgtttg gattaccctt ctgcaaattt gtgagtgcca tgttacatat ccacatgtac 300 ctcacgttcc tcttctacgt ggtgatacta gtcatcagat acctcatctt cttcaagcgt 360 agagacaaag tagaattcta tagaaaattg catgcagttg ctgcaagttc tgccatgtgg 420 cttctggtga ttgttattgt tgtgcccttg gtggtttctc agtatggaaa tagcgaagaa 480 tacaatgagc aacagtgctt tagattccat aaagaacttg gccatgattc tgtgcgagtt 540 atcaactata tgatagtcat tgttgtcata gctgttgcgt tgattctctt gggtttccag 600 gtcttcatca cattgtccat ggtgcggaag tttcgccact ccttactatc ccaccaggag 660 ttctgggcac aactgaaaaa tcttttcttt ataggtatca ttattatttg ttttcttccc 720 taccagttct tcaggattta ttacttgtat gttgtggcac attccaagag ctgtaaaaac 780 aaagttgcat tttacaatga aatcggttga 810 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Gly Tyr Asn Thr Ser Glu Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Leu 1 5 10 15 Ala His His Leu Thr Ser Ile Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Leu Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Ser Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Gly Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Ala Tyr Leu Ile Lys Gly Thr 65 70 75 80 Trp Thr Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Ile 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Arg Arg Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ser Ala Met Trp Leu Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Gln Tyr Gly Asn Ser Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Gln Gln Cys Phe Arg Phe His Lys Glu Leu Gly His Asp 165 170 175 Ser Val Arg Val Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Val Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Leu Ile Leu Leu Gly Phe Gln Val Phe Ile Thr Leu Ser Met Val 195 200 205 Arg Lys Phe Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Ile Ile Ile Ile Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Tyr Val Val Ala His Ser Lys 245 250 255 Ser Cys Lys Asn Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Gly 260 265 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 ggcttccccc aaagacaaag 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctgttcttgc tggtgaaaat gaa 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ccatgaacca ccacgaggtt 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe <400> 6 tcacgttcag tgaccaccat ggctg 25 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Gly His Asn Thr Ser Arg Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Val 1 5 10 15 Thr Pro His Leu Ile Ser Leu Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Val Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Thr Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Ser Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Tyr Leu Ile Lys Lys Thr 65 70 75 80 Trp Met Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Thr 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Cys Lys Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ala Gly Met Trp Thr Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Arg Tyr Gly Ile His Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Glu His Cys Phe Lys Phe His Lys Glu Leu Ala Tyr Thr 165 170 175 Tyr Val Lys Ile Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Phe Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Val Ile Leu Leu Val Phe Gln Val Phe Ile Ile Met Leu Met Val 195 200 205 Gln Lys Leu Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Val Ile Leu Val Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Val Val Thr His Ser Asn 245 250 255 Ala Cys Asn Ser Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Phe Leu Ser Val 260 265 270 Thr Ala Ile Ser Cys Tyr Asp Leu Leu Leu Phe Val Phe Gly Gly Ser 275 280 285 His Trp Phe Lys Gln Lys Ile Ile Gly Leu Trp Asn Cys Val Leu Cys 290 295 300 Arg 305

Claims (28)

1. 도 1의 DNA 서열(서열 1)을 포함하는 분리된 핵산 분자.
2. 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건하에서, 제1항에 따른 분리된 핵산 분자에 하이브리드화 할 수 있거나 제1항에 따른 분리된 핵산 분자에 상보적인 하이브리드화 프로브에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 도 2의 아미노산 서열(서열 2)을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
4. 제2항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열과 30% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 분리된 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 검출 가능한 표지가 효소, 방사능 동위원소 또는 형광 화학물질을 포함하는, 검출 가능하게 표지된 분리된 핵산 분자.
7. 도 2의 아미노산 서열(서열 2)을 포함하는 정제된 폴리펩티드.
8. 제7항에 따른 정제된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
9. 제7항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 정제된 폴리펩티드.
10. 제9항에 있어서, 검출 가능한 표지가 효소, 방사능 동위원소 또는 형광 화학물질을 포함하는 정제된 폴리펩티드.
11. 면역원으로서, 제7항에 따른 정제된 폴리펩티를 가지는 항체.
12. 제11항에 있어서, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메라 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체.
13. 제11항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 항체.
14. 제13항에 있어서, 검출 가능한 표지가 효소, 방사능 동위원소 또는 형광 화학물질을 포함하는 항체.
15. 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 제1항에 따른 분리된 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
16. 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 제2항에 따른 분리된 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 발현 조절 요소가 구성적 조절 서열, 세포-특이적 조절 서열, 유도성 조절 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 발현 벡터.
18. 제17항에 있어서, 발현 조절 요소가 프로모터인 발현 벡터.
19. 제18항에 있어서, 프로모터가 hCMV 이메디에이트 어얼리 프로모터, SV40 어얼리 프로모터, 아데노바이러스 어얼리 프로모터, 우두 바이러스 어얼리 프로모터, 폴리오마 어얼리 프로모터, SV40 레이트 프로모터, 아데노바이러스 레이트 프로모터, 우두 레이트 프로모터, 폴리오마 레이트 프로모터,lac시스템,trp시스템,TAC시스템,TRC시스템, 파아지 람다의 주요 작동 인자 및 프로모터 부분, fd 피막 단백질의 조절 부분, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 산 포스포타제 프로모터 또는 효모 α 교배 인자의 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
20. 제15항 또는 제16항에 따른 발현 벡터에 의해 형질 전환 또는 형질 감염된 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 진핵 세포 또는 원핵 세포를 포함하는 숙주 세포.
22. 제21항에 있어서, 대장균(E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 효모(yeast), CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 또는 Sf9 세포를 포함하는 숙주 세포.
23. a) 분리된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 조건하에서 제20항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

    b) 상기 배양물, 상기 숙주 또는 이의 복합물로부터 분리된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제7항에 따른 정제된 폴리펩티드의 생산 방법.
24. GAVE19를 발현시키는 세포를 잠재적인 효능제와 접촉시키는 단계, 및 잠재적인 효능제 존재하에서 GAVE19의 시그날 전달 활성이, 잠재적인 효능제 부재 상태에서의 GAVE19 활성에 비해 증가되었는지를 결정하는 단계를 포함하는, GAVE19의 효능제를 동정하는 방법.
25. GAVE19를 발현시키는 세포를 잠재적인 역 효능제와 접촉시키는 단계, 및 잠재적인 역 효능제 존재하에서 GAVE19의 시그날 전달 활성이, 잠재적인 역 효능제 부재 상태에서의 GAVE19 활성에 비해 감소되었는지를 결정하고, 내생 리간드 또는 효능제 존재하에서의 GAVE19 활성에 비해 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함하는, GAVE19의 역 효능제를 동정하는 방법.
26. GAVE19를 발현시키는 세포를 잠재적인 길항제와 접촉시키는 단계, 및 상기 잠재적인 길항제의 존재하에 GAVE19의 시그날 전달 활성이, 내생 리간드 또는 효능제 존재하에서의 GAVE19 활성에 비해 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함하는, GAVE19의 길항제를 동정하는 방법.
27. GAVE19 시그날 전달 활성 또는 시그날 전달을 조절할 수 있는 GAVE19의 효능제, 역 효능제 또는 길항제를 포함하는 치료학적 조성물.
28. GAVE19 시그날 전달 활성 또는 시그날 전달을 조절할 수 있는 GAVE19의 효능제, 역 효능제 또는 길항제를 포함하는 치료학적 조성물을 치료를 필요로하는 환자에 투여함을 포함하는, 질환의 치료 방법.