KR20040088072A - A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof - Google Patents
A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR20040088072A KR20040088072A KR10-2004-7012638A KR20047012638A KR20040088072A KR 20040088072 A KR20040088072 A KR 20040088072A KR 20047012638 A KR20047012638 A KR 20047012638A KR 20040088072 A KR20040088072 A KR 20040088072A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gave19
- protein
- nucleic acid
- promoter
- activity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은, 염증 및 생리학적 면역 반응에 관한 시그날 전달과 관련하여 신규하고 유용한 G-단백질 결합된 수용체를 제공한다. 또한, 수용체를 이용하여 수용체 활성을 조절할 수 있는 분자를 스크리닝하는 방법도 제공한다. 이와 같은 분자는 염증 과다 및 면역 관련 질환 및 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.The present invention provides novel and useful G-protein coupled receptors in connection with signal delivery regarding inflammatory and physiological immune responses. It also provides a method of screening molecules that can modulate receptor activity using the receptor. Such molecules can be used to treat hyperinflammatory and immune related diseases and disorders.
Description
발명의 배경Background of the Invention
G 단백질 결합된 수용체(GPCR)는 세포 시그날 전달과 관련된 막에 결합된 거대한 군의 통합 막 단백질이다. GPCR들은 신경전달물질, 호르몬, 방취제, 빛 등을 포함하는 다양한 세포 외부 시그날에 반응하여, 시그날을 전달시키는 능력을 보유하여, 세포내에 제2 메신져 반응이 시작될 수 있도록 한다. 염증, 기관지 확장, 심박율, 혈관확장, 엔도크린 방출, 연동운동을 포함하는 많은 다양한 생리학적 반응을 이와 같은 수용체가 중재하고 있기 때문에, GPCR은 많은 치료 약물의 표적이 된다.G protein coupled receptors (GPCRs) are a large group of integrated membrane proteins that are bound to membranes involved in cellular signal transduction. GPCRs have the ability to deliver signals in response to various extracellular signals, including neurotransmitters, hormones, deodorants, light, and the like, allowing a second messenger reaction to begin in the cell. Because these receptors mediate many different physiological responses, including inflammation, bronchodilation, heart rate, vasodilation, endocrine release, and peristalsis, GPCRs are the target of many therapeutic drugs.
GPCR은 세포외 도메인, 7개의 막관통 도메인, 세포내 도메인으로 구성된 특징이 있다. 리간드에 결합하거나, G 단백질과 상호작용 하는 등의 수용체에 의해 실행되는 기능 중 일부는 중요 위치에 존재하는 특정 아미노산과 관련있다. 예를 들면, 각종 연구에서 보여준 바와 같이, GPCR의 아미노산 서열이 달라지면 자연 리간드 또는 소분자 효능제 또는 길항제에 대한 친화력이 달라진다. 즉 환언하면, 서열에서의 작은 차이가 결합 친화력 및 활성 차이의 원인이 될 수 있다(Meng 등., J Bio Chem (1996) 271(50):32016-20; Burd 등., J Bio Chem (1998) 273(51):34488-95; Hurley 등., J Neurochem (1999) 72(l):413-21). 특히, 연구에 따르면 제3 세포내 도메인에서 아미노산 서열 차이로 인하여 활성이 달라진다. Myburgh등은 고나도트로핀 방출 호르몬의 세포내 3번 루프의 261번 알라닌이 G 단백질 결합 및 수용체 내재화(internalization)에 중요하다는 것을 밝혔다(Biochem J (1998) 33l(Part 3):8936). Wonerow 등은 티로트로핀 수용체에 대해 연구하였는데, 제3세포내 루프에 결손이 생기면 구성 수용체 활성이 야기된다고 설명한다(J Bio Chem (1998)273(14):7900-5).GPCRs are characterized by an extracellular domain, seven transmembrane domains, and an intracellular domain. Some of the functions performed by receptors, such as binding to ligands or interacting with G proteins, are related to specific amino acids present in critical positions. For example, as shown in various studies, different amino acid sequences of GPCRs result in different affinity for natural ligands or small molecule agonists or antagonists. In other words, small differences in sequence can cause differences in binding affinity and activity (Meng et al., J Bio Chem (1996) 271 (50): 32016-20; Burd et al., J Bio Chem (1998). 273 (51): 34488-95; Hurley et al., J Neurochem (1999) 72 (l): 413-21). In particular, studies have shown that activity is altered due to amino acid sequence differences in the third intracellular domain. Myburgh et al. Found that 261 alanine in loop 3 of the gonadotropin releasing hormone is important for G protein binding and receptor internalization (Biochem J (1998) 33l (Part 3): 8936). Wonerow et al. Studied tyrotropin receptors and explained that deletion of the third intracellular loop causes constitutive receptor activity (J Bio Chem (1998) 273 (14): 7900-5).
일반적으로, 수용체에 내생 리간드가 결합하면 수용체의 세포내 도메인(들) 입체 구조가 변형되어, G 단백질의 세포내 성분과 세포내 도메인(들) 간에 결합이 형성된다. 몇 가지 G단백질이 존재하는데, 가령 Gq, Gs, Gi, Gz, Go (Dessauer 등., Clin Sci (Colch) (1996) 91(5):527-37 참고)등이 있다. IC-3 루프뿐만 아니라 수용체의 카르복시 말단도 G 단백질과 상호작용한다(Pauwels 등., Mol Neurobiol (1998) 17(13):109-135; Wonerow 등, 상기 참조). 일부 GPCR는 G 단백질에 관하여 “불규칙적”인 데 즉, GPCR는 한 개 이상 종류의 G 단백질과 상호작용할 수 있다(Kenakin, Life Sciences (1988) 43:1095).In general, binding of an endogenous ligand to a receptor alters the intracellular domain (s) conformation of the receptor, forming a bond between the intracellular component of the G protein and the intracellular domain (s). Several G proteins exist, such as Gq, Gs, Gi, Gz, Go (Dessauer et al., Clin Sci (Colch) (1996) 91 (5): 527-37). The carboxy terminus of the receptor, as well as the IC-3 loop, interacts with G proteins (Pauwels et al., Mol Neurobiol (1998) 17 (13): 109-135; Wonerow et al., Supra). Some GPCRs are “irregular” with respect to G proteins, ie GPCRs can interact with more than one type of G protein (Kenakin, Life Sciences (1988) 43: 1095).
리간드는 GPCR를 활성화시켜 G 단백질과 결합하도록 함으로써, 시그날 전달 연속 (cascade) 반응을 시작한다(이하 “시그날 전달”이라고 통칭함). 이와 같은 시그날 전달 과정으로 세포를 활성화시키거나 세포를 저해시킨다.The ligand initiates a signal transduction cascade reaction by activating GPCR to bind G protein (hereinafter referred to as “signal transduction”). This signal transfer process activates or inhibits cells.
GPCR는 “활성”과 “비활성” 상태의 두 가지 상이한 형태 사이에 균형을 이루면서 세포막에 존재한다. 비활성 상태의 수용체는 생물학적 반응을 유도하는 세포내 시그날 전달 경로에 연결될 수 없다(예외적으로 형질 도입된 세포에서 수용체가 과다 발현되는 경우가 있다, 참조예: www.creighton,edu/phamacology/inverse.htm) . 활성 상태로 모양이 조절되면, 전달 경로(G 단백질을 경유하여)에 연결되어 생물학적 반응이 일어난다. 효능제가 결합하면 활성 상태 모양으로 더 잘 만들 수도 있다. 그러나, 때때로 임의 효능제 없이도 상당한 반응이 있다면 이와 같은 수용체는 구성적으로 활성화되었다고 말하는 경우도 있다(즉, 이미 활성 형태이거나 리간드에 대해 독립적이거나 또는 자가 활성 상태일 수 있다). 이와 같은 시스템에 효능제가 추가되는 경우에 보편적으로 강화된 반응이 관찰된다. 그러나, 전통적인 길항제가 추가되는 경우에, 이와 같은 분자가 결합되어도 영향이 없다. 한편 일부 길항제는 수용체의 구성 활성을 저해하는 원인이 되는데, 약물의 경우 기술적으로는 길항제가 아니지만, 음성적 고유 활성을 가지는 효능제임을 시사한다. 이와 같은 약물을 “역 효능제”라고한다참조예: www.creighton,edu/phamacology/inverse.htm).GPCRs exist in cell membranes, balancing between two different forms of "active" and "inactive" states. Inactive receptors cannot be connected to intracellular signal transduction pathways that induce biological responses (except in some cases the receptors are overexpressed in transfected cells, see eg www.creighton, edu / phamacology / inverse.htm) . When the shape is regulated in an active state, it is linked to a delivery pathway (via G protein) and a biological reaction occurs. When agonists are combined, they can make the active form better. However, sometimes it is said that such a receptor is constitutively activated if there is a significant response without any agonist (ie, it may already be in active form, independent of ligand, or in a self-active state). When agonists are added to such a system, a universally enhanced response is observed. However, when traditional antagonists are added, the binding of such molecules has no effect. On the other hand, some antagonists are responsible for inhibiting the constitutive activity of the receptor, the drug is not technically an antagonist, but suggests that agonists with negative intrinsic activity. Such drugs are called “inverse agonists,” for example, www.creighton, edu / phamacology / inverse.htm.
수용체에 대한 통상적인 연구는 길항제 및 다른 수용체 효능 인자 분자를 발견하기 전에 내생 리간드가 우선적으로 확인된다는 전제로부터 진행되어 왔다. 길항제가 먼저 발견되었더라도 독단적인 반응으로 내생 리간드를 확인한다(WO 00/22131). 그러나, 스크리닝을 목적으로 하는 분석 경우에 활성 상태가 가장 유용하기 때문에, 구성 수용체, 특히 GPCR를 수득하면 내생 리간드에 관한 정보 없이도 효능제, 부분 효능제, 역 효능제 및 길항제를 쉽게 분리할 수 있다. 또한, 수용체 활성 장애로 인한 질병인 경우에, 자가 활성 상태에 있는 수용체를 이용하면 구성 활성을 저해시키는 약물 또는 좀더 구체적으로 활성화된 수용체의 효과 농도를 감소시키는 약물을 바로 발견할 수 있었을 것이다. 예를 들면, 질병을 치료하기 위해 환자에게 형질 감염될 수 있는 수용체의 경우에, 이와 같은 수용체의 활성을 상기 분석에 의해 발견될 수 있는 역 효능제로 세밀히 조정할 수 있다.Conventional studies on receptors have proceeded from the premise that endogenous ligands are preferentially identified before finding antagonists and other receptor potency molecules. Even if an antagonist was found first, an endogenous reaction identifies the endogenous ligand (WO 00/22131). However, since the active state is most useful for assays for screening purposes, obtaining constitutive receptors, especially GPCRs, allows for easy separation of agonists, partial agonists, inverse agonists and antagonists without information on endogenous ligands. . In addition, in the case of diseases caused by impaired receptor activity, the use of receptors in the self-active state would immediately find a drug that inhibits constitutive activity, or more specifically a drug that reduces the effective concentration of the activated receptor. For example, in the case of receptors that can be transfected into a patient to treat a disease, the activity of such receptors can be finely tuned with inverse agonists that can be found by the assay.
천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염 (RA)과 같은 질환은 일반적으로 T 헬퍼 세포, 단세포 대식세포, 호산구가 연관된 염증 병인을 가지는 것으로 보고 있다. 코르티코스테로이드를 이용한 현재 항 염증 치료법은 천식에는 효과가 있으나, 대사적 부작용 및 엔도크린 부작용이 연루된다. 폐 또는 비강 점막을 통하여 흡수될 수 있는 흡입된 조제물의 경우에도 같을 것으로 보고 있다. RA 또는 COPD 치료용으로 현재 만족할만한 경구 치료법은 없다.Diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), rheumatoid arthritis (RA) are generally thought to have an inflammatory etiology associated with T helper cells, unicellular macrophages, and eosinophils. Current anti-inflammatory therapies with corticosteroids are effective for asthma, but metabolic and endocrine side effects are involved. The same is true for inhaled preparations that can be absorbed through the lung or nasal mucosa. There are currently no oral treatments that are satisfactory for the treatment of RA or COPD.
호산구는 알레르기 및 천식에서 많은 기도 기능장애를 중재한다. 인터루킨-5 (IL-5)는 호산구 생장 및 활성화시키는 사이토킨이다. 연구에 따르면 조직의 호산구백혈구 증가증 및 기도-기능항진증으로 발전되는 호산구-중재된 조직 손상에 IL-5가 필수적인 것으로 나타났다(Chang 등., J Allergy Clin Immunol (1996) 98(5 pt1):922-931 및 Duez 등., Am J Respir Crit Care Med (2000) 161(1):200-206). 아토피성 천식에 노출된 알레르겐(예를 들면 집먼지 진드기 항원)에 의해 T-헬퍼-2-세포(Th2)에 의해 IL5가 만들어진다.Eosinophils mediate many airway dysfunctions in allergies and asthma. Interleukin-5 (IL-5) is a cytokine that eosinophils grow and activate. Studies have shown that IL-5 is essential for eosinophil-mediated tissue damage that leads to tissue eosinophilia and airway-hyperfunction (Chang et al., J Allergy Clin Immunol (1996) 98 (5 pt1): 922- 931 and Duez et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 161 (1): 200-206). IL5 is produced by T-helper-2-cells (Th2) by allergens (eg, house dust mite antigens) exposed to atopic asthma.
병변 활막에서 활성화된 대식세포 누적으로 인하여 RA가 나타나는 것으로 보고있다. 인터페론γ (IFNγ)는 수많은 선염증성 성질을 가지는 T헬퍼1 (Th1) 세포에 의해 유도되는 사이토킨이다. 인터페론은 대식세포를 활성화시키는 가장 강력한 사이토킨이고, MHC 클래스 II 유전자 전사를 유도하여 수지상 세포-유사 표현형에 기여한다.RA appears to be due to the accumulation of activated macrophages in the lesion synovial membrane. Interferonγ (IFNγ) is a cytokine induced by T helper 1 (Th1) cells with numerous preinflammatory properties. Interferons are the most potent cytokines that activate macrophages and induce MHC class II gene transcription, contributing to the dendritic cell-like phenotype.
리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성 세균 세포 벽의 한 성분으로써, 종양 괴사 인자 α (TNFα) 방출 등을 포함하는 염증 반응을 유도한다. RA에서 정맥내 항TNFα 치료법의 효능을 임상적으로 설명한 바 있다. 폐에 대식세포가 누적되어 COPD가 발생되는 것으로 보고있으며, 대식세포는 호중구 화학물질 유인제(예를 들면, IL8: de Boer 등., J Pathol (2000) 190(5):619-626)를 만든다. 대식세포와 호중구 모두는 기포 벽의 붕괴 원인이 되는 카텝신을 방출한다. 염증성 세포 화학 유인물질 및 다른 염증성 세포 활성화 물질의 중요한 공급원은 폐 상피인 것으로 보고 있다(예로써 Thomas 등., J Virol (2000) 74(18):8425-8433; Lamkhioued 등., Am J Respir Crit Care Med (2000) 162(2 Pt. 1):723-732; Sekiya 등., J Immunol (2000) 165(4):2205-2213을 참고).Lipopolysaccharide (LPS) is a component of Gram-negative bacterial cell walls that induces inflammatory responses including tumor necrosis factor α (TNFα) release and the like. Clinically described the efficacy of intravenous anti-TNFα therapy in RA. Accumulation of macrophages in the lungs has led to the development of COPD. Macrophages contain neutrophil chemical attractants (eg, IL8: de Boer et al., J Pathol (2000) 190 (5): 619-626). Make. Both macrophages and neutrophils release cathepsin, which causes the bubble walls to collapse. An important source of inflammatory cell chemistry attractants and other inflammatory cell activators is believed to be lung epithelium (e.g. Thomas et al., J Virol (2000) 74 (18): 8425-8433; Lamkhioued et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 162 (2 Pt. 1): 723-732; Sekiya et al., J Immunol (2000) 165 (4): 2205-2213).
질병에서 GPCR가 하는 역할 및 GPCR의 활성을 조절함으로써 질병을 치료하는 능력이 있다면, 아직까지 미확인된 GPCR를 동정하고, 특징을 확인하면, GPCR 활성과 연관된 질병을 치료할 수 있는 신규한 조성물 및 그 치유 방법 개발에 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 필요한 것은 미지의 GPCR 을 암호화하는 유용하고 신규한 핵산 분자를 발견하고, 분리하여, 그 특징을 밝히는 것이다.If there is a role for GPCR in disease and the ability to treat disease by modulating the activity of GPCR, a novel composition and its cure that, if identified and unidentified GPCR, can be identified to treat disease associated with GPCR activity. It may be used for method development. Therefore, what is needed is to find useful, novel nucleic acid molecules encoding unknown GPCRs, isolate them, and characterize them.
미지의 GPCR를 이용하여 특정 GCPR 의 잠재적인 효능제 또는 길항제로 작용할 수 있는 분자를 확인하는 분석이 필요하다. 이와 같은 분자들은 생체내(in vivo)에서 GPCR 활성을 조절하는 치료제로 응용하여, GPCR 활성과 연관된 적혈구과다증을 치료한다.Assays are needed to identify molecules that may act as potential agonists or antagonists of specific GCPRs using unknown GPCRs. Such molecules are applied as therapeutic agents to modulate GPCR activity in vivo to treat erythropoiesis associated with GPCR activity.
여기에서, 문헌 인용이, 당해 문헌을 본 발명 이전의 “선행기술”로 이용할 수 있다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.Here, the citation of a document should not be construed as an admission that the document can be used as a "prior art" prior to the present invention.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 구성적으로 활성을 가지는 뮤린(murine)의 GPCR인 신규한 활성 GAVE19 발현을 확인하고, 특징을 조사하고, 관련 질환 확인 및 치료에 이용할 수 있는 방법 및 그 조성물을 제공한다.The present invention provides methods and compositions for identifying constitutively active murine (GPCR) expression of novel active GAVE19 expression, investigating its characteristics, and identifying and treating related diseases.
따라서, 넓은 의미로, 본 발명에는 도 1의 DNA 서열(이하 ”서열 1”)로 구성된 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 유도체 및 유사체까지 포함시킬 수 있다. 이와 같은 본 발명의 변이체에는 대립형질 변이체, 축퇴성(degenerate) 변이체, 또는 서열에 축퇴성 변화를 유도하게 되는 대립형질 변이체가 포함 될 수도 있다.Thus, in the broadest sense, the present invention may include isolated nucleic acid molecules, variants thereof, fragments, derivatives and analogs of the DNA sequence of FIG. 1 (hereinafter referred to as “SEQ ID NO: 1”). Such variants of the invention may include allelic variants, degenerate variants, or allelic variants that induce degenerate changes in the sequence.
또한, 본 발명은 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건 하에서 서열 1의 분리된 핵산 분자에 하이드리드될 수 있는 분리된 핵산, 이의 변이체까지도 포함된다. 또한, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열 1의 서열에 상보적인 분리된 핵산 분자에 하이드리드될 수 있는 분리된 핵산도 포함된다. 엄격한 하이브리드화 반응 조건은 하기에서 설명한다.The invention also encompasses isolated nucleic acids, variants thereof, which can be hybridized to the isolated nucleic acid molecules of SEQ ID NO: 1 under stringent hybridization conditions. The present invention also encompasses isolated nucleic acids that can be hybridized to isolated nucleic acid molecules that are complementary to the sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent hybridization conditions. Stringent hybridization conditions are described below.
또한, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자도 포함된다.The present invention also includes an isolated nucleic acid molecule comprising a DNA sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
상기한 바와 같은 본 발명의 분리된 핵산 분자에는 검출 가능한 표지가 부착될 수도 있다. 여기에서 사용할 수 있는 검출 가능한 표지로는 효소, 방사능 동위원소 또는 형광 화학물질이 포함되나, 이에 국한시키지는 않는다. 검출 가능한 표지의 특정 예는 다음에서 설명하고 있다.A detectable label may be attached to the isolated nucleic acid molecule of the present invention as described above. Detectable labels that can be used herein include, but are not limited to, enzymes, radioisotopes or fluorescent chemicals. Specific examples of detectable labels are described below.
본 발명에는 특정 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들면, 본 발명에는 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 정제된 폴리펩티드와 이의 보존성 변이체 또는 유사체 및 유도체도 포함된다. 임의로, 본 발명의 폴리펩티드에는 검출 가능한 표지가 부착될 수도 있다.Certain polypeptides are included in the present invention. For example, the present invention also encompasses purified polypeptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and conservative variants or analogs and derivatives thereof. Optionally, a detectable label may be attached to the polypeptide of the present invention.
또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드가 항체를 생산하는데 이용되는 면역원이 될 수 있어, 항체까지 포함된다. 이와 같은 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있다. 또한, 항체들은 “키메라” 형태가 될 수 있는데, 가령, 다른 종에서 본 발명의 정제된 폴리펩티드에 대항하여 형성된 항체의 단백질 도메인으로 구성될 수도 있다. 본 발명의 항체에는 검출 가능한 표지가 부착될수도 있다. 이용할 수 있는 특정 검출 가능한 표지에 대해서는 하기에서 설명하고있다.In addition, in the present invention, the polypeptide of the present invention may be an immunogen used to produce an antibody, and includes an antibody. Such antibodies can be monoclonal or polyclonal antibodies. The antibodies may also be in the “chimeric” form, such as consisting of the protein domains of antibodies formed against the purified polypeptides of the invention in other species. A detectable label may be attached to the antibody of the present invention. Specific detectable labels that can be used are described below.
본 발명에는 발현 조절 요소과 작용이 되도록 연합된, 서열 1의 DNA 서열로구성된 핵산 분자, 이의 변이체, 유사체 또는 유도체, 단편로 이루어진 발현 벡터도 포함된다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 발현 조절 요소과 작동 가능하도록 연합된 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산에 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 또는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자에 상보적인 하이브리드화 프로브에 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 핵산 분자로 구성될 수도 있고, 이때, 하이브리드화 프로브는 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 연합되어 있다. 여기에서 이용할 수 있는 발현 조절 요소의 구체적 예를 든다면 프로모터가 된다. 본 발명에 이용할 수 있는 특정 프로모터로는 hCMV 어얼리 프로모터, SV40 어얼리 프로모터, 아데노바이러스 어얼리 프로모터, 우두 어얼리 바이러스, 폴리오마(polyoma) 어얼리 프로모터, SV40 레이트 프로모터, 아데노바이러스 레이트 프로모터, 우두 레이트 프로모터, 폴리오마 레이트 프로모터,lac시스템,trp시스템,TAC시스템,TRC시스템, 파아지 람다의 주요 작동인자 및 프로모터 부분, fd 피복 단백질의 조절 부분, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 산 포스파타제 프로모터, 효모 α 교배 인자의 프로모터 등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.The present invention also encompasses expression vectors consisting of nucleic acid molecules consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, variants, analogues or derivatives thereof, and fragments associated with the expression control element. In addition, the expression vector of the present invention is an isolated nucleic acid capable of hybridizing under stringent hybridization conditions to an isolated nucleic acid consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO. Hybridization probes complementary to the nucleic acid molecules may be composed of nucleic acid molecules capable of hybridization under stringent hybridization conditions, wherein the hybridization probes are associated to be operable to expression control elements. Specific examples of expression control elements that may be employed herein are promoters. Specific promoters that can be used in the present invention include hCMV early promoter, SV40 early promoter, adenovirus early promoter, vaccinia early virus, polyoma early promoter, SV40 late promoter, adenovirus late promoter, vaccinia Late promoter, polyomalate promoter, lac system, trp system, TAC system, TRC system, major effector and promoter portion of phage lambda, regulatory portion of fd coated protein, 3-phosphoglycerate kinase promoter, acid phosphatase promoter, Such as, but not limited to, promoters of yeast α cross-factors.
본 발명의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질감염시켜, 서열 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 만들 수 있다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포가 될 수 있다. 여기에서 이용할 수 있는 단세포 숙주로는 대장균(E. coli), 슈도모나스(Pseudonomas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 효모(yeast), CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40,BMT10, Sf9 세포등이 포함된다.The host cell can be transformed or transfected with the expression vector of the present invention to make a polypeptide or variant thereof consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Host cells can be eukaryotic or prokaryotic. Here, a single-cell host which can be used is Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas (Pseudonomas), Bacillus (Bacillus), Streptomyces (Streptomyces), yeast (yeast), CHO, R1.1, BW, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10, Sf9 cells and the like.
또한, 본 발명에는 서열 2의 아미노산 서열를 포함하는 정제된 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 단편을 만드는 방법도 포함된다. 이와 같은 방법은 정제될 폴리펩티드가 발현할 수 있는 조건 하에서, 본 발명의 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; 및 단세포 숙주 또는 숙주 세포의 주변 배양물 또는 양쪽으로부터 정제된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.Also included in the present invention are methods for making purified polypeptides or variants and fragments thereof comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Such a method comprises the steps of transforming or transfecting a host cell with an expression vector of the present invention under conditions in which the polypeptide to be purified can be expressed; And recovering the purified polypeptide from a single cell host or from surrounding cultures or both of the host cells.
또한, 본 발명에는 GAVE19 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 분석도 포함된다. 이와 같은 화합물은 GAVE19의 효능제, 길항제 또는 역 효능제가 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 내생 리간드 존재하에서 GAVE19를 발현시키는 세포와 잠재적인 효능제를 접촉시키는 단계; 및, GAVE19 의 시그날 전달 활성이 잠재적인 효능제가 없는 상태에서의 GAVE19 시그날 전달 활성과 비교하였을 때, 잠재적인 효능제가 존재하는 상태에서 GAVE19 시그날 전달 활성이 증가되었는지를 결정하는 단계를 포함하는 GAVE19의 효능제를 확인하는 방법도 포함된다.The present invention also includes assays for identifying compounds capable of modulating GAVE19 activity. Such compounds may be agonists, antagonists or inverse agonists of GAVE19. Accordingly, the present invention provides a method of contacting a cell expressing GAVE19 with a potential agonist in the presence of an endogenous ligand; And determining whether the GAVE19 signal transduction activity was increased in the presence of the potential agonist when the signal transduction activity of GAVE19 was compared to the GAVE19 signal transduction activity in the absence of a potential agonist. A method of identifying the agent is also included.
유사하게, 본 발명에는 GAVE19의 역 효능제를 확인하는 방법도 포함된다. 이와 같은 방법은 GAVE19를 발현하는 세포를 잠재적인 역 효능제와 접촉시키는 단계, 잠재적인 역 효능제, 내생 리간드 또는 효능제가 있을 경우에, GAVE19의 시그날 전달 활성이 내생 리간드 또는 효능제는 있으나, 잠재적인 역 효능제가 없는 조건에서의 GAVE19 시그날 전달 활성과 비교하여 감소되었는지 여부와, 내생 리간드 또는 효능제 존재하에서 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함한다.Similarly, the invention also includes methods for identifying inverse agonists of GAVE19. Such a method involves contacting a cell expressing GAVE19 with a potential inverse agonist, where there is a potential inverse agonist, endogenous ligand or agonist, whereby the signal transduction activity of GAVE19 is present in the endogenous ligand or agonist, Determining whether it was reduced compared to GAVE19 signal transduction activity in the absence of an agonist and in the presence of an endogenous ligand or agonist.
자연적으로, 본 발명은 GAVE19의 길항제를 확인하는 방법도 포함된다. 이 방법은 GAVE19를 발현하는 세포를 잠재적인 길항제와 접촉시키는 단계, 및 내생 리간드 또는 효능제가 있을 경우 GAVE19의 시그날 전달 활성과 비교하여, 잠재적인 길항제 존재하에 GAVE19 시그날 전달 활성이 감소되었는지를 결정하는 단계를 포함한다.Naturally, the present invention also includes methods for identifying antagonists of GAVE19. The method comprises the steps of contacting a cell expressing GAVE19 with a potential antagonist and determining if the GAVE19 signal transduction activity was reduced in the presence of the potential antagonist, compared to the signal transduction activity of GAVE19 in the presence of an endogenous ligand or agonist. It includes.
따라서, 본 발명의 목적은 GAVE19 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an isolated nucleic acid sequence encoding a GAVE19 protein, fragment thereof or variant thereof.
서열 1의 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자의 변이체 또는 엄격한 조건하에서 서열 1에 하이브리드화 할 수 있는 DNA 분자를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a variant of the nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or a DNA molecule capable of hybridizing to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
본 발명에서는 GAVE19의 아미노산 서열과 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체의 아미노산 서열을 제공한다.The present invention provides the amino acid sequence of GAVE19 and amino acid sequences of variants, fragments, analogs or derivatives thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 GAVE19, 이의 변이체, 단편 또는 유도체 및 유사체를 암호화하는 DNA 서열로 구성된 발현 벡터를 제공하는 것으로 이때, DNA 서열은 발현 조절 요소와 작동 가능하도록 연합되어 있다.Another object of the present invention is to provide an expression vector consisting of DNA sequences encoding GAVE19, variants, fragments or derivatives thereof and analogues, wherein the DNA sequences are operably associated with expression control elements.
본 발명의 또 다른 목적은 GAVE19, 이의 변이체, 단편 또는 유도체 및 유사체를 면역원으로 하는 항체를 제공한다.Another object of the present invention is to provide an antibody comprising GAVE19, variants, fragments or derivatives thereof and analogs as immunogens.
또한 본 발명에서는 GAVE19 단백질 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이와 같은 조절물질은 GAVE19의 길항제, GAVE19의 효능제 또는 GAVE19의 역 효능제가 될 수 있다. 또한, 마우스에서 GAVE19의 발현 또는 활성을 조절하는 화합물들은 각종 염증 질환, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환 등의 다혈증 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.The present invention also provides a method for identifying a compound capable of modulating GAVE19 protein activity. Such modulators may be antagonists of GAVE19, agonists of GAVE19 or inverse agonists of GAVE19. In addition, compounds that modulate the expression or activity of GAVE19 in mice can treat polycytic diseases or disorders such as various inflammatory diseases, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), rheumatoid arthritis and many other diseases.
본 발명의 언급된 목적 및 다른 여러 가지 측면들은 첨부 도면과 상세한 설명을 참고로 하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.The stated objects and other various aspects of the invention will be better understood with reference to the accompanying drawings and detailed description.
발명의 분야Field of invention
본 발명은 지금까지 알려지지 않은 G 단백질 결합된 수용체인 GAVE19를 암호화하는 신규 핵산 분자와 이러한 핵산 분자 및 GAVE19의 용도와 관련된 발명이다.The present invention relates to novel nucleic acid molecules encoding GAVE19, a G protein coupled receptor so far unknown, and the use of such nucleic acid molecules and GAVE19.
도 1: GAVE19을 암호화하는 DNA 서열(서열 1)Figure 1: DNA sequence encoding GAVE19 (SEQ ID NO: 1)
도 2: GAVE19의 아미노산 서열(서열 2)Figure 2: Amino acid sequence of GAVE19 (SEQ ID NO: 2)
도 3: MPD1.1.2 상의 GAVE19 발현 프로필Figure 3: GAVE19 expression profile on MPD1.1.2
도 4: GAVE19(서열 2)의 아미노산 서열과 사람 정형체(ortholog) GAVE18(서열 7)의 비교4: Comparison of amino acid sequence of GAVE19 (SEQ ID NO: 2) and human ortholog GAVE18 (SEQ ID NO: 7)
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명은 GAVE19라고 칭한 미지의 G 단백질-결합된 수용체를 암호화하는 지금까지 공지되지 않은 쥐의 핵산 분자를 놀랍고도 예상치 않게 발견한 것에 기초한다. 특히, GAVE19가 신장, 간, 소장과 같은 면역 조직 또는 기관에서 발현된다는 것을 알아내었다. 또한, GAVE19는 천식, 류마티스 관절염, COPD등과 같은 다양한 염증질환을 치료하기 위한 약학 조성물 개발에 표적으로 용이하게 사용될 수 있다.As described above, the present invention is based on the surprising and unexpected discovery of a mouse nucleic acid molecule so far unknown to encode an unknown G protein-bound receptor called GAVE19. In particular, it has been found that GAVE19 is expressed in immune tissues or organs such as kidney, liver and small intestine. In addition, GAVE19 can be easily used as a target in the development of pharmaceutical compositions for treating various inflammatory diseases such as asthma, rheumatoid arthritis, COPD and the like.
본 발명을 설명하는 명세서 및 특허 청구범위를 통하여 사용된 다양한 용어들은 다음에서 정의하는 바와 같다.Various terms used throughout the specification and claims describing the present invention are as defined below.
여기에서 사용된 바와 같이, “조절물질(modulator)”이란 GAVE19 활성을 조절할 수 있는 잔기(리간드, 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)를 말한다. 본 발명의 조절물질은 GAVE19의 길항제, GAVE19의 효능제, 부분 효능제 또는 GAVE19의 역 효능제가 될 수 있다.As used herein, “modulator” refers to residues (including but not limited to ligands, candidate compounds) that can modulate GAVE19 activity. Modulators of the invention may be antagonists of GAVE19, agonists of GAVE19, partial agonists or inverse agonists of GAVE19.
여기에서 언급되는 “효능제”이란 수용체에 결합되었을 때 세포내 반응을 활성화 시키는 또는 막에 GTP결합을 강화시키는 잔기(리간드 또는 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다)를 의미한다.As used herein, “agonist” refers to a moiety that can activate, but is not limited to, a ligand or a candidate compound that activates an intracellular response or enhances GTP binding to a membrane when bound to a receptor.
여기에서 언급되는 “부분 효능제”는 수용체에 결합되었을 때, 효능제에 의해 유도되는 것보다는 다소 적은 정도로 세포 반응을 유도하거나 효능제에 의해 유도되는 것보다는 다소 작은 정도로 GTP가 막에 결합되도록 강화시키는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않음)를 의미한다.The “partial agonist” referred to herein, when bound to a receptor, induces a cellular response to a lesser extent than induced by an agonist or enhances GTP to bind to a membrane to a lesser extent than induced by an agonist. Means residues (eg, but are not limited to, ligands and candidate compounds).
여기에서 언급되는 “길항제”란 효능제가 수용체에 결합하는 동일한 부위에 수용체와 경쟁적으로 결합하는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않음)를 의미한다. 그러나, 길항제는 수용체가 활성화 상태가 됨으로써 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지는 않으며, 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포 반응을 저해할 수 있다. 관련 측면에서, 길항제는 효능제 또는 부분 효능제 없이도 기저수준의 세포 내 반응을 감소시키지는 않는다As used herein, “antagonist” means a moiety that competitively binds the receptor at the same site that the agonist binds to the receptor (eg, but may not be limited to, ligands and candidate compounds). However, antagonists do not activate the intracellular response initiated by the receptor becoming active and may inhibit cellular responses by agonists or partial agonists. In a related aspect, antagonists do not reduce baseline intracellular responses without agonists or partial agonists.
여기에서 언급되는 “역 효능제”란 구성 활성 수용체에 결합하여 기저 세포 반응을 저해하는 잔기(예를 들면, 리간드 및 후보 화합물이 될 수 있으나 이에 국한되지는 않음)를 말한다. 기저 반응은 효능제 또는 부분 효능제없이 관찰되는 정상적인 기저 활성 수준 이하에서 활성 수용체에 의해 개시되거나 막에 GTP 가 결합되는 것을 감소시킨다.As used herein, “inverse agonist” refers to a moiety that binds to constitutively active receptors and inhibits basal cell responses (eg, but may not be limited to, ligands and candidate compounds). Basal responses reduce the initiation of GTP to the membrane by the active receptor or below normal basal activity levels observed without agonists or partial agonists.
여기에서 언급되는 “후보 화합물”이란 선별 기술에 사용할 수 있는 잔기(가령, 화학적 화합물이 될 수 있으나 이에 국한되지는 않음)을 의미한다. 한 구체예에서, GAVE19의 효능제, 부분 효능제, 역 효능제, 길항제로 구성된 군에서 선택될 수 있는 공지된 화합물은 포함되지 않는다. 수용체에 특이적인 내생 리간드를 확인하고/하거나 수용체에 대항하는 후보 물질을 스크리닝하는 것(이때, 스크리닝은 효과를 평가하기 위해 경쟁 분석을 해야 한다)과 연관된 전통적인 약물 발견 공정을 이용하여 이와 같은 화합물을 확인할 수 있다.As used herein, “candidate compound” means a moiety that may be used in the selection technique, such as but not limited to a chemical compound. In one embodiment, known compounds that may be selected from the group consisting of agonists, partial agonists, inverse agonists, antagonists of GAVE19 are not included. Such compounds may be employed using conventional drug discovery processes associated with identifying endogenous ligands specific for receptors and / or screening candidates against the receptors, where screening must be competitively assayed to assess effectiveness. You can check it.
여기에서 언급되는 “구성적으로 활성화된 수용체” 또는 “자가 활성화되는 수용체”란 리간드 없이 활성화될 수 있는 수용체를 의미하며, 이 두 가지 용어는 상호 교환적으로 이용할 수 있다. 이와 같은 구성적으로 활성화된 수용체는 내생 (가령, GAVE19) 또는 비내생적인 것이 예를 들면, 재조합 기술을 이용하여 GPCR를 변형시켜 야생형 GPCR의 돌연변이형을 만들 수도 있다.(참고 EP 1071701; WO 00/22129; WO 00/22131; 미국 특허 제6,150,393호; 미국 특허 제6,140,509호 참고문헌으로 첨부됨).As used herein, “constitutively activated receptor” or “self-activated receptor” refers to a receptor that can be activated without a ligand, and both terms are used interchangeably. Such constitutively activated receptors may be endogenous (eg, GAVE19) or non-endogenous, for example using recombinant techniques to modify the GPCRs to create mutants of wild type GPCRs (see EP 1071701; WO 00). / 22129; WO 00/22131; US Pat. No. 6,150,393; US Pat. No. 6,140,509, incorporated by reference).
여기에서 언급되는 “구성적 수용체 활성화”란 수용체에 내생 리간드 또는 이의 화학적 등가체의 결합 이외의 방법으로 활성 상태의 수용체를 안정화시킨다는 것을 의미하는 것이다.As used herein, “constitutive receptor activation” means stabilizing an active receptor by a method other than the binding of an endogenous ligand or its chemical equivalent to the receptor.
여기에서 언급되는 “리간드”란 다른 분자에 결합하는 잔기를 말하며, 이러한 잔기는 호르몬 또는 신경 전달 물질 등이 될 수 있으나, 이에 국한되지는 않으며, 또한 이 잔기는 입체 선택적으로 수용체에 결합된다.As used herein, “ligand” refers to a moiety that binds to another molecule, which may be, but is not limited to, a hormone or a neurotransmitter, and the like, and the moiety is stereoselectively bound to a receptor.
본 발명의 핵산 분자 또는 단백질을 언급할 때, 사용한 “군(family)”이란 외양적으로 공통의 구조적 도메인을 가지고, 여기에서 정의하고 있는 충분한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열과 충분한 상동성을 가지는 두 가지 이상의 단백질 및 핵산 분자를 말하는 것이다. 동일한 또는 상이한 종에서 이와 같은 군은 자연적으로 발생할 수 있다. 예를 들면, 사람에서 기인된 제1 단백질과 쥐에서 기인된 동일한 상동성을 가지는 단백질이 포함될 뿐만 아니라 사람에서 기인된 다른 별개의 제2 단백질 및 쥐에서 기인된 동일한 별개의 제2 단백질도 포함될 수 있다. 일 군의 구성원들은 공통의 기능적 특징을 가질 수 있다.When referring to a nucleic acid molecule or protein of the invention, the “family” used refers to two or more proteins having an apparently common structural domain and having sufficient homology with the sufficient amino acid and nucleotide sequences defined herein. And nucleic acid molecules. Such groups may occur naturally in the same or different species. For example, a first protein derived from human and a homologous protein derived from rat may be included, as well as another separate second protein derived from human and the same distinct second protein derived from rat. have. Members of a group may have common functional characteristics.
여기에서 상호 교환적으로 언급하는 것과 같이, “GAVE19 활성,” “GAVE19의 생물학적 활성” 또는 “GAVE19의 기능적 활성”이란 용어는 표준 기술에 따라, 생체내(in vivo)또는 시험관내(in vitro)에서 측정하였을 때, GAVE19 반응성 세포상에 GAVE19 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 나타나는 활성을 말하는 것이다. GAVE19 활성은 제2 단백질상의 효소 활성 또는 그와 연합하는 방식으로 직접적으로 활성을 가질 수도 있고, 제 2 단백질과 GAVE19 단백질의 상호작용에 의해 중개되는 세포 시그날 전달 활성과 같은 간접적인 활성을 가질 수도 있다. 적절한 구체예에서, GAVE19 활성은 i) GAVE19 시그날 전달 과정 상에 단백질과 상호 작용할 수 있는 능력; ii) GAVE19 리간드와 상호작용할 수 있는 능력; 및 iii) 세포내 표적 단백질과 상호작용할 수 있는 능력중 어느 한 가지 이상의 활성을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.As it mentioned herein interchangeably, "GAVE19 activity,""biological activity of GAVE19" or "functional activity of GAVE19" term, in vivo (in vivo) or in vitro (in vitro) according to standard techniques As measured by, it refers to the activity exhibited by a GAVE19 protein, polypeptide or nucleic acid molecule on a GAVE19 reactive cell. GAVE19 activity may be directly active in enzymatic activity on or associated with the second protein, or indirectly such as cell signal transduction activity mediated by the interaction of the GAVE19 protein with the second protein. . In a suitable embodiment, GAVE19 activity is i) the ability to interact with a protein on the GAVE19 signal transduction process; ii) the ability to interact with GAVE19 ligands; And iii) activity of any one or more of the ability to interact with intracellular target proteins.
또한, 본 발명에 따라, 당분야내에 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있고, 이와 같은 기술들은 다음의 문헌에서 상세하게 기재되어 있다. Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (이하 "Sambrook 등., 1989"으로 칭함);DNA Cloning: A Practical Approach,Volume I 및II (D.N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];Transcription and Translation[B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)];Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)];Immobilized Cells and Enzymes[IRL Press, (1986)]; B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel 등. (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).In addition, according to the present invention, conventional molecular biology, microbiology, recombinant DNA techniques can be used in the art, such techniques are described in detail in the following documents. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hereinafter referred to as "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volume I and II (DN Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [BD Hames & SJ Higgins eds. (1985); Transcription and Translation [BD Hames & SJ Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture [RI Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); FM Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc. (1994).
다음의 용어는 하기에서 정의된 의미로 사용되었다.The following terms are used with the meanings defined below.
"벡터"는 다른 DNA 단편을 이에 부착시켜, 부착된 단편을 복제할 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 리플리콘(replicon)등을 말하나 이에 국한시키지는 않는다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제를 자체적으로 할 수 있는 임의 유전 물질(가령, 플라스미드, 염색체, 바이러스)로써, 자체적 단위로 조절하면서 복제할 수 있는 능력이 있다. 벡터의 특정 예는 하기에서 설명한다A "vector" refers to, but is not limited to, a replicon such as a plasmid, phage, or cosmid capable of attaching another DNA fragment to it to replicate the attached fragment. "Replicon" is any genetic material (eg, plasmid, chromosome, virus) that can replicate DNA in vivo, and has the ability to replicate while controlling in its own units. Specific examples of vectors are described below.
"카세트(cassette)"는 벡터내 특정 제한 부위로 삽입될 수 있는 DNA 단편을 말하는 것이다. DNA 단편에는 관심 대상이 되는 폴리펩티드가 암호화되어 있고,전사 및 해독을 위한 적절한 판독 프레임내에 카세트 및 제한 효소 부위가 삽입될 수 있도록 고안한다."Cassette" refers to a DNA fragment that can be inserted into a specific restriction site in a vector. DNA fragments encode polypeptides of interest and are designed to allow insertion of cassettes and restriction enzyme sites into appropriate reading frames for transcription and translation.
이와 같은 관심 대상 DNA 가 세포내로 유입될 때, 외생 또는 이종성 DNA 에 의해 세포가 “형질감염”되었다고 한다. 형질감염된 DNA가 표현형 변화에 영향을 주는 경우에는 외생 또는 이종성 DNA에 의해 세포가 “형질전환”되었다고 한다. 적절하게는 형질전환된 DNA가 염색체 DNA에 결합되어(공유적으로 연결), 세포의 게놈으로 구성될 수도 있다.When such DNA of interest enters a cell, the cell is said to be “transfected” by exogenous or heterologous DNA. When transfected DNA affects phenotypic changes, cells are "transformed" by exogenous or heterologous DNA. Suitably, the transformed DNA may be linked (covalently linked) to the chromosomal DNA to constitute the genome of the cell.
"이종성" DNA라는 것은 세포내에 또는 세포의 염색체 내에 자연적으로 존재하지 않는 것을 말한다. 적절하게는 이종성 DNA에는 세포에 대해 외부 물질이 되는 유전자가 포함된다.By "heterologous" DNA is meant that is not naturally present in the cell or in the chromosome of the cell. Suitably, heterologous DNA contains genes that are foreign to the cell.
“상동성 재조합”은 염색체 내에서 벡터의 외부 DNA 서열을 삽입하는 것을 말한다. 특히, 벡터는 상동성 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정 상동성 재조합의 경우에, 벡터에는 염색체 서열에 상동성인 충분한 길이를 가진 부분이 있어, 염색체내로 상보적인 결합 및 혼입이 허용될 수 있다. 더 긴 상동성 부분과 서열 상동성이 더 큰 경우에, 상동성 재조합 효능이 증대될 수 있다.“Homologous recombination” refers to the insertion of the external DNA sequence of a vector within a chromosome. In particular, the vector targets specific chromosomal sites for homologous recombination. In the case of certain homologous recombination, the vector has a portion of sufficient length that is homologous to the chromosomal sequence, allowing complementary binding and incorporation into the chromosome. In the case of greater sequence homology with longer homologous moieties, homologous recombination efficacy can be enhanced.
본 발명의 분리된 핵산 분자Isolated Nucleic Acid Molecules of the Invention
한 구체예에서, 본 발명에는 도1의 DNA 서열(서열 1)로 구성된 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 유사체 또는 유도체까지 포함된다.In one embodiment, the invention includes isolated nucleic acid molecules, variants thereof, fragments, analogs or derivatives consisting of the DNA sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
“핵산 분자” 는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘: “RNA 분자”) 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 데옥시시티딘: “DNA 분자”)의 포스페이트 에스테르 고분자형 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 임의 포스포에스테르 유사체로 된 일본쇄 또는 이본쇄 나선형을 말한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 나선형도 가능하다. 핵산 분자, 특히, DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조를 말하는 것이나, 임의 특정 3차 형에도 한정시키지는 않는다. 따라서, 핵산 분자 용어에는 선형 또는 원형 DNA 분자내에서 발견되는 이본쇄 DNA(가령, 제한효소 처리된 단편), 플라스미드, 염색체 등도 포함된다. 특정 이본쇄 DNA 분자 구조를 논의함에 있어서, DNA의 전사안된 쇄(mRNA에 상동성인 서열을 가지는 쇄)와 함께 5’에서 3’방향으로 서열이 통상적 협약에 따라 제공된다고 보면 된다. “재조합 DNA 분자"는 생물학적으로 조작된 DNA 분자를 말한다.“Nucleic acid molecule” refers to ribonucleosides (adenosine, guanosine, uridine, cytidine: “RNA molecules”) or deoxyribonucleosides (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine, deoxy Cytidine: “DNA molecule”) refers to a single or double-stranded helical chain of phosphate ester polymers or any phosphoester analogues such as phosphorothioates and thioesters. Double-stranded DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA spirals are also possible. Nucleic acid molecules, particularly DNA or RNA molecules, refer to the primary and secondary structures of the molecule, but are not limited to any particular tertiary type. Thus, nucleic acid molecular terms also include double stranded DNA (eg, restriction enzyme treated fragments), plasmids, chromosomes and the like found within linear or circular DNA molecules. In discussing a particular double-stranded DNA molecular structure, it is assumed that the sequences are provided according to conventional conventions in the 5 'to 3' direction along with the untranscribed chain of DNA (a chain having sequences homologous to the mRNA). "Recombinant DNA molecule" refers to a biologically engineered DNA molecule.
“분리된” 핵산이란 천연 핵산 원료에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 것을 말하는 것이다. 특히, “분리된” 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에 있는 GAVE19를 암호화하는 핵산에 자연적으로 인접한 서열(예를 들면, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없는 것을 말한다. 다양한 구체예에서, 분리된 GAVE19 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA 에 있는 핵산 분자에 자연적으로 인접한 뉴클레오티드 서열의 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb보다 적을 수 있다. 또한, 분리된 핵산 분자 예를 들면, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 세포내 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 포함하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우, 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 의미한다.An “isolated” nucleic acid is one that is separated from other nucleic acid molecules present in a natural nucleic acid source. In particular, “isolated” nucleic acid refers to the absence of a sequence naturally adjacent to a nucleic acid encoding GAVE19 in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (eg, sequences located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid). In various embodiments, the isolated GAVE19 nucleic acid molecule is about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 of the nucleotide sequence naturally adjacent to the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived. It may be less than kb. In addition, an isolated nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, is substantially free of intracellular material or culture medium when produced by recombinant technology, or substantially free of chemical precursors or other chemicals if chemically synthesized. It means not to.
본 발명의 핵산 분자 예를 들면, 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자 또는 이들 뉴클레오티드 핵산 서열의 단편 또는 상보체 또는 유사체 및 유도체를 표준 분자 생물학 기술 또는 여기에서 제공하는 서열 정보를 이용하여 분리해 낼 수 있다. 하이브리드화 반응의 프로브로써 서열 1의 핵산 서열의 일부 또는 전부를 이용하여, 표준 하이브리드화 반응 및 클로닝 기술(Sambrook 등.,에서 설명하는 것과 같이)을 이용하고, GAVE19 핵산 분자를 분리해낼 수 있다.Nucleic acid molecules of the invention, for example, nucleic acid molecules having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or fragments or complements or analogs and derivatives of these nucleotide nucleic acid sequences can be isolated using standard molecular biology techniques or the sequence information provided herein. Can be. Some or all of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a probe for the hybridization reaction may be used to isolate GAVE19 nucleic acid molecules using standard hybridization reactions and cloning techniques (as described in Sambrook et al., Et al.).
표준 PCR 증폭 기술에 따라, 주형으로 cDNA, mRNA, 게놈DNA를 이용하고, 적절한 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 본 발명의 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 이와 같은 프라이머는 서열 1의 정보를 이용하고, 통상적인 실험실에서 이용하는 기술을 사용하여 용이하게 만들 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터 내에 클로닝시키고, DNA 서열 분석을 통하여, 특징을 조사할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 등과 같은 표준 합성 기술을 이용하여 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 만들 수도 있다.According to standard PCR amplification techniques, nucleic acid molecules of the present invention can be amplified using cDNA, mRNA, genomic DNA as a template and appropriate oligonucleotide primers. Such primers can be readily made using the information of SEQ ID NO: 1 and using techniques used in conventional laboratories. The nucleic acid thus amplified can be cloned into an appropriate vector and characterized by DNA sequence analysis. Oligonucleotides corresponding to the GAVE19 nucleotide sequence may also be made using standard synthetic techniques, such as using an automated DNA synthesizer.
GAVE19 DNA에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 분자Isolated nucleic acid molecules that can hybridize to GAVE19 DNA
본 발명에는 GAVE19 DNA에 하이브리드화 할 수 있거나; 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 GAVE19 DNA에 상보적인 하이브리드화 프로브에 하이브리드화 할 수 있거나; 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 상기 모두에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산 분자가 포함된다. 특히, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에서 서열 1의 DNA 서열로 구성된 핵산 분자 또는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자에 상보적인 프로브에 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산이 포함된다The present invention can hybridize to GAVE19 DNA; Hybridize to hybridization probes complementary to GAVE19 DNA under stringent hybridization conditions; Included are isolated nucleic acid molecules capable of hybridizing to all of these under stringent hybridization conditions. In particular, the present invention includes an isolated nucleic acid capable of hybridizing to a probe complementary to a nucleic acid molecule consisting of a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or an isolated nucleic acid molecule consisting of a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent hybridization conditions.
온도 및 용액 이온 강도(Sambrook 등.,상기 참조)와 같은 적절한 조건하에서 일본쇄 핵산 분자가 다른 핵산 분자 즉, cDNA, 게놈 DNA, RNA와 같은 다른 핵산 분자에 어닐링될 수 있는 경우에, 이 핵산 분자는 “하이브리드화 할 수” 있다고 한다. 온도 및 이온 강도가 하이브리드화 반응의 “엄격성"(stringency)을 결정한다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝을 위해, Tm이 55 C와 같은 엄격성이 낮은 하이브리드화 반응 조건을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 포름아미드 없음; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS가 낮은 엄격성 조건이다. Tm이 더 높은 경우에는 중간 정도의 엄격성을 가지는 하이브리드화 반응으로, 예를 들면, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 사용한다. 최고의 Tm을 이용하는 경우에 매우 엄격한 하이브리드화 조건이라고 하고, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 이용한다. 하이브리드화 반응은 하이브리드화 반응의 엄격성 조건에 따라 달라지긴 하지만, 두 핵산에 상보적인 서열이 있어야 하나, 염기 간에 미스매치(mismatches)도 가능하다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적절한 엄격성 정도는 핵산 길이, 상보성 정도 및 당분야에 공지된 변수들에 따라 달라진다. 두 뉴클레오티드 서열간에 유사성 또는 상보성 정도가 클수록, 이들 서열로 구성된 핵산의 하이브르드를 위한 Tm 값이 커진다. 핵산의 하이브리드화에 대한 상대적인 안정성(더 높은 Tm에 상응하는)은 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA 순으로 감소된다. 길이가 100이상의 뉴클레오티드의 하이브리드화 경우에, Tm 을 계산하는 계산식이 유도되어 있다(Sambrook 등.,상기 참조, 9.50-0.51). 더 짧은 핵산의 하이브리드화 경우, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 경우에, 미스매치 위치가 더 중요하고, 올리고뉴클레오티드 길이가 그의 특이성을 결정짓게 된다(Sambrook 등.,상기 참조, 11.7-11.8). 하이브리드화 가능한 핵산 분자의 길이는 최소 적어도 20개 뉴클레오티드 정도는 되어야 하고, 특히, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드, 또 50개 뉴클레오티드 이상도 가능하며, 60개 정도의 뉴클레오티드도 가능하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 하이브리드화 가능한 핵산 분자는 길이가 적어도 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100개 뉴클레오티드이고, 서열 1의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 암호화 서열 또는 이의 상보체 또는 이의 단편으로 구성된 핵산 분자에 엄격한 조건하 에서 하이브리드화 할 수 있다.Under appropriate conditions, such as temperature and solution ionic strength (Sambrook et al., Supra), the nucleic acid molecule can be annealed to other nucleic acid molecules such as other nucleic acid molecules such as cDNA, genomic DNA, RNA Is “hybridized”. Temperature and ionic strength determine the “stringency” of the hybridization reaction.For preliminary screening of homologous nucleic acids, low stringency hybridization reaction conditions, such as 55 C, can be used, for example For example, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk, no formamide; or 30% formamide, 5x SSC, 0.5% SDS is a low stringency condition. For example, 40% formamide, 5x or 6x SSC is used for the reaction, which is referred to as very stringent hybridization conditions when using the highest Tm, for example 50% formamide, 5x or 6x SSC. Although hybridization reactions depend on the stringency conditions of the hybridization reaction, there must be complementary sequences between the two nucleic acids, but mismatches between bases are possible. One suitable degree of stringency depends on the length of the nucleic acid, the degree of complementarity and variables known in the art The greater the degree of similarity or complementarity between two nucleotide sequences, the greater the Tm value for the hybrid of the nucleic acid consisting of these sequences. Relative stability to hybridization of (corresponding to higher Tm) decreases in the order RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA In the case of hybridization of 100 or more nucleotides in length, a calculation to calculate Tm is derived. are summed (Sambrook et al., see above, 9.50 to 0.51) if the hybridization of shorter nucleic acids, for example, the oligonucleotides in the case of nucleotides, and the mismatch position is more important, nucleotides in length determining its specificity is (Sambrook et al., see above, 11.7 to 11.8). the length of the hybridized nucleic acid molecules are to be at least 20 nucleotides at least And, in particular, at least about 30 nucleotides, more preferably at least 40 nucleotides, and even more than 50 nucleotides, as well as about 60 nucleotides. In certain embodiments, hybridizable nucleic acid molecules of the invention have at least 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100 nucleotides in length And nucleic acid molecules composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, preferably the coding sequence or the complement or fragment thereof, under hybridization conditions.
여기에서 사용된 것과 같이, “엄격한 조건하에서 하이브리드화”는, 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 적어도 55%, 60%, 65%, 70% 바람직하게는 75% 또는 그 이상이 하이브리드화 반응 및 세척시에 하이브리드화된 상태로 유지되는 조건을 말하는 것이다. 이와 같은 엄격한 조건은 당업자에게 잘 알려진 것으로, 문헌[참조:“Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.]를 참고할 수 있다. 엄격한 조건의 적절한 예는 6X 염화나트/구연산 나트륨(SSC)에서 45℃상에서 하이브리드화 시킨 후에, 50-65℃ 에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에 1~2회 세척하는 것이나, 이에 국한시키지는 않는다. 엄격한 조건하에서 서열 1의 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 여기에서 사용된 것과 같이, “자연발생적인” 핵산 분자는 자연에서 생성 되는 뉴클레오티드 서열(자연 단백질을암호화하는)을 가지는 RNA 또는 DNA 분자를 말한다. 당업자는 서열특이적 변수(가령, 길이, G-C 함량 등)를 고려하여, 조건을 수정할 수도 있다.As used herein, “hybridization under stringent conditions” means that at least 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75% or more of the nucleotide sequences complementary to each other are subjected to hybridization reactions and washes. It is a condition that remains hybridized. Such stringent conditions are well known to those skilled in the art and are described in “Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Suitable examples of stringent conditions include, but are not limited to, hybridization at 45 ° C. in 6X sodium chloride / sodium citrate (SSC), followed by one or two washes in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 50-65 ° C. An isolated nucleic acid molecule of the invention that hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 1 or its complement under stringent conditions corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule. As used herein, a "naturally occurring" nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule having a naturally occurring nucleotide sequence (which encodes a natural protein). One skilled in the art may modify the conditions in view of sequence specific variables (eg, length, G-C content, etc.).
본 발명은 유사한 성질을 가지는 GAVE19유사 분자 진단에 GAVE19 핵산 단편을 포함한다. 진단학적 단편은 인접 서열을 포함하는 GAVE19 유전자의 일부에서 생성될 수도 있다. 단편은 공지 방법을 사용하는 라이브러리(library) 프로브로 이용할 수 있다.The present invention includes GAVE19 nucleic acid fragments in GAVE19-like molecular diagnostics with similar properties. Diagnostic fragments may also be generated from portions of the GAVE19 gene comprising contiguous sequences. Fragments can be used as library probes using known methods.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 GAVE19를 암호화하는 핵산 서열의 일부분만으로 구성될 수도 있는데, 예를 들면, GAVE 19의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 단편 또는 프로브 또는 프라이머로 이용될 수 있는 단편을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 이와 같은 단편은 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 14를 암호화하는 부분으로 구성될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 인체의 GAVE19 유전자 클로닝으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열로 다른 세포 가령, 다른 조직에 있는 상동성 GAVE19를 확인하거나 클로닝할 뿐만 아니라 다른 포유류에 상동성 GAVE19를 확인하거나 클로닝하기 위한 프로브 및 프라이머를 만들 수 있다. 프로브/프라이머는 통상 실제 순수 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 통상적으로 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 서열 1 의 센스 또는 안티센스 서열의 또는 서열 1 의 자연 발생적 돌연변이의 센스 또는 안티센스 서열의 적어도 12개, 바람직하게는 약 25개, 좀더 바람직하게는 약50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 구성 뉴클레오티드에 하이브리드화 할 수 있는 뉴클레오티드 서열 부분으로 구성된다. 사람의 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 기초한 프로브를 이용하여 유사한또는 동일한 단백질을 암호화하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출할 수 있다.In addition, the nucleic acid molecule of the present invention may consist of only a portion of the nucleic acid sequence encoding GAVE19, for example, may include a fragment encoding a biologically active portion of GAVE 19 or a fragment that can be used as a probe or primer. have. For example, such fragments may consist of, but are not limited to, portions encoding amino acid residues 1-14 of SEQ ID NO: 2. Nucleotide sequences determined from cloning the GAVE19 gene in the human body can be used to identify or clone homologous GAVE19 in other cells, such as other tissues, as well as to create probes and primers for identifying or cloning homologous GAVE19 in other mammals. Probes / primers usually consist of actual pure oligonucleotides. Typically oligonucleotides are subjected to at least 12, preferably about 25, more preferably about 50, 75 of the sense or antisense sequence of SEQ ID NO: 1 or of the naturally occurring mutations of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. , 100, 125, 150, 175, It consists of nucleotide sequence portions that can hybridize to 200, 250, 300, 350, and 400 nucleotides. Probes based on human GAVE19 nucleotide sequences can be used to detect transcript or genomic sequences encoding similar or identical proteins.
여기에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 분리된 핵산의 “단편” 또는 “일부분”은 적어도 12개, 바람직하게는 약 25개, 좀더 바람직하게는 약 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 구성 뉴클레오티드로 구성된다. 결론적으로, 본 발명의 분리된 핵산의 “단편”은 한 두개(1개 또는 2개) 뉴클레오티드만을 말하는 것이 아니다.As used herein, the “fragment” or “part of” the isolated nucleic acid of the present invention is at least 12, preferably about 25, more preferably about 50, 75, 100, 125, 150, 175, It consists of 200, 250, 300, 350 and 400 constituent nucleotides. In conclusion, the “fragment” of an isolated nucleic acid of the present invention does not refer to only one or two (one or two) nucleotides.
유사하게, 본 발명의 “일부” 또는 “단편” 폴리펩티드는 적어도 9개의 연속 아미노산 잔기로 구성된다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 특정 예는 GAVE19 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 에피토프를 포함한다.Similarly, a “partial” or “fragment” polypeptide of the invention consists of at least nine contiguous amino acid residues. Particular examples of polypeptide fragments of the invention include epitopes to which a GAVE19 antibody or fragment thereof can bind.
GAVE19 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 서열 1의 일부분을 분리시키고, GAVE19 단백질의 암호화된 부분을 발현시키고(가령, 시험관내 재조합 발현에 의해), GAVE19 암호화된 부분의 활성을 평가하여, “생물학적으로 활성을 가지는 GAVE19 부분”을 암호화하는 핵산 단편을 만들 수 있다. 본 발명은 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 서열 1의 뉴클레오티드 서열과는 상이하나, 서열 1에 나타난 핵산 서열에 의해 암호화되는 동일한 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.A portion of SEQ ID NO: 1 encoding a polypeptide having a GAVE19 biological activity is isolated, an encoded portion of the GAVE19 protein is expressed (eg, by in vitro recombinant expression), and the activity of the GAVE19 encoded portion is assessed to “biologically. Nucleic acid fragments encoding “active GAVE19 moiety” can be made. The present invention includes nucleic acid molecules encoding the same GAVE19 protein, which, due to the degeneracy of the genetic code, differs from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 but is encoded by the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
상동성 핵산 분자Homologous Nucleic Acid Molecules
본 발명에는 GAVE19 DNA 분자에 상동성인 분리된 핵산 분자가 포함되는데, 예를 들면, 서열 1의 DNA 서열을 가지는 분리된 핵산 분자에 상동성인 핵산 분자를 말한다. 두개 DNA 서열이 한정된 길이 범위의 DNA 서열에서 뉴클레오티드의 적어도50%(적절하게는 75%, 좀더 바람직하게는 약 90% 또는 95%가 일치되는 경우에, 두 DNA 서열은 “실질적으로 상동성이 있다” 또는 “실질적으로 유사”하다고 한다. 디폴트 변수를 사용한 서열 데이터 뱅크에서 구한 표준 소프트 웨어를 이용하여, 서열을 비교하거나 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 하이브리드화 반응 실험에서 이용할 수 있는 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교함으로써 실질적으로 상동성 서열을 확인할 수 있다. 적절한 하이브리드화 반응 조건은 당업자가 아는 범위에서 한정시킬 수 있다(Maniatis 등.,상기 참조; DNA Cloning, Vols. I & II,상기 참조; Nucleic Acid Hybridization,상기 참조.) 또한, 사람의 GAVE19와 상이한 뉴클레오티드 서열과 다른 종(GAVE19 상동체)에서 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 분자도 본 발명의 범위에 속한다.The present invention includes an isolated nucleic acid molecule homologous to a GAVE19 DNA molecule, for example, refers to a nucleic acid molecule homologous to an isolated nucleic acid molecule having a DNA sequence of SEQ ID NO: 1. If two DNA sequences match at least 50% (appropriately 75%, more preferably about 90% or 95%) of nucleotides in a DNA sequence in a defined length range, the two DNA sequences are “substantially homologous”. ”Or“ substantially similar. ”Using standard software from the sequence data bank using default variables, Southern hybridization reaction experiments can be used to compare sequences or under stringent conditions as defined for a particular system. there can substantially determine the homology of sequences by using a standard software that can be used compares the sequence appropriate hybridization reaction conditions may be limited in the scope those skilled in the art know (Maniatis et al., see above;. DNA Cloning, Vols. I & II, supra ; Nucleic Acid Hybridization, supra .) Also, the nucleotide sequence differs from human GAVE19. Nucleic acid molecules encoding GAVE19 protein in heat and other species (GAVE19 homologues) are also within the scope of the present invention.
본 발명의 분리된 핵산 분자 변이체Isolated Nucleic Acid Molecule Variants of the Invention
본 발명에는 서열 1의 DNA 서열로 구성된 분리된 핵산 분자 변이체까지 포함된다. 이와 같은 변이체는 축퇴성, 대립형질 또는 이의 복합체가 될 수 있다.The present invention also includes an isolated nucleic acid molecule variant consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. Such variants may be degenerate, alleles or complexes thereof.
엄격한 하이브리드화 반응 조건하에서 표준 하이브리드화 반응 기술에 따라 쥐(murine)의 cDNA 또는 이의 일부를 하이브리드화 프로브로 이용하여, 여기에서 설명하고 있는 쥐의 GAVE19 핵산과의 상동성에 근거하여, 본 발명의 GAVE19 cDNA 의 상동체 및 자연 대립 형질 변이체에 상응하는 핵산 분자를 분리해낼 수 있다.The GAVE19 of the present invention is based on homology with the murine GAVE19 nucleic acid described herein using murine cDNA or a portion thereof as a hybridization probe under strict hybridization conditions under standard hybridization reaction techniques. Nucleic acid molecules corresponding to the homologs and natural allelic variants of the cDNA can be isolated.
여기에서 설명하고 있는 "상응하는"이란 의미는 정확한 위치에서 유사성 또는 상동성을 측정받는 대상 분자와 동일한지 또는 유사한지를 결정하는 경우에, 유사한 또는 상동성 서열을 의미한다. 따라서, “상응하는”은 서열의 유사성을 말하는 것이지 아미노산 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 말하는 것은 아니다.As used herein, the term “corresponding” means a similar or homologous sequence when determining whether it is the same or similar to the subject molecule to be measured for similarity or homology at the correct position. Thus, “corresponding” refers to sequence similarity, not to number of amino acids or nucleotide bases.
또한, 본 발명의 GAVE19 단백질의 유전자 코드에서 코돈의 축퇴성으로 인하여, 여러가지 형태의 분리된 핵산 분자에 의해 본 발명의 GAVE19 단백질을 암호화할 수 있다. "축퇴성”은 유전자 코드에 따라 특정 아미노산을 명시하는 세 가지 문자로된 상이한 코돈을 이용할 때 나오는 용어이다. 당업자는 각 특정 아미노산에 대한 코드로 다음의 코돈들이 상호교환적으로 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.In addition, due to the degeneracy of the codons in the genetic code of the GAVE19 protein of the present invention, the GAVE19 protein of the present invention can be encoded by various forms of isolated nucleic acid molecules. "Degenerate" is a term used when using different three-letter codons that specify specific amino acids, depending on the genetic code: Those skilled in the art will appreciate that the following codons may be used interchangeably as codes for each specific amino acid. Will recognize.
페닐알라닌(Phe 또는 F) UUU 또는 UUCPhenylalanine (Phe or F) UUU or UUC
루이신(Leu 또는 L) UUA 또는 UUG 또는 CUU 또는 CUC 또는 CUA 또는 CUGLeucine (Leu or L) UUA or UUG or CUU or CUC or CUA or CUG
이소루이신(Ile 또는 I) AUU 또는 AUC 또는 AUAIsoleucine (Ile or I) AUU or AUC or AUA
메티오닌(Met 또는 M) AUGMethionine (Met or M) AUG
발린(Val 또는 V) GUU 또는 GUC 또는 GUA 또는 GUGValine (Val or V) GUU or GUC or GUA or GUG
세린(Ser 또는 S) UCU 또는 UCC 또는 UCA 또는 UCG 또는 AGU 또는 AGCSerine (Ser or S) UCU or UCC or UCA or UCG or AGU or AGC
프롤린(Pro 또는 P) CCU 또는 CCC 또는 CCA 또는 CCGProline (Pro or P) CCU or CCC or CCA or CCG
트레오닌(Thr 또는 T) ACU 또는 ACC 또는 ACA 또는 ACGThreonine (Thr or T) ACU or ACC or ACA or ACG
알라닌(Ala 또는 A) GCU 또는 GCG 또는 GCA 또는 GCGAlanine (Ala or A) GCU or GCG or GCA or GCG
티로신(Tyr 또는 Y) UAU 또는 UACTyrosine (Tyr or Y) UAU or UAC
히스티딘(His 또는 H) CAU 또는 CACHistidine (His or H) CAU or CAC
글루타민(Gln 또는 Q) CAA 또는 CAGGlutamine (Gln or Q) CAA or CAG
아스파라진(Asn 또는 N) AAU 또는 AACAsparagine (Asn or N) AAU or AAC
리신(Lys 또는 K) AAA 또는 AAGLysine (Lys or K) AAA or AAG
아스파르트산(Asp 또는 D)GAU 또는 GACAspartic Acid (Asp or D) GAU or GAC
글루탐산(Glu 또는 E) GAA 또는 GAGGlutamic Acid (Glu or E) GAA or GAG
시스테인(Cys 또는 C) UGU 또는 UGCCysteine (Cys or C) UGU or UGC
아르기닌(Arg 또는 R) CGU 또는 CGC 또는 CGA 또는 CGG 또는 AGA 또는 AGGArginine (Arg or R) CGU or CGC or CGA or CGG or AGA or AGG
글리신(Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGGGlycine (Gly or G) GGU or GGC or GGA or GGG
트립토판(Trp 또는 W) UGGTryptophan (Trp or W) UGG
종료 코돈 UAA (ochre) 또는 UAG (amber) 또는 UGA (opal)Termination codon UAA (ochre) or UAG (amber) or UGA (opal)
상기 명기된 코돈은 RNA 서열용 코돈임을 인지할 것이다. DNA에 상응하는 코돈은 U대신에 T가 된다.It will be appreciated that the codons specified above are codons for RNA sequences. The codon corresponding to DNA is T instead of U.
서열 1에서 볼 수 있는 것과 같은 뮤린의 GAVE19 뉴클레오티드 서열에 추가하여, GAVE19 아미노산 서열에 변화를 유도할 수 있는 DNA 서열 다형성도 본 집단에 포함된다는 것을 인지할 것이다. 자연 대립형질 변이 때문에 GAVE19 유전자에 있는 그러한 유전적 다형성이 개인간에도 존재할 수 있다. 대립형질은 주어진 유전자 위치에서 대안으로 발생할 수 있는 유전자 집단중에 하나이다. 여기에서 사용된 바와 같이, “유전자” 및 “재조합 유전자”는 GAVE19 단백질 적절하게는 포유류 GAVE19 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임으로 구성된 핵산 분자를 말한다. 여기에서 사용된 바와 같이, “대립형질 변이체”는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 GAVE19 위치에서 발생할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 여러 다른 개체에서 관심 대상이 되는 유전자를 서열화시켜, 대안 대립형질을 확인할 수 있다. 하이브리드화 반응 프로브를 이용하면 다양한 개체에서 동일한 유전자 위치를 바로 확인할 수 있다. GAVE19의 기능적인 활성에 변화를 주지않으면서 자연적인 대립 형질 변이체 결과로 인한 GAVE19 에 생성된 임의 또는 모든 뉴클레오티드 변이체 및 생성된 아미노산 다형성은 본 발명의 범위에 속한다.In addition to murine's GAVE19 nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1, it will be appreciated that this sequence also includes DNA sequence polymorphisms that can induce changes in the GAVE19 amino acid sequence. Because of natural allelic variations, such genetic polymorphisms in the GAVE19 gene can also exist among individuals. An allele is one of a group of genes that can alternatively occur at a given gene location. As used herein, "gene" and "recombinant gene" refer to a nucleic acid molecule consisting of an open reading frame encoding a GAVE19 protein, preferably a mammalian GAVE19 protein. As used herein, “allelic variant” refers to a polypeptide encoded by a nucleotide sequence or a nucleotide sequence that may occur at the GAVE19 position. Alternative alleles can be identified by sequencing genes of interest in several different individuals. Hybridization probes can be used to directly identify the same gene position in various individuals. Any or all of the nucleotide variants produced in GAVE19 and the resulting amino acid polymorphisms as a result of natural allelic variants without altering the functional activity of GAVE19 are within the scope of the present invention.
또한, 본 발명의 분리된 핵산 분자 변이체는 부위 지시된 돌연변이와 같은 통상의 실험실에서 사용하는 기술을 이용하여 당업자가 바로 만들 수 있다.In addition, isolated nucleic acid molecule variants of the invention can be readily made by those skilled in the art using techniques used in conventional laboratories, such as site directed mutations.
안티센스 뉴클레오티드 서열Antisense nucleotide sequence
본 발명에는 단백질을 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 분자, 가령, 이본쇄 cDNA 분자의 암호화 쇄에 상보적인 또는 mRNA 서열에 상보적인 안티센스(antisense) 핵산 분자도 포함된다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 또는 일부 GAVE19 암호화 쇄, 가령, 단백질 암호화 부분 또는 개방 판독 프레임의 전부(또는 일부)에 상보적이 될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 GAVE19를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 쇄의 비암호화(noncoding)부분에 안티센스될 수 있다. 비암호화 부분 (“5' 및 3' 해독안된 부분”)은 아미노산으로 해독되지 않고, 암호화 부분에 인접한 5' 및 3' 서열이다.The invention also encompasses molecules complementary to sense nucleic acids encoding proteins, such as antisense nucleic acid molecules complementary to the coding strand of a double stranded cDNA molecule or complementary to the mRNA sequence. Thus, antisense nucleic acids can hydrogen bond to sense nucleic acids. Antisense nucleic acids can be complementary to all or part of a GAVE19 coding chain, such as a protein coding portion or an open reading frame. Antisense nucleic acid molecules may be antisense to the noncoding portion of the coding chain of the nucleotide sequence encoding GAVE19. Non-coding portions (“5 'and 3' untranslated portions”) are not translated into amino acids but are 5 'and 3' sequences adjacent to the coding portion.
여기에서 나타낸 GAVE19를 암호화하는 암호화 쇄 서열이 제공되면(서열 1), Watson & Crick 의 염기쌍 형성 규칙에 준하여 본 발명의 안티센스 핵산을 고안할 수도 있다. 안티센스(antisense) 핵산 분자는 GAVE19 mRNA의 전체 암호화 부분에상보적이 될 수 있으나, GAVE19 mRNA의 비암호화 또는 암호화 부분에만 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 좀더 바람직하다. 예를 들면, GAVE19 mRNA 의 해독부분 주변에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 될 수도 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 뉴클레오티드이다. 당분야에 공지된 공정을 이용하여 화학적 합성 반응 및 효소 연결 반응을 통하여 본 발명의 안티센스 핵산을 작제할 수 있다. 예를 들면, 분자의 생물학적 안정성이 증가되도록 또는 안티센스 및 센스 핵산간에 형성된 이본쇄의 물리적인 안정성을 증가시키기 위해 자연발생 또는 다양하게 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (가령, 포스포로티오에이트 유도체, 포스포네이트 유도체, 아크리딘치환된 뉴클레오티드)를 이용하여, 안티센스 핵산(예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 합성시킬 수 있다.If the coding chain sequence encoding GAVE19 shown here is provided (SEQ ID NO: 1), the antisense nucleic acid of the present invention can be designed according to Watson & Crick's base pairing rules. While antisense nucleic acid molecules may be complementary to the entire coding portion of GAVE19 mRNA, antisense oligonucleotides corresponding only to the non-coding or coding portion of GAVE19 mRNA are more preferred. For example, it may be a complementary antisense oligonucleotide around the translational portion of GAVE19 mRNA. For example, antisense oligonucleotides are about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleotides in length. Antisense nucleic acids of the present invention can be constructed using chemical synthesis reactions and enzyme linkage reactions using processes known in the art. For example, naturally occurring or various chemically modified nucleotides (eg, phosphorothioate derivatives, phosphonates) to increase the biological stability of the molecule or to increase the physical stability of the double strands formed between antisense and sense nucleic acids. Derivatives, acridine-substituted nucleotides) can be used to synthesize antisense nucleic acids (eg antisense oligonucleotides).
안티센스 핵산을 만드는데 이용할 수 있는 변형된 뉴클레오티드에는 5-플로오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, β-D-갈락토실퀴노신, 이노신, N-6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실퀴노신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 퀴에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 2,6-디아미노퓨린 등이 포함된다. 다른 방법으로는 안티센스 방향으로 핵산이 서브클론된 발현 벡터를 이용하여 생물학적으로 안티센스 핵산을 생산할 수 있다(가령, 삽입된 핵산에서 전사된 RNA는 소요의 표적 핵산에 대해 안티센스 방향이 된다).Modified nucleotides that can be used to make antisense nucleic acids include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxy Hydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D-galactosylquinosine, inosine, N-6-isopentyladenin, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N 6 -adenine, 7-methylguanine, 5-methyl Aminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-mannosylquinosine, 5-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N 6 -isopentyladenine , Uracil-5-oxyacetic acid, wibutoxosocin, pseudouracil, quiocin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thio Rasyl, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methylester, uracil-5-oxyacetic acid, 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2- Carboxypropyl) uracil, 2,6-diaminopurine and the like. Alternatively, an antisense nucleic acid can be produced biologically using an expression vector in which the nucleic acid is subcloned in the antisense direction (eg, RNA transcribed from the inserted nucleic acid is antisense to the desired target nucleic acid).
일반적으로 본 발명의 안티센스 핵산 분자를 개체에 투여하거나 자체에서 생성되도록 하여, GAVE19 단백질이 암호화되는 세포 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화되거나 결합하여 예를들면, 전사 및 해독 저해를 통하여 단백질 발현을 저해시킨다. 하이브리드화 반응은 안정적인 이중나선을 형성하기 위해 통상의 뉴클레오티드 상보성에 의한 것인데, 예를 들면, 이중 나선의 주요 홈에서 특이적인 상호작용을 통하여 DNA 이중나선에 결합하거나 또는 GAVE19의 조절 부위에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 하이브리드화 반응이 된다.In general, the antisense nucleic acid molecule of the present invention is administered to an individual or allowed to be produced in itself, thereby hybridizing or binding to the cellular mRNA or genomic DNA to which the GAVE19 protein is encoded to inhibit protein expression, for example, by inhibiting transcription and translation. . The hybridization reaction is by conventional nucleotide complementarity to form a stable double helix, for example, an antisense that binds to a DNA double helix or to a regulatory site of GAVE19 through specific interactions in the major groove of the double helix. In the case of nucleic acid molecules it is a hybridization reaction.
본 발명의 안티센스 핵산 분자 투여 경로는 조직 부위에 직접 주사하는 것이 포함된다. 또 다른 방법으로는 안티센스 핵산 분자가 선택된 세포에 표적이 되도록 변형시키고, 전신으로 투여하는 것이다. 예를 들면, 전신 투여 경우에, 안티센스 분자를 변형시켜, 선택된 세포 표면상에 발현되는 수용체 또는 항원에 분자가 특이적으로 결합되도록 하는데, 예를 들면, 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 연결시키는 것이다. 여기에서 설명하는 벡터를 이용하여 세포로 안티센스 핵산 분자를 운반시킬 수 있다. 세포내의 안티센스 분자의 농도를 충분히 확보하기 위해, 안티센스 핵산 분자가 포함된 벡터 구조체를 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터가 선호하는 조건하에 둔다.Antisense nucleic acid molecule administration routes of the invention include direct injection into tissue sites. Another method is to modify the antisense nucleic acid molecule to target the selected cell and administer it systemically. For example, in systemic administration, the antisense molecule is modified to allow the molecule to specifically bind to a receptor or antigen expressed on a selected cell surface, eg, a peptide or antibody that binds to a cell surface receptor or antigen. To the antisense nucleic acid molecule. The vectors described herein can be used to deliver antisense nucleic acid molecules into cells. In order to ensure sufficient concentration of antisense molecules in the cells, the vector constructs containing the antisense nucleic acid molecules are placed under conditions preferred by the strong pol II or pol III promoters.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특정한 이본쇄 하이브리드화를 형성하는데, 형성된 이본쇄는 서로 평행하다 (Gaultier 등., Nucleic Acids Res (1987)15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 메틸리보뉴클레오티드로 구성되거나(Inoue 등., Nucleic Acids Res (1987) 15:6131-6148) 또는 키메라 RNADNA 유사체로 구성된다 (Inoue 등., FEBS Lett (1987) 215:327-330).Antisense nucleic acid molecules of the invention are α-anomeric nucleic acid molecules. α-anomeric nucleic acid molecules form specific double-stranded hybridization with complementary RNA, the double strands formed being parallel to each other (Gaultier et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6625-6641). Antisense nucleic acid molecules also consist of methylribonucleotides (Inoue et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6131-6148) or chimeric RNADNA analogs (Inoue et al., FEBS Lett (1987) 215: 327-330 ).
리보자임Ribozyme
본 발명에는 리보자임도 포함된다. 리보자임은 리보자임이 하이브리드화되어 일본쇄의 핵산 가령, mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 가지고 있는 촉매성 RNA 분자다. 따라서 GAVE19 mRNA 전사를 촉매적으로 절단하여, GAVE19 mRNA 의 해독을 저해시키는데 리보자임을 이용할 수 있다 (가령, 망치머리모양의 리보좀(Haselhoff 등., Nature (1988) 334:585-591)에서 설명). 여기에서 설명하고 있는 GAVE19 cDNA 의 뉴클레오티드 서열(서열 1)에 근거하여 GAVE19를 암호화하는 핵산에 대해 특이성을 가지는 리보좀을 만들 수 있다. 예를 들면, Tetrahymena L19 IVS RNA 유도체를 작제할 수 있는데, 이때 활성 부분의 뉴클레오티드 서열은 GAVE19를 암호화하는 mRNA에서 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이다.(참고 미국 특허 4,987,071 및 미국 특허 5,116,742). 다른 방법으로, GAVE19 mRNA를 이용하여RNA 분자 모음으로부터 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 가지는 촉매성 RNA을 선별할 수도 있다(Bartel 등., Science (1993) 261:1411-1418).The present invention also includes ribozymes. Ribozymes are catalytic RNA molecules that have ribonuclease activity that allows hybridization of ribozymes to cleave nucleic acids such as mRNA. Thus, ribozymes can be used to catalytically cleave GAVE19 mRNA transcription and inhibit the translation of GAVE19 mRNA (eg, hammerhead ribosome (Haselhoff et al., Nature (1988)). 334: 585-591). Ribosomes having specificity for a nucleic acid encoding GAVE19 can be made based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of GAVE19 cDNA described herein. For example, Tetrahymena L19 IVS RNA derivatives can be constructed wherein the nucleotide sequence of the active moiety is complementary to the nucleotide sequence cleaved from the mRNA encoding GAVE19 (see US Pat. No. 4,987,071 and US Pat. No. 5,116,742). Alternatively, GAVE19 mRNA can be used to select catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a collection of RNA molecules (Bartel et al., Science (1993) 261: 1411-1418).
본 발명의 삼중나선 핵산 분자 및 펩티드 핵산Triple Helix Nucleic Acid Molecules and Peptide Nucleic Acids of the Invention
본 발명에는 삼중나선 구조물을 형성하는 핵산 분자도 포함된다. 예를 들면, GAVE19의 조절 부분(가령 GAVE19 프로모터 또는 인핸서)에 상보적인 핵산 서열을 표적화시켜, 3중 나선 구조를 만들고, 표적 세포에서 GAVE19 유전자의 전사를 방해함으로써 GAVE19 유전자 발현을 저해시킬 수도 있다. (Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6(6):569; Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660:27; Maher, Bioassays (1992) 14(12):807).Also included in the present invention are nucleic acid molecules that form triple helix structures. For example, GAVE19 gene expression can be inhibited by targeting nucleic acid sequences complementary to regulatory portions of GAVE19 (eg, GAVE19 promoters or enhancers) to create triple helix structures and disrupt transcription of the GAVE19 gene in target cells. Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6 (6): 569; Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660: 27; Maher, Bioassays (1992) 14 (12): 807.
적절한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자의 염기 부분, 당 부분 또는 인산염 기본 구조 부위를 변형시켜, 분자의 안정성, 하이브리드화 반응성 또는 용해도를 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산의 디옥시리보스 포스페이트 기본구조를 변형시켜 펩티드 핵산을 만들 수도 있다(참고 Hyrup 등., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5). 여기에서 언급되는 “펩티드 핵산” 또는 “PNAs”는 핵산 모방물질, 예를 들면, DNA 모방물질 즉, 데옥시리보스 인산염 기본구조를 슈도(pseudo)펩티드 기본구조로 대체시킨 것으로, 단 4가지 천연 뉴클레오염기는 남아 있는 것을 말한다. PNAs의 중성 기본구조로 하여금 낮은 이온 강도 조건 하에서도 DNA 및 RNA 에 특이적으로 하이브리드화 반응을 할 수 있게 한다. Hyrup 등. (1996) 상기 참조; PerryO’Keefe 등., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:14670에서 설명된 것과 같이 표준 고형상 펩티드 합성 과정에 따라, PNA 올리고머를 합성할 수 있다.In suitable embodiments, the base moiety, sugar moiety or phosphate basic structural moiety of the nucleic acid molecule of the invention can be modified to improve the stability, hybridization reactivity or solubility of the molecule. For example, peptide nucleic acids may be made by modifying the deoxyribose phosphate framework of nucleic acids (see Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4: 5). The term “peptide nucleic acid” or “PNAs” referred to herein refers to the replacement of nucleic acid mimetics, eg, DNA mimetics, that is, deoxyribose phosphate frameworks with pseudopeptide frameworks. Cleobase refers to what remains. The neutral framework of PNAs enables specific hybridization of DNA and RNA even under low ionic strength conditions. Hyrup et al. (1996) supra; PNA oligomers can be synthesized following standard solid phase peptide synthesis procedures as described in PerryO'Keefe et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93: 14670.
치료요법적 분야 및 진단 분야에 GAVE19의 PNA를 이용할 수 있다. 예를 들면, 유전자 발현을 전사 또는 해독 저지를 유도하거나 복제를 저해하는 것과 같이 서열 특이적인 방식으로 조절시에, 안티센스 또는 안티진 물질로 PNA를 이용할 수도 있다. GAVE19의 PNA를 이용할 수도 있다. 가령, 유전자에서 단일 염기 쌍 돌연변이 분석시, 즉, PNA-직접적인 PCR 클램핑에 PNA를 이용하고; S1 뉴클레아제(Hyrup 등. (1996) 상기 참조)와 같은 다른 효소와 복합하여 사용하는 경우에 인위적인 제한 효소로 이용하고, DNA 서열 및 하이브리드화 반응에서의 프로브 또는 프라이머로 사용한다 (Hyrup 등. (1996) 상기 참조; Perry-O’Keefe 등. (1996) 상기 참조).GAVE19's PNA can be used for therapeutic and diagnostic applications. For example, PNA may be used as an antisense or antigenic agent in regulating gene expression in a sequence specific manner such as inducing transcriptional or translational arrest or inhibiting replication. You can also use GAVE19's PNA. For example, using PNA for single base pair mutation analysis in genes, ie, for PNA-direct PCR clamping; When used in combination with other enzymes such as S1 nuclease (Hyrup et al. (1996) supra), it is used as an artificial restriction enzyme and used as a probe or primer in DNA sequences and hybridization reactions (Hyrup et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) supra).
또 다른 구체예에서, GAVE19의 PNA를 변형시켜, 안정성, 특이성 또는 세포의 수취(uptake)등을 강화시킬 수 있는데, 예를 들면 PNA에 친지성 또는 다른 도우미 기를 부착시키거나 PNA-DNA 키메라를 형성시키거나 당분야에 공지된 약물 운반 기술 또는 리포좀을 이용할 수도 있다. PNA-DNA 키메라 합성은 Hyrup 등 (1996) 상기 참조, Finn 등., Nucleic Acids Res (1996) 24(17):3357-63, Mag 등., Nucleic Acids Res (1989) 17:5973; Peterser 등., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119에서 설명하는 방법으로 만들 수 있다.In another embodiment, the PNA of GAVE19 can be modified to enhance stability, specificity or uptake of cells, such as attaching lipophilic or other helper groups to the PNA or forming a PNA-DNA chimera. Or drug delivery techniques or liposomes known in the art. PNA-DNA chimeric synthesis is described in Hyrup et al. (1996) supra, Finn et al., Nucleic Acids Res (1996) 24 (17): 3357-63, Mag et al., Nucleic Acids Res (1989) 17: 5973; Peterser et al., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5: 1119.
GAVE19 단백질GAVE19 Protein
또한, 본 발명에는 도 2의 아미노산 서열(서열 2)로 구성된 분리된 폴리펩티드, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 유사체 및 유도체까지 포함된다.In addition, the present invention also includes isolated polypeptides, variants thereof, fragments thereof, or analogs and derivatives thereof composed of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of FIG. 2.
서열 2와는 상이한 서열을 가지는 GAVE19 단백질(가령, 변이체)을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 서열 1의 뉴클레오티드 서열내로 한 가지 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결손시켜, 암호화된 단백질내에 한 가지 이상의 아미노산 치환, 결손 또는 추가를 유도하여 만들 수 있다.An isolated nucleic acid molecule encoding a GAVE19 protein (eg, variant) having a sequence different from SEQ ID NO: 2 may be substituted, added, or deleted one or more nucleotides into the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, thereby replacing one or more amino acid substitutions, deletions in the encoded protein. Or by inducing additions.
특정 구체예에서, GAVE19 돌연변이 단백질에 대해 (1) GAVE19 시그날 전달 과정에서 단백질과 단백질:단백질 상호작용을 하는 능력; (2) GAVE19 리간드에 결합하는 능력; 또는 (3) 세포내 표적 단백질에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 또 다른 적절한 구체예에서, 세포내 증식 또는 세포 분화를 조절하는 능력에 대해 GAVE19 돌연변이체를 분석하였다.In certain embodiments, for a GAVE19 mutant protein, (1) the ability to interact with the protein: protein in a GAVE19 signal transduction process; (2) the ability to bind a GAVE19 ligand; Or (3) the ability to bind intracellular target proteins. In another suitable embodiment, GAVE19 mutants were analyzed for their ability to modulate intracellular proliferation or cell differentiation.
표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적절한 정제 계획에 따라 세포 또는 조직원에서 고유 GAVE19단백질을 분리해낼 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 GAVE19 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명에 포함되는 재조합 발현의 대안으로, 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여, GAVE19 단백질 또는 폴리펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다.Standard protein purification techniques can be used to isolate native GAVE19 protein from cells or tissue sources according to appropriate purification schemes. In another embodiment, recombinant DNA techniques can be used to produce GAVE19 protein. As an alternative to recombinant expression encompassed by the present invention, standard peptide synthesis techniques can be used to chemically synthesize GAVE19 protein or polypeptide.
“분리된” 또는 “정제된” 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분은 GAVE19 단백질이 유도되는 세포 또는 조직원으로부터 실제 세포 물질 또는 다른 오염 단백질 없는 상태 또는 화학적으로 합성되는 경우에 실제 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 없는 상태의 단백질을 말한다. “실질적으로 세포 물질 없이”란 단백질이 분리되거나 또는 재조합에 의해 합성이 되는 세포의 세포 성분으로부터 GAVE19 단백질을 분리한 단백질 준비물이 된다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 포함안된 GAVE19 단백질에는 GAVE19이외의 단백질이 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 미만(건조 중량)의 양이 포함된 GAVE19 단백질 준비물이 된다. GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분이 제조합에 의해 생산되는 경우에, 배양 배지를 포함시키지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면, 배양 배지는 단백질 준비물 중량의 20%, 10%, 5% 또는 이보다 더 적게 한다. GAVE19 단백질을 화학적 합성 방법으로 합성하는 경우에, 화학 전구물질 또는 다른 화학물질을 포함시키지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면, 단백질 합성 과정에 연루된 화학 전구물질 또는 다른 화학물질로부터 분리되어야 한다. 따라서, 이와 같은 GAVE19 단백질 준비물에는 화학 전구물질 또는 GAVE19 이외 화학물질이 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하(건조 중량 기준)로 포함된다.A “isolated” or “purified” protein or biologically active portion thereof may be an actual chemical precursor or other when synthesized or chemically free of actual cellular material or other contaminating protein from the cell or tissue source from which the GAVE19 protein is derived. A protein that is free of chemicals. The term "substantially free of cellular material" is a protein preparation in which the GAVE19 protein is isolated from the cellular components of the cell which are either isolated or recombinantly synthesized. Thus, a GAVE19 protein substantially free of cellular material is a GAVE19 protein preparation containing an amount of 30%, 20%, 10%, 5% or less (dry weight) of proteins other than GAVE19. If the GAVE19 protein or a biologically active portion thereof is produced by the preparation, it is preferred not to include the culture medium, for example, the culture medium may be 20%, 10%, 5% or more of the weight of the protein preparation. Do it less. In the case of synthesizing the GAVE19 protein by chemical synthesis methods, it is desirable not to include chemical precursors or other chemicals, for example, to be separated from chemical precursors or other chemicals involved in the protein synthesis process. Thus, such GAVE19 protein preparations contain 30%, 20%, 10%, 5% or less (based on dry weight) of chemical precursors or chemicals other than GAVE19.
GAVE19 단백질의 생물학적 활성 부분 또는 단편에는 GAVE19 단백질의 아미노산 서열 (서열 2에 나타난 아미노산 서열)로부터 유도된 또는 이와 동일한 아미노산 서열로 구성된 펩티드가 포함되는데, 이들 펩티드들은 GAVE19 전장 단백질보다는 아미노산 수가 적지만, GAVE19 단백질의 여러 활성 중 적어도 한 가지 활성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적으로 활성을 가지는 부분은 GAVE19 단백질의 적어도 한 가지 활성을 가지는 도메인 또는 모티프로 구성된다. GAVE 19 단백질의 생물학적으로 활성을 가지는 부분은 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가지는 폴리펩티드이다. 생물학적으로 활성을 가지는 적절한 폴리펩티드에는 한 개이상의 확인된 GAVE19 구조 도메인이 포함된다.Biologically active portions or fragments of the GAVE19 protein include peptides derived from or consisting of the amino acid sequence of the GAVE19 protein (the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2), which comprise fewer amino acids than the GAVE19 full-length protein. At least one of several activities of the protein. In general, the biologically active moiety consists of a domain or motif with at least one activity of the GAVE19 protein. The biologically active portion of the GAVE 19 protein is a polypeptide with an amino acid length of 10, 25, 50, 100 or more. Suitable polypeptides that are biologically active include one or more identified GAVE19 structural domains.
또한, 재조합 기술을 이용하여 단백질의 다른 부분이 결손된 생물학적으로활성을 가지는 다른 부분을 만들고, 고유 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 기능상 활성에 대해 평가하였다.Recombinant techniques were also used to make other parts of the protein that are biologically active with other parts missing, and to evaluate one or more functional activities of the native GAVE19 protein.
실제 서열 2와 동일하고, 서열 2의 단백질의 기능상 활성을 보유하나 자연적인 대립형질 변이 및 돌연변이로 인하여, 아미노산 서열에서는 차이가 있는 다른 유용한 GAVE19 단백질도 있다. 예를 들면, 이와 같은 GAVE19 단백질 및 폴리펩티드는 여기에서 설명하고 있는 생물학적 활성중 적어도 한 가지를 보유한다.There are also other useful GAVE19 proteins that are identical to actual SEQ ID NO: 2 and retain the functional activity of the protein of SEQ ID NO: 2 but differ in amino acid sequence due to natural allelic variations and mutations. For example, such GAVE19 proteins and polypeptides possess at least one of the biological activities described herein.
따라서, 유용한 GAVE19 단백질은 서열 2의 아미노산 서열에 적어도 약 45%, 적절하게는 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, 100% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 서열 2의 GAVE19 단백질의 기능상 활성을 보유하는 단백질이다. 특정 구체예에서, GAVE19 단백질은 서열 2의 GAVE19 단백질의 기능상 활성을 보유한다.Thus, a useful GAVE19 protein has an amino acid sequence that is at least about 45%, suitably 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the GAVE19 of SEQ ID NO: 2 It is a protein that retains the functional activity of a protein. In certain embodiments, the GAVE19 protein retains the functional activity of the GAVE19 protein of SEQ ID NO: 2.
두 핵산에 상응하는 두가지 아미노산 서열의 상동성 비율을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열을 배열시킨다(제 2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적하게 배열시키기 위해, 제 1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭을 만들 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기를 비교하였다. 제 1 서열의 특정 위치에 상응하는 제 2 서열의 위치에 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기가 차지하고 있다면, 분자는 그 위치에서 동일한 것으로 간주한다. 두 서열간에 상동성 비율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 대한 함수로 나타낸다(상동성 비율=동일한 위치 수/총 위치 수(겹쳐지는 위치)X100). 한 구체예에서, 이 두 서열은 동일한 길이를 가진다.To determine the homology ratio of two amino acid sequences corresponding to two nucleic acids, the sequences are arranged for optimal comparison purposes (to optimally align with the second amino acid or nucleic acid sequence, a gap is created in the first amino acid or nucleic acid sequence). Can be). Amino acid residues or nucleotide residues at the corresponding amino acid position or nucleotide position were compared. If the same amino acid residue or nucleotide residue occupies a position in a second sequence that corresponds to a specific position in the first sequence, the molecule is considered to be identical at that position. The homology ratio between the two sequences is expressed as a function of the number of identical positions shared by the sequence (homology ratio = identical positions / total positions (overlapping positions) × 100). In one embodiment, these two sequences have the same length.
두 서열간에 상동성 비율을 결정하는 방법은 수학 알고리즘을 이용할 수 있다. 두 서열을 비교하는데 이용하는 수학 알고리즘의 적절한 예가 Karlin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264; Karlin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:5873-877(변형)에 기재되어 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 알고리즘을 NBLAST 및 XBLAST 프로그램과 결합시킨다(Altschul 등., J Mol Bio (1990) 215:403). BLAST 뉴클레오티드 서치를 NBLAST 프로그램, 숫자=100, 단어길이=12으로 실행하여, 본 발명의 GAVE19 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수도 있다. BLAST 단백질 서치를 XBLAST 프로그램, 숫자=50, 단어길이=3으로 실행하여, 본 발명의 GAVE19 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수도 있다. 비교 목적으로 갭을 만든 배열의 경우, Altschul 등., Nucleic Acids Res (1997) 25:3389에서 설명하는 Gapped BLAST를 이용할 수도 있다. 다른 방법으로, 분자간에 거리 관계를 확인하기 위한 반복 서치를 실행하는데 PSIBlast를 이용 할 수도 있다(Altschul 등. (1997)상기 참조). BLAST, Gapped BLAST 및 PSIBlast 프로그램을 이용하는 경우에, 각 프로그램의 디폴트 변수(가령, XBLAST 및 NBLAST) 을 이용할 수도 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참고.The method of determining the homology ratio between two sequences can use a mathematical algorithm. Suitable examples of mathematical algorithms used to compare two sequences are described in Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 2264; Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 5873-877 (modified), but is not limited thereto. This algorithm is combined with the NBLAST and XBLAST programs (Altschul et al., J Mol Bio (1990) 215: 403). BLAST nucleotide searches can also be performed with the NBLAST program, number = 100, wordlength = 12 to obtain nucleotide sequences homologous to the GAVE19 nucleic acid molecule of the present invention. The BLAST protein search can be performed by the XBLAST program, number = 50, wordlength = 3 to obtain an amino acid sequence homologous to the GAVE19 protein molecule of the present invention. For arrays with gaps for comparison purposes, Gapped BLAST described in Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25: 3389 may be used. Alternatively, PSIBlast may be used to perform an iterative search to identify distance relationships between molecules (Altschul et al. (1997), supra). When using the BLAST, Gapped BLAST, and PSIBlast programs, the default variables of each program (eg, XBLAST and NBLAST) may be used. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference.
서열을 비교하는데 사용될 수 있는 수학 알고리즘의 적절한 예로써 Myers 등., CABIOS (1988) 4:11-17의 알고리즘을 이용하는 것이나, 이에 국한되지 않는다. 이와 같은 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 패키지의 일부분인 ALIGN 프로그램(version 2.0)에 결합시킨다. 아미노산 서열 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12, 갭 패널티 4를 이용할 수 있다.Suitable examples of mathematical algorithms that can be used to compare sequences include, but are not limited to, using the algorithms of Myers et al., CABIOS (1988) 4: 11-17. This algorithm is coupled to the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program for amino acid sequence comparison, the PAM120 weight residue table, gap length penalty 12, gap penalty 4 can be used.
2개의 서열 간에 상동성 비율은 상기에서 설명된 것과 유사한 기술을 이용하여 갭을 허용하거나 또는 허용하지 않으면서 결정 할 수 있다. 상동성 비율을 계산할 때, 정확하게 짝을 이루는 것만 계산한다.The homology ratio between the two sequences can be determined with or without allowing gaps using techniques similar to those described above. When calculating the homology ratio, only the exact pairing is done.
본 발명은 또한 GAVE19 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 여기에서 사용되는 것과 같이, GAVE19 “키메라 단백질” 또는 “융합 단백질”은 GAVE19가 아닌 폴리펩티드에 연결된 GAVE19 폴리펩티드로 구성된다. “GAVE19 폴리펩티드”는 GAVE19에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말한다. “GAVE19가 아닌 폴리펩티드(비GAVE19 폴리펩티드)”는 GAVE19 단백질과는 실제 동일하지 않은 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 가령, GAVE19 단백질과는 상이한 단백질, 동일한 또는 상이한 유기체에서 유도된 단백질이 된다. GAVE19 융합 단백질내에서, GAVE19 폴리펩티드는 GAVE19 단백질의 전부 또는 일부분에 상응할 수 있는데, 적절하게는GAVE19 단백질의 적어도 한가지 생물학적으로 활성 부분에 상응한다. 융합 단백질내에서, “작동 가능하게 연결된”이란 GAVE19 폴리펩티드와 비GAVE19 폴리펩티드가 프레임 내에 서로 융합되어 있다는 것을 나타내는 것이다. 비GAVE19 폴리펩티드는 GAVE19 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있다. 한 가지 유용한 융합 단백질로 GSTGAVE19가 될 수 있는데, 이는 GAVE19 서열이 글루타치온S전이효소(GST)의 C-말단에 융합되어 있는 것이다. 이와 같은 융합 단백질로 재조합 GAVE19를 정제할 수 있다.The invention also provides GAVE19 chimeric or fusion proteins. As used herein, GAVE19 “chimeric protein” or “fusion protein” consists of a GAVE19 polypeptide linked to a polypeptide other than GAVE19. "GAVE19 polypeptide" refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to GAVE19. A “non-GAVE19 polypeptide” (non-GAVE19 polypeptide) is a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein that is not actually identical to the GAVE19 protein, such as a protein that is different from the GAVE19 protein, or a protein derived from the same or different organism. Within the GAVE19 fusion protein, the GAVE19 polypeptide may correspond to all or a portion of the GAVE19 protein, suitably corresponding to at least one biologically active portion of the GAVE19 protein. Within a fusion protein, “operably linked” refers to the incorporation of GAVE19 polypeptides and non-GAVE19 polypeptides into each other in frame. Non-GAVE19 polypeptides are fused to the N-terminus or C-terminus of the GAVE19 polypeptide. One useful fusion protein could be GSTGAVE19, where the GAVE19 sequence is fused to the C-terminus of glutathione S transferase (GST). Recombinant GAVE19 can be purified with such a fusion protein.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질에는 GAVE19 전부 또는 일부를 면역글로블린 단백질 족(family)의 구성원에서 유도한 서열에 융합한 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질도 포함된다. 본 발명의 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 약학 조성물에 포집시키고, 개체에 투여하여, 세포 표면상에서 GAVE19 리간드와 GAVE19 단백질간에 상호작용을 방해하여 생체내 상에서 GAVE19중개된 시그날 변환을 억제하게 된다. GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 이용하여 GAVE19 동족 리간드의 생체이용성에 영향을 줄 수 있다. 증식성 및 분화성 질환을 치료하거나 세포 생존을 조절하는데(예를 들면 촉진 또는 저해) 치료요법적으로 GAVE19 리간드-GAVE19 상호작용 저해가 유용할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 GAVE19-면역글로블린 융합 단백질을 면역원으로 이용하여 개체에서 항-GAVE19 항체를 만들수 있어, GAVE19리간드를 정제하고, GAVE19 리간드와 GAVE19의 상호작용하는 것을 저해하는 분자를 확인하는 스크리닝 분석을 할 수 있다.In another embodiment, fusion proteins of the invention also include GAVE19-immunoglobulin fusion proteins in which all or part of GAVE19 is fused to sequences derived from members of the immunoglobulin protein family. The GAVE19-immunoglobulin fusion protein of the present invention is captured in a pharmaceutical composition and administered to a subject to interfere with the interaction between the GAVE19 ligand and the GAVE19 protein on the cell surface to inhibit GAVE19 mediated signal transduction in vivo. The GAVE19-immunoglobulin fusion protein can be used to influence the bioavailability of GAVE19 cognate ligands. Inhibition of GAVE19 ligand-GAVE19 interaction may be useful therapeutically to treat proliferative and differentiable diseases or to modulate cell survival (eg, promote or inhibit). In addition, the GAVE19-immunoglobulin fusion protein of the present invention can be used as an immunogen to make anti-GAVE19 antibodies in an individual, thereby purifying GAVE19 ligands and screening assays to identify molecules that inhibit the interaction of GAVE19 ligand with GAVE19. can do.
특정 구체예에서, 적절하게는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여, 본 발명의 GAVE19 키메라 또는 융합 단백질을 만들 수 있다. 통상의 기술, 예를 들면, 연결용 평활 말단 또는 점착성 말단을 이용하거나, 제한효소 절단을 통하여 적절한 말단을 만들어주고, 적당한 점착성 말단으로 채우고, 알칼리 포스포타제로 처리하여, 불필요한 결합 및 효소 연결을 막는 등의 기술을 이용하여, 상이한 폴리펩티드 서열을 코드하는 DNA 단편들을 프레임내 연결시킨다. 또 다른 구체예에서, 자가 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술을 이용하여 융합 유전자를 만들 수 있다. 대안으로, 키메라 유전자 서열을 만들기 위해 실제 어닐되고, 재증폭되는 두 가지 구성 유전자 단편 간에 상보적 돌기(overhangs)를 만드는 앵커(anchor) 프라이머를 이용하여, 유전자 단편을 PCR 증폭시킨다(Ausubel 등., 상기 참조). 또한, 융합 부분(가령,GST 폴리펩티드)을 이미 암호화한 시판되는 많은 발현 벡터를 이용할 수도 있다. GAVE19를 암호화하는 핵산을 발현 벡터내로 클로닝시켜, 융합 부분이 프레임내 상태로 GAVE19 단백질에 연결되게 한다.In certain embodiments, GAVE19 chimeras or fusion proteins of the invention may be made as appropriate using standard recombinant DNA techniques. Conventional techniques, for example, using smoothing or cohesive ends for linkage, or making appropriate ends through restriction enzyme cleavage, filling with suitable cohesive ends, and treating with alkaline phosphatase, to prevent unnecessary binding and enzymatic linkage And the like, such that DNA fragments encoding different polypeptide sequences are linked in-frame. In another embodiment, fusion genes can be made using conventional techniques, including autologous DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of the gene fragments using anchor primers that create complementary overhangs between the two constituent gene fragments that are actually annealed and reamplified to make the chimeric gene sequence (Ausubel et al., See above). It is also possible to use many commercially available expression vectors that already encode fusion moieties (eg, GST polypeptides). The nucleic acid encoding GAVE19 is cloned into an expression vector, allowing the fusion moiety to be linked to the GAVE19 protein in-frame.
변이체Variant
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명에는 GAVE19 단백질의 변이체도 포함된다. 예를 들면, 부위 지시된 돌연변이 생성 및 PCR중개된 돌연변이 형성과 같은 표준 기술을 이용하여 돌연변이를 서열 2의 아미노산 서열내로 도입시킬 수 있다. 또한, 한 군데 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 보존형 아미노산 치환을 만들 수 있다. “보존형 아미노산 치환”은 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가지는 다른 아미노산으로 치환시킨다는 것이다. 예를 들면, 1개 이상의 아미노산은 등가의 기능을 하는 유사한 극성을 가지는 또 다른 아미노산에 의해 치환되어 침묵(silent)변화를 만들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 아미노산 치환은 아미노산이 속하는 군의 다른 구성 아미노산중에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌이 포함된다. 방향족 환 구조를 포함하는 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민이 포함된다. 양 전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성)를 가지는 아미노산에는 아스파르트산, 글루탐산이 포함된다. 이와 같은 변화는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점등으로 측정할 수 있는 겉보기 분자량에는 영향을 주지 않을 것으로 보인다.As described above, the present invention also includes variants of the GAVE19 protein. For example, mutations can be introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 using standard techniques such as site directed mutagenesis and PCR mediated mutation formation. In addition, conservative amino acid substitutions can be made at one or more non-essential amino acid residues. “Conservative amino acid substitutions” refer to substitution of an amino acid residue with another amino acid having a similar side chain. For example, one or more amino acids can be substituted by another amino acid having a similar polarity that serves an equivalent function, resulting in a silent change. Amino acid substitutions within the amino acid sequence of a polypeptide of the invention may be selected from other constituent amino acids of the group to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine. Amino acids containing an aromatic ring structure include phenylalanine, tryptophan, tyrosine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine. Positive charge (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Amino acids with negative charges (acidic) include aspartic acid and glutamic acid. This change does not seem to affect the apparent molecular weight which can be measured by polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric lighting.
특별히 적절한 치환은 다음과 같다;Particularly suitable substitutions are as follows;
- 양전하를 유지할 수 있는 Arg의 경우 Lys(그 역도 성립)로 치환Arg, which can maintain a positive charge, is replaced with Lys (or vice versa).
- 음전하를 유지할 수 있는 Asp의 경우 Glu(그 역도 성립)로 치환-Asp, which can maintain negative charge, is replaced with Glu (or vice versa)
- 자유- OH기를 유지할 수 있는 Thr의 경우 Ser로 치환-Free-Substituted with Ser for Thr that can hold OH group
- 자유 NH2를 유지할 수 있는 Asn의 경우 Gln로 치환-Asn, which can maintain free NH 2 , substitute Gln
또한, 특별히 선호하는 성질을 가지는 아미노산을 대체하기 위해 아미노산 치환이 도입될 수도 있다. 예를 들면, 또 다른 Cys와 이황화결합을 할 수 있는 가능 부위에 Cys를 도입시킬 수도 있다. His를 특정 “촉매” 부위(His는 산성 또는 염기성으로 작용할 수 있기 때문에, 생화학 촉매 분석에서 가장 흔한 아미노산이다)로 도입시킬 수도 있다. Pro는 특수한 평면 구조 때문에, 단백질 구조에 β-턴(turns)을 유도하기 위해 도입될 수 있다.In addition, amino acid substitutions may be introduced to replace amino acids having particularly preferred properties. For example, Cys may be introduced at a possible site capable of disulfide bond with another Cys. His can also be introduced into specific “catalyst” sites (His is the most common amino acid in biochemical catalysis analysis because His can act either acidic or basic). Because of the special planar structure, Pro can be introduced to induce β-turns in the protein structure.
포화 돌연변이(saturation mutagenesis)와 같은 방법으로 GAVE19 암호화 서열의 전부 또는 일부분에 돌연변이를 도입시키고, 생성된 돌연변이가 활성을 보유하고 있는 것을 확인하기 위해 GAVE19 생물학적 활성에 대해 생성된 돌연변이를 스크리닝한다. 돌연변이 형성 후에, 암호화된 단백질을 재조합적으로 발현시키고, 단백질의 활성을 측정한다.Mutations are introduced into all or a portion of the GAVE19 coding sequence in the same manner as saturation mutagenesis, and the resulting mutations are screened for GAVE19 biological activity to confirm that the resulting mutations retain activity. After mutation formation, the encoded protein is expressed recombinantly and the activity of the protein is measured.
본 발명의 변이체들은 GAVE19 효능제(모방체) 또는 GAVE19 길항제로 기능을 할 수 있다. 돌연변이 생성을 통하여, GAVE19 단백질 변이체를 만들 수 있는데, 예를 들면, GAVE19 단백질의 별개의 점돌연변이 또는 절단 등을 통하여 변이체를 만들 수 있다. GAVE19 단백질 효능제는 자연발생 GAVE19 단백질의 생물학적 활성과 실제 동일한 또는 부분 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, GAVE19 단백질을 포함하는 세포 시그날 전달 연속 반응의 하향 또는 상향 원소에 경쟁적으로 결합시켜, GAVE19 단백질의 길항제가 자연 발생 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 활성을 저해한다. 따라서, 제한된 기능의 변이체로 처리하여 특정 생물학적 효과를 유도할 수도 있다. 자연 발생 형태 단백질의 생물학적 활성중 일부분을 가지는 변이체로 개체를 치료하면 자연 발생형 GAVE19 단백질로 치료한 개체에서 나타나는 것보다 부작용을 더 줄일 수도 있다.Variants of the invention may function as GAVE19 agonists (mimetics) or GAVE19 antagonists. By mutagenesis, GAVE19 protein variants can be made, for example, through point mutations or cleavage of the GAVE19 protein. GAVE19 protein agonists may have substantially the same or partial activity as the biological activity of naturally occurring GAVE19 proteins. For example, by competitively binding to the downward or upward element of a cell signal transduction cascade comprising the GAVE19 protein, the antagonist of the GAVE19 protein inhibits one or more activities of the naturally occurring GAVE19 protein. Thus, treatment with limited function variants may induce certain biological effects. Treatment of individuals with variants that have some of the biological activity of naturally occurring forms of protein may reduce side effects more than would occur in individuals treated with naturally occurring GAVE19 proteins.
GAVE19 효능제(모방체) 또는 길항제로 기능을 하는 GAVE19 단백질 변이체는 복합 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하여 확인할 수 있는데, 가령, GAVE19 효능제 또는 길항제 활성을 가지는 GAVE19 단백질의 절단형 돌연변이 등을 스크리닝할 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 수준에서 복합 돌연변이 생성으로 다양한 GAVE19 변이체의 다변화된 라이브러리를 만들 수 있고, 이들 변이체들은 다변화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. GAVE19 변이체의 다변화된 라이브러리를 합성된 올리고뉴클레오티드 혼합물을 효소를 이용하여 유전자 서열에 연결시켜 만들면, 잠재적인 GAVE19 서열의 중첩 세트는 개별 폴리펩티드로 발현되고, 또는 내부에 GAVE19 서열 세트를 포함하는 더 큰 융합 단백질 세트(가령, 파아지 디스플레이용)로 발현된다. 다양한 방법을 사용하여 중첩성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 GAVE19 변이체 라이브러리를 만든다. 자동화된 DNA합성기를 이용하여 중첩 유전자 서열을화학적으로 합성할 수 있고, 합성된 유전자를 적절한 발현 벡터에 연결시킨다. 한 혼합물에서 유전자의 중첩 세트를 이용하면 잠재적인 GAVE19 서열 세트를 암호화하는 모든 서열을 만들 수 있다. 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.(Narang, Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura 등., Ann Rev Biochem (1984) 53:323; Itakura 등., Science (1984) 198:1056; Ike 등., Nucleic Acid Res (1983) 11:477).GAVE19 protein variants that function as GAVE19 agonists (mimetics) or antagonists can be identified by screening complex mutant libraries, such as cleavage mutations of GAVE19 proteins with GAVE19 agonists or antagonist activity, and the like. In one embodiment, complex mutagenesis at the nucleic acid level can result in a diversified library of various GAVE19 variants, which variants are encoded by the diversified gene library. When a diversified library of GAVE19 variants is made by linking a synthesized oligonucleotide mixture to gene sequences using enzymes, the overlapping set of potential GAVE19 sequences is expressed as individual polypeptides, or a larger fusion comprising the GAVE19 sequence set therein. Expressed as a set of proteins (eg, for phage display). Various methods are used to create a potential GAVE19 variant library from overlapping oligonucleotide sequences. Automated DNA synthesizers can be used to chemically synthesize overlapping gene sequences, and the synthesized genes are linked to appropriate expression vectors. Using overlapping sets of genes in a mixture can produce all sequences encoding a potential GAVE19 sequence set. Methods of synthesizing overlapping oligonucleotides are known in the art. (Narang, Tetrahedron (1983) 39: 3; Itakura et al., Ann Rev Biochem (1984) 53: 323; Itakura et al., Science (1984) 198: 1056; Ike et al., Nucleic Acid Res (1983) 11: 477).
또한, GAVE19 단백질 암호화 서열의 단편 라이브러리를 이용하여 GAVE19 단백질 변이체의 스크리닝 및 연속적인 선별에 사용할 수 있는 GAVE19 단편의 다변화 개체 군을 만들 수 있다. 한 구체예에서, GAVE19 암호화 서열의 이본쇄 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하여 암호화 서열 단편 라이브러리를 만드는데, 이때 조건은 분자 하나당 니크(nick)한 번만 일어나고, 이본쇄 DNA를 변성시키고, DNA를 다시 환원시켜, 다르게 니크된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함하는 이본쇄 DNA를 만든 후에, 다시 형성된 이본쇄로부터 일본쇄 부분을 제거하기 위해 S1 뉴클레아제로 처리하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 연결시키는 것이다. 이와 같은 방법에 의해, 다양한 크기의 GAVE19 단백질 내부 단편과 N-말단을 암호화하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다In addition, fragment libraries of GAVE19 protein coding sequences can be used to create a diversified population of GAVE19 fragments that can be used for screening and continuous selection of GAVE19 protein variants. In one embodiment, the double-stranded PCR fragment of the GAVE19 coding sequence is treated with nucleases to produce a coding sequence fragment library, wherein conditions occur only once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, and reducing the DNA again. To make a double stranded DNA comprising sense / antisense pairs from the otherwise nicked product, followed by treatment with S1 nuclease to remove the single stranded portion from the reformed double strand, and linking the resulting fragment library into an expression vector. will be. By this method, GAVE19 protein internal fragments of various sizes and expression libraries encoding the N-terminus can be derived.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어지는 복합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하는데 선별된 성질을 가지는 유전자 생성물의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 몇 가지 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이와 같은 기술을 GAVE19 단백질의 복합 돌연변이 생성에 의해 만들어지는 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에도 적용할 수 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다량의 처리 분석에도 이용할 수 있는 가장 널이 이용되는 기술은 일반적으로 복제가능한 발현 벡터내로 유전자 라이브러리를 클로닝시키고, 적절한 세포에 생성된 라이브러리 벡터를 형질도입시키고, 적정 조건하에 복합 유전자를 발현시키는데, 이때 조건은 원하는 활성을 검출하여, 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하고 있는 벡터를 분리하는 것이다. 순환 전체 돌연변이 생성(Recursive ensemble mutagenesis(REM))은 라이브러리내에 있는 기능적 돌연변이의 빈도를 증가시키는 기술로써, GAVE19 변이체를 확인하는 스크리닝 분석와 복합하여 사용할 수 있다(Arkin 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave 등., Protein Engineering (1993) 6(3):327-331).Several techniques are known in the art for screening cDNA libraries of gene products having selected properties for screening gene products of complex libraries made by point mutations or cleavage. This same technique can also be applied to the rapid screening of gene libraries produced by complex mutations of the GAVE19 protein. The most null-based technique that can be used for large-scale processing assays for screening large gene libraries generally involves cloning the gene library into replicable expression vectors, transducing the generated library vector into appropriate cells, and under appropriate conditions. A complex gene is expressed, wherein the condition is to detect the desired activity and isolate the vector encoding the gene from which the product is detected. Recursive ensemble mutagenesis (REM) is a technique that increases the frequency of functional mutations in the library and can be used in combination with screening assays to identify GAVE19 variants (Arkin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992). 89: 7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering (1993) 6 (3): 327-331).
GAVE19의 유사체 및 유도체Analogs and Derivatives of GAVE19
또한, 본 발명에는 화학적 변형으로 유도된 GAVE19 유도체 및 유사체도 포함된다. 단백질 부분에 한 가지 이상의 화학기를 부착시켜, 본 발명의 GAVE19 단백질을 유도할 수도 있다.Also included in the present invention are GAVE19 derivatives and analogs derived from chemical modifications. One or more chemical groups may be attached to the protein moiety to induce the GAVE19 protein of the invention.
유도를 위한 화학기.수용성 고분자중에서 유도화 반응에 적절한 화학 기를 선택하여 GAVE19 유사체 또는 유도체가 생리학적 환경과 같은 수용성 환경에 관여하지 않도록 한다. 선택적으로 고분자는 약학적으로 사용 가능한 것이어야 한다. 당업자는 고분자/성분 결합물질이 치료요법적으로 사용할 수 있는지에 근거하여 바람직한 고분자를 선택할 수 있고, 그리고 약학적으로 적합하다면, 바람직한 투여량, 순환시간, 단백질 분해에 대한 저항성 및 다른 고려사항을 근거하여 선택할 수도 있다. GAVE19의 경우에 여기에서 설명하는 분석을 이용하면 확실하게 할 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적절한 수용성 고분자로는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오즈, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종 공중합체 또는 무작위 혼성중합체), 덱스트란, 폴리(n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종공중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 또는 폴리비닐 알코올 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에 안정하기 때문에 제조시에 유리하다. Chemical group for induction. Among the water-soluble polymers, a chemical group suitable for the derivatization reaction is selected so that the GAVE19 analog or derivative does not participate in an aqueous environment, such as a physiological environment. Optionally, the polymer should be pharmaceutically usable. One skilled in the art can select the desired polymer based on whether the polymer / component binder can be used therapeutically and, if pharmaceutically suitable, based on the desired dosage, cycle time, resistance to proteolysis and other considerations. You can also choose. In the case of GAVE19, the analysis described here can be used to ensure this. Suitable water soluble polymers usable in the present invention include polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1, 3-dioxolane, poly- 1,3,6-trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acid (homopolymer or random interpolymer), dextran, poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, proppropylene glycol homopolymer, Polypropylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohols, and the like. Polyethylene glycol propionaldehyde is advantageous in manufacturing because it is stable in water.
고분자는 임의 분자량을 가진 분지쇄 또는 직쇄일 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우에, 적절한 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100kDa("약"이란 의미는 폴리에틸렌 글리콜을 만드는데 있어서, 일부 분자에 언급된 분자량에서 다소 증감이 있을 수 있다는 것을 나타낸다)이다. 원하는 치료 프로필(가령, 지연 방출 기간, 생물학적 활성에 대한 영향, 취급 용이성, 항원성 정도 및 항원성 부족, 치료 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지 효과 등)에 따라 다양한 분자크기를 이용할 수도 있다.The polymer may be branched or straight chain with an arbitrary molecular weight. In the case of polyethylene glycol, suitable molecular weights are from about 2 kDa to about 100 kDa ("about" means that there may be some increase or decrease in the molecular weights mentioned for some molecules in making polyethylene glycol). Various molecular sizes may be used depending on the desired therapeutic profile (eg, delayed release duration, impact on biological activity, ease of handling, antigenicity and antigenicity, other known effects of polyethylene glycol on therapeutic proteins or analogs, etc.). .
GAVE19에 부착시킬 수 있는 고분자의 수는 매우 다양한데, 당업자는 기능에 미치는 효과를 확인할 수 있을 것이다. 당업자는 동일한 또는 상이한 화학기(가령, 상이한 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자를 이용)를 이용하여, 모노, 디-, 트리-, 테트라 유도체 또는 다른 조합으로 유도화 반응을 시킬 수 있을것이다. GAVE19 분자에 대해 고분자의 비율도 매우 다양하게 할 수 있고, 반응 혼합물에서 이들의 농도도 다양하게 변화시킬 수 있다. 일반적으로 원하는 유도화 정도(가령, 모노, 디, 트리 등), 선택된 고분자의 분자량, 고분자가 직쇄인지 또는 분지쇄인지, 반응 조건 등과 같은 인자를 고려하여 최적의 비율(반응 효과 측면에서, 반응안된 성분 또는 고분자가 많이 없도록)을 결정할 수 있을 것이다.The number of polymers that can be attached to GAVE19 varies widely, and those skilled in the art will be able to ascertain the effect on function. Those skilled in the art will be able to conduct derivatization reactions with mono, di-, tri-, tetra derivatives or other combinations using the same or different chemical groups (eg, using polymers such as polyethylene glycols having different molecular weights). The ratio of polymers to GAVE19 molecules can also vary widely and their concentrations in the reaction mixture can vary. In general, the optimal ratio (in terms of reaction effects, unreacted components) takes into account factors such as the desired degree of derivatization (eg, mono, di, tri, etc.), the molecular weight of the selected polymer, whether the polymer is straight or branched, and the reaction conditions. Or so that there are not a lot of polymers).
GAVE19에 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학기)가 부착될 경우에 GAVE19의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려해야 한다. 당업자가 이용할 수 있는 몇 가지 부착 방법이 있는데, 예를 들면, EP 0 401 384(참고문헌으로 첨부)에서 설명하는 PEG를 G-CSF에 결합시키는 것과, Malik 등., 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035에서 설명하는 염화 트레실을 이용한 GM-CSF 페글리에이션(peglyation) 등이 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 자유 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기를 통하여 아미노산 잔기에 공유적으로 결합될 수 있다. 반응기는 활성을 가진 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합할 수 있는 기를 말한다. 자유 아미노기를 가지는 아미노산 잔기에는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기가 있고, 자유 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기에는 아스파르트산, 글루탐산, C-말단 아미노산 잔기가 포함된다. SH기는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키기 위한 반응기로도 이용할 수 있다. 치료 목적으로 적절한 것은 N-말단 또는 리신기와 같은 아미노기에 결합시키는 것이다.When polyethylene glycol molecules (or other chemical groups) are attached to GAVE19, the effect on the functional or antigenic domains of GAVE19 should be considered. There are several methods of attachment available to those skilled in the art, for example, combining PEG described in EP 0 401 384 (referenced by reference) to G-CSF, Malik et al., 1992, Exp. Hematol. GM-CSF peglyation using tresyl chloride as described at 20: 1028-1035. For example, polyethylene glycol can be covalently linked to amino acid residues via a reactor such as a free amino group or a carboxy group. A reactor refers to a group to which an active polyethylene glycol molecule can bind. Amino acid residues having free amino groups include lysine residues and N-terminal amino acid residues, and amino acid residues having free carboxyl groups include aspartic acid, glutamic acid and C-terminal amino acid residues. The SH group can also be used as a reactor for attaching polyethylene glycol molecules. Suitable for therapeutic purposes is binding to an amino group, such as an N-terminal or lysine group.
특별히 N-말단이 화학적으로 변형된 GAVE19를 원할 수도 있다. 본 발명의 조성물로써 설명된 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 당업자는 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지쇄 등), 반응 혼합물에서 GAVE19 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 비율, 실행되는 페글리에이션(pegylation) 반응 타입, 선별된 N-말단 페글리에이션화된 단백질 분자를 얻는 방법 등에서 선택할 수 있을 것이다. N-말단 페글리에이션화된 조제물을 수득하는 방법(가령, 필요에 따라 다른 모노페글리에이션화된 부분에서 분리시키는 방법)은 페글리에이션화된 단백질 분자군으로부터 N-말단 페글리에이션화된 물질을 정제하는 것이다. GAVE19에서 유도화 반응에 이용할 수 있는 다른 타입의 1차 아미노기(리신 대 N-말단)의 차등적인 반응성을 이용하는 환원성 알킬화반응으로 선택적-N-말단 화학적 변형시킬 수 있다. 적절한 반응 조건하에 고분자를 포함하는 카르보닐기와 N-말단에서 선택적인 GAVE19 유도화 반응을 실시할 수 있다. 예를 들면, 리신 잔기의 ε아미노기와 GAVE19의 N-말단 잔기의 α아미노기의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 반응시켜, 선택적으로 N-말단을 페글리에이션(pegylate)시킬 수 있다. 이와 같은 선택적 유도화 반응에 의해, GAVE19에 수용성 고분자가 부착 되는 것을 조절할 수 있다. GAVE19의 N-말단에서 고분자와의 결합이 주로 일어나고, 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기는 크게 변형되지 않는다. 환원성 알킬화반응을 이용하여, 수용성 고분자는 상기에서 설명하는 것과 같은 것이 될 수 있으며, GAVE19에 결합하기 위해 단일 반응성 알데히드기를 가질 수 있다. 한 개의 반응기 알데히드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 프로프리온알데히드를 이용할 수도 있다.In particular, one may want GAVE19 with a chemically modified N-terminus. Using the polyethylene glycol described as the composition of the present invention, those skilled in the art will appreciate that various polyethylene glycol molecules (molecular weight, branched chain, etc.), the ratio of polyethylene glycol to GAVE19 molecules in the reaction mixture, the type of pegylation reactions carried out, Or a method of obtaining the selected N-terminal pegylated protein molecule. Methods of obtaining N-terminal pegylated preparations (eg, separation from other monopegylated moieties as needed) may be achieved by N-terminal pegylated from a group of pegylated protein molecules. To refine the material. Selective-N-terminal chemical modification can be achieved by reductive alkylation utilizing the differential reactivity of other types of primary amino groups (lysine to N-terminus) available for derivatization in GAVE19. Under appropriate reaction conditions, selective GAVE19 derivatization at the N-terminus with the carbonyl group comprising the polymer can be carried out. For example, the N-terminus can be selectively PEGylated by reacting at a pH where the pKa difference between the ε amino group of the lysine residue and the α amino group of the N-terminal residue of GAVE19 is available. By such selective induction reaction, it is possible to control the adhesion of the water-soluble polymer to GAVE19. Bonding with the polymer occurs mainly at the N-terminus of GAVE19, and other reactors, such as lysine side chain amino groups, are not significantly modified. Using reductive alkylation, the water soluble polymer may be as described above and may have a single reactive aldehyde group to bind to GAVE19. Polyethylene glycol propionaldehyde containing one reactor aldehyde may be used.
GAVE19의 항체, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 유사체 및 유도체Antibodies, variants thereof, fragments thereof or analogs and derivatives thereof of GAVE19
폴리클로날 및 모노클로날 항체를 만드는데 이용되는 표준 기술에 따라 분리된GAVE19 단백질 또는 이의 일부 또는 이의 단편을 면역원으로 이용하여, GAVE19에 결합하는 항체를 만들 수 있다. 여기에서 사용되는 “항체”는 면역글로블린 분자 및 이의 면역학적 활성 부분, 가령, GAVE19와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원결합 부분을 가지는 분자 또는 이의 단편을 의미한다. GAVE19에 특이적으로 결합하는 분자는 GAVE19에 결합하나 시료에 있는 다른 분자, 예를 들면, GAVE19 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 있는 다른 분자에는 실제 결합하지 않는 분자가 된다. 면역글로블린 분자의 면역학적으로 활성을 가진 부분은 예로 들면, F(ab)및 F(ab')2단편이 될 수 있는데, 펩신과 같은 효소로 항체를 처리하여 생성되는 단편들이다. 본 발명은 GAVE19에 결합할 수 있는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 키메라항체, 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체를 면역원으로 제공한다.An isolated GAVE19 protein or a portion or fragment thereof according to standard techniques used to make polyclonal and monoclonal antibodies can be used as an immunogen to make antibodies that bind to GAVE19. As used herein, “antibody” refers to a molecule or fragment thereof having an immunoglobulin molecule and an immunologically active portion thereof, such as an antigen binding portion that specifically binds to an antigen such as GAVE19. A molecule that specifically binds to GAVE19 is a molecule that binds to GAVE19 but does not actually bind to another molecule in the sample, such as another molecule in a biological sample containing the GAVE19 protein. Immunologically active portions of immunoglobulin molecules can be, for example, F (ab) and F (ab ') 2 fragments, which are fragments produced by treating antibodies with enzymes such as pepsin. The present invention provides polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, variants, fragments, analogs or derivatives thereof capable of binding GAVE19 as immunogens.
전장 GAVE19 단백질을 면역원으로 사용할 수 도 있고, 대안으로 GAVE19의 항원성 펩티드 단편을 면역원으로 제공할 수 있다. GAVE19의 항원성 펩티드는 서열 2 에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 8개 (적절하게는 10개, 15개, 20개, 30개 또는 그 이상) 아미노산 잔기로 구성되고, GAVE19의 에피토프를 포함하여, 펩티드에 대해 생성되는 항체가 GAVE19와 특이적인 면역 복합체를 형성한다.The full length GAVE19 protein may be used as an immunogen, or alternatively an antigenic peptide fragment of GAVE19 may be provided as an immunogen. The antigenic peptide of GAVE19 consists of at least eight (appropriately ten, fifteen, twenty, thirty or more) amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, including an epitope of GAVE19, Antibodies produced against these form an immune complex specific for GAVE19.
GAVE19 면역원을 일반 적정한 개체(가령, 토끼, 염소, 쥐 또는 다른 포유류)에 면역주사하여 항체를 만든다. 가령, 적절한 면역원 준비물에는 재조합에 의해 발현되는 GAVE19 단백질 또는 화학적으로 합성되는 GAVE19 폴리펩티드가 포함된다. 준비물에는 프룬트(Freund) 완전한 백신보조제 또는 불완전한 백신 보조제 또는 유사한 면역자극제가 추가 포함된다. 면역원성 GAVE19 준비물을 적절한 개체에 예방주사하면 폴리클로날 항 GAVE19 항체 반응을 유도할 수 있다.Antibodies are made by immunizing a GAVE19 immunogen to a general titer (eg rabbit, goat, rat or other mammal). For example, suitable immunogen preparations include recombinantly expressed GAVE19 protein or chemically synthesized GAVE19 polypeptide. The preparation further includes Freund's complete vaccine adjuvant or incomplete vaccine adjuvant or similar immunostimulatory agent. Immunization of an immunogenic GAVE19 preparation with the appropriate subject can induce a polyclonal anti-GAVE19 antibody response.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메라 항체가 될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같은 “모노클로날 항체” 또는 “모노클로날 항체조성물”이란 GAVE19의 특정 에피토프와 면역작용을 할 수 있는 한 종류의 항원결합 부위만을 가지는 항체 분자 군을 의미한다. 따라서, 모노클로날 항체 조성물은 일반적으로 특정 GAVE19 단백질 에티토프에 단일 결합 친화성을 나타낸다.Antibodies of the invention can be monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or chimeric antibodies. As used herein, "monoclonal antibody" or "monoclonal antibody composition" refers to a group of antibody molecules having only one type of antigen binding site capable of immunizing with a specific epitope of GAVE19. Thus, monoclonal antibody compositions generally exhibit a single binding affinity for certain GAVE19 protein etiope.
GAVE19 면역원을 적절한 개체에 예방주사 처리하여 상기에서 설명하는 것과 같은 폴리클로날 항GAVE19 항체를 만들 수 있다. 고정된 GAVE19를 이용한 효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA)를 이용하는 등의 표준 방법에 따라 예방주사를 맞은 개체에서 시간 경과에 따른 항GAVE19 항체 역가를 모니터할 수 있다. 원하는 경우에, 포유류로부터(주로 혈액으로부터) GAVE19에 대한 항체 분자를 분리해내고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 따라 추가 정제시켜 IgG 부분을 얻을 수 있다. 예방주사후 적절한 시간때, 가령, 항GAVE19 항체 역가가 최고치에 있을 때, 만든 항체-생성 세포를 개체로부터 수득하여, Kohler 등., Nature(1975) 256:495497 에서 설명하는 하이브리도마 기술; 사람 B 세포 하이브리도마 기술(Kohler 등., Immunol Today (1983) 4:72); EBV 하이브리도마 기술(Cole 등., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 7796); 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 따라 모노클로날 항체를 준비한다. 하이브리도마를 만드는 기술은 공지된 것이다(Current Protocols in Immunology (1994)Coligan 등., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 간략하게 설명하면, 상기에서 설명한 것과 같이, GAVE19 면역원으로 예방주사 맞은 포유류에서 취한 임파세포(주로 지라세포)에 불멸 세포주(일반적으로 골수종)를 융합시킨 다음 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝하여, GAVE19에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인한다.GAVE19 immunogens can be immunized with appropriate subjects to produce polyclonal anti-GAVE19 antibodies as described above. Anti-GAVE19 antibody titers can be monitored over time in vaccinated subjects according to standard methods such as using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with immobilized GAVE19. If desired, antibody molecules against GAVE19 can be isolated from mammals (mainly from blood) and further purified according to well known techniques such as protein A chromatography to obtain IgG portions. Antibody-producing cells made at an appropriate time after vaccination, such as when anti-GAVE19 antibody titers are at their highest, are obtained from the subject and the hybridoma technique described in Kohler et al., Nature (1975) 256: 495497; Human B cell hybridoma technology (Kohler et al., Immunol Today (1983) 4:72); EBV hybridoma technology (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 7796); Prepare monoclonal antibodies according to standard techniques such as trioma technique. Techniques for making hybridomas are known (Current Protocols in Immunology (1994) Colingan et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Briefly, as described above, immunizing an immortal cell line (usually myeloma) with lymphoid cells (usually splenic cells) taken from a mammal vaccinated with a GAVE19 immunogen and then screening the culture supernatant of the resulting hybridoma cells Thus, hybridomas producing monoclonal antibodies that bind GAVE19 are identified.
임파세포와 불멸화된 세포주를 융합시키는 많은 공지의 프로토콜중 임의의 것을 항GAVE19 모노클로날 항체를 생성시키는 목적에 이용할 수도 있다(Current Protocols in Immunology, 상기 참조; Galfre 등., Nature (1977) 266:550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); 및 Lerner, Yale J Biol Med (1981) 54:387-402). 또한, 당업자는 이와 같은 방법을 다양하게 변화시켜 유용하게 이용할 수 있을 것이다. 일반적으로 불멸 세포주(가령, 골수종 세포주)는 임파세포와 같은 동일한 포유류에서 취한다. 예를 들면, 불멸화된 마우스 세포주 가령, 하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함하는 배양 배지(“HAT 배지”)에 민감한 골수종 세포주와 본 발명의 면역학적 준비물로 예방주사를 맞은 마우스의 임파세포를 융합시켜, 뮤린(murine) 하이브리도마를 만들 수 있다. 표준 기술에 따라 융합 짝으로 임의 골수종 세포주를 이용할 수 있는데, 예를 들면, P3-NS1/l-Ag4-1, P3x63-Ag8.653, Sp2/O-Agl4 골수종 세포를 이용할 수 있다. 골수종 세포주는 ATCC 에서 구할 수 있다. 일반적으로 HAT 민감성 마우스 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜(“PEG”)를 이용하여 마우스 지라세포에 융합시킨다. 융합안된 세포 및 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 죽이는(융합안된 지라세포는 형질전환되지 않았기 때문에 몇일 후에 죽는다) HAT 배지를 이용하여, 융합으로 생성된 하이브리도마 세포만 골라낸다. 표준 ELISA 분석 방법을 이용하여, GAVE19에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝하여, 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 검출한다.Any of a number of known protocols for fusing lymphocytes and immortalized cell lines may be used for the purpose of generating anti-GAVE19 monoclonal antibodies (Current Protocols in Immunology, supra; Galfre et al., Nature (1977) 266: 550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, NY (1980); and Lerner, Yale J Biol Med (1981) 54: 387-402). In addition, those skilled in the art will be able to use various methods by changing the method. Immortal cell lines (eg, myeloma cell lines) are generally taken from the same mammals as lymphocytes. For example, lymphomas of myeloma cell lines sensitive to immortalized mouse cell lines such as culture medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine (“HAT medium”) and mice vaccinated with immunological preparations of the present invention. The cells can be fused to make murine hybridomas. Any myeloma cell line can be used as a fusion partner according to standard techniques, for example P3-NS1 / l-Ag4-1, P3x63-Ag8.653, Sp2 / O-Agl4 myeloma cells. Myeloma cell lines are available from ATCC. In general, HAT sensitive mouse myeloma cells are fused to mouse splenocytes using polyethylene glycol (“PEG”). Only fusion-produced hybridoma cells are selected using HAT medium, which kills unfused cells and non-productive fused myeloma cells (unfused splenocytes die after a few days because they have not been transformed). Hybridoma culture supernatants are screened for antibodies binding to GAVE19 using standard ELISA assay methods to detect hybridoma cells producing the monoclonal antibodies of the invention.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 만드는 또 다른 방법은 GAVE19로 재조합 복합 면역글로블린 라이브러리(가령, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 모노클로날 항GAVE19 항체를 확인 및 분리하여, GAVE19에 결합할 수 있는 면역글로블린을 분리한다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 키트도 시판되고 있다(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 279-400-01; Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog 240612).Another method of making hybridomas that secrete monoclonal antibodies is to screen recombinant recombinant immunoglobulin libraries (eg, antibody phage display libraries) with GAVE19 to identify and isolate monoclonal anti-GAVE19 antibodies to bind to GAVE19. Isolate immunoglobulins. Kits for making and screening phage display libraries are also commercially available (Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 279-400-01; Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog 240612).
또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는데 이용할 수 있는 방법 및 시약들은 다음의 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 미국 특허 5,223,409; PCT 공보 WO 92/18619; PCT 공보 WO 91/17271; PCT 공보 WO 92/20791; PCT 공보 WO 92/15679; PCT 공보 WO 93/01288; PCT 공보 WO 92/01047; PCT 공보 WO 92/09690; PCT 공보 WO 90/02809; Fuchs 등., Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay 등., Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:81-85; Huse 등., Science (1989) 246:1275-1281; Griffiths 등., EMBO J (1993) 25(12):725-734.In addition, methods and reagents that can be used to make and screen antibody display libraries can be found in the literature. U.S. Patent 5,223,409; PCT publication WO 92/18619; PCT publication WO 91/17271; PCT publication WO 92/20791; PCT publication WO 92/15679; PCT publication WO 93/01288; PCT publication WO 92/01047; PCT publication WO 92/09690; PCT publication WO 90/02809; Fuchs et al., Bio / Technology (1991) 9: 1370-1372; Hay et al., Hum Antibody Hybridomas (1992) 3: 81-85; Huse et al., Science (1989) 246: 1275-1281; Griffiths et al., EMBO J (1993) 25 (12): 725-734.
또한, 키메라 및 모노클로날 항체와 같은 재조합 항GAVE19 항체는 인체에서유도된 부분과 아닌 부분으로 구성되는데, 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다. 키메라 및 모노클로날 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있는데, 예를 들면, 다음에서 설명하는 기술을 이용할 수 있다. PCT 공보WO 87/02671; 유럽 특허출원 184,187; 유럽특허출원 171,496; 유럽특허출원 173,494; PCT 공보 WO 86/01533; 미국 특허 4,816,567; 유럽특허출원 125,023; Better 등., Science (1988) 240:1041-1043; Liu 등., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443; Lin 등., J Immunol (1987) 139:3521-3526; Sun 등., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218; Nishimura 등., Canc Res (1987) 47:999-1005; Wood 등., Nature (1985) 314:446-449; Shaw 등., J Natl Cancer Inst (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi 등., Bio/Techniques (1986) 4:214; 미국 특허5,225,539; Jones 등., Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan 등., Science (1988) 239:1534; Beidler 등., J Immunol (1988) 141:4053-4060.In addition, recombinant anti-GAVE19 antibodies, such as chimeric and monoclonal antibodies, consist of portions derived from and not derived from the human body, which antibodies can be made using standard recombinant DNA techniques. Chimeric and monoclonal antibodies can be made using recombinant DNA techniques known in the art, for example, the techniques described below can be used. PCT Publication WO 87/02671; European Patent Application 184,187; European Patent Application 171,496; European Patent Application 173,494; PCT publication WO 86/01533; U.S. Patent 4,816,567; European Patent Application 125,023; Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 3439-3443; Lin et al., J Immunol (1987) 139: 3521-3526; Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 214-218; Nishimura et al., Canc Res (1987) 47: 999-1005; Wood et al., Nature (1985) 314: 446-449; Shaw et al., J Natl Cancer Inst (1988) 80: 1553-1559; Morrison, Science (1985) 229: 1202-1207; Oi et al., Bio / Techniques (1986) 4: 214; U.S. Patent 5,225,539; Jones et al., Nature (1986) 321: 552-525; Verhoeyan et al., Science (1988) 239: 1534; Beidler et al., J Immunol (1988) 141: 4053-4060.
친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 GAVE19를 분리하는데 항GAVE19 항체(모노클로날 항체)를 이용할 수 있다. 세포로부터 천연 GAVE19를 정제 및 숙주세포에서 발현된 재조합에 의해 생산된 GAVE19를 정제할 때 항GAVE19 항체를 실행할 수 있다. 또한, GAVE19 단백질의 풍부성 및 패턴을 평가하기 위해 (세포 용해물질 또는 세포 상청액내에) 항GAVE19 항체를 이용하여 GAVE19 단백질을 검출한다. 임상적인 테스트 과정 예를 들면, 주어진 치료 과정의 효과를 평가하는 일부 과정으로 단백질 수준을 모니터하는데 진단학적으로 항GAVE19 항체를 이용할 수 있다. 항체에 검출 가능한 물질(하기에서 설명하는)을 결합시켜 검출할 수 있다.Anti-GAVE19 antibodies (monoclonal antibodies) can be used to separate GAVE19 by standard techniques such as affinity chromatography or immunoprecipitation. Anti-GAVE19 antibodies can be performed when purifying native GAVE19 from cells and purifying GAVE19 produced by recombination expressed in host cells. In addition, GAVE19 protein is detected using an anti-GAVE19 antibody (in cell lysate or cell supernatant) to assess the abundance and pattern of GAVE19 protein. Clinical Test Procedures For example, anti-GAVE19 antibodies can be used diagnostically to monitor protein levels as part of evaluating the effectiveness of a given therapeutic course. Detection can be performed by binding a detectable substance (described below) to the antibody.
검출 가능한 표지Detectable label
임의로, 본 발명의 분리된 핵산 분자, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 항체 및 이들 분자 단편에 검출 가능한 표지를 선택적으로 결합시킬 수도 있다. 적절한 표지에는 효소, 형광발색단(가령, 플루오로레신 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 자유 또는 킬레이트화된 란타니드 시리즈 염, 특히, Eu3+, 발색단, 방사능동위원소, 킬레이팅제, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자, 리간드(바이오틴), 생발광 물질, 화학적 발광물질 등이 포함된다. 기준 물질도 마커를 하는 경우 수용체 및 기준 물질에 동일한 또는 다른 표지를 이용할 수 있다.Optionally, detectable labels may also be selectively linked to isolated nucleic acid molecules of the invention, polypeptides of the invention, antibodies of the invention and these molecular fragments. Suitable labels include enzymes, fluorophores such as fluororesin isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), Texas red (TR), rhodamine, free or chelated lanthanide series salts, in particular Eu3 + , Chromophores, radioisotopes, chelating agents, dyes, colloidal gold, latex particles, ligands (biotin), bioluminescent materials, chemiluminescent materials, etc. When the reference material is also a marker, Or other labels may be used.
방사능활성 표지 가령, 동위원소,3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,131I,125I,186Re를 이용하는 경우, 현재 공지의 이용가능한 카운팅 과정을 이용한다. 효소를 표지로 사용하는 경우, 당분야에 공지된 현재 이용할 수 있는 발색, 분광광도계, 형광광도계, 전류검출, 가스검출 기술을 이용하여 검출할 수 있다.When using radioactive labels such as isotopes, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 131 I, 125 I, 186 Re, Use the currently known counting process. When the enzyme is used as a label, it can be detected using currently available colorimetric, spectrophotometer, fluorescence photometer, current detection, gas detection techniques known in the art.
본 발명에 따라서 이용할 수 있는 표지화 방법중 한 가지 방법이 직접 표지시키는 것이다. 직접 표지화하는 것은 전문에서 정의된 바와 같이, 자연상태에서 육안으로 또는 광학 필터 또는 자극을 통하여 바로 확인할 수 있는 것을 말하는데,예를 들면, UV광으로 형광을 촉진시키는 것을 말한다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 색을 가지는 표지에는 Leuvering (미국 특허 4,313,734)에서 설명하는 금으로된 졸(sole) 입자와 같은 금속성 졸 입자; Gribnau 등.(미국 특허 4,373,932)와 May 등. (WO 88/08534)에서 설명하는 염료 졸 입자; May,상기 참조, Snyder (EPA 0 280 559; 0 281 327)에서 설명하는 염색된 라텍스; Campbell 등. (미국 특허4,703,017)에서 설명된 리포좀에 포집된 염료등이 포함될 수 있다. 이외의 다른 직접 표지화에는 방사능 뉴클레오티드, 형광 기 또는 발광 기등이 포함된다. 이와 같은 직접 표지 디바이스들에 추가하여, 효소로 구성된 간접 표지화를 본 발명에서 이용할 수도 있다. 당분야에는 다양한 형태의 효소 연결된 면역분석이 공지되어 있는데, 예를 들자면, 알칼리 포스포타제, 양고추냉이 과산화효소, 라이소자임, 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로게나제, 락테이트 디하이드로게나제, 우레아제 및 다른 효소 등이 Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT inMethods in Enzymology,70. 419-439, 1980; 미국 특허 4,857,453에서 상세하게 설명되고 있다.One of the labeling methods available according to the invention is direct labeling. Direct labeling refers to what can be seen immediately in the natural state or visually through an optical filter or stimulus, as defined in the preamble, for example, to promote fluorescence with UV light. The colored labels usable in accordance with the present invention include metallic sol particles such as gold sol particles described in Leuvering (US Pat. No. 4,313,734); Gribnau et al. (US Pat. No. 4,373,932) and May et al. Dye sol particles described in (WO 88/08534); Dyed latex as described in May, supra , Snyder (EPA 0 280 559; 0 281 327); Campbell et al. Dyes entrapped in liposomes described in US Pat. No. 4,703,017. Other direct labeling includes radio nucleotides, fluorescent groups or luminescent groups. In addition to such direct labeling devices, indirect labeling consisting of enzymes may be used in the present invention. Various forms of enzyme linked immunoassays are known in the art, for example alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, lysozyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, urease And other enzymes are described in Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology , 70 . 419-439, 1980; It is described in detail in US Pat. No. 4,857,453.
본 발명에 이용할 수 있는 다른 표지로는 자성 비드 또는 자성 공명 영상 표지들이 포함된다.Other labels that can be used in the present invention include magnetic beads or magnetic resonance imaging labels.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 본 발명의 항체, 이의 단편에 인산화 반응 부위를 만들어32P로 표지시킨다. (예: 유럽 특허 0372707 또는 미국 특허5,459,240(Foxwell 등의 이름으로 1995년 10월 17일 등록)에서 설명하였음).In another embodiment, a phosphorylation site is made at an isolated polypeptide of the invention, an antibody of the invention, a fragment thereof, and labeled with 32 P. (E.g., as described in European Patent 0372707 or U.S. Patent 5,459,240, registered October 17, 1995 in the name of Foxwell et al.).
여기에서 예시한 바와 같이, 대사적 표지를 이용하여 항체를 포함한 단백질에 표지시킬 수 있다. 대사적 표지란 [35S] 메티오닌 또는 [32P]오르토포스페이트 등의 대사적 표지가 보충된 배양 배지에서 단백질을 발현시키는 세포를 시험관내 배양시키는 동안 생성되는 표지이다. [35S] 메티오닌을 이용한 대사적(또는 생합성) 표지에 추가하여, 본 발명에서는 [14C] 아미노산 및 [3H] 아미노산(안정적 위치에서 3중수소로 치환된)으로 표지시키는 것도 고려할 수 있다.As exemplified herein, metabolic labels can be used to label proteins including antibodies. A metabolic label is a label produced during in vitro culture of cells expressing a protein in a culture medium supplemented with a metabolic label such as [ 35 S] methionine or [ 32 P] orthophosphate. In addition to metabolic (or biosynthetic) labels with [ 35 S] methionine, labeling with [ 14 C] amino acids and [ 3 H] amino acids (substituted with tritium at stable positions) is also contemplated in the present invention.
재조합 발현벡터 및 숙주 세포Recombinant Expression Vectors and Host Cells
본 발명의 다른 측면에는 벡터, 바람직하게는 GAVE19(또는 이의 일부분)을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 벡터의 한 가지 형태는 “플라스미드”로써 추가 DNA 단편이 연결된 루프 모양의 이본쇄 DNA를 말한다. 또 다른 형태의 벡터는 바이러스성 벡터로써 추가 DNA 단편이 바이러스성 게놈에 연결되어 있다. 특정 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(가령, 세균 벡터는 세균성 복제 오리진 및 에피좀성 포유류 벡터를 가진다). 다른 벡터(가령, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈에 결합하여, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 발현 벡터는 유전자 발현이 작동 가능하게 연결되도록 할 수 있다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 플라스미드(벡터) 형태가 유용한 발현 벡터이다. 그러나, 본 발명에는 다른 발현 예를 들면, 등가의 기능을 할 수 있는 바이러스성 벡터(복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스) 등도 포함된다.Another aspect of the invention includes an expression vector comprising a nucleic acid encoding a vector, preferably GAVE19 (or a portion thereof). As described above, one form of the vector is a "plasmid," which refers to a loop-shaped double stranded DNA to which additional DNA fragments are linked. Another type of vector is a viral vector in which additional DNA fragments are linked to the viral genome. Certain vectors can autonomously replicate in host cells (eg, bacterial vectors have bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) bind to the genome of the host cell upon introduction into the host cell and replicate with the host genome. In addition, expression vectors may allow gene expression to be operably linked. Generally, plasmid (vector) forms are useful expression vectors in recombinant DNA techniques. However, the present invention also includes other expressions, such as viral vectors (replicative deletion retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses), etc., which may function equivalently.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 적절히 발현될 수 있는 형태의 핵산으로 구성된다. 본 발명의 재조합 발현 벡터에는 숙주 세포에 근거하여 선별된 한 가지 이상의 조절 서열이 포함되어 발현될 핵산에 실시가능 하도록 연결되어 있다. 재조합 발현 벡터내에 “ 작동 가능하게 연결된”이란 소요의 뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 연결되어, 뉴클레오티드 서열이 발현(가령, 시헌관내전사/해독 시스템 또는 숙주세포내로 벡터가 도입되었을 때 숙주 세포내에서 발현)되는 것을 말한다. “조절 서열”은 프로모터, 인핸서, 다른 발현 조절 요소(가령, 폴리아데닐화 시그날 등)를 말한다. 이와 같은 조절 서열은 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명하고 있다. 조절 서열은 다양한 형태의 숙주세포(가령, 조직 특이적인 조절 서열)에서 핵산 서열의 직접적인 구성 발현에 관계한다. 당업자는 형질전환되는 숙주 세포, 소요 단백질의 발현 수준 등의 선택 인자에 따라 발현 벡터의 양상이 달라진다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 본 발명의 발현 벡터가 숙주 세포내로 유도되어, 상기한 바의 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드(가령, GAVE19 단백질, GAVE19의 돌연변이형, 융합 단백질 등)가 생산된다.The recombinant expression vector of the present invention consists of a nucleic acid in a form that can be appropriately expressed in a host cell. The recombinant expression vector of the present invention includes one or more regulatory sequences selected based on the host cell and is linked to the nucleic acid to be expressed. “Operably linked” within a recombinant expression vector is linked to a regulatory sequence so that the nucleotide sequence is expressed (eg , in a host cell when the vector is introduced into a constitutive transcription / detoxification system or host cell). Say something. “Regulatory sequence” refers to a promoter, enhancer, other expression control element (eg, polyadenylation signal, etc.). Such regulatory sequences are described in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences relate to direct constitutive expression of nucleic acid sequences in various forms of host cells (eg, tissue specific regulatory sequences). Those skilled in the art will appreciate that the appearance of the expression vector depends on the factors of choice, such as the host cell to be transformed, the level of expression of the required protein, and the like. The expression vector of the present invention is induced into a host cell to produce a protein or peptide (e.g., GAVE19 protein, mutant of GAVE19, fusion protein, etc.) encoded by the nucleic acid as described above.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 진핵세포 또는 원핵세포 가령, 대장균(E. coli), 곤충 세포(베큘로바이러스 발현 벡터이용)와 같은 세균 세포, 효모 세포, 포유류 세포에서 GAVE19가 발현될 수 있도록 만들어질 수 있다. 적절한 숙주 세포는 Goeddel, 상기 참조에 기재되어 있다. 대안으로, T7 프로모터 또는 T7 폴리메라제와 같은 파아지 조절 요소 및 단백질을 이용하여시험관내에서 재조합 발현 벡터가 전사 및 해독된다.The recombinant expression vector of the present invention can be made to express GAVE19 in eukaryotic or prokaryotic cells such as E. coli , bacterial cells, yeast cells, mammalian cells, such as insect cells (using baculovirus expression vectors). Can be. Suitable host cells are described in Goeddel, supra. Alternatively, recombinant expression vectors are transcribed and translated in vitro using phage regulatory elements and proteins such as T7 promoter or T7 polymerase.
원핵세포에서의 단백질 발현은 대부분의 경우에 융합 또는 비융합 단백질을 발현시키는 구성 또는 유도 프로모터를 포함하고 있는 벡터에 의해 대장균(E. coli)에서 실시한다. 융합 벡터는 벡터내에 암호화되어 있는 단백질에 재조합 단백질의 주로 아미노 말단에 다수의 아미노산을 추가시킨다. 이와 같은 융합 벡터는 일반적으로 세 가지 목적으로 이용되는데 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 3) 친화성 정제시 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는 목적으로 이용된다. 또한, 융합 발현 벡터에서, 원핵성 절단 부위를 융합 부분과 재조합 부분이 만나는 위치에 도입시켜, 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있도록 하여, 융합 단백질로부터 재조합 단백질을 정제시킬 수 있다. 이와 같은 효소 및 동족 인지 서열에는 Factor Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 등이 포함된다. 전형적인 융합 발현 벡터에는 표적 재조합 단백질에 대해 글루타티온-5-트란스퍼라제 (GST)를 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 등., Gene (1988) 67:3140), 표적 단백질에 말토즈 E결합 단백질을 융합시키는 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), 표적 단백질에 단백질 A를 융합시키는 pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ)등이 포함된다.Protein expression in prokaryotic cells is in most cases carried out in E. coli by a vector comprising a constitutive or inducible promoter that expresses a fusion or non-fusion protein. Fusion vectors add a number of amino acids at the predominantly amino terminus of the recombinant protein to the protein encoded in the vector. Such fusion vectors are generally used for three purposes: 1) to increase expression of recombinant protein; 2) increase the solubility of the recombinant protein; 3) It is used for the purpose of helping to purify recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification. In addition, in a fusion expression vector, a prokaryotic cleavage site may be introduced at a position where the fusion moiety and the recombination moiety can be used to separate the recombinant protein from the fusion moiety, thereby purifying the recombinant protein from the fusion protein. Such enzymes and cognate recognition sequences include Factor Xa, thrombin, enterokinase and the like. Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene (1988) 67: 3140), which fuses glutathione-5-transferase (GST) against a target recombinant protein, a Maltose E binding protein to the target protein. PMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), Which fuses protein, and pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ), which fuses protein A to a target protein.
적절한 유도성 비융합E. coli발현 벡터에는 pTrc (Amann 등., Gene (1988) 69:301-315); pET 11d (Studier 등., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:6089)등이 포함된다. 하이브리드화 trplac 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 폴리메라제 전사에 따라 pTrc 벡터로부터 표적 유전자 발현 정도가 달라진다.Suitable inducible non-fusion E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69: 301-315); pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185: 6089). Depending on the host RNA polymerase transcription from the hybridized trplac fusion promoter, the degree of target gene expression from the pTrc vector varies.
대장균(E. coli)에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키는 한 가지 방법은 재조합 단백질을 분해 절단시키는 능력이 손상된 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 것이다.(Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:119-128). 또 다른 방법은 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산 분자의 핵산 서열을 변경시켜, 각 아미노산의 개별 코돈을 대장균(E. coli)에서 선호적으로 이용하도록 하는 것이다(Wada 등., Nucleic Acids Res (1992) 20:2111-2118). 표준 DNA 합성 기술을 이용하여 본 발명의 핵산 서열을 변경시킬 수 있다.One way to maximize recombinant protein expression in E. coli is to express the recombinant protein in a host cell that has been impaired in cleaving and cleaving the recombinant protein (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185: 119-128. Another method is to alter the nucleic acid sequence of the nucleic acid molecule that is inserted into the expression vector so that the individual codons of each amino acid are favorably used in E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res (1992) 20 : 2111-2118). Standard DNA synthesis techniques can be used to alter the nucleic acid sequences of the present invention.
또 다른 구체예에서, GAVE19 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 사카로마이세스 세르비시에(S. cerevisiae)와 같은 효모에서의 발현 벡터에는 pYepSecl (Baldari 등., EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등이 포함된다.In another embodiment, the GAVE19 expression vector is a yeast expression vector. Expression vectors in yeasts such as S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), PPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.) And the like.
대안으로, 베큘로바이러스 벡터를 이용하여 곤충세포에서 GAVE19를 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (Sf 9 세포)에서 단백질 발현에 이용될 수 있는 베큘로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈(Smith 등., Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow 등., Virology (1989) 170:31-39)가 포함된다.Alternatively, baculovirus vectors can be used to express GAVE19 in insect cells. The baculovirus vectors that can be used for protein expression in cultured insect cells (Sf 9 cells) include the pAc series (Smith et al., Mol Cell Biol (1983) 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow et al., Virology). (1989) 170: 31-39).
또 다른 구체예에서, 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현시킬 수도 있다. 포유류 발현 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 등., EMBO J (1987) 6:187195)이 포함되지만, 이것으로만 국한되지 않는다. 포유류 세포를 이용하는 경우에, 발현 벡터의 조절 기능이 바이러스 조절 요소에 의해 제공되는 경우도 있다. 예를 들면, 통상적으로 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 원숭이 바이러스 40등에서 유도된 것들이다. 진핵 및 원핵 세포에 적절한 다른 발현 시스템으로는 상기 언급된 Sambrook 등., chapters 16 및 17 를 참고하면 된다.In another embodiment, a mammalian expression vector can also be used to express a nucleic acid according to the invention in a mammalian cell. Mammalian expression vectors include, but are not limited to, pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187195). In the case of using mammalian cells, the regulatory function of the expression vector is sometimes provided by viral regulatory elements. For example, commonly used promoters are those derived from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus, monkey virus 40 and the like. Other expression systems suitable for eukaryotic and prokaryotic cells can be found in Sambrook et al., Chapters 16 and 17, above.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 형을 선호하는 핵산 발현을 지시할 수 있다(가령, 핵산을 발현시키는데 조직 특이적인 조절 요소들이 이용된다). 조직 특이적인 조절 요소들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 적절한 조직 특이적인 프로모터에는 알부민 프로모터(간 특이적 프로모터; Pinkert 등., Genes Dev (1987) 1:268-277), 임파구 특이적 프로모터(Calame 등., Adv Immunol (1988) 43:235-275), 특히, T 세포 수용체 프로모터(Winoto 등., EMBO J (1989) 8:729-733) 및 면역글로블린(Banerji 등., Cell (1983) 33:729-740; Queen 등., Cell (1983) 33:741-748), 신경 특이적인 프로모터(신경필라멘트 프로모터; Byrne 등., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:5473-5477), 췌장 특이적인 프로모터 (Edlund 등., Science (1985) 230:912-916) 및 유선 특이적인 프로모터(우유 유장 프로모터; 미국 특허 4,873,316; 유럽 출원 264,166)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 발생학적으로 조절된 프로모터 또한 포함되는데, 예를 들면,쥐의 hox 프로모터 (Kessel 등., Science (1990) 249:374-379) 및 α태아단백질 프로모터(Campes 등., Genes Dev (1989) 3:537-546)등이 포함된다.In another embodiment, the recombinant mammalian expression vector of the invention can direct nucleic acid expression in favor of a particular cell type (eg, tissue specific regulatory elements are used to express the nucleic acid). Tissue specific regulatory elements are known in the art. Suitable tissue specific promoters include, for example, albumin promoters (liver specific promoters; Pinkert et al., Genes Dev (1987) 1: 268-277), lymphocyte specific promoters (Calame et al., Adv Immunol (1988) 43: 235-275), in particular, the T cell receptor promoter (Winoto et al., EMBO J (1989) 8: 729-733) and immunoglobulins (Banerji et al., Cell (1983) 33: 729-740; Queen et al., Cell (1983) 33: 741-748), neuron specific promoters (nerve filament promoter; Byrne et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 5473-5477), pancreatic specific promoters (Edlund et al., Science (1985) 230: 912-916) and mammary gland specific promoters (milk whey promoter; US patent 4,873,316; European application 264,166) and the like. Embryogenically regulated promoters are also included, for example, in rat hox promoters (Kessel et al., Science (1990) 249: 374-379) and α fetal protein promoters (Campes et al., Genes Dev (1989) 3: 537-546).
본 발명에는 또한 안티센스 방향으로 발현 벡터에 클론된 본 발명의 DNA 분자로 구성된 재조합 발현 벡터를 포함한다. 즉, DNA 분자는 GAVE19 mRNA에 안티센스인 RNA 분자가 발현 되도록(가령, DNA 분자의 전사에 의해) 하는 방식으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클론된 핵산에 연결된 조절 서열은 다양한 세포형에서 안티센스 RNA 분자를 지속적으로 발현시킬 수 있도록 선택된다. 예를 들면, 구성, 조직특이적인 또는 세포형특이적인 안티센스RNA 발현을 지시할 수 있는 바이러스성 프로모터 또는 인핸서 또는 조절 서열이 선택된다. 안티센스 발현 벡터는 고 효율 조절 부분의 조절하에서 안티센스 핵산이 만들어 질 수 있도록 재조합 플라스미드, 파아지미드 또는 감쇠된 바이러스형태가 될 수 있고, 이들의 활성은 벡터가 도입되는 세포의 형태에 따라 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 이용한 유전자 발현 조절에 대해서는 Weintraub 등. (ReviewsTrends in Genetics, Vol. 1(1)1986)을 참고한다.The invention also includes recombinant expression vectors consisting of the DNA molecules of the invention cloned into the expression vectors in the antisense direction. That is, the DNA molecule is operably linked to regulatory sequences in such a way that the RNA molecule, which is antisense, is expressed in the GAVE19 mRNA (eg, by transcription of the DNA molecule). Regulatory sequences linked to nucleic acids cloned in the antisense direction are selected to enable continuous expression of antisense RNA molecules in various cell types. For example, viral promoters or enhancers or regulatory sequences are selected that can direct constitutive, tissue specific or cell type specific antisense RNA expression. Antisense expression vectors can be in the form of recombinant plasmids, phagemids or attenuated viruses so that antisense nucleic acids can be made under the control of high efficiency regulatory moieties, and their activity can be determined by the type of cell into which the vector is introduced. Weintraub et al. For gene expression regulation using antisense genes. (Reviews Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986).
본 발명의 또 다른 측면에는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포를 포함한다. “숙주세포” 또는 “재조합 숙주 세포”는 서로 상호교환적으로 이용할 수 있다. 이 용어는 특정 개체 세포 뿐만 아니라, 이와 같은 세포의 후손 및 잠재적인 후손도 포함된다는 것을 인지할 것이다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인하여, 후대에 변화가 있을 수 있고 후계 세포가 반드시 선조 세포와 동일하지는 않지만, 여기에서 사용된 영역에는 후계세포가 포함된다.Another aspect of the invention includes a host cell into which the recombinant expression vector of the invention is introduced. "Host cells" or "recombinant host cells" are available interchangeably. It will be appreciated that the term includes not only certain individual cells but also descendants and potential descendants of such cells. Due to mutations or environmental effects, there may be later changes and the succeeding cells are not necessarily identical to the progenitor cells, but the regions used herein include the succeeding cells.
숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포가 될 수 있다. 예를 들면, 대장균(E.coli)과 같은 세균 세포, 곤충세포, 효모 또는 포유류 세포(Chinese hamster ovary cells (CHO), 293 세포 또는 COS 세포)와 같은 세포에서 GAVE19 단백질이 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있다. 벡터 DNA를 통상의 형질도입 또는 형질감염 기술을 이용하여 진핵 또는 원핵 세포내로 도입시킬 수 있다. 여기에서 사용되는 “형질도입” 및 “형질 감염”은 숙주 세포로 외부 핵산(DNA)를 도입시키는 다양한 당분야에 인지된 기술을 말하는 것으로 예를 들면, 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침전, 유도, DEAE덱스트란 중개된 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공 등이 포함된다.Host cells can be eukaryotic or prokaryotic. For example, the GAVE19 protein can be expressed in bacterial cells such as E. coli, insect cells, yeast or mammalian cells (Chinese hamster ovary cells (CHO), 293 cells or COS cells). Other suitable host cells are known in the art. Vector DNA can be introduced into eukaryotic or prokaryotic cells using conventional transduction or transfection techniques. As used herein, “transduction” and “transfection” refer to various art-recognized techniques for introducing foreign nucleic acids (DNA) into host cells, for example, calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, induction, DEAE Dextran mediated transfection, lipofection or electroporation.
포유류 세포의 안정한 형질 감염을 위해서는 발현 벡터 및 이용된 형질 감염 기술에 따라, 세포의 일부분만이 게놈에 외부 DNA를 결합시킨다. 결합체를 확인하고, 선별하기 위해, 선택적 마커(항생제 저항성 등과 같은)을 암호화하는 유전자를 소요의 유전자와 함께 숙주 세포로 도입시킨다. 적절한 선택성 마커에는 약물 저항성, 예를 들면, G418, 하이그로마이신(hygromycin), 메토트렉세이트(methotrexate)등이 포함된다. 적절한 선택적 마커를 암호화하는 핵산을 GAVE19를 암호화하는 동일한 벡터를 이용하여 숙주 세포로 도입시키거나 별도의 벡터를 이용하여 도입시킬 수도 있다. 도입된 핵산에 의해 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별성을 이용하여 확인할 수 있다(선택성 마커가 결합된 세포는 생존하고, 다른 세포 즉, 마커 유전자가 도입안된 세포는 죽게된다)For stable transfection of mammalian cells, only a fraction of the cells bind foreign DNA to the genome, depending on the expression vector and the transfection technique used. To identify and select conjugates, genes encoding selective markers (such as antibiotic resistance, etc.) are introduced into the host cell along with the desired genes. Suitable selectable markers include drug resistance, such as G418, hygromycin, methotrexate, and the like. Nucleic acids encoding appropriate selective markers may be introduced into host cells using the same vector encoding GAVE19 or may be introduced using a separate vector. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified using drug selectivity (cells with selective markers survive and other cells, ie cells without marker genes, die).
배양물에서 진핵 또는 원핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여, GAVE19 단백질을 생산(발현)시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주세포를 이용하여 GAVE19 단백질을 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 본 발명의 숙주 세포(GAVE19를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입된)를 적절한 배지에서 생장시켜, GAVE19 단백질을 생산한다. 또 다른 구체예에서, 본 방법에는 배지 또는 숙주 세포로부터 GAVE19를 분리하는 방법도 포함된다.Host cells of the invention, such as eukaryotic or prokaryotic host cells, in culture can be used to produce (express) GAVE19 protein. Accordingly, the present invention provides a method for producing GAVE19 protein using the host cell of the present invention. In one embodiment, the method grows the host cell of the invention (incorporated with a recombinant expression vector encoding GAVE19) in a suitable medium to produce the GAVE19 protein. In another embodiment, the method also includes a method of separating GAVE19 from a medium or host cell.
또 다른 구체예에서, GAVE 19는 변형된 발현 벡터에 서브클론된 다른 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위한 유도성 발현 시스템으로 구성된다. 예를 들면, 돌연변이된 G 단백질(효모 세포, Y2 부신피질 세포 및cyc S49, 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허5,739,029; 미국 특허 5,482,835; Mitchell 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89(19):893-337; Katada 등., J Biol Chem (1984) 259(6):358-695)을 포함하는 숙주 세포에 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 가지는 제 1 발현 벡터를 형질도입시키고, 이때, 숙주 세포에서 GAVE19가 기능을 하도록 발현된다. 비록, 발현된 GAVE19가 구성적으로 활성이 있더라도, 돌연변이가 시그날 전달을 나타내는 것은 아니다. 즉, G단백질의 활성이 없는 연속 반응이 일어난다(가령, 아데닐일 사이클라제 활성화반응이 없음). 연속하여 제 2 발현 벡터를 이용하여, GAVE19를 가지는 숙주 세포내로 연속하여 형질도입시킨다. 제 2 벡터는 유도성 시스템에 의해 발현되는 소요 유전자에 추가하여, 숙주 세포의 G 단백질 돌연변이에 상보적인 구조 유전자로 구성된다(가령, 기능을 가지는 포유류 또는 효모 Gs, Gi, Go, Gq(참고 PCT 공보WO 97/48820; 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허 5,739,029; 미국 특허 5,482,835). 제 2 벡터의 상보적인 구조 유전자는 상보적인구조 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 활성화시키는 외부에서 추가된 성분(테트라사이클린, IPTG, 소분자 Sambrook 등. 상기 참조)의 조절하에서 유도성을 가진다. 유도인자에 추가하여, 상보적인 구조 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 기능적으로 발현되어, 구성적으로 활성을 가지는 GAVE19는 복합체(제2 메신져 형성)를 형성하여, 적절한 하향 경로가 활성화되도록 유도한다. 제 2 벡터로 구성된 소요 유전자는 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가지는데, 이 프로모터는 적절한 제 2 메신져(CREB, AP1 요소)에 의해 활성화된다. 따라서, 제2메신져가 누적되면, 소요의 유전자 상향에 있는 프로모터가 활성화되어, 유전자 생성물이 발현된다. 유도인자가 없는 경우에, 소요 유전자 발현이 중단된다.In another embodiment, GAVE 19 consists of an inducible expression system for recombinantly expressing another protein subcloned into a modified expression vector. For example, mutated G proteins (yeast cells, Y2 adrenal cortex cells and cyc S49, US patent 6,168,927 B1, US patent 5,739,029; US patent 5,482,835; Mitchell et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89 (19): 893-337; Katada et al., J Biol Chem (1984) 259 (6): 358-695) is transduced with a first expression vector having a nucleic acid sequence encoding a GAVE19 protein, wherein GAVE19 is expressed in the host cell to function. Although expressed GAVE19 is constitutively active, the mutation does not indicate signal transduction. That is, a continuous reaction with no activity of the G protein occurs (eg no adenylyl cyclase activation reaction). Subsequently, a second expression vector is used to continuously transduce into a host cell having GAVE19. The second vector consists of structural genes complementary to the G protein mutations in the host cell in addition to the required genes expressed by the inducible system (e.g., functioning mammalian or yeast Gs, Gi, Go, Gq (see PCT). WO 97/48820; U.S. Patent 6,168,927 B1, U.S. Patent 5,739,029; U.S. Patent 5,482,835. The complementary structural gene of the second vector is an externally added component (tetracycline that activates a promoter operably linked to the complementary structural gene). , IPTG, small molecule Sambrook, etc. (see above) In addition to the inducer, the protein encoded by the complementary structural gene is functionally expressed, and the constitutively active GAVE19 complex (see 2 messenger formation), leading to the activation of the appropriate downward pathway. This promoter is activated by an appropriate second messenger (CREB, AP1 element), so that when the second messenger accumulates, the promoter upstream of the desired gene is activated and the gene product is expressed. In the absence of inducers, required gene expression is stopped.
특정 구체예에서, 유도성 발현 시스템용 숙주 세포에는 S49 (cyc) 세포를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 세포주가 G단백질 돌연변이로 구성된 것으로 판단되는 경우에, 인위적으로 적절한 돌연변이를 만든다/작제한다 (효모 세포용으로는 미국 특허 6,168,927 B1, 미국 특허 5,739,029; 미국 특허 5,482,835을 참조한다).In certain embodiments, host cells for inducible expression systems include, but are not limited to, S49 (cyc) cells. If the cell line is judged to be composed of G protein mutations, an artificially appropriate mutation is made / created (for yeast cells see US Pat. No. 6,168,927 B1, US Pat. 5,739,029; US Pat. No. 5,482,835).
관련 측면에서, 서열 2에서 제시하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA에 작동 가능하게 연결된 벡터를 세포로 형질도입시킨다. 이와 같은 시스템으로 구성된 제 1 및 제2 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840); pMT2PC (Kaufman 등., EMBO J (1987) 6:187-195), pYepSecl (Baldari 등., EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ(Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등을 고려할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다.In a related aspect, a vector is transduced into a cell operably linked to a cDNA comprising a sequence encoding a protein set forth in SEQ ID NO: 2. The first and second vectors composed of such a system include pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840); pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187-195), pYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933- 943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA), and the like. Do not.
관련 측면에서, 적절한 수단을 이용하여 숙주 세포에 형질 감염시킬 수 있는데, 이때, 형질 감염에 의해 기능을 가지는 GAVE19 단백질이 발현된다(e.g., Sambrook 등., 상기 참조, and Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990). 이와 같은 “기능을 하는 단백질”이란 일단 발현되면, G-단백질과 복합체를 형성하는 단백질을 포함하나 이에 국한시키지 않으며, 이때 G-단백질이 제 2 메신져 형성을 조절한다. 여기에서 이용할 수 있는 숙주 세포를 형질감염시키는 다른 방법으로는 형질 감염(transfection), 전기천공(electroporation), 마이크로인젝션 (microinjection), 형질 도입(transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산 칼슘 침전, 리포펙션(라이소자임 융합), 유전자 총(gene gun) 이용, DNA 벡터 운반자( Wu 등., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut 등., 캐나다 특허 출원 2,012,311, 1990년 3월 15일에 출원)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.In a related aspect, the host cell can be transfected using appropriate means, wherein the transfected GAVE19 protein is expressed (eg, Sambrook et al., Supra, and Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990). Such “functional proteins”, once expressed, include, but are not limited to, proteins that complex with G-proteins, where the G-proteins regulate the formation of a second messenger. Other methods for transfecting host cells that can be used include transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, Lipofection (lysozyme fusion), using a gene gun, DNA vector carrier (Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263 Hartmut et al., Canada Patent Application No. 2,012,311, filed Mar. 15, 1990), and the like.
본 발명은 매우 다양한 프로모터를 이용한다. 또한, 당분야에 공지된 임의 프로모터/인핸서 요소등을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 발현을 조절할 수 있으나, 이와 같은 조절 요소들은 반드시 선택된 숙주에서 발현 기능을 할 수 있어야 한다. GAVE19 발현 조절에 이용될 수 있는 프로모터로는 SV40 어얼리 프로모터 부분(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스(Roussarcoma virus)의 3’ 긴 말단 반복체에 포함된 프로모터(Yamamoto, 등., 1980, Cell 22:787-797), 허피스(herpes) 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster 등., 1982, Nature 296:3942); β락타메이즈 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터(VillaKamaroff, 등., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731),tac프로모터(DeBoer, 등., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2125); “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242:7494; 조직 특이성을 나타내고 유전자 전이 동물에서 이용할 수 있는Gal 4 프로모터, ADC(알코올 디하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리 포스포타제 프로모터와 같은 효모 또는 다른 곰팡이의 프로모터 요소; 그리고 췌장 샘포 세포에서 활성을 가지는 엘라스타제 I 유전자 조절 부분(Swift 등., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz 등., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성을 가지는 인슐린 조절 부분 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 임파 세포에서 활성을 가지는 면역글로블린 유전자 조절 부분(Grosschedl 등., 1984, Cell 38:647-658; Adames 등., 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 임파 및 유선 세포에서 활성을 가지는 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부분 (Leder 등., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성을 가지는 알부민 유전자 조절 부분(Pinkert 등., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성을 가지는 알파페토단백질 유전자 조절 부분(Krumlauf 등., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등., 1987, Science 235:53-58), 간에서 활성을 가지는 알파 1안티트립신 유전자 조절 부분(Kelsey 등., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성을 가지는 베타글로빈 유전자 조절 부분(Mogram 등., 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등., 1986, Cell 46:89-94), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성을 가지는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부분 (Readhead 등., 1987, Cell 48:703-712), 골근육에서 활성을 가지는 미오신 경쇄2 유전자 조절 부분(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 시상하부에서 활성을 가지는 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 부분(Mason 등., 1986, Science 234:1372-1378)과 같은 조직 특이성을 나타내고, 유전자 전이 동물에 이용되었던 동물의 전사 조절 부위 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.The present invention utilizes a wide variety of promoters. In addition, although any promoter / enhancer element known in the art can be used to regulate the expression of the polypeptide of the present invention, such regulatory elements must be capable of functioning in the selected host. Promoters that can be used to modulate GAVE19 expression include the SV40 early promoter moiety (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), a promoter contained in the 3 'long terminal repeat of the Roussarcoma virus ( Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), the herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), metallothionine Regulatory sequences of genes (Brinster et al., 1982, Nature 296: 3942); prokaryotic expression vectors such as the β lactamase promoter (Villa Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), tac promoters (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci) USA 80: 2125); “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242: 7494; Promoter elements of yeast or other fungi, such as Gal 4 promoter, ADC (alcohol dehydrogenase) promoter, PGK (phosphoglycerol kinase) promoter, alkaline phosphatase promoter, which exhibit tissue specificity and are available in transgenic animals; And the elastase I gene regulatory moiety having activity in pancreatic glandular cells (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); Insulin regulatory moiety active in pancreatic beta cells (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), immunoglobulin gene regulatory moiety active in lymphatic cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al. ., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), mouse breast tumor virus regulatory portion having activity in testes, breast, lymph and mammary cells (Leder Et al., 1986, Cell 45: 485-495), an albumin gene regulatory region that is active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), alphafetoprotein gene regulation that is active in the liver. Portion (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58), alpha 1 antitrypsin gene regulatory portion having activity in the liver (Kelsey et al. , 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), a beta globin gene regulatory region that is active in bone marrow cells (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340 Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94), myelin basic protein gene regulatory regions having activity in oligodendrocytes of the brain (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712), bone Myosin light chain 2 gene regulatory region active in muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-286), gonadotropin releasing hormone gene regulatory region active in the hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234: 1372) -1378) and include, but are not limited to, transcriptional regulatory sites of animals used in transgenic animals.
본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 다음 4가지 일반적인 방법으로 확인가능하다: (a) 원하는 플라스미드 DNA 또는 특정 mRNA의 PCR 증폭 (b) 핵산 하이브리드화 반응, (c) 선택성 마커 유전자 기능의 존부, (d) 삽입된 서열의 발현. 첫번째 방법으로, 증폭된 생성물을 검출하기 위해, PCR을 통하여 핵산을 증폭시킬 수 있다. 두번째 방법으로, 삽입된 마커 유전자에 상동성 서열로 구성된 프로브를 이용하여, 핵산을 하이브리드화 시키는 방법을 통하여 발현 벡터내에 삽입된 외부 유전자를 검출할 수 있다. 세번째 방법으로, 벡터에 외부 유전자가 삽입됨으로써 특정“선택성 마커” 유전자 기능의 존부(가령, β갈락토시다제 활성, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 저항성, 형질전환 표현형의 베큘로바이러스에 폐색 체 형성 등)에 근거하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 확인하고 선별할 수 있다. 또 다른 예를 들면, GAVE19 단백질, 이의 변이체, 이의 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산이 벡터의 “선택성 마커 유전자”내에 삽입되는 경우에, 삽입체를 포함하는 재조합체의 경우는 GAVE19 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 네번째 방법으로, 발현된 단백질이 기능적으로 활성 모양인 경우에, 재조합에 의해 발현되는 유전자 생성물의 활성, 생화학적, 면역학적 특징을 분석하여, 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다.Expression vectors comprising nucleic acid molecules of the invention can be identified by four general methods: (a) PCR amplification of the desired plasmid DNA or specific mRNA, (b) nucleic acid hybridization reactions, (c) the absence of selectable marker gene function. , (d) expression of inserted sequences. In the first method, the nucleic acid can be amplified by PCR to detect the amplified product. In a second method, an external gene inserted into an expression vector can be detected by hybridizing nucleic acids using a probe composed of homologous sequences to the inserted marker gene. In a third method, the insertion of an external gene into a vector prevents the presence of certain "selective marker" gene functions (eg, β-galactosidase activity, thymidine kinase activity, antibiotic resistance, transgenic phenotypes of baculoviruses). Formation, etc.) to identify and select recombinant vector / host systems. In another example, when a nucleic acid encoding a GAVE19 protein, variant thereof, analogue or derivative thereof is inserted into a "selective marker gene" of a vector, in the case of a recombinant comprising an insert, the absence of GAVE19 gene function may result. Can be confirmed. In a fourth method, when the expressed protein is in a functionally active form, the recombinant expression vector can be identified by analyzing the activity, biochemical and immunological characteristics of the recombinantly expressed gene product.
본 발명의 DNA 서열 발현에 매우 다양한 형태의 숙주/발현 벡터 조합을 이용할 수 있다. 예를 들어, 유용한 발현 벡터는 염색체 부분 단편, 비염색체 부분 단편 및 합성 DNA 서열 부분 단편으로 구성된다. 적절한 벡터에는 SV40 유도체 및 공지의 세균성 플라스미드 가령, 대장균(E. coli) 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMalC2, pET, pGEX (Smith등., 1988, Gene 67:3140), pMB9 및 이의 유도체들, RP4 플라스미드; 파아지 DNA(phage λ의 많은 유도체 가령, NM989, 및 다른 파아지 DNA가령 M13, 필라멘트성 일본쇄 파아지 DNA); 2μ 플라스미드 및 이의 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파아지 DNA 복합체에서 유도된 벡터, 가령, 플라스미드를 변형시켜, 파아지 DNA를 이용하게 하거나 또는 다른 발현 조절 서열등을 이용하게 한 유도 벡터등이 포함된다.A wide variety of host / expression vector combinations can be used for the expression of DNA sequences of the invention. For example, useful expression vectors consist of chromosomal fragments, non-chromosomal fragments, and synthetic DNA sequence fragments. Suitable vectors include SV40 derivatives and known bacterial plasmids such as E. coli plasmid col El, pCR1, pBR322, pMalC2, pET, pGEX (Smith et al. , 1988, Gene 67: 3140), pMB9 and derivatives thereof, RP4 plasmid; Phage DNA (many derivatives of phage λ such as NM989, and other phage DNA such as M13, filamentary single-chain phage DNA); Yeast plasmids such as 2μ plasmid and derivatives thereof; Vectors useful for eukaryotic cells, such as vectors useful for insects or mammalian cells; Vectors derived from plasmid and phage DNA complexes, such as induction vectors that modify the plasmid to use phage DNA or other expression control sequences, may be included.
예를 들어, 베큘로바이러스 발현 시스템에서는 비융합 전달 벡터 및 융합 전달 벡터를 모두 이용할 수 있는데, 이때 비융합 전달 벡터로는 pVL941(BamH1 클로닝 부위; Summers), pVL1393(BamH1,SmaI,XbaI,EcoR1,NotI,XmaIII,BglII,PstI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392(BglII,PstI,NotI,XmaIII,EcoRI,XbaI,SmaI,BamH1 클로닝 부위; Summers and Invitrogen), pBlueBacIII (BamH1,BglII,PstI,NcoI,HindIII 클로닝 부위와 blue/white 재조합 스크리닝 가능; Invitrogen)을 포함하나 이에 한정시키지 않으며; 융합 전달 벡터로는 pAc700(BamH1 및KpnI 클로닝 부위, 이때BamH1 인지는 개시 코돈에서 시작됨; Summers), pAc701, pAc702(pAc700와 동일, 단, 상이한 판독 프레임을 가짐), pAc360(BamH1 클로닝 부위는 폴리헤드린 개시 코돈의 하류 36개 염기쌍임; Invitrogen(195)), pBlueBacHisA, B, C(세 가지 상이한 판독 프레임,BamH1,BglII,PstI,NcoI,HindIII 클로닝 부위, ProBond 정제를 위한 N-말단 펩티드, blue/white 재조합 플락 스크리닝; Invitrogen (220))을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.For example, in a baculovirus expression system, both a non-fusion delivery vector and a fusion delivery vector can be used, wherein as the non-fusion delivery vector, pVL941 ( Bam H1 cloning site; Summers), pVL1393 ( Bam H1, Sma I, Xba I, Eco R1, Not I, Xma III, Bgl II, Pst I cloning site; Invitrogen), pVL1392 ( Bgl II, Pst I, Not I, Xma III, Eco RI, Xba I, Sma I, Bam H1 cloning site; Summers and Invitrogen), pBlue Bac III ( Bam H1, Bgl II, Pst I, Nco I, Hind III cloning sites and blue / white recombinant screening available; Invitrogen); Fusion transfer vectors include pAc700 ( Bam H1 and Kpn I cloning sites, where Bam H1 recognition begins at the start codon; Summers), pAc701, pAc702 (same as pAc700, but with a different reading frame), pAc360 ( Bam H1 cloning The site is 36 base pairs downstream of the polyhedrin initiation codon; Invitrogen (195)), pBlueBacHisA, B, C (three different read frames, Bam H1, Bgl II, Pst I, Nco I, Hind III cloning site, ProBond purification) N-terminal peptides for, blue / white recombinant flock screening; Invitrogen (220)).
본 발명에 이용할 수 있는 포유류 발현 벡터에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 가지는 벡터가 포함되는데, 가령,DHFR발현벡터를 가지는 임의 발현 벡터나 클론된 유전자와DHFR를 모두 발현시키는 벡터와 pED(클로닝 부위는PstI,SalI,SbaI,SmaI,EcoRI이다)의DHFR/메토트렉세이트 공-증폭 벡터 등이 포함될 수 있다(Kaufman,Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). 대안으로, pEE14(클로닝 부위는HindIII,XbaI,SmaI,SbaI,EcoRI,BclI이다 이때 벡터는 글루타민 합성효소와 클론된 유전자를 발현시킴)와 같은 글루타민 합성효소/메티오닌 설폭시민 공증폭 벡터를 이용할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, Epstein Barr Virus (EBV) 조절하에 에피좀 발현에 관계하는 벡터를 이용할 수도 있는데, 예를 들면, pREP4 (클로닝 부위는BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII,KpnI이다. 구성 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커; Invitrogen), pCEP4(클로닝 부위는BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII,KpnI이다 구성 hCMV 이메디에이트 어얼리 유전자, 하이그로마이신 선택성 마커; Invitrogen), pMEP4(클로닝 부위는KpnI,PvuI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI,BamH1이다, 유도성 메탈로티오닌 Iia 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커: Invitrogen), pREP8(클로닝 부위는BamH1,XhoI,NotI,HindIII,NheI,KpnI이다, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선택성 마커; Invitrogen), pREP9(클로닝 부위는KpnI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI, BamHI이다, RSVLTR 프로모터, G418 선택성 마커; Invitrogen), pEBVHis(RSVLTR 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커, ProBond 수지와 엔테로키나제 절단을 통하여, N-말단 펩티드 정제가능; Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명에서 이용할 수 있는 선택가능한 포유류 발현 벡터에는 pRc/CMV(클로닝 부위는HindIII,BstXI,NotI,SbaI,ApaI이다, G418 선택: Invitrogen), pRc/RSV(클로닝 부위는HindIII,SpeI,BstXI,NotI,XbaI이다, G418 selection; Invitrogen) 및 기타 다른 것등이 포함된다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 우두 바이러스 포유류 발현 벡터(Kaufman, 1991,상기 참조) 에는 pSC11 (SmaI 클로닝 부위이다, TK 및 βgal 선택성), pMJ601(클로닝 부위는SalI,SmaI,AflI,NarI,BspMII,BamHI,ApaI,NheI,SacII,KpnI,HindIII이다; TK 및 βgal 선택성), pTKgptF1S (클로닝부위는EcoRI,PstI,SalI,AccI,HindII,SbaI,BamHI, Hpa이다, TK 또는 XPRT 선별)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.In mammalian expression vector that can be used in the present invention it is included a vector having an inducible promoter, such as a dihydro folate reductase (DHFR) promoter, e.g., with a DHFR expression vector, both of any expression vector or cloned gene and DHFR Expression vectors and DHFR / methotrexate co-amplification vectors of pEDs (cloning sites are Pst I, Sal I, Sba I, Sma I, Eco RI) can be included (Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology , 16.12 (1991). Alternatively, glutamine synthetase / methionine sulfoxide, such as pEE14 (cloning sites are Hind III, Xba I, Sma I, Sba I, Eco RI, Bcl I, where the vector expresses the gene cloned with glutamine synthetase) Citizen co-amplification vectors can also be used In another embodiment, vectors that are involved in episomal expression under the control of Epstein Barr Virus (EBV) can be used, for example pREP4 (cloning site is Bam H1, Sfi I, Xho I, Not I, Nhe I, Hind III, Nhe I, Pvu II, Kpn I a block RSV-LTR promoter, hygromycin selectable marker;. Invitrogen), pCEP4 (cloning site is Bam H1, Sfi I , Xho I, Not I, Nhe I, Hind III, Nhe I, Pvu II, Kpn I a structural hCMV this media Eight early gene, hygromycin selectable marker; Invitrogen), pMEP4 (cloning site is Kpn I, Pvu I , Nhe I, Hind III, Not I, Xho I, Sfi I, Bam H1, inducible metallothionine Iia gene promoter, hygromycin selective marker: Invitrogen), pREP8 (cloning site is Bam H1, Xho I, Not I, Hind III, Nhe I, the Kpn I, RSV-LTR promoter, Heath T dinol selectable marker; Invitrogen), pREP9 (cloning site is Kpn I, Nhe I, Hind III, Not I, Xho I, Sfi I, BamHI, RSVLTR promoter, G418 selectable marker; Invitrogen), pEBVHis (RSVLTR promoter, hygromycin selectable marker, N-terminal peptide purified via ProBond resin and enterokinase cleavage; Invitrogen) and the like. Selectable mammalian expression vectors that can be used in the present invention include pRc / CMV (cloning site is Hind III, Bst XI, Not I, Sba I, Apa I, G418 selection: Invitrogen), pRc / RSV (cloning site is Hind III , Spe I, Bst XI, Not I, Xba I, G418 selection; Invitrogen) and others. Vaccinia virus mammalian expression vectors (Kaufman, 1991, supra ) which can be used according to the present invention include pSC11 ( Sma I cloning site, TK and βgal selectivity), pMJ601 (cloning sites are Sal I, Sma I, Afl I, Nar). I, Bsp MII, Bam HI, Apa I, Nhe I, Sac II, Kpn I, Hind III; TK and βgal selectivity), pTKgptF1S (cloning sites are Eco RI, Pst I, Sal I, Acc I, Hind II, Sba I, Bam HI, Hpa is, but the like TK or XPRT selection) does sikijineun limited.
효모균 발현 시스템을 이용하여 본 발명에 따른 GAVE19 단백질, 이의 변이체 또는 유도체 및 유사체를 발현시킨다. 예를 들면, 비융합된 pYES2 벡터(클로닝 부위는XbaI,SphI,ShoI,NotI,GstXI,EcoRI,BstXI,BamH1,SacI,Kpn1,HindIII 이다; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C(클로닝 부위는XbaI,SphI,ShoI,NotI,BstXI,EcoRI,BamH1,SacI,KpnI,HindIII이다, ProBond 수지와 엔테로키나제 절단을 통하여, N-말단 펩티드 정제가능; Invitrogen) 등이 본 발명에 이용될 수 있다.A yeast expression system is used to express the GAVE19 protein, variants or derivatives and analogs thereof according to the present invention. For example, the unfused pYES2 vector (cloning site is Xba I, Sph I, Sho I, Not I, Gst XI, Eco RI, Bst XI, Bam H1, Sac I, Kpn 1, Hind III; Invitrogen) or fusion pYESHisA, B, C (cloning site is the Xba I, Sph I, Sho I, Not I, Bst XI, Eco RI, Bam H1, Sac I, Kpn I, Hind III, via ProBond resin and enterokinase cleavage, N-terminal peptide purified; Invitrogen) and the like can be used in the present invention.
특정 재조합 DNA 분자를 확인하고, 분리한 후에, 당분야에 공지된 몇 가지 방법으로 이를 증식시킬 수 있다. 적절한 숙주 시스템 및 생장 조건이 정립되면, 재조합 발현 벡터를 증식시켜 다량 준비할 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 이용할 수 있는 발현 벡터에는 다음의 벡터 또는 이의 유도체가 포함된다: 우두 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 베큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파아지 벡터(예를 들면, 람다), 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터 등이 있으나 이에 한정시키지 않는다.After identifying and isolating a particular recombinant DNA molecule, it can be propagated by several methods known in the art. Once the appropriate host system and growth conditions have been established, large amounts can be prepared by propagating the recombinant expression vector. As already described, expression vectors that can be used include the following vectors or derivatives thereof: human or animal viruses such as vaccinia virus or adenovirus; Insect viruses such as baculovirus; Yeast vectors; Bacteriophage vectors (eg, lambda), plasmids, and cosmid DNA vectors, and the like.
또한, 삽입된 서열 발현을 조절하는, 적절한 숙주 세포 주를 선택하여 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 또는 진행시킬 수 있다. 여러가지 다른 숙주 세포는 단백질의 전사 및 전사후 프로세싱 과정 및 변형(가령, 글리코실화반응, 시그날 서열의 절단 등)등 특징적이고, 독특한 기작을 가진다. 발현된 외부 단백질을 원하는 방식으로 변형 및 프로세싱시키기 위해 적절한 세포 주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 예를 들면, 글리코실화안된 코어 단백질 생성물을 만들기 위해 세균 시스템에서 발현을 이용할 수도 있다.In addition, an appropriate host cell line, which modulates inserted sequence expression, can be selected to modify or progress the gene product in a particular manner. Many other host cells have distinctive and unique mechanisms such as protein transcription and post-transcriptional processing and modification (eg, glycosylation, cleavage of signal sequences, etc.). Appropriate cell lines or host systems can be selected to modify and process the expressed foreign protein in the desired manner. For example, expression may be used in bacterial systems to make unglycosylated core protein products.
유전자 전이 동물Gene transfer animal
본 발명의 숙주 세포를 이용하여 사람이 아닌 유전자 전이된 동물을 만들 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포이고, 이들 세포내로 GAVE19를 암호화하는 서열이 도입된다. 이와 같은 숙주 세포를 이용하여, 사람이 아닌 유전자 전이 동물을 만들고, 게놈 또는 상동성 재조합 동물에 외부 GAVE19 서열을 도입시키고, 내생 GAVE19 서열이 변경된다. GAVE19의 기능 및 활성 연구에 그러한 유전자 전이 동물이 유용하고, GAVE19 활성 조절 물질을 확인하고 평가하는데 이용할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, “유전자 전이 동물”은 사람이 아닌 동물, 적절하게는 포유류, 좀더 바람직하게는 마우스 또는 들쥐 등의 설치류가 되고, 동물의 하나 이상의 세포에 전이 유전자를 포함하고 있다. 유전자 전이 동물의 다른 예로는 사람이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등이 포함된다.The host cell of the invention can be used to make non-human genetically transcribed animals. For example, in one embodiment, the host cells of the invention are fertilized oocytes or embryonic stem cells, and sequences encoding GAVE19 are introduced into these cells. Such host cells are used to create non-human transgenic animals, introduce foreign GAVE19 sequences into genomic or homologous recombinant animals, and alter the endogenous GAVE19 sequence. Such transgenic animals are useful for studying the function and activity of GAVE19 and can be used to identify and evaluate GAVE19 activity modulators. As used herein, a "gene transfer animal" is a non-human animal, suitably a rodent, such as a mammal, more preferably a mouse or a mouse, and contains a transgene in one or more cells of the animal. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cattle, goats, chickens, amphibians, and the like.
여기에서 사용된 바와 같이, “전이 유전자”는 유전자 전이 동물이 발생되는 세포의 게놈에 결합되어, 성숙한 동물의 게놈에 유지되는 외부 DNA를 말한다. 전이 유전자는 유전자 전이 동물의 한 가지 이상의 세포 형에서 암호화된 유전자 생성물의 발현에 관계한다. 여기에서 사용된 것과 같은 “상동성 재조합 동물”은 사람이 아닌 동물, 적절하게는 포유류, 좀더 바람직하게는 마우스가 되고, 이때 내생 GAVE19 유전자는 상동성 재조합에 의해 변경된다. 이는 동물의 세포로 도입되는 외생 DNA 분자와 내생 유전자간에 이루어지는데, 예를 들면, 동물이 발생되기 전에 동물의 배아 세포에서 이루어진다.As used herein, "transgene" refers to foreign DNA that is bound to the genome of the cell from which the transgenic animal is generated and maintained in the genome of a mature animal. The transfer gene is involved in the expression of the encoded gene product in one or more cell types of the transgenic animal. As used herein, a "homologous recombinant animal" is a non-human animal, suitably a mammal, more preferably a mouse, wherein the endogenous GAVE19 gene is altered by homologous recombination. This is done between exogenous DNA molecules and endogenous genes introduced into the cells of the animal, for example in the embryonic cells of the animal before the animal develops.
상기에서 설명하는 형질 감염 방법중 한 가지를 이용하여, GAVE19를 암호화하는 핵산 분자를 수정된 난모세포의 수컷 전핵으로 도입시켜, 본 발명의 유전자 전이 동물이 만들어지는 것이다. 난모세포가 가상 임신한 암컷 부양 동물에서 발생된다. GAVE19 cDNA 서열, 즉, 서열 l을 전이유전자로 사람이 아닌 동물의 게놈으로 도입시킬 수 있다. 대안으로, 마우스 GAVE19 유전자와 같은 사람의 GAVE19를 가지는 비-사람 상동성 유전자를 사람 GAVE19 cDNA에 대한 하이브리드화 반응에 근거하여 분리할 수 있고, 전이유전자로 이용할 수 있다. 전이 유전자의 발현 효율을 증가시키기 위해 인트론 서열 및 폴리아데닐화 반응 시그날이 전이 유전자에 포함될 수도 있다. 조직-특이적인 조절 서열(들)이 GAVE19 전이 유전자에 작동 가능하게 연결되어, 특정 세포에서 GAVE19 단백질을 발현시킨다. 배아 조절 및 마이크로인젝션을 통한 유전자 전이 동물을 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 미국 특허 4,736,866; 미국 특허4,870,009, 미국 특허 4,873,191)을 참고하면 된다. 동물의 조직 또는 세포에 GAVE19 mRNA 의 발현 및 게놈에 전이 유전자를 가지는 다른 유전자 전이 동물을 만드는 유사한 방법을 이용할 수 있다. 그 다음 유전자 전이된 최초 동물을 이용하여 전이 유전자를 가지는 추가 동물을 낳을 수 있다. 또한, GAVE19를 암호화하는 전이 유전자를 가지는 유전자 전이 동물을 번식시켜, 다른 전이 유전자를 가지는 유전자 전이 동물을 만들 수도 있다Using one of the transfection methods described above, a nucleic acid molecule encoding GAVE19 is introduced into a male pronucleus of fertilized oocytes, thereby producing a transgenic animal of the present invention. Oocytes develop in virtually pregnant female dependent animals. The GAVE19 cDNA sequence, ie, sequence l, can be introduced as a transgene into the genome of a non-human animal. Alternatively, non-human homologous genes with human GAVE19, such as the mouse GAVE19 gene, can be isolated based on hybridization reactions to human GAVE19 cDNA and used as transgenes. Intron sequences and polyadenylation reaction signals may be included in the transgene to increase the expression efficiency of the transgene. Tissue-specific regulatory sequence (s) are operably linked to the GAVE19 transfer gene to express GAVE19 protein in specific cells. Methods for making transgenic animals via embryo control and microinjection are known in the art and are described in US Pat. No. 4,736,866; See US Patent 4,870,009 and US Patent 4,873,191. Similar methods can be used to produce GAVE19 mRNA in animal tissues or cells and to make other transgenic animals with a transgene in the genome. The first animal to be transfected can then be used to produce additional animals with the transgene. In addition, a transgenic animal having a transgene encoding GAVE19 can be bred to make a transgenic animal having another transgene.
상동성 재조합 동물을 창조하기 위해, GAVE19 유전자의 일부분(GAVE19 유전자의 사람 또는 사람이 아닌 상동체, 즉, 뮤린 GAVE19 유전자)이 결손, 추가, 치환되어 기능적으로 GAVE19 유전자의 기능을 방해하는 유전자를 포함하는 벡터를 만든다. 적절한 구체예에서, 벡터에는 상동성 재조합시에 내생 GAVE19 유전자가 기능적으로 파괴되도록 벡터를 만든다(즉, 기능을 하는 단백질이 암호화되어 있지 않는 것으로써, 이러한 벡터를 “녹아웃(“knock out”) 벡터라고 한다).To create a homologous recombinant animal, a portion of the GAVE19 gene (human or non-human homolog of the GAVE19 gene, ie the murine GAVE19 gene) contains a gene that is functionally disruptive to the function of the GAVE19 gene by deletion, addition and substitution. Makes a vector In a suitable embodiment, the vector is constructed such that the endogenous GAVE19 gene is functionally disrupted upon homologous recombination (ie, it does not encode a functioning protein, thereby “knocking out” the vector). Is called).
대안으로, 상동성 재조합시에, 내생 GAVE19 유전자를 돌연변이시키거나 기능은 있으나 변형된 형태가 되도록 벡터를 만든다(즉, 상향 조절 부분을 변경시켜, 내생 GAVE19 단백질 발현이 변경되도록 한다).Alternatively, upon homologous recombination, the vector is mutated or made into a functional but modified form of the endogenous GAVE19 gene (ie, the upregulation portion is altered such that the endogenous GAVE19 protein expression is altered).
상동성 재조합에서, GAVE19 유전자의 추가 핵산에 의해GAVE19 유전자의 변경된 부분이 5' 및3' 말단에 인접하도록 하여, 벡터가 운반하는 외생 GAVE19 유전자와 배아 줄기 세포에 있는 내생 GAVE19 세포 사이에서 상동성 재조합이 발생되도록 한다. 추가 인접 GAVE19 핵산 서열이 내생 유전자와 상동성 재조합을 성공적으로 실시하는데 충분한 길이를 가진다. 일반적으로, 인접한 DNA 수 kb(5’ 및 3’ 말단)가 벡터내에 포함된다 (상동성 재조합 벡터에 대한 설명은 Thomas 등., Cell (1987) 51:503을 참고한다).In homologous recombination, the homologous recombination between the exogenous GAVE19 gene carried by the vector and the endogenous GAVE19 cells in embryonic stem cells, such that the altered portion of the GAVE19 gene is adjacent to the 5 'and 3' ends by an additional nucleic acid of the GAVE19 gene. Let this occur. The additional contiguous GAVE19 nucleic acid sequence is of sufficient length to successfully perform homologous recombination with the endogenous gene. In general, adjacent DNA numbers kb (5 'and 3' ends) are included in the vector (see Thomas et al., Cell (1987) 51: 503 for description of homologous recombination vectors).
벡터를 배아 줄기 세포(가령, 전기천공에 의해) 및 세포로 도입시키고, 도입된 GAVE19 유전자와 내생 GAVE19가 상동성 재조합된 것을 선별한다(Li 등., Cell (1992) 69:915). 그 다음 선별된 세포를 동물(마우스)의 낭포로 주사하여, 응집 키메라(Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A PracticalApproach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113l52)를 만든다. 그 다음 키메라 배아를 적절한 가상 임신한 부양 동물에 이식시키고, 임신 기한동안 둔다. 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 가지는 후손을 이용하여 동물을 번식시키는데, 이때 동물의 모든 세포에는 전이 유전자의 생식선 전달에 의해 상동성 재조합된 DNA를 가지고 있다.Vectors are introduced into embryonic stem cells (eg by electroporation) and cells, and the homologous recombination of the introduced GAVE19 gene and endogenous GAVE19 is selected (Li et al., Cell (1992) 69: 915). Selected cells are then injected into the cysts of the animals (mouses) to make aggregated chimeras (Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113l52). The chimeric embryos are then implanted in the appropriate virtual pregnant dependent animal and left for the gestational period. Animals are reproduced using progeny having homologous recombination DNA in germ cells, wherein all cells of the animal have homologous recombination DNA by germline transmission of the transgene.
상동성 재조합 벡터 및 상동성 재조합 동물을 작제하는 방법은 Bradley, Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829; PCT 공보 WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968; WO 93/04169에서 상세하게 설명하고 있다.Methods for constructing homologous recombinant vectors and homologous recombinant animals are described in Bradley, Current Opinion in Bio / Technology (1991) 2: 823-829; PCT publications WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968; It is described in detail in WO 93/04169.
또 다른 구체예에서, 전이 유전자의 발현을 조절할 수 있는 선택된 시스템을 가지고 있는 유전자 전이된 사람이 아닌 동물을 만들 수 있다. 이와 같은 시스템의 한 예는 박테리오파아지 P1의 cre/loxP 리콤비나제 시스템이다. cre/loxP 리콤비나제 시스템의 추가 설명은 Lakso 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:6232-6236을 참고한다. 리콤비나제 시스템의 또 다른 예는 사카로마이세스 세르비시에(S. cerevisiae)의 FLP 리콤비나제 시스템이다(O'Gorrnan 등., Science (1991) 251:1351-1355). cre/loxP 리콤비나제 시스템을 이용하여 전이 유전자의 발현을 조절할 수 있다면, 리콤비나제 및 선택된 단백질을 모두 암호화하는 전이 유전자를 가지는 동물이 필요하다. 이와 같은 동물은 “이중” 유전자 전이 동물, 가령, 하나는 선택된 단백질을 암호화하는 전이 유전자를 가지는 것이고, 다른 하나는 리콤비나제를 암호화하는 전이 유전자를 가지는 것인 두 가지 유전자 전이 동물을 짝지어 만들수 있다.In another embodiment, non-transgenic animals can be made that have a selected system that can regulate expression of the transgene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. For a further description of the cre / loxP recombinase system, see Lakso et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 6232-6236. Another example of a recombinase system is the FLP recombinase system of S. cerevisiae (O'Gorrnan et al., Science (1991) 251: 1351-1355). If the expression of the transgene can be controlled using the cre / loxP recombinase system, an animal with a transgene encoding both the recombinase and the selected protein is needed. Such an animal can be paired with two genetically transgenic animals, one having a transgene encoding one selected protein and the other having a transgene encoding a recombinase. have.
여기에서 설명하고 있는 사람이 아닌 유전자 전이 동물의 클론은 Wilmut 등., Nature (1997) 385:810-813; PCT 공보 WO 97/07668; WO 97/07669에서 설명하는 방법에 따라 만들 수 있다. 간략하게 설명하면, 유전자 전이 동물의 체세포를 분리하여, 생장 과정에서 빠져나와, G0단계로 들어가도록 유도하였다. 그 다음 정지 세포가 분리된 동일한 동물로부터 핵을 빼낸 난모세포에 정지상태의 세포를 전기 자극을 통하여 융합시킬 수 있다. 재구성된 난모세포를 배양시켜, 상실배 또는 배반세포로 발생시키고, 그 다음 가상 임신한 암컷 부양 동물로 옮긴다. 암컷 부양 동물의 후손이 체세포가 분리된 동물의 클론이 된다.Clones of non-human transgenic animals described herein are described in Wilmut et al., Nature (1997) 385: 810-813; PCT publication WO 97/07668; It can be made according to the method described in WO 97/07669. Briefly, the somatic cells of the transgenic animal were isolated and induced to exit the growth process and enter the G 0 stage. The stationary cells can then be fused via electrical stimulation to oocytes from which the nucleus has been removed from the same animal from which the stationary cells have been isolated. Reconstituted oocytes are cultured and developed into mortality or blastocysts and then transferred to a virtual pregnant female dependent animal. A descendant of a female dependent animal becomes a clone of an animal from which somatic cells have been separated.
본 발명의 용도 및 방법Uses and Methods of the Invention
여기에서 설명하고 있는 핵산 분자, 단백질, 단백질 상사체 및 항체 및 이들의 단편들을 다음의 한 가지 이상 방법에 이용할 수 있다 a) 스크리닝 분석; b) 검출 분석(가령, 염색체 매핑, 조직 타이핑, 법의학); c) 예측 약물(가령, 진단 분석, 예후 분석, 임상적 시도 모니터링 및 약리 유전체학(pharmacogenomics)); d) 치료 방법(가령, 치료 및 예방). GAVE19 단백질이 다른 세포 단백질과 상호작용하기 때문에: (i) 세포 증식 조절 (ii) 세포 분화 조절 (iii) 세포 생존 조절에 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산을 이용하여 GAVE19 단백질을 발현시켜(가령, 유전자 치료법에서 숙주세포내에 재조합 발현 벡터를 통한 발현), GAVE19 mRNA(생물학적 시료내에 있는)를 검출하거나 또는 GAVE19 유전자에 있는 유전적 병소를 검출하거나 GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 또한, GAVE19 단백질을 이용하여 GAVE19활성 또는 발현을 조절하고, GAVE19 단백질의 과다 생산 또는 부족으로 인한 질환을 치료할 수 있는 약물 또는 화합물을 선별하거나 또는 GAVE19 야생형 단백질과 비교하였을 때, 감소된 또는 변종 활성을 가지는 GAVE19 단백질 형을 만들 수 있다. 또한 본 발명의 항GAVE19 항체를 이용하여 GAVE19 단백질을 검출 및 분리시키고, GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 설명한 스크리닝에 의해 확인된 신규한 물질을 포함하고, 여기에서 설명하고 있는 것을 이용하는 것도 포함한다.The nucleic acid molecules, proteins, protein analogs and antibodies and fragments thereof described herein can be used in one or more of the following methods: a) screening analysis; b) detection assays (eg, chromosome mapping, tissue typing, forensics); c) predictive drugs (eg, diagnostic analysis, prognostic analysis, clinical trial monitoring and pharmacogenomics); d) methods of treatment (eg, treatment and prevention). Because GAVE19 protein interacts with other cellular proteins: it can be used to: (i) regulate cell proliferation, (ii) regulate cell differentiation, and (iii) regulate cell survival. The isolated nucleic acid of the present invention is used to express GAVE19 protein (e.g., through recombinant expression vectors in host cells in gene therapy) to detect GAVE19 mRNA (in a biological sample) or genetic lesions in the GAVE19 gene. Can be detected or modulated GAVE19 activity. In addition, GAVE19 protein may be used to modulate GAVE19 activity or expression, select drugs or compounds that can treat diseases caused by overproduction or lack of GAVE19 protein, or to reduce or modify mutant activity when compared to GAVE19 wild-type protein. Eggplant can make the GAVE19 protein type. In addition, the anti-GAVE19 antibody of the present invention can be used to detect and isolate GAVE19 protein and regulate GAVE19 activity. The present invention also includes the novel materials identified by the screening described above and includes the use of those described herein.
스크리닝 분석Screening Analysis
내생 리간드 존재하에서 G 단백질이 활성화되면 G 단백질 수용체 복합체가 형성되어, GTP가 G 단백질에 결합하게 된다. G 단백질의 GTPase 도메인이 서서히 GTP를 GDP로 가수분해시켜, 정상적인 조건하에서 수용체 비활성화를 유도하게 된다. 그러나, 구성적으로 활성화된 수용체는 GDP를 GTP로 계속 가수분해한다.Activation of G protein in the presence of an endogenous ligand results in the formation of a G protein receptor complex, which binds GTP to the G protein. The GTPase domain of the G protein slowly hydrolyzes GTP to GDP, leading to receptor inactivation under normal conditions. However, constitutively activated receptors continue to hydrolyse GDP to GTP.
G 단백질의 가수분해되지 않은 기질인 [35S]GTPγS를 이용하여 구성적으로 활성화되는 수용체를 발현시키는 막에 결합되는 것이 강화되는지를 모니터한다. Traynor and Nahorski는 [35S]GTPγS 를 이용하여 리간드의 존부시에, 막에 G 단백질이 결합되는지를 모니터하였다고 보고한 바 있다(Traynor 등., Mol Pharmacol (1995) 47(4):848-54). 수용체에 결합하는 특정 G 단백질 없이 모든 G 단백질-결합된 수용체에 일반적으로 이와 같은 시스템을 이용할 수 있기 때문에 후보 화합물의 초기 스크리닝에도 이러한 분석 시스템을 적절하게 사용할 수 있다.[ 35 S] GTPγS, an unhydrolyzed substrate of G protein, is used to monitor binding to membranes that express constitutively activated receptors. Traynor and Nahorski have reported using [ 35 S] GTPγS to monitor the binding of G proteins to membranes in the presence of ligand (Traynor et al., Mol Pharmacol (1995) 47 (4): 848-54 ). Since such a system is generally available for all G protein-bound receptors without specific G protein binding to the receptor, such analytical systems can also be used appropriately for the initial screening of candidate compounds.
Gs20는 효소 아데닐 사이클라제를 자극하고, Gi 및 Go는 이 효소를 저해한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 아데닐 사이클라제는 ATP가 cAMP로 전환되는 것을 촉매하여, Gs 단백질에 결합하는 구성적으로 활성화된 GPCRs가 세포에서의 증가된 cAMP 수준과 연관이 있다. 대안으로, Gi (또는 Go) 단백질에 결합할 수 있는 구성적으로 활성화된 GCPRs는 세포내 감소된 cAMP 수준과 연관된다.“Indirect Mechanism of Synaptic Transmission,” Chpt. 8, from Neuron to Brain (3rd Ed.), Nichols 등. eds., Sinauer Associates, Inc., 1992참고. 따라서, cAMP를 검출하는 분석을 이용하여 후보 화합물이 수용체에 역 효능제인지를 결정할 수 있다. cAMP를 측정하는 당분야에 다양하게 공지된 방법을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 항cAMP 항체를 ELISA포멧에 이용하였다. 한 구체예에서는 전체 세포 제 2 메신져 리포터 시스템을 고려하였다(PCT 공보 WO 00/22131).G s20 stimulates the enzyme adenyl cyclase and Gi and Go inhibit this enzyme. As is known in the art, adenyl cyclase catalyzes the conversion of ATP to cAMP, so that constitutively activated GPCRs that bind Gs proteins are associated with increased cAMP levels in cells. Alternatively, constitutively activated GCPRs capable of binding Gi (or Go) proteins are associated with reduced intracellular cAMP levels. “Indirect Mechanism of Synaptic Transmission,” Chpt. 8, from Neuron to Brain (3rd Ed.), Nichols et al. See eds., Sinauer Associates, Inc., 1992. Thus, assays for detecting cAMP can be used to determine if a candidate compound is an inverse agonist at the receptor. Various methods known in the art for measuring cAMP can be used. In one embodiment, anti-cAMP antibodies were used in ELISA format. In one embodiment a whole cell second messenger reporter system was considered (PCT Publication WO 00/22131).
관련 측면에서, cyclic AMP는 cAMP반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자(CREB) 결합을 촉진시키고, 따라서 cAMP반응성 요소라고 불리는 특정 위치에서 프로모터에 결합되어 유전자 발현을 유도하게 된다. 따라서, β-갈락토시다제 또는 루시페라제와 같은 리포터 유전자 앞에 다중 cAMP 반응 요소를 포함하는 프로모터가 위치하도록 리포터 시스템을 구성한다. 또한, 구성적으로 활성화된 Gs 연결된 리포터는 cAMP가 누적되게 하기 때문에, 유전자를 활성화시키고, 리포터 단백질을 발현시킨다. β갈락토시다제 또는 루시페라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학적 분석법을 이용하여 검출할 수 있다(PCT 공보 WO 00/22131).In a related aspect, the cyclic AMP promotes cAMP reactive DNA binding protein or transcription factor (CREB) binding, and thus binds to a promoter at a specific location called cAMP reactive element to induce gene expression. Thus, the reporter system is constructed such that a promoter comprising multiple cAMP response elements is positioned before a reporter gene such as β-galactosidase or luciferase. In addition, constitutively activated Gs linked reporters cause cAMP to accumulate, thereby activating genes and expressing reporter proteins. Reporter proteins such as βgalactosidase or luciferase can be detected using standard biochemical assays (PCT Publication WO 00/22131).
Go 및 Gq와 같은 다른 G 단백질은 포스포리파제 C 효소의 활성화에 연관있는데, 이 효소는 인지질 PIP2를 가수분해시켜, 두 가지 세포내 메신져 즉, 디아실글리세롤(DAG) 과 이노시톨1,4,5삼인산염(IP3)을 방출한다. IP3 누적이 증가되는 것은 Gq 연합된 수용체 및 Go 연합된 수용체의 활성화와 연관 있다(PCT 공보 WO 00/22131). IP3 누적을 검출하는 분석을 이용하여 후보 화합물이 Gq 연합된 수용체 또는 Go연합된 수용체에 대해 역 효능제인지를 결정할 수 있다. Gq 연합된 수용체는 AP1 리포터 분석을 이용하여 분석할 수 있는데, 이 분석법은 Gq의존성 포스포리파제 C가 AP1 요소를 포함하는 유전자를 활성화시키는 원인인지를 분석한다. 따라서, 활성화된 Gq연합된 수용체는 이와 같은 유전자의 발현이 증가되었다는 것을 설명하고, 이에 따라 역 효능제는 이와 같은 발현에서 감소된다는 것을 설명한다.Other G proteins, such as Go and Gq, are involved in the activation of phospholipase C enzymes, which hydrolyze phospholipid PIP2, resulting in two intracellular messengers: diacylglycerol (DAG) and inositol1,4,5 It releases triphosphate (IP3). Increased IP3 accumulation is associated with activation of Gq associated receptors and Go associated receptors (PCT publication WO 00/22131). Assays that detect IP3 accumulation can be used to determine whether candidate compounds are inverse agonists for Gq associated or Go-associated receptors. Gq associated receptors can be analyzed using the AP1 reporter assay, which analyzes whether Gq-dependent phospholipase C is responsible for activating genes containing AP1 elements. Thus, activated Gq-associated receptors demonstrate increased expression of such genes, and thus reverse agonists decrease in such expressions.
또한, 본 발명은 후보 물질 또는 GAVE19 단백질에 결합하는 또는 GAVE19 발현 또는 GAVE19 활성에 자극 또는 저해 효과를 가지는 후보 또는 시험 화합물 또는 물질(펩티드, 펩티드 모방체, 소분자 또는 다른 약물)을 확인하는 방법(이하 “스크리닝 방법”이라 통칭함)을 제공한다.In addition, the present invention provides methods for identifying candidate or test compounds or substances (peptides, peptide mimetics, small molecules, or other drugs) that bind to the candidate substance or GAVE19 protein or have a stimulating or inhibitory effect on GAVE19 expression or GAVE19 activity Collectively referred to as the "screening method".
한 구체예에서, 본 발명은 GAVE19 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 막-결합된 형의 활성을 조절하거나 이에 결합할 수 있는 후보물질 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 당분야에 공지된 복합 라이브러리 방법에 이용할 수 있는 다양한 접근 방식으로 수득할 수 있는데, 예를 들면, 생물학적 라이브러리; 공간적으로 접근가능한 평행 고형상 또는 액상 라이브러리; 풀림(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; “한 개 비드한 개 화합물” 라이브러리 방법; 친화력 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법등이 포함된다. 생물학적 라이브러리 접근 방법은 펩티드 라이브러리에 한정하고, 다른 네가지 접근 방법은 펩티드, 펩티드가 아닌 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에도 적용할 수 있다(Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12:145).In one embodiment, the present invention provides a method for screening a candidate or test compound capable of modulating or binding the activity of a membrane-bound form of a GAVE19 protein, polypeptide or biologically active moiety thereof. Test compounds of the present invention can be obtained in a variety of approaches that can be used in complex library methods known in the art, including, for example, biological libraries; Spatially accessible parallel solid or liquid phase libraries; Synthetic library methods requiring deconvolution; “One bead compound” library method; Synthetic library methods using affinity chromatography screening, and the like. Biological library approaches are limited to peptide libraries, and other four approaches can also be applied to peptides, non-peptide oligomers or small molecule libraries of compounds (Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12: 145).
분자 라이브러리 합성 방법은 당분야에서 실예를 찾을 수 있다: DeWitt 등., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:6909; Erb 등., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:11422; Zuckermann 등., J Med Chem (1994) 37:2678; Cho 등., Science (1993) 261:1303; Carrell 등., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059; Carell 등., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2061; and Gallop 등., J Med Chem (1994) 37:1233.Molecular library synthesis methods can be found in the art: DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 6909; Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 11422; Zuckermann et al., J Med Chem (1994) 37: 2678; Cho et al., Science (1993) 261: 1303; Carrell et al., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33: 2061; and Gallop et al., J Med Chem (1994) 37: 1233.
화합물 라이브러리는 용액(예를들면 Houghten Bio/Techniques (1992) 또는 비드(Lam, Nature (1991) 354:82-84); 칩(Fodor, Nature (1993) 364:555-556), 세균(미국 특허 5,223,409), 포자(미국 특허 5,571,698; 미국 특허5,403,484; 미국 특허 5,223,409), 플라스미드(Cull 등., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:1865-1869) , 파아지(Scott 등., Science (1990) 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6378-6382; Felici, J Mol Biol (1991) 222:301-310)상에 제공할 수 있다.Compound libraries can be prepared by solution (e.g., Houghten Bio / Techniques (1992) or beads (Lam, Nature (1991) 354: 82-84); Chip (Fodor, Nature (1993) 364: 555-556), bacteria (US patent) 5,223,409), Spores (U.S. Patent 5,571,698; U.S. Patent 5,403,484; U.S. Patent 5,223,409), Plasmid (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 1865-1869), Phage et al., Science (1990) 249 : 386-390; Devlin, Science (1990) 249: 404-406; Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6378-6382; Felici, J Mol Biol (1991) 222: 301-310) Can be provided to
특정 구체예에서, 분석 방법은 세포 근거한 방법인데, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분의 막 결합된 형을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, GAVE19 단백질에 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정한다. 예를 들면, 세포는 효모균 세포 또는 포유류 기원의 세포가 될 수 있다. GAVE19 단백질에 결합할 수 있는 테스트 화합물의 결합 능력은 방사능 동위원소 표지된 또는 효소적으로 표지된 테스트 화합물을 결합시키고, 복합물내에 있는 표지된 화합물을 검출하여 GAVE19 단백질 또는 이 단백질의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 테스트 화합물이 결합되었는 지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 화합물에는125I,35S,14C,3H를 직간접적으로 표지시켜, 방사능 방출량을 직접적으로 헤아리거나 또는 신틸레이션 카운팅을 이용하여 방사능 동위원소를 검출한다. 대안으로, 테스트 화합물을 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제 또는 루시페라제를 이용하여 표지화하고, 적절한 기질이 생성물로 전환되는 양을 결정한다. 특정 구체예에서, 분석 방법은 세포상에 세포막에 결합된 형태의 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분 단백질을 발현시키는 세포를 GAVE19 단백질과 결합하여 분석 혼합물을 형성하는 공지의 화합물과 접촉시키고, 분석 혼합물을 테스트 화합물과 접촉시켜, GAVE19 단백질과 상호작용할 수 있는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것으로 구성되는데, 이때 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정하는 방법은 공지의 화합물과 비교하였을 때, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 선호적으로 결합할 수 있는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것으로 구성된다.In certain embodiments, the assay method is a cell based method, wherein cells expressing the membrane bound form of the GAVE19 protein or a biologically active portion thereof are contacted with the test compound and the ability of the test compound to bind to the GAVE19 protein is determined. For example, the cells can be yeast cells or cells of mammalian origin. The ability of a test compound to bind to GAVE19 protein binds to a radioisotope labeled or enzymatically labeled test compound and detects the labeled compound in the complex to provide a bioactive activity of the GAVE19 protein or the protein. It can be determined whether the test compound is bound to the moiety. For example, the compounds may be labeled directly or indirectly with 125 I, 35 S, 14 C, and 3 H to detect radioactive isotopes by directly counting the amount of radioactive release or by using scintillation counting. Alternatively, the test compound is labeled with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or luciferase and the amount of conversion of the appropriate substrate to the product is determined. In certain embodiments, the assay method comprises contacting a cell expressing a GAVE19 protein or a biologically active partial protein thereof in a form bound to the cell membrane with a known compound that binds to the GAVE19 protein to form an assay mixture, Contacting the assay mixture with a test compound to determine the ability of the test compound to interact with the GAVE19 protein, wherein the method of determining the ability to interact with the GAVE19 protein, when compared to a known compound, is a GAVE19 protein. Or determining the ability of a test compound to bind preferentially to its biologically active moiety.
또 다른 구체예에서, 분석 방법은 세포를 기초한 분석 방법으로, 이 방법은 세포막에 결합된 형태의 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분단백질을 발현시키는 세포를 그 세포 표면 상에서 테스트 화합물과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절(자극 또는 저해)하는 능력을 결정하는 것으로 구성된다. GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력은 GAVE19 단백질이 GAVE19 표적 분자와 결합하는 능력 또는 표적분자와 상호작용하는 능력을 결정하여 이루어진다. 여기에서 사용된 것과 같이, “표적 분자”는 자연에서 GAVE19 단백질이 결합하는 또는 상호작용하는 분자를 말하는데, 예를 들면, GAVE19 단백질을 발현시키는 세포의 표면에 있는 분자, 제 2 세포의 표면상에 있는 분자, 세포외 매트릭스상에 분자, 세포 막 내면 또는 세포질 분자와 연합하는 분자등이 된다. GAVE19 표적 분자는 GAVE19 이 아닌 분자 또는 본 발명의 GAVE19 단백질 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 한 구체예에서, GAVE19 표적 분자는 세포 막을 통하여 세포외 시그날을 세포로 유도할 수 있는 시그날 유도 경로의 성분(가령, 막에 결합된 GAVE19 분자에 화합물이 결합되어 발생되는 시그날)이 될 수 있다. 예를 들면, 표적은 촉매 활성을 가지는 제 2 세포 단백질 또는 GAVE19와 하향 시그날 분자와 연합될 수 있는 단백질이 될 수 있다.In another embodiment, the assay is a cell-based assay, wherein the method comprises contacting a cell expressing a GAVE19 protein in its bound form with a test compound on its cell surface and expressing a biologically active subprotein thereof. , Test compounds determine the ability to modulate (stimulate or inhibit) the activity of the GAVE19 protein or a biologically active portion thereof. The ability of a test compound to modulate the activity of a GAVE19 protein or a biologically active portion thereof is determined by determining the ability of the GAVE19 protein to bind to or interact with the GAVE19 target molecule. As used herein, “target molecule” refers to a molecule that GAVE19 protein binds to or interacts with in nature, for example, a molecule on the surface of a cell expressing GAVE19 protein, on the surface of a second cell. Molecules on the extracellular matrix, molecules inside the cell membrane, or molecules associated with cytoplasmic molecules. The GAVE19 target molecule can be a molecule other than GAVE19 or a GAVE19 protein or polypeptide of the invention. In one embodiment, the GAVE19 target molecule can be a component of a signal induction pathway capable of inducing extracellular signals into cells through the cell membrane (eg, a signal generated by binding a compound to a GAVE19 molecule bound to the membrane). For example, the target may be a second cellular protein having catalytic activity or a protein capable of associating with GAVE19 and a downstream signal molecule.
GAVE19 표적 분자에 결합할 수 있는 또는 상호작용할 수 있는 GAVE19 단백질의 능력은 직접적인 결합을 결정하는 상기에서 설명하는 한 가지 방법에 의해 이루어진다. 적절한 구체예에서, GAVE19 표적 분자에 결합할 수 있는 또는 상호작용할 수 있는 GAVE19 단백질의 능력을 결정하는 방법은 표적 분자의 활성을 결정하는 것으로 이루어진다. 예를 들면, 표적 분자의 활성은 표적의 세포 제 2 메신져 유도를검출하여(가령, 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3등), 적절한 기질상에 표적의 촉매적/효소적 활성을 검출하고(예를 들면, 루시페라제와 같은 검출 가능한 마커를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 GAVE19 반응성 조절 원소), 세포 분화 또는 세포 증식과 같은 세포 반응을 검출하는 것으로 결정된다.The ability of a GAVE19 protein to bind to or interact with a GAVE19 target molecule is achieved by one of the methods described above to determine direct binding. In suitable embodiments, the method of determining the ability of a GAVE19 protein to bind to or interact with a GAVE19 target molecule consists in determining the activity of the target molecule. For example, the activity of the target molecule can be detected by detecting the cellular second messenger induction of the target (eg intracellular Ca 2+ , diacylglycerol, IP3, etc.) to detect the catalytic / enzymatic activity of the target on an appropriate substrate. (Eg, a GAVE19 responsive regulatory element operably linked to a nucleic acid encoding a detectable marker, such as luciferase), and to detect cellular responses such as cell differentiation or cell proliferation.
본 발명은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 테스트 화합물에 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분과 결합하는 능력을 측정하는 것으로 구성된 무세포 분석을 포함한다. GAVE19 단백질에 테스트 화합물이 결합하는 정도는 상기에서 설명하는 것과 같이 직간접적으로 결정할 수 있다. 적절한 구체예에서, 분석법에는 GAVE19에 결합하는 공지 화합물을 GAVE19 단백질 또는 생물학적으로 활성을 가지는 부분과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정하고, 이때 GAVE19 단백질이 테스트 화합물에 결합하는 능력을 공지 화합물의 능력과 비교하여, GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분에 테스트 화합물이 결합하는 능력을 결정하는 것으로 구성된다.The present invention includes acellular analysis consisting of contacting a GAVE19 protein or a biologically active portion thereof with a test compound and measuring the ability of the test compound to bind to the GAVE19 protein or a biologically active portion thereof. The degree of binding of the test compound to the GAVE19 protein can be determined directly or indirectly as described above. In a suitable embodiment, the assay comprises contacting a known compound that binds GAVE19 with a GAVE19 protein or a biologically active moiety and determining the ability of the test compound to interact with the GAVE19 protein, wherein the GAVE19 protein binds to the test compound. Comparing the ability to that of a known compound, it consists in determining the ability of the test compound to bind to the GAVE19 protein or its biologically active moiety.
본 발명의 또다른 무세포 분석 방법은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 테스트 화합물과 접촉시키고, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분의 활성을 조절하는 능력(예를 들면, 자극 또는 저해)을 결정하는 것으로 구성된다. GAVE19 의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 방법은 직접 결합하는 정도를 결정하기 위해 상기에서언급하는 방법중 한 가지를 이용하여 GAVE19 표적 분자에 결합하는 GAVE19의 활성을 결정하는 것이다. 또 다른 구체예에서, GAVE19 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력은 추가로 GAVE19 표적 분자를 조절하는 GAVE19 단백질의 능력을 결정하는 것이다. 예를 들면, 적절한 기질상에 표적 분자의 촉매/효소 활성은 이미 언급한 것과 같이 결정될 수 있다.Another cell-free assay method of the present invention provides a method of contacting a GAVE19 protein or a biologically active portion thereof with a test compound, and the ability of the test compound to modulate the activity of the GAVE19 protein or a biologically active portion thereof (e.g., , Stimulation or inhibition). A method of determining the ability of a test compound to modulate the activity of GAVE19 is to determine the activity of GAVE19 binding to the GAVE19 target molecule using one of the methods mentioned above to determine the extent of direct binding. In another embodiment, the ability of the test compound to modulate GAVE19 activity is further to determine the ability of the GAVE19 protein to modulate GAVE19 target molecules. For example, the catalytic / enzyme activity of the target molecule on a suitable substrate can be determined as already mentioned.
본 발명의 또 다른 무세포 분석 방법은 GAVE19 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성을 가진 부분을 공지 화합물(GAVE19 단백질과 접촉하여 혼합물을 형성하는 것으로 공지된)과 접촉시키고, 분석 혼합물과 테스트 혼합물을 접촉시켜, 테스트 화합물이 GAVE19 단백질과 상호작용하는 능력을 결정한다. GAVE19 단백질과 분석 화합물의 상호작용을 결정하는 단계는 GAVE19 단백질이 GAVE19 표적 분자에 선호적으로 결합하는지 또는 표적 분자의 활성을 조절하는지를 결정하는 것으로 구성된다.Another cell-free assay method of the present invention comprises contacting a GAVE19 protein or a biologically active portion thereof with a known compound (known to form a mixture by contacting the GAVE19 protein) and contacting the assay mixture with the test mixture, The test compound determines the ability to interact with the GAVE19 protein. Determining the interaction of the GAVE19 protein with the analyte compound consists of determining whether the GAVE19 protein binds preferentially to the GAVE19 target molecule or modulates the activity of the target molecule.
수용체는 리간드가 아닌 분자에 의해 활성이 조절되는데, 비리간드 분자가 리간드 결합을 반드시 저해하는 것은 아니지만, 수용체내에 구조적 변화를 유도하여, G 단백질 결합 또는 수용체 응집, 이량체화 또는 군집화되도록 하여 활성화의 원인이 될 수도 있다. 예를 들면, 세포 표면상에 누출된 다양한 GAVE19 부분에 대한 항체가 생성될 수 있다. 이들 항체는 표준 분석 가령, cAMP 수준 또는 세포내 Ca+2수준을 모니터하는 등의 방법으로 결정하였을 때, G 단백질 연속 반응을 통하여 세포를 활성화시킨다. 분자 매핑, 특히 에피토프 매핑이 관련되기 때문에, 모노클로날 항체가 적합할 것이다. 세포 표면상에서 발현되는 고유 수용체 및 세포 표면에서 형성되는 것으로 공지된 펩티드 모두에 대해 모노클로날 항체를 만들 수 있다. 다수의 관련 펩티드를 수득하기 위해 Geysen 등., 미국 특허 5,998,577 방법을 실시할 수도 있다. GAVE19를 활성화시키는 것으로 밝혀진 항체를 변형시켜, 상보적 고정과 같은 GAVE19 활성화에 대한 외생 활성을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 항체를 절단 또는 돌연변이시켜 GAVE19 활성화이외의 활성을 최소화 또는 제거할 수 있다. 예를 들면, 특정 항체 경우에, 항원결합 부분만 필요하다. 따라서, 항체의 Fc 부분을 제거할 수 있다.Receptors are regulated by non-ligand molecules, although nonligand molecules do not necessarily inhibit ligand binding, but induce structural changes in the receptor, causing G protein binding or receptor aggregation, dimerization, or clustering, causing activation It could be For example, antibodies to various GAVE19 moieties that leak on the cell surface can be generated. These antibodies activate cells through a G protein serial response, as determined by standard assays such as monitoring cAMP levels or intracellular Ca +2 levels. As molecular mapping, in particular epitope mapping, is involved, monoclonal antibodies will be suitable. Monoclonal antibodies can be made against both native receptors expressed on the cell surface and peptides known to form on the cell surface. Geysen et al., US Pat. No. 5,998,577 can also be carried out to obtain a number of related peptides. Antibodies found to activate GAVE19 can be modified to minimize exogenous activity on GAVE19 activation, such as complementary immobilization. Thus, antibodies can be cleaved or mutated to minimize or eliminate activity other than GAVE19 activation. For example, for certain antibodies, only the antigen binding portion is needed. Thus, the Fc portion of the antibody can be removed.
GAVE19를 발현시키는 세포를 항체에 노출시켜, GAVE19를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 세포에 다양한 분자를 노출시켜, 어떤 분자가 활성의 상승 또는 감소와 같은 수용체 활성을 조절하는지를 확인한다. 활성화가 안된 세포상에서 항체의 효과를 관찰하기 위해 항체 없이 GAVE19를 발현시키는 세포상에서 이러한 목적을 가진 분자를 테스트하였다. 그 다음 표적분자는 공지 기술을 이용하여 GAVE19 대사가 변경된 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 후보 물질로써 테스트 및 변형시킨다.Cells expressing GAVE19 can be exposed to antibodies to activate GAVE19. Various molecules are exposed to activated cells to identify which molecules regulate receptor activity, such as increase or decrease in activity. To observe the effect of antibodies on inactivated cells, molecules with this purpose were tested on cells expressing GAVE19 without antibodies. Target molecules are then tested and modified using candidate techniques as candidates that can be used to treat diseases with altered GAVE19 metabolism.
본 발명의 무세포 분석은 가용성 형태 및 막결합된 형태의 GAVE19에 모두 이용할 수 있다. 막결합된 GAVE19로 구성된 무세포 분석 경우에, 가용제를 이용하여 막결합된 GAVE19 형을 용액내에 유지시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 가용화제를 예로 들면, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥탄오일-N-메틸글루코시드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤 X100, 트리톤 X114,THESIT , 이소트리데실폴리(에틸렌 글리콜 에테스)n, 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-아미노-1-프로판 설포네이트와 같은 비-이온성 계면활성제를 이용한다.Cell-free assays of the present invention can be used for both soluble and membrane bound forms of GAVE19. In the case of cell-free analysis consisting of membrane-bound GAVE19, it is desirable to maintain the membrane-bound GAVE19 form in solution using a soluble agent. Examples of such solubilizers include n-octylglucoside, n-dodecylglucoside, n-dodecyl maltoside, octanoyl-N-methylglucoside, decanoyl-N-methylglucamide, triton X100, Triton X114, THESIT, Isotridecylpoly (ethylene glycol ethers) n, 3-[(3-chloroamidopropyl) dimethylamino] -1-propane sulfonate (CHAPS), 3-[(3-chloroamido Propyl) dimethylamino] -2-hydroxy-1-propane sulfonate (CHAPSO) or N-dodecyl = N, N-dimethyl-3-amino-1-propane sulfonate. .
본 발명의 상기 분석 방법의 한 가지 이상의 구체예에서, GAVE19 또는 이의 표적분자를 고정시켜 한 가지 또는 두 가지 단백질이 복합된 형을 복합안된 형으로부터 분리시키고, 자동화된 분석을 실행할 수 있다. 테스트 화합물이 GAVE19 단백질에 결합 또는 후보 테스트 화합물 유무하에 GAVE19와 이의 표적 분자의 상호작용이 있는지를 분석하는 것은 반응물질을 포함하는 임의 용기내에서 실행할 수 있다. 이와 같은 용기로는 미량적정 플레이트, 시험관, 마이크로 원심분리 튜브등이 포함된다. 한 구체예에서, 한 가지 또는 두 가지 단백질 모두다 매트릭스에 결합을 허용하는 도메인을 융합 단백질을 추가 제공할 수도 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스퍼라제/GAVE19 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제 /표적 단백질을 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO)상에 흡착시킨다. 대안으로 글루타치온-유도된 미량 적정판은 시험 화합물과 복합된다. 순차로, 비흡착된 표적 단백질 또는 GAVE19 단백질 복합체 형성을 유도하는 조건(가령, 염, pH에 대해 생리학적 조건에서)에서 배양된다. 배양 후에, 비드 또는 미량적정 플레이트를 세척하여 결합안된 임의 성분을 씻어내고, 상기에서 설명한 것과 같이 복합체가 형성된 것을 직간접적으로 측정할 수 있다. 대안으로, 복합체는 매트릭스로부터 분리되어, 표준 기술을 이용하여 GAVE19 결합 또는 활성 레벨을 결정할 수 있다.In one or more embodiments of the assay method of the present invention, GAVE19 or a target molecule thereof may be immobilized to separate one or two protein-combined forms from an uncomplexed form and to perform automated analysis. Assaying whether a test compound binds to GAVE19 protein or interacts with GAVE19 and its target molecule with or without a candidate test compound can be performed in any vessel containing the reactants. Such containers include microtiter plates, test tubes, micro centrifuge tubes, and the like. In one embodiment, one or both proteins may further provide a fusion protein with a domain that allows binding to the matrix. For example, glutathione-S-transferase / GAVE19 fusion protein or glutathione-S-transferase / target protein is adsorbed onto glutathione sepharose beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Alternatively, the glutathione-derived microtiter plate is combined with the test compound. Sequentially, they are cultured under conditions that lead to the formation of non-adsorbed target proteins or GAVE19 protein complexes (eg, under physiological conditions for salt, pH). After incubation, the beads or microtiter plates can be washed to wash away any unbound components and to measure directly or indirectly the formation of the complex as described above. Alternatively, the complex can be separated from the matrix to determine GAVE19 binding or activity levels using standard techniques.
단백질을 매트릭스에 고정시키는 다른 기술을 본 발명의 스크리닝 분석에 이용할 수 있다. 예를 들면, GAVE19 또는 이의 표적 분자를 바이오틴 및 스트렙타아비딘을 복합 사용하여 고정시킬 수 있다. 당분야에 공지된 기술(바이오티닐화 반응 키드, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 이용하여 바이오틴-NHS(N-하이드록시숙시니미드)로부터 바이오티닐화된 GAVE19 또는 이의 표적분자를 준비할 수 있고, 스트렙타아비딘피복된 96웰 플레이트(Pierce Chemicals)에 고정시킨다. 대안으로 GAVE19 또는 이의 표적 분자와 반응성이 있으나, GAVE19 단백질이 이의 표적 분자에 결합하는 것을 방해하지는 않는항체를 플레이트의 웰로부터 유도할 수 있다. 배양시에 결합안된 표적 또는 GAVE19는 항체 결합에 의해 웰에 갇히게 된다. GST고정된 복합체에 대해 상기에서 설명하는 것에 추가하여, 이와 같은 복합체를 검출하는 방법에는 GAVE19 또는 이의 표적 분자와 반응성이 있는 항체를 이용한 복합체의 면역검출 뿐만 아니라, GAVE19 또는 표적 분자와 연합된 효소 활성을 검출하는 것에 효소-연결된 분석을 이용하는 것이 포함된다.Other techniques for immobilizing proteins on the matrix can be used in the screening assays of the present invention. For example, GAVE19 or a target molecule thereof can be immobilized using a combination of biotin and streptavidin. Biotinylated GAVE19 or its target molecules can be prepared from biotin-NHS (N-hydroxysuccinimide) using techniques known in the art (Biotinylation Reaction Kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) And fixed in streptavidin coated 96 well plates (Pierce Chemicals). Alternatively, antibodies can be derived from the wells of the plate that are reactive with GAVE19 or its target molecule but do not interfere with the binding of the GAVE19 protein to its target molecule. Uncultivated target or GAVE19 is trapped in the wells by antibody binding upon incubation. In addition to what is described above for GST-fixed complexes, methods for detecting such complexes include enzyme activity associated with GAVE19 or a target molecule, as well as immunodetection of the complex with an antibody that is reactive with GAVE19 or a target molecule thereof. Detecting an enzyme involves using an enzyme-linked assay.
또 다른 구체예에서, GAVE19 발현 조절물질을 확인할 수 있는데, 이때 확인하는 방법은 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 세포에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질이 발현되었는지를 결정한다. 후보 화합물 존재하에 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물이 없는 상태에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 비교한 것을 기초하여 후보 화합물이 GAVE19 발현 조절물질 인지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 후보화합물이 없을 때 보다 후보 화합물이 있을 때, GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현이 더 큰 경우(통계학적으로 유의성이 더 큰), 후보 화합물은 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현의 자극물질 또는 효능제라고 할 수 있다. 대안으로, 후보 화합물이 없을 경우보다 있는 경우 GAVE19 mRNA 또는 단백질의 발현 정도가 적다면(통계상으로 유의성이 적은 경우), 후보 화합물은 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현의 저해물질 또는 길항제라고 할 수 있다. GAVE19 활성이 리간드 또는 효능제가 있는 상태에서 활성이 감소된다면 또는 구성 GAVE19에서 기저 수준 이하인 경우에, 후보 화합물은 역 효능제라고 할 수 있다. GAVE19 mRNA 또는 단백질을 검출용으로 설명된 방법으로 세포에서 GAVE19 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 결정할 수 있다.In another embodiment, GAVE19 expression modulators can be identified wherein the method of contacting a cell is contacted with a candidate compound and determines whether GAVE19 mRNA or protein is expressed in the cell. The expression level of GAVE19 mRNA or protein in the presence of the candidate compound is compared to the expression level of GAVE19 mRNA or protein in the absence of the candidate compound. Based on the comparison, it can be determined whether the candidate compound is a GAVE19 expression modulator. For example, when there is greater expression of GAVE19 mRNA or protein (more statistically significant) when there is a candidate compound than when there is no candidate compound, the candidate compound is a stimulant or agonist of GAVE19 mRNA or protein expression. It can be said. Alternatively, if there is less expression of GAVE19 mRNA or protein (when statistically less significant) than there is no candidate compound, the candidate compound may be called an inhibitor or antagonist of GAVE19 mRNA or protein expression. If GAVE19 activity is reduced in the presence of a ligand or agonist, or below the baseline level in constituent GAVE19, the candidate compound may be referred to as a reverse agonist. The method described for detecting GAVE19 mRNA or protein can determine GAVE19 mRNA or protein expression levels in cells.
본 발명의 또 다른 측면에서, GAVE19 단백질을 이중-하이브리드화 분석 또는 삼중-하이브리드화 분석에서 “미끼 단백질”로 이용하여, GAVE19 단백질에 결합하는 또는 상호작용하는 다른 단백질(“GAVE19결합 단백질” 또는 “GAVE19bp”) 을 확인할 수 있고(미국 특허 5,283,317; Zervos 등., Cell (1993) 72:223-232; Madura 등., J Biol Chem (1993) 268:12046-12054; Bartel 등., Bio/Techniques (1993) 14:920-924; Iwabuchi 등., Oncogene (1993) 8:1693-1696; PCT 공보 WO 94/10300), GAVE19 활성을 조절할 수 있다. 이와 같은 GAVE19 결합 단백질은 GAVE19 경로의 상행 또는 하행 요소등의 GAVE19 단백질에의한 시그날 전달에 연관이 되는 것으로 보인다.In another aspect of the invention, the GAVE19 protein is used as a "bait protein" in a double-hybridization assay or in a triple-hybridization assay, whereby another protein that binds to or interacts with the GAVE19 protein ("GAVE19 binding protein" or " GAVE19bp ”) (US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell (1993) 72: 223-232; Madura et al., J Biol Chem (1993) 268: 12046-12054; Bartel et al., Bio / Techniques ( 1993) 14: 920-924; Iwabuchi et al., Oncogene (1993) 8: 1693-1696; PCT publication WO 94/10300), GAVE19 activity can be modulated. These GAVE19 binding proteins appear to be involved in signal transduction by GAVE19 proteins, such as the ascending or descending elements of the GAVE19 pathway.
본원 발명으로 인하여 다량의 순수 GAVE19가 만들어지는 경우에, 이상적인 약물 디자인을 위해, 기능을 하는 것으로 보이는 부위의 모양에 대한 물리적인 특징을 조정할 수 있다. 분자의 IC3 부분과 EC 도메인이 특히 관심을 끄는 부분이다.일단 부위의 모양 및 이온성 특징이 확인되면, 이들 부위와 상호작용할 있는 후보 약물을 만들고, 고유 세포, 동물 및 환자에서 테스트한다. 3D 구조 정보와 같은 정보를 끌어낼 수 있는 방법은 X선 결정학, NMR 분광기, 분자 모델링 등이 포함된다. 3D 구조로 공지 약물에 존재하는 공지 단백질에서 유사 모양을 확인할 수 있다. 이들 약물 및 유도체는 류마티스 관절염 또는 COPD와 같은 염증 질환 또는 질병 및 다른 여러질환을 치료하는데 이용 될 수도 있다.Where a large amount of pure GAVE19 is produced by the present invention, for ideal drug design, the physical characteristics of the shape of the site that appears to function can be adjusted. The IC3 portion and the EC domain of the molecule are of particular interest. Once the shape and ionic characteristics of the sites are identified, candidate drugs are created that can interact with these sites and tested in native cells, animals and patients. Methods that can derive information, such as 3D structural information, include X-ray crystallography, NMR spectroscopy, and molecular modeling. The 3D structure can identify similar shapes in known proteins present in known drugs. These drugs and derivatives may also be used to treat inflammatory diseases or conditions such as rheumatoid arthritis or COPD and many other diseases.
본 발명은 또한 상기에서 설명하는 스크리닝 분석에의해 확인된 신규 물질 및 여기에서 설명하는 치료 용도에 이 물질을 이용하는 것이 포함된다.The present invention also encompasses the use of these materials in novel materials identified by the screening assays described above and in the therapeutic uses described herein.
본 발명의 분석Analysis of the Invention
검출 분석Detection analysis
본 발명의DNA 서열 일부 또는 단편을 폴리뉴클레오티드 시약으로써 다양한 곳에 이용할 수 있다. 예를 들면 (i) 염색체상에 각 유전자를 매핑하고, 유전자 질환과 연관된 유전자 부위를 찾고; (ii) 작은 생물학적 시료(조직 타이핑)에서 개별 샘플을 확인하고 (iii) 생물학적 시료의 법의학적인 확인 때 서열을 사용할 수 있다. 이용 부분은 하기에서 설명한다.A portion or fragment of the DNA sequence of the present invention can be used in various places as a polynucleotide reagent. For example (i) mapping each gene on the chromosome and finding a gene region associated with the genetic disease; (ii) identify individual samples in small biological samples (tissue typing), and (iii) use sequences in forensic identification of biological samples. The use part is described below.
염색체 매핑Chromosome Mapping
일단 유전자 서열(또는 서열의 일부)이 분리되면, 그 서열을 이용하여 염색체상에 GAVE19 유전자 위치를 매핑할 수 있다. 따라서, 여기에서 설명하는 GAVE19 핵산 분자 또는 이의 단편을 이용하여, 게놈 상에 GAVE19 위치를 매핑할 수 있다.게놈 내의 GAVE19 서열의 매핑은 질병과 유전자 서열의 관계를 확인할 때 중요한 단계이다.Once the gene sequence (or a portion of the sequence) is isolated, the sequence can be used to map the GAVE19 gene position on the chromosome. Thus, the GAVE19 nucleic acid molecules or fragments thereof described herein can be used to map GAVE19 positions on the genome. The mapping of GAVE19 sequences in the genome is an important step in identifying the relationship between disease and gene sequences.
간략하게 설명하면, GAVE19유전자는 GAVE19 서열에서 PCR프라이머(바람직하게는 1525bp 길이)를 준비하여 게놈 내에 매핑한다. 프라이머는 개별 뮤린 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드화 PCR 스크리닝에 이용된다. GAVE19 서열에 상응하는 뮤린 유전자를 포함하는 하이브리드화만 증폭된 단편을 생산한다.Briefly, the GAVE19 gene prepares a PCR primer (preferably 1525 bp in length) from the GAVE19 sequence and maps it into the genome. Primers are used for somatic hybridization PCR screening involving individual murine chromosomes. Only hybridizations containing murine genes corresponding to the GAVE19 sequence produce amplified fragments.
특정 방법에는 쥐의 염색체를 변성시키고, 엄격한 조건하에서 검출 가능한 표지된 GAVE19 DNA 분자와 접촉시키는 것이 포함되나 이에 한정시키지는 않는다. 하이브리드화 반응과 연속하여 검출 가능하게 표지된 GAVE19 DNA 분자 검출로 쥐의 염색체 상에 GAVE19 위치를 확인할 수 있다. 이와 같은원위치하이브리드화 반응 기술 (Fan 등., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6223-27에서 상술되어 있음)에서, 표지된 유동 선별된 염색체를 이용한 사전스크리닝 및 염색체 특이적인 cDNA 라이브러리에 하이브리드화 반응에 의한 사전 선별등이 포함된다. 유사분열 중기 염색체 스프레드에 DNA 서열의 형광원위치하이브리드화 반응(FISH)을 이용하여 단일 단계에서 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 유사분열 스핀들을 파괴하는 화학물질 예로 콜세미드(colcemid)에 의해 분열이 중기에서 차단된 세포를 이용하여, 염색체 스프레드를 만들 수 있다. 염색체를 트립신으로 간단하게 처리한 후에 Giemsa로 착색한다. 각 염색체상에 명암 패턴이 나타나기 때문에 염색체를 개별적으로 확인할 수 있다. FISH 기술은 길이가 500 또는 600bp로 짧은 DNA 서열에 이용할 수 있다. 그러나, 1,000bp이상의 긴 클론은 간단하게 검출할 수 있는 독특한 염색체 위치에 더 잘 결합할 수 있다. 바람직하게는 1,000개 염기, 더 바람직하게는 2,000개 염기 정도면 적절한 시간내에 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 기술에 대해서는 Verma 등. (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988))에서 확인할 수 있다. 염색체 매핑은 컴퓨터 시뮬레이션으로 추정할 수 있는데, 로드 스코어 또는 메어 근접성과 같은 통계학적 변수를 이용할 수 있다.Specific methods include, but are not limited to, degeneration of mouse chromosomes and contact with labeled GAVE19 DNA molecules detectable under stringent conditions. Detecting GAVE19 DNA molecules detectably labeled in series with the hybridization reaction can confirm the GAVE19 position on the mouse chromosome. In this in situ hybridization reaction technique (as described in Fan et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6223-27), hybridization to prescreening and chromosome specific cDNA libraries using labeled flow-selected chromosomes Pre-screening by ignition reaction is included. Fluorescence in situ hybridization reaction (FISH) of DNA sequences can be used for mitotic midterm chromosomal spreads to provide accurate chromosomal location in a single step. Chemicals that disrupt mitotic spindles can be used to produce chromosomal spreads, using cells whose division is blocked in the middle phase by colisemid. The chromosome is simply treated with trypsin and then stained with Giemsa. Contrasts can be identified individually because light and dark patterns appear on each chromosome. FISH techniques are available for short DNA sequences of 500 or 600 bp in length. However, long clones of more than 1,000 bp can bind better to unique chromosomal sites that are simply detectable. Preferably, about 1,000 bases, more preferably about 2,000 bases, can achieve good results in a timely manner. Verma et al. (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988)). Chromosomal mapping can be estimated by computer simulation, using statistical variables such as load scores or mare proximity.
염색체 매핑에 이용되는 시약을 개별적으로 이용하여 염색체를 표시한다. 또한, 시약 패널을 이용하여 다중위치 또는 다중 염색체를 표시할 수 있다. GAVE19 유전자의 인접 부분에 상응하는 시약을 사용하는 것이 매핑에 적절하다. 암호화 서열은 유전자 족내에서 보존되어, 염색체 매핑동안에 교차 하이브리드화 반응의 기회가 늘어난다.The reagents used for chromosome mapping are used individually to mark chromosomes. In addition, reagent panels can be used to indicate multi-site or multiple chromosomes. Use of reagents corresponding to adjacent portions of the GAVE19 gene is appropriate for mapping. Coding sequences are conserved within the gene family, increasing the chance of cross-hybridization reactions during chromosome mapping.
서열을 일단 정확한 염색체에 매핑한 후에, 염색체 상에 서열의 물리적인 위치를 유전자 지도 데이터와 연관시킬 수 있다. 동일한 염색체 부분에 매핑된 유전자와 질병과의 상관관계는 연결 분석을 통하여 확인할 수 있다(물리적으로 인접한 유전자의 공통유전)Egeland 등., Nature (1987) 325:783-787.Once the sequence is mapped to the correct chromosome, the physical location of the sequence on the chromosome can be associated with genetic map data. Correlation between genes mapped to the same chromosomal region and disease can be confirmed by linkage analysis (common genetics of physically contiguous genes) Egeland et al., Nature (1987) 325: 783-787.
또한, GAVE19 과 연관된 질병이 있는 개체와 질병이 없는 개체 간에 DNA 서열의 차이를 결정할 수 있다. 질병이 있는 개체의 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰되나, 질병이 없는 개체에서는 관찰되지 않는다면, 돌연변이는 특정 질환의 원인 인자가 될 가능성이 있다. 질병이 있는 개체와 질병이 없는 개체와의 비교는 일반적으로 염색체 스프레드에서 육안으로 확인되거나 DNA 서열에 기초한 PCR을 이용하여 검출 가능한 결손 또는 전치와 같은 염색체 상의 구조적 변화를 우선 찾는다. 궁극적으로는 몇 몇 개체의 유전자의 완전한 서열로 다형성과 구별하여, 돌연변이가 있는지를 확인하는 것이다In addition, differences in DNA sequences can be determined between individuals with disease associated with GAVE19 and those without disease. If mutations are observed in some or all of the diseased subject but not in the diseased subject, the mutation is likely a causative agent of certain diseases. Comparisons between diseased and diseased individuals generally look first for structural changes on the chromosome, such as defects or translocations that are visually identified on chromosomal spreads or detectable using PCR based on DNA sequences. Ultimately, the complete sequence of several genes is used to distinguish them from polymorphisms to identify mutations.
1. 진단학적 분석1. Diagnostic Analysis
생물학적 시료내에 GAVE19의 존부를 검출하는 방법은 시험 개체로부터 생물학적 시료를 얻고, GAVE19 단백질 또는 GAVE19 단백질을 암호화하는 핵산 (mRNA 또는 게놈 DNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질을 생물학적 시료에 접촉시켜, 시료내에 GAVE19가 존재하는지를 검출하는 것으로 구성된다. GAVE19 mRNA 또는 게놈 DNA 검출에 적절한 물질은 GAVE19 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화 할 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 서열 1의 핵산 등의 전장 GAVE19 핵산 또는 이의 일부분이 핵산 프로브가 될 수 있는데, 일부분이란 엄격한 조건하에서 GAVE19 mRNA 또는 게놈DNA에 하이브리드화 할 수 있을 정도의 충분한 길이 즉, 적어도 15, 30, 50, 100, 250, 500개 또는 그 이상의 길이가 될 수 있다. 진단 분석에 이용할 수 있는 다른 적절한 프로브도 여기에서 설명한다.The method of detecting the presence of GAVE19 in a biological sample comprises obtaining a biological sample from a test subject and contacting the biological sample with a compound or substance capable of detecting GAVE19 protein or nucleic acid (mRNA or genomic DNA) encoding GAVE19 protein, Consists in detecting whether GAVE19 is present in the. Suitable materials for detecting GAVE19 mRNA or genomic DNA are labeled nucleic acid probes capable of hybridizing to GAVE19 mRNA or genomic DNA. The full length GAVE19 nucleic acid, or a portion thereof, such as the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 may be a nucleic acid probe, the portion being of sufficient length to hybridize to GAVE19 mRNA or genomic DNA under stringent conditions, i.e. at least 15, 30, 50, 100 , 250, 500 or more. Other suitable probes that can be used for diagnostic analysis are also described herein.
GAVE19 단백질을 검출하는 특정 시약은 GAVE19 단백질에 결합할 수 있는 항체, 예를 들면, 검출 가능한 표지가 있는 항체가 된다. 항체는 폴리클로날 항체, 키메라항체 또는 바람직하게는 모노클로날 항체가 된다. 고유 항체 또는 이의 단편(Fab 또는 F(ab')2) 을 이용할 수 있다. “생물학적 시료”는 개체에서 분리할 수 있는 조직, 세포, 생물학적 유체 및 개체내에 있는 조직, 세포 유체도 포함된다. 본 발명의 검출 방법을 이용하여,시험관내및생체내에서 생물학적 시료내에GAVE19 mRNA, 단백질, 게놈 DNA를 검출한다. 예를 들면, GAVE19 mRNA검출용시험관내기술에는 노던(Northern) 하이브리드화 반응 및원위치하이브리드화 반응이 포함된다. GAVE19 단백질을 검출하는시험관내기술에는 ELISA, 웨스턴 블랏, 면역 침전 및 면역형광법등이 포함된다. GAVE19 게놈 DNA를 검출하는생체내기술에는 서던(southern) 하이브리드화 반응이 포함된다. 또한, GAVE19를 검출하는생체내기술에는 개체내로 표지된 항GAVE19 항체를 도입시키는 것도 포함된다. 예를 들면, 항체는 방사능 활성 마커로 표지될 수 있어, 표준 이미지 기술을 이용하면 개체내에서 그의 존부 및 위치를 확인할 수 있다.Particular reagents for detecting GAVE19 protein are antibodies capable of binding to GAVE19 protein, such as antibodies with detectable labels. The antibody is a polyclonal antibody, chimeric antibody or preferably monoclonal antibody. Native antibodies or fragments thereof (Fab or F (ab ') 2) can be used. A "biological sample" includes tissues, cells, biological fluids, and tissues and cellular fluids within an individual that can be separated from an individual. Using the detection method of the present invention, GAVE19 mRNA, protein, genomic DNA is detected in biological samples in vitro and in vivo . For example, in vitro techniques for detecting GAVE19 mRNA include Northern hybridization reactions and in situ hybridization reactions. In vitro techniques for detecting GAVE19 protein include ELISA, western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence. In vivo techniques for detecting GAVE19 genomic DNA include southern hybridization reactions. In vivo techniques for detecting GAVE19 also include introducing labeled anti-GAVE19 antibodies into an individual. For example, an antibody can be labeled with a radioactive marker so that its presence and location can be identified within the subject using standard imaging techniques.
한 구체예에서, 생물학적 시료에는 시험 개체로부터 얻은 단백질 분자가 포함된다. 대안으로, 생물학적 시료에는 시험 개체에서 얻은 mRNA 분자 또는 게놈 DNA 분자가 포함된다. 통상의 방법을 이용하여 개체로부터 분리한 말초 혈액 백혈구세포가 여기에서 이용되는 용도에 가장 적절한 시료이다.In one embodiment, the biological sample comprises protein molecules obtained from a test subject. Alternatively, biological samples include mRNA molecules or genomic DNA molecules obtained from a test subject. Peripheral blood leukocytes isolated from an individual using conventional methods are the most suitable samples for use herein.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한, 기준 개체에서 생물학적 시료를 얻고, GAVE19 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 시약에 시료를 접촉시켜, 생물학적 시료 내에 있는 GAVE19 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 및 그 양을 검출하고, 기준 시료에 있는 GAVE19 단백질, mRNA, 게놈 DNA와 테스트 시료에 있는 GAVE19 단백질, mRNA, 게놈 DNA양을 비교하여 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하는 화합물이 있는지를 결정한다.In another embodiment, the methods of the present invention also obtain a biological sample from a reference subject and contact the sample with a compound or reagent capable of detecting GAVE19 protein, mRNA or genomic DNA, such that the GAVE19 protein, mRNA in the biological sample. Or detects the presence and amount of genomic DNA and compares the amount of GAVE19 protein, mRNA and genomic DNA in the reference sample with the amount of GAVE19 protein, mRNA and genomic DNA in the test sample to determine whether there is a compound that modulates GAVE19 expression or activity. Decide
화학적 라이브러리 고처리량 분석Chemical Library High Throughput Analysis
GAVE19 활성을 조절할 수 있는 화합물을 분석하는 임의 방법을 고처리량 스크리닝에 이용할 수 있다. 고처리량 스크리닝 시스템은 시판되는 것을 이용할 수 있다(Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA,등). 이와 같은 시스템은 일반적으로 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간을 정한 배양, 분석에 적합한 미량플레이트의 최종 판독 등을 포함하는 전 공정이 자동화되어 있다. 이와 같은 환경설정을 변경시킬수 있는 시스템으로 고처리량, 신속한 개시, 고도의 유연성 및 맞춤화가 가능하다. 이와 같은 시스템의 제조업자는 다양한 고처리량의 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, Zymark Corp와 같은 업자는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조절을 검출하는 스크리닝 기술을 설명하는 기술 보고서도 제공한다.Any method of analyzing compounds capable of modulating GAVE19 activity can be used for high throughput screening. High throughput screening systems may be commercially available (Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc. ). Such systems generally automate the entire process, including pipetting all samples and reagents, dispensing liquids, timed incubation, final reading of microplates suitable for analysis, and the like. A system that can change these configurations allows for high throughput, rapid startup, high flexibility and customization. Manufacturers of such systems provide a variety of high throughput detailed protocols. Thus, vendors such as Zymark Corp also provide a technical report describing screening techniques for detecting regulation of gene transcription, ligand binding, and the like.
키트Kit
본 발명에는 또한 생물학적 시료(테스트 시료)내에 GAVE19 존부를 검출하는 키트를 포함한다. 이와 같은 키트를 이용하여 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하는 특정 화합물이 존재하는지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 키트에는 시료내에 GAVE19 단백질 또는 mRNA 를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 물질과 포함되어 있고, 시료내에 GAVE19양을 결정하는 수단(예를 들면, 서열 1 과 같이 GAVE19를 암호화하는 DNA 에 결합하는 항GAVE19 항체 또는 올리고뉴클레오티드 프로브)를 포함되어 있다.The present invention also includes a kit for detecting the presence of GAVE19 in a biological sample (test sample). Such kits can be used to determine the presence of specific compounds that modulate GAVE19 expression or activity. For example, the kit includes a labeled compound or substance capable of detecting GAVE19 protein or mRNA in a sample, and means for determining the amount of GAVE19 in the sample (e.g., in DNA encoding GAVE19 as shown in SEQ ID NO: 1). Binding to anti-GAVE19 antibody or oligonucleotide probe).
항체를 이용한 키트에서, 키트는 (1) GAVE19 단백질에 결합하는 제1항체(고형상에 부착된); (2) 선택적으로 GAVE19 단백질에 결합하거나 또는 제1항체에 결합하여 검출 가능한 물질로 결합되는 제 2 항체의 항체가 포함된다. 제 2 항체가 존재하기 않는 경우에 제1항체에 결합할 수 있고, 표지화 할 수 있는 다른 분자 또는 표지를 한 제 1 항체를 이용할 수도 있다. 어느 경우에든, 당분야에 공지된 것과 같은 검출 가능한 리포터 분자로 작용할 표지된 결합 부분이 포함된다.In kits with antibodies, the kit may comprise (1) a first antibody (attached to a solid phase) that binds to the GAVE19 protein; (2) An antibody of the second antibody which selectively binds to GAVE19 protein or binds to a detectable substance by binding to the first antibody is included. In the absence of a second antibody, a first antibody may be used that binds to the first antibody and may be labeled or labeled with another molecule. In either case, labeled binding moieties are included that will act as detectable reporter molecules, such as those known in the art.
올리고뉴클레오티드 기초한 키트에는 (1) 올리고뉴클레오티드, 가령, GAVE19 핵산 서열에 하이브리드화 할 수 있는 검출 가능한 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) GAVE19 핵산 분자를 증폭하는데 이용될 수 있는 한쌍의 프라이머가 포함된다.Oligonucleotide based kits include (1) oligonucleotides such as detectable labeled oligonucleotides capable of hybridizing to GAVE19 nucleic acid sequences or (2) pairs of primers that can be used to amplify GAVE19 nucleic acid molecules.
키트에는 또한 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제가 포함된다. 또한 키트에는 검출 가능한 물질(가령, 효소 또는 기질)을 검출하는데 필수적인 성분이 포함된다. 또한, 키트에는 시험 시료와 비교하여 분석하게 될 한 가지 기준 시료 또는 일련의 기준 시료도 포함되어 있다. 키트의 각 성분은 통상 개별 용기에 포함되어 있고, 모든 다양한 용기들은 단일 포장되어있다.Kits also include buffers, preservatives or protein stabilizers. The kit also includes components necessary for detecting a detectable substance (eg, enzyme or substrate). The kit also includes one reference sample or set of reference samples that will be analyzed relative to the test sample. Each component of the kit is usually contained in a separate container and all the various containers are in a single package.
약리유전체학Pharmacological Genomics
여기에서 설명하고 있는 것과 같이, 활성화된 또는 염증 상태 세포에서 GAVE19 발현이 조절된다. 염증과 연관된 질환에는 과민성 상태, 결장염, 크론(Crohn) 질환, 부종 상태, 접촉성 과민성, 알레르기 및 다른 형태의 관절염, 수막염, 맥관 팽창, 열, 세포 및 유체가 부위에 모임으로써 팽창등과 같은 손상에 대해 면역 반응이 작용하는 다른 질환등이 포함된다. 따라서, 여기에서 설명하고 있는선별 분석에 의해 확인된 것과 같이, GAVE19 활성(GAVE19 유전자 발현) 저해 또는 자극 효과를 가지는 물질 또는 조절 물질을 GAVE19 활성과 연관이 있는 질환(가령, 천식관련 염증, 만성 폐색성 폐질환, 류마티스 관절염)을 치료(또는 예방)하기 위해 개체로 투여할 수 있다. 이와 같은 치료에 결합시켜, 개인의 약리유전체학(개인의 유전자 형과 약물 또는 외부 화합물에 대해 개인이 나타내는 반응간에 상관 관계를 연구하는 학문)을 고려할 수 있다. 약학적으로 활성 약물의 투여량 및 혈중 농도간에 상관 관계를 변화시키면, 치료요법제 대사과정이 달라지게 되고 이로 인하여 심각한 독성 또는 치료 실패로 이어질 수 있다. 따라서, 개인의 약리 유전학을 이용하여 개인의 유전자형을 고려한 예방 또는 치료에 효과적인 물질(약물)을 선택할 수 있다. 이와 같은 약리 유전학을 이용하여 적절한 투여량 및 치료 섭생을 결정할 수도 있다.As described herein, GAVE19 expression is regulated in activated or inflammatory cells. Diseases associated with inflammation include damage such as irritability, colitis, Crohn's disease, edema, contact hypersensitivity, allergies and other forms of arthritis, meningitis, vasodilation, heat, cells and fluids gathering at the site Other diseases to which immune response acts on include. Thus, as confirmed by the screening assays described herein, substances or modulators that have GAVE19 activity (GAVE19 gene expression) inhibitory or stimulatory effects are associated with GAVE19 activity (eg, asthma related inflammation, chronic obstruction). Sex lung disease, rheumatoid arthritis) may be administered to a subject to treat (or prevent). In combination with such treatments, one can consider an individual's pharmacogenomics (a study of the correlation between an individual's genotype and the person's response to drugs or foreign compounds). Changing the correlation between pharmacologically active drug dose and blood concentration can alter the therapeutic metabolic process and lead to severe toxicity or treatment failure. Thus, the pharmacological genetics of an individual can be used to select a substance (drug) that is effective in preventing or treating the individual's genotype. Such pharmacological genetics may be used to determine appropriate dosages and treatment regimens.
약물유전체학은 질병이 있는 환자의 변경된 약물처리 및 비정상적인 작용에 반응하여 약물에 대한 임상적으로 심각한 유전학적 변화를 다루는 학문이다 (Linder, Clin Chem (1997) 43(2):254-266). 일반적으로 약리 유전학에서는 두가지 질환으로 구분지을 수 있다. 신체상에 약물이 작용하는 방식을 변경시키는 하나의 요인으로써 유전되는 유전적 질환을 “변경된 약물 작용”이라 한다. 약물에 신체가 반응하는 방식을 변경시키는 하나의 요인으로써 유전되는 유전적 질환을 “변경된 약물 대사과정”이라고 한다. 약리 유전학 질환은 매우 희귀한 결함으로 또는 다형현상으로 나타난다. 예를 들면, 글루코즈6포스페이트 디하이드로게나제 결핍(G6PD)은 가장 흔히 유전되는 효소관련 질환으로써 임상적으로 나타나는 주요 합병증은 산성 약물(항말라리아제, 설폰아미드, 진통제, 니트로퓨란) 및 누에콩을 복용후에 나타나는 용혈현상이다.Pharmacogenomics is the study of clinically severe genetic changes in drugs in response to altered drug treatment and abnormal action in diseased patients (Linder, Clin Chem (1997) 43 (2): 254-266). In general, pharmacological genetics can be divided into two diseases. Genetic disorders that are inherited as one factor that alters the way drugs act on the body are called "modified drug action." Genetic disorders that are inherited as a factor in changing the way the body responds to drugs are called "modified metabolism of the drug." Pharmacological genetic disorders appear as very rare defects or polymorphisms. For example, glucose 6 phosphate dehydrogenase deficiency (G6PD) is the most commonly inherited enzyme-related disease and the major clinical complications are after taking acidic drugs (antimalarials, sulfonamides, analgesics, nitrofuran) and silkworm beans. It is a hemolysis phenomenon.
예시적인 구체예로써, 약물을 대사시키는 효소 활성이 약물 작용의 강도 및 지구성의 주요 결정인자가 된다. 약물을 대사시키는 효소(N아세틸트란스퍼라제 2(NAT2), 사이토크롬 P450 효소, CYP2D6, CYP2Cl 9)의 유전적 다형현상이 발견됨으로써 왜 일부 환자에서는 예상되는 약물효과가 나타나지 않는지 또는 과도한 약물 반응이 나타나는지 그리고, 약물의 기준 또는 표준 안전 투여량 복용후에도 심각한 독성이 나타나는지에 대해 설명을 할 수 있게 되었다. 다형현상은 집단에서 두 가지 표현형 즉, 대사가 정상적으로 잘 되는 개체군(extensive metabolizer (EM)) 과 대사가 잘되지 않는 개체군(poor metabolizer (PM))으로 나눌 수 있다. PM 정도는 집단마다 다르게 나타난다. 예를 들면, CYP2D6를 코드하는 유전자는 상당한 다형성으로 PM에 몇 가지 돌연변이가 확인되었고, 이들 모두는 CYP2D6의 기능이 사라지도록 한다. CYP2D6 및 CYP2Cl 9 의 대사가 잘 되지 않는 경우는 과도한 약물 반응에서 자주 나타나는 것으로 표준 투여량을 복용하였을 경우에도 부작용이 나타난다. 대사물질이 활성이 있는 치료요법제라면, PM은 치료요법적 반응을 보이지 않을 것인데, 이는 CYP2D6형성된 대사물질, 몰핀에 의해 중개되는 코데인의 마취 효과에서 설명된다. 다른 극단적인 예로는 표준 투여량에도 반응을 하지 않는 소위 초속 대사군이다. 최근에, CYP2D6 유전자 증폭으로 인하여 초속 대사과정의 분자원리가 확인되었다.In exemplary embodiments, enzymatic activity to metabolize drugs is a major determinant of strength and endurance of drug action. Genetic polymorphisms of enzymes that metabolize drugs (Nacetyltransferase 2 (NAT2), cytochrome P450 enzymes, CYP2D6, CYP2Cl 9) have been discovered to explain why some patients do not have the expected drug effects or excessive drug reactions. It is possible to explain whether it appears and whether serious toxicity occurs even after taking a standard or standard safe dose of the drug. Polymorphisms can be divided into two phenotypes in the population: an extensive metabolizer (EM) and a poorly metabolized population (PM). PM levels vary from group to group. For example, the gene encoding CYP2D6 is a significant polymorphism with several mutations identified in PM, all of which cause CYP2D6 to lose its function. Poor metabolism of CYP2D6 and CYP2Cl 9 often occurs in excessive drug reactions, even when taken at standard doses. If the metabolite is an active therapy, PM will not show a therapeutic response, which is explained by the anesthetic effect of codeine mediated by CYP2D6 formed metabolite, morphine. Another extreme example is the so-called metabolic group, which does not respond to standard dosages. Recently, the molecular principle of the rapid metabolic process has been confirmed by amplification of the CYP2D6 gene.
개체에서 GAVE19 단백질 동족체의 활성, GAVE19 핵산 동족체인 DNA 분자의발현 정도를 결정하여, 치료요법적 또는 예방차원의 개인 치료에 적합한 물질을 선별할 수 있다. 또한, 약물유전체학을 이용하여 개인의 약물 반응표현형을 확인하기 위해 약물을 대사시키는 효소를 암호화하는 다형성 대립형질의 유전자형을 확인할 수 있다. 약물 또는 투여량 선택에 이와 같은 지식을 이용하면 부작용 또는 치료 실패를 피할 수 있고, 여기에서 설명하는 예시적인 스크리닝 분석에 의해 확인된 조절 물질과 같은 GAVE19 조절물질로 개체를 치료할 경우에 치료 또는 예방효과를 강화시킬 수 있다.By determining the activity of GAVE19 protein homologs and the expression of DNA molecules that are GAVE19 nucleic acid homologs in an individual, a substance suitable for therapeutic or prophylactic individual treatment can be selected. In addition, pharmacogenomics can be used to identify genotypes of polymorphic alleles that encode enzymes that metabolize drugs to identify individual drug response phenotypes. The use of this knowledge in drug or dosage selection avoids side effects or treatment failures, and the therapeutic or prophylactic effects of treating individuals with GAVE19 modulators, such as modulators identified by the exemplary screening assays described herein. Can be strengthened.
D.치료 방법 D. Treatment Methods
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명에는 마우스에서 GAVE19 발현을 조절하는 약물 또는 물질을 확인하는 방법도 포함된다. 정상적인 지라에서 GAVE19가 상당하게 발현되는 등 GAVE19 발현 프로필이 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) RA 마우스 지라에서 정상 지라에서 볼 수 있는 수준과 비교하였을 때 2배 증가된 발현 수준을 보유하고, 정상 폐와 비교하였을 때 CIA RA 마우스 폐에서 발현 수준이 5배이상 상승되었기 때문에, 이와 같은 약물 및 물질은 염증성 질환(가령, 천식), 만성 폐색성 폐 질환, 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환 치료에 바로 이용될 수 있을 것이다.As described above, the present invention also includes methods for identifying drugs or substances that modulate GAVE19 expression in mice. GAVE19 expression profile, including significant expression of GAVE19 in normal spleen, has a 2-fold increased expression level compared to levels seen in normal spleen in collagen-induced arthritis (CIA) RA mouse spleen and normal lung Since the expression levels in the lungs of CIA RA mice are more than five-fold higher when compared to, these drugs and substances can be used directly to treat inflammatory diseases (eg, asthma), chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis and many other diseases. Could be.
예방 방법Prevention method
한 측면에서 본 발명은 개체에서 상기 언급된 질환을 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 GAVE19 발현 또는 GAVE19의 적어도 한 가지 활성을 조절할 수 있는 물질을 개체에 투여하는 것이다. 당업자에게 공지된 진단 또는 예후 분석을임의 복합하여 이와 같은 치료를 통하여 유익한 효과를 얻을 수 있는 개체를 확인한다. GAVE19 이상 발현 또는 활성 증상이 명백하게 나타나기 전에 예방 물질을 투여하여, 발병을 방지하거나 발병을 지연시킬 수도 있다.In one aspect, the present invention provides a method for preventing the above-mentioned diseases in a subject, which method comprises administering to the subject a substance capable of modulating GAVE19 expression or at least one activity of GAVE19. Any combination of diagnostic or prognostic assays known to those of skill in the art can be combined to identify individuals that can benefit from such treatment. Prophylactic agents may be administered before the onset of GAVE19 aberration or activity symptoms to prevent or delay the onset.
2. 치료요법적 방법2. Therapeutic Methods
마우스에서 GAVE19 단백질 활성을 조절하는 것으로 발견된 것과 같은 염증 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 물질은 여기에서 설명하는 것과 같은 GAVE19의 핵산, 단백질, GAVE19의 자연 발생 동족 리간드, 펩티드, GAVE19 펩티드 모방체, 다른 소분자등이 될 수 있다. 한 구체예에서, 이와 같은 물질이 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 활성을 자극하는 물질에는 세포로 유입된 GAVE19를 암호화하는 핵산 분자 및 활성 GAVE19 단백질이 포함된다. 다른 예에서는 GAVE19 단백질의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 저해하는 물질도 있다. 이와 같은 저해성 물질에는 안티센스 GAVE19 핵산 분자 및 항GAVE19 항체가 포함된다. 조절 방법은시험관내에서 조절할 수도 있고 (가령, 세포를 물질로 배양시키는 방법) 또는생체내에서 조절할 수도 있다(가령, 개체에 물질을 투여하는 방법). 이와 같은 경우에, 본 발명은 상기에서 설명하는 질환을 앓는 개체를 치료는 방법을 지공하는데, 그 방법도 마우스에서 GAVE19 활성 또는 발현을 조절하는(하향 또는 상향조절)하는 것으로 확인된 물질(가령, 상기에서 설명하는 스크리닝 방법에 의해 확인된 물질) 또는 물질들을 복합시켜 투여하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 GAVE19 단백질 또는 핵산 분자를 투여하는 방법을 포함한다.Substances that can be used to treat inflammatory diseases, such as those found to modulate GAVE19 protein activity in mice, include nucleic acids, proteins of GAVE19, naturally occurring cognate ligands of GAVE19, peptides, GAVE19 peptide mimetics, and the like described herein. It can be a small molecule. In one embodiment, such agents may modulate one or more biological activities of the GAVE19 protein. Substances that stimulate activity include nucleic acid molecules encoding GAVE19 introduced into cells and active GAVE19 proteins. In another example, a substance inhibits one or more biological activities of the GAVE19 protein. Such inhibitory substances include antisense GAVE19 nucleic acid molecules and anti-GAVE19 antibodies. The control method may be controlled in vitro (eg, by culturing cells with a substance) or in vivo (eg, by administering a substance to a subject). In such cases, the present invention provides a method for treating an individual suffering from the disease described above, which method has also been found to modulate (down or upregulate) GAVE19 activity or expression in mice (eg, The substance identified by the screening method described above) or a combination of the substances. In another embodiment, the present invention includes a method of administering a GAVE19 protein or nucleic acid molecule.
본 발명은 다음의 실시예로 더 자세하게 설명되나, 이에 한정하지는 않는다.다음의 실시예는 본 발명의 적절한 구체예를 충분하게 설명하기 위해 제공하는 것이다. 그러나, 본 발명의 범위를 이에 한정하는 것은 아니다.The invention is illustrated in more detail by the following examples, which are not intended to be limiting. The following examples are provided to fully illustrate suitable embodiments of the invention. However, the scope of the present invention is not limited thereto.
현재 치료 약물 시장의 표적의 50% 이상이 상당수의 G-단백질 결합된 수용체등이다. 펩티드, 신경전달물질, 호르몬, 생장인자, 아민, 지질, 지방산, 취기 분자 및 빛을 포함하는 상당히 다양한 리간드에 의해 GPCR등이 활성화된다. GPCR 기능이 불안해지면 많은 병리학적 결과를 초래한다. 정상 지라에서 상당히 발현되는 사람의GAVE18의 정형체(ortholog)인 GAVE19는 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) RA 마우스 지라에서는 정상적인 지라에서의 수준과 비교하였을 때 약 2배 증가된 발현 수준을 가지고, 정상 폐와 비교하였을 때, CIA RA 마우스 폐에서는 5배 이상의 발현 수준을 가진다. 따라서, GAVE19는 염증 질환(가령, 천식), 만성 폐색성 폐질환, 류마티스 관절염 및 다른 여러 질환을 치료하는 새로운 표적 약물 또는 물질을 제공한다.More than 50% of the targets of the current therapeutic drug market are a significant number of G-protein coupled receptors. GPCRs are activated by a wide variety of ligands, including peptides, neurotransmitters, hormones, growth factors, amines, lipids, fatty acids, odor molecules and light. Unstable GPCR function has many pathological consequences. GAVE19, an ortholog of GAVE18 in humans that is significantly expressed in normal spleen, has an approximately 2-fold increased expression level in collagen-induced arthritis (CIA) RA mouse spleen compared to the level in normal spleen, Compared with normal lungs, CIA RA mouse lungs have a 5-fold or higher expression level. Thus, GAVE19 provides new target drugs or substances to treat inflammatory diseases (eg, asthma), chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis and many other diseases.
GAVE19 확인 및 클로닝으로 "데-오파닝"(de-orphaning)이라고 하는 공정을 통하여 내생 리간드를 발견하는 기회를 제공할 수 있다. 천연 리간드 또는 데-오파닝을 통하여 확인된 대체 리간드는 수용체 시그날 전달을 활성화시키거나 차단시키는 일부 분자를 스크리닝하는 도구를 제공하여, 세포의 생리학적 그리고 세포 기능을 변화시킨다.GAVE19 identification and cloning may provide an opportunity to discover endogenous ligands through a process called “de-orphaning”. Natural ligands or alternative ligands identified through de-opanning provide a tool for screening some molecules that activate or block receptor signal transduction, thereby altering the physiology and cellular function of the cell.
재료 및 방법Materials and methods
GAVE19의 동정 및 클로닝.마우스 게놈 DNA 데이터베이스를 얻기 위해 사람 GAVE18 DNA 서열을 이용하여도 마우스 상동성 DNA 서열이 나타나지 않았다. 그 다음 암호화 부분을 포함하는 사람 GAVE18 DNA를 프로브로 이용하여 Research Genetics 마우스 게놈 BAC 라이브러리를 스크리닝하였다. 사람 GAVE18 서열에 따라 고안된 다중 DNA 프라이머를 이용하여 포지티브 마우스 BAC를 서열화시켰다. 프라이머 5' GGC TTC CCC CAA AGA CAA AG 3’ (서열 3)만이 마우스GAVE19 DNA 서열 데이터를 제공하였다. 그 다음 다중 마우스 DNA 서열 프라이머를 마우스 GAVE19 암호화 부분을 서열화시키는 워킹 프라이머로 고안하였다. Identification and Cloning of GAVE19. Using the human GAVE18 DNA sequence to obtain a mouse genomic DNA database did not result in mouse homology DNA sequences. Research Genetics mouse genome BAC libraries were then screened using human GAVE18 DNA containing coding portions as probes. Positive mouse BACs were sequenced using multiple DNA primers designed according to the human GAVE18 sequence. Only primer 5 ′ GGC TTC CCC CAA AGA CAA AG 3 ′ (SEQ ID NO: 3) provided mouse GAVE19 DNA sequence data. Multiple mouse DNA sequence primers were then devised as working primers to sequence the mouse GAVE19 coding portion.
마우스 질환 모델 및 RNA 분리. 다른 조직 및 기관으로부터 분리시킨 마우스 tRNA을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 GIBCO BLR사의 Trizol 시약으로 실시하였다. ABI사의 Multiscribe RT-PCR 키트(ABI)를 이용하여 tRNAs를 cDNAs로 변환시켰다. Mouse Disease Model and RNA Isolation . Mouse tRNA isolated from other tissues and organs was used as Trizol reagent of GIBCO BLR according to the manufacturer's instructions. TRNAs were converted to cDNAs using ABI's Multiscribe RT-PCR kit (ABI).
TaqMan 분석. TaqMan 반응은 마우스 조직 cDNA를 이용하여 2회 실시하고, GAPDH 유전자를 내부 기준으로 이용한다. TaqMan 결과는 상대적인 발현으로 계산한다. 상대적인 발현은 (2^(0-ddCt))*1000와 같은데, 이때, ddCT는(GAVE19 평균Cts- GAPDH 평균 Cts)-(GAVE19 평균 NTC Cts-GAPDH 평균 NTC Cts)과 같다. TaqMan 프로브는 Operon Technologies에서 주문 합성하였다. TaqMan 프라이머 서열 1: 5’ CTGTTCTTGCTGGTGAAAATGAA 3’(서열 4)과 서열2: 5’ CCATGAACCACCACGAGGTT 3’ (서열 5). TaqMan 프로브 서열: 5’ (Fam)-TCACGTTCAGTGACCACCATGGCTG-(Tet) 3’ (서열 6). TaqMan 반응은 96-웰 플레이트 MicroAmp 광학 튜브(PE)에서 실행하였다. TaqMan Analysis . TaqMan reactions were performed twice using mouse tissue cDNA and the GAPDH gene was used as an internal reference. TaqMan results are calculated as relative expression. Relative expression is equal to (2 ^ (0-ddCt)) * 1000, where ddCT is equal to (GAVE19 mean Cts-GAPDH mean Cts)-(GAVE19 mean NTC Cts-GAPDH mean NTC Cts). TaqMan probes were custom synthesized from Operon Technologies. TaqMan primer sequence 1: 5 'CTGTTCTTGCTGGTGAAAATGAA 3' (SEQ ID NO: 4) and SEQ ID NO: 2: 5 'CCATGAACCACCACGAGGTT 3' (SEQ ID NO: 5). TaqMan probe sequence: 5 '(Fam) -TCACGTTCAGTGACCACCATGGCTG- (Tet) 3' (SEQ ID NO: 6). TaqMan reactions were run in 96-well plate MicroAmp optical tubes (PE).
결과 설명Result Description
TaqMan 발현 프로필에서는 정상 조절된 샘플에서 RA 등급 4까지 CIA RA 모델의 관절에서 GAVE19 의 발현 수준이 점진적으로 증가되었다는 것을 보여준다. 관절에서 RA 등급이 높을수록 GAVE19 발현이 높다는 것이다. 정상적인 폐 및 지라와 비교하였을 때 CIA RA 폐 및 지라에서 GAVE19발현 수준이 상당히 증가되었다는 것을 볼 수 있다. 다발성 경색을 가진 마우스 EAE(실험적으로 알레르기성 뇌척수염)에서, 임상단계전에 뇌에서 발현된GAVE19 수준과 비교하였을 때, EAE 절정 단계에서 뇌에서 발현되는 수준이 상당히 증가되었다는 것을 볼 수 있다.The TaqMan expression profile shows a gradual increase in the expression level of GAVE19 in the joints of the CIA RA model up to RA grade 4 in normal regulated samples. The higher the RA grade in the joint, the higher the expression of GAVE19. Compared with normal lung and splenic, GAVE19 expression levels were significantly increased in CIA RA lung and splenic. In mouse EAE (experimentally allergic encephalomyelitis) with multiple infarctions, it can be seen that the level of brain expression is significantly increased at the peak of the EAE compared to GAVE19 levels expressed in the brain prior to the clinical stage.
마우스 조직에서 GAVE19의 TaqMan 발현 프로필을 정리한 표Table of TaqMan expression profiles of GAVE19 in mouse tissues
도 3에는 발현 프로필 데이터를 도시하였다. 모든 데이터를 근거할 때 염증관련 질환에 GAVE 19가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 볼 수 있다.3 shows expression profile data. Based on all the data, we can see that GAVE 19 plays an important role in inflammatory diseases.
토의discussion
사람 GAVE18 의 정형체(orthlog)인 신규한 마우스 G-단백질 결합된 수용체인 GAVE19를 확인하고, 클론하였다. DNA의 암호화 부분의 전장(Full-length)과 이의아미노산 서열을 확인하였다. 정상적으로 조절된 마우스와 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) 마우스에서 RT-PCR (TaqMan) 분석을 통하여 수용체의 조직 분포를 분석하였다. GAVE19 발현 프로필에서 GAVE18(사람 정형체)에 유사하고, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환에서 이의 역할이 분명하게 나타났다. 여기에서 설명하는 다양한 분석법을 이용하여, GAVE19는 천식, RA, COPD 등의 염증 질환에 신규한 약물 표적을 제공한다. 또한, 마우스에서 GAVE19 발현 또는 활성을 조절하기 위해 본 발명의 분석법에서 발견된 화합물 및 물질을 이와 같은 질환 치료에 바로 이용할 수 있을 것이다.GAVE19, a novel mouse G-protein coupled receptor that is an orthlog of human GAVE18, was identified and cloned. The full length of the coding portion of the DNA and its amino acid sequence were identified. Tissue distribution of receptors was analyzed by RT-PCR (TaqMan) analysis in normally regulated and collagen-induced arthritis (CIA) mice. Similar to GAVE18 (human stereotype) in the GAVE19 expression profile, its role in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis is evident. Using the various assays described herein, GAVE19 provides novel drug targets for inflammatory diseases such as asthma, RA, COPD. In addition, the compounds and substances found in the assays of the present invention to modulate GAVE19 expression or activity in mice will be readily available for the treatment of such diseases.
본 발명은 상기에서 설명하는 실시예를 통하여 상세하게 설명되었으나, 당업자는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한 다양한 변화를 만들 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 이와 같은 변형 또한, 다음의 청구범위에만 속한다.While the invention has been described in detail through the embodiments described above, those skilled in the art will recognize that various changes can be made without departing from the scope of the invention. Such modifications also belong to the following claims.
또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 중량치는 어림치이며, 설명을 위해 예시되었음을 인지할 것이다.It will also be appreciated that the base size or amino acid size and all molecular weights or weight values provided for a nucleic acid or polypeptide are approximations and are illustrated for illustration.
본 출원에 언급된 모든 특허 및 공보는 전문을 참고문헌으로 첨부한다.All patents and publications mentioned in this application are incorporated by reference in their entirety.
<110> Aventis Pharmaceuticals Inc. <120 A NUCLEIC ACID ENCODING A G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR, AND USES THEREOF <130> 5-2002-007191-8 <140> PCT/US2003/04350 <141> 2003-02-13 <150> US 60/356,686 <151> 2002-02-14 <150> GB 0219574.1 <151> 2002-08-22 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggatggat ataatacctc tgagaattcc tcttgtgacc ctatactggc acaccactta 60 acatcgattt acttcatagt gctcattgga ggactggtag gtctcatctc catcctgttc 120 ttgctggtga aaatgaactc acgttcagtg accaccatgg ctgtcatcaa cctcgtggtg 180 gttcatgggg tcttcctact gacggtgcct ttccgcttgg catacctcat caaagggact 240 tggacgtttg gattaccctt ctgcaaattt gtgagtgcca tgttacatat ccacatgtac 300 ctcacgttcc tcttctacgt ggtgatacta gtcatcagat acctcatctt cttcaagcgt 360 agagacaaag tagaattcta tagaaaattg catgcagttg ctgcaagttc tgccatgtgg 420 cttctggtga ttgttattgt tgtgcccttg gtggtttctc agtatggaaa tagcgaagaa 480 tacaatgagc aacagtgctt tagattccat aaagaacttg gccatgattc tgtgcgagtt 540 atcaactata tgatagtcat tgttgtcata gctgttgcgt tgattctctt gggtttccag 600 gtcttcatca cattgtccat ggtgcggaag tttcgccact ccttactatc ccaccaggag 660 ttctgggcac aactgaaaaa tcttttcttt ataggtatca ttattatttg ttttcttccc 720 taccagttct tcaggattta ttacttgtat gttgtggcac attccaagag ctgtaaaaac 780 aaagttgcat tttacaatga aatcggttga 810 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Gly Tyr Asn Thr Ser Glu Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Leu 1 5 10 15 Ala His His Leu Thr Ser Ile Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Leu Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Ser Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Gly Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Ala Tyr Leu Ile Lys Gly Thr 65 70 75 80 Trp Thr Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Ile 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Arg Arg Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ser Ala Met Trp Leu Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Gln Tyr Gly Asn Ser Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Gln Gln Cys Phe Arg Phe His Lys Glu Leu Gly His Asp 165 170 175 Ser Val Arg Val Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Val Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Leu Ile Leu Leu Gly Phe Gln Val Phe Ile Thr Leu Ser Met Val 195 200 205 Arg Lys Phe Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Ile Ile Ile Ile Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Tyr Val Val Ala His Ser Lys 245 250 255 Ser Cys Lys Asn Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Gly 260 265 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 ggcttccccc aaagacaaag 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctgttcttgc tggtgaaaat gaa 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ccatgaacca ccacgaggtt 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe <400> 6 tcacgttcag tgaccaccat ggctg 25 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Gly His Asn Thr Ser Arg Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Val 1 5 10 15 Thr Pro His Leu Ile Ser Leu Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Val Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Thr Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Ser Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Tyr Leu Ile Lys Lys Thr 65 70 75 80 Trp Met Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Thr 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Cys Lys Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ala Gly Met Trp Thr Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Arg Tyr Gly Ile His Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Glu His Cys Phe Lys Phe His Lys Glu Leu Ala Tyr Thr 165 170 175 Tyr Val Lys Ile Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Phe Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Val Ile Leu Leu Val Phe Gln Val Phe Ile Ile Met Leu Met Val 195 200 205 Gln Lys Leu Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Val Ile Leu Val Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Val Val Thr His Ser Asn 245 250 255 Ala Cys Asn Ser Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Phe Leu Ser Val 260 265 270 Thr Ala Ile Ser Cys Tyr Asp Leu Leu Leu Phe Val Phe Gly Gly Ser 275 280 285 His Trp Phe Lys Gln Lys Ile Ile Gly Leu Trp Asn Cys Val Leu Cys 290 295 300 Arg 305<110> Aventis Pharmaceuticals Inc. <120 A NUCLEIC ACID ENCODING A G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR, AND USES THEREOF <130> 5-2002-007191-8 <140> PCT / US2003 / 04350 <141> 2003-02-13 <150> US 60 / 356,686 <151> 2002-02-14 <150> GB 0219574.1 <151> 2002-08-22 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggatggat ataatacctc tgagaattcc tcttgtgacc ctatactggc acaccactta 60 acatcgattt acttcatagt gctcattgga ggactggtag gtctcatctc catcctgttc 120 ttgctggtga aaatgaactc acgttcagtg accaccatgg ctgtcatcaa cctcgtggtg 180 gttcatgggg tcttcctact gacggtgcct ttccgcttgg catacctcat caaagggact 240 tggacgtttg gattaccctt ctgcaaattt gtgagtgcca tgttacatat ccacatgtac 300 ctcacgttcc tcttctacgt ggtgatacta gtcatcagat acctcatctt cttcaagcgt 360 agagacaaag tagaattcta tagaaaattg catgcagttg ctgcaagttc tgccatgtgg 420 cttctggtga ttgttattgt tgtgcccttg gtggtttctc agtatggaaa tagcgaagaa 480 tacaatgagc aacagtgctt tagattccat aaagaacttg gccatgattc tgtgcgagtt 540 atcaactata tgatagtcat tgttgtcata gctgttgcgt tgattctctt gggtttccag 600 gtcttcatca cattgtccat ggtgcggaag tttcgccact ccttactatc ccaccaggag 660 ttctgggcac aactgaaaaa tcttttcttt ataggtatca ttattatttg ttttcttccc 720 taccagttct tcaggattta ttacttgtat gttgtggcac attccaagag ctgtaaaaac 780 aaagttgcat tttacaatga aatcggttga 810 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Gly Tyr Asn Thr Ser Glu Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Leu 1 5 10 15 Ala His His Leu Thr Ser Ile Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Leu Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Ser Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Gly Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Ala Tyr Leu Ile Lys Gly Thr 65 70 75 80 Trp Thr Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Ile 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Arg Arg Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ser Ala Met Trp Leu Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Gln Tyr Gly Asn Ser Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Gln Gln Cys Phe Arg Phe His Lys Glu Leu Gly His Asp 165 170 175 Ser Val Arg Val Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Val Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Leu Ile Leu Leu Gly Phe Gln Val Phe Ile Thr Leu Ser Met Val 195 200 205 Arg Lys Phe Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Ile Ile Ile Ile Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Tyr Val Val Ala His Ser Lys 245 250 255 Ser Cys Lys Asn Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Gly 260 265 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 ggcttccccc aaagacaaag 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctgttcttgc tggtgaaaat gaa 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ccatgaacca ccacgaggtt 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe <400> 6 tcacgttcag tgaccaccat ggctg 25 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Gly His Asn Thr Ser Arg Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Val 1 5 10 15 Thr Pro His Leu Ile Ser Leu Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gly Val Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Thr Arg 35 40 45 Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Ser Val 50 55 60 Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Tyr Leu Ile Lys Lys Thr 65 70 75 80 Trp Met Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His 85 90 95 Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Thr 100 105 110 Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Cys Lys Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg 115 120 125 Lys Leu His Ala Val Ala Ala Ser Ala Gly Met Trp Thr Leu Val Ile 130 135 140 Val Ile Val Val Pro Leu Val Val Ser Arg Tyr Gly Ile His Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Glu His Cys Phe Lys Phe His Lys Glu Leu Ala Tyr Thr 165 170 175 Tyr Val Lys Ile Ile Asn Tyr Met Ile Val Ile Phe Val Ile Ala Val 180 185 190 Ala Val Ile Leu Leu Val Phe Gln Val Phe Ile Ile Met Leu Met Val 195 200 205 Gln Lys Leu Arg His Ser Leu Leu Ser His Gln Glu Phe Trp Ala Gln 210 215 220 Leu Lys Asn Leu Phe Phe Ile Gly Val Ile Leu Val Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Phe Phe Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Val Val Thr His Ser Asn 245 250 255 Ala Cys Asn Ser Lys Val Ala Phe Tyr Asn Glu Ile Phe Leu Ser Val 260 265 270 Thr Ala Ile Ser Cys Tyr Asp Leu Leu Leu Phe Val Phe Gly Gly Ser 275 280 285 His Trp Phe Lys Gln Lys Ile Ile Gly Leu Trp Asn Cys Val Leu Cys 290 295 300 Arg 305
Claims (28)
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US35668602P | 2002-02-14 | 2002-02-14 | |
US60/356,686 | 2002-02-14 | ||
GBGB0219574.1A GB0219574D0 (en) | 2002-02-14 | 2002-08-22 | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof |
GB0219574.1 | 2002-08-22 | ||
PCT/US2003/004350 WO2003068803A2 (en) | 2002-02-14 | 2003-02-13 | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20040088072A true KR20040088072A (en) | 2004-10-15 |
Family
ID=23402496
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR10-2004-7012638A KR20040088072A (en) | 2002-02-14 | 2003-02-13 | A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030166008A1 (en) |
KR (1) | KR20040088072A (en) |
AR (1) | AR038423A1 (en) |
GB (1) | GB0219574D0 (en) |
TW (1) | TW200401027A (en) |
ZA (1) | ZA200406327B (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0817233A2 (en) | 2007-09-28 | 2012-11-06 | Intrexon Corp | therapeutic constructs of trca gene and bireactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
-
2002
- 2002-08-22 GB GBGB0219574.1A patent/GB0219574D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-02-13 KR KR10-2004-7012638A patent/KR20040088072A/en not_active Application Discontinuation
- 2003-02-13 US US10/366,504 patent/US20030166008A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-13 AR ARP030100477A patent/AR038423A1/en unknown
- 2003-02-14 TW TW092103029A patent/TW200401027A/en unknown
-
2004
- 2004-08-10 ZA ZA200406327A patent/ZA200406327B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA200406327B (en) | 2006-06-28 |
US20030166008A1 (en) | 2003-09-04 |
TW200401027A (en) | 2004-01-16 |
GB0219574D0 (en) | 2002-10-02 |
AR038423A1 (en) | 2005-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2002531069A (en) | Novel members of the capsaicin / vanilloid receptor family of proteins and their uses | |
AU2236999A (en) | Ligand receptors and uses therefor | |
US20080171339A1 (en) | Novel members of the capsaicin/vanilloid receptor family of proteins and uses thereof | |
US7723074B2 (en) | Nucleic acid molecules encoding prostaglandin receptor proteins | |
KR20040088072A (en) | A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
JP2002516079A (en) | Novel secreted and membrane-associated proteins and uses therefor | |
CA2476239A1 (en) | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
US20030186873A1 (en) | Nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
US20030138418A1 (en) | Nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
EP1470420A2 (en) | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
KR20050044461A (en) | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
AU2003214861A1 (en) | A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
AU2002363792A1 (en) | A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof | |
JP2005504540A (en) | GAVE10, a novel G protein-coupled receptor | |
CA2451686A1 (en) | A novel g protein-coupled receptor, gave 3 | |
MXPA06007364A (en) | Nucleic acid encoding a novel prostaglandin receptor protein and methods of use thereof | |
CA2454427A1 (en) | A novel g protein-coupled receptor, gave8 | |
ZA200400383B (en) | A novel G protein-coupled receptor, GAVE8. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |