JP2002531069A - New members and their use of capsaicin / vanilloid receptor family of proteins - Google Patents

New members and their use of capsaicin / vanilloid receptor family of proteins

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JP2002531069A JP2000582560A JP2000582560A JP2002531069A JP 2002531069 A JP2002531069 A JP 2002531069A JP 2000582560 A JP2000582560 A JP 2000582560A JP 2000582560 A JP2000582560 A JP 2000582560A JP 2002531069 A JP2002531069 A JP 2002531069A
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カーテイス,ロリ・エイ・ジエイ
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ミレニアム・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Abstract

(57)【要約】 本発明は、カプサイシン/バニロイド受容体ファミリーの新規メンバーをコードするhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子と称する単離された核酸分子を提供する。 (57) Abstract: The present invention provides an isolated nucleic acid molecule referred to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule encoding a novel member of the capsaicin / vanilloid receptor family. 本発明はまた、アンチセンス核酸分子、hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子を含有する組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入されている宿主細胞並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子が導入されているかまたは破壊されている非ヒトトランスジェニック動物も提供する。 The present invention also antisense nucleic acid molecule, hVR-1, hVR-2 and recombinant expression vectors containing RVR-2 nucleic acid molecules, host cells and hVR-1 expression vector has been introduced, hVR-2 and non-human transgenic animals that RVR-2 gene has been or destroyed are introduced also provided. 本発明はなおさらに、単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチド並びに抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体を提供する。 The present invention yet further provides an isolated hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, fusion proteins, antigenic peptides and anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody to. 本発明の組成物を利用する診断方法もまた提供される。 Diagnostic methods utilizing compositions of the present invention are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 発明の背景痛みは、感覚ニューロンの亜群の末梢終末が有毒な化学的、機械的または熱刺激により活性化されると開始される。 [0001] BACKGROUND OF THE INVENTION Pain, peripheral endings toxic chemical subgroup of sensory neurons, is started when activated by mechanical or thermal stimuli. 侵害受容器と呼ばれるこれらのニューロンは、組織損傷に関する情報を脊髄及び脳における痛み処理中枢に伝達する(Fiel These neurons, called nociceptors, transmits the information about the tissue damage to pain processing center in the spinal cord and brain (Fiel
ds, HL Pain, McGraw-Hill, New York, 1987)。 ds, HL Pain, McGraw-Hill, New York, 1987). 侵害受容器は、一つには、カプサイシン、バニロイド(vanilloid)含有化合物、並びに多数の「辛い」及び薬味のきいた食物の活性成分であるトウガラシの天然産物に対するそれらの感受性を特徴とする。 Nociceptors, in part, capsaicin, characterized vanilloid (vanilloids) containing compounds, as well as a number of "hard" and their sensitivity to natural products pepper, the active ingredient in spicy foods with condiments. 哺乳類において、カプサイシンへの侵害受容器終末の暴露は最初にニューロンの興奮を導き、その結果、痛みの認知及び炎症メディエーターの局所放出が起こる。 In mammals, infringement of receptor endings exposure to capsaicin leads initially neuronal excitement, so that local release of cognitive and inflammatory mediators pain occurs. 長引く暴露では、侵害受容器終末はカプサイシン並びに他の有毒な刺激に対して無反応になる(Szolcsanyi, J. Capsaicin in the Study of In prolonged exposure, nociceptors endings become insensitive to capsaicin, as well as other toxic stimuli (Szolcsanyi, J. Capsaicin in the Study of
Pain中(Wood, J.編集)1-26(Academic, London, 1993))。 In Pain (Wood, J. editing) 1-26 (Academic, London, 1993)). 侵害受容器脱感受性のこの後者の現象は、ウイルス性及び糖尿病性ニューロパシーから慢性関節リューマチまで多岐にわたる痛みを伴う疾患の処置における鎮痛剤としてのカプサイシンの表面的には矛盾した使用の根拠をなす(Campbell, E. Capsaicin and the This latter phenomenon of nociceptor desensitization are superficially of capsaicin as an analgesic in the treatment of diseases involving pain variety of viral and diabetic neuropathies to rheumatoid arthritis underlie use inconsistent ( Campbell, E. Capsaicin and the
Study of Pain中(Wood, J.編集)255-272(Academic, London, 1993);Szallasi, In the Study of Pain (Wood, J. Edit) 255-272 (Academic, London, 1993); Szallasi,
A. et al.(1996)Pain 68, 195-208)。 A. et al. (1996) Pain 68, 195-208). 有毒な刺激に対するこの減少した感受性のいくらかは、侵害受容器の可逆的変化に起因する可能性があるが、応答の長期間の喪失は、カプサイシンへの暴露後の侵害受容器の死またはその末梢終末の破壊により説明することができる(Jancso, G. et al.(1977)Nature 270, 741-743 Toxic How much of this decreased sensitivity to stimuli, but may be due to reversible changes in the nociceptor, the long-term loss of response, or a peripheral nociceptors after exposure to capsaicin it can be explained by the destruction of the terminal (Jancso, G. et al. (1977) Nature 270, 741-743
)。 ).

【0002】 カプサイシン作用の細胞特異性及び激しい痛みの感覚を呼び起こすその能力により、カプサイシン作用の標的が痛みを伴う刺激の検出において重要な生理学的役割を果たすという推論が導かれている。 [0002] by its ability evoke a sense of cellular specificity and severe pain of capsaicin effects inference that plays an important physiological role in the detection of stimulus target capsaicin effects painful have been derived. 実際、カプサイシンは、生理学的刺激または組織損傷中に産生される内因性リガンドの作用をまねることにより痛みの認知を引き出す可能性がある(James, IF, Kinkina, NN & Wood, JN C In fact, capsaicin is likely to elicit a perception of pain by mimicking the action of endogenous ligands produced in physiological stimuli or tissue damage (James, IF, Kinkina, NN & Wood, JN C
apsaicin in the Study of Pain中(Wood, J.編集)83-104(Academic, London, 19 apsaicin in the Study of Pain in the (Wood, J. Edit) 83-104 (Academic, London, 19
93))。 93)).

【0003】 最近、Caterina MJ et al.は、ラット知覚神経節においてバニロイド受容体(VR-1)をコードする機能性cDNAを特性化することによりこの現象を引き起こす分子的根拠を決定した(Caterina MJ et al.(1997)Nature 389:816-824 Recently, Caterina MJ et al. Have determined the molecular basis for causing this phenomenon by characterizing the functional cDNA encoding vanilloid receptor (VR-1) in rat sensory ganglia (Caterina MJ . et al (1997) Nature 389: 816-824
)。 ). VR-1は、最初にドロソフィラ(Drosophila)光伝達経路の成分として同定された(Montell et al.(1989)Neuron 2:1313-1323)一過性受容体電位(transien VR-1 has been identified as a component of the initially Drosophila (Drosophila) optical transmission path (Montell et al (1989) Neuron 2:. 1313-1323) transient receptor potential (Transien
t receptor potential)(TRP)チャンネルファミリーのメンバーに似ているバニロイド依存性非選択的陽イオンチャンネルである。 A t receptor potential) (TRP) vanilloid-dependent non-selective cation channels that are similar to the members of the channel family.

【0004】 目次 A. [0004] Table of Contents A. 発明の要約 -3- B. Summary of the Invention -3- B. 図面の簡単な説明 -8- C. BRIEF DESCRIPTION -8- C. of drawings 発明の詳細な記述 -10- I. A detailed description -10- I. of invention 単離された核酸分子 -16- II. An isolated nucleic acid molecule -16- II. 単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質並びに 抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体 -29- III. hVR-1 isolated, hVR-2 and RVR-2 protein and anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody -29- III. 組換え発現ベクター及び宿主細胞 -42- IV. The recombinant expression vectors and host cells -42- IV. 製薬学的組成物 -52- V. Pharmaceutical compositions -52- V. 本発明の使用及び方法 -59- A. Use of the present invention and methods -59- A. スクリーニングアッセイ -60- B. Screening assays -60- B. 検出アッセイ -67- 1. Detection assay -67- 1. 染色体マッピング -67- 2. Chromosome Mapping -67- 2. 組織タイピング -70- 3. Tissue typing -70- 3. 司法生物学における部分hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列の使用 -71- C. The use of partial hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequences in judicial biology -71- C. 予測医学 -72- 1. Predictive medicine -72- 1. 診断アッセイ -73- 2. Diagnostic assays -73- 2. 予後アッセイ -75- 3. Prognostic assays -75- 3. 臨床試験中の効果のモニタリング -81- D. Monitoring of the effects of in clinical trials -81- D. 処置の方法 -83- 1. Method of treatment -83- 1. 予防的方法 -84- 2. Prophylactic methods -84- 2. 治療的方法 -84- 3. Therapeutic methods -84- 3. 薬理ゲノム学 -85- D. Pharmacogenomics -85- D. 実施例 -88- 発明の要約本発明は、少なくとも一つには、受容体のカプサイシン/バニロイドファミリーの新規メンバーの発見に基づく。 Summary of the Invention The embodiment -88- invention, at least one, on the discovery of a new member of the capsaicin / vanilloid family of receptors. 本明細書において記述するのは、本明細書においてhVR-1と呼ばれる、ラットVR-1(rVR-1)のヒトオーソロガス並びに本明細書においてVR-2、詳細にはヒトVR-2(hVR-2、欠失を含有する別形態(alternate Describe herein are referred to herein as hVR-1, rat VR-1 (rVR-1) human orthologous and VR-2 in the present specification, in particular human VR-2 ( hVR-2, another form containing a deletion (alternate
form)を包含する)及びラットVR-2(rVR-2)核酸及びタンパク質分子と呼ばれる、受容体のVRファミリーの以前に未知の別のメンバーの単離である。 form) called) and rat VR-2 (rVR-2) nucleic acid and protein molecules, including, in previous VR family of receptor isolation of unknown another member. 本発明のhV hV of the present invention
R-1、hVR-2及びrVR-2分子は、様々な細胞プロセス、例えば痛みに関与する細胞プロセスを調節する調節因子を開発するための標的として有用である。 R-1, hVR-2 and RVR-2 molecules are useful as targets for developing various cellular processes, for example, a regulatory factor that regulates the cellular processes involved in pain. 従って、 Therefore,
一つの態様として、本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質及びそのフラグメントをコードする単離された核酸分子並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適当な核酸フラグメントを提供する。 In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid encoding hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and nucleic acid molecules and hVR-1 isolated a fragment thereof, hVR-2 and RVR-2 providing appropriate nucleic acid fragments as primers or hybridization probes for the detection.

【0005】 一つの態様として、本発明のhVR-1、hVR-2またはrVR-2核酸分子は、配列番号: [0005] In one embodiment, hVR-1, hVR-2 or RVR-2 nucleic acid molecules of the present invention, SEQ ID NO:
1、3、4、6、7、9、10もしくは12に示すヌクレオチド配列(例えばヌクレオチド配列の全長に)またはその相補物に少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、 1,3,4,6,7,9,10 or nucleotide sequence shown in 12 (for example, the full length of the nucleotide sequence) or at least 60% to the complement, 65%, 70%, 75%, 80%,
83%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 83%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一である。 96%, 97%, 98%, 99% or more identical.

【0006】 別の態様として、単離された核酸分子は、配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12に示すヌクレオチド配列またはその相補物を含む。 [0006] As another embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleotide sequence or its complement shown in 12. 別の態様として、核酸分子は、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の少なくとも10、15、20またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含む。 In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or 12 of at least 10, 15, 20 or more consecutive nucleotides.

【0007】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子は、配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。 [0007] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 2, 5, 8 or nucleotides that encodes a protein having a sufficiently homologous amino acid sequence to the amino acid sequence of the 11 including the array. 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子は、配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列の全長に少なくとも60%、65% In one embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 2, 5, 8, or at least 60% the entire length of the amino acid sequence of 11, 65%
、70%、75%、80%、85%、87%、90%、95%、98%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。 , Including 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 95%, a nucleotide sequence encoding a protein having an amino acid sequence identical 98% or more.

【0008】 本発明の別の態様は、非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2タンパク質をコードする核酸分子に対してhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子を特異的に検出する核酸分子、好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子を特徴とする。 [0008] Another aspect of the present invention, non-hVR-1, specifically non-hVR-2 and non rVR-2 hVR-1 with a nucleic acid molecule protein encoding, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule nucleic acid detection molecule, preferably wherein the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule. 例えば、一つの態様として、そのような核酸分子は、少なくとも100-150、150-200、200-250、250 For example, in one embodiment, such a nucleic acid molecule is at least 100-150,150-200,200-250,250
-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-700、700 -300,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-700,700
-800、800-900、900-1000、1088またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、 Of -800,800-900,900-1000,1088 or more nucleotides in length,
そして配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12に示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。 The SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence shown in 12 hybridize under stringent conditions. 好ましい態様として、核酸分子は少なくとも15個の(例えば連続した)ヌクレオチドの長さであり、そして配列番号:1のヌクレオチド1-17、3696-3863または3901-3909にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。 In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is a length of at least 15 (e.g., contiguous) nucleotides, and SEQ ID NO: hybridizes to 1 nucleotide 1-17,3696-3863 or 3901-3909 under stringent conditions to. 別の好ましい態様として、核酸分子は配列番号:1のヌクレオチド1-17、3696-3863または3901-3909を含んでなる。 In another preferred embodiment, the nucleic acid molecule SEQ ID NO: comprising one of the nucleotide 1-17,3696-3863 or 3901-3909. さらに別の好ましい態様として、核酸分子は配列番号:1のヌクレオチド1-17、 In yet another preferred embodiment, the nucleic acid molecule SEQ ID NO: 1 nucleotides 1-17,
3696-3863または3901-3909からなる。 Consisting of 3696-3863 or 3901-3909. 好ましい態様として、核酸分子は少なくとも15個の(例えば連続した)ヌクレオチドの長さであり、そして配列番号:4のヌクレオチド1944-2003にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。 In a preferred embodiment, nucleic acid molecules (as for example, consecutive) at least 15 nucleotides in length, and SEQ ID NO: hybridizes to 4 nucleotides 1944-2003 under stringent conditions. 別の好ましい態様として、核酸分子は配列番号:4ヌクレオチド1944-2003を含んでなる。 In another preferred embodiment, the nucleic acid molecule SEQ ID NO: comprising 4 nucleotides 1944-2003. さらに別の好ましい態様として、核酸分子は配列番号:4ヌクレオチド1944-2 In yet another preferred embodiment, the nucleic acid molecule SEQ ID NO: 4 nucleotides 1944-2
003からなる。 Consisting of 003.

【0009】 別の態様として、核酸分子は配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードし、ここで、該核酸分子はストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4、6、7、9、10または1 [0009] As another embodiment, the nucleic acid molecule SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 encoding the allelic variants present in the polypeptide native comprising the amino acid sequence of, wherein said nucleic acid molecule SEQ ID NO: under stringent conditions: 1,3,4,6,7,9,10 or 1
2からなる核酸分子にハイブリダイズし、そしてhVR-1、hVR-2またはrVR-2と同じ遺伝子座によりコードされる。 It hybridizes to a nucleic acid molecule consisting of 2, and is encoded by the same genetic locus as the hVR-1, hVR-2 or RVR-2.

【0010】 本発明の別の態様は、配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然に存在するオーソロガスをコードする核酸分子を提供し、ここで、該核酸分子はストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4、6、7、9、1 [0010] Another aspect of the present invention, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or providing a nucleic acid molecule encoding a orthologous naturally occurring polypeptide comprising the amino acid sequence of 11, wherein said nucleic acid molecule sequence under stringent conditions number: 1,3,4,6,7,9,1
0または12からなる核酸分子にハイブリダイズする。 Hybridizes to a nucleic acid molecule consisting of 0 or 12.

【0011】 本発明の別の態様は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子、例えばhVR-1、hVR-2 Another aspect of the present invention, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule, for example, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2核酸分子のコーディング鎖にアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。 And provides an isolated nucleic acid molecule which is antisense to the coding strand of the RVR-2 nucleic acid molecule.

【0012】 hVR2(別形態)及びrVR2配列はこれらの遺伝子の全コーディング領域のフラグメントに相当するので、本発明の別の態様は完全な遺伝子配列を提供する。 [0012] HVR2 (another form) and rVR2 sequence so corresponds to a fragment of the entire coding region of these genes, another aspect of the present invention provides a complete gene sequence. 当業者は、本明細書において開示する配列を用いてそのような分子を容易に単離することができる。 Those skilled in the art can readily isolate such molecules using the sequences disclosed herein.

【0013】 本発明の別の態様は、hVR-1、hVR-2またはrVR-2核酸分子を含んでなるベクターを提供する。 Another aspect of the invention provides a vector comprising a hVR-1, hVR-2 or RVR-2 nucleic acid molecule. ある態様として、ベクターは組換え発現ベクターである。 As an embodiment, the vector is a recombinant expression vector. 別の態様として、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。 In another aspect, the present invention provides a host cell containing the vector of the present invention. さらに別の態様として、本発明は、本発明の核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a host cell containing nucleic acid molecules of the present invention.
本発明はまた、タンパク質が生産されるように、組換え発現ベクターを含有する本発明の宿主細胞、例えば非ヒト哺乳類細胞のような哺乳類宿主細胞を適当な培地中で培養することにより、タンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を製造する方法も提供する。 The present invention also provides, as the protein is produced by culturing the host cells of the present invention containing a recombinant expression vector, for example, mammalian host cells, such as nonhuman mammalian cells in a suitable medium, the protein, preferably also provides a method of producing a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein.

【0014】 本発明の別の態様は、単離されたまたは組換えのhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質及びポリペプチドを特徴とする。 Another aspect of the invention features a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 proteins and polypeptides isolated or recombinant. 一つの態様として、単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメインを含む。 In one embodiment, the isolated protein, preferably hVR-1, hVR-2 or RVR-2 protein comprises at least one transmembrane domain. 別の態様として、単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1、h In another embodiment, the isolated protein, preferably hVR-1, h
VR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン及び少なくとも VR-2 or RVR-2 protein comprises at least one transmembrane domain and at least
1個のプロリンに富んだドメイン(proline rich domain)を含む。 Including rich domain in one of proline (proline rich domain). さらに別の態様として、単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン及び少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを含む。 In yet another embodiment, the isolated protein, preferably hVR-1, hVR-2 or RVR-2 protein comprises at least one transmembrane domain, domain and at least one enriched in at least one proline including the ankyrin repeat domain. さらに別の態様として、タンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン及び少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを含み、そして配列番号:2、5、8 In yet another embodiment, the protein, preferably hVR-1, hVR-2 or RVR-2 protein comprises at least one transmembrane domain, enriched in at least one proline domain and at least one ankyrin repeat domain It includes, and SEQ ID NO: 2, 5, 8
または11のアミノ酸配列に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、 Or at least about 60% amino acid sequence of 11, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
87%、90%、95%、98%またはそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。 87%, 90%, 95%, 98% or more homologous to the amino acid sequence. 別の態様として、タンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン及び少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを含み、そして痛みの発生及び調節において役割を果たす。 In another embodiment, the protein, preferably hVR-1, hVR-2 or RVR-2 protein includes at least one transmembrane domain, enriched in at least one proline domain and at least one ankyrin repeat domain and it plays a role in the development and regulation of pain. さらに別の態様として、タンパク質、好ましくはhVR-1 In yet another embodiment, the protein, preferably hVR-1
、hVR-2またはrVR-2タンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン及び少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを含み、そして配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。 , HVR-2 or RVR-2 protein includes at least one transmembrane domain, enriched in at least one proline domain and at least one ankyrin repeat domain, and SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 It is encoded by a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence which hybridizes with 7, 9, 10 or 12 under stringent hybridization conditions to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence of.

【0015】 別の態様として、本発明は、配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントを特徴とし、ここで、該フラグメントは少なくとも [0015] As another aspect, the present invention is SEQ ID NO: fragment of a protein characterized having the amino acid sequence of 2, 5, 8 or 11, wherein said fragments are at least
15、30、40、50、60、70、80、90または100個のアミノ酸(例えば連続したアミノ酸)を含んでなる。 Comprising 15,30,40,50,60,70,80,90 or 100 amino acids (e.g., contiguous amino acids).

【0016】 別の態様として、本発明は、配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12のヌクレオチド配列またはその相補物に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80% [0016] As another aspect, the present invention is SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or at least about 60% nucleotide sequence or its complement of 12, 65%, 70%, 75 %, 80%
、83%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% , 83%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%
、96%、97%、98%、99%またはそれ以上相同なヌクレオチド配列からなる核酸分子によりコードされる単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2及びrV , 96%, 97%, 98%, isolated protein encoded by a nucleic acid molecule consisting of 99% or more homologous to the nucleotide sequence, preferably hVR-1, hVR-2 and rV
R-2タンパク質を特徴とする。 Wherein the R-2 protein. 本発明はさらに、配列番号:1、3、4、6、7、9、10 The present invention further relates SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10
もしくは12のヌクレオチド配列またはその相補物からなる核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる核酸分子によりコードされる単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1 Or 12 isolated protein encoded by a nucleic acid molecule consisting of nucleotide sequence which hybridizes to a nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence or its complement under stringent hybridization conditions, preferably hVR-1
、hVR-2またはrVR-2タンパク質を特徴とする。 , Characterized in hVR-2 or RVR-2 protein.

【0017】 本発明のタンパク質またはその一部、例えばその生物学的に活性の部分は、非 The protein or portion thereof of the present invention, for example, biologically active portions thereof, the non
hVR-1、非hVR-2または非rVR-2ポリペプチド(例えば異種起源のアミノ酸配列) hVR-1, non-hVR-2 or non-RVR-2 polypeptide (e.g., an amino acid sequence of the heterologous)
に操作可能に連結して融合タンパク質を生成せしめることができる。 It can be produced operably linked to the fusion protein. 本発明はさらに、本発明のタンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体のような抗体を特徴とする。 The present invention further provides a protein of the present invention, preferably characterized by antibodies such as monoclonal or polyclonal antibodies that specifically bind to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein. さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分は、場合により製薬学的に許容しうる担体を含んでもよい製薬学的組成物中に導入することができる。 Furthermore, part of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or biologically active may be optionally introduced into even better pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier it can.

【0018】 別の態様として、本発明は、生物学的サンプルにおいてhVR-1、hVR-2及びrVR- [0018] In another aspect, the present invention is, hVR-1, hVR-2 and in a biological sample rVR-
2核酸分子、タンパク質またはポリペプチドの存在が検出されるようにhVR-1、hV 2 nucleic acid molecule, hVR-1 as the presence of a protein or polypeptide is detected, hV
R-2及びrVR-2核酸分子、タンパク質またはポリペプチドを検出することができる作用因子と生物学的サンプルとを接触させることにより生物学的サンプルにおけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子、タンパク質またはポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。 R-2 and RVR-2 nucleic acid molecule, protein, or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid in a biological sample by contacting the agent with a biological sample capable of detecting a polypeptide provides a method for detecting molecules, the presence of the protein or polypeptide.

【0019】 別の態様として、本発明は、生物学的サンプルにおいてhVR-1、hVR-2及びrVR- [0019] In another aspect, the invention, hVR-1, hVR-2 and in a biological sample rVR-
2活性の存在が検出されるようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性の指標を検出することができる作用因子と生物学的サンプルとを接触させることにより生物学的サンプルにおけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性の存在を検出する方法を提供する。 By the presence of 2 activity to contact the agent with a biological sample capable of detecting the indication of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity as detected in a biological sample hVR- 1, provides a method of detecting the presence of a hVR-2 and RVR-2 activity.

【0020】 別の態様として、本発明は、細胞におけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性が調節されるようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する作用因子とhVR-1、hVR-2及びrVR-2を発現することができる細胞とを接触させることを含んでなるhVR-1、hV [0020] As another aspect, the present invention includes a agent that modulates hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity as hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity in cells is regulated hVR-1, capable of expressing the hVR-2 and RVR-2 comprising contacting a cell hVR-1, hV
R-2及びrVR-2活性を調節する方法を提供する。 It provides a method of modulating the R-2 and RVR-2 activity. 一つの態様として、作用因子はhV In one embodiment, the agent hV
R-1、hVR-2及びrVR-2活性を阻害する。 Inhibit R-1, hVR-2 and RVR-2 activity. 別の態様として、作用因子はhVR-1、hVR- In another embodiment, the agent hVR-1, HVR
2及びrVR-2活性を刺激する。 Stimulating 2 and RVR-2 activity. 一つの態様として、作用因子は、hVR-1、hVR-2及び In one embodiment, the agent, hVR-1, hVR-2 and
rVR-2タンパク質に特異的に結合する抗体である。 Is an antibody that specifically binds to RVR-2 protein. 別の態様として、作用因子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の転写またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAの翻訳を調節することによりhVR-1、hVR-2及びrVR-2の発現を調節する。 In another aspect, the agent, hVR-1, hVR-1 by adjusting the hVR-2 and the transfer of the RVR-2 gene or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA translation, hVR-2 and to regulate the expression of RVR-2. さらに別の態様として、作用因子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはhVR-1、hVR-2及び In yet another embodiment, the agent, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA or hVR-1, hVR-2 and
rVR-2遺伝子のコーディング鎖にアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。 The coding strand of RVR-2 gene is a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence that is antisense.

【0021】 一つの態様として、本発明の方法は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターである作用因子を被験体に投与することにより異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸発現または活性を特徴とする疾患にかかっている被験体を処置するために用いられる。 [0021] In one embodiment, the method of the present invention, hVR-1, aberrant hVR-1 by administering an agent which is hVR-2 and RVR-2 modulators to a subject, hVR-2 and rVR- used to treat a subject suffering from a disease characterized by 2 protein or nucleic acid expression or activity. 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質である。 In one embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 modulator is a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein. 別の態様として、hVR-1、 In another embodiment, hVR-1,
hVR-2及びrVR-2モジュレーターは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子である。 hVR-2 and RVR-2 modulator is a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule. さらに別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターは、ペプチド、ペプチド模倣物または他の小分子である。 In yet another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 modulator is a peptide, a peptidomimetic, or other small molecule. さらなる態様として、異常なhVR-1、hVR As a further aspect, aberrant hVR-1, hVR
-2及びrVR-2タンパク質または核酸発現を特徴とする疾患は痛み疾患、例えば痛覚過敏である。 -2 and diseases characterized by RVR-2 protein or nucleic acid expression pain disease, for example hyperalgesia.

【0022】 本発明はまた、(i)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または突然変異;(ii)該遺伝子の誤った調節;並びに(iii)hVR [0022] The present invention also provides, (i) hVR-1, aberrant modification or mutation of a gene encoding a hVR-2 and RVR-2 protein; adjusted erroneous (ii) said gene; and (iii) hVR
-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の異常な翻訳後修飾の少なくとも1つを特徴とする遺伝子変化の有無を同定するための診断アッセイも提供し、ここで、該遺伝子の野生型形態は(本明細書において記述するような)hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を有するタンパク質をコードする。 -1 also provides diagnostic assays for identifying the presence or absence of a genetic alteration characterized by at least one of the hVR-2 and RVR-2 aberrant post-translational modification of proteins, where the wild-type form of the gene coding for a protein having the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity (as described herein).

【0023】 別の態様として、本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を有するhVR-1、hVR- [0023] In another aspect, the invention, hVR-1 having a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity, HVR
2及びrVR-2タンパク質を含んでなる指標組成物を準備すること、指標組成物を試験化合物と接触させること及び指標組成物におけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性に対する試験化合物の影響を決定してhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の活性を調節する化合物を同定することにより、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に結合するかまたはその活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。 2 and providing a comprising at index composition RVR-2 proteins, effects of hVR-1, the test compound on hVR-2 and RVR-2 activity in contacting with the indicator composition test compound and an indicator composition the determined by identifying compounds that modulate the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein activity, modulate hVR-1, or its activity to bind to hVR-2 and RVR-2 protein provides methods for identifying compounds.

【0024】 本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記述及び請求項から明らかである。 [0024] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and claims.

【0025】 発明の詳細な記述本発明は、少なくとも一つには、受容体のカプサイシン/バニロイドファミリーの新規メンバーである核酸及びアミノ酸分子の発見に基づく。 [0025] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is based, at least in one, based on the discovery of a nucleic acid and amino acid molecule that is a novel member of the capsaicin / vanilloid family of receptors. 本明細書において記述するのは、本明細書においてhVR-1と呼ばれる、ラットVR-1(rVR-1)のヒトオーソロガス並びに本明細書においてVR-2、詳細にはヒトVR-2(hVR-2)及びラットVR-2(rVR-2)核酸及びタンパク質分子と呼ばれる、受容体のVRファミリーの以前に未知の別のメンバーの単離である。 Describe herein are referred to herein as hVR-1, rat VR-1 (rVR-1) human orthologous and VR-2 in the present specification, in particular human VR-2 ( hVR-2) and rat VR-2 (rVR-2) are referred to as nucleic acid and protein molecules, in previous VR family of receptor isolation of unknown another member. hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は、 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule,
既知のラットバニロイド受容体(VR-1)に対するそれらの配列類似性に基づいて同定された。 It has been identified based on their sequence similarity to known rat vanilloid receptor (VR-1). VR-1は、細胞内カルシウム貯蔵の枯渇に応答して細胞外カルシウムの流入をもたらす一過性受容体電位(TRP)イオンチャンネルファミリー(Monte VR-1 is transient receptor potential in response to depletion of intracellular calcium stores results in influx of extracellular calcium (TRP) ion channel family (Monte
ll et al.(1989)Neuron 2:1313-1323に記述されている)のメンバーに似ているバニロイド依存性非選択的陽イオンチャンネルである。 . Ll et al (1989) Neuron 2: 1313-1323 are described in) is a vanilloid-dependent non-selective cation channels that are similar to the members of. ラットVR-1 cDNAは、838 Rat VR-1 cDNA is, 838
アミノ酸のタンパク質をコードする2514ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有する。 It contains a 2514 nucleotide open reading frame that encodes a protein of amino acid. 親水性分析により、ラットVR-1は6個の膜貫通ドメイン(主にα-へリックスであると予測される)を膜貫通領域5と6の間のさらなる短い疎水性範囲と共に含有することが示されている。 The hydrophilic analysis, rat VR-1 is able to contain with additional short hydrophobic region between six transmembrane domains (expected to be helix primarily to alpha-) transmembrane regions 5 and 6 It is shown. アミノ末端の親水性セグメントは、比較的プロリンに富んだ領域及びそれに続く3個のアンキリンリピートドメインを含有する。 Hydrophilic segment of the amino terminus, contains three ankyrin repeat domain followed rich region and its comparatively proline. ラットVR-1は、知覚神経節内の小直径ニューロン(small diamet Rat VR-1 is a small diameter neurons in the sensory ganglia (small diamet
er neuron)において発現される。 It is expressed in er neuron). 本発明のhVR-1配列はrVR-1のヒトオーソロガスである。 hVR-1 sequences of the present invention is a human orthologous the RVR-1. 以下にさらに詳細に記述するように、ヒトVR-1は、結節性(nodose)、 As described in more detail below, the human VR-1 is nodular (nodose),
三叉神経感覚ニューロン並びに全てではないがいくつかの小型脊髄神経節(DRG Not a trigeminal sensory neurons as well as all but some of the small dorsal root ganglion (DRG
)ニューロン及び少数の中型DRGニューロンにおいて発現される。 ) It is expressed in neurons and a few medium sized DRG neurons.

【0026】 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は、痛みシグナリング機構において役割を果たす。 [0026] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules of the present invention plays a role in pain signaling mechanisms. 本明細書において用いる場合、「痛みシグナリング機構」という用語には、被験体、例えばヒトのような哺乳類における痛み、例えば有毒な化学的、 As used herein, the term "pain signaling mechanisms" includes subjects, such as pain in a mammal such as a human, for example, toxic chemical,
機械的または熱刺激により引き出される痛みの発生及び調節に関与する細胞機構が包含される。 Cellular mechanisms are encompassed involved in the development and regulation of pain elicited by mechanical or thermal stimulus. 哺乳類において、「侵害受容」と呼ばれるプロセスである、有毒な化学的、機械的または熱刺激の初期検出は、主として、多様式(polymodal) In mammals, a process referred to as "nociception", toxic chemical, mechanical or early detection of thermal stimulation, primarily, polymodal (polymodal)
侵害受容器と呼ばれる特殊化した小直径一次求心性ニューロン(small diameter Nociceptors specialization called the small diameter primary afferent neurons (small For diameter
primary afferent neurons)の末梢終末で起こる。 It takes place in the primary afferent neurons) peripheral endings. これらの求心性ニューロンは、この情報を中枢神経系に伝達し、痛みまたは不快の認知を喚起し、そして適当な防御反射を開始する。 These afferent neurons transmit the information to the central nervous system, arouse perception of pain or discomfort, and to initiate appropriate defense reflection. これらの求心性ニューロン上に存在するカプサイシン/バニロイド受容体、例えば本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は、これらの有毒な化学的、機械的または熱刺激を検出すること及びこの情報を膜脱分極事象に変換することに関与する。 Capsaicin / vanilloid receptors present on these afferent neurons, for example, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules of the present invention, and it is detect these toxic chemical, mechanical or thermal stimuli responsible for converting the information layer in depolarization events. 従って、痛みシグナリング機構に関与することによりhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は痛みを引き出すことを調節することができ、そして痛みを制御するための新規な診断標的及び治療因子を提供することができる。 Therefore, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules by participating in pain signaling mechanisms can be adjusted to withdraw the pain and provide novel diagnostic targets and therapeutic agents for controlling pain can do.

【0027】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は、調節を失った、例えばアップレギュレーションされたまたはダウンレギュレーションされた痛み応答を特徴とする様々な疾患、疾病または症状において痛みを制御するための新規な診断標的及び治療因子を提供する。 [0027] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules lost regulatory controls pain in a variety of diseases, disease or condition characterized pain response, for example, which is upregulated or down-regulated provide novel diagnostic targets and therapeutic agents for. 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子は、一般に痛覚過敏(例えば、F For example, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules generally hyperalgesia (e.g., F
ields, HL(1987)Pain, New York:McGraw-Hillに記述されている)と呼ばれる様々な形態の組織損傷、例えば炎症、感染及び虚血の間に引き出される過大な痛み応答を制御するための新規な診断標的及び治療因子を提供する。 ields, HL (1987) Pain, New York: McGraw-Hill described in) and tissue damage in a variety of forms, called, for example inflammation, to control excessive pain response elicited during infection and ischemia to provide a novel diagnostic targets and therapeutic agents. さらに、hVR- In addition, hVR-
1、hVR-2及びrVR-2分子は、、筋骨格疾患(muscoloskeletal disorders)と関連する痛み、例えば関節痛;歯痛;頭痛;手術と関連する痛みまたは神経障害性の痛みを制御するための新規な診断標的及び治療因子を提供する。 1, hVR-2 and RVR-2 molecules pain associated with ,, Musculoskeletal disorders (muscoloskeletal disorders), for example, joint pain; toothache; headache; novel for controlling pain or neuropathic pain associated with surgery providing Do diagnostic targets and therapeutic agents.

【0028】 hVR-1遺伝子は、WI-5436(7.7cR)とWI-6584(18.9cR)の間のヒト第17染色体の領域に位置し(実施例6)、これは重症筋無力症、スミス-マジェニス(Smith-Mage [0028] hVR-1 gene is located in the area of ​​human chromosome 17 between WI-5436 (7.7cR) and WI-6584 (18.9cR) (Example 6), which is myasthenia gravis, Smith - Majenisu (Smith-Mage
nis)症候群、CORD5、錐体-杆体ジストロフィー及び乳癌と関連しているので、h nis) syndrome, CORD5, cone - so associated with rod dystrophy and breast cancer, h
VR-1分子は、この染色体領域に関連するこれらの疾患または他の疾患を処置する、診断するまたは予測するための新規な診断標的及び治療因子を提供することができる。 VR-1 molecule, to treat these diseases or other diseases associated with this chromosomal region, can provide a novel diagnostic targets and therapeutic agents for the diagnosing or predicting. 同様に、hVR-2遺伝子は、AFMA043ZB5(23.3cR)とD17A721(29.3cR)の間のヒト第17染色体の領域に位置し(実施例6)、これは重症筋無力症、スミス-マジェニス症候群、CORD5、錐体-杆体ジストロフィー、脈絡膜ジストロフィー、中心性輪紋状及び網膜錐体ジストロフィーと関連しているので、hVR-2分子は、この染色体領域に関連するこれらの疾患または他の疾患を処置する、診断するまたは予測するための新規な診断標的及び治療因子を提供することができる。 Similarly, hVR-2 gene, AFMA043ZB5 (23.3cR) and D17A721 located in the region of the human chromosome 17 between (29.3cR) (Example 6), which is myasthenia gravis, Smith - Majenisu syndrome, CORD5, cone - rod dystrophy, choroidal dystrophy, since associated with centrilobular areolar and retinal cone dystrophy, hVR-2 molecules to treat these diseases or other diseases associated with this chromosomal region , it is possible to provide a novel diagnostic targets and therapeutic agents for diagnosing or predicting.

【0029】 「ファミリー」という用語は、本発明のタンパク質及び核酸分子をさす場合、 [0029] The term "family", when referring to the protein and nucleic acid molecules of the present invention,
共通の構造ドメインまたはモチーフを有する及び本明細書において定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する2つまたはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味するものとする。 It shall mean two or more proteins or nucleic acid molecules having sufficient amino acid or nucleotide sequence homology as defined in and herein having a common structural domain or motif. そのようなファミリーメンバーは、天然にまたは非天然に存在することができ、そして同じまたは異なる種のいずれからであることができる。 Such family members can be naturally occurring or non-naturally occurring and can be from either the same or different species. 例えば、ファミリーはヒト起源の第一のタンパク質並びにヒト起源の他の異なるタンパク質を含有することができ、あるいはまた非ヒト起源の相同物を含有することができる。 For example, family can contain other different proteins can contain, alternatively homolog of non-human origin of a first protein and human origin of human origin. また、ファミリーのメンバーは共通の機能特性を有してもよい。 In addition, members of the family may have a common functional characteristics.

【0030】 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のファミリーは、少なくとも1個、 [0030] For example, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein family, at least one,
好ましくは6個の「膜貫通ドメイン」を含んでなる。 Preferably comprise the six "transmembrane domain". 本明細書において用いる場合、「膜貫通ドメイン」という用語には、細胞膜にまたがる約15アミノ酸残基の長さのアミノ酸配列が包含される。 As used herein, the term "transmembrane domain", the amino acid sequence of a length of about 15 amino acid residues that spans the cell membrane, and the like. より好ましくは、膜貫通ドメインは少なくとも約20、25、30、35、40または45アミノ酸残基を含み、細胞膜にまたがる。 More preferably, a transmembrane domain includes at least about 20,25,30,35,40 or 45 amino acid residues, across the cell membrane. 膜貫通ドメインは疎水性残基に富み、典型的にへリックス構造を有する。 The transmembrane domain is rich in hydrophobic residues, have a helical structure typically. ある態様として、膜貫通ドメインの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上のアミノ酸残基は疎水性、例えばロイシン、イソロイシン、チロシンまたはトリプトファンである。 As an embodiment, at least 50% of the transmembrane domain, is 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more amino acid residues are hydrophobic, such as leucine, isoleucine, tyrosine or tryptophan. 膜貫通ドメインは、例えば、Zagotta WN et al. The transmembrane domain, for example, Zagotta WN et al.
(1996) Annual.. Rev. Neurosci. 19:235-63に記述されており、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。 (1996) Annual .. Rev. Neurosci 19:. Are described in 235-63, the contents of which are incorporated herein by reference. hVR-1(配列番号:2)のアミノ酸残基 hVR-1 (SEQ ID NO: 2) amino acid residues
434-455、480-495、(509-531;ラットVR-1に対する相同性に基づく)または514 434-455,480-495, (509-531; based on homology to rat VR-1) or 514
-531、(543-569;ラットVR-1に対する相同性に基づく)または538-555、(577- -531, (543-569; based on homology to rat VR-1) or 538-555, (577-
596;ラットVR-1に対する相同性に基づく)または580-599及び(656-683;ラットVR-1に対する相同性に基づく)または658-682並びにhVR-2(配列番号:5)のアミノ酸残基391-410、431-448、459-476、486-508、538-556及び621-645は、膜貫通ドメインを含んでなる。 596; rats based on VR-1 homology to) or 580-599 and (656-683; based on homology to rat VR-1) or 658-682 and hVR-2 (SEQ ID NO: 5 amino acid residues) 391-410,431-448,459-476,486-508,538-556 and 621-645 comprise the transmembrane domain.

【0031】 別の態様として、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2は、タンパク質または対応する核酸分子中の「プロリンに富んだドメイン」の存在に基づいて同定される。 [0031] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 of the present invention is identified based on the presence of "rich domains proline" of a protein or corresponding nucleic acid molecule.
本明細書において用いる場合、「プロリンに富んだドメイン」という用語には、 As used herein, the term "rich domains proline" is,
一般配列X-Pro-XX-Pro-X(ここで、Xはいずれのアミノ酸であってもよい)を有する約4-6アミノ酸残基の長さのアミノ酸配列が包含される。 (Wherein, X is may also be any amino acid) general sequence X-Pro-XX-Pro-X amino acid sequence length of about 4-6 amino acid residues having the like. プロリンに富んだドメインは、一般にへリックス構造中に位置し、疎水性相互作用によりSH3ドメインに結合する。 Rich domain proline, located in helix structure to generally binds to SH3 domain by hydrophobic interaction. SH3ドメインは、フォワード及びリバースの両方の向きのプロリンに富んだドメインを認識する。 SH3 domain, recognizes the rich domain to proline of forward and reverse of both orientations. プロリンに富んだドメインは、例えば、Satt Domain rich in proline, for example, Satt
ler M. et al.(1998)Leukemia 12:637-644に記述されており、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。 . Ler M. et al (1998) Leukemia 12: are described in 637-644, the contents of which are incorporated herein by reference.

【0032】 別の態様として、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2は、タンパク質または対応する核酸分子中の「アンキリンリピートドメイン」の存在に基づいて同定される。 [0032] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 of the present invention is identified based on the presence of "ankyrin repeat domain" of a protein or corresponding nucleic acid molecule. 本明細書において用いる場合、「アンキリンリピートドメイン」という用語には、約30-50アミノ酸残基のアミノ酸配列を有しそして少なくとも6のアンキリンリピートドメイン(HMM)への配列の整列のビットスコアを有するタンパク質ドメインが包含される。 As used herein, the term "ankyrin repeat domain", has a bit score for the alignment of sequences to have an amino acid sequence and at least 6 ankyrin repeat domain of about 30-50 amino acid residues (HMM) protein domains are included. 好ましくは、アンキリンリピートドメインは、少なくとも約30-45、より好ましくは約30-40アミノ酸残基または約30-35アミノ酸を有し、 Preferably, ankyrin repeat domain has at least about 30-45, more preferably about 30-40 amino acid residues, or about 30-35 amino acids,
そして少なくとも3-10、より好ましくは10-30、より好ましくは30-50、さらにより好ましくは50-75、75-100、100-200またはそれ以上のアンキリンリピートドメイン(HMM)への配列の整列のビットスコアを有する。 And at least 3-10, more preferably 10-30, more preferably 30-50, even more preferably alignment of sequences to 50-75,75-100,100-200 or more ankyrin repeat domain (HMM) having a bit score. アンキリンリピートドメインHMMは、PFAM Accession PF00023が付与されている({ HYPERLINK "http://geno Ankyrin repeat domain HMM is, PFAM Accession PF00023 has been granted ({HYPERLINK "http: // geno
me.wustl.edu/" , http://genome.wustl.edu/ }Pfam/.html)。アンキリンリピートは、タンパク質-タンパク質相互作用に関与し、例えばKetchum KA et al.( . me.wustl.edu/ ", http://genome.wustl.edu/} Pfam / .html) ankyrin repeats, protein - involved in protein-protein interactions, for example Ketchum KA et al (.
1996)FEBS Letters 378:19-26に記述されており、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。 1996) FEBS Letters 378: 19-26 are described in, the contents of which are incorporated herein by reference.

【0033】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質中のアンキリンリピートドメインの存在を同定し、目的のタンパク質が特定のプロフィールを有することを決定するために、デフォールトパラメーターを用いてHMMのデータベース(例えばPfamデータベース、リリース2.1)に対してタンパク質のアミノ酸配列を検索する(http://ww [0033] to identify the presence of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 ankyrin repeat domains in the protein to the protein of interest is determined to have a particular profile, the HMM using the default parameters database (for example Pfam database, release 2.1) to find the amino acid sequence of the protein with respect to (http: // ww
w.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)。 w.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Pfamデータベースの記述は、Son Description of the Pfam database, Son
hammer et al.(1997) Proteins 28(3)405-420に見出すことができ、HMMの詳細な記述は、例えば、Gribskov et al.(1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribsk . Hammer et al (1997) Proteins 28 (3) can be found in 405-420, detailed description of the HMM is, for example, Gribskov et al (1990) Meth Enzymol 183:... 146-159; Gribsk
ov et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al.(19 ..... Ov et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:. 4355-4358; Krogh et al (19
94) J. Mol. Biol. 235:1501-1531;及びStultz et al.(1993) Protein Sci. 2:3 .. 94) J. Mol Biol 235:.. 1501-1531; and Stultz et al (1993) Protein Sci 2: 3
05-314に見出すことができ、それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。 Can be found in 05-314, the contents of which are incorporated herein by reference. HMMデータベースに対して検索を実施し、配列番号:2(約残基201-233 To perform a search against HMM database, SEQ ID NO: 2 (about residue 201-233
、248-283及び333-361で)及び配列番号:5(約残基162-194、208-243及び293-32 , 248-283 and in 333-361) and SEQ ID NO: 5 (about residues 162-194,208-243 and 293-32
8で)のアミノ酸配列における3個のアンキリンリピートドメインの同定がもたらされた。 Identification of three ankyrin repeat domains in the amino acid sequence of 8) has been brought about. 検索の結果を図13及び15に記述する。 Described in FIGS. 13 and 15 search results.

【0034】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、配列番号:2、5、8もしくは11のアミノ酸配列に十分に同一であるアミノ酸配列を有するかまたは配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12に十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる。 The isolated protein of the present invention, preferably hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, SEQ ID NO: the amino acid sequence sufficiently identical to the 2, 5, 8, or 11 amino acid sequence of or SEQ ID NO with: encoded by a nucleotide sequence sufficiently identical to 1,3,4,6,7,9,10 or 12. 本明細書において用いる場合、「 As used herein, "
十分に同一である」という用語は、第一及び第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフ及び/または共通の機能活性を共有するように第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同じまたは同等な(例えば、同様の側鎖を有するアミノ酸残基)アミノ酸残基またはヌクレオチドの十分なまたは最低限の数を含有する第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列をさす。 The term sufficiently identical "are the same or equivalent to a second amino acid or nucleotide sequence such that the first and second amino acid or nucleotide sequences share common structural domains or motifs and / or common functional activity a (e.g., amino acid residues having similar side chains) refers to a first amino acid or nucleotide sequence which contains a number sufficient or minimal amino acid residues or nucleotides. 例えば、共通の構造ドメインを共有し、ドメインのアミノ酸配列にわたって少なくとも30%、40%または50%の同一性、好ましくは60%の同一性、より好ましくは For example, share a common structural domain, at least 30% over the amino acid sequence of the domain, 40% or 50% identity, preferably 60% identity, more preferably
70-80%、さらにより好ましくは90-95%の同一性を有し、そして少なくとも1個、好ましくは2個の構造ドメインまたはモチーフを含有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に同一であると定義される。 70-80%, even more preferably has a identity of 90-95%, and at least one, preferably the amino acid or nucleotide sequence contains two structural domains or motifs, sufficiently identical herein it is defined to be. さらに、少なくとも30%、40%または50%、好ましくは60%、より好ましくは70-80%または90-95%の同一性を共有し、そして共通の機能活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に同一であると定義される。 Furthermore, at least 30%, 40% or 50%, preferably 60%, more preferably share the identity of 70-80%, or 90-95%, and common functional active amino acid or nucleotide sequences share is it is defined to be sufficiently identical herein.

【0035】 本明細書において互換的に用いる場合、「hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性」、「h [0035] If interchangeably used herein, "hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity", "h
VR-1、hVR-2及びrVR-2の生物学的活性」または「hVR-1、hVR-2及びrVR-2の機能活性」は、標準的な技術に従って、インビボまたはインビトロで測定した場合に、hVR-1、hVR-2及びrVR-2応答細胞またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質基質に対してhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子により及ぼされる活性をさす。 VR-1, hVR-2 and RVR-2 biological activity "or" hVR-1, hVR-2 and RVR-2 functional activity ", according to standard techniques, as measured in vivo or in vitro , hVR-1, hVR-2 and RVR-2 responsive cell or hVR-1, hVR-1 with respect to hVR-2 and RVR-2 protein substrate, hVR-2 and RVR-2 protein, the polypeptide or nucleic acid molecule It refers to an activity that is exerted. 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性は、h In one embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity, h
VR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子との会合のような直接的活性である。 It is a direct activity, such as an association with VR-1, hVR-2 and RVR-2 target molecule. 本明細書において用いる場合、「標的分子」または「結合相手」は、hVR-1、hVR-2及びrVR- As used herein, "target molecule" or "binding partner" is, hVR-1, hVR-2 and rVR-
2によりもたらされる機能が得られるように、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質が事実上結合するかまたは相互作用する分子である。 As functions provided by 2 is obtained, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein is a molecule that to bind to or interact effectively. hVR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子は、非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2分子または本発明のhVR-1、hVR-2及びr hVR-1, hVR-2 and RVR-2 target molecule, non-hVR-1, non-hVR-2 and non-RVR-2 molecule or the invention hVR-1, hVR-2 and r
VR-2タンパク質もしくはポリペプチドであることができる。 It can be a VR-2 protein or polypeptide. 典型的態様として、 As a typical embodiment,
hVR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子はhVR-1、hVR-2及びrVR-2リガンド、例えばカプサイシンである。 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 target molecule hVR-1, hVR-2 and RVR-2 ligand, such as capsaicin. あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性は、hVR-1、hVR-2 Alternatively, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2リガンドとhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質との相互作用によりもたらされる細胞シグナリング活性のような間接的活性である。 And an indirect activity, such as a cellular signaling activity exerted by the interaction of the RVR-2 ligand and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein.

【0036】 従って、本発明の別の態様は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を有する単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質及びポリペプチドを特徴とする。 [0036] Accordingly, another aspect of the present invention is characterized in hVR-1, hVR-1 was isolated with a hVR-2 and RVR-2 activity, hVR-2 and RVR-2 proteins and polypeptides . 本発明の別のタンパク質は、少なくとも1個、好ましくは6個の膜貫通ドメイン並びに好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質である。 Another protein of the invention, at least one, preferably six transmembrane domains and preferably hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein having a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity is there. 本発明のさらに別のタンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、 Yet another protein of the invention, at least one transmembrane domain,
少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン並びに好ましくはhVR-1、hVR-2及びr At least one rich domains and preferably proline hVR-1, hVR-2 and r
VR-2活性を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質である。 A hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein having a VR-2 activity. 本発明の別のタンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン、少なくとも1個のアンキリンリピートドメイン並びに好ましくはhVR Another protein of the invention, at least one transmembrane domain, a domain rich in at least one proline at least one ankyrin repeat domains and preferably hVR
-1、hVR-2及びrVR-2活性を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質である。 -1, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein having a hVR-2 and RVR-2 activity. 本発明のさらなるタンパク質は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、少なくとも1 A further protein of the invention, at least one transmembrane domain, at least one
個のプロリンに富んだドメイン、少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを有し、そして好ましくは配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。 Rich domain number of proline, has at least one ankyrin repeat domains, and preferably SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence of 12 It is encoded by a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence that hybridizes under stringent hybridization conditions.

【0037】 全長hVR-1 cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-1ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図1並びに配列番号:1及び2にそれぞれ示す。 The full length hVR-1 cDNA nucleotide sequence and hVR-1 polypeptide of the predicted amino acid sequence Figure 1 and in SEQ ID NO: respectively in 1 and 2.

【0038】 全長hVR-2 cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-2ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図2並びに配列番号:4及び5にそれぞれ示す。 The full length hVR-2 cDNA nucleotide sequence and hVR-2 polypeptide of the predicted amino acid sequence Figure 2 and SEQ ID NO: respectively 4 and 5.

【0039】 部分hVR-2(別形態)cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-2(別形態)ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図3並びに配列番号:7及び8にそれぞれ示す。 The portion hVR-2 (another form) cDNA nucleotide sequence and hVR-2 (another form) polypeptide 3 and SEQ ID NO: The predicted amino acid sequence of: respectively 7 and 8.

【0040】 部分rVR-2 cDNAのヌクレオチド配列及びrVR-2ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図4並びに配列番号:10及び11にそれぞれ示す。 The partial RVR-2 cDNA nucleotide sequence and RVR-2 polypeptide predicted amino acid sequence of Figure 4 and SEQ ID NO: respectively 10 and 11.

【0041】 本発明の様々な態様を以下の小節においてさらに詳細に記述する: I. [0041] are described in further detail in the following subsections Various aspects of the present invention: I. 単離された核酸分子本発明の一つの態様は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分をコードする単離された核酸分子並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2 One embodiment of the isolated nucleic acid molecule present invention, hVR-1, hVR-2 and an isolated nucleic acid molecule that encodes a RVR-2 protein or biologically active portions thereof, as well as hVR-1, hVR -2 and RVR-2
をコードする核酸分子(例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNA)を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために十分な核酸フラグメント並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子の増幅または突然変異のためのPCRプライマーとしての使用のためのフラグメントに関する。 Encoding nucleic acid molecules (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA) sufficient nucleic acid fragments and hVR-1 for use as hybridization probes to identify, hVR-2 and RVR-2 regarding fragments for use as PCR primers for the amplification or mutation of nucleic acid molecules. 本明細書において用いる場合、「核酸分子」という用語には、DNA分子(例えばcDNAまたはゲノムDNA)及びRN As used herein, the term "nucleic acid molecule", DNA molecules (e.g., cDNA or genomic DNA) and RN
A分子(例えばmRNA)並びにヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNAまたはRN A molecule (e.g., mRNA) and are generated using nucleotide analogs DNA or RN
Aの類似体が包含されるものとする。 Shall analogs of A are included. 核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖DNAである。 Nucleic acid molecules can be single-stranded or double-stranded, but preferably is double-stranded DNA.

【0042】 「単離された核酸分子」という用語には、核酸の生来の供給源において存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子が包含される。 [0042] The term "isolated nucleic acid molecule" is a nucleic acid molecule which is separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid are encompassed. 例えば、ゲノムDNA For example, genomic DNA
に関して、「単離された」という用語には、ゲノムDNAが生来会合している染色体から分離されている核酸分子が包含される。 Regard, the term "isolated" nucleic acid molecule genomic DNA is separated from the chromosome with which it is associated native and the like. 好ましくは「単離された」核酸は、該核酸が由来する生物体のゲノムDNAにおいて該核酸に生来隣接する配列(すなわち、該核酸の5'及び3'末端に位置する配列)を含まない。 Preferably "isolated" nucleic acid is free of native flanking sequences in the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (i.e., 5 'and 3' located at the end sequence of the nucleic acid). 例えば、様々な態様として、単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムDNAにおいて該核酸分子に生来隣接する約5kb、4kb、3kb、2kb、1 For example, the various embodiments, the isolated hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule is about to naturally adjacent to the nucleic acid molecule in genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1
kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含有することができる。 kb, can contain a nucleotide sequence of less than 0.5kb or 0.1 kb. さらに、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により製造する場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まないことができ、または化学的に合成する場合には化学的前駆体もしくは他の化学製品を実質的に含まないことができる。 Moreover, an "isolated" nucleic acid molecule such as a cDNA molecule, when produced by recombinant techniques may be substantially free of other cellular material or culture medium, or chemically when synthesizing it can be substantially free of chemical precursors or other chemicals to.

【0043】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を有する核酸分子。 [0043] The nucleic acid molecules of the present invention, e.g., SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of 12. hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子は、配列番号: hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule is SEQ ID NO:
1、3、4、6、7、9、10または12の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて(例えば、Sambrook, J., Fritsh, EF及びMania All or part of the nucleic acid sequence of 1,3,4,6,7,9,10 or 12 using as hybridization probes (e.g., Sambrook, J., Fritsh, EF and Mania
tis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbo tis, T. Molecular Cloning:. A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N r Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
Y, 1989 に記述されているような)標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使用して単離することができる。 Y, 1989 as described in) can be isolated using standard hybridization and cloning techniques.

【0044】 さらに、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の全部または一部を包含する核酸分子は、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR) [0044] In addition, SEQ ID NO: nucleic acid molecule encompassing all or a portion of 1,3,4,6,7,9,10 or 12, SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9, polymerase chain reaction using synthetic oligonucleotide primers designed based on the 10 or 12 sequences (PCR)
により単離することができる。 It can be isolated by.

【0045】 本発明の核酸は、標準的なPCR増幅技術に従ってcDNA、mRNAあるいはまたゲノムDNAを鋳型としてそして適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。 The nucleic acids of the present invention, cDNA according to standard PCR amplification techniques, the mRNA or alternatively genomic DNA can be amplified using and appropriate oligonucleotide primers as a template. このようにして増幅した核酸を適当なベクター中にクローン化し、そしてDNA配列分析により特性化することができる。 Thus the nucleic acid amplification and cloned into a suitable vector by and can be characterized by DNA sequence analysis. さらに、標準的な合成技術により、例えば自動DNA合成機を用いて、hVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを調製することができる。 Furthermore, by standard synthetic techniques, e.g., using an automated DNA synthesizer, can be prepared hVR-1, hVR-2 and RVR-2 oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequence.

【0046】 一つの態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含んでなる。 [0046] In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: comprising a nucleotide sequence shown in. 配列番号:1の配列は、cDNAをコードする全長hVR-1に対応する。 SEQ ID NO: 1 of the sequence corresponds to the full length hVR-1 encoding cDNA.

【0047】 別の態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:4に示すヌクレオチド配列を含んでなる。 [0047] As another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: comprising a nucleotide sequence shown in 4. 配列番号:4の配列は、cDNAをコードする全長hVR-2に対応する。 SEQ ID NO: sequence of 4 corresponds to the full length hVR-2 encoding cDNA.

【0048】 別の態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:7に示すヌクレオチド配列を含んでなる。 [0048] As another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: comprising a nucleotide sequence shown in 7. 配列番号:7の配列は、cDNAをコードするhVR-2(別形態)のフラグメントに対応する。 SEQ ID NO: 7 sequences correspond to fragments of hVR-2 (another form) encoding cDNA.

【0049】 別の態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:10に示すヌクレオチド配列を含んでなる。 [0049] As another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: comprising a nucleotide sequence shown in 10. 配列番号:10の配列は、rVR-2 cDNAのフラグメントに対応する。 SEQ ID NO: sequence of 10 corresponds to a fragment of the RVR-2 cDNA.

【0050】 別の態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:1、3、4、6、7、 [0050] As another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,
9、10もしくは12に示すヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部の相補物である核酸分子を含んでなる。 9,10 or nucleotide sequence shown in 12 or comprising a nucleic acid molecule which is a complement of the part of either of these nucleotide sequences. 配列番号:1、3、4、6、7、 SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,
9、10または12に示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号:1 Nucleic acid molecule that is complementary to the nucleotide sequence shown in 9, 10 or 12, SEQ ID NO: 1
、3、4、6、7、9、10または12に示すヌクレオチド配列にそれがハイブリダイズし、それにより安定な二重鎖を形成することができるように、配列番号:1、3、4 It hybridizes to the nucleotide sequence shown in 3,4,6,7,9,10 or 12, thereby to be able to form a stable duplex, SEQ ID NO: 1, 3, 4
、6、7、9、10または12に示すヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。 Is sufficiently complementary to the nucleotide sequence shown in 6, 7, 9, 10 or 12.

【0051】 さらに別の好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:1 [0051] In yet another preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: 1
、3、4、6、7、9、10もしくは12に示すヌクレオチド配列の全長またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80 , At least about 60% in a part of either the full length or these nucleotide sequences of a nucleotide sequence shown in 3,4,6,7,9,10 or 12, 65%, 70%, 75%, 80
%、83%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %, 83%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95
%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列を含んでなる。 %, Composed of 96%, 97%, 98%, comprises a nucleotide sequence that is 99% or more homologous.

【0052】 さらに、本発明の核酸分子は、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の核酸配列の一部のみ、例えばプローブもしくはプライマーとして用いることができるフラグメントまたはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の一部、例えばhVR-1、 [0052] Further, the nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or part of the nucleic acid sequence of 12 alone, fragment or hVR that can be used for example as a probe or primer -1, a portion of the hVR-2 and RVR-2 protein, e.g., hVR-1,
hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分をコードするフラグメントを含んでなることができる。 Portion of the hVR-2 and RVR-2 protein in biologically active can comprise a fragment encoding. hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列により、他のhVR-1、hVR-2及びrVR-2ファミリーメンバー並びに他の種からのhVR-1、hVR-2及びrVR-2相同物の同定及び/またはクローニングにおける使用のために設計されるプローブ及びプライマーを作製することができる。 hVR-1, hVR-2 and the nucleotide sequence determined from the cloning of the RVR-2 gene, hVR-1, hVR-2 from other hVR-1, hVR-2 and RVR-2 family members, as well as other species and it can be manufactured probes and primers designed for use in identifying and / or cloning of the RVR-2 homologue. 該プローブ/プライマーは、典型的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。 The probe / primer typically comprises substantially purified oligonucleotide. 該オリゴヌクレオチドは、典型的に、配列番号:1、 The oligonucleotides, typically, SEQ ID NO: 1,
3、4、6、7、9、10もしくは12のセンス配列の、または配列番号:1、3、4、6、7 The sense sequence of 3,4,6,7,9,10 or 12, or SEQ ID NO: 1,3,4,6,7
、9、10もしくは12のアンチセンス配列の、または配列番号:1、3、4、6、7、9、 , Of the antisense sequence of 9, 10 or 12, or SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,
10もしくは12の天然に存在する対立遺伝子変異体もしくは突然変異体の少なくとも約12または15個、好ましくは約20または25個、より好ましくは約30、35、40、45 At least about 12 or 15 10 or present in the 12 naturally occurring allelic variant or mutant, preferably about 20 or 25, more preferably about 30, 35, 40, 45
、50、55、60、65、75または100個の連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含んでなる。 Comprises a region of nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to 50,55,60,65,75 or 100 contiguous nucleotides. 典型的態様として、本発明の核酸分子は、100-150、150-200、200-250、250-300、300-35 Typical embodiments, the nucleic acid molecule of the present invention, 100-150,150-200,200-250,250-300,300-35
0、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-75 0,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650,650-700,700-75
0、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1088またはそれ以上より大きいヌクレオチドの長さでありそして配列番号:1、3、4、6、7、9、10または1 Of 0,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1088 or more larger nucleotides in length and SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9, 10 or 1
2の核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる。 Comprising hybridizing nucleotide sequence under stringent hybridization conditions to a second nucleic acid molecule.

【0053】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写産物またはゲノム配列を検出するために用いることができる。 [0053] hVR-1, hVR-2 and probes based on the RVR-2 nucleotide sequences can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding the same or homologous proteins. 好ましい態様として、プローブはそれに結合した標識基をさらに含んでなり、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であることができる。 In a preferred embodiment, the probe further comprises a label group attached thereto, for example, can be labeled groups radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzyme cofactor. そのようなプローブは、被験体からの細胞のサンプルにおいてhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸のレベルを測定すること、例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAレベルを検出することまたはゲノムのhVR-1、h Such probes, measuring the level of a nucleic acid encoding the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 in a sample of cells from a subject, for example, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA levels it detects the or genomic hVR-1, h
VR-2及びrVR-2遺伝子が突然変異しているかもしくは欠失しているかどうかを決定することによるような、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いることができる。 VR-2 and RVR-2 gene, such as by determining whether the deleted to or deleted are mutated, identify cells or tissues expressing mis hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein it can be used as part of a diagnostic test kit for.

【0054】 「hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分」をコードする核酸フラグメントは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2生物学的活性(hVR-1、hVR-2及びr [0054] A nucleic acid fragment encoding a "hVR-1, biologically active portion of a hVR-2 and RVR-2 protein", hVR-1, hVR-2 and RVR-2 biological activity (HVR 1, hVR-2 and r
VR-2タンパク質の生物学的活性は本明細書において記述されている)を有するポリペプチドをコードする配列番号: 1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列の部分を単離し、(例えばインビトロでの組換え発現により)hVR-1、hVR VR-2 biological activity of the protein SEQ ID NO: encodes a polypeptide having have) been described herein: a moiety of 1,3,4,6,7,9,10 or 12 nucleotide sequence isolated, (e.g., by recombinant expression in vitro) hVR-1, hVR
-2及びrVR-2タンパク質の該コード部分を発現させ、そしてhVR-1、hVR-2及びrVR 2 and to express the coding portion of the RVR-2 protein, and hVR-1, hVR-2 and RVR
-2タンパク質の該コード部分の活性を評価することにより調製することができる。 It can be prepared by assessing the 2 activity of the coding portion of the protein.

【0055】 本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のために配列番号: 1、3、4、6、7、9、10または12に示すヌクレオチド配列と異なり、従って、配列番号: 1、3、4、6、7、9 [0055] The present invention further relates SEQ ID NO due to the degeneracy of the genetic code: Unlike 1,3,4,6,7,9,10 or nucleotide sequence shown in 12, therefore, SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9
、10または12に示すヌクレオチド配列によりコードされるものと同じhVR-1、hVR The same hVR-1 as that encoded by the nucleotide sequence shown in 10 or 12, hVR
-2及びrVR-2タンパク質をコードする核酸分子を包含する。 It encompasses nucleic acid molecules encoding the -2 and RVR-2 protein. 別の態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:2、5、8または11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。 In another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention, SEQ ID NO: having a nucleotide sequence encoding a protein having the amino acid sequence shown in 2, 5, 8 or 11.

【0056】 配列番号: 1、3、4、6、7、9、10または12に示すhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列に加えて、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすDNA配列多型が集団(例えばヒト集団)内に存在する可能性があることを当業者は認識する。 [0056] SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or in addition to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequence shown in 12, hVR-1, hVR-2 and rVR- those skilled in the art that DNA sequence polymorphisms that lead to changes in the amino acid sequence of 2 protein may exist within a population (e.g., the human population) recognizes. hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子におけるそのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異のために集団内の個体間に存在する可能性がある。 hVR-1, such genetic polymorphism in hVR-2 and RVR-2 genes may exist among individuals within a population due to natural allelic variation. 本明細書において用いる場合、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、好ましくは哺乳類のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさし、さらに非コーディング調節配列及びイントロンを含むことができる。 As used herein, the term "gene" and "recombinant gene", hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, preferably of mammalian hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein refers to nucleic acid molecules comprising an open reading frame encoding may further include a non-coding regulatory sequences and introns.

【0057】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2の対立遺伝子変異体には、機能性および非機能性の両方のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質が包含される。 [0057] The hVR-1, hVR-2 and allelic variants of RVR-2, functionality and both nonfunctional hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, and the like. 機能性対立遺伝子変異体は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2リガンドに結合する能力及び/または痛みシグナリング機構を調節する能力を維持するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変異体である。 Functional allelic variants, of hVR-1, hVR-2 and hVR-1 maintains the ability and / or the ability to modulate pain signaling mechanisms that bind to RVR-2 ligand, hVR-2 and RVR-2 protein is an amino acid sequence variants that exist in nature. 機能性対立遺伝子変異体は、典型的に、配列番号:2、5、8もしくは11の1個もしくはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみまたはタンパク質の重要でない領域中の重要でない残基の置換、欠失もしくは挿入を含有する。 Functional allelic variants typically, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 wherein one or insignificant substituted residues more in conservative substitutions not only or importance of the protein region of amino acids, It contains a deletion or insertion.

【0058】 非機能性対立遺伝子変異体は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2リガンドに結合する能力及び/または痛みシグナリング機構を調節する能力をもたないhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変異体である。 [0058] Non-functional allelic variants, hVR-1, hVR-2 and do not have the ability to modulate the ability to bind to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 ligand and / or pain signaling mechanisms an amino acid sequence naturally occurring variants of RVR-2 protein. 非機能性対立遺伝子変異体は、典型的に、配列番号:2、5、8もしくは11のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失もしくは挿入もしくは未熟末端切断(premature truncation)または重要な残基もしくは重要な領域における置換、挿入もしくは欠失を含有する。 Nonfunctional allelic variants will typically SEQ ID NO: non-conservative substitutions of the amino acid sequence of 2, 5, 8 or 11, deletions or insertions or premature truncations (premature truncation) or critical residues or substitutions in critical areas, containing insertions or deletions.

【0059】 本発明はさらに、hVR-2及びrVR-2タンパク質の非ヒトオーソロガスを提供する。 [0059] The present invention further provides a non-human orthologous the hVR-2 and RVR-2 protein. hVR-2及びrVR-2タンパク質のオーソロガスは、非ヒト及び非ラット生物体から単離され且つhVR-2及びrVR-2タンパク質と同じhVR-2及びrVR-2リガンド結合及び/または痛みシグナリング機構の調節能力を保有するタンパク質である。 The hVR-2 and RVR-2 protein orthologs, non-human and non-rat is from an organism isolated and hVR-2 and RVR-2 protein identical to hVR-2 and RVR-2 ligand binding and / or pain signaling mechanisms a protein that possesses the ability to regulate. hVR-2 hVR-2
及びrVR-2タンパク質のオーソロガスは、配列番号:4、6、8または10に実質的に相同なアミノ酸配列を含んでなると容易に同定することができる。 And orthologous the RVR-2 protein, SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10 comprising an amino acid sequence substantially homologous to be able to readily identify.

【0060】 さらに、他のhVR-1、hVR-2及びrVR-2ファミリーメンバーをコードし、従って、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12のhVR-1、hVR-2及びrVR-2配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であるものとする。 [0060] Further, by encoding other hVR-1, hVR-2 and RVR-2 family members, therefore, SEQ ID NO: of 1,3,4,6,7,9,10 or 12 hVR-1, hVR which have a nucleotide sequence which differs from the -2 and RVR-2 sequences are intended to be within the scope of the present invention. 例えば、別のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAをhVR-1、hVR-2及びrVR-2のヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。 For example, it can be identified based on another hVR-1, hVR-2 and RVR-2 cDNA to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequences. さらに、異なる種からのVR-2タンパク質をコードし、従って、配列番号: 4、6、8または10のhVR-2及びrVR-2配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であるものとする。 Furthermore, different encoding the VR-2 proteins from seeds, therefore, SEQ ID NO: 4, 6, 8, or nucleic acid molecules with different nucleotide sequences hVR-2 and RVR-2 sequence of 10, within the scope of the present invention and those which are.
例えば、マウスhVR-2 cDNAをヒトVR-2(hVR-2)またはラットVR-2(rVR-2)のヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。 For example, a mouse hVR-2 cDNA can be identified based on the nucleotide sequence of the human VR-2 (hVR-2) or rat VR-2 (rVR-2).

【0061】 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAの天然の対立遺伝子変異体及び相同物に相当する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして本明細書に開示するcDNAまたはその一部を用いて本明細書に開示するhVR-1、h [0061] Nucleic acid molecules corresponding to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 natural allelic variants and homologues of the cDNA of the present invention, according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions as a hybridization probe using cDNA or portion thereof as disclosed herein as disclosed herein hVR-1, h
VR-2及びrVR-2核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。 It can be isolated based on their homology to VR-2 and RVR-2 nucleic acid.
さらに、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAの天然の対立遺伝子変異体及び相同物に相当する核酸分子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 遺伝子と同じ染色体または遺伝座へのマッピングにより単離することができる。 Furthermore, nucleic acid molecules corresponding to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 natural allelic variants and homologues of the cDNA of the present invention, hVR-1, the same chromosome as the hVR-2 and RVR-2 gene or it can be isolated by mapping to the genetic locus.

【0062】 従って、別の態様として、本発明の単離された核酸分子は少なくとも15、20、 [0062] Thus, in another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention is at least 15, 20,
25、30またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、そして配列番号:1、3、4、 Of 25, 30 or more nucleotides in length, and SEQ ID NO: 1, 3, 4,
6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。 A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence of 6, 7, 9, 10 or 12 hybridizing under stringent conditions. 別の態様として、核酸は少なくとも30、50 In another embodiment, the nucleic acid is at least 30, 50
、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 , 100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,
800、850、900または950ヌクレオチドの長さである。 Of 800,850,900 or 950 nucleotides in length. 本明細書において用いる場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、相互に少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列が典型的に相互にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表すものとする。 As used herein, the term "hybridizes under stringent conditions" is hybridization and washing conditions remain mutually nucleotide sequence at least 60% identical was typically hybridize to each other It is intended to refer to. 好ましくは、該条件は、相互に少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約85%または90%同一である配列が典型的に相互にハイブリダイズしたままであるようにである。 Preferably, the conditions are mutually at least about 70%, more preferably at least about 80%, as even more preferably remains at least about 85%, or sequences 90% identical was typically hybridize to each other it is on. そのようなストリンジェントな条件は当業者に既知であり、そしてCurrent Protocols in Molecular Biology, Such stringent conditions are known to those skilled in the art, and Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。 John Wiley & Sons, NY (1989), can be found in 6.3.1-6.3.6. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい限定しない例は、約45℃で Examples to preferred limitation of stringent hybridization conditions, at about 45 ° C.
6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション及びそれに続く50℃で、好ましくは55℃で、より好ましくは60℃で、さらにより好ましくは65℃で0.2 X SSC、0.1% SDS中での1回またはそれ以上の洗浄である。 Hybridization and 50 ° C. followed by the in 6X sodium chloride / sodium citrate (SSC), preferably at 55 ° C., and more preferably at 60 ° C., even more preferably 0.2 X SSC at 65 ° C., in 0.1% SDS is one or more washes with.
好ましくは、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。 Preferably, SEQ ID NO: An isolated nucleic acid molecule of the present invention arranged in the 1,3,4,6,7,9,10 or 12 hybridizing under stringent conditions, nucleic acids present in the native molecule It corresponds to. 本明細書において用いる場合、「天然に存在する」核酸分子は、現実に存在する(例えば天然のタンパク質をコードする)ヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子をさす。 As used herein, a "naturally-occurring" nucleic acid molecule is actually present (eg, encodes a natural protein) refers to an RNA or DNA molecule having a nucleotide sequence.

【0063】 集団中に存在する可能性があるhVR-1、hVR-2及びrVR-2配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、さらに、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12 [0063] In addition to the allelic variants present in the native hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequence may be present in the population, further SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10 or 12
のヌクレオチド配列中に突然変異により変異を導入し、それによりhVR-1、hVR-2 Mutations by introducing a mutation into the nucleotide sequence, thereby hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質の機能性能を変えずに、コードされるhVR-1、hVR-2及びrVR And without changing the function performance of RVR-2 protein, encoded hVR-1, hVR-2 and RVR
-2タンパク質のアミノ酸配列の変異をもたらすことができることを当業者は認識する。 Those skilled in the art that can result in 2 mutant of the amino acid sequence of the protein is recognized. 例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の配列において実施することができる。 For example, "non-essential" amino acid residues nucleotide substitutions leading to amino acid substitutions sequence ID NO: can be carried out in 1,3,4,6,7,9,10 or array of 12. 「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えずにhVR-1、hVR-2及び "Non-essential" amino acid residue, hVR-1, hVR-2 and without changing the biological activity
rVR-2の野生型配列(例えば、配列番号:2、5、8または11の配列)から改変することができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性のために必要とされる。 Wild-type sequence of RVR-2 (e.g., SEQ ID NO: 2, 5, 8 or SEQ 11) is a residue that can be altered from, whereas an "essential" amino acid residue for biological activity Needed. 例えば、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は、特に容易に改変できないと予測される。 For example, amino acid residues that are conserved among the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein of the present invention are not expected to be particularly easily modified. さらに、本発明の In addition, according to the present invention
hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質とカプサイシン/バニロイド受容体ファミリーの他のメンバー間で保存されるさらなるアミノ酸残基は、容易に改変できないと思われる。 hVR-1, additional amino acid residues that are conserved among other members of the hVR-2 and RVR-2 protein and capsaicin / vanilloid receptor family is likely to not be easily modified.

【0064】 従って、本発明の別の態様は、活性のために必須でないアミノ酸残基における変異を含有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする核酸分子に関する。 [0064] Accordingly, another aspect of the invention pertains to nucleic acid molecules encoding hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein contains a mutation in the amino acid residues that are not essential for activity. そのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、配列番号:2、5、8または1 Such hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 1
1とアミノ酸配列が異なるが、それでもなお生物学的活性を保持する。 1 and amino acid sequence differ and still retain biological activity. 一つの態様として、単離された核酸分子は、配列番号:2、5、8または11に少なくとも約60 In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule SEQ ID NO: 2, 5, 8, or at least about 60 to 11
%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、95%、98%またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。 %, 65%, 70%, comprising 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 95%, comprising the nucleotide sequence encoding a protein comprising 98% or more homologous to the amino acid sequence.

【0065】 配列番号:2、5、8または11のタンパク質に相同なhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質中に1個またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、配列番号:1 [0065] SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 isolated nucleic acid molecule protein encoding homologous hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein is one in the encoded protein or more amino acid substitutions, as additions or deletions are introduced, SEQ ID NO: 1
、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列中に1個またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製することができる。 It can be prepared by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into the nucleotide sequence of 3,4,6,7,9,10 or 12.
突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びPCRによりもたらされる突然変異誘発のような標準的な技術により、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12中に導入することができる。 Mutations, by standard techniques, such as mutagenesis caused by site-directed mutagenesis and PCR, SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or be introduced into a 12 can. 好ましくは、保存的アミノ酸置換を1個またはそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基で実施する。 Preferably, to implement the conservative amino acid substitutions at one or more predicted non-essential amino acid residues. 「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。 "Conservative amino acid substitution" is one in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. 同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。 Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art.
これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、荷電していない極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が包含される。 These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine , cysteine), nonpolar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, an amino acid with histidine) are included. 従って、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。 Therefore, non-essential amino acid residues predicted to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein is preferably replaced with another amino acid residue from the same side chain family. あるいはまた、別の態様として、突然変異は、飽和突然変異誘発によるように、hVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、そして得られた突然変異体をhVR-1、hVR-2及びrV Alternatively, in another embodiment, mutations, such as by saturation mutagenesis, can be introduced randomly along all or part of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 coding sequence, and the resulting mutant hVR-1, hVR-2 and rV
R-2生物学的活性に関してスクリーニングして活性を保持する突然変異体を同定することができる。 Screened for R-2 biological activity can be identified mutants that retain activity. 配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12の突然変異誘発後。 SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or 12 mutagenesis later.

【0066】 ある態様として、突然変異体hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、(1)非h [0066] As an embodiment, mutant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein is (1) non-h
VR-1、非hVR-2もしくは非rVR-2タンパク質分子、例えばカプサイシンのようなバニロイド化合物と相互作用する能力;(2)細胞内カルシウム濃度を調節する能力;(3)hVR-1、hVR-2及びrVR-2依存性シグナル伝達経路を活性化する能力; VR-1, non-hVR-2 or non-RVR-2 protein molecule, for example, the ability to interact with vanilloid compounds such as capsaicin; the ability to modulate (2) Intracellular Calcium Concentration; (3) hVR-1, hVR- ability to activate 2 and RVR-2 dependent signaling pathway;
または(4)痛みシグナリング機構を調節する能力に関してアッセイすることができる。 Or (4) can be assayed for the ability to modulate pain signaling mechanisms.

【0067】 上記のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、それらにアンチセンスである単離された核酸分子に関する。 [0067] In addition to the nucleic acid molecule encoding the above hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, another aspect of the present invention relates to isolated nucleic acid molecules are those antisense.
「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、 "Antisense" nucleic acid is, in a "sense" nucleic acid encoding a protein complementary,
例えば二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的なまたはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。 For example comprising a nucleotide sequence complementary to the complementary or mRNA sequence to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule. 従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。 Accordingly, an antisense nucleic acid can hydrogen bond to a sense nucleic acid. アンチセンス核酸は、全hVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング鎖にまたはその一部のみに相補的であることができる。 Antisense nucleic acid can all hVR-1, a hVR-2 and RVR-2 coding strand, or only to the complementary portion thereof. 一つの態様として、アンチセンス核酸分子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」にアンチセンスである。 In one embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a "coding region" of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域をさす(例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2のコーディング領域)。 The term "coding region" refers to regions of a nucleotide sequence comprising codons which are translated into amino acid residues (e.g., hVR-1, the coding region of the hVR-2 and RVR-2). 別の態様として、アンチセンス核酸分子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。 In another embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a "noncoding region" of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する5'及び3'配列をさす(すなわち、5'及び3'非翻訳領域とも呼ばれる)。 The term "noncoding region" refers to 5 'and 3' sequences which flank the coding region that are not translated into amino acids (i.e., also referred to as 5 'and 3' untranslated regions).

【0068】 本明細書に開示するhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードするコーディング鎖配列が与えられれば、ワトソン・クリック塩基対合の規則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計することができる。 [0068] Given the coding strand sequences encoding hVR-1, hVR-2 and RVR-2 disclosed herein, to design an antisense nucleic acid of the present invention according to the rules of Watson-Crick base pairing can. アンチセンス核酸分子は、hVR-1、hVR-2及び The antisense nucleic acid molecule, hVR-1, hVR-2 and
rVR-2 mRNAの全コーディング領域に相補的であることができるが、より好ましくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAのコーディングまたは非コーディング領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。 Can the entire coding region of the RVR-2 mRNA is complementary, and more preferably is antisense to only a portion of the coding or noncoding region of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA oligonucleotide it is. 例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であることができる。 For example, the antisense oligonucleotide can be complementary to the region surrounding the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA translation start site. アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、 An antisense oligonucleotide can be, for example,
約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドの長さであることができる。 About 5,10,15,20,25,30,35,40,45 or 50 nucleotides may be long. 本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において既知の方法を用いて化学合成及び酵素連結反応を使用して構築することができる。 The antisense nucleic acids of the present invention can be constructed using chemical synthesis and enzymatic ligation reactions using methods known in the art. 例えば、アンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増すようにもしくはアンチセンスとセンス核酸間で形成される二重鎖の物理的安定性を増すように設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを用いることができる。 For example, an antisense nucleic acid (e.g., antisense oligonucleotide), physical stability of the duplex formed between the or antisense and sense nucleic acid so as to increase the biological stability of the nucleotide or molecule naturally occurring can be chemically synthesized using various modified nucleotides designed to increase, for example, it can be used phosphorothioate derivatives and acridine substituted nucleotides. アンチセンス核酸を作製するために用いることができる改変されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5 Examples of modified nucleotides can be used to produce an antisense nucleic acid, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chloro-uracil, 5-iodo uracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxymethyl hydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethyl-aminomethyl-2-thiouridine, 5
-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1 - carboxymethyl-methylaminomethyl uracil, dihydrouracil, beta-D-galactosyl queue Oh thin, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1
-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5 - methyl inosine, 2,2-dimethyl guanine, 2-methyl-adenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5
-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D - methylaminomethyl uracil, 5-methoxy aminomethyl-2-thiouracil, beta-D
-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、 - mannosyl queue Oh thin, 5'-methoxy carboxymethyl uracil, 5-methoxy uracil, 2-methylthio -N6- isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wybutoxosine, pseudouracil, queosine, 2-thiocytosine, 5 methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyl uracil, uracil-5-oxyacetic acid methylester, uracil-5-oxyacetic acid (v),
5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w及び2,6-ジアミノプリンが包含される。 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino -3-N-2-carboxypropyl) uracil, is (acp3) w and 2,6-diaminopurine is embraced. あるいはまた、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きにサブクローン化されている発現ベクターを用いて生物学的に製造することができる(すなわち、挿入した核酸から転写されるRNAは、目的の標的核酸にアンチセンスの向きのものである、以下の小節においてさらに記述する)。 Alternatively, antisense nucleic acid, the nucleic acid can be produced biologically using an expression vector that has been subcloned in an antisense orientation (i.e., RNA transcribed from the inserted nucleic acid will of interest those to the target nucleic acid antisense orientation, further described in the following subsections).

【0069】 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、それらがhVR-1、hVR-2及びrVR- [0069] The antisense nucleic acid molecules of the present invention typically they hVR-1, hVR-2 and rVR-
2タンパク質をコードする細胞mRNA及び/またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたは結合してそれにより例えば転写及び/または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害するように被験体に投与されるかまたはインサイチューで作製される。 2 protein and or binding hybridizes with cellular mRNA and / or genomic DNA encoding or are administered to the subject so as to inhibit expression of the protein by inhibiting whereby e.g. transcription and / or translation It is produced in situ. ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によるか、または例えばDNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によることができる。 Hybridization, in the case of normal or by nucleotide complementarity, or, for example which binds to DNA duplexes antisense nucleic acid molecules to form a stable duplex, specific cross in the major groove of the double helix it is possible by the action. 本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接注入が包含される。 Examples of routes of administration of antisense nucleic acid molecules of the present invention, direct injection is included at a tissue site. あるいはまた、アンチセンス核酸分子を選択した細胞を標的とするように改変し、次に全身的に投与することができる。 Alternatively, the cell of choice antisense nucleic acid molecules modified to target, can then be administered systemically. 例えば、全身投与のために、アンチセンス核酸分子は、例えば細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択した細胞表面上に発現される受容体または抗原にそれらが特異的に結合するように改変することができる。 For example, for systemic administration, antisense nucleic acid molecules, for example, by linking the antisense nucleic acid molecules to peptides or antibodies which bind to cell surface receptors or antigens, receptors are expressed on a selected cell surface, or they antigen can be modified to specifically bind. アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記述するベクターを用いて細胞に送達することもできる。 The antisense nucleic acid molecule can also be delivered to cells using the described vectors herein. アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。 To achieve sufficient intracellular concentrations of the antisense molecules, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is placed under the control of a strong pol II or pol III promoter are preferred.

【0070】 さらに別の態様として、本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子である。 [0070] In yet another embodiment, the antisense nucleic acid molecule of the present invention is α- anomeric nucleic acid molecule. α-アノマー核酸分子は相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、その場合、通常のβ-ユニットとは異なり、それらの鎖は相互に平行に伸びる(Gaultier et al.(1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641)。 α- anomeric nucleic acid molecule forms complementary RNA specific double-stranded hybrids, in which case, contrary to the usual β- units, their chains extending parallel to each other (Gaultier et al. (1987) Nucleic .. Acids Res 15: 6625-6641). アンチセンス核酸分子はまた、2'- o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.(1987) Nucl The antisense nucleic acid molecule can also comprise, 2'o-methyl ribonucleotides (Inoue et al. (1987) Nucl
eic Acids Res. 15:6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al.(1987 eic Acids Res 15:.. 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analogues (Inoue et al (1987
) FEBS Lett.215:327-330)を含んでなることもできる。 ) FEBS Lett.215: 327-330) may also comprise.

【0071】 さらに別の態様として、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。 [0071] In yet another embodiment, the antisense nucleic acids of the present invention is a ribozyme. リボザイムは、それらが相補的領域を有するmRNAのような一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。 Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity which are capable of cleaving a single-stranded nucleic acid, such as an mRNA, to which they have a complementary region. 従って、hVR-1、hV Therefore, hVR-1, hV
R-2及びrVR-2 mRNA転写産物を触媒的に切断してそれによりhVR-1、hVR-2及びrVR Thereby cutting the R-2 and RVR-2 mRNA transcripts catalytically hVR-1, hVR-2 and RVR
-2 mRNAの翻訳を阻害するためにリボザイム(例えばハンマーヘッド型リボザイム(Haselhoff及びGerlach (1988) Nature 334:585-591に記述される))を用いることができる。 Ribozymes to inhibit -2 mRNA translation (eg hammerhead ribozymes (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591 described in)) can be used. hVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示するhVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAのヌクレオチド配列(すなわち、配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12)に基づいて設計することができる。 hVR-1, hVR-2 and A ribozyme having specificity for a nucleic acid encoding a RVR-2 is, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 cDNA nucleotide sequence disclosed herein (i.e., SEQ ID NO: can be designed based on 1,3,4,6,7,9,10 or 12). 例えば、活性部位のヌクレオチド配列がhVR-1、hVR-2及びrVR-2 For example, the nucleotide sequence of the active site is hVR-1, hVR-2 and RVR-2
をコードするmRNAにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナ(Tetrahymena)L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。 It can be constructed a derivative of Tetrahymena (Tetrahymena) L-19 IVS RNA which is complementary to the nucleotide sequence to be cleaved in mRNA encoding. 例えば、Cec For example, Cec
h et al. 米国特許第4,987,071号;及びCech et al. 米国特許第5,116,742号を参照。 See and Cech et al U.S. Pat. No. 5,116,742;. H et al U.S. Pat. No. 4,987,071.. あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAを用いてRNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することができる。 Alternatively, it is possible to select a catalytic RNA having a specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules using hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA. 例えば、Bartel, D.及びSzostak, JW (1993) Sience 261:1411-1418を参照。 For example, Bartel, D. and Szostak, JW (1993) Sience 261: see 1411-1418.

【0072】 あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子発現は、標的細胞におけるhVR-1 [0072] Alternatively, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene expression, hVR-1 in the target cell
、hVR-2及びrVR-2遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するようにhVR-1 , So as to form triple helical structures that prevent transcription of the hVR-2 and RVR-2 gene hVR-1
、hVR-2及びrVR-2の調節領域(例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2プロモーター及び/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることにより阻害することができる。 It can be inhibited by targeting nucleotide sequences complementary to the regulatory region of the hVR-2 and RVR-2 (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 promoter and / or enhancer). 一般に、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): . In general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des 6 (6):
569-84; Helene, C. et al.(1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:27-36;及びMaher 569-84; Helene, C. et al (1992) Ann NY Acad Sci 660:.... 27-36; and Maher
, LJ (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照。 , LJ (1992) Bioassays 14 (12): see 807-15.

【0073】 さらに別の態様として、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善するために塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンで改変することができる。 [0073] In yet another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecules of the present invention, for example, the base moiety in order to improve the stability, hybridization, or solubility of the molecule, a sugar moiety, or phosphate it can be modified in the backbone. 例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンを改変してペプチド核酸を作製することができる(Hyrup B. et al.(1996) Bioorganic & Medicinal.. Chemistry 4(1): . For example, it is possible to generate peptide nucleic acids by modifying the deoxyribose phosphate backbone of the nucleic acid molecule (Hyrup B. et al (1996) Bioorganic & Medicinal .. Chemistry 4 (1):
5-23を参照)。 See 5-23). 本明細書において用いる場合、「ペプチド核酸」または「PNA」 As used herein, "peptide nucleic acid" or "PNA"
という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンがプソイドペプチドバックボーンで置換され、4種の天然のヌクレオ塩基(nucleobase)のみが保持される核酸模倣物、例えばDNA模倣物をさす。 Term, the deoxyribose phosphate backbone is replaced by a pseudopeptide backbone refers four natural nucleic acid mimic only nucleobase (nucleobases) is held in, for example, a DNA mimic that. PNAの中性バックボーンは、低イオン強度の条件下でDNA及びRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを与えることが示されている。 PNA neutral backbone has been shown to provide specific hybridization to DNA and RNA under conditions of low ionic strength. PNAオリゴマーの合成は、Hyrup B. et al.(1996)上記; Perry-O'Keefe The synthesis of PNA oligomers, Hyrup B. et al (1996) above;. Perry-O'Keefe
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:14670-675に記述されているような標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施することができる。 ..... Et al Proc Natl Acad Sci 93: can be carried out using standard solid phase peptide synthesis protocols as described in 14670-675.

【0074】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子のPNAは、治療および診断用途に用いることができる。 [0074] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 PNA nucleic acid molecules can be used in therapeutic and diagnostic applications. 例えば、PNAは、例えば、転写もしくは翻訳停止を引き起こすかまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗原因子として用いることができる。 For example, PNA, for example, by inhibiting or replication cause transcription or translation termination, it can be used as antisense or antigen factors for sequence-specific modulation of gene expression. hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子のP hVR-1, hVR-2 and RVR-2 P nucleic acid molecule
NAはまた、遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析において(例えば、PNAにより導かれるPCRクランプ固定(PNA-directed PCR clamping)による);他の酵素( NA also in the analysis of single base pair mutations in a gene (e.g., by PCR clamping derived by PNA (PNA-directed PCR clamping)); other enzymes (
例えばS1ヌクレアーゼ(Hyrup B. (1996)上記)と組み合わせて用いる場合に「 For example, "when used in combination with S1 nuclease (Hyrup B. (1996) supra)
人工制限酵素」として;またはDNAシークエンシングもしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(Hyrup B. et al. (1996)上記; Perry-O' Keefe上記)用いることもできる。 As artificial restriction enzymes "; or as probes or primers for DNA sequencing or hybridization (Hyrup B. et al (1996) above;. Perry-O 'Keefe above) can be used.

【0075】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2のPNAは、(例えばそれらの安定性または細胞の取り込みを高めるために)、親油性もしくは他のヘルパー基をPNAに結合することにより、PNA-DNAキメラの形成により、またはリポソームもしくは当該技術分野において既知である薬物送達の他の技術の使用により改変することができる。 [0075] As another embodiment, PNA of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 is (for example, to enhance the uptake of their stability or cellular), coupling a lipophilic or other helper groups to PNA by, it can be modified by the use of other techniques by the formation of PNA-DNA chimeras, or liposomes or drug delivery known in the art. 例えば、PNAとDNAの有益な特性を組み合わせることができるhVR-1、h For example, hVR-1 can be combined beneficial properties of PNA and DNA, h
VR-2及びrVR-2核酸分子のPNA-DNAキメラを作製することができる。 It can be manufactured PNA-DNA chimeras of VR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule. そのようなキメラは、DNA認識酵素(例えば、RNアーゼ H及びDNAポリメラーゼ)をDNA部分と相互作用させ、一方、PNA部分は高い結合親和性及び特異性を与える。 Such chimeras, DNA recognition enzymes (e.g., RN ase H and DNA polymerase) was interact with the DNA portion while, PNA portion provides high binding affinity and specificity. PNA-DNAキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合の数及び向きに関して選択された適当な長さのリンカーを用いて連結することができる(Hyrup B. (1996)上記)。 PNA-DNA chimeras, base stacking, can be attached using an appropriate length of linker that is selected with respect to the number and orientation of the bonds between nucleobases (Hyrup B. (1996) supra). PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup B. (1996)上記及びFinn PJ et al.(19 The synthesis of PNA-DNA chimeras, Hyrup B. (1996) supra and Finn PJ et al. (19
96) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記述されているように実施することができる。 96) Nucleic Acids Res 24 (17):. 3357-63 can be carried out as described in. 例えば、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いてDNA For example, DNA using standard phosphoramidite coupling chemistry
鎖を固体支持体上に合成することができ、そして改変されたヌクレオシド類似体、例えば5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ−チミジンホスホルアミダイトをPNAとDNAの5'末端の間として用いることができる(Mag, M. et al Chain can be synthesized on a solid support and modified nucleoside analogs, e.g., 5 '- (4-methoxytrityl) amino-5'-deoxy - thymidine phosphoramidite PNA and DNA 5' end can be used as a between the (Mag, M. et al
.(1989) Nucleic Acid Res. 17:5973-88)。 . (1989) Nucleic Acid Res 17:. 5973-88). 次に、PNAモノマーを段階的に連結して5' PNAセグメント及び3' DNAセグメントを有するキメラ分子を生成せしめる(Finn PJ et al.(1996)上記)。 Then stepwise coupling of PNA monomers 5 'PNA segment and a 3' allowed to produce a chimeric molecule with a DNA segment (Finn PJ et al. (1996) supra). あるいはまた、5' DNAセグメント及び3 Alternatively, 5 'DNA segment and 3
' PNAセグメントを有するキメラ分子を合成することができる(Peterser, K. H 'Can be synthesized a chimeric molecule with a PNA segment (Peterser, K. H
. et al.(1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)。 ..... Et al (1975) Bioorganic Med Chem Lett 5: 1119-11124).

【0076】 別の態様として、オリゴヌクレオチドは(例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするための)ペプチドのような他の付加された基または細胞膜(例えば、Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemai [0076] As another embodiment, the oligonucleotide (e.g., for targeting host cell receptors in vivo) other appended groups or cell membranes, such as peptides (e.g., Letsinger et al. (1989) Proc .... Natl Acad Sci USA 86: 6553-6556; Lemai
tre et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT公開第WO88/09 ..... Tre et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 648-652; PCT Publication No. WO88 / 09
810号を参照)もしくは血液-脳関門(例えばPCT公開第WO89/10134号を参照)を横切る輸送を容易にする因子を含むことができる。 810 See No.) or blood - may include an agent that facilitates transport across the brain barrier (see, e.g., PCT Publication No. WO89 / 10134). さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤(例えば、Krol et al.(19 Furthermore, the oligonucleotide cleavage agent induced by hybridization (e.g., Krol et al. (19
88) Bio-Techniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon (1988) Pha 88) Bio-Techniques 6: 958-976 See) or intercalating agents (e.g., Zon (1988) Pha
rm. Res. 5:539-549を参照)で改変することができる。 .. Rm Res 5: 539-549 can be modified in the reference). この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションにより誘発される架橋剤、輸送因子またはハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤)に結合させることができる。 For this purpose, the molecular oligonucleotides another (e.g., a peptide, a crosslinking agent which is induced by hybridization-triggered cleavage agents by transporters or hybridization) may be attached to. II. II. 単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質並びに抗-hVR-1、抗-hVR-2及 HVR-1 isolated, hVR-2 and RVR-2 protein and anti -hVR-1, anti -hVR-2及
び抗-rVR-2抗体本発明の一つの態様は、単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質並びにその生物学的に活性の部分並びに抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体を作製するための免疫原としての使用のために適当なポリペプチドフラグメントに関する。 Beauty aspect of the anti -rVR-2 antibodies present invention, hVR-1 was isolated, hVR-2 and part of the RVR-2 protein as well as biologically active and anti -hVR-1, anti -HVR -2 and about appropriate polypeptide fragments for use as immunogens to generate anti -rVR-2 antibody. 一つの態様として、天然のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を標準的なタンパク質精製技術を用いて適当な精製スキームにより細胞または組織源から単離することができる。 In one embodiment, the native hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein can be isolated from cells or tissue sources by an appropriate purification scheme using standard protein purification techniques. 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を組換えD In another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein Recombinant D
NA技術により製造する。 Produced by NA technology. 組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を用いてhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはポリペプチドを化学的に合成することができる。 Alternative to recombinant expression, it is possible to chemically synthesize the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or polypeptide using standard peptide synthesis techniques.

【0077】 「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性の部分は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成する場合には化学的前駆体もしくは他の化学製品を実質的に含まない。 [0077] part of the "isolated" or "purified" protein or biologically active cellular material from hVR-1, hVR-2 and cell or tissue source RVR-2 protein is derived or free of other contaminating proteins substantially or when chemically synthesized will be substantially free of chemical precursors or other chemicals. 「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質が単離されるかまたは組換え的に製造される細胞の細胞成分から該タンパク質が分離されているhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の調製物が包含される。 The term "substantially free of cellular material", the protein is separated from cellular components of the cells from hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein is produced or recombinantly isolated and has hVR-1, preparation of hVR-2 and RVR-2 protein, and the like. 一つの態様として、「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、(乾量により) In one embodiment, the term "substantially free of cellular material" (by dry weight)
約30%未満の非hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質(本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる)、より好ましくは約20%未満の非hVR-1、hVR-2及びrV Less than about 30% non-hVR-1, (also referred to as "contaminating protein" herein) hVR-2 and RVR-2 protein, non-hVR-1 more preferably less than about 20%, hVR-2 and rV
R-2タンパク質、さらにより好ましくは約10%未満の非hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、そして最も好ましくは約5%未満の非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2タンパク質を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の調製物が包含される。 R-2 protein, still more preferably less than about 10% of non-hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and most preferably less than about 5% non-hVR-1,, non hVR-2 and non rVR- hVR-1, preparation of hVR-2 and RVR-2 protein having a 2 proteins are encompassed. hVR hVR
-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合、それは好ましくは培養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の容量の約20%未満、より好ましくは約10%未満、そして最も好ましくは約5%未満に相当する。 -1, when manufacturing parts of the hVR-2 and RVR-2 protein or biologically active recombinantly, it also substantially free Preferably the culture medium, i.e., culture medium of the protein preparation less than about 20% of the volume, more preferably less than about 10%, and most preferably less than about 5%.

【0078】 「化学的前駆体もしくは他の化学製品を実質的に含まない」という用語には、 [0078] The term "substantially free of chemical precursors or other chemicals" is,
hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の合成に含まれる化学的前駆体もしくは他の化学製品から該タンパク質が分離されているhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の調製物が包含される。 hVR-1, hVR-2 and hVR-1 from chemical precursors or other chemicals contained in the synthesis of RVR-2 protein wherein the protein is separated, preparations of hVR-2 and RVR-2 protein It is included. 一つの態様として、「化学的前駆体もしくは他の化学製品を実質的に含まない」という用語には、(乾量により)約30%未満の化学的前駆体もしくは非hVR-1、hVR-2及びrVR-2化学製品、より好ましくは約20%未満の化学的前駆体もしくは非hVR-1、hVR-2及びrVR-2化学製品、さらにより好ましくは約10%未満の化学的前駆体もしくは非hVR-1、hVR-2及びrVR-2化学製品、そして最も好ましくは約5%未満の化学的前駆体もしくは非hVR-1、hVR-2及びrVR-2 In one embodiment, the term "chemical precursors or other chemicals is substantially free of", (by dry weight) chemical precursors of less than about 30% or non-hVR-1, hVR-2 and RVR-2 chemicals, more preferably less than about 20% chemical precursors or non-hVR-1, hVR-2 and RVR-2 chemicals, still more preferably less than about 10% chemical precursors or non hVR-1, hVR-2 and RVR-2 chemicals, and most preferably chemical precursors or non-hVR-1 of less than about 5%, hVR-2 and RVR-2,
化学製品を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の調製物が包含される。 hVR-1, preparation of hVR-2 and RVR-2 proteins with chemicals and the like.

【0079】 本明細書において用いる場合、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の「生物学的に活性の部分」には、それぞれ、hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子と非hVR-1、非hV [0079] As used herein, a "biologically active portions" are the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, respectively, and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule non-hVR-1, non-hV
R-2及び非rVR-2分子間の相互作用に関与するhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子タンパク質のフラグメントが包含される。 Fragments of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule proteins involved in the interaction between R-2 and non-RVR-2 molecule are included. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分には、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号:2、5、8または11に示すアミノ酸配列に十分に相同なまたはそれに由来するアミノ酸配列を含んでなるペプチドが包含され、それらは全長hVR-1、hVR hVR-1, the portion of the hVR-2 and RVR-2 protein in biologically active, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein amino acid sequence, such as SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 peptide comprising the amino acid sequence derived sufficiently homologous or it is included in the amino acid sequence shown in, they full length hVR-1, hVR
-2及びrVR-2タンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてhVR-1、hVR-2及びrVR 2 and includes fewer amino acids than the RVR-2 protein, and hVR-1, hVR-2 and RVR
-2タンパク質の少なくとも1つの活性を示す。 -2 exhibits at least one activity of the protein. 典型的には、生物学的に活性の部分は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の少なくとも1つの活性、例えば、バニロイド化合物、例えばカプサイシンのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2リガンドの結合を有するドメインまたはモチーフを含んでなる。 Typically, biologically active portions, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 at least one activity of the protein, e.g., vanilloid compounds such hVR-1, hVR-2 and such as capsaicin comprising a domain or motif with the binding of RVR-2 ligand. hVR-1、hVR-2及びrVR-2 hVR-1, hVR-2 and rVR-2
タンパク質の生物学的に活性の部分は、例えば10、20、30、40、50、60、70、80 Biologically active portion of a protein, for example, 50, 60, 70, 80
、90、100、200またはそれ以上のアミノ酸の長さであるポリペプチドであることができる。 It can be a polypeptide which is the length of 90,100,200 or more amino acids. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分は、hVR-1 hVR-1, part of the hVR-2 and RVR-2 protein in biologically active, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2によりもたらされる活性、例えば痛みシグナリング機構を調節する作用因子を開発するための標的として用いることができる。 , Activity exerted by hVR-2 and RVR-2, can be used, for example, as targets for developing agents that modulate pain signaling mechanisms.

【0080】 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分は、少なくとも1個の膜貫通ドメイン及び/または少なくとも1個のプロリンに富んだドメイン及び/または少なくとも1個のアンキリンリピートドメインを含んでなる。 [0080] In one embodiment, portions of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in biologically active domain and enriched in at least one transmembrane domain and / or at least one proline / or comprising at least one of the ankyrin repeat domain. 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分は、上に同定した構造ドメインの少なくとも1つを含有することができると理解されるべきである。 hVR-1, part of the hVR-2 and RVR-2 protein in biologically active of the invention should be understood to be able to contain at least one of the structural domains identified above. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のより好ましい生物学的に活性の部分は、上に同定した構造ドメインの少なくとも2つを含有することができる。 More preferred biologically active portion of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein may contain at least two structural domains identified above. さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性の部分を組換え技術により作製し、天然のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の1つまたはそれ以上の機能活性に関して評価することができる。 Moreover, the portion other biologically active in which other regions of the protein are deleted produced by recombinant techniques, native hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein one or more of it can be evaluated for functional activity.

【0081】 ある態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、配列番号:2、5、8または11に示すアミノ酸配列を有する。 [0081] As an embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, SEQ ID NO: having 2, 5, 8 or an amino acid sequence shown in 11. 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 In another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2
タンパク質は、配列番号:2、5、8または11に実質的に相同であり、そして配列番号:2、5、8または11のタンパク質の機能活性を保持するが、上記小節Iにおいて詳細に記述したように、天然の対立遺伝子変異または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。 Protein, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 in a substantially homologous, and SEQ ID NO: 2, 5, 8 or retains the functional activity of the protein of 11, have been described in detail in the above subsection I as such, the amino acid sequence due to natural allelic variation or mutagenesis are different. 従って、別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、配列番号:2、5、8または11に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80% Thus, in another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 to at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%
、85%、87%、90%、95%、98%またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。 , 85%, 87%, 90%, 95%, protein comprising 98% or more homologous to the amino acid sequence.

【0082】 2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性%を決定するために、それらの配列を最適比較目的のために整列させる(例えば、最適整列のために第一及び第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、そして比較目的のために非相同配列を無視することができる)。 [0082] To determine the percent identity of two amino acid sequences or of two nucleic acid sequences are aligned and their sequences for optimal comparison purposes (e.g., a first and a second amino acid or for optimal alignment gaps can be introduced in one or both of the nucleic acid sequence, and can be disregarded homologous sequences for comparison purposes). ある態様として、比較目的のために整列させる照合配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%。 As an embodiment, the length of the matching sequence is aligned for comparison purposes is at least 30% of the length of the reference sequence, preferably at least 40%, more preferably at least 50%. さらにより好ましくは少なくとも60%、そしてさらにより好ましくは少なくとも70%、80 Even more preferably at least 60%, and even more preferably at least 70%, 80
%または90%である(例えば、177アミノ酸残基を有する配列番号:2、5、8または11のhVR-1、hVR-2及びrVR-2アミノ酸配列に第二の配列を整列させる場合、少なくとも80、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも120、さらにより好ましくは少なくとも140、さらにより好ましくは少なくとも150、160または170アミノ酸残基を整列させる)。 % Or 90% (e.g., SEQ ID NO: having 177 amino acid residues: the 2, 5, 8 or 11 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 amino acid sequence when aligning a second sequence, at least 80, preferably at least 100, more preferably at least 120, even more preferably at least 140, even more preferably align at least 150, 160 or 170 amino acid residues). 次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。 Then, comparing the amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions. 第1の配列中のある位置が第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、これらの分子はその位置で同一である(本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同じである)。 If the first sequence a location is occupied by the second corresponding same amino acid residue or nucleotide as the position in the sequence, if these molecules used in the same (herein in its position, an amino acid or nucleic acid "identity" is the same as the amino acid or nucleic acid "homology"). 2つの配列間の同一性%は、2つの配列の最適整列のために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である。 The percent identity between the two sequences, taking into account the length of the number and the gaps of the gap that needs to be introduced for optimal alignment of the two sequences, the number of identical positions shared by the sequences which is a function.

【0083】 2つの配列間の配列の比較及び同一性%の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。 [0083] Determination of the comparison and percent identity of sequences between two sequences can be accomplished using a mathematical algorithm. ある態様として、2つのアミノ酸配列間の同一性%をB As an embodiment, the percent identity between two amino acid sequences B
lossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか並びに16、14、12 Lossum 62 either matrix or PAM250 matrix and 16,14,12
、10、8、6または4のギャップ加重及び1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラム中に組み込まれているNeedleman及びWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-45 , Using a length-weighted gap weights and five or six of 10,8,6, or 4, in the GCG software package (available at http://www.gcg.com) is incorporated into the GAP program Needleman and Wunsch (J Mol Biol (48):... 444-45
3(1970))アルゴリズムを使用して決定する。 3 (1970)) using an algorithm to determine. さらに別の態様として、2つのヌクレオチド配列間の同一性%をNWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70 In yet another embodiment, the percent identity between two nucleotide sequences NWSgapdna.CMP matrix and 40, 50, 60, 70
または80のギャップ加重及び1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラムを使用して決定する。 Or with 80 the length weighted gap weights and 1,2,3,4,5 or 6, using the GAP program in the GCG software package (available at http://www.gcg.com) decide. 別の態様として、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性%をPAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを用いて、ALIGNプログラム(バージョン2.0)中に組み込まれているE. Meyers及びW. Miller(CABIOS, 4:11-17(1989))のアルゴリズムを使用して決定する。 In another embodiment, the percent identity between two amino acid or nucleotide sequence PAM120 weight residue table, 12 using a gap penalty of a gap length penalty of 4, ALIGN program E, which is incorporated (Version 2.0) . Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) determined using the algorithm.

【0084】 さらに、本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実施するための「問い合わせ配列」として用いることができる。 [0084] Further, the nucleic acid and protein sequences of the present invention, for example, identify other family members or related sequences, can be used as a "query sequence" to perform a search against public databases. そのような検索は、Altsch Such a search, Altsch
ul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。 ul, et al (1990) J. Mol Biol 215:... 403-10 NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) can be carried out using. 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 Of the present invention hVR-1, hVR-2 and RVR-2
核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためにBLASTヌクレオチド検索をNBLAS NBLAS BLAST nucleotide searches to obtain nucleotide sequences homologous to a nucleic acid molecule
Tプログラム、スコア=100、ワード長=12で実施することができる。 T program, score = 100, can be implemented wordlength = 12. 本発明のhV hV of the present invention
R-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためにBLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3で実施することができる。 R-1, hVR-2 and RVR-2 protein molecule homologous XBLAST program BLAST protein searches to obtain amino acid sequences, score = 50, can be carried wordlength = 3. 比較目的のためのギャップを調整した整列を得るために、Gapped BLAST To obtain adjusted aligned gaps for comparison purposes, Gapped BLAST
をAltschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記述されているように利用することができる。 . The Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res 25 (17):. 3389-3402 as described in may be utilized. BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォールトパラメーターを用いることができる。 When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs, the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used the default parameters of. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。 See http://www.ncbi.nlm.nih.gov..

【0085】 本発明はまたhVR-1、hVR-2及びrVR-2キメラまたは融合タンパク質も提供する。 [0085] The invention also hVR-1, hVR-2 and RVR-2 chimeric or fusion proteins are also provided. 本明細書において用いる場合、hVR-1、hVR-2及びrVR-2「キメラタンパク質」 As used herein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 "chimeric protein"
または「融合タンパク質」は、非hVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドに操作可能に連結されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドを含んでなる。 Or "fusion protein" comprises a non-hVR-1, hVR-2 and rVR-2 hVR-1 operably linked to a polypeptide, hVR-2 and RVR-2 polypeptide. 「hVR-1、hV "HVR-1, hV
R-2及びrVR-2ポリペプチド」は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさし、一方、「非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2ポリペプチド」は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に実質的に相同でないタンパク質、例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質と異なりそして同じまたは異なる生物体由来であるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。 R-2 and RVR-2 polypeptide "refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to hVR-1, hVR-2 and RVR-2, while the" non-hVR-1, non-hVR-2 and non RVR-2 polypeptide ", a protein that is not substantially homologous to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, for example, unlike the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and the same or a different organism It refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein is derived from. hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質内でhVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の全部または一部に相当することができる。 hVR-1, hVR-1 in hVR-2 and RVR-2 fusion in proteins, hVR-2 and RVR-2 polypeptide corresponds to all or part of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein be able to. ある態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質は、hVR-1、 As an embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion protein, hVR-1,
hVR-2及びrVR-2タンパク質の少なくとも1つの生物学的に活性の部分を含んでなる。 hVR-2 and RVR-2 at least one biologically protein comprising a portion of the activity. 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質は、hVR-1、hVR-2 In another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion protein, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質の少なくとも2つの生物学的に活性の部分を含んでなる。 And comprising at least two biologically active portion of a RVR-2 protein.
融合タンパク質内で、「操作可能に連結された」という用語は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドと非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2ポリペプチドが相互にインフレームに融合していることを示すものとする。 Within the fusion protein, the term "operably linked", hVR-1, hVR-2 and RVR-2 polypeptide and the non-hVR-1, the non-hVR-2 and non-RVR-2 polypeptide mutual It intended to indicate that you are fused in-frame. 非hVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドのN末端またはC末端に融合させることができる。 Non hVR-1, hVR-2 and RVR-2 polypeptide can be fused to the N-terminus or C-terminus of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 polypeptide.

【0086】 例えば、一つの態様として、融合タンパク質は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列がGST配列のC末端に融合しているGST-hVR-1、GST-hVR-2及びGST-rVR-2融合タンパク質である。 [0086] For example, in one embodiment, the fusion protein, hVR-1, hVR-2 and GST-hVR-1 rVR-2 sequences are fused to the C-terminus of the GST sequences, GST-hVR-2 and GST it is a -rVR-2 fusion protein. そのような融合タンパク質は、組換えhVR-1、hVR-2及びrVR-2の精製を容易にすることができる。 Such fusion proteins can facilitate the purification of recombinant hVR-1, hVR-2 and RVR-2.

【0087】 別の態様として、融合タンパク質は、そのN末端に異種起源のシグナル配列を含有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質である。 [0087] As another embodiment, the fusion protein is a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein contains a heterologous signal sequence at its N-terminus. ある種の宿主細胞(例えば哺乳類宿主細胞)において、異種起源のシグナル配列の使用によりhVR-1、hVR-2 In certain host cells (e.g., mammalian host cells), hVR-1, hVR-2 by use of a heterologous signal sequence
及びrVR-2の発現及び/または分泌を高めることができる。 And it is possible to increase the expression and / or secretion of RVR-2.

【0088】 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質を製薬学的組成物中に導入し、インビボで被験体に投与することができる。 [0088] The hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion proteins of the present invention is introduced into a pharmaceutical composition, it may be administered to a subject in vivo. hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2基質の生物学的利用能に影響を及ぼすために用いることができる。 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion proteins can be used to affect the bioavailability of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 substrates. hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質の使用は、例えば、(i)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または突然変異;(ii)hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の誤った調節;並びに(iii hVR-1, using the hVR-2 and RVR-2 fusion protein, for example, (i) hVR-1, aberrant modification or mutation of a gene encoding a hVR-2 and RVR-2 protein; (ii) hVR -1, adjusted incorrectly hVR-2 and RVR-2 gene; and (iii
)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の異常な翻訳後修飾により引き起こされる疾患の処置のために治療的に有用である可能性がある。 ) HVR-1, there is a therapeutically useful as potential for the treatment of hVR-2 and diseases caused by aberrant post-translational modification of the RVR-2 protein.

【0089】 さらに、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質は、被験体において抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体を作製するために免疫原として、hVR-1、h [0089] Further, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion proteins of the present invention, immunization to produce anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies in a subject as the original, hVR-1, h
VR-2及びrVR-2リガンドを精製するため及びスクリーニングアッセイにおいてhVR hVR In order and screening assays for purifying VR-2 and RVR-2 ligand
-1、hVR-2及びrVR-2基質とhVR-1、hVR-2及びrVR-2との相互作用を阻害する分子を同定するために用いることができる。 -1 can be used to identify molecules that inhibit the interaction of hVR-2 and RVR-2 substrate and hVR-1, hVR-2 and RVR-2.

【0090】 好ましくは、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術により製造される。 [0090] Preferably, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 chimeric or fusion protein of the present invention is produced by standard recombinant DNA techniques. 例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを通常の技術に従って、例えば、連結のために平滑末端化または付着末端化した末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、 For example, different according to the polypeptide sequence encoding DNA fragment conventional techniques, for example, ends and blunt-ended or stagger-ended for ligation, restriction enzyme digestion to provide for appropriate termini,
適切なように付着末端の充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理及び酵素連結を用いることによりインフレームに一緒に連結する。 Filling of sticky ends to suitable manner, linked together in-frame by using the alkaline phosphatase treatment and enzymatic ligation to avoid undesirable joining.
別の態様として、融合遺伝子は、自動DNA合成機を包含する通常の技術により合成することができる。 In another embodiment, the fusion gene can be synthesized by including conventional techniques automated DNA synthesizer. あるいはまた、2個の連続した遺伝子フラグメント間に相補的突出部を生じるアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのPCR増幅を実施することができ、続いてそれらをアニーリングさせ、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成せしめることができる(例えば、Current Protocols in Molecul Alternatively, it is possible to carry out PCR amplification of gene fragments using anchor primers which give rise to complementary overhangs between two consecutive gene fragments, followed by annealing them, a chimeric gene sequence was reamplified it can be generated allowed to (for example, Current Protocols in Molecul
ar Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992を参照)。 ar Biology, eds Ausubel et al, John Wiley & Sons:.. 1992). さらに、すでに融合部分(例えばGSTポリペプチド)をコードする多数の発現ベクターが市販されている。 In addition, numerous expression vectors encoding already fusion moiety (eg, a GST polypeptide) are commercially available. 融合部分がhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質にインフレームに連結されるようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸をそのような発現ベクター中にクローン化することができる。 Cloned nucleic acid fusion moiety to encode hVR-1, hVR-2 and RVR-2 to be coupled in-frame to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein into such an expression vector be able to.

【0091】 本発明はまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2アゴニスト(模倣物)またはhVR-1、hV [0091] The present invention also provides, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 agonists (mimetics) or hVR-1, hV
R-2及びrVR-2アンタゴニストのいずれかとして機能するhVR-1、hVR-2及びrVR-2 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 to function as either a R-2 and RVR-2 antagonists
タンパク質の変異体にも関する。 Also it relates to a variant of the protein. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の変異体は、突然変異誘発、例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の別個の点突然変異または末端欠失により作製することができる。 hVR-1, hVR-2 and variants of RVR-2 protein can be produced by mutagenesis, e.g., hVR-1, hVR-2 and discrete point mutation or terminal deletions of RVR-2 protein . hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のアゴニストは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の実質的に同じものまたは一組を保持することができる。 Agonists hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, retain substantially the same, or a set of biological activities of the naturally occurring form of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein can do. hVR-1、h hVR-1, h
VR-2及びrVR-2タンパク質のアンタゴニストは、例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 Antagonists of VR-2 and RVR-2 protein, for example, hVR-1, hVR-2 and RVR-2
タンパク質のhVR-1、hVR-2及びrVR-2によりもたらされる活性を競合的に調節することにより、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在する形態の1つまたはそれ以上の活性を阻害することができる。 By modulating the activity provided by hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein competitively, one or more of the naturally occurring form of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein it can inhibit the activity. 従って、限られた機能の変異体での処置により特定の生物学的作用を引き出すことができる。 Thus, by treatment with a variant of limited function can draw a specific biological effect. 一つの態様として、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の一組を有する変異体での被験体の処置は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在する形態での処置に比べて被験体における副作用が少ない。 In one embodiment, treatment of a subject with a variant having a set of the biological activities of the naturally occurring form of the protein is naturally occurring hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein form It has fewer side effects in the subject compared to treatment with.

【0092】 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2アゴニスト(模倣物)またはhVR-1、 [0092] In one embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 agonists (mimetics) or hVR-1,
hVR-2及びrVR-2アンタゴニストのいずれかとして機能するhVR-1、hVR-2及びrVR- hVR-1, hVR-2 and acts as either hVR-2 and RVR-2 antagonists rVR-
2タンパク質の変異体は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の突然変異体、例えば末端欠失突然変異体の組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。 Variant 2 protein, a combination of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 hVR-1 with respect to a protein agonist or antagonist activity, hVR-2 and RVR-2 protein mutants, for example terminal deletion mutants it can be identified by screening the library. 一つの態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2変異体の多様なライブラリーを核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により作製し、 In one embodiment, a variegated library of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 variant prepared by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level,
そしてそれは多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。 And it is encoded by a variegated gene library. hVR-1、hVR-2及び hVR-1, hVR-2 and
rVR-2変異体の多様なライブラリーは、例えば、可能なhVR-1、hVR-2及びrVR-2配列の縮重した一組が個々のポリペプチドとしてあるいはまたhVR-1、hVR-2及びrV Diverse library of RVR-2 variants, for example, possible hVR-1, hVR-2 and degenerate Alternatively hVR-1 set as a individual polypeptides of RVR-2 sequence, hVR-2 and rV
R-2配列の該組を中に含有する(例えばファージ展示のための)一組のより大きい融合タンパク質として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に連結することにより作製することができる。 Containing therein a said set of R-2 sequence (e.g. for phage display) so as to be expressed as a set of larger fusion proteins, enzymatically ligated into gene sequences of a mixture of synthetic oligonucleotides it can be produced by. 縮重したオリゴヌクレオチド配列から可能なhVR-1、hVR-2及びrVR-2変異体のライブラリーを作製するために用いることができる様々な方法がある。 There are various methods that can be used to produce libraries of degenerate hVR-1 possible oligonucleotide sequence, hVR-2 and RVR-2 variant. 縮重した遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成機で実施し、次に合成遺伝子を適当な発現ベクター中に連結することができる。 Chemical synthesis of a degenerate gene sequence was carried out in an automatic DNA synthesizer, can then be connected to the synthetic gene into a suitable expression vector. 遺伝子の縮重した一組の使用により、可能なhVR-1 The degenerate set of use of the gene can be hVR-1
、hVR-2及びrVR-2配列の適切な組をコードする配列の全てを1つの混合物中に準備することができる。 , It is possible to prepare all of the sequences encoding the appropriate set of hVR-2 and RVR-2 sequences in one mixture. 縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該技術分野において既知である(例えばNarang, SA (1983) Tetrahedron 39:3;Itakura e Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are known in the art (e.g. Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura e
t al.(1984) Annu.Rev. Biochem.53:323;Itakura et al.(1984) Science 198:1 .. T al (1984) Annu.Rev Biochem.53:. 323; Itakura et al (1984) Science 198: 1
056;Ike et al.(1983) Nucleic Acids Res. 11:477を参照)。 .. 056; Ike et al (1983) Nucleic Acids Res 11: See 477).

【0093】 さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の変異体のスクリーニング及びその後の選択のためのhVR-1、hVR-2及びrVR-2フラグメントの多様な集団を作製するためにhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いることができる。 [0093] Further, in order to produce a hVR-1, hVR-2 and diverse population of RVR-2 fragments for screening and subsequent selection of hVR-1, hVR-2 and variants of RVR-2 protein libraries of fragments of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein coding sequence can be used. 一つの態様として、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング配列の二本鎖P In one embodiment, a library of coding sequence fragments, hVR-1, a double-stranded P of hVR-2 and RVR-2 coding sequence
CRフラグメントを分子当たり約1回だけニックが生じる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖DNAを変性させ、DNAを再生して異なるニック生成物からのセンス The CR fragment was treated with nuclease under conditions where only a nick generated about once per molecule, denaturing the double stranded DNA, sense from different nicked products play the DNA
/アンチセンス対を含むことができる二本鎖DNAを形成し、再形成した二重鎖から / Antisense pairs double stranded DNA to form that can include, from duplexes reshaping
S1ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより作製することができる。 It can be prepared by linking removing single stranded portions by treatment with S1 nuclease, and the resulting fragment library into an expression vector.
この方法により、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の様々な大きさのN末端フラグメント、C末端フラグメント及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを得ることができる。 By this method, one can derive an expression library that encodes hVR-1, N-terminal fragments of various sizes of the hVR-2 and RVR-2 protein, the C-terminal fragment and internal fragments.

【0094】 点突然変異または末端欠失より作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため及び選択した特性を有する遺伝子産物に関してcDNA [0094] point cDNA for gene products having a and selected characteristic to mutation or screening gene products of combinatorial libraries from terminal deletions were generated
ライブラリーをスクリーニングするためにいくつかの技術が当該技術分野において既知である。 Several techniques for screening libraries are known in the art. そのような技術は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の組み合わせ突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適用できる。 Such techniques can be applied for rapid screening of the gene libraries generated by the combinatorial mutagenesis of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein. 容易に高処理量分析ができる、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も一般に用いられる技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換すること及び産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が適切な活性の検出により容易になる条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることを含む。 Can be easily high throughput analysis, the most commonly used technique large gene libraries for screening are typically be cloned into replicable expression vector gene library, live resulting vector appropriate cells in rally comprising expressing the combinatorial genes under conditions in which isolation of the vector encoding the and product was detected gene transformed is facilitated by the detection of the appropriate activity. ライブラリー中の機能性突然変異体の頻度を高める新しい技術のレクルーシブアンサンブル(Recrusive ensemble)突然変異誘発(REM)をhVR-1、hVR-2及びrVR-2変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる(Arkin及びYourvan (1992) Pr Screening to identify functional mutant increase the frequency of new technologies les inclusive ensemble (Recrusive ensemble) mutagenesis (REM) to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mutants in the libraries it can be used in combination with assays (Arkin and Yourvan (1992) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815;Delgrave et al.(1993) Protein En .... Oc Natl Acad Sci USA 89:. 7811-7815; Delgrave et al (1993) Protein En
gineering 6(3):327-331)。 gineering 6 (3): 327-331).

【0095】 一つの態様として、多様なhVR-1、hVR-2及びrVR-2ライブラリーを分析するために細胞に基づくアッセイを利用することができる。 [0095] In one embodiment, it is possible to use cell-based assays to analyze a wide variety of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 library. 例えば、通常hVR-1、hVR-2 For example, usually hVR-1, hVR-2
及びrVR-2に依存して特定のリガンドに応答する細胞系、例えばニューロン細胞系中に発現ベクターのライブラリーをトランスフェクションすることができる。 And cell lines that respond to a particular ligand, depending on the RVR-2, a library of expression vectors, for example, in neuronal cell lines can be transfected.
次に、トランスフェクションした細胞をリガンドと接触させ、そして例えば細胞内カルシウム濃度、ニューロン膜脱分極またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2により調節される転写因子の活性を測定することにより、リガンドによるシグナリングに対する突然変異体の発現の影響を検出することができる。 Then, by measuring the activity of transcription factors regulating the transfected cells are contacted with the ligand, and include, for example intracellular calcium concentration by neuronal membrane depolarization or hVR-1, hVR-2 and RVR-2, it is possible to detect the effect of expression of the mutant relative to signaling by the ligand. 次に、リガンドによるシグナリングの阻害あるいはまた相乗作用に関して優る細胞からプラスミドDNA Then, plasmid DNA from the cells over for inhibition Alternatively the synergistic action of the signaling by the ligand
を回収し、個々のクローンをさらに特性化することができる。 The recovered can be further characterize the individual clones.

【0096】 単離されたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその一部もしくはフラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いてhVR-1、hVR-2及びrVR-2に結合する抗体を作製するための免疫原として用いることができる。 [0096] Isolated hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, or a portion or fragment thereof, hVR-1 using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparations, hVR-2 and RVR antibodies that bind to -2 can be used as immunogens for generating. 全長hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を用いることができ、 Can be used full-length hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein,
あるいはまた、本発明は免疫原としての使用のためのhVR-1、hVR-2及びrVR-2の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。 Alternatively, the present invention provides a hVR-1, antigenic peptide fragments of hVR-2 and RVR-2 for use as immunogens. hVR-1、hVR-2及びrVR-2の抗原性ペプチドは、配列番号:2、5、8または11に示すアミノ酸配列の少なくとも8アミノ酸残基を含んでなり、そしてペプチドに対して生じた抗体がhVR-1、hVR-2及びrVR- hVR-1, hVR-2 and RVR-2 antigenic peptide, SEQ ID NO: 2, 5, 8 or comprises at least 8 amino acid residues of the amino acid sequence shown in 11 and raised against peptide antibody There hVR-1, hVR-2 and rVR-
2と特異的免疫複合体を形成するようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2のエピトープを包含する。 To form a 2-specific immune complex encompasses an epitope of hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも10アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも15アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも20アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも30アミノ酸残基を含んでなる。 Preferably, the antigenic peptide comprises at least 10 amino acid residues, more preferably at least 15 amino acid residues, even more preferably at least 20 amino acid residues, and most preferably at least 30 amino acid residues.

【0097】 抗原性ペプチドにより包含されるエピトープは、タンパク質の表面上に位置するhVR-1、hVR-2及びrVR-2の領域、例えば親水性領域、並びに高い抗原性を有する領域である(例えば、図12及び14を参照)。 [0097] epitopes encompassed by the antigenic peptide are regions having hVR-1, hVR-2 and RVR-2 in a region located on the surface of the protein, e.g., hydrophilic regions, a high antigenicity as well (e.g. see FIGS. 12 and 14).

【0098】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2免疫原は、典型的に、適当な被験体(例えばウサギ、 [0098] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 immunogen typically suitable subject (e.g. rabbits,
ヤギ、マウスまたは他の哺乳類)を免疫原で免疫感作することにより抗体を調製するために用いられる。 Goats, is used to prepare antibodies by immunizing a mouse or other mammal) with the immunogen. 適当な免疫原性調製物は、例えば、組換え的に発現させたhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または化学的に合成したhVR-1、hVR-2及びr An appropriate immunogenic preparation can contain, for example, hVR-1 was recombinantly expressed, hVR-2 and hVR-1 were RVR-2 protein or a chemically synthesized, hVR-2 and r
VR-2ポリペプチドを含有することができる。 It can contain VR-2 polypeptide. 調製物はさらにフロイント完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバントまたは同様な免疫刺激剤を含むことができる。 Preparation can further include an adjuvant, or similar immunostimulatory agent such as Freund's complete or incomplete adjuvant. 免疫原性hVR-1、hVR-2及びrVR-2調製物での適当な被験体の免疫感作は、ポリクローナル抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体反応を誘導する。 Immunization immunogenic hVR-1, hVR-2 and a suitable subject with a RVR-2 preparation induces a polyclonal anti--hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody response to.

【0099】 従って、本発明の別の態様は抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体に関する。 [0099] Thus, another aspect the anti -hVR-1, relates to an anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies of the present invention.
本明細書において用いる場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、hVR-1、hVR-2及びrVR- As used herein, the term "antibody" immunologically part of the activity of immunoglobulin molecules and immunoglobulin molecules, i.e., hVR-1, hVR-2 and rVR-
2のような抗原に特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含有する分子をさす。 Specifically binds an antigen, such as 2 (immunoreacts with) refers to molecules that contain an antigen binding site. 免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例には、抗体をペプシンのような酵素で処理することにより作製することができるF(ab)及びF(ab') 2フラグメントが包含される。 Examples of portions of immunologically active immunoglobulin molecules, antibodies can be prepared by treatment with an enzyme such as pepsin F (ab) and F (ab ') 2 fragments are encompassed. 本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。 The invention provides polyclonal and monoclonal antibodies that bind to hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 本明細書において用いる場合、「 As used herein, "
モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、hVR- Monoclonal antibody "or the term" monoclonal antibody composition ", hVR-
1、hVR-2及びrVR-2の特定のエピトープと免疫反応することができる1種類のみの抗原結合部位を含有する抗体分子の集団をさす。 1, refers to a population of antibody molecules that contain only one type of antigen binding site capable of hVR-2 and of immunoreacting with a particular epitope of RVR-2. 従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的に、それが免疫反応する特定のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に単一の結合親和性を示す。 A monoclonal antibody composition thus typically displays a single binding affinity for a particular hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein with which it immunoreacts.

【0100】 ポリクローナル抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体は、適当な被験体をhVR- [0100] Polyclonal anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody, a suitable subject hVR-
1、hVR-2及びrVR-2免疫原で免疫感作することにより上記のように調製することができる。 1, can be prepared as described above by immunizing with hVR-2 and RVR-2 immunogen. 免疫感作した被験体における抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体力価は、固定化したhVR-1、hVR-2及びrVR-2を用いる固相酵素免疫検定法(ELISA) Anti -hVR-1 in the immunized subject, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody titers, hVR-1, hVR-2 and enzyme linked immunosorbent assays using a RVR-2 immobilized law (ELISA)
でのような、標準的技術により継時的にモニターすることができる。 Can be over time monitored such, by standard techniques as in. 所望に応じて、hVR-1、hVR-2及びrVR-2に対して誘導された抗体分子を哺乳類から(例えば血液から)単離し、そしてIgG画分を得るためのプロテインAクロマトグラフィーのような周知の技術によりさらに精製することができる。 If desired, hVR-1, the antibody molecules directed against hVR-2 and RVR-2 from mammalian (eg, from the blood) is isolated, and such as protein A chromatography to obtain the IgG fraction it can be further purified by well known techniques. 免疫感作後の適当な時期に、例えば抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体力価が最高である時に、抗体産生細胞を被験体から得、そして最初にKohler及びMilstein (1975) Nature 2 An appropriate time after immunization, e.g., an anti -hVR-1, when the anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody titers are highest, give the antibody-producing cells from the subject, and first Kohler and Milstein (1975) Nature 2
56:495-497(Brown et al.(1981) J. Immumol. 127:539-46; Brown et al.( 56: 495-497 (Brown et al (1981) J. Immumol 127:.. 539-46; Brown et al (.
1980)J. Biol. Chem. 255:4980-83;Yeh et al.(1976)Proc. Natl. Acad. Sc ... 1980) J Biol Chem 255:.... 4980-83; Yeh et al (1976) Proc Natl Acad Sc
i. USA 76:2927-31;及びYeh et al.(1982)Int. J. Cancer 29:269-75も参照)により記述されたハイブリドーマ技術、より最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.(1983) Immumol Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術( . I USA 76:.. 2927-31; and Yeh et al (1982) Int J. Cancer 29: 269-75 described the hybridoma technique by even reference), the more recent human B cell hybridoma technique (Kozbor et al. (1983) Immumol Today 4:72), EBV- hybridoma technology (
Cole et al.(1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Threapy, Alan R. Lis Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Threapy, Alan R. Lis
s, Inc., pp.77-96)またはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクロ−ナル抗体を調製するために用いることができる。 Can be used to prepare the monoclonal antibody - s, Inc., monochrome by standard techniques such as pp. 77-96) or trioma techniques. モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である(一般に、RH Kenneth, Monoclona The technology for producing monoclonal antibody hybridomas is well known (see generally, RH Kenneth, Monoclona
l Antibodies:A New Dimension In Biological Analysis中, Plenum Publishin l Antibodies: in A New Dimension In Biological Analysis, Plenum Publishin
g Corp., New York, New York (1980); EA Lerner (1981) Yale J. Biol. M g Corp., New York, New York (1980);. EA Lerner (1981) Yale J. Biol M
ed., 54:387-402; ML Gefter et al.(1977)Somatic Cell Genet. 3:231-3 ed, 54:... 387-402; ML Gefter et al (1977) Somatic Cell Genet 3: 231-3
6を参照)。 See 6). 簡潔に言えば、上記のようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2免疫原で免疫感作した哺乳類からのリンパ球(典型的には脾臓細胞)に不死細胞系(典型的には骨髄腫)を融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングしてhVR-1、hVR-2及びrVR-2に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。 Briefly, hVR-1 as described above, hVR-2 and RVR-2 immunogen lymphocytes from immunized mammalian immortal cell line (typically splenocytes) (typically bone marrow tumor) fusing, to identify a hybridoma producing a monoclonal antibody by screening the culture supernatants of the resulting hybridoma cells bind to hVR-1, hVR-2 and RVR-2.

【0101】 抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2モノクローナル抗体を作製する目的のために、リンパ球と不死化細胞系を融合させるために用いられる多数の周知のプロトコールのいずれかを適用することができる(例えば、G. Galfre et al.(1977) Nat [0102] Anti -hVR-1, for the purpose of generating anti--hVR-2 and anti--rVR-2 monoclonal antibodies, a number of well known protocols used for fusing lymphocytes and immortalized cell lines it can be applied either (e.g., G. Galfre et al. (1977) Nat
ure 266:550-52;Gefter et al. Somatic Cell Genet., 上記引用;Lerner, Yal ure 266:.. 550-52; Gefter et al Somatic Cell Genet, cited above; Lerner, Yal
e J. Biol. Med., 上記引用;Kenneth, Monoclonal Antibodies, 上記引用を参照)。 .. See Kenneth, Monoclonal Antibodies, the above-cited); e J. Biol Med, cited above. さらに、同様に有用であると思われるそのような方法の多数の変形があることを当業者は認識する。 Furthermore, those skilled in the art that there are many variations of such methods are believed to be equally useful recognizes. 典型的には、リンパ球と同じ哺乳類種から不死細胞系(例えば骨髄種細胞系)を得る。 Typically, obtained from the same mammalian species as the lymphocytes immortalized cell line (e.g., myeloma cell line). 例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスからのリンパ球を不死化したマウス細胞系と融合させることによりマウスハイブリドーマを作製することができる。 For example, it is possible to produce a mouse hybridoma by lymphocytes fused with mouse cell lines immortalized from immunogenic preparation in mice immunized according to the invention. 不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培養培地(「HAT培地」)に感受性であるマウス骨髄種細胞系である。 Immortal cell lines are hypoxanthine, mouse myeloma cell lines that are sensitive to culture medium containing aminopterin and thymidine ( "HAT medium"). 多数の骨髄種細胞系のいずれか、例えばP3-NS1/1-A Any of a number of myeloma cell lines such as P3-NS1 / 1-A
g4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄種系を標準的な技術に従って融合相手として用いることができる。 g4-1, can be used as a fusion partner according P3-x63-Ag8.653 or Sp2 / O-Ag14 standard techniques myeloma system. これらの骨髄種系はATCCから入手可能である。 These myeloma system are available from the ATCC.
典型的には、ポリエチレングリコール(「PEG」)を用いてHAT-感受性マウス骨髄種細胞をマウス脾臓細胞に融合させる。 Typically, fusing HAT- sensitive mouse myeloma cells using polyethylene glycol ( "PEG") in mouse spleen cells. 次に、融合していない及び非生産的に融合した骨髄種細胞を殺すHAT培地を用いて(融合していない脾臓細胞は、トランスフォーメーションされていないので数日後に死ぬ)、融合から生じたハイブリドーマ細胞を選択する。 Next, using HAT medium, which kills unfused and unproductively fused myeloma cells (spleen cells unfused die after several days because they are not transformation), resulting from the fusion hybridomas the cells are selected. 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイを用いて、hVR-1、hVR-2及びrVR-2に結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。 Hybridoma cells producing a monoclonal antibody of the present invention may be detected, for example, using a standard ELISA assay, by screening the hybridoma culture supernatants for antibodies that bind to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 .

【0102】 モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する代わりに、組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー(例えば抗体ファージ展示ライブラリー) [0102] As an alternative to generate hybridomas secreting monoclonal antibodies, recombinant combination immunoglobulin library (eg, an antibody phage display library)
をhVR-1、hVR-2及びrVR-2でスクリーニングし、それによりhVR-1、hVR-2及びrVR It was screened in hVR-1, hVR-2 and RVR-2, thereby hVR-1, hVR-2 and RVR
-2に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体を同定し、単離することができる。 Immunoglobulin library members that bind to -2 by isolating the monoclonal anti -hVR-1, to identify anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies can be isolated. ファージ展示ライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、Pharmacia 組換えファージ抗体システム(Recombinant P To produce a phage display library, a kit for screening are commercially available (e.g., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System (Recombinant P
hage Antibody System)、カタログ番号27-9400-01;及びStratagene SurfZAP TMファージ展示キット(Phage Display Kit)、カタログ番号240612)。 hage Antibody System), Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAP TM phage display kit (Phage Display Kit), Catalog No. 240612). さらに、 further,
抗体展示ライブラリーを作製し、スクリーニングすることにおいて特に容易に使用できる方法および試薬の例は、例えばLander et al. 米国特許第5,223,409号;Kang et al. PCT国際公開第WO92/18619号;Dower et al. PCT国際公開第WO 91 Generate antibodies display libraries, examples of methods and reagents that can particularly readily used in screening, for example Lander et al U.S. Pat. No. 5,223,409;. Kang et al PCT International Publication No. WO92 / 18619;. Dower et al. PCT International Publication No. WO 91
/17271号;Winter et al. PCT国際公開第WO 92/20791号;Markland et al. PCT / 17271 Patent; Winter et al PCT International Publication No. WO 92/20791;.. Markland et al PCT
国際公開第WO 92/15679号;Breitling et al. PCT国際公開第WO93/01288号;McC International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al PCT International Publication No. WO93 / 01288;. McC
afferty et al. PCT国際公開第WO92/01047号;Garrard et al. PCT国際公開第WO afferty et al PCT International Publication No. WO92 / 01047;.. Garrard et al PCT International Publication No. WO
92/09690号;Ladner et al. PCT国際公開第WO92/02809号;Fuchs et al.(1991) No. 92/09690; Ladner et al PCT International Publication No. WO92 / 02809;.. Fuchs et al (1991)
Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: Bio / Technology 9:... 1370-1372; Hay et al (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:
81-85;Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281;Griffiths et al.(1993) E . 81-85; Huse et al (1989) Science 246:. 1275-1281; Griffiths et al (1993) E
MBO J 12:725-734;Hawkins et al.(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896;Clarks MBO J 12:... 725-734; Hawkins et al (1992) J. Mol Biol 226: 889-896; Clarks
on et al.(1991) Nature 352:624-628;Gram et al.(1992) Proc. Natl. Acad. . On et al (1991) Nature 352:... 624-628; Gram et al (1992) Proc Natl Acad.
Sci. USA 89:3576-3580;Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9:1373-1377;H . Sci USA 89:. 3576-3580; Garrad et al (1991) Bio / Technology 9: 1373-1377; H
oogenboom et al.(1991) Nuc.Acid Res. 19:4133-4137;Barbas et al.(1991) P . Oogenboom et al (1991) Nuc.Acid Res 19:.. 4133-4137; Barbas et al (1991) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982;及びMcCafferty et al. Nature (19 .... Roc Natl Acad Sci USA 88:. 7978-7982; and McCafferty et al Nature (19
90) 348:552-554に見いだすことができる。 90) 348: it can be found in 552-554.

【0103】 さらに、標準的な組換えDNA技術を用いて作製することができる、ヒト及び非ヒト部分の両方を含んでなる、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体は本発明の範囲内である。 [0103] Furthermore, can be made using standard recombinant DNA techniques, comprising both human and non-human portions, recombinant anti -hVR-1, such as chimeric and humanized monoclonal antibodies, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies are within the scope of the present invention. そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の組換えDNA Such chimeric and humanized monoclonal antibodies, known recombinant DNA in the art
技術により、例えばRobinson et al. 国際出願第PCT/US86/02269号;Akira et a The technique, for example, Robinson et al International Application No. PCT / US86 / 02269;. Akira et a
l. 欧州特許出願184,187;Taniguchi, M., 欧州特許出願171,496;Morrison et . L European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et
al. 欧州特許出願173,494;Neuberger et al. PCT国際公開第WO86/01533号;Cab . Al European Patent Application 173,494; Neuberger et al PCT International Publication No. WO86 / 01533;. Cab
illy et al. 米国特許第4,816,567号;Cabilly et al. 欧州特許出願125,023;B . Illy et al U.S. Pat. No. 4,816,567;. Cabilly et al European Patent Application 125,023; B
etter et al.(1988) Science 240:1041-1043;Liu et al.(1987)Proc. Natl. Ac . Etter et al (1988) Science 240:... 1041-1043; Liu et al (1987) Proc Natl Ac
ad. Sci. USA 84:3439-3443;Liu et al.(1987)J. Immumol. 139:3521-3526;Su .. Ad Sci USA 84:... 3439-3443; Liu et al (1987) J Immumol 139: 3521-3526; Su
n et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218;Nishimura et al.(1 ..... N et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:. 214-218; Nishimura et al (1
987) Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.(1985) Nature 314:446-449;及びSha 987) Canc.Res.47:. 999-1005; Wood et al (1985) Nature 314: 446-449; and Sha
w et al.(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1533-1559);Morrison, SL (198 .. W et al (1988) J. Natl Cancer Inst 80:. 1533-1559); Morrison, SL (198
5) Science 229:1202-1207;Oi et al.(1986) BioTechniques 4:214;Winter 米国特許第5,225,539号;Jones et al.(1986) Nature 321:552-525;Verhoeyan et 5) Science 229:. 1202-1207; Oi et al (1986) BioTechniques 4: 214; Winter U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al (1986) Nature 321:. 552-525; Verhoeyan et
al.(1988) Science 239:1534;及びBeidler et al.(1998) J. Immumol. 141:40 . Al (1988) Science 239:.. 1534; and Beidler et al (1998) J. Immumol 141: 40
53-4060に記述された方法を用いて作製することができる。 It can be prepared using the methods described 53-4060.

【0104】 抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体(例えばモノクローナル抗体)は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準的な技術によりhV [0104] Anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies (e.g., monoclonal antibody), hV by standard techniques such as affinity chromatography or immunoprecipitation
R-1、hVR-2及びrVR-2を単離するために用いることができる。 The R-1, hVR-2 and RVR-2 can be used to isolate. 抗-hVR-1、抗-hVR- Anti--hVR-1, anti--hVR-
2及び抗-rVR-2抗体は、細胞からの天然のhVR-1、hVR-2及びrVR-2の精製及び宿主細胞において発現された組換え的に製造したhVR-1、hVR-2及びrVR-2の精製を容易にすることができる。 2 and anti -RVR-2 antibody, hVR-1, hVR-2 and RVR was recombinantly produced which is naturally expressed in hVR-1, purified and host cells hVR-2 and RVR-2 from cell purification -2 can be facilitated. さらに、抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体は、(例えば細胞ライセートまたは細胞上清中の)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を検出してhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現の量及びパターンを評価するために用いることができる。 In addition, anti -hVR-1, anti--hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies, to detect (e.g., a cell lysate or cell supernatant) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein hVR -1 can be used to assess the amount and pattern of expression of hVR-2 and RVR-2 protein. 抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体は、例えば、 Anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies, for example,
与えられた処置計画の効能を決定するために、臨床試験方法の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いることができる。 To determine the efficacy of a given treatment regimen can diagnostically used it to monitor protein levels in tissue as part of a clinical testing methods. 検出可能な物質に抗体をカップリングすること(すなわち、物理的に連結すること)により検出を容易にすることができる。 Be coupled to an antibody to a detectable substance (i.e., physically linking) makes it possible to facilitate detection. 検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質及び放射性物質が包含される。 Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, and radioactive materials are encompassed. 適当な酵素の例には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 Examples of suitable enzyme horseradish peroxidase, alkaline phosphatase,
β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが包含され;適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンが包含され;適当な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが包含され;発光物質の例にはルミノールが包含され;生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが包含され、そして適当な放射性物質の例には125 I、 131 It is included the β- galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes are encompassed streptavidin / biotin and avidin / biotin; examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate , rhodamine, dichlorotriazinyl-amine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin is included; luminol is included in the example of a luminescent material; examples of bioluminescent materials luciferase, luciferin, and aequorin are included, and suitable radioactive material examples 125 I, 131 I
35 Sまたは3 Hが包含される。 , 35 S or 3 H, and the like. III. III. 組換え発現ベクター及び宿主細胞本発明の別の態様は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質(またはその一部) Another aspect of the Recombinant Expression Vectors and Host Cells The present invention, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein (or portion thereof)
をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。 Vectors containing a nucleic acid encoding, preferably expression vectors. 本明細書において用いる場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子をさす。 As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、それはさらなるDNAセグメントを連結することができる環状の二本鎖DNAループをさす。 One type of vector is a "plasmid", which refers to a circular double stranded DNA loop that can be ligated additional DNA segments. 別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。 Another type of vector is a viral vector, in which case, it is possible to connect the additional DNA segments into the viral genome. ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター)。 Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors and episomal mammalian vectors having a bacterial origin of replication). 他のベクター(例えば非エピソーム性哺乳類ベクター)は宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。 Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host genome. さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を導くことができる。 Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。 Such vectors are referred to herein as "expression vectors". 一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。 In general, expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. プラスミドは最も一般的に用いられるベクター形態であるので、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」を互換的に用いることができる。 As the plasmid is the vector form the most commonly used, herein, it can be used as a "plasmid" and "vector" interchangeably. しかしながら、本発明は、同等な機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターを包含するものとする。 However, invention is intended to function, viral vectors (e.g., replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses) are intended to encompass other forms of expression vectors, such as.

【0105】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現のために適当な形態の本発明の核酸を含んでなり、これは、組換え発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択される1つまたはそれ以上の調節配列を含み、それが発現される核酸配列に操作可能に連結されることを意味する。 [0105] The recombinant expression vectors of the invention comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell, host recombinant expression vector, used for expression It includes one or more regulatory sequences, selected on the basis of the cell, which means that it is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed. 組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」は、(例えば、インビトロ転写/ Within the recombinant expression vector, "operably linked", (e.g., in vitro transcription /
翻訳系においてまたはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞において)ヌクレオチド配列を発現できるように目的のヌクレオチド配列が調節配列(1つまたは複数)に連結されることを意味するものとする。 As or vector in the translation system, which means that it is linked to the nucleotide sequence of interest is a regulatory sequence to allow expression of) a nucleotide sequence in a host cell (s) when introduced into a host cell to. 「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素(例えばポリアデニル化シグナル)が包含されるものとする。 The term "regulatory sequence" is intended to promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) are included. そのような調節配列は、例えば、 Such regulatory sequences are described, for example,
Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academi Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academi
c Press, San Diego, CA (1990)に記述されている。 c Press, are described in San Diego, CA (1990). 調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及びある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの(例えば組織特異的調節配列)が包含される。 Regulatory sequences are those that direct expression of the nucleotide sequence only in many types of and certain host cells that direct constitutive expression of a nucleotide sequence in a host cell (e.g. tissue-specific regulatory sequences) are encompassed. 発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、 The design of the expression vector, choice of the host cell to be transformed,
所望されるタンパク質の発現レベル等のような因子により決まり得ることを当業者は認識する。 Those skilled in the art to obtain determined by factors such as expression levels or the like of the desired protein recognizes. 本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記述するような核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを包含するタンパク質またはペプチド(例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の突然変異体形態、融合タンパク質等)を生産することができる。 The expression vector of the present invention into host cells, whereby a protein or peptide comprising the fusion proteins or peptides, encoded by nucleic acids as described herein (e.g., hVR-1, hVR-2 and rVR 2 protein can be produced mutant forms of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, fusion proteins, etc.).

【0106】 本発明の組換え発現ベクターを原核または真核細胞におけるhVR-1、hVR-2及び [0106] hVR-1, hVR-2 and recombinant expression vector in prokaryotic or eukaryotic cells of the invention
rVR-2タンパク質の発現のために設計することができる。 It can be designed for expression of RVR-2 protein. 例えば、hVR-1、hVR-2 For example, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質は、エシェリキア・コリ(E. coli)のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)、酵母細胞または哺乳類細胞において発現させることができる。 And RVR-2 protein, bacterial cells such as Escherichia coli (E. coli), (using baculovirus expression vectors) insect cells, can be expressed in yeast cells or mammalian cells. 適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Suitable host cells, Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1 Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1
990)にさらに説明されている。 It is further described in 990). あるいはまた、組換え発現ベクターは、例えばT7 Alternatively, the recombinant expression vector, for example, T7
プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写し、翻訳することができる。 With promoter regulatory sequences and T7 polymerase, it can be transcribed in vitro and translated.

【0107】 原核生物におけるタンパク質の発現は、たいてい、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてエシェリキア・コリにおいて実施される。 [0107] Expression of proteins in prokaryotes is often carried out in E. coli with vectors containing constitutive or inducible promoters directing the expression of either fusion or non-fusion proteins. 融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、一般に組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。 Fusion vectors, the protein encoded therein, generally add a number of amino acids to the amino terminus of the recombinant protein. そのような融合ベクターは典型的に3つの目的を果たす:1)組換えタンパク質の発現を増やす;2)組換えタンパク質の可溶性を高める;そして3)アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を促進する。 Such fusion vectors typically serve three purposes: 1) Increase the expression of recombinant protein; 2) to increase the solubility of the recombinant protein; and 3) of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification to facilitate purification. 融合発現ベクターでは、たいて、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離できるように、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入される。 In fusion expression vectors, and want, from the fusion moiety subsequent to purification of the fusion protein to allow separation of the recombinant protein, proteolytic cleavage site is introduced at the junction of the fusion moiety and the recombinant protein. そのような酵素及びそれらのコグネイト認識配列には、第Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが包含される。 Such enzymes, and their cognate recognition sequences, Factor Xa, thrombin and enterokinase are included. 典型的な融合発現ベクターには、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを融合させるpGEX(Pharmacia Biotech Inc.; Smith, DB及びJ Typical fusion expression vectors, respectively glutathione S- transferase, to the target recombinant protein (GST), pGEX to maltose E binding protein, or protein A (Pharmacia Biotech Inc .; Smith, DB and J
ohnson, KS (1988) Gene 67:31-40)、 pMAL(New England Biolabs, Beverly, ohnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly,
MA)及びpRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)が包含される。 MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), and the like.

【0108】 精製された融合タンパク質はhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性アッセイ(例えば、 [0108] Purified fusion proteins can hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity assay (e.g.,
以下に詳細に記述する直接アッセイもしくは競合アッセイ)においてまたは例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に特異的な抗体を作製するために利用することができる。 Can be utilized to produce antibodies specific for direct assay or competitive assay) or in for example hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein described in detail below. ある態様として、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現されるhVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質を骨髄細胞に感染させるために利用することができ、続いてそれらを放射線照射した受容者に移植する。 As an embodiment, receiving the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion protein is expressed in a retroviral expression vector of the present invention can be utilized to infect bone marrow cells, followed by their were irradiated transplantation into people. 次に、十分な時間(例えば6週)が経過した後に該受容者の病状を調べる。 Next, examine the condition of the recipient after a sufficient time (e.g. 6 weeks) has elapsed.

【0109】 適当な誘導性の非融合エシェリキア・コリ発現ベクターの例には、pTrc(Amann [0109] Examples of suitable inducible non-fusion E. coli expression vector, pTrc (Amann
et al. (1988) Gene 69:301-315)及びpET 11d(Studier et al., Gene Express . Et al (1988) Gene 69:. 301-315) and pET 11d (Studier et al, Gene Express
ion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca ion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca
lifornia (1990)60-89)が包含される。 lifornia (1990) 60-89), and the like. pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、 Target gene expression from the pTrc vector,
ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写により決まる。 Determined by the host RNA polymerase transcription from a hybrid trp-lac fusion promoter. pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスRNAポリメラーセ゛(T7 gn1)によりもたらされるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写により決まる。 Target gene expression from the pET 11d vector is determined by transcription from a T7 gn10-lac fusion promoter caused by viral RNA Porimerase Bu coexpressed (T7 gn1). このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下のT7 gn1遺伝子を保有する内在プロファージから宿主株BL21(DE3)またはHMS174( This viral polymerase is host strain BL21 from resident prophage harboring a T7 gn1 gene under the transcriptional control of the lacUV5 promoter (DE3) or HMS174 (
DE3)により供給される。 DE3) supplied by.

【0110】 エシェリキア・コリにおける組換えタンパク質発現を最大にする一つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌においてタンパク質を発現させることである(Gottesman, S., Gene Expressio [0110] One strategy to maximize recombinant protein expression in E. coli is to express the protein in host bacteria with capacity to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S ., Gene Expressio
n Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Cali n Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Cali
fornia (1990)119-128)。 fornia (1990) 119-128). 別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンがエシェリキア・コリにおいて優先的に利用されるものであるように発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を改変することである(Wada et al. (1992) Nucleic Acids Another way is to alter the nucleic acid sequence of the nucleic acid to individual codons for each amino acid is inserted into an expression vector as are those preferentially utilized in E. coli (Wada et al. ( 1992) Nucleic Acids
Res. 20:2111-2118)。 Res 20:. 2111-2118). 本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なDNA合成技術により実施することができる。 Such alteration of nucleic acid sequences of the present invention can be carried out by standard DNA synthesis techniques.

【0111】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2発現ベクターは酵母発現ベクターである。 [0111] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression vector is a yeast expression vector. 酵母サッカロミセス・セレビシエ(S. cerivisae)における発現のためのベクターの例には、pYepSec1(Baldari et al.(1987) Embo J. 6:229-234)、 pMFa(K Examples of vectors for expression in yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerivisae) is, pYepSec1 (Baldari et al (1987) Embo J. 6:. 229-234), pMFa (K
urjan及びHerskowitz, (1982) Cell 30:933-943)、 pJRY88(Schultz et al.(1987 urjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:. 933-943), pJRY88 (Schultz et al (1987
) Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)及びpicZ ) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) and picZ
(Invitrogen Corp, San Diego, CA)が包含される。 (Invitrogen Corp, San Diego, CA) and the like.

【0112】 あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現させることができる。 [0112] Alternatively, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors. 培養した昆虫細胞(例えばSf9細胞)におけるタンパク質の発現のために利用できるバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ(Smith et al.(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156- ... Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells (e.g., Sf9 cells), pAc series (Smith et al (1983) Mol Cell Biol 3: 2156-
2165)及びpVLシリーズ(Lucklow及びSummers (1989) Virology 170:31-39)が包含される。 2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39) and the like.

【0113】 さらに別の態様として、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞において発現される。 [0113] In yet another embodiment, the nucleic acid of the invention is expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector. 哺乳類発現ベクターの例には、pCDM8(Seed, B. (1987 Examples of mammalian expression vector, pCDM8 (Seed, B. (1987
) Nature 329:840)及びpMT2PC(Kaufman et al.(1987) EMBO J.6:187-195)が包含される。 ) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al (1987) EMBO J.6:. 187-195) and the like. 哺乳類細胞において用いる場合、発現ベクターの制御機能はたいていウイルスの調節要素により提供される。 When used in mammalian cells, the expression vector's control functions are often provided by viral regulatory elements. 例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス40に由来する。 For example, commonly used promoters are derived from polyoma, Adenovirus 2, cytomegalovirus and Simian Virus 40. 原核及び真核細胞の両方の他の適当な発現系については、Samb For other suitable expression systems for both prokaryotic and eukaryotic cells, Samb
rook, J., Fritsh, EF及びManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory rook, J., Fritsh, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual.., 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labor Manual .., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labor
atory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の16及び17章を参照。 atory Press, Cold Spring Harbor, NY, referring to the 16 and Chapter 17 of 1989.

【0114】 別の態様として、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を導くことができる(例えば、核酸を発現させるために組織特異的調節要素を用いる)。 [0114] As another embodiment, the recombinant mammalian expression vector is capable of directing expression of the nucleic acid preferentially in a particular cell type (e.g., using tissue-specific regulatory elements to express the nucleic acid). 組織特異的調節要素は当該技術分野において既知である。 Tissue-specific regulatory elements are known in the art. 適当な組織特異的プロモーターの限定しない例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的;Pinkert et al.(1987) Genes Dev. 1:268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame及びEaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、特にT細胞受容体(Winoto及びBaltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)及び免疫グロブリン(Banerji et al.(1983) Cell 33:729-740; Queen及びBaltimore (1983) Ce Non-limiting examples of suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al (1987) Genes Dev 1:.. 268-277), lymphoid-specific promoters (Calame and Eaton (1988) Adv .. Immunol 43: 235-275), particularly a T-cell receptor (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) and immunoglobulins (Banerji et al (1983.) cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Ce
ll 33:741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えばニューロフィラメントプロモーター;Byrne及びRuddle (1989) Proc. Natl. Acad. S ll 33:... the promoter of 741-748), neuron-specific promoters (e.g., the neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) Proc Natl Acad S
ci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al.(1985) Scien . Ci USA 86: 5473-5477), pancreas-specific promoter (. Edlund et al (1985) Scien
ce 230:912-916)並びに乳腺特異的プロモーター(例えば乳清プロモーター;米国特許第4,873,316号及び欧州出願公開第264,166号)が包含される。 ce 230: 912-916) and mammary gland-specific promoters (e.g., whey promoter; U.S. Pat. No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166), and the like. 発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスホックスプロモーター(Kessel及びGruss Developmentally-regulated promoters are, for example, murine hox promoters (Kessel and Gruss
(1990) Science 249:374-379)及びα-フェトプロテインプロモーター(Campes及びTilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)もまた包含される。 (1990) Science 249: 374-379) and α- fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:. 537-546) are also included.

【0115】 細胞系または微生物内の内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の発現特性は、 [0115] Expression characteristics of endogenous hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene in a cell-based or in microorganisms,
挿入した調節要素が内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子と操作可能に連結されるように異種起源のDNA調節要素を安定な細胞系またはクローン化した微生物のゲノム中に挿入することにより改変することができる。 Inserted regulatory element is inserted into the genome of the endogenous hVR-1, hVR-2 and microorganism a DNA regulatory element heterologous to a stable cell line or cloned as operably linked to a RVR-2 gene it can be modified by. 例えば、細胞系または微生物において通常発現される遺伝子産物の発現を促進することができる調節要素を挿入することにより、通常「転写的にサイレント」である内在性hVR-1、hVR-2 For example, by inserting a regulatory element which is capable of promoting the expression of a gene product normally expressed in the cell line or microorganism, usually "transcriptionally silent" endogenous hVR-1 is, hVR-2
及びrVR-2遺伝子、すなわち、その細胞系または微生物において通常発現されないかまたは非常に低いレベルでのみ発現されるhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子を活性化することができる。 And RVR-2 gene, i.e., capable of activating hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene expressed only in the normal expressed no or very low levels in the cell line or microorganism. あるいはまた、細胞タイプにわたって機能する無差別の調節要素の挿入により、転写的にサイレントである内在性hVR-1、hVR-2及びrV Alternatively, the insertion of regulatory elements of promiscuous functioning over cell type, endogenous hVR-1 is a transcriptionally silent, hVR-2 and rV
R-2遺伝子を活性化することができる。 It can activate R-2 gene.

【0116】 当業者に周知であり、そして例えばChappel, 米国特許第5,272,071号;1991年5 [0116] are well known to those skilled in the art and include Chappel, U.S. Patent No. 5,272,071; 1991 5
月16日に公開されたPCT公開第WO 91/06667号に記述されている標的(targeted) Target, which is described in PCT Publication No. WO 91/06667, published a month 16 days (targeted)
相同的組換えのような技術を用いて、異種起源の調節要素をそれが内在性hVR-1 Using techniques such as homologous recombination, the regulatory element heterologous it endogenous hVR-1
、hVR-2及びrVR-2遺伝子と操作可能に連結されるように安定な細胞系またはクローン化した微生物中に挿入することができる。 It can be inserted into a stable cell line or in cloned microorganisms to be operably linked to hVR-2 and RVR-2 gene.

【0117】 本発明はさらに、発現ベクター中にアンチセンスの向きにクローン化された本発明のDNA分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。 [0117] The present invention further provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule of the invention cloned in the antisense orientation into the expression vector. すなわち、DNA分子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAにアンチセンスであるRNA分子を(DNA分子の転写により)発現できるように調節配列に操作可能に連結される。 That, DNA molecule is operably linked to hVR-1, the RNA molecule (by transcription of the DNA molecule) which is antisense to hVR-2 and RVR-2 mRNA regulatory sequences to allow expression. 様々な細胞タイプにおいてアンチセンスRNA分子の連続発現を導く、アンチセンスの向きにクローン化された核酸に操作可能に連結された調節配列、例えばウイルスのプロモーター及び/もしくはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセンスRN Directing the continuous expression of the antisense RNA molecule in a variety of cell types, operably linked regulatory sequences in the antisense orientation to a nucleic acid cloned, can be selected promoter and / or enhancers such as viruses, or antisense RN
Aの構成的、組織特異的もしくは細胞タイプ特異的発現を導く調節配列を選択することができる。 It can be selected regulatory sequences that direct constitutive, tissue specific or cell type specific expression of A. アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態であることができ、その場合、アンチセンス核酸は高効率の調節領域の制御下で生産され、その活性は、ベクターが導入される細胞タイプにより決定することができる。 The antisense expression vector, recombinant plasmids, can be in the form of phagemid or attenuated virus, in which case, the antisense nucleic acids are produced under the control of regulatory regions of high efficiency, its activity, the vector is introduced it can be determined by the cell type. アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の説明については、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular For a description of the regulation of gene expression using antisense genes, Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular
tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986を参照。 tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, see Vol.1 (1) 1986.

【0118】 本発明の別の態様は、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子、例えば、組換え発現ベクター内のhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子または宿主細胞のゲノムの特定の位置への相同的組換えが可能な配列を含有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2 [0118] Another aspect of the present invention, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecules of the present invention, for example, hVR-1 in a recombinant expression vector, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 homologous recombination to a specific location of the genome of the host cell contains a sequence capable
核酸分子が導入される宿主細胞に関する。 It relates to a host cell the nucleic acid molecule is introduced. 「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」 "Host cell" and "recombinant host cell"
という用語は、本明細書において互換的に用いられる。 The term is used interchangeably herein. そのような用語は特定の該細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または可能性がある子孫もさすと理解される。 Such terms refer not only to the particular said cell, is understood to refer also such a cell progeny or potential progeny. 突然変異または環境的影響のいずれかのために後の世代においてある種の改変が起こる可能性があるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書において用いる場合それでもなおその用語の範囲内に含まれる。 Since there is a possibility that certain modifications may occur in succeeding generations due to either mutation or environmental influences, such progeny are in fact may not be identical to the parent cell, herein It is included within the scope of the case still that term is used in.

【0119】 宿主細胞はあらゆる原核または真核細胞であることができる。 [0119] Host cells can be any prokaryotic or eukaryotic cell. 例えば、hVR-1 For example, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2タンパク質をエシェリキア・コリのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)もしくはCOS細胞のような)哺乳類細胞において発現させることができる。 , Can be expressed hVR-2 and RVR-2 protein bacterial cells such as E. coli, insect cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells) yeast or in mammalian cells. 他の適当な宿主細胞は当業者に既知である。 Other suitable host cells are known to those skilled in the art.

【0120】 ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞中に導入することができる。 [0120] Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. 本明細書において用いる場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を包含する、宿主細胞中に外来核酸(例えばDNA As used herein, the term "transformation" and "transfection", calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, transfection with DEAE- dextran, including lipofection, or electroporation, foreign nucleic acid into a host cell (e.g. DNA
)を導入するための様々な当該技術分野で認められている技術をさすものとする。 ) Shall refer to techniques appreciated in various art for introducing. 宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適当な方法は、Sa Suitable methods for transforming or transfecting host cells can, Sa
mbrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Sprin mbrook, et al (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, NY, 1989)及び他の実験マニュアルに見いだすことができる。 rbor, it can be found in NY, 1989) and other laboratory manuals.

【0121】 哺乳類細胞の安定なトランスフェクションに関して、用いる発現ベクター及びトランスフェクション技術により、細胞のほんの一部分のみがそれらのゲノム中に外来DNAを組込む可能性があることが知られている。 [0121] For stable transfection of mammalian cells, the expression vector and transfection technique used, it is known that only a fraction of the cells could integrate the foreign DNA into their genome. これらの組込み体を同定し、選択するために、一般に、選択マーカー(例えば、抗生物質に対する耐性) To identify these integrants, in order to select, in general, a selectable marker (e.g., resistance to antibiotics)
をコードする遺伝子を目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入する。 Introduced into the host cells along with the gene of interest a gene encoding. 選択マーカーには、G418、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を与えるものが包含される。 The selection marker, G418, those which confer resistance to drugs, such as hygromycin and methotrexate are included. 選択マーカーをコードする核酸は、hVR-1、hVR-2 Nucleic acid encoding a selectable marker, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別個のベクター上で導入することができる。 And RVR-2 protein can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding or can be introduced on a separate vector. 導入した核酸で安定にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んでいる細胞は生存し、一方、他の細胞は死ぬ)。 Stably transfected cells with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (e.g., cells that have incorporated the selectable marker gene will survive, while the other cells die).

【0122】 培養した原核または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、hVR-1、hVR-2 [0122] Host cells of the present invention, such as a prokaryotic or eukaryotic host cells were cultured, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質を製造する(すなわち、発現させる)ために用いることができる。 And producing a RVR-2 protein can be used to (i.e., express). 従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてhVR-1、hVR-2及び Accordingly, the invention further, hVR-1, hVR-2 and using the host cells of the present invention
rVR-2タンパク質を製造する方法を提供する。 To provide a method for producing the RVR-2 protein. 一つの態様として、該方法は、hVR In one embodiment, the method, hVR
-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質が生産されるように適当な培地中で(hVR-1、hVR -1, hVR-2 and RVR-2 protein in a suitable medium as produced (hVR-1, hVR
-2及びrVR-2タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている)本発明の宿主細胞を培養することを含んでなる。 The recombinant expression vector encoding the -2 and RVR-2 protein comprising culturing a host cell of the introduced and are) present invention. 別の態様として、該方法はさらに、培地または宿主細胞からhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を単離することを含んでなる。 In another embodiment, the method further comprises isolating the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein from the medium or the host cell.

【0123】 本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために用いることもできる。 [0123] Host cells of the present invention can also be used to produce nonhuman transgenic animals. 例えば、一つの態様として、本発明の宿主細胞は、hVR-1、h For example, in one embodiment, the host cell of the present invention, hVR-1, h
VR-2及びrVR-2をコードする配列が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。 Sequence encoding the VR-2 and RVR-2 is a fertilized oocyte or embryonic stem cells has been introduced. 次に、そのような宿主細胞を用いて、外来hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列がゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物または内在性hVR- Next, using such host cells, exogenous hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequences have been introduced into the genome non-human transgenic animal or endogenous hVR-
1、hVR-2及びrVR-2配列が改変されている相同的組換え動物を作製することができる。 1, hVR-2 and RVR-2 sequence can be prepared homologous recombinant animals which are modified. そのような動物は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2の機能及び/または活性を研究するため並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性のモジュレーターの同定及び/または評価のために有用である。 Such animals, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 functions and / or as well as for hVR-1 to study the activity, hVR-2 and RVR-2 activity for the identification and / or evaluating modulators of it is useful to. 本明細書において用いる場合、「トランスジェニック動物」は、動物の1個またはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含有する非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類である。 As used herein, "transgenic animal" is a non-human animal in which one or more cells of the animal contain a transgene, preferably a mammal, more preferably a rodent such as a rat or mouse is there. トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が包含される。 Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, amphibians, etc. are included. 導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれ、成熟した動物のゲノム中にとどまり、それによりトランスジェニック動物の1つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコード遺伝子産物の発現を導く外来DNAである。 Transgene integrated into the genome of a cell from which a transgenic animal develops, the expression of mature remains in the genome of an animal, whereby one of the transgenic animal or more cell types or encoded in tissues gene product it is a foreign DNA lead. 本明細書において用いる場合、「相同的組み換え動物」は、動物の発生前に、内在性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の胚性細胞中に導入された外来DNA分子間の相同的組換えにより内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子が改変されている非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスである。 As used herein, "homologous recombinant animal" is before animal development, endogenous genes and animal cells, for example by homologous recombination between the foreign DNA molecules introduced into the animal embryonic cells Endogenous hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene is a non-human animal that has been modified, preferably a mammal, more preferably a mouse.

【0124】 本発明のトランスジェニック動物は、例えば微量注入、レトロウイルス感染により、受精卵母細胞の雄性前核中にhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸を導入し、該卵母細胞を偽妊娠メス仮親動物において発生させることにより作製することができる。 [0124] Transgenic animals of the present invention, for example microinjection, by retroviral infection, by introducing a nucleic acid encoding hVR-1, hVR-2 and RVR-2 in fertilized oocytes male pronucleus of a cell, the the oocytes may be produced by generating in a pseudopregnant female foster animal. 配列番号:1、3、5、7または9のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNA SEQ ID NO: of 1, 3, 5, 7 or 9 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 cDNA
配列を導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入することができる。 It can be introduced into the genome of a nonhuman animal as a transgene sequences. あるいはまた、マウスまたはラットhVR-2のようなhVR-2遺伝子の非ヒト相同物、例えば Alternatively, a mouse or hVR-2 nonhuman homologue of a gene, such as a rat hVR-2, for example,
rVR-2遺伝子を導入遺伝子として用いることができる。 RVR-2 gene can be used as a transgene. あるいはまた、カプサイシン/バニロイドファミリーの別のメンバーのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子相同物を配列番号:1、3、4、6、7、9、10または12のhVR-1、hVR-2及びrVR- Alternatively, hVR-1, such as another member of the capsaicin / vanilloid family, hVR-2 and RVR-2 gene homologs of SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or 12 hVR- 1, hVR-2 and rVR-
2 cDNA配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離し(上記小節Iにおいてさらに記述する)、導入遺伝子として用いることができる。 Based on hybridization to 2 cDNA sequence was isolated (further described in the subsection I), it may be used as a transgene. また、導入遺伝子の発現の効率を上げるためにイントロン配列及びポリアデニル化シグナルを導入遺伝子中に含むこともできる。 It is also possible to include in the transgene intronic sequences and polyadenylation signals to increase the efficiency of expression of the transgene. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現を特定の細胞に向けるために組織特異的調節配列(1つまたは複数)をhVR-1、hVR-2及び hVR-1, hVR-2 and RVR-2 tissue-specific regulatory sequences the expression of a protein to direct to a specific cell (s) hVR-1 a, hVR-2 and
rVR-2導入遺伝子に操作可能に連結することができる。 It can be operably linked to RVR-2 transgene. 胚操作及び微量注入によりトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製する方法は当該技術分野において慣例的になってきており、例えば、両方ともLeder et al.による米国特許第4,736,866号及び4,870,009号、Wagner et al.による米国特許第4,873,19 Transgenic animals via embryo manipulation and microinjection, has become customary way, in particular making animals such as mice in the art, for example, both Leder et al. US Patent No. 4,736,866 and No. 4,870,009 , Wagner et al. US Patent according to 4,873,19
1号中並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor No. 1 as well as in Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986)に記述されている。 Laboratory Press, are described Cold Spring Harbor, in NY, 1986). 同様の方法を他のトランスジェニック動物の作製のために用いる。 Using an analogous procedure for the production of other transgenic animals. トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2導入遺伝子の存在並びに/または動物の組織もしくは細胞におけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAの発現に基づいて同定することができる。 A transgenic founder animal, based on the expression of hVR-1, hVR-2 and rVR-2 hVR-1 in tissues or cells in the presence and / or animals of the transgene, hVR-2 and RVR-2 mRNA in its genome it can be identified. 次に、トランスジェニック創始動物を用いて導入遺伝子を保有するさらなる動物を育種することができる。 Then, it is possible to breed additional animals carrying the transgene using transgenic founder animal. さらに、hVR-1 In addition, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物を他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物に交配させることができる。 It can be crossed with transgenic animals carrying a transgene encoding a hVR-2 and RVR-2 protein to other transgenic animals carrying other transgenes.

【0125】 相同的組み換え動物を作製するために、欠失、付加または置換が導入されておりそれによりhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊するhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。 [0125] To create a homologous recombinant animal, deletions, alter the addition or substitution has been introduced thereby hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene, disrupting example functionally hVR- 1, to prepare a vector containing at least a portion of the hVR-2 and RVR-2 gene. VR-1またはVR-2遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば、配列番号:1、3、5、4、 VR-1 or VR-2 gene is a human gene (e.g., SEQ ID NO: 1,3,5,4,
6、7または9のcDNA)であることができるが、より好ましくは、hVR-1及びhVR- Can 6, 7, or 9 which is a cDNA), and more preferably, hVR-1 and hVR-
2遺伝子の非ヒト相同物である(例えば、配列番号:10もしくは12のcDNAまたは配列番号:1、3、5、4、6、7もしくは9のヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたcDNA)。 2 is a non-human homologous those genes (e.g., SEQ ID NO: 10 or 12 cDNA or SEQ ID NO: isolated by stringent hybridization with 1,3,5,4,6,7 or 9 nucleotide sequence It has been cDNA). 例えば、マウスVR-2遺伝子を用いてマウスゲノム中の内在性VR-2遺伝子を改変するために適当な相同的組換え核酸分子、例えばベクターを構築することができる。 For example, it is possible to construct a suitable homologous recombination nucleic acid molecule to modify the endogenous VR-2 gene in the mouse genome using the mouse VR-2 gene, for example a vector. ある態様として、相同的組換え核酸分子は、相同的組換えの際に、内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子が機能的に破壊されるように設計される(すなわち、もはや機能性タンパク質をコードしない;「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる)。 As an embodiment, the homologous recombination nucleic acid molecule, upon homologous recombination, the endogenous hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene is designed to be functionally disrupted (i.e., no longer It does not encode a functional protein; also referred to as a "knock out" vector). あるいはまた、 Alternatively,
相同的組換え核酸分子は、相同的組み換えの際に、内在性hVR-1、hVR-2及びrVR- Homologous recombination nucleic acid molecule, upon homologous recombination, the endogenous hVR-1, hVR-2 and rVR-
2遺伝子が突然変異を受けるかそうでなければ改変されるが、それでもなお機能性タンパク質をコードするように設計することができる(例えば、上流調節領域を改変してそれにより内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現を改変することができる)。 2 gene is altered or otherwise undergo mutation, but can be designed still to encode a functional protein (e.g., whereby endogenous hVR-1 to modify the upstream regulatory region, it is possible to alter the expression of the hVR-2 and RVR-2 protein). 相同的組換え核酸分子において、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の改変部分には、相同的組換え核酸分子により保有される外来hVR-1、hVR-2 In homologous recombination nucleic acid molecule, hVR-1, hVR-2 and the modified portion of the RVR-2 gene, exogenous hVR-1 carried by the homologous recombination nucleic acid molecule, hVR-2
及びrVR-2遺伝子と細胞、例えば胚性幹細胞中の内在性hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子間で相同的組換えが起こるようにその5'及び3'末端でhVR-1、hVR-2及びrV And RVR-2 gene and cells such hVR-1 at its 5 'and 3' ends as endogenous hVR-1 embryonic stem cells, hVR-2 and homologous recombination between the RVR-2 gene occurs, hVR-2 and rV
R-2遺伝子の付加的核酸配列が隣接する。 Additional nucleic acid sequence of R-2 gene is adjacent. 隣接する付加的hVR-1、hVR-2及びrVR-2 Adjacent additional hVR-1, hVR-2 and RVR-2
核酸配列は、内在性遺伝子と相同的組換えができるために十分な長さのものである。 Nucleic acid sequence is of sufficient length in order to be the endogenous gene and homologous recombination. 典型的には、(5'及び3'末端の両方で)数キロ塩基の隣接するDNAが相同的組換え核酸分子中に含まれる(相同的組換えベクターの説明については、例えば、Thomas, KR及びCapecchi, MR (1987) Cell 51:503を参照)。 Typically, (5 'and 3' at both ends) adjacent DNA of several kilobases description of Included (homologous recombination vector in homologous recombination nucleic acid molecule, for example, Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: see 503). 相同的組換え核酸分子を(例えば、電気穿孔により)細胞、例えば胚性幹細胞系中に導入し、そして導入したhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子が内在性hVR-1、hVR-2及びr The phases homologous recombination nucleic acid molecule (e.g., by electroporation) cells, for example, introduced into an embryonic stem cells system and introduced hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene endogenous hVR-1, HVR 2 and r
VR-2遺伝子と相同的に組換えられている細胞を選択する(例えば、Li, E. et al Phase in the same manner as VR-2 gene to select cells are recombinant (e.g., Li, E. et al
.(1992)Cell 69:915を参照)。 . Refer to 915): (1992) Cell 69. 次に、選択した細胞を動物(例えばマウス)の胚盤胞中に注入して集合キメラを形成する(例えば、Bradley, A. Teratocarcinom Then, the selected cells to form an animal (e.g. a mouse) injected to aggregation chimeras to blastocyst of (eg, Bradley, A. Teratocarcinom
as and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach中, EJ Robertson 編集(IRL, Oxford, 1987) pp.113-152を参照)。 as and Embryonic Stem Cells: in A Practical Approach, EJ Robertson editing (IRL, Oxford, 1987) see pp.113-152). 次に、キメラ胚を適当な偽妊娠メス仮親動物中に移植し、胚を出産させることができる。 Then, they implanted the chimeric embryo into a suitable pseudopregnant female foster animal, it is possible that the embryo brought to term. 生殖細胞中に相同的に組換えられたDNAを保有する子孫を用いて、導入遺伝子の生殖細胞系伝達により動物の全ての細胞が相同的に組換えられたDNAを含有する動物を育種することができる。 Using the descendants carrying homologously recombined DNA in the germ cells, that all cells of the animal by germline transmission of the transgene to breed animals containing the homologously recombined DNA can. 相同的組換え核酸分子、例えばベクターまたは相同的組換え動物を構築する方法は、Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 Homologous recombination nucleic acid molecule, the method for constructing the example vectors or homologous recombinant animals, Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829
並びにLe Mouellec et al.によるPCT国際公開WO第90/11354号; Smithies et al. And PCT International Publication No. WO 90/11354 According to Le Mouellec et al;. Smithies et al.
による WO第91/01140号; Zijlstra et al.による WO第92/0968号;及びBerns et No. WO 91/01140 by;. Zijlstra et al in accordance WO No. 92/0968; and Berns et
al.によるWO第93/04169号にさらに記述されている。 It is further described in WO 93/04169 by al..

【0126】 別の態様として、導入遺伝子を調節発現できる選択系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。 [0126] As another embodiment, it is possible to produce a transgenic nonhuman animals containing selected systems that can regulate expression of the transgene. そのような系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxP組換え酵素系である。 An example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. cre/loxP組換え酵素系の説明については、例えば、Lakso et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 For a description of the cre / loxP recombinase system, eg, Lakso et al (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:..... 6232-6236
を参照。 See. 組換え酵素系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエのFLP組換え酵素系である(O'Gorman et al.(1991) Science 251:1351-1555)。 Another example of a recombinase system is the FLP recombinase system of Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al (1991) Science 251:. 1351-1555). 導入遺伝子の発現を調節するためにcre/loxP組換え酵素系を用いる場合、Cre組換え酵素及び選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。 If in order to regulate expression of the transgene using cre / loxP recombinase system, it is necessary animals containing transgenes encoding both the Cre recombinase and a selected protein.
そのような動物は、例えば、選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有するもの及び組換え酵素をコードする導入遺伝子を含有するものの2匹のトランスジェニック動物を交配させることによる、「二重」トランスジェニック動物の構築により提供することができる。 Such animals, e.g., by mating two animals transgenic animals but contains a transgene encoding and those recombinant enzyme containing a transgene encoding a selected protein, "double" trans it can be provided by the construction of a transgenic animal.

【0127】 本明細書に記述する非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut [0127] Non-human transgenic animal clones described herein can also, Wilmut
, I. et al. (1997) Nature 385:810-813並びにPCT国際公開WO第97/07668号及び , I. et al (1997) Nature 385:. 810-813 and PCT International Publication No. WO 97/07668 and
WO第97/07669号に記述されている方法に従って作製することもできる。 It can also be produced according to the methods described in WO 97/07669. 簡潔に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖周期を出てG 0期に入るように誘導することができる。 Briefly, it can be induced to cells from transgenic animals, e.g., a somatic cell isolated and enter G 0 phase exit the growth cycle. 次に、静止細胞を単離したものと同じ種の動物からの除核卵母細胞に、例えば電気パルスの使用により、静止細胞を融合させることができる。 Next, the quiescent cells to an enucleated oocyte from an animal of the same species as isolated, for example, by the use of electrical pulses, it is possible to fuse the quiescent cells. 次に、再構成した卵母細胞が桑実胚または胚盤胞に発生するようにそれを培養し、次に偽妊娠メス仮親動物に移す。 Then, culturing it as reconstructed oocyte occurs morula or blastocyst and then transferred to pseudopregnant female foster animal. このメス仮親動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンである。 Offspring born from this female foster animal, the cells, for example, the somatic cell is a clone of the isolated animals. IV. IV. 製薬学的組成物本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のフラグメント並びに抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体(本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる)は、投与のために適当な製薬学的組成物中に導入することができる。 HVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule, hVR-1, fragment of hVR-2 and RVR-2 protein and anti -hVR-1 of a pharmaceutical composition the present invention, an anti -hVR-2 and anti (also referred to herein as "active compounds") -rVR-2 antibodies can be introduced into a suitable pharmaceutical composition for administration. そのような組成物は、典型的に、該核酸分子、タンパク質または抗体及び製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。 Such compositions typically comprise the nucleic acid molecule, protein, or antibody and a pharmaceutically acceptable carrier. 本明細書において用いる場合、「製薬学的に許容しうる担体」という用語には、製薬学的投与に適合するいずれか及び全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が包含されるものとする。 As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier which may be" any and all solvents compatible with pharmaceutical administration, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic shall agents and absorption delaying agents, and the like. 製薬学的に有効な物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。 The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. あらゆる通常の媒質または薬剤は、活性化合物と配合禁忌でない限り、組成物におけるそれらの使用が考えられる。 Any conventional media or agent is unless incompatible with the active compound, contemplated for use thereof in the compositions. 補足的活性化合物もまた組成物中に導入することができる。 Supplementary active compounds can also be introduced into the composition.

【0128】 本発明の製薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように調合される。 [0128] A pharmaceutical composition of the invention is formulated to be compatible with its intended route of administration. 投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜及び直腸投与が包含される。 Examples of routes of administration include parenteral, eg, intravenous, intradermal, subcutaneous, oral (eg, inhalation), transdermal (topical), transmucosal and rectal administration are included. 非経口、皮内または皮下用途のために用いる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる:注入用の水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌した希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファー及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性の調整のための薬剤。 Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal, or subcutaneous application can include the following components: water for injection, saline solution, fixed oils, polyethylene glycols, glycerine, propylene glycol or other chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; diluent and sterilized as synthetic solvents acetates, citrates or phosphate agents for tonicity adjustment, such as buffers and sodium chloride or dextrose such as an acid salt. pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。 pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. 非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアル中に封入することができる。 The parenteral preparation can be enclosed glass or plastic ampoules, disposable syringes or multiple dose vials.

【0129】 注入可能な用途のために適当な製薬学的組成物には、滅菌した水溶液(水溶性の場合)または分散液及び滅菌した注入可能な溶液または分散液の必要に応じた調製のための滅菌した粉末が包含される。 [0129] Suitable pharmaceutical compositions for injectable use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile injectable solutions or dispersions for the preparation according to the needs of the sterile powder is included in. 静脈内投与のために、適当な担体には生理食塩水、静菌水、Cremophor EL TM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が包含される。 For intravenous administration, physiological saline to a suitable carrier, bacteriostatic water, Cremophor EL TM (BASF, Parsippany , NJ) or phosphate buffered saline (PBS) and the like. 全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、そして容易に注入できる程度に流動性であるべきである。 In all cases, the composition must be sterile and should be a fluid to the extent that easy syringability exists. それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。 It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. 担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)並びにこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒質であることができる。 Carriers are, for example, water, ethanol, polyol (e.g. glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, and the like) and be a solvent or dispersion medium containing suitable mixtures thereof. 適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、そして界面活性剤の使用により保つことができる。 Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and can be maintained by the use of surfactants. 微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により行うことができる。 Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, can be performed parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. 多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。 In many cases, isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, may include sodium chloride in the composition. 注入可能な組成物の遷延吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによりもたらすことができる。 Prolonged absorption of the injectable compositions of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin can be brought about by including in the composition.

【0130】 滅菌した注入可能な溶液は、必要に応じて、上に挙げた成分のいずれかまたは組み合わせと共に適当な溶媒中に必要な量の活性化合物(例えば、hVR-1、hVR-2 [0130] Sterile injectable solutions may optionally amounts of active compound required in an appropriate solvent with one or a combination of ingredients enumerated above (for example, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質のフラグメントまたは抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体)を導入し、続いて濾過滅菌により調製することができる。 And fragments or anti -hVR-1 of RVR-2 protein, by introducing anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibody), followed can be prepared by filtered sterilization. 一般に、分散液は、基本分散媒質及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌した賦形剤中に活性化合物を導入することにより調製される。 Generally, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle which contains the required other ingredients from those enumerated basic dispersion medium and the above. 滅菌した注入可能な溶液の調製のための滅菌した粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、 In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, methods of preparation are vacuum drying and freeze drying,
それにより先に滅菌濾過した溶液からあらゆる付加的な要求される成分を加えた有効成分の粉末が生じる。 Whereby powder of the active ingredient plus any additional required components from the solution a previously sterile-filtered results.

【0131】 一般に、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。 [0131] Generally, the oral compositions include an inert diluent or an edible carrier. それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に圧縮することができる。 They can be or compressed into tablets enclosed in gelatin capsules. 経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。 For the purpose of oral therapeutic administration, the active compound is mixed with excipients and used in the form of tablets, it can be used in the form of troches, or capsules. 経口組成物はまた、口内洗浄剤としての使用のために液体担体を用いて調製することもでき、その場合、液体担体中の化合物は経口的に投与され、さっと動かされ、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。 Oral compositions also can be prepared using a fluid carrier for use as a mouthwash, in which case the compound in the fluid carrier is administered orally, or moved quickly, and be discharged swallowed. 製薬学的に適合した結合剤及び/または添加剤材料を組成物の一部として含むことができる。 The pharmaceutically binder and / or additive material adapted can be included as part of the composition. 錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は以下の成分のいずれかまたは同様の性質の化合物を含有することができる:微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのような結合剤;澱粉もしくはラクトースのような賦形剤;アルギン酸、Primogelもしくはコーンスターチのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesのような潤滑剤;コロイド二酸化ケイ素のような減摩剤(glidant);ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料;またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料のような香料。 Tablets, pills, capsules, troches and the like can contain compounds of either or similar nature of the following ingredients: microcrystalline cellulose, a binder such as gum tragacanth or gelatin; starch or as lactose excipients; alginic acid, Primogel, or corn starch; a lubricant such as magnesium stearate or Sterotes; colloidal dioxide lubricants such as silicon (glidants); sucrose or sweeteners such as saccharin; or peppermint, fragrances such as methyl salicylate or orange flavoring.

【0132】 吸入による投与のために、組成物は適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。 [0132] For administration by inhalation, the compositions suitable propellant, are delivered in the form of an aerosol spray from e.g. pressured container or dispenser which contains a gas such as carbon dioxide or a nebulizer.

【0133】 全身投与はまた経粘膜または経皮手段によってもよい。 [0133] Systemic administration can also be by transmucosal or transdermal means. 経粘膜または経皮投与のために、透過する障壁に対して適当な浸透剤を製剤中に用いる。 For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the formulation to the transmission to the barrier. そのような浸透剤は一般に当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与のためには、溶剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が包含される。 Such penetrants are generally known in the art, for example, for transmucosal administration, solvents, bile salts and fusidic acid derivatives is encompassed. 経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬の使用により実施することができる。 Transmucosal administration can be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. 経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野において一般に既知であるような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに調合される。 For transdermal administration, the active compound is generally an ointment such as known in the art, salves, are formulated into a gel or cream.

【0134】 化合物はまた、直腸送達のために座薬(例えば、ココアバター及び他のグリセリドのような通常の座薬基剤を有する)または停留浣腸の形態に調製することもできる。 The compounds also can be prepared in the form of suppositories (e.g., with conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas for rectal delivery.

【0135】 一つの態様として、活性化合物は、移植及びマイクロカプセル化送達系を包含する制御放出製剤のような、体からの迅速な除去から化合物を保護する担体を用いて調製される。 [0135] In one embodiment, the active compounds, such as a controlled release formulation including transplantation and microencapsulated delivery systems are prepared with carriers that will protect the compound against rapid elimination from the body. エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。 Ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, biodegradable, biocompatible polymers such as polyorthoesters, and polylactic acid. そのような製剤の調製方法は当業者に明らかである。 Methods for preparation of such formulations will be apparent to those skilled in the art.
それらの材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.からも市販されている。 These materials can also, Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, are also commercially available from Inc.. (ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを包含する)リポソーム懸濁液もまた、製薬学的に許容しうる担体として用いることができる。 Liposomal suspensions (liposomes including the infected cells targeted with monoclonal antibodies to viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. これらは、例えば米国特許第4,522,811 These include, for example U.S. Patent 4,522,811
号に記述されているような、当業者に既知である方法により調製することができる。 As described in JP, it can be prepared by methods known to those skilled in the art.

【0136】 投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、単位剤形に経口または非経口組成物を調合することが特に有益である。 [0136] For uniformity of ease and dosage of administration, it is especially advantageous to formulate oral or parenteral compositions in unit dosage form. 本明細書において用いる場合、単位剤形は、処置する被験体のために単位投薬量として適当な物理的に分割された単位をさし;各単位は、必要な製薬学的担体と会合して適切な治療効果をもたらすように計算された予め定められた量の活性化合物を含有する。 As used herein, the unit dosage form, suitable physically refers to divided unit as unitary dosages for the subject to be treated; each unit, in association with the required pharmaceutical carrier containing the active compound calculated predetermined amount so as to provide appropriate therapeutic effect. 本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独特な特性及び得られる特定の治療効果並びに個体の処置のためにそのような活性化合物を調合する当該技術分野に固有の制約により決定され、そしてそれらに直接依存する。 The specification for the dosage unit forms of the present invention is determined in the art of compounding such an active compound for the treatment of unique properties and the particular therapeutic effect as well as individuals obtained the active compounds by the inherent limitations, and them to directly dependent.

【0137】 そのような化合物の毒性及び治療効能は、例えばLD50(集団の50%に致死的な用量)及びED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することができる。 [0137] The toxicity and therapeutic efficacy of such compounds, for example, LD50 (the dose lethal to 50% of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50% of the population) cell cultures or for determining the it can be determined by standard pharmaceutical procedures in experimental animals. 毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、それは比率LD50 /ED50として表すことができる。 The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio, LD50 / ED50. 大きい治療指数を示す化合物が好ましい。 Compounds which exhibit large therapeutic indices are preferred. 有毒な副作用を示す化合物を用いることができるが、感染していない細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑え、それにより副作用を減らすために、冒された組織の部位にそのような化合物を向ける送達系を設計することに注意が払われるべきである。 It may be used compounds that exhibit toxic side effects, minimizing potential damage to uninfected cells and thereby directs to reduce side effects, such compounds to the site of affected tissue delivery it should be paid attention to design the system.

【0138】 細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定めることに用いることができる。 [0138] The data obtained from cell culture assays and animal studies can be used to define a range of dosage for use in humans. そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性なしにED50を含む循環濃度の範囲内にある。 The dosage of such compounds lies preferably almost within a range of circulating concentrations that include the ED50 entirely without toxicity. 投薬量は、用いる剤形及び利用する投与経路によりこの範囲内で変わる可能性がある。 Dosage may vary within this range by the dosage form employed and the route of administration utilized. 本発明の方法に用いるあらゆる化合物に対して、治療的に有効な用量を最初に細胞培養アッセイから概算することができる。 For any compound used in the method of the present invention, the therapeutically effective dose can be initially estimated from cell culture assays. 細胞培養において決定したようなIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて用量を定めることができる。 IC50 as determined in cell culture (i.e., the concentration of the test compound which achieves a half-maximal inhibition of symptoms) can be defined a dose in animal models to achieve a circulating plasma concentration range that includes the. そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。 Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. 血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。 Levels in plasma, for example, can be measured by high performance liquid chromatography.

【0139】 本明細書において定義する場合、タンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量(すなわち、有効投薬量)は、約0.001~30mg/kg体重、好ましくは約0.01 [0139] As defined herein, a therapeutically effective amount of protein or polypeptide (i.e., an effective dosage) ranges from about 0.001 ~ 30mg / kg body weight, preferably about 0.01
~25mg/kg体重、より好ましくは約0.1~20mg/kg体重、さらにより好ましくは約1 ~ 25 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 ~ 20 mg / kg body weight, even more preferably about 1
~10mg/kg、2~9mg/kg、3~8mg/kg、4~7mg/kgまたは5~6mg/kg体重である。 ~ 10mg / kg, 2 ~ 9mg / kg, which is 3 ~ 8mg / kg, 4 ~ 7mg / kg or 5 ~ 6 mg / kg body weight. 当業者は、疾病または疾患の重さ、以前の処置、被験体の一般的な健康及び/または年齢並びに存在する他の疾病を包含するがこれらに限定されるものではないある種の因子が被験体を効果的に処置するために必要とされる投薬量に影響を及ぼす可能性があることを認識する。 Those skilled in the art, the weight of the disease or disorder, previous treatments, certain factors subject encompasses the general health and / or age, as well as other diseases that are present in the subject but is not limited thereto It recognizes that may affect the dosage required to effectively treat the body. さらに、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体の治療的に有効な量での被験体の処置は、単一の処置を含むことができ、または好ましくは一連の処置を含むことができる。 Furthermore, proteins, treatment of a subject with a therapeutically effective amount of the polypeptide or antibody can include a single treatment or, preferably, can include a series of treatments. 好ましい例として、被験体を約0.1~ Preferred examples, from about 0.1 to a subject
20mg/kg体重の間の範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドで約1~10週の間、好ましくは2~8週の間、より好ましくは約3~7週の間、さらにより好ましくは約 Antibodies in the range between 20 mg / kg body weight, during the protein or polypeptide at about 1-10 weeks, preferably between 2 to 8 weeks, more preferably between about 3 to 7 weeks, and even more preferably about
4、5または6週間、週に1回処置する。 4, 5, or 6 weeks, treatment once a week. 処置に使用する抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効投薬量は、特定の処置の経過にわたって増加または減少する可能性があることもまた認識される。 Antibodies for use in the treatment, an effective dosage amount of a protein or polypeptide is also recognized that there may increase or decrease over the course of a particular treatment. 投薬量の変更は、本明細書に記述するような診断アッセイの結果に起因し、そしてそれらから明らかになる可能性がある。 Changes in dosage, due to the results of diagnostic assays as described herein, and it may become apparent from them.

【0140】 本発明は、発現または活性を調節する作用因子を包含する。 [0140] The present invention encompasses agents that modulate expression or activity. 作用因子は、例えば小分子であることができる。 Agent may be for example a small molecule. 例えば、そのような小分子には、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を包含する)、1モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、1モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、1モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物及び塩、エステル並びにそのような化合物の他の製薬学的に許容しうる形態が包含されるがこれらに限定されるものではない。 For example, such small molecules, peptides, peptidomimetics, amino acids, amino acid analogs, polynucleotides, polynucleotide analogs, nucleotides, nucleotide analogs, organic or inorganic having a molecular weight less than about 10,000 grams per mole compounds (i.e., including hetero-organic compounds and organometallic compounds), organic or inorganic compounds having a molecular weight less than about 5,000 grams per mole, organic or inorganic compounds having a molecular weight less than about 1,000 grams per mole, 1 mole organic or inorganic compounds and salts having a molecular weight less than about 500 grams per Although esters and other pharmaceutically acceptable forms of such compounds are included but not limited thereto.

【0141】 小分子作用因子の適当な用量は、当該(ordinarily skilled)医師、獣医または研究者の認識の範囲内の多数の因子により決まることが理解される。 [0141] Suitable doses of a small molecule agent is the (ordinarily skilled) doctor, be determined by a number of factors within the recognition of veterinary or researcher is understood. 小分子の用量(1つまたは複数)は、例えば、処置する被験体またはサンプルの本質、大きさ及び状態により、さらに、適用できる場合、組成物が投与される経路、及び小分子が本発明の核酸またはポリペプチドに対して有することを専門家が望む作用により変わる。 Doses of a small molecule (s), for example, the nature of the subject or sample being treated, the size and condition, further, when applicable, the route composition is administered, and small molecules of the present invention having the nucleic acid or polypeptide varies by action of expert wants.

【0142】 典型的な用量には、被験体またはサンプルの重さのkg当たりmgまたはμg量の小分子(例えば、約1μg/kg~約500mg/kg、約100μg/kg~約5mg/kgまたは約1μg/k [0142] Exemplary doses, subject or sample weight of kg per mg or μg amounts of the small molecule (e.g., about 1 [mu] g / kg ~ about 500 mg / kg, about 100 [mu] g / kg ~ about 5 mg / kg or about 1μg / k
g~約50μg/kg)が包含される。 g ~ about 50 [mu] g / kg) are included. さらに、小分子の適当な用量は、調節される発現または活性に関する小分子の効能により決まることが理解される。 Furthermore, appropriate doses of a small molecule, it depends on the potency of the small molecule with respect to the expression or activity to be modulated is understood. そのような適当な用量は、本明細書に記述するアッセイを用いて決定することができる。 Such appropriate dose can be determined using the assays described herein.

【0143】 本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために1つまたはそれ以上のこれらの小分子を動物(例えばヒト)に投与する場合、医師、獣医または研究者は、例えば、最初は比較的低用量を処方し、続いて適当な応答が得られるまで用量を増やすことができる。 [0143] When these small molecules one to modulate the expression or activity of a polypeptide or nucleic acid or more of the present invention is administered to an animal (e.g. a human), a physician, veterinarian, or researcher may, for example, , prescribe a relatively low dose at first, subsequently appropriate response can be increased the dose until obtained. さらに、あらゆる特定の動物被験体の特定の用量レベルは、用いる特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、一般的な健康、性別及び飲食物、投与の期間、投与の経路、排出の速度、あらゆる薬物組み合わせ並びに調節される発現または活性の程度を包含する様々な因子により決まることが理解される。 Furthermore, the specific dose level for any particular animal subject, the activity of the specific compound employed, the age of the subject, weight, general health, sex and food, duration of administration, route of administration, the rate of discharge it determined by a variety of factors, including the extent of any drug combination, as well as expression or activity to be modulated is understood.

【0144】 本発明の核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。 [0144] The nucleic acid molecules of the invention can be inserted into vectors and used as gene therapy vectors. 遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与(米国特許第 Gene therapy vectors may, for example, intravenous injection, local administration (U.S. Pat. No.
5,328,470号を参照)によるかまたは定位固定注入(例えば、Chen et al.(1994) According or stereotactic injection into see No. 5,328,470) (e.g., Chen et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照)により被験体に送達することができる。 .... Proc Natl Acad Sci USA 91: see 3054-3057) makes it possible to deliver to the subject. 遺伝子治療ベクターの製薬学的調製物は、許容しうる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達媒体が埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでなることができる。 The pharmaceutical preparation of the gene therapy vector can comprise a slow release matrix in which can include the gene therapy vector in an acceptable diluent, or the gene delivery vehicle is embedded. あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞から完全に製造することができる場合(例えばレトロウイルスベクター)、製薬学的調製物は遺伝子送達系を製造する1個またはそれ以上の細胞を含むことができる。 Alternatively, complete if the gene delivery vector can be fabricated entirely from recombinant cell (e.g., a retroviral vector), that pharmaceutical preparations containing one or more cells which produce the gene delivery system can.

【0145】 製薬学的組成物は、投与説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に入れることができる。 [0145] The pharmaceutical composition can be placed in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. V. V. 本発明の使用及び方法本明細書に記述する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同物及び抗体は、1 Nucleic acid molecules described uses and methods herein of the present invention, proteins, protein homologues, and antibodies 1
つまたはそれ以上の以下の方法において用いることができる:a)スクリーニングアッセイ;b)予測医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング及び薬理遺伝学);及びc)処置の方法(例えば、治療的及び予防的)。 One or more may be used in the following methods: a) screening assays; b) predictive medicine (eg, diagnostic assays, prognostic assays, monitoring and pharmacogenetics clinical trials); and c) methods of treatment (e.g. , therapeutic and prophylactic). 本明細書に記述するように、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は1つまたはそれ以上の以下の活性を有し:(1)非hVR-1、非hVR-2及び非rVR- As described herein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein of the present invention has one or more of the following activities: (1) non-hVR-1, non-hVR-2 and non-rVR-
2タンパク質分子、例えばカプサイシンのようなバニロイド化合物と相互作用する;(2)細胞内カルシウム濃度を調節する;(3)hVR-1、hVR-2及びrVR-2依存性シグナル伝達経路を活性化する;そして(4)痛みシグナリング機構を調節する、従って、例えば、(1)非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2タンパク質分子との相互作用を調節するため;(2)細胞内カルシウム濃度を調節するため;(3)hV 2 protein molecules, for example, interacts with vanilloid compounds such as capsaicin; (2) adjusting the intracellular calcium concentration; (3) activates the hVR-1, hVR-2 and RVR-2-dependent signaling pathways ; and regulate (4) pain signaling mechanisms, thus, for example, (1) non-hVR-1, for modulating the interaction of non-hVR-2 and non-RVR-2 protein molecule; (2) intracellular calcium to adjust the concentration; (3) hV
R-1、hVR-2及びrVR-2依存性シグナル伝達経路を活性化するため;及び4)痛みシグナリング機構を調節するために用いることができる。 To activate the R-1, hVR-2 and RVR-2 dependent signaling pathway; and 4) pain signaling mechanisms can be used to adjust the.

【0146】 本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに記述するように、hVR-1、hVR-2 [0146] Isolated nucleic acid molecules of the present invention, as further described below, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質を発現させるため(例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組換え発現ベクターにより)、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNA(例えば生物学的サンプル中)またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の遺伝子変化を検出するため及びhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節するために用いることができる。 And for expressing the RVR-2 protein (e.g., by recombinant expression vector in a host cell in gene therapy applications), hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA (e.g., in a biological sample) or hVR- can be used to modulate 1, hVR-2 and RVR-2 to detect a genetic alteration in a gene and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、天然に存在するhVR-1、hVR-2及びrVR-2 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 naturally occurring
基質をスクリーニングするため、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の不十分なもしくは過剰な生産またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質形態の生産を特徴とする疾患(例えば痛み疾患)を処置するために用いることができる。 To screen for substrates, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 and hVR-1 for screening drugs or compounds that modulate the activity, hVR-2 and RVR-2 insufficient or excessive production or protein hVR-1, hVR-2 and rVR-2 hVR-1 with reduced or aberrant activity compared to the wild type protein, hVR-2 and disorders characterized by production of RVR-2 protein form (e.g. pain disorders ) it can be used to treat. さらに、本発明の抗-hVR-1、抗-hVR-2及び抗-rVR-2抗体は、hVR-1 In addition, anti -hVR-1, anti -hVR-2 and anti--rVR-2 antibodies of the present invention, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2タンパク質を検出し、単離するため、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 , For detecting and hVR-2 and RVR-2 protein, isolated, hVR-1, hVR-2 and RVR-2
タンパク質の生物学的利用能を調節するため及びhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節するために用いることができる。 It can be used to modulate the bioavailability of proteins and to adjust the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity. A. A. スクリーニングアッセイ : 本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に結合するか、例えばhVR-1、hV Screening Assays: The invention, hVR-1, hVR-2 and binds to RVR-2 protein, e.g., hVR-1, hV
R-2及びrVR-2発現もしくはhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性に対する刺激もしくは阻害作用を有するかまたは例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2基質の発現もしくは活性に対する刺激もしくは阻害作用を有するモジュレーター、すなわち、候補もしくは試験化合物または作用因子(例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬物)を同定する方法(本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)を提供する。 Stimulation or for R-2 and RVR-2 expression or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 or example hVR-1 have a stimulatory or inhibitory effect on activity, hVR-2 and RVR-2 substrate expression or activity modulators have an inhibitory effect, i.e., candidate or test compounds or agents (e.g., peptides, peptidomimetics, small molecules or other drugs) provides a method of identifying a (also referred to herein as "screening assays") .

【0147】 一つの態様として、本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性の部分の基質である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。 [0147] In one embodiment, the present invention is, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or polypeptide or assay for screening are substrates candidate or test compound biologically active portion thereof I will provide a. 別の態様として、本発明は、 In another aspect, the present invention is,
hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性の部分に結合するかまたはその活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。 Provides an assay for screening hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or polypeptide or binds to a portion of a biologically active or candidate or test compounds which modulate the activity. 本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー;空間的にアドレサブルな(addressable)平行固相または溶液相ライブラリー;解析を必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する当該技術分野において既知の組み合わせライブラリー法における多数の方法のいずれかを用いて得ることができる。 Test compounds of the present invention, biological libraries; spatially addressable for (addressable) parallel solid phase or solution phase libraries; synthetic library methods requiring analysis; the "one-bead one-compound" library method; and it can be in the art including synthetic library methods using affinity chromatography selection obtained using any number of methods in the known combinatorial library method. 生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定され、一方、他の4つの方法は、化合物のペプチド、 The biological library approach is limited to peptide libraries, while the other four approaches are applicable to the compound peptides,
非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用できる(Lam, KS (19 Can be applied to non-peptide oligomer or small molecule libraries (Lam, KS (19
97) Anticancer Drug Des.12:145)。 97) Anticancer Drug Des.12: 145).

【0148】 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術分野において例えば: [0148] Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be, for example, in the art:
DeWitt et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al.(19 ..... DeWitt et al (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:. 6909; Erb et al (19
94) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al.(1994) J. Med. .... 94) Proc Natl Acad Sci USA 91:. 11422; Zuckermann et al (1994) J. Med.
Chem. 37:2678; Cho et al.(1993) Science 261:1303; Carrell et al.(1994)A Chem 37:.. 2678; Cho et al (1993) Science 261:. 1303; Carrell et al (1994) A
ngew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. In ..... Ngew Chem Int Ed Engl 33:... 2059; Carell et al (1994) Angew Chem In
t. Ed. Engl. 33:2061;及びGallop et al.(1994) J. Med. Chem.37:1233に見いだすことができる。 ... T Ed Engl 33:.. 2061; and Gallop et al (1994) J. Med Chem.37: it can be found in 1233.

【0149】 化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques [0149] Libraries of compounds may be presented in solution (eg, Houghten (1992) Biotechniques
13:412-421)、またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (199 13: 412-421), or beads (Lam (1991) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (199
3) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP '409) 3) Nature 364: 555-556), bacteria (Ladner USP 5,223,409), spores (Ladner USP '409)
、プラスミド(Cull et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)上もしくはファージ(Scott及びSmith (1990) Science 249:386-390);(Devlin (1990) S , Plasmids (Cull et al (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869.) Or on phage (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) S
cience 249:404-406);(Cwirla et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378- cience 249:.... 404-406); (. Cwirla et al (1990) Proc Natl Acad Sci 87: 6378-
6382);(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310);(Ladner, 上記)上に与えることができる。 6382); (Felici (1991) J. Mol Biol 222:.. 301-310); (Ladner, can be given on the above).

【0150】 一つの態様として、アッセイは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分を発現する細胞、例えばニューロン細胞を試験化合物と接触させ、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する試験化合物の能力を決定する細胞に基づくアッセイである。 [0150] In one embodiment, the assay includes contacting the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 proteins or cells expressing biologically active portions thereof, for example, neuronal cells with a test compound, hVR-1 a cell based assay for determining the ability of the test compound to modulate the hVR-2 and RVR-2 activity. hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、(例えばTominaga M. et al.(1998)Neuron 21:531- . HVR-1, determining the ability of a test compound to modulate the hVR-2 and RVR-2 activity, (for example, Tominaga M. et al (1998) Neuron 21: 531-
543に記述されているような)例えば全細胞の内側が外(inside-out)及び外側が外(outside-out)の配置におけるパッチ-クランプ記録により例えば細胞内カルシウム濃度または膜脱分極をモニターすることによって測定することができる。 Inner) such as whole cells such as described in 543 outside (inside inside-out) and outside the outer (outside outside-out patch in place of) - monitoring the clamp recording, for example, by intracellular calcium concentration or membrane depolarization it can be measured by. hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、 Determining the ability of a test compound to modulate the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity,
さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2により調節される転写因子の活性をモニターすることより実施することができる。 Furthermore, it can be carried out from monitoring the activity of a transcription factor that is regulated by hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 細胞は例えば哺乳類起源のもの、例えばニューロン細胞であることができる。 Cells can be, for example, of mammalian origin, for example neuronal cells.

【0151】 基質へのhVR-1、hVR-2及びrVR-2結合を調節する試験化合物の能力またはhVR-1 [0151] The ability of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 test compound to modulate the binding to a substrate or hVR-1
、hVR-2及びrVR-2に結合する試験化合物の能力もまた決定することができる。 , It can also be determined the ability of the test compound to bind to hVR-2 and RVR-2. 基質へのhVR-1、hVR-2及びrVR-2結合を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2へのhVR-1、hVR-2及びrVR-2基質の結合が複合体中の標識したhVR-1、hVR-2及びrVR-2基質を検出することにより決定できるようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2基質を放射性同位元素または酵素標識と連結することにより実施することができる。 Determining the ability of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 binding to adjust the test compound to the substrate, for example, hVR-1 to hVR-1, hVR-2 and rVR-2, hVR-2 and radioactive isotopes of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 substrates as can be determined by binding of RVR-2 substrate is detected labeled hVR-1, hVR-2 and RVR-2 substrate in a complex it can be carried out by linking the elements or enzymatic label. hVR-1、hVR-2及びrVR-2に結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2への化合物の結合が複合体中の標識したhVR-1、hVR-2及びrVR-2化合物を検出することにより決定できるように化合物を放射性同位元素または酵素標識と連結することにより実施することができる。 hVR-1, determining the ability of the test compound to bind to hVR-2 and RVR-2, for example, binding of a compound to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 was labeled in the complex hVR -1 can be carried out by coupling a compound with a radioisotope or enzymatic label such can be determined by detecting the hVR-2 and RVR-2 compound. 例えば、化合物(hVR-1、hVR-2及びrVR-2基質)を125 I、 35 S、 14 Cまたは3 Hで直接的または間接的に標識することができ、該放射性同位元素を放射線放射(radioemission)の直接計数によるかまたはシンチレーション計数により検出することができる。 For example, compound (hVR-1, hVR-2 and RVR-2 substrate) to 125 I, 35 S, 14 C or directly or indirectly can be labeled with 3 H, radiation emitting the radioactive isotopes ( it can be detected by either or scintillation counting by direct counting of radioemission). あるいはまた、試験化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、生成物への適当な基質の転化の測定により該酵素標識を検出することができる。 Alternatively, test compounds such as horseradish peroxidase, enzymatically can be labeled with alkaline phosphatase, or luciferase can detect the enzyme label by measuring the appropriate substrate conversion to product.

【0152】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2と相互作用する試験化合物の能力を反応物のいずれの標識もなしに測定することもまた本発明の範囲内である。 [0152] It is also within the scope of the present invention the ability of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 and the test compound to interact measured without any labeling of the reactants. 例えば、化合物または For example, the compound or
hVR-1、hVR-2及びrVR-2のいずれの標識もなしにhVR-1、hVR-2及びrVR-2と化合物との相互作用を検出するために微小生理学的計量装置(microphysiometer)を用いることができる。 Using small physiological metering device (microphysiometer) to detect the interaction of the hVR-1, hVR-2 and hVR-1 without any labels rVR-2, hVR-2 and RVR-2 with the compound be able to. McConnell, HM et al.(1992) Science 257:1906-1912。 McConnell, HM et al (1992) Science 257:. 1906-1912.
本明細書において用いる場合、「微小生理学的計量装置」(例えばCytosensor) As used herein, "micro physiological metering device" (e.g., Cytosensor)
は、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレサブル(light-addressable) Is the rate at which a cell acidifies its environment light addressable (light-addressable)
電位差センサー(LAPS)を用いて測定する分析装置である。 It is an analytical instrument that measures by using a potentiometric sensor (LAPS). この酸性化速度の変化を化合物とhVR-1、hVR-2及びrVR-2間の相互作用の指標として用いることができる。 It can be used Changes in this acidification rate as an indicator of the interaction between the compound and the hVR-1, hVR-2 and RVR-2.

【0153】 さらに別の態様として、本発明のアッセイは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分を試験化合物と接触させ、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分に結合する試験化合物の能力を決定する無細胞アッセイである。 [0153] In yet another embodiment, the assay of the present invention, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 proteins or biologically active portions thereof is contacted with a test compound, hVR-1, hVR-2 it is a cell-free assay to determine the ability of the test compound to bind to and RVR-2 protein or biologically active portions thereof. 本発明のアッセイにおいて使用するhVR-1 hVR-1 used in the assays of the present invention
、hVR-2及びrVR-2タンパク質の生物学的に活性の部分には、非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば高い表面確率スコア(surface probability scores)を有するフラグメントが包含される。 , The biologically active portion of a hVR-2 and RVR-2 protein, non-hVR-1, fragments that participate in interactions with non-hVR-2 and non-RVR-2 molecules, e.g., high surface probability scores ( fragments with Surface probability scores) are included. hVR-1 hVR-1
、hVR-2及びrVR-2タンパク質への試験化合物の結合は、上記のように直接的または間接的のいずれかで決定することができる。 , Binding of the test compound to hVR-2 and RVR-2 protein can be determined either directly or indirectly as described above. ある態様として、アッセイは、hV As one aspect, assays, hV
R-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分をhVR-1、hVR- R-1, hVR-2 and RVR-2 protein or a hVR-1 and biologically active portions thereof, HVR
2及びrVR-2に結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を生成せしめること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること並びにhVR-1、hVR-2及び That allowed to produce a 2 and bind to RVR-2 is contacted with a known compound assay mixture, it and hVR-1 is contacted with the assay mixture with a test compound, hVR-2 and
rVR-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、既知の化合物と比較した場合にhVR-1、hVR-2及びrVR-2またはその生物学的に活性の部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含んでなる。 And determining the ability of a test compound to interact with RVR-2 protein, wherein determining the ability of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and the test compound to interact with, the known the portion of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 or biologically active when compared to compounds comprising determining the ability of preferentially bind to the test compound.

【0154】 別の態様として、アッセイは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分を試験化合物と接触させ、そしてhVR-1、hVR-2及びrVR-2 [0154] As another embodiment, the assay, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 proteins or biologically active portions thereof is contacted with a test compound, and hVR-1, hVR-2 and rVR- 2
タンパク質またはその生物学的に活性の部分の活性を調節する(刺激するまたは阻害する)試験化合物の能力を決定する無細胞アッセイである。 Modulating the activity of a protein or biologically active portion thereof is free assay to determine the ability of (stimulate or inhibit) the test compound. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、直接結合を決定するための上記の方法のいずれかにより、hVR-1、hVR-2及び Determining the ability of a test compound to modulate the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein activity, for example, by any of the methods described above for determining direct binding, hVR-1, HVR 2 and
rVR-2標的分子、例えばカプサイシンのようなバニロイド化合物に結合するhVR-1 RVR-2 target molecule, for example, hVR-1 binding to vanilloid compounds such as capsaicin
、hVR-2及びrVR-2タンパク質の能力を決定することにより実施することができる。 It can be carried out by determining the ability of hVR-2 and RVR-2 protein. hVR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子に結合するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の能力を決定することはまた、瞬時の生体分子相互作用分析(Biomolecular Int hVR-1, hVR-2 and hVR-1 binding to RVR-2 target molecule, it determines the ability of a hVR-2 and RVR-2 protein can also be instantaneous biomolecular interaction analysis (Biomolecular Int
eraction Analysis)(BIA)のような技術を用いて実施することもできる。 eraction Analysis) techniques can also be carried out with such as (BIA). Sjol Sjol
ander, S.及びUrbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345並びにSzabo e ander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal Chem 63:.. 2338-2345 and Szabo e
t al.(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。 ..... T al (1995) Curr Opin Struct Biol 5: 699-705. 本明細書において用いる場合、「BIA」は、反応物のいずれも標識せずに瞬時に生体特異的相互作用を研究するための技術である(例えばBIAcore)。 As used herein, "BIA" are both a technology for studying instantaneously biospecific interactions without labeling reactant (e.g. BIAcore). 表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象の変化を生物学的分子間の瞬時の反応の指標として用いることができる。 It can be used Changes in the optical phenomenon of surface plasmon resonance (SPR) as an indicator of instantaneous reactions between biological molecules.

【0155】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子の下流のエフェクターの活性をさらに調節するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の能力を決定することにより実施することができる。 [0155] As another embodiment, hVR-1, determining the ability of the test compound to modulate the activity of hVR-2 and RVR-2 protein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 downstream target molecules can be carried out by determining the hVR-1, the ability of hVR-2 and RVR-2 protein to further modulate the activity of the effector. 例えば、前記のように、適当な標的に対するエフェクター分子の活性を決定することができ、または適当な標的へのエフェクターの結合を決定することができる。 For example, as described above, it is possible to determine the binding of the effector to an appropriate can determine the activity of the effector molecule to the target, or a suitable target.

【0156】 さらに別の態様として、無細胞アッセイは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分をhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質に結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を生成せしめること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、hVR-1、hVR-2 [0156] In yet another embodiment, the cell-free assay, hVR-1, binding portions of hVR-2 and RVR-2 protein or biologically active hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein to be allowed to generate by contacting a known compound assay mixture, determining the ability of the assay mixture that is contacted with the test compounds and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and the test compound to interact hints, here, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、hVR-1 And determining the ability of a test compound to interact with RVR-2 protein, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調節するhVR- It regulates preferentially binds to or its activity hVR-2 and RVR-2 target molecule hVR-
1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の能力を決定することを含んでなる。 1, comprising determining the ability of the hVR-2 and RVR-2 protein.

【0157】 本発明の無細胞アッセイは、単離されたタンパク質(例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはその生物学的に活性の部分)の可溶性及び/または膜結合形態の両方を容易に使用することができる。 [0157] Cell-free assays of the present invention, isolated proteins (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or biologically active portions thereof) soluble and / or membrane-bound forms of both can be easily used. 単離されたタンパク質の膜結合形態を用いる無細胞アッセイの場合、単離されたタンパク質の膜結合形態が溶液中に保たれるように可溶化剤を利用することが望ましい可能性がある。 In the case of cell-free assays using a membrane bound form of the isolated protein, membrane-bound form of the isolated protein might be desirable to utilize a solubilizing agent to be kept in solution. そのような可溶化剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton R X-100、Triton R X-114、Thesit R 、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル) n 、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-1- Examples of such solubilizing agents, n- octylglucoside, n- dodecyl glucoside, n- dodecyl maltoside, octanoyl -N- methyl glucamide, decanoyl -N- methyl glucamide, Triton R X-100, Triton R X-114, Thesit R, Isotorideshipori (ethylene glycol ether) n, 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio mini o] -1
プロパンスルホネート(CHAPS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)またはN-ドデシル=N, Propane sulfonate (CHAPS), 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio mini o] -2-hydroxy-1-propane sulfonate (CHAPSO) or N- dodecyl = N,
N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートのような非イオン性溶剤が包含される。 Non-ionic solvent, such as N- dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate, and the like.

【0158】 本発明の上記アッセイ方法の1つより多くの態様において、hVR-1、hVR-2及び [0158] In more than one embodiment of the above assay methods of the present invention, hVR-1, hVR-2 and
rVR-2とその標的分子の一方または両方の複合体形成していない形態から複合体形成したものの分離を容易にするため並びにアッセイの自動化に対応するためにこれらのタンパク質のいずれかを固定することが望ましい可能性がある。 Possible to fix either of these proteins to well to corresponding automation of the assay to RVR-2 from one or both of the forms of uncomplexed form of its target molecule to facilitate separation of those complexed it may be desirable. 候補化合物の存在下及び非存在下でのhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質への試験化合物の結合または標的分子とhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質との相互作用は、 Interaction with hVR-1, hVR-2 and hVR-1 and binding or target molecule of the test compound to the RVR-2 protein, hVR-2 and RVR-2 protein in the presence and absence of a candidate compound ,
反応物を含有するために適当なあらゆる容器中で実施することができる。 The reaction can be carried out in a suitable any vessel for containing. そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管及びミクロ遠心管が包含される。 Examples of such vessels include microtiter plates, test tubes, and microcentrifuge tubes and the like. 一つの態様として、これらのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。 In one embodiment, one or both of these proteins may provide a fusion protein that adds a domain that is bound to the matrix. 例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/hVR-1、hVR-2及びrVR-2融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St.Louis, MO)またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次にそれらを試験化合物または試験化合物と吸着していない標的タンパク質もしくはhVR-1、hVR-2 For example, glutathione -S- transferase / hVR-1, hVR-2 and RVR-2 fusion proteins or glutathione -S- transferase / target fusion proteins glutathione sepharose beads (Sigma Chemical, St.Louis, MO) or glutathione derivatized micro It can be adsorbed onto microtiter plates, then the target protein or hVR-1 is not adsorbed them with test compound or the test compound, hVR-2
及びrVR-2タンパク質のいずれかと組み合わせ、そして複合体形成を導く条件下で(例えば、塩及びpHに関して生理的条件で)混合物をインキュベートする。 And combined with any of the RVR-2 proteins, and under conditions conducive to complex formation (e.g., at physiological conditions for salt and pH) mixture is incubated. インキュベーション後に、あらゆる結合していない成分を除くためにビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように直接的または間接的のいずれかで複合体を測定する。 After incubation, the beads or microtiter plate wells are washed to remove any unbound components, in the case of beads to fix the matrix, for example, a direct or indirect complex in any of the above taking measurement.
あるいはまた、複合体をマトリックスから解離させ、標準的な技術を用いてhVR- Alternatively, the complexes can be dissociated from the matrix, using standard techniques hVR-
1、hVR-2及びrVR-2結合または活性のレベルを決定することができる。 1, it is possible to determine the level of hVR-2 and RVR-2 binding or activity.

【0159】 マトリックス上にタンパク質を固定する他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。 [0159] Other techniques for immobilizing proteins on matrices can also be used in the screening assays of the present invention. 例えば、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用してhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2標的分子のいずれかを固定することができる。 For example, it is possible to fix either of biotin and hVR-1 utilizing conjugation of streptavidin, hVR-2 and RVR-2 protein or a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 target molecule. ビオチニル化したhVR-1、 hVR-1 was biotinylated,
hVR-2及びrVR-2タンパク質または標的分子を当該技術分野において周知の技術( hVR-2 and RVR-2 protein or target molecule known in the art technology (
例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製し、ストレプトアビジンを被覆した96穴プレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定することができる。 For example, biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) using a biotin -NHS (N-hydroxy - be Ill), to secure the streptavidin in the wells of the coated 96 well plates (Pierce Chemical) it can. あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または標的分子と反応するが、h Alternatively, it reacts with hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or target molecule, h
VR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質のその標的分子への結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導化し、結合していない標的またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を抗体結合によりウェル中に捕捉することができる。 VR-1, induced into the wells of the plate which does not interfere with the binding of the hVR-2 and RVR-2 to its target molecule protein, the bound target or hVR-1 does not, hVR-2 and RVR-2 protein it can be trapped in the wells by antibody conjugation. そのような複合体を検出する方法には、GST固定化複合体について上に記述したものに加えて、hVR Methods for detecting such complexes, in addition to those described above for the GST-immobilized complexes, hVR
-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または標的分子と関連する酵素活性を検出することによる酵素結合検定法が包含される。 -1, detecting an enzymatic activity associated with the immunodetection and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or target molecule complexes using antibodies reactive with hVR-2 and RVR-2 protein or target molecule enzyme-linked assays due are included.

【0160】 別の態様として、細胞を候補化合物と接触させ、細胞におけるhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質の発現を決定する方法においてhVR-1、hVR-2及び [0160] As another embodiment, cells are contacted with a candidate compound, hVR-1, hVR-2 and in hVR-1, hVR-2 and RVR-2 method for determining the mRNA or protein expression in a cell
rVR-2発現のモジュレーターを同定する。 To identify modulators of rVR-2 expression. 候補化合物の存在下でのhVR-1、hVR-2 hVR-1 in the presence of a candidate compound, hVR-2
及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質の発現のレベルを候補化合物の非存在下でのhV And hV the level of expression of the RVR-2 mRNA or protein in the absence of the candidate compound
R-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。 Compared to R-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA or the level of expression of the protein. 次にこの比較に基づいて候補化合物をhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現のモジュレーターとして同定することができる。 Then it is possible to identify candidate compounds on the basis of this comparison as modulators of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression. 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその非存在下でより多い(統計学的に有意に多い)場合、該候補化合物はhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。 For example, hVR-1, greater (statistically significantly greater) in the absence in the presence of a hVR-2 and RVR-2 mRNA or expression candidate compound protein case, the candidate compound is hVR-1 It is identified as a stimulator of hVR-2 and RVR-2 mRNA or protein expression. あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその非存在下でより少ない(統計学的に有意に少ない)場合、該候補化合物はhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。 Alternatively, hVR-1, (less statistically significant) less in its absence in the presence of a hVR-2 and RVR-2 mRNA or expression candidate compound protein case, the candidate compound is hVR- 1, is identified as hVR-2 and RVR-2 mRNA or inhibitors of protein expression. 細胞におけるhVR-1、hVR-2及び hVR-1, hVR-2 and in the cell
rVR-2 mRNAまたはタンパク質発現のレベルは、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはタンパク質を検出するために本明細書に記述する方法により決定することができる。 RVR-2 mRNA or the level of protein expression can be determined by methods described herein for detecting the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA or protein.

【0161】 本発明のさらに別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質は、hVR-1 [0161] In yet another aspect of the present invention, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2に結合するかまたはそれと相互作用し(「hVR-1-結合タンパク質」、「hVR-2-結合タンパク質」及び「rVR-2-結合タンパク質」または「hVR-1- , HVR-2 and binds to RVR-2 or interact with it ( "hVR-1-binding protein", "hVR-2-binding protein" and "RVR-2-binding protein" or "hVR-1-
bp」、「hVR-2-bp」及び「rVR-2-bp」)、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性に関与する他のタンパク質を同定するために、2-ハイブリッドアッセイまたは3-ハイブリッドアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al.(1993) Cell 72 bp "," hVR-2-bp "and" RVR-2-bp "), to identify other proteins involved in hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity, two-hybrid assay or three - hybrid assay (e.g., U.S. Pat. No. 5,283,317;. Zervos et al (1993) Cell 72
:223-232; Madura et al.(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et :... 223-232; Madura et al (1993) J. Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel et
al.(1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al.(1993) Oncogene 8:16 . Al (1993) Biotechniques 14:. 920-924; Iwabuchi et al (1993) Oncogene 8:16
93-1696;及びBrent WO94/10300を参照)における「餌タンパク質」として用いることができる。 It can be used as "bait proteins" in and see Brent WO94 / 10300); 93-1696. そのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2-結合タンパク質はまた、例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2によりもたらされるシグナリング経路、例えば痛みシグナリング経路の下流要素としてhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはhVR-1 Such hVR-1, hVR-2 and RVR-2-binding proteins are also, for example, hVR-1, signaling pathway caused by the hVR-2 and RVR-2, for example, hVR-1 as a downstream element of pain signaling pathway, hVR-2 and RVR-2 protein or a hVR-1
、hVR-2及びrVR-2標的によるシグナルの伝播にも関与していると思われる。 Appears to be involved in the propagation of signals by hVR-2 and RVR-2 targets. あるいはまた、そのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2-結合タンパク質は、hVR-1、hVR-2 Alternatively, such a hVR-1, hVR-2 and RVR-2-binding protein, hVR-1, hVR-2
及びrVR-2インヒビターであると思われる。 And it appears to be RVR-2 inhibitors.

【0162】 2-ハイブリッド系は、分離可能なDNA結合ドメイン及び活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュール性質に基づく。 [0162] 2-hybrid system is based on the modular nature of most transcription factors, which consist of separable DNA-binding and activation domains. 簡潔に言えば、該アッセイは2 Briefly, the assay 2
種の異なるDNA構築物を利用する。 To use the seeds of different DNA constructs. 一方の構築物において、hVR-1、hVR-2及びrVR In one construct, hVR-1, hVR-2 and rVR
-2タンパク質をコードする遺伝子を既知の転写因子(例えばGAL-4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。 The gene encoding 2 protein is fused to a gene encoding the DNA binding domain of a known transcription factor (eg, GAL-4). もう一方の構築物において、同定されていないタンパク質(「餌食」または「サンプル」)をコードするDNA配列のライブラリーからのDNA配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。 In other constructs, fusing the DNA sequence of the unidentified protein ( "prey" or "sample") from a library of DNA sequences encoding a gene that codes for the activation domain of the known transcription factor. 「餌」及び「餌食」タンパク質がインビボで相互作用することができ、hVR-1、hVR-2及びrVR-2依存的複合体を形成する場合、転写因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインは接近する。 Can "bait" and "prey" proteins interact in vivo, hVR-1, the case of forming a hVR-2 and RVR-2-dependent complex, DNA-binding and activation domains of the transcription factor approach to. この接近により、転写因子に応答する転写調節部位に操作可能に連結されているレポーター遺伝子(例えばLacZ)が転写される。 This proximity reporter gene is operably linked to a transcriptional regulatory site responsive to the transcription factor (e.g., LacZ) is transferred. レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離して用いてhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化された遺伝子を得ることができる。 It can be used to detect expression of the reporter gene was cloned encoding a functional transcription factor and cell colonies containing using isolated hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein interacting proteins it is possible to obtain the gene.

【0163】 本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な作用因子に関する。 [0163] The present invention further relates to novel agents identified by the above-described screening assays. 従って、本明細書に記述するように同定される作用因子を適当な動物モデルにおいてさらに使用することは本発明の範囲内である。 Therefore, to further use an agent identified as described herein in an appropriate animal model is within the scope of the present invention. 例えば、本明細書に記述するように同定される作用因子(例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2調節因子、アンチセンスhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸分子、hVR-1、hVR-2及びrVR-2特異的抗体またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2結合相手)は、そのような作用因子での処置の効能、毒性または副作用を決定するために動物モデルにおいて用いることができる。 For example, the agent identified as described herein (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 modulators, antisense hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid molecule, hVR-1 , hVR-2 and RVR-2 specific antibodies or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 binding partner) is the efficacy of the treatment with such agents, in an animal model to determine the toxicity or side effects it can be used. あるいはまた、本明細書に記述するように同定される作用因子は、そのような作用因子の作用機構を決定するために動物モデルにおいて用いることができる。 Alternatively, the agent identified as described herein can be used in an animal model to determine the mechanism of action of such agents. さらに、本発明は、本明細書に記述するような処置のための上記スクリーニングアッセイにより同定される新規な作用因子の使用に関する。 Furthermore, the present invention relates to the use of novel agents identified by the above-described screening assays for treatments as described herein. B. B. 検出アッセイ本明細書において同定するcDNA配列の一部またはフラグメント(及び対応する完全な遺伝子配列)は、ポリヌクレオチド試薬として多様に用いることができる。 Portions or fragments of the cDNA sequences identified in detection assays herein (and the corresponding complete gene sequences) can be used variously as polynucleotide reagents. 例えば、これらの配列は:(i)染色体上にそれらのそれぞれの遺伝子をマッピングし;従って、遺伝病と関連する遺伝子領域の位置を突き止めるため;( For example, these sequences: (i) mapping of their respective genes on a chromosome; therefore, to locate gene regions associated with genetic disease; (
ii)微量の生物学的サンプルから個体を同定するため(組織タイピング);及び(iii)生物学的サンプルの司法同定を助けるために用いることができる。 ii) to identify individuals from biological samples traces (tissue typing); can be used to help judicial identification of and (iii) a biological sample. これらの用途を以下の小節において記述する。 Describing these applications in the following subsections.

【0164】 1. [0164] 1. 染色体マッピングいったん遺伝子の配列(または配列の一部)が単離されると、この配列を用いて染色体上の該遺伝子の位置をマッピングすることができる。 When Chromosome Mapping Once the sequence of a gene (or part of the sequence) is isolated, it is possible to map the location of the gene on the chromosome using this arrangement. この工程は染色体マッピングと呼ばれる。 This process is called chromosome mapping. 従って、本明細書に記述するhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列の一部またはフラグメントは、染色体上にhVR-1、hVR-2及びrVR- Accordingly, portions or fragments of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequences described herein, hVR-1, hVR-2 and on the chromosome rVR-
2遺伝子の位置をマッピングするために用いることができる。 It can be used to map the location of the 2 gene. 染色体へのhVR-1、 hVR-1 into the chromosome,
hVR-2及びrVR-2配列のマッピングは、疾病と関連する遺伝子とこれらの配列を相関させることにおける重要な第一段階である。 Mapping hVR-2 and RVR-2 sequences is an important first step in correlating genes and these sequences associated with disease.

【0165】 簡潔に言えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列からPCRプライマー(好ましくは15-25bpの長さ)を調製することにより染色体にマッピングすることができる。 [0165] Briefly, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene, hVR-1, hVR-2 and PCR primers from RVR-2 nucleotide sequence (the length of preferably 15-25 bp) prepared it can be mapped to chromosomes by. ゲノムDNAにおいて1個より多くのエキソンにまたがらず、従って増幅工程を複雑にしないプライマーを予測するためにhVR-1、hVR-2及びrVR-2配列のコンピューター分析を用いることができる。 Not span more exons from one in genomic DNA, thus can be used Computer analysis of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequences to predict primers that do not complicate the amplification process.
次にこれらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの Then these primers, the somatic cell hybrids containing individual human chromosomes
PCRスクリーニングのために用いることができる。 It can be used for PCR screening. hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。 Only those hybrids containing the human gene corresponding to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequences will yield an amplified fragment.

【0166】 体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類(例えば、ヒト及びマウス細胞)からの体細胞を融合させることにより調製される。 [0166] Somatic cell hybrids are different mammals (e.g., human and mouse cells) are prepared by fusing somatic cells from. ヒト及びマウス細胞のハイブリッドは、増殖して分裂するにつれて任意の順序でヒト染色体を徐々に喪失するが、マウス染色体を保持する。 Hybrids of human and mouse cells, but gradually lose human chromosomes in any order as to divide growing is holding the mouse chromosome. マウス細胞は特定の酵素を欠くので増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含有する1個のヒト染色体が保持される。 Mouse cells can not grow because they lack a particular enzyme, human cells by using a medium capable of growing, one human chromosome that contains the gene encoding an enzyme required is maintained. 様々な培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルを樹立することができる。 By using various media, it is possible to establish a panel of hybrid cell lines. パネル中の各細胞系は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれかと完全な一組のマウス染色体を含有し、特定のヒト染色体への個々の遺伝子の容易なマッピングを可能にする(D Each cell line in a panel contains either a complete set of mouse chromosomes of a single human chromosome or a small number of human chromosomes, allowing easy mapping of individual genes to specific human chromosomes ( D
'Eustachio P. et al.(1983) Science 220:919-924)。 . 'Eustachio P. et al (1983) Science 220: 919-924). 転座および欠失を有するヒト染色体を用いることによりヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドを作製することもできる。 It is also possible to produce a somatic cell hybrids containing only fragments of human chromosomes by using translocations and human chromosome with a deletion.

【0167】 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定の配列を定めるための迅速な方法である。 [0167] PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for determining a particular sequence to a particular chromosome. 1台のサーマルサイクラーを用いて1日あたり3またはそれ以上の配列を定めることができる。 It can be defined three or more sequences per day using a single thermal cycler. オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列を用いて、特定の染色体からのフラグメントのパネルで次位置決定(sublocalization)を実施することができる。 Using hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequences to design oligonucleotide primers, it can be performed following position determination (sublocalization) in panels of fragments from specific chromosomes. hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列をその染色体にマッピングするために同様に用いることができる他のマッピング方法には、インサイチューハイブリダイゼーション(Fan, Y. et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6223-27に記述される)、標識したフローソーティングした染色体での前スクリーニング及び染色体特異的cDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションによる前選択が包含される。 Other mapping strategies that can similarly be used to map the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequence at its chromosome, in situ hybridization (Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl ... Acad Sci USA 87: 6223-27 is described), before selection by hybridization to the previous screening and chromosome specific cDNA libraries with labeled flow sorted chromosomes, and the like.

【0168】 さらに、1段階で正確な染色体位置を与えるために中期染色体散在物へのDNA [0168] In addition, DNA to a metaphase chromosomal scattered material to provide a precise chromosomal location in one step
配列の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を用いることができる。 It can be used fluorescent in situ hybridization (FISH) of the array. 染色体散在物は、紡錘体を壊すコルセミドのような化学製品により分裂が中期に止められている細胞を用いて作製することができる。 Chromosomal scattered material may be split by chemical products such as colcemid breaking spindle is produced using cells that have stopped in the medium term. これらの染色体をトリプシンでしばらくの間処理し、次にギムザで染色することができる。 These chromosomes can be treated for some time with trypsin, and then stained with Giemsa. 明暗バンドのパターンが各染色体上に現れ、その結果、染色体を個々に同定することができる。 Pattern of light and dark bands appear on each chromosome so that it is possible to identify the chromosomal individually. FISH技術は、500または600塩基程度の短いDNA配列で用いることができる。 FISH technology can be used in a DNA sequence as short as 500 or 600 bases.
しかしながら、1,000塩基より大きいクローンは、簡単な検出のために十分なシグナル強度で唯一の染色体位置に結合する可能性がより高い。 However, clones larger than 1,000 bases have a higher likelihood of binding to a unique chromosomal location with sufficient signal intensity for simple detection. 好ましくは1,000 Preferably from 1,000
塩基、より好ましくは2,000塩基が合理的な時間量で良好な結果を得るために十分である。 Bases, more preferably sufficient to 2,000 bases to obtain good results in a reasonable amount of time. この技術の総説については、Verma et al., Human Chromosomes: AM For a review of this technique, Verma et al, Human Chromosomes:. AM
anual of Basic Techniques(Pergamon Press, New York 1988)を参照。 anual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988) see.

【0169】 単一の染色体もしくはその染色体上の単一部位を示すために染色体マッピングの試薬を個々に用いることができ、または複数の部位及び/もしくは複数の染色体を示すために試薬のパネルを用いることができる。 [0169] Reagents chromosomal mapping to indicate a single site on a single chromosome or a chromosome can be used individually, or using a panel of reagents to indicate the plurality of sites and / or multiple chromosomes be able to. 実際には、遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬がマッピング目的のためである。 In fact, reagent corresponding to noncoding regions of the genes is for mapping purposes. コーディング配列は遺伝子ファミリー内で保存されている可能性が高く、従って、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの機会を増やす。 Coding sequence is likely to have been conserved within gene families, thus, increase the chance of cross hybridization during chromosomal mapping.

【0170】 いったん配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の該配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。 [0170] Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical position of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. (そのようなデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで利用できる、V. McKusick、 Mendelian Inheritance in Manに見出される) (Such data may, for example, available online through Johns Hopkins University Welch Medical Library, V. McKusick, found in Mendelian Inheritance in Man)
. 次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾病の関係を、例えばEgel Next, the relationship between genes and diseases that are mapped to the same chromosomal region, for example Egel
and, J. et al.(1987) Nature、325:783-787に記述されている連鎖分析(物理的に隣接する遺伝子の共遺伝)により同定することができる。 and, J. et al (1987) Nature, 325:. can be identified by 783-787 linkage are described in the analysis (coinheritance of physically adjacent genes).

【0171】 さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子と関連する疾病に冒された個体と冒されていない個体間のDNA配列の違いを決定することができる。 [0171] Further, it is possible to determine the difference in hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene and DNA sequences between individuals unaffected and affected individuals in related diseases. 突然変異が冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、冒されていない個体においては認められない場合、該突然変異は特定の疾病の原因因子であると思われる。 Mutations are found in some or all of the affected individuals, if not observed in individuals unaffected, it seems the mutation is the causative agent of the particular disease.
冒された個体と冒されていない個体との比較は、一般に、染色体散在物から明白であるかまたはそのDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失または転座のような、染色体中の構造変化をまず調べることを含む。 Comparison with affected individuals and affected non individual, generally, such as detectable deletions or translocations using PCR based on whether or DNA sequence is apparent from the chromosome scattered material, in a chromosome It comprises determining structural changes first. 最終的には、突然変異の存在を確かめるため及び突然変異を多型と区別するために数個体からの遺伝子の完全なシークエンシングを実施することができる。 Finally, it is possible to implement the complete sequencing of genes from several individuals to distinguish and mutant To confirm the presence of mutations and polymorphisms.

【0172】 2. [0172] 2. 組織タイピング本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2配列はまた、微量の生物学的サンプルから個体を同定するために用いることもできる。 HVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequence of tissue typing the present invention can also be used to identify individuals from biological samples traces. 例えば、米国陸軍は、その人員の同定のために制限断片長多型(RFLP)の使用を考慮している。 For example, the US Army, contemplates the use of restriction fragment length polymorphism (RFLP) for identification of its personnel. この技術では、個体のゲノムDNAを1種またはそれ以上の制限酵素で消化し、そしてサザンブロット上でプローブで調べて同定のために独特なバンドを生成せしめる。 In this technique, an individual's genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes, and allowed to produce a unique band for identified probed on a Southern blot. この方法は、失われるか、交換されるかまたは奪われる可能性があり、明白な同定を困難にする「認識票(Dog Tags)」の現在の制約を欠点として持たない。 This method is either lost, there are or deprived possibility is exchanged, no current limitations of "identification tag (Dog Tags)" which makes it difficult to unambiguous identification as disadvantages. 本発明の配列は、 Sequences of the present invention,
(米国特許5,272,057に記述されている)RFPLのさらなるDNAマーカーとして有用である。 Are useful as additional DNA markers for (U.S. Patent 5,272,057 is described in) RFPL.

【0173】 さらに、本発明の配列は、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのDN [0173] In addition, sequences of the present invention, DN for each actual base selected portions of the genome of an individual
A配列を決定する別の技術を提供するために用いることができる。 It can be used to provide an alternative technique which determines the A sequence. 従って、本明細書に記述するhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列を用いて該配列の5' Accordingly, 5 of the sequence using a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequences described herein '
及び3'末端から2個のPCRプライマーを調製することができる。 And it can be prepared two PCR primers from the 3 'end. 次に、これらのプライマーを用いて個体のDNAを増幅し、続いてそれをシークエンスすることができる。 Then, it is possible to amplify an individual's DNA using these primers, followed by sequencing it.

【0174】 このようにして調製した、個体からの対応するDNA配列のパネルは、各個体が対立遺伝子の違いのためにそのようなDNA配列の独特な一組を持つので、独特な個体の同定を提供することができる。 [0174] was prepared in this way, Panels of corresponding DNA sequences from individuals, because it has a unique set of such DNA sequences for each individual allelic differences, identification of unique individuals it is possible to provide a. 本発明の配列は、個体及び組織からそのような同定配列を得るために用いることができる。 Sequences of the present invention can be used to obtain such identification sequences from individuals and organizations. 本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR- hVR-1, hVR-2 and the present invention rVR-
2ヌクレオチド配列はヒトゲノムの一部を独特に表す。 2 nucleotide sequences uniquely represent portions of the human genome. 対立遺伝子変異はこれらの配列のコーディング領域においてある程度に、そして非コーディング領域においてより大きい程度に起こる。 Allelic variation to some extent in the coding regions of these sequences, and occurs a greater degree in the noncoding regions. 個々のヒト間の対立遺伝子変異は各500塩基当たり約1回の頻度で起こると概算される。 Allelic variation between individual humans is estimated to occur at a frequency of about once per each 500 bases. 本明細書に記述する配列の各々は、ある程度、個体からのDNAを同定目的のために比較することができる基準として用いることができる。 Each described sequence herein, in part, can be used as a reference that can be compared with DNA from an individual for identification purposes. 非コーディング領域にはより多数の多型が存在するので、個体を識別するためにより少ない配列が必要である。 Since the non-coding regions present more numerous polymorphisms requires less sequence by to identify an individual.

【0175】 本明細書に記述するhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列からの一団の試薬を個体の独特な同定データベースを作製するために用いる場合、それらの同じ試薬を後でその個体からの組織を同定するために用いることができる。 [0175] If the reagent gang from herein described hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequence used to generate a unique identification database for an individual, that the same reagent them later it can be used to identify tissue from an individual. 独特な同定データベースを用いて、生存するかまたは死亡した個体の明白な同定を極めて少量の組織サンプルから実施することができる。 Using a unique identification database, can be performed unambiguous identification of or deceased individuals surviving from very small tissue samples.

【0176】 3. [0176] 3. 司法生物学における部分hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列の使用 DNAに基づく同定技術はまた、司法生物学において用いることもできる。 Identification techniques based on the use DNA portion hVR-1, hVR-2 and RVR-2 sequences in judicial biology may also be used in judicial biology. 司法生物学は、例えば、犯罪の加害者を明白に同定するための手段として犯罪現場で見い出された生物学的証拠の遺伝子タイピングを用いる科学分野である。 Judicial biology, for example, is a scientific field using genotyping of biological evidence found at a crime scene as a means to unambiguously identify the perpetrators of crimes. そのような同定を行うために、PCR技術を用いて、犯罪現場で見い出された組織、例えば毛髪もしくは皮膚、または体液、例えば血液、唾液もしくは精液のような非常に少量の生物学的サンプルから採取されるDNA配列を増幅することができる。 To make such an identification, using PCR technology harvested tissue found in a crime scene, such as the hair or skin, or body fluids, such as blood, from a very small amount of biological sample such as saliva or semen it can amplify DNA sequences. 次に、増幅配列を基準と比較することができ、それにより生物学的サンプルの起源を同定することができる。 It can then be compared to a reference amplification sequence, whereby it is possible to identify the origin of the biological sample.

【0177】 本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的とするポリヌクレオチド試薬、例えばPCRプライマーを提供するために用いることができ、これらは、 [0177] The sequences of the present invention are polynucleotide reagents to target specific loci in the human genome, can be used to provide for example PCR primers, these,
例えば、別の「同定マーカー」(すなわち、特定の個体に特有である別のDNA配列)を提供することによりDNAに基づく司法同定の信頼性を高めることができる。 For example, another "identification marker" (i.e. another DNA sequence that is unique to a particular individual) can increase the reliability of the judicial identification based on DNA by providing a. 上記のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素で生じたフラグメントにより形成されるパターンの正確な代わりとして同定のために用いることができる。 As mentioned above, actual base sequence information can be used for identification as an accurate alternative to patterns formed by fragments generated by restriction enzymes. ポリヌクレオチド試薬の例には、hVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列またはその一部、例えば、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基の長さを有する配列番号:1、3、4、6、7、9、10または11に由来するフラグメントが包含される。 Examples of polynucleotide reagents, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequence or a portion thereof, such as at least 20 bases, SEQ ID NO: preferably has a length of at least 30 bases: 1,3,4 , fragments derived from 6, 7, 9, 10 or 11, and the like.

【0178】 さらに、本明細書に記述するhVR-1、hVR-2及びrVR-2ヌクレオチド配列は、特定の組織、例えば脳組織を同定するために例えばインサイチューハイブリダイゼーション技術において用いることができるポリヌクレオチド試薬、例えば標識したまたは標識可能なプローブを提供するために用いることができる。 [0178] Further, hVR-1 described herein, hVR-2 and RVR-2 nucleotide sequence, a polynucleotide that can be used in a particular tissue, for example, for example, in situ hybridization technology to identify brain tissue reagents can be used to provide, for example, labeled or labelable probes. これは、司法病理学者が未知の起源の組織を与えられる場合に非常に有用である可能性がある。 This can be very useful when the judicial pathologist given tissue of unknown origin. そのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2プローブのパネルは、種及び/または器官タイプにより組織を同定するために用いることができる。 Panel such hVR-1, hVR-2 and RVR-2 probes can be used to identify tissue by species and / or organ type.

【0179】 同様に、これらの試薬、例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2プライマーまたはプローブは、汚染に関して組織培養物をスクリーニングする(すなわち、培養物中の細胞の異なるタイプの混合物の存在に関してスクリーニングする)ために用いることができる。 [0179] Similarly, the presence of these reagents, e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 primers or probes for screening a tissue culture with respect to contamination (i.e., mixtures of different types of cells in culture screening) can be used for terms.

【0180】 C. [0180] C. 予測医学 : 本発明はまた、予後(予測)目的のために診断アッセイ、予後アッセイ及び臨床試験のモニタリングを用いてそれにより個体を予防的に処置する予測医学の分野にも関する。 Predictive medicine: The present invention also relates prognosis (predicted) diagnostic assays for the purpose, to the field of predictive medicine thereby prophylactically treat an individual with a monitoring prognostic assays and clinical trials. 従って、本発明の一つの態様は、生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、組織)に関連して、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質及び/ Accordingly, one aspect of the present invention, a biological sample (e.g., blood, serum, cells, tissue) in association with, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein and /
または核酸発現並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を測定してそれによりある個体が異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現もしくは活性と関連する疾病もしくは疾患に悩まされているかどうか、または疾患を発症する危険にさらされているかどうかを決定するための診断アッセイに関する。 Or suffer from nucleic acid expression as well as hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity abnormality individuals with thereby to measure a hVR-1, diseases or disorders associated with hVR-2 and RVR-2 expression or activity whether it is or relates to diagnostic assays for determining whether the risk of developing the disease. 本発明はまた、ある個体がhVR-1 The present invention also relates to an individual is hVR-1
、hVR-2及びrVR-2タンパク質、核酸発現または活性と関連する疾患を発症する危険にさらされているかどうかを決定するための予後(または予測)アッセイも提供する。 , HVR-2 and RVR-2 protein, the prognosis for determining whether the risk of developing a disease associated with nucleic acid expression or activity (or predictive) assays also provided. 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の突然変異を生物学的サンプルにおいてアッセイすることができる。 For example, it can be assayed in a biological sample mutations hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene. そのようなアッセイを予後または予測目的のために用いてそれによりhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、核酸発現または活性を特徴とするかまたはそれと関連する疾患の発症前に個体を予防的に処置することができる。 Prevention thereby hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, an individual prior to the onset of either or diseases associated with features nucleic acid expression or activity used for such assays prognostic or predictive purpose it can be to treat.

【0181】 本発明の別の態様は、臨床試験においてhVR-1、hVR-2及びrVR-2の発現または活性に対する作用因子(例えば、薬物、化合物)の影響をモニタリングすることに関する。 [0181] Another aspect of the present invention, effects in clinical trials for hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity factors (e.g., drugs, compounds) relates to monitoring the influence of.

【0182】 これら及び他の作用因子を以下の節においてさらに詳細に記述する。 [0182] described in further detail in these and other agents following sections a.

【0183】 1. [0183] 1. 診断アッセイ生物学的サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸の有無を検出する典型的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得ること並びにhV Exemplary methods for detecting the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or the presence or absence of nucleic acid in a diagnostic assay a biological sample, obtaining a biological sample from a test subject and hV
R-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸の存在が該生物学的サンプルにおいて検出されるようにhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質またはhVR-1、hVR-2及びr R-1, hVR-2 and hVR-1 as the presence of RVR-2 protein or nucleic acid is detected in said biological sample, hVR-2 and RVR-2 protein or a hVR-1, hVR-2 and r
VR-2タンパク質をコードする核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNA)を検出することができる化合物または作用因子と生物学的サンプルを接触させることを含む。 Nucleic acid encoding the VR-2 protein (e.g., mRNA, genomic DNA) containing compound can be detected or contacting an agent with a biological sample. hV hV
R-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはゲノムDNAを検出するための作用因子は、hVR-1 Agents for detecting R-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA or genomic DNA is, hVR-1
、hVR-2及びrVR-2 mRNAまたはゲノムDNAにハイブリダイズすることができる標識した核酸プローブである。 A labeled nucleic acid probe capable of hybridizing to hVR-2 and RVR-2 mRNA or genomic DNA. 核酸プローブは、例えば、配列番号:1、3、4、6、7、 The nucleic acid probe can be, for example, SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,
9、10もしくは12の核酸のような全長hVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸、または少なくとも15、30、50、100、250もしくは500ヌクレオチドの長さで且つストリンジェントな条件下でhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAもしくはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドのようなその一部であることができる。 Full length hVR-1, such as a nucleic acid of 9,10 or 12, hVR-2 and RVR-2 nucleic acid or at least 15,30,50,100,250 or 500 nucleotides in hVR in and under stringent conditions with a length, -1 can be a part, such as a sufficient oligonucleotides to specifically hybridize to hVR-2 and RVR-2 mRNA or genomic DNA. 本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適当なプローブは本明細書に記述されている。 Other suitable probes for use in diagnostic assays of the present invention are described herein.

【0184】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質を検出するための作用因子は、hVR-1、hVR- [0184] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 agents for proteins to detect the can, hVR-1, hVR-
2及びrVR-2タンパク質に結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。 Antibodies capable of binding to the 2 and RVR-2 protein, preferably an antibody with a detectable label. 抗体はポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであることができる。 Antibodies can be polyclonal, or more preferably, monoclonal. 完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、FabもしくはF(ab') 2 )を用いることができる。 An intact antibody, or a fragment thereof (e.g., Fab or F (ab ') 2) can be used. プローブまたは抗体に関して「標識した」という用語には、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(すなわち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、 The term "labeled" is with regard to the probe or antibody, coupling a detectable substance to the probe or antibody (i.e., physically linking) direct labeling of the probe or antibody by,
並びに直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識が包含されるものとする。 And directly indirect labeling of the probe or antibody by reactivity with another reagent that is labeled is intended to be included. 間接的標識の例には、蛍光的に標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出及び蛍光的に標識したストレプトアビジンで検出することができるようなビオチンでのDNAプローブの末端標識が包含される。 Examples of indirect labeling include end-labeling of a DNA probe with biotin such that it can be detected by detecting and fluorescently labeled streptavidin of a primary antibody using a fluorescently labeled secondary antibody and the like . 「生物学的サンプル」という用語には、被験体から単離された組織、細胞及び生物学的液体並びに被験体内に存在する組織、細胞及び液体が包含されるものとする。 The term "biological sample", tissue isolated from a subject, cells and biological fluids and tissue present in a subject, it is assumed that the cells and liquid are included. すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ並びにインビボで生物学的サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNA、タンパク質またはゲノムDNAを検出するために用いることができる。 That is, the detection method of the present invention can be used to detect the in vitro and in vivo hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA in a biological sample, protein, or genomic DNA. 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 mRNAの検出のためのインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが包含される。 For example, in vitro techniques for detection of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mRNA, Northern hybridization and in situ hybridization, and the like. hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の検出のためのインビトロ技術には、固相酵素免疫検定法(ELISA)、ウェスタンブロット、 hVR-1, in vitro techniques for detection of hVR-2 and RVR-2 protein, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Western blots,
免疫沈降法及び免疫蛍光法が包含される。 Immunoprecipitation and immunofluorescence, and the like. hVR-1、hVR-2及びrVR-2ゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが包含される。 In vitro techniques for hVR-1, hVR-2 and RVR-2 genomic DNA detection, Southern hybridization, and the like.
さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の検出のためのインビボ技術には、 Furthermore, in vivo techniques for detection of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein,
標識した抗-hVR-1、hVR-2及びrVR-2抗体を被験体中に導入することが包含される。 It is included to introduce a labeled anti -hVR-1, hVR-2 and RVR-2 antibodies in a subject. 例えば、抗体を放射性マーカーで標識することができ、被験体におけるその存在及び位置を標準的な画像形成技術により検出することができる。 For example, it can be labeled with a radioactive marker antibodies can be detected by standard imaging techniques whose presence and location in a subject.

【0185】 一つの態様として、生物学的サンプルは試験被験体からのタンパク質分子を含有する。 [0185] In one embodiment, the biological sample contains protein molecules from the test subject. あるいはまた、生物学的サンプルは試験被験体からのmRNA分子または試験被験体からのゲノムDNA分子を含有することができる。 Alternatively, the biological sample can contain genomic DNA molecules from mRNA molecules or test subject from the test subject. 生物学的サンプルは被験体から常法により単離された血清サンプルである。 Biological sample is a serum sample isolated by conventional methods from the subject.

【0186】 別の態様として、該方法はさらに、コントロール被験体からコントロールの生物学的サンプルを得ること、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在が生物学的サンプルにおいて検出されるようにhVR-1、hVR-2及びr [0186] As another embodiment, the method further obtaining a biological sample of a control from a control subject, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, the presence of mRNA or genomic DNA is biological organisms as detected in the sample hVR-1, hVR-2 and r
VR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAを検出することができる化合物または作用因子とコントロールサンプルとを接触させること並びに試験サンプル中のhVR- VR-2 protein, contacting the compound or agent and control samples can detect mRNA or genomic DNA as well as in the test sample hVR-
1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在とコントロールサンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在とを比較することを含む。 And comparing 1, hVR-2 and RVR-2 protein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in the presence and control samples of mRNA or genomic DNA, the presence of mRNA or genomic DNA.

【0187】 本発明はまた、生物学的サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2の存在を検出するためのキットも包含する。 [0187] The present invention also encompasses kits for detecting the presence of a hVR-1, hVR-2 and RVR-2 in a biological sample. 例えば、キットは、生物学的サンプル中のhVR-1、h For example, the kit, hVR-1, h in a biological sample
VR-2及びrVR-2タンパク質またはmRNAを検出することができる標識した化合物または作用因子;サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2の量を決定するための手段;並びにサンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2の量を基準と比較するための手段を含んでなることができる。 Means for determining the amount of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 in the sample; labeled compound or agent capable of detecting the VR-2 and RVR-2 protein or mRNA as well as in the sample the amount of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 may comprise means for comparing a reference. 該化合物または作用因子は、適当な容器中に包装することができる。 The compound or agent can be packaged in a suitable container. キットはさらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸を検出するためのキットの使用説明書を含んでなることができる。 The kit can further comprise instructions for using the kit to detect the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or nucleic acid.

【0188】 2. [0188] 2. 予後アッセイ本明細書に記述する診断方法はさらに、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性と関連する疾病または疾患にかかっているかまたは発症する危険にさらされている被験体を同定するために利用することができる。 Prognostic Assays Diagnostic methods described herein further aberrant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or subject activity and are at risk of or developing suffering related diseases or disorders it can be utilized to identify. 本明細書において用いる場合、「異常な」という用語には、野生型hVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性から逸脱するhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性が包含される。 As used herein, the term "aberrant" includes wild-type hVR-1, hVR-1 departing from hVR-2 and RVR-2 expression or activity, hVR-2 and RVR-2 expression or activity It is included. 異常な発現または活性には、増加したまたは減少した発現または活性並びに発現の野生型発生パターンまたは発現の細胞以下(subcellular)パターンに従わない発現または活性が包含される。 The aberrant expression or activity, increased or decreased expression or activity and does not follow the wild-type occurrence pattern or following cellular expression (subcellular) pattern of expression expression or activity are included. 例えば、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性には、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の突然変異によりhVR-1、hVR-2及びr For example, abnormal the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity, hVR-1, hVR-1 Mutation of hVR-2 and RVR-2 gene, hVR-2 and r
VR-2遺伝子が不十分に発現されるかまたは過剰に発現される場合並びにそのような突然変異により非機能性hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または野生型のように機能しないタンパク質、例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2リガンドと相互作用しないタンパク質もしくは非hVR-1、非hVR-2及び非rVR-2リガンドと相互作用するものがもたらされる状況が包含されるものとする。 VR-2 gene insufficiently if either expressed or over-expressed and nonfunctional hVR-1 by such mutations, hVR-2 and RVR-2 protein, or does not function as the wild-type protein , and, for example, those hVR-1, hVR-2 and RVR-2 ligand and mutually not act protein or non-hVR-1, the situation of which interacts with a non-hVR-2 and non-RVR-2 ligand is brought encompasses to.

【0189】 前記の診断アッセイまたは以下のアッセイのような本明細書に記述するアッセイは、痛み疾患のような、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質活性または核酸発現における誤った調節と関連する疾患にかかっているかまたは発症する危険にさらされている被験体を同定するために利用することができる。 [0189] Assays described herein, such as the diagnostic assays or the following assays, such as pain diseases, and Misregulation in hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein activity or nucleic acid expression it can be utilized to identify a subject at risk of or developing afflicted with a disease associated. あるいはまた、予後アッセイは、痛み疾患のような、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質活性または核酸発現における誤った調節と関連する疾患にかかっているかまたは発症する危険にさらされている被験体を同定するために利用することができる。 Alternatively, prognostic assays, such as pain diseases, are at risk of or developing suffering hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein activity or modulate diseases associated with a wrong in the nucleic acid expression it can be used to identify the subject. 従って、 Therefore,
本発明は、被験体から試験サンプルを得、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸(例えば、mRNAもしくはゲノムDNA)を検出する、異常なhVR-1、hVR-2 The present invention, to obtain a test sample from a subject, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or nucleic acid (eg, mRNA or genomic DNA) detects an abnormal hVR-1, hVR-2
及びrVR-2発現または活性と関連する疾病または疾患を同定する方法を提供し、 And provides a method for identifying a disease or disorder associated with RVR-2 expression or activity,
その場合、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸の存在は、異常なhVR-1 In that case, the presence of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or nucleic acid, abnormal hVR-1
、hVR-2及びrVR-2発現または活性と関連する疾病または疾患にかかっているかまたは発症する危険にさらされている被験体の診断に役立つ。 , Help diagnose a subject at risk of or developing afflicted with a disease or disorder associated with hVR-2 and RVR-2 expression or activity. 本明細書において用いる場合、「試験サンプル」は、目的の被験体から得られる生物学的サンプルをさす。 As used herein, "test sample" refers to a biological sample obtained from a subject of interest. 例えば、試験サンプルは生物学的液体(例えば血清)、細胞サンプルまたは組織であることができる。 For example, the test sample is a biological fluid (e.g. serum) can be a cell sample or tissue.

【0190】 さらに、本明細書に記述する予後アッセイは、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2 [0190] Furthermore, prognostic assays described herein, aberrant hVR-1, hVR-2 and RVR-2
発現または活性と関連する疾病または疾患を処置するために作用因子(例えば、 Agents for treating a disease or disorder associated with expression or activity (e.g.,
アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、 Agonists, antagonists, peptidomimetics, proteins, peptides, nucleic acids,
小分子または他の薬物候補)を被験体に投与することができるかどうかを決定するために用いることができる。 It can be used to determine whether it is possible to administer a small molecule, or other drug candidate) to a subject. 例えば、そのような方法は、痛み疾患に対して被験体を作用因子で効果的に処置することができるかどうかを決定するために用いることができる。 For example, such methods can be used to determine whether it can be effectively treated with an agent to subject against pain disorders. 従って、本発明は、試験サンプルを得、hVR-1、hVR-2及びrVR- Accordingly, the present invention is to obtain a test sample, hVR-1, hVR-2 and rVR-
2タンパク質または核酸発現または活性を検出する、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR Detecting the 2 protein or nucleic acid expression or activity, abnormal hVR-1, hVR-2 and rVR
-2発現または活性と関連する疾患に対して被験体を作用因子で効果的に処置することができるかどうかを決定する方法を提供する(例えば、その場合、hVR-1、h It provides a method for determining whether it is possible to effectively treat a subject with an agent against diseases associated -2 ​​expression or activity (e.g., in which case, hVR-1, h
VR-2及びrVR-2タンパク質または核酸発現または活性の量は、異常なhVR-1、hVR- The amount of VR-2 and RVR-2 protein or nucleic acid expression or activity, abnormal hVR-1, HVR
2及びrVR-2発現または活性と関連する疾患を処置するために作用因子を投与することができる被験体の診断に役立つ)。 Help diagnose a subject can be administered an agent for treating diseases associated with 2 and RVR-2 expression or activity).

【0191】 本発明の方法はまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の遺伝子変化を検出し、それにより変化した遺伝子を有する被験体が神経変性疾患のようなhVR-1、hVR [0191] The method of the present invention also includes, hVR-1, to detect a genetic change in hVR-2 and RVR-2 gene, hVR-1 subject, such as neurodegenerative diseases with gene altered by it, hVR
-2及びrVR-2タンパク質活性または核酸発現における誤った調節を特徴とする疾患の危険にさらされているかどうかを決定するために用いることもできる。 Can also be used to determine whether the risk of diseases characterized by Misregulation of -2 and RVR-2 protein activity or nucleic acid expression. 態様として、該方法は、被験体からの細胞のサンプルにおいて、hVR-1、hVR-2及びrV As embodiments, the method, in a sample of cells from a subject, hVR-1, hVR-2 and rV
R-2タンパク質をコードする遺伝子の完全な状態に影響を及ぼす少なくとも1つの変化またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の誤った発現を特徴とする遺伝子変化の有無を検出することを含む。 Detecting the presence or absence of a genetic alteration characterized by R-2 protein of the at least one influence the integrity of the gene encoding a change or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene incorrect expression including. 例えば、そのような遺伝子変化は、1)hVR-1 For example, such genetic alterations, 1) hVR-1
、hVR-2及びrVR-2遺伝子からの1個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、2) Deletion of one or more nucleotides from hVR-2 and RVR-2 gene, 2)
hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子への1個またはそれ以上のヌクレオチドの付加; Addition of hVR-1, hVR-2 and one or more nucleotides to RVR-2 gene;
3)hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の1個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、4)hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の染色体再編成;5)hVR-1、hVR-2及びrVR 3) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 1 one or substitution of more nucleotides of a gene, 4) hVR-1, chromosomal rearrangement of hVR-2 and RVR-2 gene; 5) hVR-1, hVR-2 and rVR
-2遺伝子のメッセンジャーRNA転写産物のレベルの変化、6)ゲノムDNAのメチル化パターンのような、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の異常な修飾、7)hVR-1、 Level change of 2 gene messenger RNA transcript, 6) such as of the methylation pattern of the genomic DNA, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene aberrant modification of, 7) hVR-1,
hVR-2及びrVR-2遺伝子のメッセンジャーRNA転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在、8)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の非野生型レベル、9 The presence of a non-wild type splicing pattern of a hVR-2 and RVR-2 gene messenger RNA transcript, 8) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein of a non-wild type levels, 9
)hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子の対立遺伝子喪失並びに10)hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の不適当な翻訳後修飾の少なくとも1つの存在を確かめることにより検出することができる。 ) HVR-1, detected by ascertaining the existence of at least one of hVR-2 and allele loss and 10 of the RVR-2 gene) hVR-1, hVR-2 and inappropriate post-translational modification of the RVR-2 protein be able to. 本明細書に記述するように、hVR-1、hVR-2及び As described herein, hVR-1, hVR-2 and
rVR-2遺伝子中の変化を検出するために用いることができる当該技術分野において既知の多数のアッセイがある。 There are a number of assays known in the art which can be used to detect changes in the RVR-2 gene. 生物学的サンプルは、被験者から常法により単離された組織または血清サンプルである。 Biological sample is isolated tissue or serum samples by conventional methods from the subject.

【0192】 ある態様として、変化の検出は、アンカーPCRまたはRACE PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号を参照)、あるいはまた、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えばLandegran et al. [0192] As an embodiment, detection of the change, the polymerase chain reaction, such as anchor PCR or RACE PCR (PCR) (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202), or alternatively, in a ligation chain reaction (LCR) (for example Landegran et al.
(1988) Science 241:1077-1080;及びNakazawa et al.(1994)Proc. Natl. Acad. (1988) Science 241:... 1077-1080; and Nakazawa et al (1994) Proc Natl Acad.
Sci. USA 91:360-364を参照)におけるプローブ/プライマーの使用を含み、それらの後者は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の点突然変異を検出するために特に有用である可能性がある(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:6 . Sci USA 91: it involves the use of probes / primers in the reference) 360-364, which latter is particularly useful for detecting point mutations hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene there is a possibility (Abravaya et al (1995) Nucleic Acids Res 23:.. 6
75-682を参照)。 See 75-682). この方法は、被験体から細胞のサンプルを集め、サンプルの細胞から核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたは両方)を単離し、(存在する場合)hV The method collects a sample of cells from the subject, nucleic acids from a sample of cells (e.g., genomic, mRNA or both) to isolate an (if present) hV
R-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子のハイブリダイゼーション及び増幅が起こるような条件下でhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子に特異的にハイブリダイズする1個またはそれ以上のプライマーと核酸サンプルとを接触させ、そして増幅産物の有無を検出するか、または増幅産物の大きさを検出しそしてその長さをコントロールサンプルと比較する工程を含むことができる。 R-1, hVR-2 and RVR-2 gene of hybridization and one or more primers which specifically hybridize to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene under conditions such happens amplification and a nucleic acid sample is contacted, and detecting the presence or absence of an amplification product, or detecting the size of the amplification product and can include the step of comparing the length to a control sample. PCR及び/またはLCRは、本明細書に記述する突然変異を検出するために用いる技術のいずれかと共に予備増幅工程として用いることが望ましい可能性があることが予想される。 PCR and / or LCR may be expected that with any of the techniques used for detecting describing mutations herein it may be desirable to use as a preliminary amplification step.

【0193】 別の増幅方法には:自給(self sustained)配列複製(Guatelli, JC et al., [0193] The alternative amplification methods: self-sufficiency (self sustained) sequence replication (Guatelli, JC et al,.
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh, DY e .... 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874-1878), transcriptional amplification system (Kwoh, DY e
t al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-βレプリカーゼ( t al, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:..... 1173-1177), Q-β replicase (
Lizardi,PM et al., 1988, Bio/Technology 6:1197)またはいずれかの他の核酸増幅方法が包含され、続いて当業者に周知の技術を用いて増幅分子を検出する。 . Lizardi, PM et al, 1988, Bio / Technology 6: 1197) or any other nucleic acid amplification methods are encompassed, followed by detecting the amplified molecules using techniques well known to those skilled in the art. これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在する場合にそのような分子を検出するために特に有用である。 These detection schemes are especially useful for detecting such molecules where the nucleic acid molecules are present in very low numbers.

【0194】 別の態様として、サンプル細胞からのhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の突然変異は、制限酵素切断パターンの変化により同定することができる。 [0194] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 mutation in the gene from a sample cell can be identified by alterations in restriction enzyme cleavage patterns. 例えば、サンプル及びコントロールDNAを単離し、(場合により)増幅し、1種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてフラグメント長の大きさをゲル電気泳動により決定し、比較する。 For example, the sample and control DNA is isolated, (optionally) amplified, digested with one or more restriction endonucleases, and the size of the fragment length was determined by gel electrophoresis and compared. サンプルとコントロールDNA間のフラグメント長の大きさの違いは、サンプルDNA中の突然変異を示す。 Differences in fragment length sizes between sample and control DNA indicates mutations in the sample DNA. さらに、リボザイム切断部位の発生または喪失により特定の突然変異の存在について評点するために配列特異的リボザイム(例えば米国特許第5,498,531号を参照)を用いることができる。 Furthermore, it is possible to use a sequence specific ribozymes to score for the presence of specific mutations by development or loss of a ribozyme cleavage site (see, for example U.S. Pat. No. 5,498,531).

【0195】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2中の遺伝子突然変異は、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレーにサンプル及びコントロール核酸、例えばDNAまたはRNAをハイブリダイズさせることにより同定することができる(Cronin, MT et al.(1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal [0195] As another embodiment, hVR-1, hVR-2 and gene mutations in RVR-2 is several hundreds or thousands of samples and control nucleic acid in high-density arrays containing oligonucleotide probes, such as DNA or RNA can be identified by hybridizing (Cronin, MT et al (1996) Human Mutation 7:. 244-255; Kozal
, MJ et al.(1996) Nature Medicine 2:753-759)。 , MJ et al (1996) Nature Medicine 2:. 753-759). 例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2中の遺伝子突然変異は、Cronin, MT et al. 上記に記述されているような光生成(light-generated)DNAプローブを含有する二次元アレーにおいて同定することができる。 For example, hVR-1, hVR-2 and gene mutations in RVR-2 is, Cronin, in MT et al. Two-dimensional array containing a light generation (light-generated) DNA probes as described in the it can be identified. 簡潔に言えば、プローブの一次ハイブリダイゼーションアレーを用いてサンプル及びコントロール中のDNAの長い距離にわたって走査し、連続した重複するプローブの直線状アレーを作製することにより配列間の塩基変化を同定することができる。 Briefly, to identify base changes between the sequences by using the primary hybridization array of probes is scanned over long distances DNA in a sample and control to produce a linear array of continuous overlapping probes can. この工程により点突然変異を同定することができる。 It can be identified point mutations by the process.
この工程の後に二次ハイブリダイゼーションアレーが続き、それは検出された全ての変異体または突然変異に相補的なより小さい特殊化したプローブアレーを用いることにより特定の突然変異を特性化することができる。 After this step is followed by secondary hybridization array, which can characterize the specific mutations by using a probe array was complementary smaller specialized to all variants or mutations detected. 各突然変異アレーは、一方が野生型遺伝子に相補的でありそしてもう一方が突然変異体遺伝子に相補的である平行プローブ組からなる。 Each mutation array is composed of one is complementary to the wild-type gene and the other parallel probe sets are complementary to the mutant gene.

【0196】 さらに別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子を直接シークエンスし、サンプルhVR-1、hVR-2及びrVR-2の配列を対応する野生型(コントロール)配列と比較することにより突然変異を検出するために当該技術分野において既知の様々なシークエンシング反応のいずれかを用いることができる。 [0196] In yet another embodiment, directly sequenced hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene, the sample hVR-1, hVR-2 and wild-type (control) corresponding to the sequence of the RVR-2 sequence any of various known sequencing reactions can be used in the art for detecting mutations by comparison. シークエンシング反応の例には、Maxam及びGilbert((1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560 Examples of sequencing reactions, Maxam and Gilbert ((1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:.... 560
)またはSanger((1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)により開発された技術に基づくものが包含される。 ) Or Sanger ((1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:.... 5463) is based on technology developed encompassed by. 診断アッセイ((1995) Biotechniques 19:448 Diagnostic assays ((1995) Biotechniques 19: 448
)を実施する場合、質量分析によるシークエンシング(例えば、PCT国際公開第W If) carrying out, sequencing by mass spectrometry (e.g., PCT International Publication No. W
O 94/16101号; Cohen et al.(1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162;及びGriffin O No. 94/16101; Cohen et al (1996) Adv Chromatogr 36:... 127-162; and Griffin
et al.(1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を包含する様々な自動シークエンシング法のいずれかを利用できることもまた予想される。 .... Et al (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: is also expected that the 147-159 see) can utilize any of a variety of automated sequencing procedures including.

【0197】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の突然変異を検出する他の方法には、切断剤からの保護を用いてRNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法(Myers et al.(1985) Science 230:1242)が包含される。 [0197] hVR-1, Other methods for detecting mutations in hVR-2 and RVR-2 gene, mismatches in RNA / RNA or RNA / DNA in heteroduplex with protection from cleavage agents method of detecting a base (Myers et al (1985) Science 230:. 1242) and the like. 一般に、「ミスマッチ切断」の当該技術分野の技術は、野生型hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列を含有する(標識した)RNAまたはDNAを組織サンプルから得られた潜在的突然変異体 In general, the technical art of "mismatch cleavage" wild-type hVR-1, containing hVR-2 and RVR-2 sequence (labeled) Potential mutants RNA or DNA obtained from a tissue sample
RNAまたはDNAとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二重鎖を与えることにより開始する。 Starts by providing heteroduplexes formed by RNA or DNA hybridized. コントロールとサンプル鎖間の塩基対ミスマッチのために存在するような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で二本鎖の二重鎖を処理する。 Processing a double-stranded duplex with an agent which cleaves single-stranded regions of the duplex such as exists for base pair mismatches between the control and sample strands. ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、例えば、RNA/DNA二重鎖をRNアーゼで処理することができ、そしてDNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理することができる。 For to enzymatically digest the mismatched regions, e.g., RNA / DNA duplexes to can be treated with RN-ase, and it is possible to process the DNA / DNA hybrids with S1 nuclease. 別の態様として、ミスマッチ領域を消化するために、DNA/ In another embodiment, in order to digest mismatched regions, DNA /
DNAまたはRNA/DNA二重鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、そしてピペリジンで処理することができる。 DNA or RNA / DNA duplexes with hydroxylamine or osmium tetroxide, and can be treated with piperidine. ミスマッチ領域の消化後に、得られた材料を次に変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさにより分離して突然変異の部位を決定する。 After digestion of the mismatched regions, separated by the size and the next denaturing polyacrylamide gels and the resulting material is to determine the site of mutation. 例えば、Cotton et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:43 For example, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:43
97; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295を参照。 .. 97; Saleeba et al (1992) Methods Enzymol 217: see 286-295. ある態様として、コントロールDNAまたはRNAを検出のために標識することができる。 As one embodiment, it can be labeled for detection control DNA or RNA.

【0198】 さらに別の態様として、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルから得られた [0198] In yet another embodiment, the mismatch cleavage reaction, obtained from a sample of cells
hVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNA中の点突然変異の検出及びマッピングのための特定の系において二本鎖DNA中のミスマッチ塩基対を認識する1つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる、「DNAミスマッチ修復」酵素)を用いる。 hVR-1, hVR-2 and RVR-2 one recognizes the double-stranded mismatched base pairs in DNA in particular system for detecting and mapping point mutations in the cDNA or more proteins (so-called, using a "DNA mismatch repair" enzymes). 例えば、エシェリキア・コリのmutY酵素はG/AミスマッチでAを切断し、そしてHeLa細胞からのチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチでTを切断する(Hsu et al.(199 For example, mutY enzyme E. coli cleaves A at G / A mismatches and the thymidine DNA glycosylase from HeLa cells cleaves T at G / T mismatches (Hsu et al. (199
4) Carcinogenesis 15:1657-1662)。 4) Carcinogenesis 15: 1657-1662). 典型的態様により、hVR-1、hVR-2及びrVR- The typical embodiment, hVR-1, hVR-2 and rVR-
2配列、例えば野生型hVR-1、hVR-2及びrVR-2配列に基づくプローブを試験細胞( 2 sequence, for example, a wild-type hVR-1, hVR-2 and probes the test cells based on RVR-2 sequence (
1個またはそれ以上)からのcDNAまたは他のDNA産物にハイブリダイズさせる。 Hybridized to one or cDNA or other DNA product from above).
この二重鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、そしてもしあれば、切断生成物を電気泳動プロトコル等から検出することができる。 The duplex is treated with a DNA mismatch repair enzyme, and, if any, can be detected cleavage products from electrophoresis protocols or the like. 例えば米国特許第5,459,03 For example, US Patent No. 5,459,03
9号を参照。 See No. 9.

【0199】 別の態様として、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子中の突然変異を同定するために電気泳動移動度の変化を用いる。 [0199] As another embodiment, hVR-1, in order to identify mutations of the hVR-2 and RVR-2 gene using a change in electrophoretic mobility. 例えば、突然変異体と野生型核酸間の電気泳動移動度の違いを検出するために一本鎖構造多型(SSCP)を用いることができる(Orita et al.(1989) Proc Natl. Acad. Sci USA:86:2766、 Cotton (1993) Mut For example, it is possible to use single-strand conformation polymorphism to detect differences in electrophoretic mobility between wild-type nucleic acid and mutant (SSCP) (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766, Cotton (1993) Mut
at. Res. 285:125-144;及びHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 .. At Res 285:.... 125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73-79
も参照)。 See also). サンプル及びコントロールhVR-1、hVR-2及びrVR-2核酸の一本鎖DNAフラグメントを変性させ、再生させる。 The samples and controls hVR-1, hVR-2 and single-stranded DNA fragments of RVR-2 nucleic acid is denatured, is reproduced. 一本鎖核酸の二次構造は配列により変わり、その結果生じる電気泳動移動度の変化により単一塩基の変化さえ検出することができる。 The secondary structure of single-stranded nucleic acids varies with the sequence, it is possible to detect even a single base change by a change in electrophoretic mobility resulting. DNAフラグメントを標識するかまたは標識したプローブで検出することができる。 It can be detected at or labeled probe to label the DNA fragments. (DNAよりむしろ)RNAを用いることによりアッセイの感度を高めることができ、その場合、二次構造は配列の変化にさらに感受性である。 (Rather than DNA) can increase the sensitivity of the assay by the use of RNA, in which case, the secondary structure is more sensitive to a change in sequence. ある態様として、該方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する(Keen et al.(1991) Trends Gen As an embodiment, the method for separating the heteroduplex double-stranded molecules based on a change in electrophoretic mobility utilizes heteroduplex analysis (Keen et al. (1991) Trends Gen
et 7:5)。 et 7: 5).

【0200】 さらに別の態様として、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を変性勾配ゲル電気泳動(DGGE) [0200] In yet another embodiment, mutant or wild-type fragments move denaturing gradient gel electrophoresis in polyacrylamide gels containing a gradient of denaturant (DGGE)
を用いてアッセイする(Myers et al.(1985) Nature 313:495)。 Assayed using (Myers et al (1985) Nature 313:. 495). DGGEを分析の方法として用いる場合、例えば、PCRにより約40bpの高融解のGCに富んだDNAのGC When DGGE is used as the method of analysis, for example, GC of DNA rich GC high melting of about 40bp by PCR
クランプを付加することにより、DNAを修飾してそれが完全には変性しないことを保証する。 By adding the clamp, to ensure that the complete it by modifying the DNA is not denatured. さらなる態様として、コントロール及びサンプルDNAの移動度の違いを同定するために変性勾配の代わりに温度勾配を用いる(Rosenbaum及びReiss As a further aspect, using a temperature gradient in place of a denaturing gradient to identify differences in the mobility of control and sample DNA (Rosenbaum and Reiss
ner (1987) Biophys Chem 265:12753)。 ner (1987) Biophys Chem 265: 12753).

【0201】 点突然変異を検出するための他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が包含されるが、これらに制限されるものではない。 [0201] Examples of other techniques for detecting point mutations, selective oligonucleotide hybridization, although selective amplification, or selective primer extension encompassed, but is not limited thereto. 例えば、既知の突然変異が中央に置かれるオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次に完全な一致がある場合にのみハイブリダイゼーションが可能な条件下で標的DNAにハイブリダイズさせることができる(Saiki et al.(1986) Nature 324:163); Saiki et al.(1989) Proc. Natl For example, oligonucleotide primers known mutation is placed in the center can be prepared and hybridized to the target DNA hybridization which can be under conditions only if the next perfect match (Saiki et al. (1986) Nature 324:.. 163); Saiki et al (1989) Proc Natl
Acad. Sci USA 86:6230)。 . Acad Sci USA 86: 6230). そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする膜に結合させ、そして標識した標的DNAとハイブリダイズさせる場合、PCR増幅した標的DNAまたは多数の異なる突然変異にそれらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。 Such allele specific oligonucleotide is bound to hybridize the membrane, and case of labeled target DNA hybridized and hybridized them oligonucleotide to the target DNA or a number of different mutations was PCR amplified.

【0202】 あるいはまた、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と共に用いることができる。 [0202] Alternatively, it is possible to use allele specific amplification technology which depends on selective PCR amplification with the present invention. 特異的増幅のためのプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションによるように)分子の中央に(Gibbs et al.(1989) Nucleic Acids Res.17:2437-2448) Oligonucleotides used as primers for specific amplification (amplification as by differential hybridization) in the center of the molecule (Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res.17:. 2437-2448)
または適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げるかもしくは減らすことができる一方のプライマーの最も3'末端に(Prossner (1993) Tibtech 11 Or mismatched under appropriate conditions is the most 3 'end of one primer can reduce prevent or polymerase extension (Prossner (1993) Tibtech 11
:238)目的の突然変異を保有することができる。 : 238) can be held by the mutation of interest. さらに、切断に基づく検出をもたらすために突然変異の領域中に新規な制限部位を導入することが望ましい可能性がある(Gasparini et al.(1992) Mol. Cell Probes 6:1)。 Furthermore, in the region of the mutation to result in cleavage-based detection it may be desirable to introduce a novel restriction site (Gasparini et al (1992) Mol Cell Probes 6:.. 1). ある態様として、増幅のためにTaqリガーゼを用いて増幅を実施することもできると予想される(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189)。 As an embodiment, it is expected to be able to be implemented amplified using Taq ligase for amplification (Barany (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:... 189). そのような場合、5' In such a case, the 5 '
配列の3'末端で完全な対合がある場合にのみ連結が起こり、増幅の有無を調べることにより特定の部位での既知の突然変異の存在を検出することができる。 Ligation will occur only if there is a perfect pairing at the 3 'end of the sequence, it can detect the presence of a known mutation at a specific site by looking for the presence or absence of amplification.

【0203】 本明細書に記述する方法は、例えば、本明細書に記述する少なくとも1つのプローブ核酸または抗体試薬を含んでなる予め包装された診断キットを利用することにより実施することができ、これを例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子を伴う疾病または疾患の症状または家族歴を示す患者を診断するために臨床環境において都合よく用いることができる。 [0203] methods described herein, for example, can be carried out by utilizing prepackaged diagnostic kits comprising at least one probe nucleic acid or antibody reagent described herein, which it can be conveniently used in the example hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene clinical setting to diagnose patients exhibiting symptoms or family history of a disease or disorder involving.

【0204】 さらに、hVR-1、hVR-2及びrVR-2が発現されるあらゆる細胞タイプまたは組織を本発明に記述する予後アッセイにおいて利用することができる。 [0204] Further, it is possible to utilize the described prognostic assays of the present invention any cell type or tissue hVR-1, hVR-2 and RVR-2 is expressed.

【0205】 3. [0205] 3. 臨床試験中の効果のモニタリング hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現または活性に対する作用因子(例えば薬物)の影響のモニタリングは、基礎的な薬物スクリーニングにおいてだけでなく、臨床試験においても適用することができる。 Monitoring the influence of agents for monitoring hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein expression or activity of Effects During Clinical Trials (e.g. drugs), not only in basic drug screening, also in clinical trials it is possible to apply. 例えば、hVR-1、hVR-2及びrV For example, hVR-1, hVR-2 and rV
R-2遺伝子発現、タンパク質レベルを増やすかまたはhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性をアップレギュレーションする本明細書に記述するようなスクリーニングアッセイにより決定された作用因子の効果は、減少したhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子発現、タンパク質レベルまたはダウンレギュレーションされたhVR-1、hVR-2及び R-2 gene expression, the effect of either or hVR-1, hVR-2 and agent determined by a screening assay as described herein for the upregulation RVR-2 activity increased protein levels decreased hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene expression, hVR-1 was protein levels, or down-regulation, hVR-2 and
rVR-2活性を示す被験体の臨床試験においてモニターすることができる。 It can be monitored in clinical trials of subjects exhibiting RVR-2 activity. あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子発現、タンパク質レベルを減らすかまたはhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性をダウンレギュレーションするスクリーニングアッセイにより決定された作用因子の効果は、増加したhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子発現、タンパク質レベルまたはアップレギュレーションされたhVR-1、hVR-2 Alternatively, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene expression, the effect of either or hVR-1, hVR-2 and agent determined by a screening assay to downregulate RVR-2 activity reduced protein levels , increased hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene expression, hVR-1, hVR-2 which are protein levels or upregulate
及びrVR-2活性を示す被験体の臨床試験においてモニターすることができる。 And it can be monitored in clinical trials of subjects exhibiting RVR-2 activity. そのような臨床試験において、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子並びに好ましくは例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2関連疾患に関与している他の遺伝子の発現または活性を特定の細胞の表現型の「表示」またはマーカーとして用いることができる。 In such clinical trials, identify hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene and preferred examples hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression of other genes involved in related diseases or activity it can be used as a "display" or markers of the phenotype of the cell.

【0206】 例えば、限定としてではなく、(例えば、本明細書に記述するようなスクリーニングアッセイにおいて同定される)hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する作用因子(例えば、化合物、薬物または小分子)での処置により細胞において調節される、hVR-1、hVR-2及びrVR-2を包含する遺伝子を同定することができる。 [0206] For example, and not limitation, (e.g., identified as in screening assays as described herein) agent modulating hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity (e.g., compound, treatment of the drug or small molecule) is regulated in a cell can be identified encompassing gene hVR-1, hVR-2 and RVR-2. 従って、例えば臨床試験において、hVR-1、hVR-2及びrVR-2関連疾患(例えば痛み疾患)に対する作用因子の効果を調べるために、細胞を単離し、RNAを調製し、 Thus, for example, in clinical trials, to investigate the effect of the agent for hVR-1, hVR-2 and RVR-2-related diseases (e.g., pain disorders), the cells were isolated, prepared RNA,
そしてhVR-1、hVR-2及びrVR-2並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2関連疾患に関与する他の遺伝子の発現のレベルに関してそれぞれ分析することができる。 And can each analyzed for hVR-1, hVR-2 and RVR-2 and hVR-1, hVR-2 and RVR-2-related disease with the level of expression of other genes involved. 遺伝子発現のレベル(すなわち、遺伝子発現パターン)は、本明細書に記述するように、ノーザンブロット分析もしくはRT-PCRにより、あるいはまた本明細書に記述するような方法のいずれかで、生産されるタンパク質の量を測定することにより、またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2もしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量することがでできる。 Levels of gene expression (i.e., a gene expression pattern), as described herein, Northern blot analysis or RT-PCR, or alternatively in any manner as described herein, is produced by measuring the amount of protein, or in be quantified by measuring the level of hVR-1, hVR-2 and RVR-2 or other gene activity. このように、遺伝子発現バターンは、作用因子に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして用いることができる。 Thus, gene expression Bataan, can be used as a marker, indicative of the physiological response of the cells to the agent. 従って、 Therefore,
この応答状態は、作用因子での個体の処置の前及び間の様々な時点で決定することができる。 This response state may be determined before, and at various points during treatment of the individual with the agent.

【0207】 ある態様として、本発明は、(i)作用因子の投与前に被験体から投与前サンプルを得;(ii)投与前サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNA [0207] As one aspect, the present invention is, (i) to give the pre-administration sample from a subject prior to administration of the agent; (ii) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in pre-dose sample, mRNA
またはゲノムDNAの発現のレベルを検出し;(iii)被験体から1個またはそれ以上の投与後サンプルを得;(iv)投与後サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現または活性のレベルを検出し;(v)投与前サンプル中のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現または活性のレベルを投与後のサンプルまたは複数のサンプル中のhVR-1、hVR Or detecting the level of expression of genomic DNA; (iii) to obtain one or more post-administration samples from the subject; (iv) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in a sample after administration, detecting the level of expression or activity of the mRNA or genomic DNA; (v) samples after administration levels hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, expression or activity of the mRNA or genomic DNA in pre-dose sample or a plurality of samples of hVR-1, hVR
-2及びrVR-2タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAと比較し;そして(vi)相応して被験体への作用因子の投与を変える工程を含む、作用因子(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または本明細書に記述するスクリーニングアッセイにより同定される他の薬物候補) -2 and RVR-2 protein, compared to the mRNA or genomic DNA; and (vi) comprises the step of changing the administration of the agent corresponding to the subject, the agent (e.g., an agonist, antagonist, peptidomimetic, proteins, peptides, nucleic acids, other drug candidate identified by the described screening assays small molecules or herein)
での被験体の処置の効果をモニタリングする方法を提供する。 To provide a method for monitoring the effect of treatment of a subject in. 例えば、作用因子の増加した投与は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2の発現または活性を検出されたものより高いレベルまで上げるため、すなわち、作用因子の効果を上げるために望ましい可能性がある。 For example, the administration increases the agents, to increase up to hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity higher than that detected levels, i.e., it is desirable in order to increase the effect of the agent there is. あるいはまた、作用因子の減少した投与は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2の発現または活性を検出されたものより低いレベルまで下げるため、すなわち、作用因子の効果を下げるために望ましい可能性がある。 Alternatively, the administration reduced the agents, to lower until hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or lower levels than those detected activity, i.e., capable desirable to reduce the effect of the agent there is sex. そのような態様により、hVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性は、識別可能な表現型応答の非存在下でさえ、作用因子の有効性の指標として用いることができる。 Such embodiments, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity, even in the absence of identifiable phenotypic response, can be used as an indicator of the effectiveness of an agent.

【0208】 C. [0208] C. 処置の方法 : 本発明は、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性と関連する疾患の危険にさらされている(もしくはそれにかかりやすい)かまたは疾患にかかっている被験体を処置する予防的及び治療的方法の両方を提供する。 Methods of treatment: the present invention, abnormal hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity and are at risk of diseases associated with (or predisposed to) or a subject suffering from a disease It provides both prophylactic and therapeutic methods of treating. 処置の予防的及び治療的方法の両方に関して、そのような処置は、薬理ゲノム学の分野から得られる知識に基づいて、特別にあつらえるかまたは改変することができる。 For both prophylactic and therapeutic methods of treatment, such treatment, based on knowledge obtained from the field of pharmacogenomics, you can either specially tailored or modified. 本明細書において用いる場合、「薬理ゲノム学」は、臨床開発における及び市場での薬物への遺伝子シークエンシング、統計遺伝学及び遺伝子発現分析のようなゲノム学技術の適用をさす。 As used herein, "pharmacogenomics" refers gene sequencing to drugs in and markets in clinical development, the application of genomics technologies such as statistical genetics, and gene expression analysis. より詳細には、該用語は、患者の遺伝子がある薬物に対する彼または彼女の応答をどのように決定するか(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)の研究をさす。 More specifically, the term, the study of how to determine his or her response to the drug there is a patient of the gene (for example, a patient's "drug response phenotype", or "drug response genotype") It refers. 従って、本発明の別の態様は、 Accordingly, another aspect of the present invention,
個体の薬物応答遺伝子型に従って本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子またはhVR hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule or hVR of the present invention in accordance with drug response genotype of the individual
-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターのいずれかでのその個体の予防的または治療的処置をあつらえる方法を提供する。 -1, to provide a method for tailor prophylactic or therapeutic treatment of the individual with either hVR-2 and RVR-2 modulators. 薬理ゲノム学により、臨床家または医師は、処置から最も利益を得るであろう患者に予防的または治療的処置を向け、そして薬物に関係する有毒な副作用を経験するであろう患者の処置を回避することができる。 The Pharmacogenomics, clinician or physician avoids most benefit to the patient that would obtain for a prophylactic or therapeutic treatment, and treatment of patients will experience toxic side effects related to the drug from the treatment can do. 1. 1. 予防的方法一つの態様として、本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現もしくは少なくとも一つのhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を調節する作用因子を被験体に投与することにより、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性と関連する疾病または症状を該被験体において予防する方法を提供する。 As a preventive method one aspect, the present invention is, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or at least one hVR-1, hVR-2 and rVR- by administering an agent that modulates 2 activity into a subject, provides a method for preventing a disease or condition associated with abnormal hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity in said subject.
異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性により引き起こされるかまたはそれに起因する疾病の危険にさらされている被験体は、例えば、本明細書に記述するような診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより同定することができる。 Abnormal hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or caused by activity or subjects at risk for diseases caused by it, for example, diagnostic or prognostic assays as described herein it can be identified by any or a combination of. 予防的作用因子の投与は、疾病または疾患を予防するか、あるいはまたその進行を遅らせるように、hVR-1、hVR-2及びrVR-2異常性を特徴とする症状の発現前であることができる。 Administration of a prophylactic agent, either preventing a disease or disorder, or alternatively to delay its progression, that is prior to the manifestation of symptoms characteristic of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 abnormalities it can. hVR-1、hVR-2及びrVR-2異常性のタイプにより、例えば、hVR-1、hVR-2及びrVR-2、hVR-1、hVR-2及びrVR-2アゴニストまたはhV hVR-1, depending on the type of hVR-2 and RVR-2 abnormality, for example, hVR-1, hVR-2 and rVR-2, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 agonist or hV
R-1、hVR-2及びrVR-2アンタゴニスト作用因子を被験体を処置するために用いることができる。 The R-1, hVR-2 and RVR-2 antagonist agent can be used for treating the subject. 適当な作用因子は、本明細書に記述するスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。 Suitable agents may be determined based on describing screening assays herein. 2. 2. 治療的方法本発明の別の態様は、治療目的のためにhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性を調節する方法に関する。 Another aspect of the therapeutic methods The present invention relates to a method of modulating hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity for therapeutic purposes. 従って、典型的態様として、本発明の調節方法は、 Therefore, typical embodiments, the modulatory methods of the invention,
hVR-1、hVR-2及びrVR-2または細胞と関連するhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質活性の1つまたはそれ以上の活性を調節する作用因子と細胞を接触させることを含む。 Comprising contacting an agent with a cell that regulate the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 or one or more of the activities of cells and associated hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein activity . hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質活性を調節する作用因子は、核酸もしくはタンパク質、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の天然に存在する標的分子(例えばhVR-1、hVR-2及びrVR-2基質)、hVR-1、hVR-2及びrVR-2抗体、hVR-1、h hVR-1, hVR-2 and the agent that modulates the RVR-2 protein activity, a nucleic acid or protein, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 target molecule present in the natural protein (e.g., hVR-1, hVR -2 and RVR-2 substrate), hVR-1, hVR-2 and RVR-2 antibody, hVR-1, h
VR-2及びrVR-2アゴニストもしくはアンタゴニスト、hVR-1、hVR-2及びrVR-2アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣物または他の小分子のような、本明細書に記述するような作用因子であることができる。 VR-2 and RVR-2 agonist or antagonist, such as hVR-1, peptide mimics of hVR-2 and RVR-2 agonist or antagonist, or other small molecules, is an agent as described herein be able to. 一つの態様として、作用因子は1つまたはそれ以上のhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を刺激する。 In one embodiment, the agent stimulates one or more of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity. そのような刺激因子の例には、活性のあるhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質並びに細胞中に導入されているhVR-1、hVR-2及びrVR-2をコードする核酸分子が包含される。 Examples of such stimulating factors, nucleic acid molecules encoding hVR-1, hVR-2 and RVR-2 has been introduced into hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein, as well as in cells with active It is included. 別の態様として、作用因子は1つまたはそれ以上のhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性を阻害する。 In another embodiment, the agent inhibits one or more of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity. そのような阻害因子の例には、アンチセンスhVR-1、hVR-2及びrV Examples of such inhibitors, antisense hVR-1, hVR-2 and rV
R-2核酸分子、抗-hVR-1、hVR-2及びrVR-2抗体並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2インヒビターが包含される。 R-2 nucleic acid molecules, anti -hVR-1, hVR-2 and RVR-2 antibodies and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 inhibitors are included. これらの調節方法は、インビトロで(例えば、作用因子と共に細胞を培養することにより)、あるいはまたインビボで(例えば、作用因子を被験体に投与することにより)実施することができる。 These modulatory methods can be performed in vitro (e.g., by culturing the cell with the agent) or, alternatively in vivo (e.g., by administering the agent to a subject) can be performed. そのようなものとして、本発明は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾病または疾患に悩まされている個体を処置する方法を提供する。 As such, the present invention provides a method of treating an individual afflicted with a disease or disorder characterized by hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or aberrant expression or activity of a nucleic acid molecule to. 一つの態様として、該方法は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性を調節する(例えば、アップレギュレーションするまたはダウンレギュレーションする)作用因子(例えば、本明細書に記述するスクリーニングアッセイにより同定される作用因子)または作用因子の組み合わせを投与することを含む。 In one embodiment, the method, hVR-1, to adjust the hVR-2 and RVR-2 expression or activity (e.g., or downregulate upregulation) agent (e.g., described screening assays herein comprising administering a combination of the agent) or an agent identified by. 別の態様として、該方法は、減少したまたは異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2発現または活性を補うための治療としてhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質または核酸分子を投与することを含む。 In another embodiment, the method of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein or nucleic acid molecule as therapy to compensate for reduced or aberrant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 expression or activity including the administration.

【0209】 hVR-1、hVR-2及びrVR-2が異常にダウンレギュレーションされ、そして/または増加したhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性が有益な効果を有すると思われる状況では、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性の刺激が望ましい。 [0209] hVR-1, hVR-2 and RVR-2 is abnormally downregulated and / or in situations where increased hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity is likely to have a beneficial effect, hVR-1, stimulation of hVR-2 and RVR-2 activity is desirable. 例えば、hVR-1、hVR-2及びr For example, hVR-1, hVR-2 and r
VR-2がダウンレギュレーションされ、そして/または増加したhVR-1、hVR-2及び VR-2 is downregulated and / or increased hVR-1, hVR-2 and was
rVR-2活性が有益な効果を有すると思われる状況では、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性の刺激が望ましい。 In situations where RVR-2 activity is likely to have a beneficial effect, hVR-1, stimulation of hVR-2 and RVR-2 activity is desirable. 同様に、hVR-1、hVR-2及びrVR-2が異常にアップレギュレーションされ、そして/または減少したhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性が有益な効果を有すると思われる状況では、hVR-1、hVR-2及びrVR-2活性の阻害が望ましい。 Similarly, in situations in which appear to have hVR-1, hVR-2 and RVR-2 is abnormally upregulated and / or decreased hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity is beneficial effect, hVR-1, inhibition of hVR-2 and RVR-2 activity is desirable.

【0210】 3. [0210] 3. 薬理ゲノム学本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子並びに本明細書に記述するスクリーニングアッセイにより同定されるようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性(例えばhVR-1、 HVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecules and hVR-1 as identified by the described screening assays herein, hVR-2 and RVR-2 activity of pharmacogenomics present invention (e.g., hVR-1 ,
hVR-2及びrVR-2遺伝子発現)に対する刺激または阻害作用を有する作用因子またはモジュレーターは、異常なhVR-1、hVR-2及びrVR-2活性と関連するhVR-1、hVR- Agents or modulators have a stimulatory or inhibitory effect on hVR-2 and RVR-2 gene expression) is, hVR-1 associated with aberrant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 activity, HVR
2及びrVR-2関連疾患(例えば痛み疾患)を(予防的にまたは治療的に)処置するために個体に投与することができる。 2 and RVR-2-related diseases (e.g., pain disorders) (prophylactically or therapeutically) may be administered to an individual to treat. そのような処置と共に、薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答間の関係の研究)を考慮することができる。 With such treatment, it can be considered the pharmacogenomics (i.e., the study of the relationship between the individual to genotype and a foreign compound or drug of individual response). 治療薬の代謝の違いは、薬理学的に有効な薬物の用量と血液濃度の関係を変えることにより激しい毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。 Differences in metabolism of therapeutics can lead to failure of severe toxicity or therapeutic by changing the relationship between dose and blood concentration of the pharmacologically active drug. 従って、医師または臨床家は、hVR-1、hVR-2及びrVR-2 Thus, a physician or clinician, hVR-1, hVR-2 and RVR-2
分子またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターを投与するかどうかを決定すること並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターでの処置の投薬量及び/または治療計画をあつらえることにおいて関連する薬理ゲノム学研究で得られた知識を適用することを考慮することができる。 Molecule or hVR-1, hVR-2 and possible to determine whether the administration of RVR-2 modulators and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule or hVR-1, hVR-2 and in RVR-2 modulators it can be of considering applying knowledge obtained in relevant pharmacogenomics studies in be tailored dosage and / or therapeutic regimen of treatment.

【0211】 薬理ゲノム学は、患者における変わってしまった薬物素因及び異常な作用による薬物に対する応答の臨床的に有意な遺伝的変動を扱う。 [0211] Pharmacogenomics deals with clinically significant hereditary variations in the response to drugs due to drug predisposition and abnormal action has changed in a patient. 例えば、Eichelbaum, For example, Eichelbaum,
M. et al.(1996)Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23(10-11):983-985及びLind .... M. et al (1996) Clin Exp Pharmacol Physiol, 23 (10-11):. 983-985 and Lind
er, MW et al.(1997)Clin. Chem., 43(2):254-266を参照。 .. Er, MW et al (1997) Clin Chem, 43 (2):. Referring to the 254-266. 一般に、2つのタイプの薬理遺伝学症状を区別することができる。 In general, it is possible to distinguish the pharmacogenetics symptoms of two types. 薬物が体に対して作用する様式を変える1個の単一因子として伝達される遺伝的症状(変わってしまった薬物作用)または体が薬物に対して作用する様式を変える複数の単一因子として伝達される遺伝的症状(変わってしまった薬物代謝)。 As a plurality of single factors drug alters the manner in which acting on one genetic symptoms (drug action has changed) transmitted as a single factor or body drugs alter the manner in which acts on the body genetic condition that is transmitted (changed gone drug metabolism). これらの薬理遺伝学症状は、稀な遺伝子欠損または天然に存在する多型のいずれかとして起こる可能性がある。 These pharmacogenetic conditions may polymorphism can occur either as present on the rare genetic defects or natural.
例えば、グルコース-6-リン酸脱水素酵素欠損症(G6PD)は、主な臨床的合併症が酸化剤薬物(抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン)の摂取及びソラマメの消費後の溶血である一般的な遺伝性酵素欠損症である。 For example, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency (G6PD) is a major clinical complications oxidant drugs (anti-malarials, sulfonamides, analgesics, nitrofurans) after ingestion and fava beans consumption is a common inherited enzyme deficiency is hemolysis.

【0212】 「ゲノムの範囲にわたる関連(genome-wide association)」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための1つの薬理ゲノム学方法は、主として、すでに既知の遺伝子関連マーカーからなるヒトゲノムの高解像度地図( [0212] One pharmacogenomics method for identifying "Related ranging genome (genome-wide association)" are known as, genes that predict drug response, mainly, from an already known gene-related markers consisting of a high-resolution map of the human genome (
例えば、ヒトゲノム上の60,000〜100,000の多型または可変部位から成る「二対立遺伝子」遺伝子マーカー地図、これらの各々は2個の変異体を有する)による。 For example, a polymorphic or variable sites 60,000 to 100,000 on the human genome "biallelic" gene marker map, each of which depends on having two variants). そのような高解像度遺伝子地図を第II/III相薬物試験に参加している統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムの地図と比較して特定の認められる薬物応答または副作用と関連するマーカーを同定することができる。 Associated with such high-resolution genetic map certain of recognized is drug response or side effects as compared to each of the genomic map of the statistically significant number of patients participating in Phase II / III drug trial it is possible to identify the marker. あるいはまた、そのような高解像度地図をヒトゲノム中の約1,000万の既知の単一ヌクレオチド多型(S Alternatively, approximately 10 million known single nucleotide polymorphisms of the human genome such high-resolution map (S
NP)の組み合わせから作製することができる。 Can be made from a combination of NP). 本明細書において用いる場合、「 As used herein, "
SNP」は一続きのDNA中の単一ヌクレオチド塩基に存在する一般的な変化である。 SNP "is a common change that exists in a single nucleotide base in a stretch of DNA.
例えば、SNPは、1000塩基のDNA毎に1回存在する可能性がある。 For example, SNP is likely to be present once every DNA of 1000 base. SNPは疾病プロセスに関与する可能性があるが、しかしながら、大多数は疾病に関連していない可能性がある。 SNP is likely to be involved in a disease process, however, the majority may not have been associated with the disease. そのようなSNPの存在に基づく遺伝子地図を考えれば、個体をそれらの個々のゲノム中のSNPの特定のパターンにより遺伝子カテゴリーに分類することができる。 Given a genetic map based on the presence of such SNP, the particular pattern of SNP of individuals in their individual genome can be grouped into genetic categories. そのようにして、そのような遺伝的に類似した個体間で共通の可能性がある形質を考慮に入れて、遺伝的に類似した個体の群に対して治療計画をあつらえることができる。 As such, it is possible to traits that have a common potential between such genetically similar individuals, taking into account, tailoring a treatment plan against a group of genetically similar individuals.

【0213】 あるいはまた、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために「候補遺伝子法」 [0213] Alternatively, in order to identify genes that predict drug response "candidate gene method"
と呼ばれる方法を利用することができる。 It is possible to use a method called. この方法では、薬物標的をコードする遺伝子が既知である場合(例えば、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質)、その遺伝子の全ての一般的変異体を集団においてかなり容易に同定することができ、そして遺伝子のあるバージョンを別のものに対して有することが特定の薬物応答と関連するかどうかを決定することができる。 In this method, if a gene that encodes a drug target is known (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein of the present invention), all common variants of that gene rather easily in a population can be identified, and that has on one a version of the gene of another can determine whether associated with a particular drug response.

【0214】 例示的態様として、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強さ及び期間の両方の主要な決定要素である。 [0214] As an exemplary embodiment, the activity of drug metabolizing enzymes is a major determinant of both the intensity and duration of drug action. 薬物代謝酵素(例えば、N-アセチルトランスフェラーゼ2 Drug metabolizing enzymes (e.g., N- acetyltransferase 2
(NAT2)並びにチトクロームP450酵素 CYP2D6及びCYP2C19)の遺伝子多型の発見により、標準的で安全な用量の薬物を服用した後に患者が予想される薬物効果を得ないかまたは過大な薬物応答及び激しい毒性を示すことがある理由に関して説明が与えられている。 (NAT2) as well as the discovery of genetic polymorphisms of cytochrome P450 enzymes CYP2D6 and CYP2C19), standard, or not to give the drug effects a patient is expected after taking safe dose of a drug or excessive drug response and severe toxicity explanation is given as to why there is to show. これらの多型は集団において2つの表現型、多量代謝体(e These polymorphisms two phenotypes in the population, multimeric metabolite (e
xtensive metabolizer)(EM)及び少量代謝体(poor metabolizer)(PM)で発現される。 xtensive metabolizer) is expressed by (EM) and a small amount metabolites (poor metabolizer) (PM). PMの罹患率は別個の集団間で異なる。 The prevalence of PM is different among different populations. 例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は非常に多型であり、いくつかの突然変異がPMにおいて同定されており、それらは全て機能性CYP2D6の欠如をもたらす。 For example, the gene coding for CYP2D6 is highly polymorphic and several mutations have been identified in PM, which leads to lack of any functional CYP2D6. CYP2D6及びCYP2C19の少量代謝体は、標準的な用量を与えられた場合に過大な薬物応答及び副作用を極めて頻繁に経験する。 Minor metabolites of CYP2D6 and CYP2C19 is quite frequently experience excessive drug response and side effects when given a standard dose. 代謝産物が有効な治療成分である場合、PMは、そのCYP2D6で形成される代謝産物モルヒネによりもたらされるコデインの鎮痛効果に関して示されるように、いかなる治療応答も示さない。 If a metabolite is the active therapeutic moiety, PM, as shown for the analgesic effect of codeine caused by the metabolite morphine formed at its CYP2D6, it does not exhibit any therapeutic response. 他の極端な状態は、標準的な用量に反応しないいわゆる超迅速代謝体である。 Other extremes are the so called ultra-rapid metabolism body do not respond to standard doses. 最近、超迅速代謝の分子的根拠はCYP2D6遺伝子増幅のためであると同定されている。 Recently, the molecular basis of ultra-rapid metabolism has been identified to be due to CYP2D6 gene amplification.

【0215】 あるいはまた、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために「遺伝子発現概略提示(profiling)」と呼ばれる方法を利用することができる。 [0215] Alternatively, it is possible to use a method termed the "gene expression schematic presentation (profiling)" in order to identify genes that predict drug response. 例えば、薬物(例えば、本発明のhVR-1、hVR-2及びrVR-2分子またはhVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーター)を投与した動物の遺伝子発現は、毒性に関係する遺伝子経路が作動しているかどうかの指標を与えることができる。 For example, a drug (e.g., hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule or hVR-1, hVR-2 and RVR-2 modulators of the present invention) of animals administered gene expression, gene pathways related to toxicity but it is possible to give an indication of whether they are working.

【0216】 上記の薬理ゲノム学的方法の1つより多くから生じた情報は、個体の予防的または治療的処置のために適当な投薬量及び処置計画を決定するために用いることができる。 [0216] Information generated from more than one of the above pharmacogenomics approach can be used to determine the appropriate dosage and treatment regimens for prophylactic or therapeutic treatment of an individual. この知識は、投薬または薬物選択に適用する場合、不都合な反応または治療の失敗を回避することができ、従って、hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子または本明細書に記述する典型的スクリーニングアッセイのいずれかにより同定されるモジュレーターのようなhVR-1、hVR-2及びrVR-2モジュレーターで被験者を処置する場合に治療的または予防的効率を高めることができる。 This knowledge, when applied to dosing or drug selection, can avoid adverse reactions or therapeutic failure and thus, typically described in hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecule or herein can enhance the therapeutic or prophylactic efficiency when treating a subject with hVR-1, hVR-2 and RVR-2 modulator such as modulators identified by any of the screening assays.

【0217】 本発明は以下の実施例によりさらに例示され、それらは限定すると解釈されるべきではない。 [0217] The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. 本願の全体にわたって引用される全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容並びに図面及び配列表は、引用することにより本明細書に組み込まれる。 All references cited throughout the present application, the contents and figures and sequence listing of the patents and published patent applications are incorporated herein by reference.

【0218】 実施例実施例1:hVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAの同定及び特性化本実施例において、hVR-1(クローンFchrb87a6)、hVR-2(クローンflh21e11 [0218] EXAMPLES Example 1: hVR-1, in the identification and characterization embodiment of hVR-2 and rVR-2 cDNA, hVR-1 ( clone Fchrb87a6), hVR-2 (clone flh21e11
)、hVR-2別形態(クローンfrhob12c4)及びrVR-2(クローンflrxb147g11)をコードする遺伝子の同定及び特性化を記述する。 ), Describe the identification and characterization of genes encoding hVR-2 Another embodiment (clone Frhob12c4) and RVR-2 (clone Flrxb147g11). hVR-1、hVR-2及びrVR-2 cDNAの単離本発明は、少なくとも一つには、本明細書においてそれぞれhVR-1、hVR-2及び hVR-1, hVR-2 and RVR-2 cDNA Isolation The present invention is based, at least in part, each herein hVR-1, hVR-2 and
rVR-2と呼ばれる、カプサイシン/バニロイド受容体ファミリーの新規メンバーをコードする2個のヒト遺伝子及び1個のラット遺伝子の発見に基づく。 It called RVR-2, based on the discovery of two human genes and one rat gene encoding a novel member of the capsaicin / vanilloid receptor family. これらのクローンは、既知のラットVR-1(受託番号AF029310)に対する配列相同性に基づいて、ヒト心臓ライブラリー及びラット脊髄神経節(DRG)ライブラリーから同定された。 These clones, based on sequence homology to known rat VR-1 (Accession No. AF029310), was identified from a human heart library and a rat dorsal root ganglion (DRG) library. 2個のヒトクローン及びラットクローンの配列を決定し、オープンリーディングフレームを含有することが分かった。 Sequenced two human clones and rat clones were found to contain an open reading frame.

【0219】 全長hVR-1 cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-1ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図1並びに配列番号:1及び2にそれぞれ示す。 [0219] full-length hVR-1 cDNA nucleotide sequence and hVR-1 polypeptide of the predicted amino acid sequence Figure 1 and in SEQ ID NO: respectively in 1 and 2.

【0220】 全長hVR-2 cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-2ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図2並びに配列番号:4及び5にそれぞれ示す。 [0220] full-length hVR-2 cDNA nucleotide sequence and hVR-2 polypeptide of the predicted amino acid sequence Figure 2 and SEQ ID NO: respectively 4 and 5.

【0221】 部分hVR-2(別形態)cDNAのヌクレオチド配列及びhVR-2(別形態)ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図3並びに配列番号:7及び8にそれぞれ示す。 [0221] partial hVR-2 (another form) cDNA nucleotide sequence and hVR-2 (another form) polypeptide 3 and SEQ ID NO: The predicted amino acid sequence of: respectively 7 and 8.

【0222】 予測される全長ヒトVR-2タンパク質(別形態)のアミノ酸配列を図16及び配列番号:20に示す。 [0222] The amino acid sequences 16 and SEQ ID NO: full-length human VR-2 protein predicted (another form): shown in 20.

【0223】 部分rVR-2 cDNAのヌクレオチド配列及びrVR-2ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図4並びに配列番号:10及び11にそれぞれ示す。 [0223] partial RVR-2 cDNA nucleotide sequence and RVR-2 polypeptide predicted amino acid sequence of Figure 4 and SEQ ID NO: respectively 10 and 11. hVR-1、hVR-2及びrVR-2分子の分析 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いてhVR-1タンパク質(配列番号:2) hVR-1, hVR-2 and RVR-2 molecular analysis GCG software package in the GAP program of (Blosum 62 matrix) and hVR-1 protein using the length-weighted gap weights and 4 of 12 (SEQ ID NO: 2)
をヒトVR-2タンパク質(配列番号:5)と整列させた。 Human VR-2 protein (SEQ ID NO: 5) and aligned. 結果は、これら2つの配列間で46.348%の同一性及び55.378%の類似性を示した(図5参照)。 The results showed 46.348% identity and 55.378% similarity between these two sequences (see FIG. 5).

【0224】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(nwsgapdnaマトリックス)並びに50のギャップ加重及び3の長さ加重を用いてhVR-1ヌクレオチド配列(配列番号:1)をヒトVR-2ヌクレオチド配列(配列番号:4)と整列させた。 [0224] GCG software package in the GAP program (nwsgapdna matrix) and hVR-1 nucleotide sequence using the length of the gap weights and 3 weights of 50 (SEQ ID NO: 1) Human VR-2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) were aligned. 結果は、これら2つの配列間で55.316%の同一性及び55.316%の類似性を示した(図6参照) The results showed 55.316% identity and 55.316% similarity between these two sequences (see Figure 6)
.

【0225】 CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いて(図7)、そしてGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いてhVR-2タンパク質(配列番号:5)をラットVR-2 [0225] using CLUSTAL W (1.74) multiple sequence alignment program (Fig. 7), and the GCG software package in the GAP program (Blosum 62 matrix) and hVR-2 using a length of the gap weights and 4 weighting of 12 protein (SEQ ID NO: 5) the rat VR-2
タンパク質(配列番号:11)と整列させた。 Protein (SEQ ID NO: 11) and aligned. 結果は、これら2つの配列間で79.16 Results are between these two sequences 79.16
7%の同一性及び81.703%の類似性を示した(図8参照)。 7% showed identity and 81.703% similarity (see FIG. 8).

【0226】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(nwsgapdnaマトリックス)並びに50のギャップ加重及び3の長さ加重を用いてhVR-1ヌクレオチド配列(配列番号:1)をラットVR-1ヌクレオチド配列(受託番号:AF029310)と整列させた。 [0226] GCG software package in the GAP program (nwsgapdna matrix) and hVR-1 nucleotide sequence using the length of the gap weights and 3 weights of 50 (SEQ ID NO: 1) Rat VR-1 nucleotide sequence (accession number: AF029310) and were aligned. 結果は、これら2つの配列間で82.125%の同一性及び82.125%の類似性を示した( The results showed 82.125% identity and 82.125% similarity between two sequences (
図9参照)。 See Figure 9).

【0227】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いてhVR-1タンパク質(配列番号:2) [0227] GCG software package in the GAP program (Blosum 62 matrix) and hVR-1 protein using the length of the gap weights and 4 weighting of 12 (SEQ ID NO: 2)
をラットVR-1タンパク質(受託番号:AF029310)と整列させた。 The rat VR-1 protein (accession number: AF029310) and were aligned. 結果は、これら2つの配列間で86.022%の同一性及び89.247%の類似性を示した(図10参照)。 The results showed 86.022% identity and 89.247% similarity between these two sequences (see Figure 10).

【0228】 CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いてhVR-2タンパク質(配列番号 [0228] hVR-2 protein (SEQ ID NO: using CLUSTAL W (1.74) multiple sequence alignment program
:5)をヒトVR-2タンパク質(別形態)(配列番号:8)と整列させた(図11)。 : 5) Human VR-2 protein (another form) (SEQ ID NO: 8) and aligned (Figure 11).

【0229】 最後に、CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いてhVR-2タンパク質( [0229] Finally, CLUSTAL W (1.74) hVR-2 protein using a plurality sequence alignment program (
配列番号:5)を予測される全長ヒトVR-2タンパク質(別形態)(配列番号:20) SEQ ID NO: 5) full length human VR-2 protein (another form that is predictive of) (SEQ ID NO: 20)
と整列させた(図17)。 Were aligned (Fig. 17).

【0230】 HMMデータベースに対して検索を実施し、hVR-1(配列番号:2)のアミノ酸配列において約残基201-233、248-283及び333-361で、そしてhVR-2(配列番号:5)のアミノ酸配列において約残基162-194、208-243及び293-328で3個のアンキリンリピートドメインの同定がもたらされた。 [0230] to perform a search against HMM database, hVR-1 (SEQ ID NO: 2) in the amino acid sequence of about residues 201-233,248-283 and 333-361, and hVR-2 (SEQ ID NO: identification of about residues 162-194,208-243 and 293-328 in three ankyrin repeat domains in the amino acid sequence of 5) were introduced. 検索の結果をそれぞれ図13及び15に記述する。 It describes search results in FIGS. 13 and 15.

【0231】 疎水親水プロットによりhVR-1及びhVR-2タンパク質における6個の膜貫通ドメインが同定された(それぞれ図12及び14を参照)。 [0231] Six transmembrane domains in hVR-1 and hVR-2 protein by hydropathic plots were identified (see Figure 12 and 14, respectively).

【0232】 一連の検索により、hVR-1タンパク質は、バニロイド受容体サブタイプのProDo [0232] A series of search, hVR-1 protein, vanilloid receptor subtype ProDo
m登録141801及びバニロイド受容体サブタイプのProDom登録145518にマッチすることが示された。 It has been shown to match m registration 141801 and vanilloid receptor subtype ProDom registered 145,518.

【0233】 さらに、Prositeデータベースに対して検索を実施し、配列番号:5のアミノ酸配列中の4個のN-グリコシル化部位(約残基171-174、192-195、604-607及び749- [0233] Further, to perform a search against Prosite database, SEQ ID NO: 4 N- glycosylation sites in the amino acid sequence of 5 (about residues 171-174,192-195,604-607 and 749-
752で)、配列番号:5のアミノ酸配列中の3個のcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位(約残基2−5、368-371及び499-502で)、配列番号:5のアミノ酸配列中の一連のプロテインキナーゼC及びカゼインキナーゼIIリン酸化部位、配列番号:5のアミノ酸配列中の2個のチロシンキナーゼリン酸化部位(約残基368-375 752), SEQ ID NO: 5 of the three cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites in the amino acid sequence (about residues 2-5,368-371 and 499-502), SEQ ID NO: 5 in the amino acid sequence a series of protein kinase C and casein kinase II phosphorylation sites, SEQ ID NO: 2 tyrosine kinase phosphorylation sites in the amino acid sequence of 5 (about residues 368-375
及び622-628で)並びに配列番号:5のアミノ酸配列中の2個のミリストイル化部位(約残基169-174及び765-770で)の同定がもたらされた。 And 622-628 in) and SEQ ID NO: Identification of two myristoylation sites in the amino acid sequence of 5 (at about residues 169-174 and 765-770) were brought. hVR-1及びhVR-2 mRNAの組織分布本実施例は、インサイチューハイブリダイゼーションにより決定した場合のhV Tissue Distribution embodiment of hVR-1 and hVR-2 mRNA is as determined by in situ hybridization hV
R-1及びhVR-2 mRNAの組織分布を記述する。 It describes the tissue distribution of R-1 and hVR-2 mRNA.

【0234】 インサイチュー分析のために、ヒト及びサルから得た脳領域及び全脳のような組織を最初にドライアイス上で凍結させた。 [0234] For in situ analysis, were first frozen on dry ice tissues such as brain regions and whole brain were obtained from human and monkey. これらの組織の10μmの厚さの冠状切片をDEPC処理した1Xリン酸緩衝食塩水中4%のホルムアルデヒドで10分間室温で後固定し(postfix)、その後、DEPC 1Xリン酸緩衝食塩水中で2回、そして0.1 These thick coronal sections of 10μm tissues were postfixed for 10 min at room temperature with DEPC treated 1X phosphate-buffered saline of 4% formaldehyde (postfix), then twice with DEPC 1X ​​phosphate buffered saline, and 0.1
Mトリエタノールアミン-HCl(pH 8.0)中で1回すすいだ。 Rinsed once in M ​​triethanolamine -HCl (pH 8.0). 0.25%無水酢酸-0.1M 0.25% acetic anhydride -0.1M
トリエタノールアミン-HCl中で10分間インキュベーション後、切片をDEPC 2X SS After incubation for 10 minutes in triethanolamine-HCl, sections DEPC 2X SS
C(1X SSCは、0.015Mクエン酸ナトリウムを加えた0.15M NaClである)中ですすいだ。 C (1X SSC is 0.15 M NaCl plus 0.015M sodium citrate) rinsed in. 次に、一連のエタノール洗浄により組織を脱水し、100%クロロホルム中で5分間インキュベートし、次に、100%エタノール中で1分間、そして95%エタノール中で1分間すすぎ、風乾させた。 Next, dehydrated tissue through a series of ethanol washes, incubated in 100% chloroform for 5 minutes, then 1 minute in 100% ethanol, and rinsed for 1 minute in 95% ethanol, air dried.

【0235】 35 Sで放射性標識した(5 X 10 7 cpm/ml)cRNAプローブでハイブリダイゼーションを実施した。 [0235] Hybridization was performed at radiolabeled (5 X 10 7 cpm / ml ) cRNA probes 35 S. 600mM NaCl、10mM Tris(pH 7.5)、1mM EDTA、0.01%の剪断したサケ精子DNA、0.01%酵母tRNA、0.05%酵母全RNAタイプX1、1Xデンハルト溶液、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、100mMジチオトレイトール、0.1 600mM NaCl, 10mM Tris (pH 7.5), 1mM EDTA, 0.01% sheared salmon sperm DNA, 0.01% yeast tRNA, 0.05% yeast total RNA type X1,1X Denhardt's solution, 50% formamide, 10% dextran sulfate, 100 mM dithio threitol, 0.1
%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及び0.1%チオ硫酸ナトリウムを含有する溶液の存在下でプローブを55℃で18時間インキュベートした。 Incubated for 18 hours with a probe at 55 ° C. in the presence of a% solution containing sodium dodecyl (SDS) and 0.1% sodium thiosulfate sulfate.

【0236】 ハイブリダイゼーション後、スライドを2X SSCで洗浄した。 [0236] and washed after hybridization, the slides in 2X SSC. 次に、切片を37℃ Then, Sections 37 ℃
でTNE(10mM Tris-HCl(pH 7.6)、500mM NaCl及び1mM EDTAを含有する溶液)中で10分間、1ml当たり10μgのRNアーゼAを含むTNE中で30分間、そして最後にTNE In TNE 10 minutes in (10mM Tris-HCl (pH 7.6), 500mM NaCl and the solution containing 1 mM EDTA), 30 minutes in TNE containing RN ase A of 1ml per 10 [mu] g, and finally TNE
中で10分間順次インキュベートした。 Sequentially and incubated for 10 minutes at medium. 次に、スライドを室温で2X SSCですすぎ、 Then rinsed in 2X SSC at room temperature Slides
50℃で2X SSCで1時間洗浄し、55℃で0.2X SSCで1時間、そして60℃で0.2X SSCで It washed 1 hour at 2X SSC at 50 ° C., 1 hour at 0.2X SSC at 55 ° C., and in 0.2X SSC at 60 ° C.
1時間洗浄した。 It was washed for one hour. 次に、連続エタノール-0.3M酢酸ナトリウム濃縮により切片を迅速に脱水し、その後で風乾させ、Kodak Biomax MR科学的画像形成フィルムに24 Then, rapidly dehydrated slices with sodium Continuous ethanol -0.3M acetic concentrated, then air dried to Kodak Biomax MR scientific imaging films 24
時間感光させ、続いて、NB-2写真感光乳剤中に浸し、4℃で7日間感光させ、その後で現像し、対比染色した。 It is time sensitive, subsequently immersed in NB-2 photographic emulsion and exposed at 4 ° C. 7 days, developed thereafter, and counterstained.

【0237】 このデータは、hVR-1分子がヒト脳でもサル脳でも発現されないことを示す。 [0237] The data show that hVR-1 molecule is not expressed in monkey brain in human brain. h h
VR-1分子は、結節性、三叉神経感覚ニューロンにおいて発現されるが、交感神経ニューロンでは発現されない。 VR-1 molecule, nodular, is expressed in trigeminal sensory neurons, not expressed in sympathetic neurons. 結節性感覚ニューロン及び三叉神経感覚ニューロン内で、発現は異なる亜集団において見られた。 In nodular sensory neurons and the trigeminal sensory neurons expression was seen in different subpopulations. さらに、hVR-1は、全てではないがいくつかの小型脊髄神経節(DRG)ニューロン及び少数の中型DRGニューロンにおいて発現される。 Furthermore, hVR-1, but not all are expressed in several small dorsal root ganglion (DRG) neurons and a few medium sized DRG neurons. hVR-1分子は、侵害受容ニューロンに存在する神経ペプチドCGRP及びサブスタンスPとある程度共に発現される。 hVR-1 molecule is to some extent both expressed as neuropeptide CGRP and substance P present on the nociceptive neurons.

【0238】 このデータはさらに、VR-2分子がヒト及びサルの両方の脳において、主に皮質ニューロンにおいて発現されることを示す。 [0238] indicates that the data further, VR-2 molecules in both the human brain and monkeys, which are predominantly expressed in cortical neurons. VR2分子はまた、他の脳領域、例えば、視床、線条、海馬、視床下部、中脳、髄質及び脳幹においても発現される。 VR2 molecule can also comprise other brain regions, for example, thalamus, striatum, hippocampus, hypothalamus, midbrain, is also expressed in the medulla and brain stem.
さらに、VR-2分子は、サル心臓(心房)の副交感神経ニューロン、結節性感覚ニューロン、三叉神経(TRG)感覚ニューロン、脊髄神経節感覚ニューロン、交感神経ニューロン及び脊髄の運動ニューロンにおいて発現される。 Additionally, VR-2 molecule is expressed parasympathetic neurons monkey heart (atria), nodular sensory neurons, trigeminal (TRG) sensory neurons, dorsal root ganglion sensory neurons, in sympathetic neurons and spinal cord motor neurons. VR2分子は、TRG VR2 molecules, TRG
及びDRGニューロンにおいて広範囲に発現され、大部分の小型及び中型ニューロンにおいて、そして少数の大型ニューロンにおいても存在する。 And it is widely expressed in DRG neurons in most small and medium-sized neurons, and also present in a few large neurons. VR2は、VR-1のように、ある程度CGRP及びサブスタンスPと共に局在する。 VR2, as the VR-1, is localized with CGRP and substance P to some extent.

【0239】 三叉神経感覚ニューロンは認められた痛み中枢であり、一方、交感神経ニューロンは神経障害性の痛みに関与することが示されている。 [0239] trigeminal sensory neurons is a pain center, which was found, on the other hand, sympathetic neurons has been shown to be involved in neuropathic pain.

【0240】 実施例2:細菌細胞における組換えhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現 本実施例では、hVR-1、hVR-2及びrVR-2をエシェリキア・コリにおいて組換えグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ポリペプチドとして発現させ、 [0240] Example 2: Expression of Recombinant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in bacterial cells in the present embodiment, hVR-1, recombinant glutathione hVR-2 and RVR-2 in E. coli -S- transferase (GST) was expressed as a fusion polypeptide,
そしてこの融合ポリペプチドを単離し、特性化する。 And the fusion polypeptide is isolated and characterized. 詳細には、hVR-1、hVR-2及びrVR-2をGSTに融合させ、この融合ポリペプチドをエシェリキア・コリ、例えば株PEB199において発現させる。 In particular, the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 is fused to GST, the fusion polypeptide E. coli and expressed in eg strain PEB199. PEB199におけるGST-hVR-1、GST-hVR-2及びGST-rV GST-hVR-1, GST-hVR-2 and GST-rV in PEB199
R-2融合タンパク質の発現をIPTGで誘導する。 Expression of R-2 fusion proteins induced by IPTG. 誘導したPEB199株の粗細菌ライセートから組換え融合ポリペプチドをグルタチオンビーズでのアフィニィティークロマトグラフィーにより精製する。 The recombinant fusion polypeptide is purified by Affi Nyi tea chromatography on glutathione beads from crude bacterial lysates of the induced the PEB199 strain. 細菌ライセートから精製したポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて、得られた融合ポリペプチドの分子量を決定する。 Using polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the purified polypeptide from bacterial lysates to determine the molecular weight of the resultant fusion polypeptide.

【0241】 実施例3:COS細胞における組換えhVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質の発現 COS細胞においてhVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子を発現させるために、Invitrog [0241] Example 3: To express hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene in the expression COS cells Recombinant hVR-1, hVR-2 and RVR-2 protein in COS cells, Invitrog
en Corporation(San Diego、CA)からのpcDNA/Ampベクターを用いる。 en Corporation (San Diego, CA) using the pcDNA / Amp vector from. このベクターは、SV40複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、エシェリキア・コリ複製起点、 This vector, SV40 origin of replication, ampicillin resistance gene, E. coli origin of replication,
CMVプロモーター及びそれに続くポリリンカー領域、並びにSV40イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。 CMV promoter and subsequent polylinker region, and contains a SV40 intron and polyadenylation site. 全hVR-1、hVR-2及びrVR-2タンパク質をコードするDNAフラグメント並びにフラグメントのその3'末端にインフレームに融合したHA標識(Wilson et al.(1984)Cell 37:767)またはFLAG標識をベクターのポリリンカー領域中にクローン化し、それにより組換えタンパク質の発現をCMVプロモーターの制御下に置く。 All hVR-1, hVR-2 and its 3 'HA-labeled fused in frame to the ends of DNA fragments and fragment encoding RVR-2 protein (Wilson et al (1984) Cell 37:. 767) or a FLAG tag cloned into the polylinker region of the vector, thereby placing the expression of the recombinant protein under the control of the CMV promoter.

【0242】 プラスミドを構築するために、2個のプライマーを用いてPCRによりhVR-1、hVR [0242] To construct the plasmid, hVR-1 by PCR using two primers, hVR
-2及びrVR-2DNA配列を増幅する。 -2 and amplify the RVR-2 DNA sequence. 5'プライマーは目的の制限部位並びにそれに続く約20ヌクレオチドの開始コドンから始まるhVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング配列を含有し;3'末端配列は目的のもう一方の制限部位、翻訳終止コドン、HA標識またはFLAG標識並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング配列の最後の20ヌクレオチドに相補的な配列を含有する。 The 5 'primer contains the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 coding sequence starting from the initiation codon of the object of restriction sites and about 20 nucleotides followed by; 3' terminal sequence and the other restriction site of interest, translation stop codon, it contains a sequence complementary to the last 20 nucleotides of the HA tag or FLAG tag and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 coding sequence. PCR増幅フラグメント及びpcDNA/A PCR amplified fragment and pcDNA / A
mpベクターを適当な制限酵素で消化し、CIAP酵素(New England Biolabs、Beverly Was digested mp vector with an appropriate restriction enzyme, CIAP enzymes (New England Biolabs, Beverly
、MA)を用いてベクターを脱リン酸する。 The vector dephosphorylated using MA). 好ましくは、選択する2つの制限部位は異なり、その結果、hVR-1、hVR-2及びrVR-2遺伝子は正しい向きに挿入される。 Preferably, unlike the two restriction sites to be selected, as a result, hVR-1, hVR-2 and RVR-2 gene is inserted in the correct orientation.
ライゲーション混合物をエシェリキア・コリ細胞(Stratagene Cloning Systems、 The ligation mixture E. coli cells (Stratagene Cloning Systems,
La Jolla、CAから入手できる株HB101、DH5α、SUREを用いることができる)中に形質転換し、形質転換した培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選択する。 La Jolla, strain HB101 available from CA, DH5 [alpha, can be used SURE) was transformed into the cultures transformed and plated on ampicillin media plates and resistant colonies are selected. 形質転換体からプラスミドDNAを単離し、適切なフラグメントの存在に関して制限分析により調べる。 Plasmid DNA was isolated from transformants examined by restriction analysis for the presence of a suitable fragment.

【0243】 続いて、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を用いてCO [0243] Subsequently, calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, transfection with DEAE- dextran, using lipofection or electroporation CO
S細胞をhVR-1、hVR-2及びrVR-2-pcDNA/AmpプラスミドDNAでトランスフェクションする。 Transfecting S cells in hVR-1, hVR-2 and rVR-2-pcDNA / Amp plasmid DNA. 宿主細胞をトランスフェクションするための他の適当な方法は、Sambro Other suitable methods for transfecting host cells can, Sambro
ok, J., Fritsh, EF及びManiatis, T., Molecular Cloning:A Laboratory Ma ok, J., Fritsh, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborator nual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に見い出すことができる。 y Press, Cold Spring Harbor, can be found in NY, 1989. 放射性標識(NEN、Boston、MAから入手できる35 S-メチオニンまたは35 S-システインを用いることができる)及びHA特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降(Harlow, E. Radiolabeled (NEN, Boston, available from MA can be used 35 S- methionine or 35 S- cysteine) and immunoprecipitation with HA-specific monoclonal antibody (Harlow, E.
及びLane, D., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat And Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)によりhVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドの発現を検出する。 ory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) by detecting the expression of the hVR-1, hVR-2 and RVR-2 polypeptide. 簡潔に言えば、細胞を35 S-メチオニン(または35 S- Briefly, the cells 35 S- methionine (or 35 S-
システイン)で8時間標識する。 Labeled for 8 hours in cysteine). 次に培養培地を集め、溶剤(RIPAバッファー、1 Then collected culture medium, the solvent (RIPA buffer, 1
50mM NaCl、 1% NP-40、 0.1% SDS、 0.5% DOC、 50mM Tris、 pH 7.5)を用いて細胞を溶解する。 Lysing the cells with 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 50mM Tris, the pH 7.5). 細胞ライセート及び培養培地の両方をHA特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。 Both cell lysates and culture media are precipitated with an HA specific monoclonal antibody. 次に、沈殿したポリペプチドをSDS-PAGEにより分析する。 Then, the precipitated polypeptide is analyzed by SDS-PAGE.

【0244】 あるいはまた、hVR-1、hVR-2及びrVR-2コーディング配列を含有するDNAを適当な制限部位を用いてpcDNA/Ampベクターのポリリンカー中に直接クローン化する。 [0244] Alternatively, cloned directly into the polylinker of pcDNA / Amp vector using the hVR-1, hVR-2 and DNA containing the RVR-2 coding sequence suitable restriction sites. 得られたプラスミドを上記のようにCOS細胞中にトランスフェクションし、放射性標識並びにhVR-1、hVR-2及びrVR-2特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降によりhVR-1、hVR-2及びrVR-2ポリペプチドの発現を検出する。 The resulting plasmid was transfected into COS cells as described above, hVR-1, hVR-2 and by immunoprecipitation with radiolabeled and hVR-1, hVR-2 and RVR-2 specific monoclonal antibodies rVR- detecting the expression of the polypeptide.

【0245】 実施例4:VR-2の電気生理学的研究 電気生理学的方法を用いてヒトVR2をHEK293細胞及びアフリカツメガエル(Xen [0245] Example 4: Human VR2 using electrophysiological studies electrophysiological methods VR2 HEK293 cells and Xenopus (Xen
opus)卵母細胞の両方において機能的に特性化した。 opus) it was functionally characterized in both oocytes. (Invitrogenにより購入したpcDNA3.1ベクター中の)VR2をHEK293細胞(ATCC)において一過性発現させ、 (In pcDNA3.1 vector purchased by Invitrogen) VR2 were transiently expressed in HEK293 cells (ATCC),
全細胞パッチ-クランプ法(Bertil Hille, Ionin Channels of excitable membr Whole-cell patch - clamp method (Bertil Hille, Ionin Channels of excitable membr
anes, 1992; Hammill et al.(1981)Pluger Arch. 391:85-100に記述されている)を用いて細胞のトランスフェクション後48時間で記録を実施した。 .. Anes, 1992; Hammill et al (1981) Pluger Arch 391: 85-100 is described in) was carried out recorded at 48 hours after transfection of cells using. これらの結果は、熱刺激(>50℃)が急速な不活性化する内側への電流(1-2nA)を誘導することを示す。 These results indicate that induce thermal stimulation (> 50 ° C.) the current inward to rapid inactivate (1-2nA). VR2の熱誘起電流は強い脱感作を示し、VR1インヒビターカプサゼピン(capsazepin)(10μM濃度で)により可逆的に妨げることができた。 Thermally induced current VR2 showed strong desensitization could prevent reversibly by VR1 inhibitors Cap Sa peptidase pin (capsazepin) (at 10μM concentration). ラットVR1と異なり、カプサイシン(1−10μM濃度で)、レジニフェラトキシン(res Unlike the rat VR1, capsaicin (in 1-10μM concentration), resiniferatoxin (res
iniferatoxin)(0.1-3μM濃度で)及び低いpH(5.0-6.0)は、VR2からいかなる電流も誘導しない。 Iniferatoxin) (in 0.1-3μM concentration) and low pH (5.0-6.0) is not also induce any current from VR2. HEK293細胞ホモジネートから単離した膜におけるヒトVR1及びVR2の両方に対する[ 3 H]-レジニフェラトキシン(NEN)の結合研究もまた、レジニフェラトキシン(0.1-10nM濃度で)がVR2に特異的に結合せず、一方、ヒトV [3 H] for both human VR1 and VR2 in isolated membranes from HEK293 cell homogenates - resiniferonol also binding studies Blow toxin (NEN) Also, specific to resiniferatoxin (at 0.1-10nM concentration) VR2 does not bind, while the human V
R1に高い親和性で結合することを示す。 It indicates that binds with high affinity to R1.

【0246】 卵母細胞研究のために、アフリカツメガエルβ-グロビンの5'-及び3'-UTRを含有する卵母細胞発現ベクター中にヒトVR2をサブクローン化した(Chiara et a [0246] For oocyte studies, the human VR2 were subcloned into oocyte expression vector containing 5'- and 3'-UTR of the Xenopus β- globin (Chiara et a
l.(1999) Biochemistry 38(20)6689-6698)。 l. (1999) Biochemistry 38 (20) 6689-6698). Chiara et al.(上記)に記述されているようにインビトロ転写を実施し、次にcRNA(10-100ng)を卵母細胞中に注入した。 Chiara et al. Carried out in vitro transcription as described in (above), it was then injected cRNA the (10-100 ng) in oocytes. 標準的な2電極電圧-クランプを用いてcRNA注入後48時間で卵母細胞においてVR2機能を特性化した。 Standard two-electrode voltage - to characterize the VR2 functions in oocyte 48 hours after cRNA injection using a clamp. HEK293研究からのデータと一致して、VR2は熱刺激( Consistent with data from HEK293 research, VR2 is thermal stimulation (
48-50℃)によってのみ活性化することができるが、バニロイド受容体アゴニスト、カプサイシンまたはレジニフェラトキシンにより活性化することはできない。 It can be activated only by 48-50 ° C.), but can not activate the vanilloid receptor agonist, capsaicin or resiniferatoxin. バニロイド受容体アンタゴニストカプサゼピン(1-10μM濃度)は、VR2の熱応答を可逆的に妨げる。 Vanilloid receptor antagonists Cap Sa peptidase pin (1-10MyuM concentration) reversibly prevent the thermal response of VR2.

【0247】 実施例5:抗-hVR-2抗体の作製及び免疫染色によるhVR-2タンパク質位置確認 Ed Harlow及びDavid Lane(1988)「Antibodies;A Laboratory Manal」Cold Spr [0247] Example 5: Anti -hVR-2 antibodies of Preparation and confirmation hVR-2 protein position by immunostaining Ed Harlow and David Lane (1988) "Antibodies; A Laboratory Manal" Cold Spr
ing harbor Laboratory Pressに記述されている技術を用いて、ヒトVR2アミノ酸配列に由来する以下の3種のペプチドに対してウサギにおいてポリクローナル抗血清を作製した。 Using techniques described in ing harbor Laboratory Press, to prepare a polyclonal antiserum in rabbits against the following three peptides derived from human VR2 amino acid sequence. 抗体ペプチド1: AFHCKSPHRHRMVVLE (配列番号:13) 抗体ペプチド2: RPEAPTGPNATESVQPMEGQEDEGN (配列番号:14) 抗体ペプチド3: SVLEMENGYWWCRKKQRAG (配列番号:15) 続いて、ペプチド免疫原を用いて抗血清をアフィニティー精製した。 Antibody peptide 1: AFHCKSPHRHRMVVLE (SEQ ID NO: 13) antibody peptide 2: RPEAPTGPNATESVQPMEGQEDEGN (SEQ ID NO: 14) antibody peptide 3: SVLEMENGYWWCRKKQRAG (SEQ ID NO: 15) Then, the antiserum was affinity purified using peptide immunogen.

【0248】 これらのポリクローナル抗血清をサル及びラットの両方の脊髄神経節感覚ニューロンの免疫染色に関して試験した。 [0248] were tested for immune staining of both of these polyclonal antisera the monkey and rat spinal ganglion sensory neurons. ペプチド1及び3は、対応するペプチドと競合する感覚ニューロンの亜集団の特異的染色を与えた。 Peptide 1 and 3 gave specific staining of a subpopulation of sensory neurons that compete with the corresponding peptide. この発現パターンは、VR This expression pattern, VR
-2リボプローブを用いて認められたものと非常に類似した。 -2 very similar to that observed with riboprobes. 実施例6:hVR-1及びhVR-2の染色体位置確認 hVR-1遺伝子を染色体に位置付けるために、hVR-1(クローンFchrb87a6)の配列に基づいてプライマーを設計した(PCRによりヒトコントロール細胞系DNAから Example 6: hVR-1 and chromosomal localization hVR-1 gene in hVR-2 to position the chromosome, hVR-1 (clone Fchrb87a6) human control cell line DNA by (PCR the primers were designed based on the sequence of from
177bpの産物を、そしてコントロールハムスター細胞系DNAから複数のわずかに大きい産物を増幅する)。 The product of 177 bp, and amplifying multiple slightly larger products from the control hamster cell line DNA). これらのプライマーを用いてGenebridge 4 Radiation H Using these primers GeneBridge 4 Radiation H
ybrid Panel(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)から二重に93 DNAを増幅した。 ybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) was amplified 93 DNA double from.

【0249】 PCRマッピング研究において使用したhVR-1プライマーは:フォワード-TAGGAGAC [0249] hVR-1 primer used in the PCR mapping studies were: forward -TAGGAGAC
CCCGTTGCCACG(配列番号:16)及びリバース-GATTCACTTGGGGACAGTGACG(配列番号 CCCGTTGCCACG (SEQ ID NO: 16) and reverse -GATTCACTTGGGGACAGTGACG (SEQ ID NO:
:17)であり、PCR反応を以下のように実施した:95℃で10分間、続いて94℃で40 : 17), and a PCR reaction was carried out as follows: 95 ° C. for 10 minutes, followed by 94 ° C. 40
秒間、55℃で40秒間、72℃で40秒間を35サイクル、そして72℃で5分間の増幅プロフィールを用いて、5μlの鋳型DNA(10ng/μl)、1.5μlの10X Perkin Elmer Seconds, 40 seconds at 55 ° C., 35 cycles of 40 seconds at 72 ° C., and using an amplification profile of 5 minutes at 72 ° C., 5 [mu] l of template DNA (10ng / μl), 1.5μl of 10X Perkin Elmer
PCRバッファー、1.2μlのPharmacia dNTPミックス2.5mM、1.15μlのフォワードプライマー6.6μM、1.15μlのリバースプライマー6.6μM、5μlのGibco/BRL Pla PCR buffer, 1.2μl of Pharmacia dNTPs mix 2.5 mM, forward primer 6.6MyuM of 1.15μl, 1.15μl reverse primer 6.6μM, 5μl of Gibco / BRL Pla
tinum Taq .05U/μl(ホットスタート)。 tinum Taq .05U / μl (hot start). PCR産物を2%アガロースゲルで泳動し、SYBR Gold(1X TBE中1:10,000希釈)で後染色し、Molecular Dynamics 595 Fluo The PCR products were run on 2% agarose gel, SYBR Gold: post stained with (1X TBE in 1 10,000 dilution), Molecular Dynamics 595 Fluo
rimagerで走査した。 It was scanned in rimager.

【0250】 以下のものは、93 Genebridge 4ハイブリッドDNAのベクターデータである。 [0250] The following thing is a vector data of 93 Genebridge 4 hybrid DNA. これらは1-93の順である。 These are in the order of 1-93. 「1」は陽性の結果であり、「-」は陰性の結果であり、 "1" is a positive result, "-" is the result of a negative,
「?」は不確かな結果である。 "?" Is an uncertain result.

【0251】 [0251]

【化1】 [Formula 1]

【0252】 RH連鎖分析をMap Manager QTb28ソフトウェアパッケージを用いて実施した。 [0252] The RH linkage analysis was performed using the Map Manager QTb28 software package.

【0253】 hVR1は、ヒト第17染色体のp腕、Whitehead Institute構成マーカー(framewor [0253] hVR1 is, p arm of human chromosome 17, Whitehead Institute configuration marker (framewor
k marker)WI-6584の18.9cR 3000テロメアに、そしてWhitehead構成マーカーWI-5 to k marker) 18.9cR 3000 telomere of WI-6584, and Whitehead configuration marker WI-5
436の7.7cR 3000動原体に位置することがわかった。 It was found to be located in the 7.7cR 3000 centromere of 436. 連鎖のLODスコアは、WI-6584 LOD score of the chain, WI-6584
では14.5、そしてWI-5436では19.3であった。 In 14.5, and it was 19.3 in WI-5436. この領域は、細胞遺伝学位置17p12 This region, cytogenetics position 17p12
-13に対応する。 Corresponding to -13. この領域はマウス第11染色体にシンテニーである。 This region is syntenic to mouse chromosome 11.

【0254】 hVR-2遺伝子を染色体に位置付けるために、ヒトVR-2(クローンFlh21e11)の5 [0254] The hVR-2 gene in order to position the chromosome, 5 of the human VR-2 (clone Flh21e11)
' UTR配列からプライマーを設計した(PCRによりヒトコントロール細胞系DNAから166bpの産物を、そしてコントロールハムスター細胞系DNAから2本のはるかに大きい弱いバンドを増幅する)。 'Primer from UTR sequences were designed (the product of 166bp from human control cell line DNA by PCR, and to amplify the much larger faint band of the two from the control hamster cell line DNA). これらのプライマーを用いてGenebridge 4 Rad GeneBridge 4 Rad using these primers
iation Hybrid Panel(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)から二重に93 iation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) to double from 93
DNAを増幅した。 DNA was amplified.

【0255】 PCRマッピング研究において使用したhVR-2プライマーは:フォワード-TTAAGCTC [0255] hVR-2 primers were used in PCR mapping studies were: forward -TTAAGCTC
CCGTTCTCACCG(配列番号:18)及びリバース-GCTGCGGGAGGAAGTGAAGC(配列番号:1 CCGTTCTCACCG (SEQ ID NO: 18) and reverse -GCTGCGGGAGGAAGTGAAGC (SEQ ID NO: 1
9)であり、PCR反応を以下のように実施した:95℃で10分間、続いて94℃で40秒間、55℃で40秒間、72℃で40秒間を35サイクル、そして72℃で5分間の増幅プロフィールを用いて、5μlの鋳型DNA(10ng/μl)、1.5μlの10X Perkin Elmer PC 9), and a PCR reaction was carried out as follows: 95 ° C. for 10 minutes, followed by 40 seconds at 94 ° C., 40 seconds at 55 ° C., 35 cycles of 40 seconds at 72 ° C., and 5 minutes at 72 ° C. using amplification profile, 5 [mu] l of template DNA (10ng / μl), 1.5μl of 10X Perkin Elmer PC
Rバッファー、1.2μlのPharmacia dNTPミックス2.5mM、1.15μlのフォワードプライマー6.6μM、1.15μlのリバースプライマー6.6μM、5μlのGibco/BRL Plati R buffer, 1.2Myueru of Pharmacia dNTPs mix 2.5 mM, forward primer 6.6MyuM of 1.15μl, 1.15μl reverse primer 6.6μM, 5μl of Gibco / BRL Plati
num Taq .05U/μl(ホットスタート)。 num Taq .05U / μl (hot start). PCR産物を2%アガロースゲルで泳動し、 The PCR products were run on 2% agarose gels,
SYBR Gold(1X TBE中1:10,000希釈)で後染色し、Molecular Dynamics 595 Fluori SYBR Gold: post-stained with (1X TBE in 1 10,000 dilution), Molecular Dynamics 595 Fluori
magerで走査した。 It was scanned in mager.

【0256】 以下のものは、93 Genebridge 4ハイブリッドDNAのベクターデータである。 [0256] The following thing is a vector data of 93 Genebridge 4 hybrid DNA. これらは1-93の順である。 These are in the order of 1-93. 「1」は陽性の結果であり、「-」は陰性の結果であり、 "1" is a positive result, "-" is the result of a negative,
「?」は不確かな結果である。 "?" Is an uncertain result.

【0257】 [0257]

【化2】 ## STR2 ##

【0258】 RH連鎖分析をMap Manager QTb28ソフトウェアパッケージを用いて実施した。 [0258] The RH linkage analysis was performed using the Map Manager QTb28 software package.

【0259】 hVR2は、ヒト第17染色体のp腕、Whitehead Institute構成マーカーD17S721の2 [0259] hVR2 is, p arm of human chromosome 17, 2 of the Whitehead Institute configuration marker D17S721
9.3cR 3000テロメアに、そしてWhitehead構成マーカーAFMA043ZB5の23.3cR 3000動原体に位置することがわかった。 The 9.3CR 3000 telomeres, and it found to be located 23.3CR 3000 centromere Whitehead configuration markers AFMA043ZB5. 連鎖のLODスコアは、D17S721では11.9、そして LOD score of the chain, in D17S721 11.9 and,
AFMA043ZB5では13.6であった。 In AFMA043ZB5 was 13.6. この領域は、細胞遺伝学位置17p11-12に対応する。 This region corresponds to the cytogenetic position 17P11-12. この領域はマウス第11染色体にシンテニーである。 This region is syntenic to mouse chromosome 11. 同等物当業者は、本明細書に記述する本発明の特定の態様の多数の同等物を認識するかまたは慣例の実験のみを用いて確かめることができる。 Equivalents Those skilled in the art, can be ascertained using only the number of equivalents of recognizing or routine experimentation particular aspect of the present invention described herein. そのような同等物は、 Such equivalents,
以下の請求項により包含されるものとする。 It is intended to be covered by the following claims.

【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 ヒトVR-1(hVR-1)の全長cDNA配列及び予測されるアミノ酸配列を示す。 1 shows an amino acid sequence full length cDNA sequence and predicted human VR-1 (hVR-1). ヌクレオチド配列は、配列番号:1の核酸1〜3909に対応する。 Nucleotide sequence, corresponds to SEQ ID NO: 1 nucleic acid 1-3909. アミノ酸配列は、配列番号:2のアミノ酸1〜839に対応する。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: corresponding to two of the amino acids 1-839. ヒトVR-1(hVR-1)遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を含まないコーディング領域を配列番号:3に示す。 Human VR-1 (hVR-1) 5 'and 3' untranslated coding regions which does not include a region sequence number of the gene: shown in 3.

【図2】 ヒトVR-2(hVR-2)の全長cDNA配列及び予測されるアミノ酸配列を示す。 Figure 2 shows the amino acid sequence full length cDNA sequence and predicted human VR-2 (hVR-2). ヌクレオチド配列は、配列番号:4の核酸1〜2809に対応する。 The nucleotide sequence corresponds to SEQ ID No. 4 of the nucleic acid 1-2809. アミノ酸配列は、配列番号:5のアミノ酸1〜764に対応する。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: corresponding to the 5 amino acids 1-764. ヒトVR-2(hVR-2)遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を含まないコーディング領域を配列番号:6に示す。 Human VR-2 (hVR-2) gene 5 'and 3' untranslated region contains no coding region shown in SEQ ID NO: 6.

【図3】 ヒトVR-2(hVR-2)の別形態の部分cDNA配列及び予測される部分アミノ酸配列を示す。 3 shows a human VR-2 (hVR-2) Another embodiment of the partial cDNA sequence and predicted partial amino acid sequence of. ヌクレオチド配列は、配列番号:7の核酸1〜1489に対応する。 Nucleotide sequence, corresponds to SEQ ID NO: 7 of the nucleic acid 1-1489. アミノ酸配列は、配列番号:8のアミノ酸1〜436に対応する。 The amino acid sequence, corresponds to SEQ ID NO: 8 amino acids 1-436. ヒトVR-2(hVR-2)遺伝子の別形態の5'及び3'非翻訳領域を含まないコーディング領域を配列番号:9に示す。 Human VR-2 (hVR-2) Another embodiment of the 5 'and 3' coding region which does not include a non-translated region SEQ ID NO genes: shown in 9.

【図4】 ラットVR-2(rVR-2)の部分cDNA配列及び予測される部分アミノ酸配列を示す。 Figure 4 shows the partial cDNA sequence and predicted partial amino acid sequence of the rat VR-2 (rVR-2). ヌクレオチド配列は、配列番号:10の核酸1〜1794に対応する。 Nucleotide sequence, corresponds to SEQ ID NO: 10 nucleic acid 1-1794. アミノ酸配列は、配列番号:11のアミノ酸1〜554に対応する。 The amino acid sequence, corresponds to SEQ ID NO: 11 amino acids 1-554. ラットVR-2(rVR-2)遺伝子の5' Rat VR-2 (rVR-2) 5 'of the gene
及び3'非翻訳領域を含まないコーディング領域を配列番号:12に示す。 And 3 'untranslated region contains no coding region shown in SEQ ID NO: 12.

【図5】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いたヒトVR-2タンパク質(配列番号: [5] GCG software in the package GAP program (Blosum 62 matrix) and human VR-2 protein using the length-weighted gap weights and 4 of 12 (SEQ ID NO:
5)とhVR-1タンパク質(配列番号:2)との整列を示す。 5) a hVR-1 protein (SEQ ID NO: 2) shows the alignment between.

【図6】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(nwsgapdnaマトリックス)並びに50のギャップ加重及び3の長さ加重を用いたヒトVR-2ヌクレオチド配列(配列番号:4)とhVR-1ヌクレオチド配列(配列番号:1)との整列を示す。 [6] GAP program (nwsgapdna matrix) in the GCG software package and human VR-2 nucleotide sequences using the length of the gap weights and 3 weights of 50 (SEQ ID NO: 4) and hVR-1 nucleotide sequence (SEQ ID NO: : 1) shows the alignment of the.

【図7】 CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いたラットVR-2タンパク質( [7] CLUSTAL W (1.74) Rat VR-2 proteins using multiple sequence alignment program (
配列番号:11)とhVR-2タンパク質(配列番号:5)との整列を示す。 SEQ ID NO: 11) and hVR-2 protein (SEQ ID NO: shows the alignment of the 5).

【図8】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いたラットVR-2タンパク質(配列番号:11)とhVR-2タンパク質(配列番号:5)との整列を示す。 [8] GCG software in the package GAP program (Blosum 62 matrix) as well as rat VR-2 protein using the length-weighted gap weights and 4 of 12 (SEQ ID NO: 11) and hVR-2 protein (SEQ ID NO: 5) shows the alignment of the.

【図9】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(nwsgapdnaマトリックス)並びに50のギャップ加重及び3の長さ加重を用いたラットVR-1ヌクレオチド配列( [9] GAP program (nwsgapdna matrix) in the GCG software package, as well as rat VR-1 nucleotide sequences using the length of the gap weights and 3 weights of 50 (
受託番号:AF029310)とhVR-1ヌクレオチド配列(配列番号:1)との整列を示す。 Accession number: AF029310) and hVR-1 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) shows the alignment between.

【図10】 GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(Blosum 62マトリックス)並びに12のギャップ加重及び4の長さ加重を用いたラットVR-1タンパク質(受託番号:AF029310)とhVR-1タンパク質(配列番号:2)との整列を示す。 [10] GCG software in the package GAP program (Blosum 62 matrix) as well as rat VR-1 protein (accession number: AF029310) using the length-weighted gap weights and 4 of 12 hVR-1 protein (SEQ ID NO: showing the alignment of and 2).

【図11】 CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いたヒトVR-2タンパク質(別形態)(配列番号:8)とhVR-2タンパク質(配列番号:5)との整列を示す。 [11] CLUSTAL W (1.74) human VR-2 proteins using multiple sequence alignment program (another form) (SEQ ID NO: 8) and hVR-2 protein (SEQ ID NO: 5) shows the alignment between.

【図12】 hVR-1タンパク質の構造、疎水性及び抗原性分析を示す。 [Figure 12] Structure of hVR-1 protein shows a hydrophobic and antigenic analysis.

【図13】 HMMデータベースに対するhVR-1タンパク質のアミノ酸配列を用いた検索の結果を示す。 Figure 13 shows the results of search using the amino acid sequence of the hVR-1 protein to HMM database.

【図14】 hVR-2タンパク質の構造、疎水性及び抗原性分析を示す。 [14] The structure of hVR-2 protein, exhibits hydrophobicity and antigenicity analysis.

【図15】 HMMデータベースに対するhVR-2タンパク質のアミノ酸配列を用いた検索の結果を示す。 Figure 15 shows the results of search using the amino acid sequence of the hVR-2 protein on HMM database.

【図16】 ヒトVR-2タンパク質(別形態)(配列番号:20)の予測される全長アミノ酸配列を示す。 [16] Human VR-2 protein (another form) (SEQ ID NO: 20) shows the predicted full-length amino acid sequence of.

【図17】 CLUSTAL W(1.74)複数配列整列プログラムを用いた予測される全長ヒトVR-2 [Figure 17] CLUSTAL W (1.74) full length human VR-2 predicted using a plurality sequence alignment program
タンパク質(別形態)(配列番号:20)とhVR-2タンパク質(配列番号:5)との整列を示す。 Protein (Another Embodiment) (SEQ ID NO: 20) and hVR-2 protein (SEQ ID NO: 5) shows the alignment between.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) C07K 19/00 C12N 1/15 4C084 C12N 1/15 1/19 4H045 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33/566 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A (31)優先権主張番号 09/258,633 (32)優先日 平成11年2月26日(1999.2.26) (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 09/421,134 (32)優先日 平成11年10月19日(1999.10.19) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR, ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) C07K 19/00 C12N 1/15 4C084 C12N 1/15 1/19 4H045 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33/566 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A (31) priority claim No. 09 / 258,633 (32) priority date, 1999 February 26 (1999.2.26) (33) priority Kwon claimed countries the United States (US) (31) priority claim No. 09 / 421,134 (32) priority date 1999 October 19 (1999.10.19) (33) priority country the United States (US) ( 81) designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, B,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, B, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, C R, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD , GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, K Z, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, I,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,UZ,VN,YU,ZA,ZW Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 BB14 BB24 BB50 FA20 FB02 FB03 4B024 AA01 AA15 BA61 BA63 CA04 DA02 DA03 EA04 FA02 GA14 HA01 HA14 HA15 4B063 QA01 QQ08 QQ42 QQ53 QR32 QR51 QR55 QS25 QS34 4B064 AG20 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA03 BA05 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA081 ZA082 ZC022 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA40 CA40 DA50 DA75 EA21 FA74 I, S K, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW F-term (reference) 2G045 AA34 AA35 BB14 BB24 BB50 FA20 FB02 FB03 4B024 AA01 AA15 BA61 BA63 CA04 DA02 DA03 EA04 FA02 GA14 HA01 HA14 HA15 4B063 QA01 QQ08 QQ42 QQ53 QR32 QR51 QR55 QS25 QS34 4B064 AG20 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA03 BA05 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA081 ZA082 ZC022 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA40 CA40 DA50 DA75 EA21 FA74

Claims (26)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 (a)配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12に示されるヌクレオチド配列またはその相補物を含んでなる核酸分子;及び (b)配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12に示されるヌクレオチド配列またはその相補物からなる核酸分子 よりなる群から選択される単離された核酸分子。 1. A (a) SEQ ID NO: nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence or its complement shown in 1,3,4,6,7,9,10 or 12; and (b) SEQ ID NO: 1 an isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of a nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence or complement thereof shown in 3,4,6,7,9,10 or 12.
  2. 【請求項2】 (a)配列番号:2、5、8または11に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;及び (b)配列番号:2、5、8または11に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸分子。 Wherein (a) SEQ ID NO: 2, 5, 8 or comprising the amino acid sequence shown in 11 polypeptide; and (b) SEQ ID NO: the amino acid sequence shown in 2, 5, 8 or 11 an isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide selected from the group consisting of consisting polypeptide.
  3. 【請求項3】 配列番号:2、5、8または11に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする単離された核酸分子。 3. SEQ ID NO: 2, 5, 8 or isolated nucleic acid molecule encoding the allelic variants present in the polypeptide native comprising the amino acid sequence shown in 11.
  4. 【請求項4】 (a)配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12のヌクレオチド配列またはその相補物に少なくとも83%同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子; (b)配列番号:1、3、4、6、7、9、10もしくは12のヌクレオチド配列またはその相補物を含んでなる核酸の少なくとも20ヌクレオチドのフラグメントを含んでなる核酸分子; (c)配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列に少なくとも約87%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子;及び (d)配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子(ここで、該フラグメントは、配列番号:2、5 4. (a) SEQ ID NO: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence at least 83% identical to the nucleotide sequence or its complement of 12; ( b) SEQ ID NO: nucleic acid molecule comprising a fragment of at least 20 nucleotides of 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid comprising a nucleotide sequence or its complement of 12; (c) SEQ ID NO: nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence which is at least about 87% identical to the 2, 5, 8 or 11 amino acid sequence of; and (d) SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 amino acid sequence of in comprising at nucleic acid encoding a fragment of the polypeptide molecule (here, the fragment SEQ ID NO: 2, 5
    、8または11のアミノ酸配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含むものである)、 よりなる群から選択される単離された核酸分子。 , 8 or 11 which contains at least 15 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of) an isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of.
  5. 【請求項5】 請求項1、2、3または4のいずれか一つの核酸分子及び異種起源のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。 5. A comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide of any one of the nucleic acid molecules and heterologous of claims 1 to 4 isolated nucleic acid molecule.
  6. 【請求項6】 請求項1、2、3または4のいずれか一つの核酸分子を含んでなるベクター。 6. comprising any one of the nucleic acid molecule of claim 1, 2, 3 or 4 vector.
  7. 【請求項7】 発現ベクターである請求項6のベクター。 The vector of claim 6 7. is an expression vector.
  8. 【請求項8】 請求項7の発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞。 8. transfected host cells with an expression vector of claim 7.
  9. 【請求項9】 請求項8の宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、それによりポリペプチドを発現させることを含んでなるポリペプチドを発現させる方法。 9. A method of culturing a host cell of claim 8 in a suitable culture medium, thereby expressing a polypeptide comprising expressing the polypeptide.
  10. 【請求項10】 a)配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのフラグメント(ここで、該フラグメントは、配列番号:2、5、8 10. a) SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 comprising the amino acid sequence fragment of a polypeptide (where made of, said fragment, SEQ ID NO: 2, 5, 8
    または11の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むものである); b)配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体(ここで、該ポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号: 1、3、4、6、7、9、10または12からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるものである); c)配列番号: 1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも83%同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子によりコードされるポリペプチド;及び d)配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列に少なくとも87%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド よりなる群から選択される単離されたポリペプチド。 Or 11 of those comprising at least 15 contiguous amino acids); b) SEQ ID NO: 2, 5, 8 or 11 naturally occurring allelic variant of a polypeptide comprising the amino acid sequence of (here, the polypeptide sequence under stringent conditions number: 1,3,4,6,7,9,10 or nucleic acid molecule consisting of 12 those encoded by hybridizing nucleic acid molecule); c) sequence number: 1,3,4,6,7,9,10 or polypeptide encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which is at least 83% identical to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of 12; and d) SEQ ID NO: 2, 5, 8 or isolated polypeptide selected from the group consisting of polypeptide comprising an amino acid sequence at least 87% identical to the amino acid sequence of 11.
  11. 【請求項11】 配列番号:2、5、8または11のアミノ酸配列を含んでなる請求項10の単離されたポリペプチド。 11. SEQ ID NO: 2, 5, 8 or comprising the amino acid sequence of 11 isolated polypeptide of claim 10.
  12. 【請求項12】 異種起源のアミノ酸配列をさらに含んでなる請求項10のポリペプチド。 12. A polypeptide of claim 10, further comprising the amino acid sequence of a heterologous origin.
  13. 【請求項13】 請求項10のポリペプチドに選択的に結合する抗体。 13. An antibody that selectively binds to a polypeptide of claim 10.
  14. 【請求項14】 a)ポリペプチドに選択的に結合する化合物とサンプルとを接触させること;及び b)化合物がサンプル中のポリペプチドに結合するかどうかを決定し、それによりサンプル中の請求項10のポリペプチドの存在を検出すること を含んでなるサンプル中の請求項10のポリペプチドの存在を検出する方法。 14. a) polypeptide to contacting the compound with a sample to bind selectively; and b) the compound to determine whether to bind to the polypeptide in the sample, claims whereby the sample method for detecting the presence of a polypeptide of claim 10 in a sample comprising detecting the presence of 10 of the polypeptide.
  15. 【請求項15】 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である請求項14の方法。 15. The method of claim 14 compounds that bind to the polypeptide is an antibody.
  16. 【請求項16】 請求項10のポリペプチドに選択的に結合する化合物及び使用説明書を含んでなるキット。 16. A kit comprising a compound and instructions for use which selectively binds to a polypeptide of claim 10.
  17. 【請求項17】 a)核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーとサンプルとを接触させること;及び b)核酸プローブまたはプライマーがサンプル中の核酸分子に結合するかどうかを決定し、それによりサンプル中の請求項1、2、3または4のいずれか一つの核酸分子の存在を検出すること を含んでなるサンプル中の請求項1、2、3または4のいずれか一つの核酸分子の存在を検出する方法。 17. a) contacting a nucleic acid probe or primer and the sample that selectively hybridizes to the nucleic acid molecule; and b) a nucleic acid probe or primer to determine whether to bind to the nucleic acid molecule in a sample, whereby any one of the nucleic acid molecule of claim 1, 2, 3 or 4 in the sample comprising detecting the presence of any one of the nucleic acid molecule of claim 1, 2, 3 or 4 in a sample a method for detecting the presence of.
  18. 【請求項18】 サンプルがmRNA分子を含んでなり、そしてサンプルを核酸プローブと接触させる請求項17の方法。 18. sample comprises mRNA molecules and method of claim 17, contacting the sample with a nucleic acid probe.
  19. 【請求項19】 請求項1、2、3または4のいずれか一つの核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物及び使用説明書を含んでなるキット。 19. The method of claim 1, 2, 3 or 4 compounds and instructions for use of comprising at Kit selectively hybridize to any one of the nucleic acid molecule.
  20. 【請求項20】 a)ポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を試験化合物と接触させること;及び b)ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定すること を含んでなる請求項10のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法。 Poly and b) polypeptide comprises determining whether binding to a test compound according to claim 10; 20. a) contacting the cell with a test compound for expressing the polypeptide or polypeptide method of identifying a compound that binds to the peptide.
  21. 【請求項21】 ポリペプチドへの試験化合物の結合が、 a)試験化合物/ポリペプチド結合の直接検出による結合の検出; b)競合結合アッセイを用いる結合の検出;及び c)hVR-1、hVR-2またはrVR-2活性に関するアッセイを用いる結合の検出 よりなる群から選択される方法により検出される請求項20の方法。 The bond 21. test compound to the polypeptide, a) the test compound / detection of binding by direct detection of the polypeptide binding; b) detection of binding using a competition binding assay; and c) hVR-1, hVR the method of claim 20, which is detected by a method selected from the group consisting of detection of binding using an assay for 2 or RVR-2 activity.
  22. 【請求項22】 ポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞をポリペプチドの活性を調節するために十分な濃度のポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含んでなる請求項10のポリペプチドの活性を調節する方法。 22. A polypeptide or a cell expressing a polypeptide comprising contacting a compound that binds to a sufficient concentration of the polypeptide to modulate the activity of a polypeptide according to claim 10 of a polypeptide activity how to adjust the.
  23. 【請求項23】 a)請求項10のポリペプチドを試験化合物と接触させること;及びb)ポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を決定し、それによりポリペプチドの活性を調節する化合物を同定すること を含んでなる請求項10のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法。 23. a) claim 10 of a polypeptide that are contacted with a test compound; and determining the effect of and b) the test compound on the activity of the polypeptide, thereby identifying a compound that modulates the activity of a polypeptide method of identifying a compound that modulates the activity of a polypeptide of claim 10 comprising that.
  24. 【請求項24】 被験体の処置が起こるように被験体にhVR-1またはhVR-2モジュレーターを投与することを含んでなる異常なhVR-1またはhVR-2タンパク質活性または核酸発現を特徴とする疾患にかかっている被験体を処置する方法。 Characterized 24. comprising administering a hVR-1 or hVR-2 modulator to the subject as treatment of a subject occurs abnormal hVR-1 or hVR-2 protein activity or nucleic acid expression a method of treating a subject suffering from the disease.
  25. 【請求項25】 hVR-1またはhVR-2モジュレーターが小分子である請求項2 25. hVR-1 or claim 2 hVR-2 modulator is a small molecule
    4の方法。 4 of the way.
  26. 【請求項26】 疾患が痛み疾患(pain disorder)である請求項24の方法。 26. The method of claim 24 disease is pain disease (pain disorder).
JP2000582560A 1998-11-13 1999-11-12 New members and their use of capsaicin / vanilloid receptor family of proteins Pending JP2002531069A (en)

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