KR20220115602A - 세포의 조절된 아머를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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러셀 모리슨 고들리
미셸 엘리자베스 헝
게리 리
잭 추-치아오 린
티모시 콴-타 루
아센 보야노프 로그에프
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센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드
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Abstract

조절 가능 전사 인자 및/또는 활성화 유도성 프로모터를 사용하여 효과기 분자의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에서 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및 ACP 반응성 프로모터 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.

Description

세포의 조절된 아머를 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/947,427 및 2020년 11월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/116,103의 이익을 주장하고, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하고 그 전체가 참고로 포함된다. 20XX년 XX월 XX일에 생성된, 상기 ASCII 사본의 이름은 XXXXXUS_sequencelisting.txt이고 크기는 X,XXX,XXX 바이트이다.
배경
종양은 면역 체계에 의한 인식 및 소실을 피하기 위해 다양한 직접 및 간접 억제 전략을 사용한다. 이러한 탈출 전략은 세포 치료법을 효과적으로 차단할 수 있다. 효과기 조합의 발현인 조합 아머(combinatorial armoring)는 전체 암 면역 주기에 영향을 미치고 비아머(unarmored) 요법이 고형 종양에서 효과가 좋지 않기 때문에 세포 치료법의 활성을 높일 수 있다. 그러나 현재의 세포 및 유전자 치료제는 제어할 수 없다. 제어되지 않은 아머 요법은 대상체에서 독성을 가질 수 있다. 따라서, 효과기 분자의 조합의 발현을 제어하고 조절하는 추가적인 방법이 필요하다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서, 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, 여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 발현 시스템이 본원에서 제공되고: (a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 (b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및/또는 제2 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 발현 시스템은 추가의 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 상기 추가의 프로모터는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 발현 카세트 또는 제2 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트 및 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 제2 발현 카세트 및 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 발현 시스템은 열거된 구현예 1-359에 기재된 임의의 양태, 특징 또는 구현예를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 조작된 핵산의 임의의 양태, 특징 또는 구현예를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 발현 카세트가 (L-E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 개별 폴리펩티드로서 각 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그(skipping tag)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트는 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-천연 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP 결합 도메인 및 프로모터 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 프로모터 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 합성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 성가 ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 구성적 프로모터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
일부 구현예에서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
일부 구현예에서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15.
일부 구현예에서, 상기 성장 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: FLT3L 및 GM-CSF.
일부 구현예에서, 상기 공동-활성화 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L.
일부 구현예에서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
일부 구현예에서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 항원 인식 수용체를 추가로 암호화한다.
특정 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에서 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
특정 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에서 제공되고: 제1 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 활성화-조건부 제어 폴리펩티드-반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 항원 인식 수용체이고 ACP는 ACP가 동족 항원에 결합한 후 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 동족 항원에 결합함으로써 유도될 수 있는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 동족 항원에 결합한 후 상향 조절된 유전자의 프로모터 영역으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 합성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역과 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 항원 인식 수용체의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 항원 수용체 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 프로모터는 ACP, 링커 폴리뉴클레오티드 서열, 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1. 일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 GPC3을 인식한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 메조텔린 (MSLN)을 인식한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고, 여기서 VH는 하기를 포함하고: KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및 GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 그리고 여기서 VL는 하기를 포함한다: KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및 QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3).
일부 구현예에서, 상기 VH 영역은
EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 VL 영역은
DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열을 갖는 단일 도메인 단일클론 항체의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다:
QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는 QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130).
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하고, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 CAR이다.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 각각의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, MyD88 세포내 신호전달 도메인, 2B4 세포내 신호전달 도메인, CD16a 세포내 신호전달 도메인, DNAM-1 세포내 신호전달 도메인, KIR2DS1 세포내 신호전달 도메인, KIR3DS1 세포내 신호전달 도메인, NKp44 세포내 신호전달 도메인, NKp46 세포내 신호전달 도메인, FceRlg 세포내 신호전달 도메인, NKG2D 세포내 신호전달 도메인, 및 EAT-2 세포내 신호전달 도메인.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 막횡단 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceRlg 막횡단 도메인, 및 NKG2D.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 조절제이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 억제자(repressor)이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 활성화제이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인 (ERT2 도메인)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 인자이다.
일부 구현예에서, 상기 전사 인자는 징크-핑거-함유 전사 인자이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 전사 효과기 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ZF 단백질 도메인은 설계상 모듈식이고 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 효과기 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 직렬 카피로 이루어진 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제, 세 부분으로 된 활성화제는 VPR 활성화 도메인으로 알려짐; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제자 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된(hairy-related) 염기성 나선-루프-나선 억제자 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려짐; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.
일부 구현예에서, 상기 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)이다.
일부 구현예에서, 상기 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르이다. 일부 구현예에서, 그라조프레비르 및 엘바스비르는 약학 조성물로 공동-제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 정제이다. 일부 구현예에서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르는 2 대 1 중량비이다. 일부 구현예에서, 상기 그라조프레비르는 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르는 단위 용량당 50 mg이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 ERT2 도메인이 타목시펜 또는 이의 대사산물에 결합할 때 핵 국소화를 겪을 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 타목시펜 대사산물은 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 데그론을 추가로 포함하고, 상기 데그론은 ACP에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 텐덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 텐덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달의 히드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포 의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 면역조절 약물 (IMiD)에 대한 반응으로 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진한다.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물이다.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (서열 번호 131)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물이다.
일부 구현예에서, 상기 IMiD는 FDA 승인 약물이다.
일부 구현예에서, 상기 IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', ZF 단백질 도메인의 5', ZF 단백질 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 절연체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 절연체는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 반대 배향으로 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 조작된 핵산, 발현 시스템, 또는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 본원에 개시된 추가 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 조작된 핵산, 발현 시스템, 또는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 본원에 기재된 추가 발현 카세트, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 조작된 핵산, 발현 시스템, 또는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 본원에 기재된 추가 발현 카세트 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 재조합적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 세포의 게놈으로부터 선택된 유전자좌 또는 벡터로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC-유래 세포. 일부 구현예에서, 상기 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 자가 조직이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 동종이계이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포이다: 선암종 세포, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경교종 세포, 신장 종양 세포, 간 종양 세포, 폐 종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소 종양 세포, 췌장 종양 세포, 위 종양 세포, 고환 난황낭 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포.
일부 구현예에서, 상기 세포는 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작된다.
일부 구현예에서, 상기 종양용해성 바이러스는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체.
일부 구현예에서, 상기 종양용해 바이러스는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 클로스트리디움 베이제린키, 클로스트리디움 스포로게네스, 클로스트리디움 노비, 에쉐리히아 콜리, 슈도모나스 에루지노사, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 티피무리움, 및 살모넬라 콜레라수이스로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 세포이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 단리된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 단리된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 단리된 세포 또는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 단리된 세포 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 단리된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 단리된 세포 또는 조성물을 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 전신 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 대상체와 관련하여 동종이계이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
또 다른 양태에서, 조작된 핵산, 발현 시스템, 또는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 본원에 기재된 추가 발현 카세트의 지질 기반 구조가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 지질-기반 구조는 세포외 소포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 소포는 나노소포 및 엑소좀으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 지질-기반 구조는 지질 나노입자 또는 미셀을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 지질-기반 구조는 리포솜을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 지질-기재 구조, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 지질-기반 구조 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 지질-기반 구조 또는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 지질 기반 구조 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 지질-기반 구조 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 지질-기반 구조 또는 조성물을 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 전신 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 지질 기반 구조는 대상체에서 세포를 조작할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로부터 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로부터 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
또 다른 양태에서, 나노입자, 조작된 핵산, 발현 시스템, 또는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 본원에 기재된 추가 발현 카세트가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 나노입자는 무기 물질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 나노입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 나노입자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 나노입자 또는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 나노입자 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 나노입자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 나노입자 또는 조성물을 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 전신 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 나노입자는 대상체에서 세포를 조작할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 조작된 핵산을 포함하도록 조작된 바이러스가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 종양용해성 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 및 바이러스-유사 입자 (VLP)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스는 종양용해성 바이러스이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 종양 세포에서 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
일부 구현예에서, 상기 종양용해성 바이러스는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체.
또 다른 양태에서, 조작된 바이러스 또는 조성물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 임의의 조작된 바이러스 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 임의의 조작된 바이러스 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 치료 유효량의 임의의 조작된 바이러스 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 본원에 제공되고, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 임의의 조작된 바이러스 또는 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 전신 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 바이러스는 대상체의 세포를 감염시키고 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 단일 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
제153항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 발현 카세트가 (L 1 -E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L1 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되는 것인 조작된 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 여기서 제2링커 폴리뉴클레오티드는 제1 발현 카세트를 제2 발현 카세트에 연결한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자 및 ACP의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 (L 1 - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트는 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-천연 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 유린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP 결합 도메인 및 프로모터 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 프로모터 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 합성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 구성적 프로모터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
일부 구현예에서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
일부 구현예에서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; 및 GPR15.
일부 구현예에서, 상기 성장 인자는 FLT3L 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 공동-활성화 분자는 c-Jun, 4-1BBL, 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
일부 구현예에서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 제3 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 항원 인식 수용체를 추가로 암호화한다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 제3 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP)를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 항원 인식 수용체이고 ACP는 ACP가 동족 항원에 결합한 후 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 동족 항원에 결합함으로써 유도될 수 있는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 동족 항원에 결합한 후 상향 조절된 유전자의 프로모터 영역으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 항원 인식 수용체이고 ACP는 그의 동족 항원에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 그의 동족 항원에 결합함으로써 유도될 수 있는 유도성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 합성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역과 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역 사이에 국소화된 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 항원 인식 수용체의 번역과 작동 가능하게 연관된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 프로모터는 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열, 및 항원 인식 수용체에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 항원 수용체 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 항원 인식 수용체의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1. 일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 GPC3을 인식한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 메조텔린 (MSLN)을 인식한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고, 여기서 VH는 하기를 포함하고: KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및 GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 여기서 VL은 하기를 포함한다: KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및 QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3).
일부 구현예에서, 상기 VH 영역은 EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 VL 영역은 DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열을 갖는 단일-도메인 단일클론 항체의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다: QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130) 일부 구현예에서, 상기 scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하고, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
일부 구현예에서, 상기 항원 인식 수용체는 CAR이다.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, 및 MyD88 세포내 신호전달 도메인.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 막횡단 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceRlg 막횡단 도메인, 및 NKG2D 막횡단 도메인.
일부 구현예에서, 상기 CAR은 항원-결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 조절제이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 억제자이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 활성화제이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인 (ERT2 도메인)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 전사 인자이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 징크-핑거-함유 전사 인자이다.
일부 구현예에서, 상기 전사 인자는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 효과기 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ZF 단백질 도메인은 설계상 모듈식이고 징크 핑거 어레이(ZFA)로 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 효과기 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피로 이루어진 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인으로 이루어진 세 부분으로 된 활성화제, 세 부분으로 된 활성화제는 VPR 활성화 도메인으로 알려져 있음; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제자 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음); DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.
일부 구현예에서, 상기 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)이다.
일부 구현예에서, 상기 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 NS3프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르이다. 일부 구현예에서, 여기서 그라조프레비르 및 엘바스비르는 약학 조성물로 공동-제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 정제이다. 일부 구현예에서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르는 2 대 1 중량비이다. 일부 구현예에서, 그라조프레비르는 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르는 단위 용량당 50 mg이다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 ERT2 도메인이 타목시펜 또는 그의 대사산물에 결합할 때 핵 국소화를 겪을 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 타목시펜 대사산물은 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 ACP는 데그론을 추가로 포함하고, 상기 데그론은 ACP에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개의 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개의 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달의 히드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포 의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 면역조절 약물 (IMiD)에 대한 반응으로 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진한다.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물이다.
일부 구현예에서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (서열 번호 131)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물이다.
일부 구현예에서, 상기 IMiD는 FDA 승인 약물이다.
일부 구현예에서, 상기 IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 데그론은 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', ZF 단백질 도메인의 5', ZF 단백질 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 핵산은 절연체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 절연체는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 반대 배향으로 국소화된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 제3 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, 여기서 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하다.
일부 구현예에서, 제3 발현 카세트가 (L-E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제3 발현 카세트는 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 비-천연 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
일부 구현예에서, 상기 추가 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 추가 프로모터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구성적 프로모터이다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
일부 구현예에서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
일부 구현예에서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; 및 GPR15.
일부 구현예에서, 상기 성장 인자는 FLT3L 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 공동-활성화 분자는 c-Jun, 4-1BBL, 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
일부 구현예에서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC 유래 세포. 일부 구현예에서, 상기 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 자가 조직이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 동종이계이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포이다: 선암종 세포, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경교종 세포, 신장 종양 세포, 간 종양 세포, 폐 종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소 종양 세포, 췌장 종양 세포, 위 종양 세포, 고환 난황낭 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포.
일부 구현예에서, 상기 세포는 종양용해 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작되었다.
일부 구현예에서, 상기 종양용해성 바이러스는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체.
일부 구현예에서, 상기 종양용해 바이러스는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 박테리아 세포이다: 클로스트리디움 베이제린키, 클로스트리디움 스포로게네스, 클로스트리디움 노비, 에쉐리히아 콜리, 슈도모나스 에루지노사, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 티피무리움, 및 살모넬라 콜레라수이스.
또 다른 양태에서, 조작된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 치료 유효량의 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법을 본원에서 제공하고, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 치료 유효량의 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 전신 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 대상체와 관련하여 동종이계이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
일부 구현예에서, 상기 방법은 프로테아제 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 억제성 프로테아제를 억제하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물의 투여 전, 투여와 동시에, 투여 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르이다. 일부 구현예에서, 그라조프레비르 및 엘바스비르는 약학 조성물로 공동-제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 정제이다. 일부 구현예에서, 그라조프레비르 및 엘바스비르는 2 대 1 중량비이다. 일부 구현예에서, 그라조프레비르는 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르는 단위 용량당 50 mg이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 타목시펜 또는 그의 대사산물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 타목시펜 대사산물은 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 이들 및 다른 특징, 양태, 및 장점은 다음의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1a는 minCMV 프로모터 및 mCherry 유전자를 갖는 예시적인 조절 가능한 TF 단백질 및 TF 유도성 유전자의 다이어그램을 제공한다.
도 1b는 아수나프레비르의 존재 또는 부재하에 조절 가능한 TF 및 mCherry 벡터를 모두 발현하는 세포에서 mCherry 단백질의 발현을 나타낸다.
도 1c는 minYB_TATA 프로모터 및 mCherry 유전자를 갖는 예시적인 조절 가능한 TF 단백질 및 조절 가능한 TF 유도성 유전자의 다이어그램을 제공한다.
도 1d는 아수나프레비르의 존재 또는 부재하에 조절 가능한 TF 및 mCherry 벡터를 모두 발현하는 세포에서 mCherry 단백질의 발현을 나타낸다.
도 2a는 minTK 프로모터 및 IL-10 유전자를 갖는 조절 가능한 TF 및 조절 가능한 TF 유도성 유전자를 발현하는 예시적인 단일 벡터의 다이어그램을 제공한다.
도 2b는 아스나프레비르의 존재 또는 부재하에 조절 가능한 TF 및 IL-10 벡터를 발현하는 세포에서의 IL-10 생산을 나타낸다.
도 3a는 minTK 프로모터 및 IL-12 유전자를 갖는 조절 가능한 TF 및 조절 가능한 TF 유도성 유전자를 발현하는 예시적인 단일 벡터의 다이어그램을 제공한다.
도 3b는 아스나프레비르의 존재 또는 부재하에 조절 가능한 TF 및 IL-12 벡터를 발현하는 세포에서의 IL-12 생산을 나타낸다.
도 4a는 minYB_TATA 프로모터 및 mCherry 유전자를 갖는 조절 가능한 TF 유도성 유전자 및 myc-태그된 CAR 유전자에 연결된 조절 가능한 TF를 발현하는 예시적인 단일 벡터의 다이어그램을 제공한다.
도 4b는 아스나프레비르의 존재 및 부재하에 조절 가능한 TF 및 mCherry 벡터를 발현하는 세포에서의 CAR의 발현을 나타낸다.
도 4c는 아수나프레비르의 존재 또는 부재하에 조절 가능한 TF 및 mCherry 벡터를 발현하는 세포에서의 mCherry의 발현을 나타낸다.
도 5는 단일 벡터 시스템에서 조절 가능한 TF 및 효과기 유전자 발현을 위한 추가적인 예시적인 벡터를 제공한다.
도 6a는 GPC3 CAR 작제물 ("1106")의 개략도를 나타낸다.
도 6b는 유세포 분석에 의해 평가된 다양한 작제물과 조합된 CAR 형질도입 프로파일을 나타낸다.
도 7은 평가된 YFP MFI (상부 패널) 및 백분율 (하부 패널)에 따른 다양한 작제물의 형질도입 프로파일을 나타낸다.
도 8a는 CAR의 동시발현이 있거나 (오른쪽) 없는 (왼쪽) 다양한 작제물의 IL-12 생산을 나타낸다.
도 8b는 CAR의 동시발현이 있거나 (오른쪽) 없는 (왼쪽) 다양한 작제물의 IL-15 생산을 나타낸다.
도 8c는 CAR의 동시발현이 있거나 (오른쪽) 없는 (왼쪽) 다양한 작제물의 IL-21 생산을 나타낸다.
도 9a는 표적 HepG2 세포와의 공동 배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 IL-12 생산을 나타낸다.
도 9b는 표적 HepG2 세포와의 공동 배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 IL-15 생산을 나타낸다.
도 9c는 표적 HepG2 세포와의 공동 배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 IL-21 생산을 나타낸다.
도 10a는 표적 HepG2 세포와의 공동 배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 TNFa 생산을 나타낸다.
도 10b는 표적 HepG2 세포와의 공동-배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 IFNg 생산을 나타낸다.
도 10c는 표적 HepG2 세포와의 공동-배양이 있거나 (하부) 없는 (상부) 다양한 작제물의 IL-2 생산을 나타낸다.
도 11a는 GPC3 CAR 작제물 ("1108")의 개략도를 나타낸다.
도 11b는 유세포 분석에 의해 평가된 다양한 작제물과 조합된 CAR 형질도입 프로파일을 나타낸다.
도 12는 다양한 작제물로 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스에 대해 11일, 14일, 21일 및 24일에 BLI 측정에 의해 평가된 종양 크기를 나타낸다. 도 13c - IL-15; 도 13d - IL-12; 도 13e - IL-21)
도 13a는 바이러스 없이 T 세포 (도 13a - 왼쪽 패널) 또는 사이토카인이 없는 GPC3-CAR T 단독 (도 13a - 오른쪽 패널)으로 처리한 개별 마우스를 나타낸다.
도 13b는 IL-12/IL-21 동시-발현 아머로 조작된 GPC3-CAR T로 처리된 개별 마우스를 나타낸다.
도 13c는 IL-15 아머로 조작된 GPC3-CAR T로 처리된 개별 마우스를 나타낸다.
도 13d는 IL-12 아머로 조작된 GPC3-CAR T로 처리된 개별 마우스를 나타낸다.
도 13e는 IL-21 아머로 조작된 GPC3-CAR T로 처리된 개별 마우스를 나타낸다.
도 14a는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 13일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 TNFα의 생산을 나타낸다.
도 14b는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 13일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 IFNγ의 생산을 나타낸다.
도 14c는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 13일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 IL-2의 생산을 나타낸다.
도 15a는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 10일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 IL-12의 생산을 나타낸다.
도 15b는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 10일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 IL-15의 생산을 나타낸다.
도 15c는 처리 후 3일 (상부 패널) 및 10일 (하부 패널)에 다양한 작제물로 처리된 마우스의 혈장에서 평가된 바와 같은 IL-21의 생산을 나타낸다.
도 16a는 종양 주사 후 14일 (T 세포 치료 후 3일)에 다양한 작제물로 조작된 T 세포에 대한 종양 크기 (왼쪽 패널) 및 인간 T 세포 지속성 (오른쪽 패널)을 나타낸다.
도 16b는 종양 주사 후 21일 (T 세포 처리 후 13일)에 다양한 작제물로 조작된 T 세포에 대한 종양 크기 (왼쪽 패널) 및 인간 T 세포 지속성 (오른쪽 패널)을 나타낸다.
도 17a는 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용하는 다양한 페이로드 발현 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 17b는 상이한 양의 4-OHT로 처리한 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현을 나타낸다.
도 17c는 상이한 양의 N-데스메틸타목시펜으로 처리한 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현을 나타낸다.
도 17d는 상이한 양의 엔독시펜으로 처리한 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현을 나타낸다.
도 17e는 처리 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현의 요약을 나타낸다.
도 18은 처리 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 발현의 요약을 나타낸다.
도 19는 처리 후 다양한 타목시펜 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 발현의 유세포 분석 플롯을 나타낸다.
도 20은 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용하는 다양한 페이로드 발현 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 21은 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용하는 다양한 페이로드 발현 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 22는 다양한 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 발현을 나타낸다.
도 23a는 특정 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현을 나타낸다.
도 23b는 특정 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 발현을 나타낸다.
도 24a는 특정 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 리포터 발현을 나타낸다.
도 24b는 특정 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 발현을 나타낸다.
도 25는 NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (작제물 "1845")을 사용하는 약물 유도성 형식에 대한 ACP ("synTF"라고도 함) 뿐만 아니라 hIL-12 효과기 분자 페이로드를 구동하는 4x BS minYB-TATA ACP 반응성 프로모터를 사용하는 발현 카세트의 개략도를 나타낸다.
도 26은 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템을 사용한 hIL-12의 시험관 내 생산을 나타낸다. 컬럼은 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 약물 없음, 0.1μM GRZ, 및 0.5μM GRZ이다.
도 27은 생체 내에서 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템을 평가하는데 사용된 실험 설계를 나타낸다.
도 28은 생체 내에서 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포의 배수 확장을 나타낸다.
도 29는 생체 내에서 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포의 글루코스 프로파일을 나타낸다.
도 30은 생체 내에서 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 순환 T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 31은 생체 내에서 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포에 의해 생성된 혈장 내 hIL-12의 생산을 나타낸다.
도 32는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용하는 다양한 페이로드 발현 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 33은 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-12의 시험관 내 생산을 나타낸다.
도 34는 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-15의 시험관 내 생산을 나타낸다.
도 35는 다양한 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에서의 CAR 발현을 나타낸다.
도 36은 표적 세포 사멸 (LDH 방출)에 의해 평가된 바와 같은 다양한 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용한 CAR 활성을 나타낸다.
도 37은 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 NK 세포에 의한 시험관 내 hIL-12 생산을 나타낸다.
도 38은 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 TF 발현 시스템을 사용하는 다양한 페이로드 발현 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 39는 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-12의 시험관 내 생산을 나타낸다.
도 40은 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-15의 시험관 내 생산을 나타낸다.
도 41은 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-15의 시험관 내 생산을 나타낸다.
도 42는 다양한 그라조프레비르 투여 요법에 대한 시간 경과에 따른 생체 내 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 혈액 내 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨)를 나타낸다 (4일차 상부 패널 ; 8일째 중간 패널, 12일째 하부 패널). *2그룹의 샘플이 손실되어 분석에 포함되지 않았다.
도 43은 4일째에 다양한 그라조프레비르 투여 요법에 대해 생체 내에서 구성적 hIL-12발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포에 의해 생성된 혈장 내 hIL-12의 생산을 나타낸다.
도 44는 8일 (왼쪽 패널) 및 12일 (오른쪽 패널)에 다양한 그라조프레비르 투여 요법에 대해 생체 내에서 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포에 의해 생성된 혈장 내 hIL-12의 생산을 나타낸다.
도 45는 "온/오프/온(on/off/on)" 그라조프레비르 (Grz) 투여 요법을 나타낸다.
도 46은 생체 내에서 "온/오프/온" 그라조프레비르 (Grz) 투여 요법에 대해 지정된 날짜에 시간 경과에 따라 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 혈액 내 T 세포 (hCD3+:hCD45+가 살아있는 세포의 %로 표시됨)를 나타낸다.
도 47은 생체 내에서 "온/오프/온" 그라조프레비르 (Grz) 투여 요법에 대해 표시된 날짜에 시간 경과에 따른 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포에 의해 생성된 혈장 내 hIL-12의 생산을 나타낸다.
도 48은 생체 내에서 "온/오프/온" 그라조프레비르 (Grz) 투여 요법에 대해 표시된 날짜에 시간 경과에 따라 구성적 hIL-12 발현 시스템 또는 약물 유도성 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 조작된 T 세포가 투여된 마우스의 체중을 나타낸다.
도 49는 CAR 세포가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는(turn on) 프로모터를 평가하기 위한 스크린에 대한 워크플로우를 제시한다.
도 50은 CAR 세포가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 프로모터에 대한 스크린에서 평가된 작제물 및 후보 프로모터를 제시한다.
도 51은 CAR 세포가 HepG2 표적 세포와 함께 (오른쪽 컬럼) 또는 HepG2 표적 세포 없이 (왼쪽 컬럼) 배양 후 24시간에 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 프로모터에 대한 스크린에서 평가된 작제물 및 후보 프로모터에 대한 유세포 분석에 의한 정량화된 mKate 발현을 나타낸다.
도 52는 CAR 세포가 HepG2 표적 세포와 함께 (오른쪽 컬럼) 또는 HepG2 표적 세포 없이 (왼쪽 컬럼) 배양 후 48시간에 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 프로모터에 대한 스크린에서 평가된 작제물 및 후보 프로모터에 대한 유세포 분석에 의한 정량화된 mKate 발현을 나타낸다.
도 53은 CAR 세포가 HepG2 표적 세포 ("프로모터+표적")와 함께 배양 후 24시간 (상단 패널) 및 48시간 (하단 패널)에 표적 세포에 의해 활성화되는 경우 전사를 켜는 확인된 프로모터에 대한 유세포 분석에 의한 mKate 발현의 히스토그램을 나타낸다. HepG2 표적 없이 배양된 CAR 단독 ("CAR 단독"), HepG2 표적과 함께 배양된 CAR 단독 ("CAR+표적"), HepG2 표적 없이 배양된 CAR + 프로모터 ("프로모터 단독")도 나타낸다.
도 54는 엘바스비르와 함께 또는 엘바스비르 없이 다양한 농도의 그라조프레비르로 처리한 후 다양한 ACP 기반 조절 가능한 발현 시스템으로 형질도입된 T 세포에 의한 hIL-12의 시험관 내 생산을 나타낸다.
정의
청구범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 다음과 같이 정의된다.
용어 "개선"은 질환 상태, 예를 들어, 암 질환 상태의 치료에서 예방, 중증도 또는 진행의 감소, 관해 또는 치유를 포함하는 임의의 치료학적으로 유익한 결과를 지칭한다.
용어 "제자리"는 살아있는 유기체와 분리되어 성장하는, 예를 들어 조직 배양에서 성장하는 살아있는 세포에서 발생하는 과정을 지칭한다.
용어 "생체 내"는 살아있는 유기체에서 일어나는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "포유동물"은 인간 및 비인간 둘 모두를 포함하고 인간, 비인간 영장류, 개과, 고양이과, 쥐과, 소, 말, 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 퍼센트 "동일성"은 하기에 기술된 서열 비교 알고리즘 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용할 수 있는 기타 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 일치를 위해 비교되고 정렬될 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, 퍼센트 "동일성"은 비교되는 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어, 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로, 비교될 2개의 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교에 대해, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열과 관련된 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 지역적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이러한 알고리즘 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터 구현에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로 하기 Ausubel et al. 참조) 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘이고, 이는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 제공된다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예를 들어 세포에서 단백질 응집을 조절하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 질환의 증상을 개선하는데 효과적인 양이다. 치료적 유효량은 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방적 유효량"일 수 있다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
조작된 핵산 및 폴리펩티드
세포 요법에서 약물 발현의 조절은 치료 효능 창에 도달하는 데 필요하다. 이러한 방법은 임의의 바람직한 효과기 분자 또는 효과기 분자의 조합의 발현을 유도할 수 있는 조절 가능한 전사 인자를 사용하여 본원에 기재되어 있다. 이 시스템은 예를 들어 ON 또는 OFF 구성을 가능하게 하는 모듈식 프로테아제 시스템을 사용하여 세포내 또는 막 결합 단백질을 조절할 수 있으므로 다목적이다. FDA 승인을 받은 프로테아제 스위치 약물을 사용할 수 있고 유리한 약동학 프로파일로 경구 전달을 통해 투여할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 예를 들어, 세포 또는 유전자 요법에서 조절된 면역조절 효과기 발현을 위해 사용될 수 있다. 조절 가능한 전사 인자는 예를 들어, CAR T 세포, CAR NK 세포, TCR T 세포, TIL 요법, 바이러스-특이적 T 세포, 또는 임의의 다른 적절한 면역 세포 요법과 함께 사용될 수 있다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및/또는 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 선택적으로 상기 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합하여 제1 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, ACP는 약물 유도성 도메인, 예를 들어 테트라사이클린 반응성 도메인 (예를 들어, TetR 도메인) 또는 억제성 프로테아제 도메인 (예를 들어, NS3 프로테아제)을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 항원 인식 수용체이고 수용체는 그의 동족 항원에 결합, 예를 들어 동족 항원에 대한 CAR 결합 후 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있고 ("활성화 유도성 시스템"), ACP 반응성 프로모터는 CAR 신호전달에 반응하여 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열을 포함한다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에 제공되고: 하기를 포함하는 제1 발현 카세트: (a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 핵산이 본원에 제공되고: 제1 프로모터 및 활성화 조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 활성화 조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하다. 제2 발현 카세트의 발현은 ACP 반응성 프로모터에 결합하는 ACP에 의해 유도될 수 있다. ACP는 수용체, 예를 들어 항원 인식 수용체일 수 있고, ACP 반응성 프로모터로부터 발현을 유도하는 리간드 결합 후 다운스트림 신호와 같이, ACP가 동족 리간드 (예를 들어, 동족 항원)에 결합할 때 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 비제한적인 예시적인 예에서, ACP는 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있고, CAR이 동족 수용체에 결합할 때, 다운스트림 신호전달 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 수용체 신호전달)은 표적 항원의 CAR 결합에 특이적인 ACP 반응성 프로모터로부터 사이토카인 페이로드 (예를 들어, 사이토카인 아머)의 발현을 유도할 수 있다. 활성화 유도성 시스템에서 유용한 ACP 반응성 프로모터의 예는 하기에 기술되어 있다 ("프로모터" 참조).
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트가 2개 이상의 (L-E) X 의 단위를 포함하는 경우, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 개별 폴리펩티드로서 각 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
X는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 조작된 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함한다. 일반적으로, 각각의 발현 카세트는 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 지칭한다. 예를 들어, ACP, 효과기 분자, 및 항원 인식 수용체는 동일한 조작된 핵산 (예를 들어, 벡터) 상의 별도의 발현 카세트에 의해 암호화될 수 있다. 발현 카세트는 서로에 대해 임의의 방향으로 배향될 수 있다 (예를 들어, 카세트는 동일한 배향 또는 반대 배향일 수 있음). 3개 이상의 발현 카세트를 갖는 예시적인 조작된 핵산에서 카세트는 동일한 배향 또는 혼합된 배향일 수 있다 (예를 들어, 제1 및 제2 카세트는 동일한 배향일 수 있고 제3 카세트는 반대 배향일 수 있음). 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화된다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 반대 방향으로 국소화된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 조작된 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 2개 이상의 조작된 핵산을 포함하는 조절된 아머를 위한 전략은 "조작된 발현 시스템"으로 지칭될 수 있다. 한 양태에서, 하기를 포함하는 조작된 발현 시스템이 본원에 제공되고 (a) 제1 프로모터 및 활성화 조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 (2) ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트: (L - E) X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및/또는 제2 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 조작된 발현 시스템은 추가의 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 추가의 프로모터는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 발현 카세트 또는 제2 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 발현 카세트와 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트 및 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 제2 발현 카세트를 포함한다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 제2 발현 카세트 및 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함한다. 발현 시스템의 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함한다.
발현 시스템의 예시적인 비제한적 예로서, (1) 항원 인식 수용체 발현 카세트 및 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, ACP 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고; (2) ACP 발현 카세트 및 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 항원 인식 수용체 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고; (3) ACP 발현 카세트 및 항원 인식 수용체 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 효과기 분자 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 추가의 예시적인 비제한적 예에서, 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, ACP 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 다중시스트론성일 수 있고, 즉, 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 (예를 들어, 다중 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 효과기 분자)가 단일 mRNA 전사체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 다중시스트론성 발현 카세트는 ACP 및 항원 인식 수용체 모두, 예를 들어, 구성적 프로모터에 의해 구동되는 단일 발현 카세트로부터 발현되는 둘 모두를 암호화할 수 있다. 다른 예에서, 다중시스트론성 발현 카세트는 효과기 분자 및 항원 인식 수용체 모두, 예를 들어, ACP 반응성 프로모터에 의해 구동되는 단일 발현 카세트로부터 발현되는 둘 모두를 암호화할 수 있다. 발현 카세트는 다양한 링커의 사용을 통해 다중시스트론성일 수 있으며, 예를 들어, 5'에서 3' 방향으로 첫 번째 유전자:링커:두 번째 유전자에서와 같이, 첫 번째 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 두 번째 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 다중시스트론성 기능 및 옵션은 " 다중시스트론성 및 다중 프로모터 시스템" 섹션에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드로부터 선택된다. 또한, 조작된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 절연체를 추가로 포함한다. 절연체는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치할 수 있다. 절연체는 두 카세트가 서로에 대해 동일한 방향에 있는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치할 수 있다. 절연체는 카세트가 서로에 대해 반대 방향에 있는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치할 수 있다. 절연체는 인핸서 차단 또는 장벽 기능을 갖는 시스 조절 요소이다. 인핸서-차단제 절연체는 인핸서가 근처 유전자의 프로모터에 작용하는 것을 차단한다. 장벽 절연체는 유크로마틴 침묵을 방지한다. 본 개시내용의 적합한 절연체의 예는 Liu M, et al., Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):198-203에 기술된 A2 절연체이다. 추가 절연체는 West et al, Genes & Dev, 002. 16: 271-288에 기술되어 있고, 둘 다 그 전체가 참고로 포함된다. 적합한 절연체의 다른 예는 제한 없이 A1 절연체, CTCF 절연체, 집시 절연체, HS5 절연체, 및 β-글로빈 좌 절연체, 예를 들어 cHS4를 포함한다. 일부 구현예에서, 절연체는 A2 절연체, A1 절연체, CTCF 절연체, HS5 절연체, 집시 절연체, β-글로빈 좌 절연체, 또는 cHS4 절연체이다. 절연체는 A2 절연체일 수 있다.
활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)
일부 구현예에서, ACP는 전사 조절제이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 억제자이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 활성화제이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 인자이다. 일부 구현예에서, ACP는 DNA-결합 도메인 및 전사 효과기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 징크-핑거-함유 전사 인자이다. 일부 구현예에서, 징크-핑거-함유 전사 인자는 합성 전사 인자일 수 있다. 일부 구현예에서, ACP DNA-결합 도메인은 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 효과기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 테트라사이클린 (또는 이의 유도체) 억제자 (TetR) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 본 개시내용의 항원 인식 수용체이다.
징크 핑거 단백질 도메인
일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 설계상 모듈식이고 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 구성된다. 징크 핑거 어레이는 함께 연결된 여러 징크 핑거 단백질 모티프를 포함한다. 각각의 징크 핑거 모티프는 다른 핵산 모티프에 결합한다. 이는 원하는 핵산 서열에 특이성을 갖는 ZFA를 생성한다. ZF 모티프는 서로 직접 인접하거나, 유연한 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, ZFA는 일렬로 배열된 ZF 모티프의 어레이, 스트링 또는 사슬이다. ZFA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,1 3, 14, 또는 15개 징크 핑거 모티프를 가질 수 있다. ZFA는 1-10, 1-15, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 또는 5-15개 징크 핑거 모티프를 가질 수 있다.
ZF 단백질 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 이상의 ZFA를 가질 수 있다. ZF 도메인은 1-10, 1-15, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 또는 5-15개 ZFA를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA(들)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 하나의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 2개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 3개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 4개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 5개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 10개의 ZFA를 포함할 수 있다.
예시적인 ZF 단백질 도메인은 서열 SRPGERPFQCRICMRNFSRRHGLDRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSSLKRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSVRHNLTRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSNLSRHLKTHTGSQKPFQCRICMRNFSQRSSLVRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSESGHLKRHLRTHLRGS (서열 번호 88)에 나타낸다.
ACP 효과기 도메인
ACP는 또한 효과기 도메인, 예를 들어 전사 효과기 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 전사 효과기 전사 인자의 효과기 또는 활성화제 도메인일 수 있다. 전사 인자 활성화 도메인은 또한 트랜스활성화 도메인으로 알려져 있으며, 유전자 전사를 활성화하거나 억제하는 작용을 하는 전사 공조절제와 같은 단백질에 대한 스캐폴드 도메인으로 작용한다. 임의의 적합한 전사 효과기 도메인은 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피로 이루어진 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제, 세 부분으로 된 활성화제는 VPR 활성화 도메인으로 알려져 있음; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 ACP에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 효과기 도메인은 하기로부터 선택된 전사 효과기 도메인이다: 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피로 이루어진 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; ; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제, 세 부분으로 된 활성화제는 VPR 활성화 도메인으로 알려져 있음; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.
예시적인 전사 효과기 도메인 단백질 서열은 표 8에 제시되어 있다. 예시적인 전사 효과기 도메인 뉴클레오티드 서열은 표 9에 제시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
약물 유도성 도메인
일부 구현예에서, ACP는 소분자 (예를 들어, 약물) 유도성 폴리펩티드이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ACP는 테트라사이클린 (또는 이의 유도체)에 의해 유도될 수 있고, TetR 도메인 및 VP16 효과기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 타목시펜 또는 이의 대사산물, 예를 들어 4-히드록시-타목시펜 (4-OHT)에 의해 유도될 수 있고, 에스트로겐 수용체 변이체, 예를 들어 ERT2를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 포함하는 소분자 (예를 들어, 약물) 유도성 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 용어 "억제성 프로테아제"는 (예를 들어, 프로테아제에 결합하는) 특이적 작용제의 존재 또는 부재에 의해 불활성화될 수 있는 프로테아제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 억제성 프로테아제는 특이적 작용제의 부재하에 활성이고 (동족 절단 부위를 절단하는) 특이적 작용제의 존재하에 불활성이다 (동족 절단 부위를 절단하지 않음). 일부 구현예에서, 특이적 작용제는 프로테아제 억제제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 본 개시내용의 주어진 억제성 프로테아제를 특이적으로 억제한다.
억제성 프로테아제의 비제한적 예는 C형 간염 바이러스 프로테아제 (예를 들어, NS3 및 NS2-3); 신호 펩티다제; 서브틸리신/켁신 패밀리의 프로단백질 전환효소 (퓨린, PCI, PC2, PC4, PACE4, PC5, PC); 소수성 잔기 (예를 들어, Leu, Phe, Val, 또는 Met)에서 절단하는 프로단백질 전환효소; Ala 또는 Thr과 같은 작은 아미노산 잔기에서 절단하는 프로단백질 전환효소; 프로피오멜라노코르틴 전환 효소 (PCE); 크로마핀 과립 아스파르트산 프로테아제 (CGAP); 프로호르몬 티올 프로테아제; 카르복시펩티다제 (예를 들어, 카르복시펩티다제 E/H, 카르복시펩티다제 D 및 카르복시펩티다제 Z); 아미노펩티다제 (예를 들어, 아르기닌 아미노펩티다제, 라이신 아미노펩티다제, 아미노펩티다제 B); 프롤릴 엔도펩티다제; 아미노펩티다제 N; 인슐린 분해효소; 칼페인; 고분자량 프로테아제; 및 카스파제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9를 포함한다. 다른 프로테아제는 아미노펩티다제 N; 퓨로마이신 민감성 아미노펩티다제; 안지오텐신 전환 효소; 피로글루타밀 펩티다제 II; 디펩티딜 펩티다제 IV; N-아르기닌 이염기성 전환효소;엔도펩티다제 24.15; 엔도펩티다제 24.16; 아밀로이드 전구체 단백질 분비효소 알파, 베타 및 감마; 안지오텐신 전환 효소 세크레타제; TGF 알파 세크라타제; T F 알파 세크라타제; FAS 리간드 세크라타제; TNF 수용체-I 및 -II 세크라타제; CD30 세크라타제; KL1 및 KL2 세크라타제; IL6 수용체 세크라타제; CD43, CD44 세크라타제; CD 16-1 및 CD 16-11 세크라타제; L-셀렉신 세크라타제; 엽산 수용체 세크라타제; MMP 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15; 유로키나제 플라스미노겐 활성화제; 조직 플라스미노겐 활성화제; 플라스민; 트롬빈; BMP-l (프로콜라겐 C-펩티다제); ADAM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11; 및, 그랜자임 A, B, C, D, E, F, G, 및 H를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 프로테아제에 대한 논의는 예를 들어, V. Y. H. Hook, Proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing, RG Landes Company, Austin, Tex., USA (1998); N. M. Hooper et al., Biochem. J. 321 : 265-279 (1997); Z. Werb, Cell 91 : 439-442 (1997); T. G. Wolfsberg et al., J. Cell Biol. 131 : 275-278 (1995); K. Murakami 및 J. D. Etlinger, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1249-1259 (1987); T. Berg et al., Biochem. J. 307: 313-326 (1995); M. J. Smyth 및 J. A. Trapani, Immunology Today 16: 202-206 (1995); R. V. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272: 9677-9682 (1997); 및 N. A. Thomberry et al., J. Biol. Chem. 272: 17907-17911 (1997) 참조, 그 개시내용이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "동족 절단 부위"는 억제성 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 특정 서열 또는 서열 모티프를 지칭한다. 프로테아제에 대한 절단 부위는 단백질 분해성 절단 동안 프로테아제에 의해 인식되는 특정 아미노산 서열 또는 모티프를 포함하고 일반적으로 절단 결합의 양쪽에 주변의 1 내지 6개의 아미노산을 포함하고, 이는 프로테아제의 활성 부위에 결합하고 기질로 인식하는 데 사용된다.
상기 및 표 1에 열거된 것들을 포함하는 다른 프로테아제가 사용될 수 있다. 프로테아제가 선택될 때, 그의 동족 절단 부위 및 프로테아제에 결합하고 억제하는 것으로 당업계에 공지된 프로테아제 억제제를 조합하여 사용할 수 있다. 사용을 위한 예시적인 조합이 하기 표 1에 제공된다. 프로테아제의 대표적인 서열은 uniprot.org 웹사이트를 통해 UniProt을 포함한 공개 데이터베이스에서 사용할 수 있다. 프로테아제에 대한 UniProt 수탁 번호도 하기 표 1에 제공된다.
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일부 구현예에서, 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 DNA-결합 도메인과 ACP의 효과기 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)이다. 일부 구현예에서, 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다. 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 프로테아제 억제제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르 (C형 간염 바이러스 NS5A 복제 복합체의 NS5A 억제제)의 조합이다. 그라조프레비르 및 엘바스비르는 정제 형태 (예를 들어, 상표명 Zepatier® 하에 이용 가능한 정제)와 같은 약제학적 조성물로서 공동 제형화될 수 있다. 그라조프레비르 및 엘바스비르는 각각 2:1 중량비로, 예를 들어 100 mg 그라조프레비르 50 mg 엘바스비르의 단위 용량 (예를 들어, 상표명 Zepatier® 하에 이용 가능한 정제에서와 같이)으로 공동 제형화될 수 있다. 그라조프레비르와 구조적으로 유사한 프로테아제 억제제, 예를 들어 하기 일반식 (I)을 사용할 수 있고
Figure pct00010
식 중
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는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고리이고,
Figure pct00012
R1은 ―CO2R10　및 ―CONR10SO2R6로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 ―CH-CH2이고; R3는 C1-C6　알킬이고; R6는 C3　시클로알킬이고; Y는 ―OC(O)―로 이루어진 군으로부터 선택되고; Z는 직접 결합이고; M은 C1-C12　알킬렌 및 C2-C12　알케닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고, M은 C1-C8　알킬 및 -CH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개 치환체 F로 치환되고; X는 ―(CH2)0-3O―로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00013
는 존재하는 경우　―(CH2)0-3에 부착되고; 각각의 R10은 독립적으로 H이다. 그라조프레비르, 엘바스비르, 및 이들의 조합은 미국 특허 번호 9,738,661; 7,973,040; 및 8,871,759 및 미국 특허 공개 번호 US20160243128에 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 ACP는 에스트로겐 수용체의 소분자 (예를 들어, 약물) 유도성 호르몬-결합 도메인 (ERT2 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, ERT2 도메인은 타목시펜, 및 이의 대사산물에 결합하지만 에스트라디올에는 결합하지 않는 에스트로겐 수용체 변이체이다. 타목시펜 대사물의 비제한적인 예는 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-산화물, 및 엔독시펜을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 발현되고 소분자 (예를 들어, 타목시펜 또는 그의 대사산물)의 부재하에 ERT2 도메인을 포함하는 ACP는 HSP90에 결합하고 세포의 세포질에서 유지된다. 일부 구현예에서, 소분자 (예를 들어, 타목시펜 또는 이의 대사산물)의 도입 시, 소분자는 ERT2 도메인에 결합된 HSP90을 대체하고, 이는 ERT2 도메인을 포함하는 ACP가 세포의 핵으로 전위되도록 한다.
따라서, 일부 구현예에서 ERT2 도메인을 포함하는 본 개시내용의 ACP는 ERT2 도메인이 타목시펜 또는 그의 대사산물에 결합할 때 핵 국소화를 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 타목시펜 대사산물은 4-히드록시-타목시펜 (4-OHT), N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 및 엔독시펜으로부터 선택된다.
분해 서열 및 데그론
일부 구현예에서, ACP는 데그론을 추가로 포함하고, 여기서 데그론은 ACP에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 데그론은 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', DNA-결합 도메인의 5', DNA-결합 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화된다.
본원에 사용된 용어 "데그론" "데그론 도메인"은 단백질 분해 속도 조절에 중요한 단백질 또는 이의 일부를 지칭한다. 짧은 아미노산 서열, 구조적 모티프 및 노출된 아미노산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 데그론이 본 개시내용의 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 다양한 유기체에서 확인된 데그론을 사용할 수 있다. 데그론 및 데그론 경로는 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, Varshazsky A., PNAS 2019 Jan 8;116(2):358-366 참조, 이는 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "분해 서열"은 프로테아좀 또는 자가포식-리소좀 경로를 통해 부착된 단백질의 분해를 촉진하는 서열을 지칭한다. 당업계에 공지된 분해 서열은 본 개시내용의 다양한 구현예에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분해 서열은 유기체로부터 확인된 데그론, 또는 이의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분해 서열은 단백질에 융합될 때 단백질의 반감기가 적어도 2배 감소되도록 단백질을 불안정화시키는 폴리펩티드이다. (예를 들어, 유비퀴틴- 프로테아좀 시스템의) 많은 상이한 분해 서열/신호가 당업계에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것이 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 분해 서열은 세포 수용체에 작동 가능하게 연결될 수 있지만, 분해 서열이 여전히 세포 수용체의 분해를 지시하는 기능을 하는 한 인접할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 분해 서열은 세포 수용체의 빠른 분해를 유도한다. 분해 서열 및 단백질 분해에서의 기능에 대한 논의는, 예를 들어, Kanemaki et al. (2013) Pflugers Arch. 465(3):4l9-425, Erales et al. (2014) Biochim Biophys Acta 1843(l):216-221 , Schrader et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(11): 815-822, Ravid et al. (2008) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(9):679-690, Tasaki et al. (2007)Trends Biochem Sci. 32(1 1):520-528, Meinnel et al. (2006) Biol. Chem. 387(7):839- 851, Kim et al. (2013) Autophagy 9(7): 1100-1103, Varshavsky (2012) Methods Mol. Biol. 832: 1-11, 및 Fayadat et al. (2003) Mol Biol Cell. 14(3): 1268-1278 참조; 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 데그론 또는 분해 서열은 하기로부터 선택된다: HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달의 하이드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스.
일부 구현예에서, 데그론은 면역조절 약물 (IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진한다. 일부 구현예에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 하기로부터 선택된다: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편. 일부 구현예에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물이다. 일부 구현예에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (서열 번호 131)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물이다.
일부 구현예에서, 면역조절 약물 (IMiD)은 FDA 승인 약물이다. 일부 구현예에서, IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드로부터 선택된다.
프로모터
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 핵산은 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 핵산은 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 ACP 반응성 프로모터를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 각각 본 개시내용의 별개의 조작된 핵산에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 본 개시내용의 동일한 조작된 핵산에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 ACP 반응성 프로모터는 ACP 결합 도메인 및 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 ACP 반응성 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 2개의 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 ACP 반응성 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 조작된 핵산은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 ACP 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 ACP 반응성 프로모터를 포함한다.
"프로모터"는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역을 지칭한다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같이 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 하위 영역을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적 또는 이들의 조합일 수 있다. 프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다. 여기에서, 프로모터는 그것이 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("구동")하기 위해 조절하는 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및 방향에 있을 때 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트의 업스트림에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 그러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 핵산 서열은 자연 환경에서 코딩된 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 위치할 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 분리된 프로모터; 및 예를 들어, 당업계에 공지된 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경하는 상이한 전사 조절 영역 및/또는 돌연변이의 상이한 요소를 함유하는 것들과 같은 "자연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 외에, 서열은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202 및 미국 특허 번호 5,928,906 참조).
본 개시내용의 조작된 핵산의 프로모터는 "유도성 프로모터"일 수 있고, 이는 신호의 존재하에, 신호에 의해 영향을 받거나 신호에 의해 접촉될 때 전사 활성을 조절 (예를 들어, 개시 또는 활성화) 하는 것을 특징으로 하는 프로모터를 지칭한다. 신호는 유도성 프로모터로부터의 전사 활성 조절에 활성이 되는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉하는 내인성 또는 정상적으로 외인성 조건 (예를 들어, 빛), 화합물 (예를 들어, 화학적 또는 비화학적 화합물) 또는 단백질 (예를 들어, 사이토카인)일 수 있다. 전사의 활성화는 전사를 유도하기 위해 프로모터에 직접 작용하거나 프로모터가 전사를 유도하는 것을 방지하는 억제자를 비활성화함으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 비활성화는 전사를 방지하기 위해 프로모터에 직접 작용하거나 프로모터에 작용하는 억제자를 활성화함으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다.
프로모터는 해당 상태 또는 신호의 존재하에 프로모터로부터의 전사가 활성화, 비활성화, 증가 또는 감소되는 경우 국소 종양 상태 (예를 들어, 염증 또는 저산소증) 또는 신호에 "반응성"이거나 "이에 의해 조절"된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 반응 요소를 포함한다. "반응 요소"는 프로모터로부터 유전자 발현을 바꾸는 (조절하는) 특정 분자 (예를 들어, 전사 인자)에 결합하는 프로모터 영역 내의 짧은 DNA 서열이다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 반응 요소는 제한 없이, 플로레틴 조절 가능 제어 요소 (PEACE 징크-핑거 DNA-결합 도메인 (DBD), 인터페론-감마-활성화 서열 (GAS) (Decker, T. et al. J Interferon Cytokine Res. 1997 Mar;17(3):121-34, 본원에 참고로 포함됨), 인터페론 자극 반응 요소 (ISRE) (Han, K. J. et al. J Biol Chem. 2004 Apr 9;279(15):15652-61, 본원에 참고로 포함됨), NF-카파B 반응 요소 (Wang, V. et al. Cell Reports. 2012; 2(4): 824-839, 본원에 참고로 포함됨), 및 STAT3 반응 요소 (Zhang, D. et al. J of Biol Chem. 1996; 271: 9503-9509, 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. 다른 반응 요소가 본원에 포함된다. 반응 요소는 또한 동족 결합 분자에 대한 반응 요소의 민감성을 일반적으로 증가시키기 위해 탠덤 반복 (예를 들어, 반응 요소를 암호화하는 동일한 뉴클레오티드 서열의 연속적인 반복)을 함유할 수 있다. 탠덤 반복은 존재하는 반복의 수를 나타내기 위해 2X, 3X, 4X, 5X 등으로 표시될 수 있다.
반응성 프로모터 ("유도성 프로모터"라고도 함) (예를 들어, TGF-베타 반응성 프로모터)의 비제한적 예는 표 2에 나열되어 있고, 이는 프로모터 및 전사 인자의 설계 뿐만 아니라 전사 인자 (TF) 및 전이유전자 전사 (T)에 대한 유도 분자의 효과가 표시된다 (B, 결합; D, 해리; n.d., 결정되지 않음) (A, 활성화; DA, 비활성화; DR, 억제) (Horner, M. & Weber, W. FEBS Letters 586 (2012) 20784-2096m, 및 거기에 인용된 참고 문헌 참조). 유도성 프로모터의 다른 비제한적 예는 표 3에 나타낸 것들을 포함한다.
표 2. 예시적인 유도성 프로모터
Figure pct00014
Figure pct00015
표 3. 예시적인 유도성 프로모터
Figure pct00016
프로모터의 다른 비제한적인 예는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1-알파 (EF1a) 프로모터, 신장 인자 (EFS) 프로모터, MND 프로모터 (골수증식성 육종 바이러스 인핸서가 있는 변형된 MoMuLV의 U3영역을 포함하는 합성 프로모터), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 예시적인 구성적 프로모터는 표 4에 제시되어 있다.
표 4. 예시적인 구성적 프로모터
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 구현예에서, 프로모터 서열은 하기로부터 선택된 프로모터로부터 유래된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도자 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복.
일부 구현예에서, 제1 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 하기로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 합성 프로모터이다. 일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. ACP 결합 도메인은 1, 2, 3, 4,5 ,6 7, 8, 9, 10개, 또는 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ACP 결합 도메인은 하나의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 결합 도메인은 2개의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 결합 도메인은 3개의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 결합 도메인은 4개의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 예시적인 ACP 결합 도메인은 서열 cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCGcattcgtaagaggctcactctcccttacacggagtggataACTAGTTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA (서열 번호 92)에 나타낸다.
일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 항원 인식 수용체가 동족 항원, 예를 들어, 표적 세포 상에서 발현된 항원과 맞물릴 때 전사를 촉진하는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 활성화된 T 세포의 ATAC-seq가 풍부한 인핸서 (Gate et al. Nat Genet. 저자 원고; PMC 2019 Jan 9에서 이용 가능; 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨) 또는 단일 세포 RNA 서열 데이터에서 상향 조절된 유전자와 관련된 인핸서 (Xhangolli et al. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 Apr;17(2):129-139. doi: 10.1016/j.gpb.2019.03.002; 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 인핸서는 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에서 상향 조절되는 것으로 알려지거나 의심되는 한 쌍의 전사 인자와 같은 합성 인핸서일 수 있다. 합성 인핸서는 전사 인자 결합 부위의 다중 반복, aaaabbbb 또는 abababab 구조에서 2개의 별개의 전사 인자 결합 부위의 4번의 반복을 포함할 수 있다. 인핸서가 유도될 수 있는 유전자의 예시적인 비제한적 예는 ATF2, ATF7, BACH1, BATF, Bcl-6, Blimp-1, BMI1, CBFB, CREB1, CREM, CTCF, E2F1, EBF1, EGR1, ETV6, FOS, FOXA1, FOXA2, GATA3, HIF1A, IKZF1, IKZF2, IRF4, JUN, JUNB, JUND, Lef1, NFAT, NFIA, NFIB, NFKB, NR2F1, Nur77, PU.1, RELA, RUNX3, SCRT1, SCRT2, SP1, STAT4, STAT5A, T-Bet, Tcf7, ZBED1, ZNF143, 또는 ZNF217을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 수용체가 활성화 유도성 시스템에서와 같이 동족 리간드와 맞물릴 때 전사를 촉진하는 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 항원 인식 수용체가 동족 항원, 예를 들어 표적 세포 상에서 발현된 항원과 맞물릴 때 전사를 촉진하는 프로모터를 포함한다. 예를 들어, ACP가 항원 수용체 (예를 들어, CAR)인 경우, ACP 반응성 프로모터는 항원 수용체가 동족 항원에 결합한 후 신호 전달에 의해 유도되는 프로모터를 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포에서 전사 활성이 증가된 프로모터를 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 활성화된 세포, 예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포에서 상향 조절되는 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 활성화된 세포에서 전사 인자 결합이 증가된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 유전자의 2kb 업스트림에 있는 게놈 영역을 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 유전자의 전사 개시 부위의 -100bp 다운스트림에 게놈 영역을 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 유전자 전사 개시 부위의 -100bp 다운스트림에 대해 유전자의 2kb 업스트림에 있는 게놈 영역을 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 유전자 번역 개시 부위의 업스트림에 있는 게놈 영역을 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 유전자 번역 개시 부위에 대해 2kb 업스트림에 있는 게놈 영역을 포함할 수 있다. 유래된 프로모터는 프로모터 영역에서 확인된 하나 이상의 인핸서를 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 CCL3, CCL4, 또는 MTA2 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. ACP 반응성 프로모터는 CCL3 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 156), CCL4 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 157), 및/또는 MTA2 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 158)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. ACP 반응성 프로모터는 CCL3 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 156), CCL4 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 157), 및/또는 MTA2 프로모터 영역 (예를 들어, 서열 번호 158)에 존재하는 인핸서를 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 합성 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, ACP 반응성 프로모터는 다른 프로모터, 예를 들어 최소 프로모터 (예를 들어, min AdeP 또는 YB-TATA)와 결합된 항원 유도 인핸서 또는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. ACP 반응성 프로모터는 합성 인핸서, 예를 들어 전사 인자 결합 부위의 다중 반복을 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 예시적인 비제한적 예에서, 합성 프로모터를 포함하는 ACP 반응성 프로모터는 최소 Ade 프로모터와 조합하여 NFAT 전사 인자 결합 부위의 5회 반복을 포함할 수 있다 (5x NFAT_minAdeP).
다중시스트론성 및 다중 프로모터 시스템
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 다중 효과기 분자를 생성하도록 구성된다. 예를 들어, 핵산은 2-20개의 상이한 효과기 분자를 생성하도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-20, 17-19, 17-18, 18-20, 18-19, 또는 19-20개의 효과기 분자를 생성하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 효과기 분자를 생성하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 다중시스트론성일 수 있고, 즉, 하나 초과의 개별 폴리펩티드 (예를 들어, 다중 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 효과기 분자) 가 단일 mRNA 전사체로부터 생성될 수 있다. 조작된 핵산은 다양한 링커의 사용을 통해 다중시스트론성일 수 있고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 유전자:링커:제2 유전자 5'에서 3' 방향으로에서와 같이 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 효과기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 요소, 예를 들어 T2A를 암호화할 수 있다. 다른 2A 리보솜 스키핑 요소는 E2A, P2A, 및 F2A를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 2A 리보솜 스키핑 요소는 번역 동안 생성되는 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드의 생성을 허용한다. 링커는 퓨린 절단 부위 또는 TEV 절단 부위와 같은 절단 가능한 링커 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있고, 여기서 발현 후 절단 가능한 링커 폴리펩티드는 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생성되도록 절단된다. 절단 가능한 링커는 절단을 추가로 촉진하는, 가요성 링커 (예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)와 같은 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트가 (L 1 - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L1 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화할 수 있어, 번역 동안 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생성된다. 링커는 바이러스 스플라이스 수용체와 같은 스플라이스 수용체를 암호화할 수 있다.
링커는 2A 리보솜 스키핑에 이어 2A 잔기의 완전한 제거를 허용하는 퓨린 부위의 추가 절단을 통해 별도의 폴리펩티드를 생성할 수 있는 퓨린-2A 링커와 같은 링커의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 조합은 퓨린 가요성 링커, 및 2A 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 링커는 퓨린-Gly-Ser-Gly-2A 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 링커는 퓨린-Gly-Ser-Gly-T2A 융합 폴리펩티드이다.
일반적으로, 다중시스트론성 시스템은 임의의 수의 유전자 또는 이의 부분을 발현하기 위해 링커의 임의의 수 또는 조합을 사용할 수 있다 (예를 들어, 조작된 핵산은 각각 다음과 같은 링커에 의해 분리된 제1, 제2 및 제3 효과기 분자를 암호화할 수 있고, 제1, 제2 및 제3 효과기 분자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생성된다).
본원에 사용된 "링커"는 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 폴리펩티드 또는 상기 기재된 다중시스트론성 링커를 지칭할 수 있다.
효과기 분자
당업계에 공지된 임의의 적합한 효과기 분자는 조작된 핵산에 의해 암호화되거나 조작된 세포에 의해 발현될 수 있다. 적합한 효과기 분자는 구조 유사성, 서열 유사성 또는 기능을 기반으로 하여 치료 부류로 그룹화될 수 있다. 효과기 분자 치료 부류는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 조절제, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류는 하기로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
일부 구현예에서, 효과기 분자는 케모카인이다. 케모카인은 세포에서 지시된 주화성을 유도할 수 있는 세포에서 분비되는 작은 사이토카인 또는 신호 단백질이다. 케모카인은 CXC, CC, CX3C 및 XC의 4가지 주요 서브패밀리로 분류할 수 있고, 이들 모두 표적 세포 표면에 위치한 케모카인 수용체에 선택적으로 결합하여 생물학적 효과를 발휘한다. 본 개시내용의 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있는 케모카인의 비제한적 예는 하기를 포함한다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 케모카인은 하기로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
일부 구현예에서, 효과기 분자는 사이토카인이다. 본 개시내용의 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있는 사이토카인의 비제한적 예는 하기를 포함한다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 사이토카인은 하기로부터 선택된다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 귀소 분자를 생성하도록 구성된다. "귀소"는 표적 부위 (예를 들어, 세포, 조직 (예를 들어, 종양) 또는 기관)로의 세포의 능동적 탐색(이동)을 지칭한다. "귀소 분자"는 세포를 표적 부위로 안내하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 귀소 분자는 표적 부위에 대한 조작된 세포의 상호작용을 인식 및/또는 개시하는 기능을 한다. 귀소 분자의 비제한적 예는 CXCR1, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR4, FPR2, VEGFR, IL6R, CXCR1, CSCR7, PDGFR, 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 귀소분자는 하기로부터 선택된다: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 성장 인자를 생성하도록 구성된다. 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 성장 인자는 FLT3L 및 GM-CSF, 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 하기로부터 선택된다: FLT3L 및 GM-CSF.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 공동-활성화 분자를 생성하도록 구성된다. 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 공동-활성화 분자는 c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L, 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 공동-활성화 분자는 하기로부터 선택된다: c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L.
"종양 미세 환경"은 주위 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 골수 유래 염증 세포, 림프구, 신호 분자 및 세포외 기질 (ECM)을 포함하는 종양이 존재하는 세포 환경이다 (예를 들어, Pattabiraman, D.R. & Weinberg, R.A. Nature Reviews Drug Discovery 13, 497-512 (2014); Balkwill, F.R. et al. J Cell Sci 125, 5591-5596, 2012; 및 Li, H. et al. J Cell Biochem 101(4), 805-15, 2007 참조). 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 종양 미세환경 조절제는 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2, 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양 미세환경 조절제는 하기로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 TGF베타 억제제를 생산하도록 구성된다. 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, TGF베타 억제제는 하기로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 생산하도록 구성된다. 효과기 분자로 사용하기에 적합한 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체, 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 하기로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
예시적인 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙 (항-PD-1; MK-3475/Keytruda® - Merck), 니볼루맙 (항-PD-1; Opdivo® - BMS), 피딜리주맙 (항-PD-1 항체; CT-011 - Teva/CureTech), AMP224 (항-PD-1; NCI), 아벨루맙 (항-PD-L1; Bavencio® - Pfizer), 더발루맙 (항-PD-L1; MEDI4736/Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca), 아테졸리주맙 (항-PD-L1; Tecentriq® - Roche/Genentech), BMS-936559 (항-PD-L1 - BMS), 트레멜리루맙 (항-CTLA-4; Medimmune/AstraZeneca), 이필리무맙 (항-CTLA-4; Yervoy ® - BMS), 리릴루맙 (항-KIR; BMS), 모날리주맙 (항-NKG2A; Innate Pharma/AstraZeneca)을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 VEGF 억제제를 생성하도록 구성된다. 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자이다.
분비 신호
일반적으로, 하나 이상의 효과기 분자는 분비 또는 막 삽입을 목적으로 하는 새로 합성된 단백질을 적절한 단백질 처리 경로로 안내하는 효과기 분자의 N-말단에 분비 신호 펩티드 (신호 펩티드 또는 신호 서열이라고도 함)를 포함한다. 2개 이상의 효과기 분자를 갖는 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 분비 신호 (S)를 포함할 수 있다. 2개 이상의 효과기 분자를 갖는 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 각각의 효과기 분자가 조작된 세포로부터 분비되도록 분비 신호를 포함할 수 있다. 구현예에서, (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트는 분비 신호 펩티드 (S)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관되어 있다. 구현예에서, 제2 발현 카세트는 ACP 반응성 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다: (L -S- E) X .
효과기 분자와 작동 가능하게 연관된 분비 신호 펩티드는 천연 분비 신호 펩티드 천연 분비 신호 펩티드 (예를 들어, 일반적으로 주어진 효과기 분자와 내인적으로 연관된 분비 신호 펩티드)일 수 있다. 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된 분비 신호 펩티드는 비-천연 분비 신호 펩티드 천연 분비 신호 펩티드일 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드는 종양 미세환경과 같은 특정 환경에서 유지된 분비와 같은 개선된 발현 및 기능을 촉진할 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드의 비제한적인 예는 표 5에 제시되어 있다.
표 5. 예시적인 신호 분비 펩티드
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
항원 인식 수용체
본 개시내용의 특정 양태는 항원 인식 수용체를 포함하는 조작된 핵산에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 핵산은 항원 인식 수용체를 추가로 포함하는 제1 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리펩티드 및 제1 프로모터에 대해 작동 가능하게 연결된 항원 인식 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 효과기 분자로서 사용하기에 적합한 항원 인식 수용체는 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린 (MSLN), MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1, 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항원을 인식한다.
일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 하기로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1.
일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 GPC3을 인식한다. GPC3을 인식하는 항원 인식 수용체는 GPC3에 결합하는 항-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고, 여기서 VH는 하기를 포함하고: KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및 GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 여기서 VL은 하기를 포함한다: KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및 QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3). 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1)을 포함한다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2)을 포함한다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함한다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1)을 포함한다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2)을 포함한다. 일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다.
일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 MSLN을 인식한다. MSLN을 인식하는 항원 인식 수용체는 MSLN에 결합하는 항-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는 QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단일-도메인 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 아미노산 서열 QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는 QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130)을 갖는 단일-도메인 결합 도메인으로부터 각각의 CDR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 아미노산 서열 QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는 QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130)을 갖는 단일-도메인 결합 도메인으로부터 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 ACP와 항원 인식 수용체 사이에 위치한 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
scFv는 폴리펩티드 사슬에 의해 중쇄 (VH)의 가변 도메인의 C-말단에서 N-말단으로 연결된 경쇄 (VL)의 가변 도메인을 갖는다. 대안적으로 scFv는 VH의 C-말단에서 폴리펩티드 사슬에 의해 VL의 N-말단에 연결된 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 일부 구현예에서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하고, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
sdAb는 항체의 한 가변 도메인이 다른 가변 도메인의 존재 없이 항원에 특이적으로 결합하는 분자이다.
F(ab) 단편은 각각 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 VL 및 VH와 함께 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab') 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 단편은 이황화 결합에 의해 힌지 영역 근처에서 연결된 두 개의 Fab' 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 구현예에서, 항원 인식 수용체는 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 하기로부터 선택된다: CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, 및 MyD88 세포내 신호전달 도메인. 일부 구현예에서, CAR은 CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인 및 CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, MyD88 세포내 신호전달 도메인, 2B4 세포내 신호전달 도메인, CD16a 세포내 신호전달 도메인, DNAM-1 세포내 신호전달 도메인, KIR2DS1 세포내 신호전달 도메인, KIR3DS1 세포내 신호전달 도메인, NKp44 세포내 신호전달 도메인, NKp46 세포내 신호전달 도메인, FceRlg 세포내 신호전달 도메인, NKG2D 세포내 신호전달 도메인, 및 EAT-2 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동 자극 도메인)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 막횡단 도메인은 하기로부터 선택된다: CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceRlg 막횡단 도메인, 및 NKG2D 막횡단 도메인.
일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역 (예를 들어, 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 스페이서 또는 힌지 도메인은 막횡단 도메인을 폴리펩티드 사슬의 세포외 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드이다. 스페이서 또는 힌지 도메인은 억제성 또는 종양 표적화 키메라 수용체, 또는 이의 도메인에 유연성을 제공하거나, 억제성 또는 종양 표적화 키메라 수용체, 또는 이의 도메인의 입체 장애를 방지한다. 일부 구현예에서, 스페이서 도메인 또는 힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 10 내지 100개 아미노산, 또는 5 내지 20개 아미노산). 일부 구현예에서, 하나 이상의 스페이서 도메인(들)은 억제성 또는 종양 표적화 키메라 수용체의 다른 영역에 포함될 수 있다.
예시적인 스페이서 또는 힌지 도메인은 제한 없이 IgG 도메인 (예를 들어 IgG1 힌지, IgG2 힌지, IgG3 힌지, 또는 IgG4 힌지), IgD 힌지 도메인, CD8α 힌지 도메인, 및 CD28 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 또는 힌지 도메인은 IgG 도메인, IgD 도메인, CD8α 힌지 도메인, 또는 CD28 힌지 도메인이다.
예시적인 스페이서 또는 힌지 도메인 단백질 서열은 표 6에 제시되어 있다. 예시적인 스페이서 또는 힌지 도메인 뉴클레오티드 서열은 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
CAR에서 사용하기에 적합한 막횡단 도메인, 스페이서 또는 힌지 도메인, 및 세포내 도메인은 Stoiber et al, Cells 2019, 8(5), 472; Guedan et al, Mol Therapy: Met & Clinic Dev, 2019 12:145-156; 및 Sadelain et al, Cancer Discov; 2013, 3(4); 388-98에 일반적으로 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, CAR은 분비 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 본 개시내용의 임의의 적합한 분비 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
전사후 조절 요소
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 핵산은 전사후 조절 요소 (PRE)를 포함한다. PRE는 4차 RNA 구조 안정성 및 3' 말단 형성을 가능하게 하여 유전자 발현을 향상시킬 수 있다. PRE의 비제한적 예는 B형 간염 바이러스 PRE (HPRE) 및 우드척 간염 바이러스 PRE (WPRE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)이다. 일부 구현예에서, WPRE는 WPRE 요소의 알파, 베타, 및 감마 구성성분을 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE는 WPRE 요소의 알파 구성성분을 포함한다.
조작된 세포
또한, 본 개시내용의 하나 이상의 조작된 핵산을 포함하는 세포, 및 세포를 생산하는 방법이 본원에서 제공된다. 이들 세포는 본원에서 "조작된 세포"로 지칭된다. 일반적으로 하나 이상의 조작된 핵산을 포함하는 이러한 세포는 자연에서 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 조작된 핵산을 재조합적으로 발현하는 단리된 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 벡터 또는 세포의 게놈으로부터 선택된 유전자좌로부터 발현된다. 일부 구현예에서, 세포는 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP), 예를 들어 전사 인자, 및/또는 항원 인식 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 억제성 프로테아제 및 동족 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 데그론을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 항원 인식 수용체이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및/또는 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고: (L - E)X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. ACP는 항원 인식 수용체이고 수용체는 동족 항원에 결합하여 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, X는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 조작된 세포에서 별도의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 세포는 2개의 조작된 핵산을 포함한다; 제1 발현 카세트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 조작된 핵산 및 제2 발현 카세트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 조작된 핵산. 예시적인 예에서, 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, ACP 발현 카세트는 조작된 세포에서 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 다른 예시적인 예에서, 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, ACP 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 항원 인식 수용체 발현 카세트는 조작된 세포에서 제3 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 조작된 세포에서 단일 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 세포는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 조작된 핵산을 포함한다. 다른 예시적인 예는 (1) 항원 인식 수용체 발현 카세트 및 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, ACP 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고; (2) ACP 발현 카세트 및 효과기 분자 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 항원 인식 수용체 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고; (3) ACP 발현 카세트 및 항원 인식 수용체 발현 카세트는 제1 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 효과기 분자 발현 카세트는 제2 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 카세트는 다중시스트론성일 수 있고, 즉, 하나 초과의 개별 폴리펩티드 (예를 들어, 다중 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 효과기 분자)가 단일 mRNA 전사체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 다중시스트론성 발현 카세트는 예를 들어, 구성적 프로모터에 의해 구동되는 단일 발현 카세트로부터 모두 발현되는 ACP 및 항원 인식 수용체를 둘 다 암호화할 수 있다. 다른 예에서, 다중시스트론성 발현 카세트는 예를 들어, ACP 반응성 프로모터에 의해 구동되는 단일 발현 카세트로부터 모두 발현되는 효과기 분자 및 항원 인식 수용체를 둘 다 암호화할 수 있다. 발현 카세트는 다양한 링커의 사용을 통해 다중시스트론성일 수 있고, 예를 들어, 첫 번째 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향 제1 유전자:링커:제2 유전자에서와 같이, 두 번째 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 다중시스트론성 기능 및 옵션은 섹션 "다중시스트론성 및 다중프로모터 시스템"에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 (L - E)X의 2개 이상의 단위를 포함하고, 각각의 L 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되어 있다. 일부 구현예에서, (L - E)X의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트는 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된다. 일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-천연 분비 신호 펩티드는 하기로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
일부 구현예에서, 세포는 추가 효과기 분자, 예를 들어, 들어 면역 반응을 자극하는 분자를 암호화하는 추가 외인성 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 추가 프로모터를 포함하는 추가 발현 카세트를 포함하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 추가의 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함하고: (L - E)X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20, 여기서 추가 프로모터는 추가 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하다.
X는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 발현 카세트는 (L - E)X의 2개 이상의 단위를 포함하고, 각각의 L 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되어 있다. 일부 구현예에서, 추가 발현 카세트는 (L - E)X의 하나 이상의 단위를 포함하고 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된다. 일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-천연 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVIICD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
일부 구현예에서, 제1 프로모터 및/또는 추가 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터 및/또는 추가 프로모터는 하기로부터 선택된 구성적 프로모터이다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
본 개시내용의 조작된 세포는 세포의 게놈 내로 통합된 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 조작된 세포는 예를 들어, 플라스미드 또는 mRNA와 같은 일시적 발현 시스템으로 조작된, 세포의 게놈으로 통합되지 않고 발현할 수 있는 조작된 핵산을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 효과기 분자(들) 및 이들이 생성되는 조작된 세포 사이의 부가성 및 상승작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상) 효과기 분자를 생성하도록 조작되고, 각각은 상이한 종양 매개 면역억제 기전을 조절할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 세포에 의해 천연적으로 생산되지 않는 적어도 하나의 효과기 분자를 생산하도록 조작된다. 이러한 효과기 분자는 예를 들어, 세포에 의해 천연적으로 생성된 효과기 분자의 기능을 보완할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, 종양 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 또는 박테리아 세포)는 하나 이상의 효과기 분자를 생성하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 1-20개의 상이한 효과기 분자를 생성하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-20, 17-19, 17-18, 18-20, 18-19, 또는 19-20개의 효과기 분자를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 효과기 분자를 생성하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 그리고 ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 조작된 핵산을 포함하고: (L - E)X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 다수의 조작된 핵산, 예를 들어, 적어도 2개의 조작된 핵산을 포함하도록 조작되고, 각각은 제1 프로모터 및 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하고: (L - E)X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20이다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2 또는 3) 효과기 분자를 암호화한다. 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 또는 그 이상의 효과기 분자를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 세포는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 또는 그 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있고, 각각은 ACP 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 ACP 반응성 프로모터 및 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 이상) 효과기 분자를 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 암호화한다. 일부 구현예에서, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있고, 각각은 ACP 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 ACP 반응성 프로모터 및 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 이상) 효과기 분자를 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 암호화한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 제3 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 항원 인식 수용체를 추가로 암호화한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및/또는 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 조작된 핵산을 포함하고, 여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 제2 발현 카세트는 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고: (L - E)X 여기서 E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 항원 인식 수용체를 암호화하는 구현예에서, 조작된 세포는 제3 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 예시적인 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, ACP는 항원 인식 수용체이고 ACP는 그의 동족 항원에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, ACP 반응성 프로모터는 ACP가 그의 동족 항원에 결합함으로써 유도될 수 있는 유도성 프로모터이다.
조작된 세포는 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 폴리펩티드, 상기 기재된 하나 이상의 다중시스트론성 링커, 추가 ORF에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 추가 프로모터, 또는 이들의 조합과 같은, 상기 기재된 링커 중 적어도 하나를 암호화하는 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 단일 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 제2 발현 카세트가 (L 1 - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L1 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각각의 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 여기서 제2 링커 폴리뉴클레오티드는 제1 발현 카세트를 제2 발현 카세트에 연결한다. 일부 구현예에서, 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자 및 ACP의 번역과 작동 가능하게 연관된다.
일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 치료 부류로부터 독립적으로 선택된 효과기 분자를 생성하도록 조작되고, 여기서 치료 부류는 하기로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 케모카인을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 케모카인은 하기로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 사이토카인을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 하기로부터 선택된다: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 적어도 하나의 귀소 분자를 생성하도록 조작된다. "귀소"는 표적 부위 (예를 들어, 세포, 조직 (예를 들어, 종양), 또는 기관)로의 세포의 능동적 탐색 (이동)을 지칭한다. "귀소 분자"는 세포를 표적 부위로 안내하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 귀소 분자는 표적 부위에 대한 조작된 세포의 상호 작용을 인식 및/또는 개시하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 귀소분자는 하기로부터 선택된다: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 적어도 하나의 성장 인자를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 하기로부터 선택된다: FLT3L 및 GM-CSF.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 적어도 하나의 공동-활성화 분자를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 공동-활성화 분자는 하기로부터 선택된다: c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 하나 이상의 TGF베타 억제제를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, TGF베타 억제제는 하기로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 적혈구, 또는 혈소판 세포)는 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 하기로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
예시적인 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙 (항-PD-1; MK-3475/Keytruda® - Merck), 니볼루맙 (항-PD-1; Opdivo® - BMS), 피딜리주맙 (항-PD-1 항체; CT-011 - Teva/CureTech), AMP224 (항-PD-1; NCI), 아벨루맙 (항-PD-L1; Bavencio® - Pfizer), 더발루맙 (항-PD-L1; MEDI4736/Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca), 아테졸리주맙 (항-PD-L1; Tecentriq® - Roche/Genentech), BMS-936559 (항-PD-L1 - BMS), 트레멜리루맙 (항-CTLA-4; Medimmune/AstraZeneca), 이필리무맙 (항-CTLA-4; Yervoy ® - BMS), 리릴루맙 (항-KIR; BMS), 모날리주맙 (항-NKG2A; Innate Pharma/AstraZeneca)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포 (예를 들어, 종양 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 또는 박테리아 세포)는 적어도 하나의 VEGF 억제제를 생성하도록 조작된다. 일부 구현예에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자이다.
조작된 세포 유형
본 개시내용의 조작된 세포 또는 단리된 세포는 인간 세포일 수 있다. 조작된 세포 또는 단리된 세포는 인간 1차 세포일 수 있다. 조작된 1차 세포는 종양 침윤 1차 세포일 수 있다. 조작된 1차 세포는 1차 T 세포일 수 있다. 조작된 1차 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC)일 수 있다. 조작된 1차 세포는 자연 살해 세포일 수 있다. 조작된 1차 세포는 모든 체세포일 수 있다. 조작된 1차 세포는 MSC일 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 대상체와 관련하여 동종이계이다.
본 개시내용의 조작된 세포는 암이 있는 것으로 알려지거나 의심되는 대상체와 같은 대상체로부터 단리될 수 있다. 세포 단리 방법은 당업자에게 공지되어 있고 FACS 분류, 양성 단리 기술 및 음성 단리, 자기 단리, 및 이들의 조합과 같은 세포-표면 마커 발현에 기초한 분류 기술을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 조작된 세포는 치료를 받는 대상과 관련하여 동종이형일 수 있다. 동종이형 변형된 세포는 치료가 투여되는 대상체에 HLA-일치될 수 있다. 조작된 세포는 생체 외 배양된 세포와 같은 배양된 세포일 수 있다. 조작된 세포는 대상체로부터 단리된 1차 세포와 같은 생체 외 배양된 세포일 수 있다. 배양된 세포는 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 또는 단리된 세포는 하기로부터 선택된다: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC-유래된 세포. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 자가 조직이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 동종이계이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 하기로부터 선택된 종양 세포이다: 선암종 세포, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경교종 세포, 신장 종양 세포, 간 종양 세포, 폐 종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소 종양 세포, 췌장 종양 세포, 위 종양 세포, 고환 난황낭 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 하기로부터 선택된 박테리아 세포이다: 클로스트리디움 베이제린키, 클로스트리디움 스포로게네스, 클로스트리디움 노비, 에쉐리히아 콜리, 슈도모나스 에루지노사, 리스테리아 모노사이토게네스, 살모넬라 티피무리움, 및 살모넬라 콜레라수이스.
또한 본 개시내용의 조작된 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 조작된 세포를 배양하는 방법은 공지되어 있다. 당업자는 배양 조건이 관심의 특정 조작된 세포에 의존할 것임을 인식할 것이다. 당업자는 배양 조건이 조작된 세포의 특정 다운스트림 용도, 예를 들어 대상체에게 조작된 세포의 후속 투여를 위한 특정 배양 조건에 의존할 것임을 인식할 것이다.
세포 조작 방법
또한, 본원에 기재된 바와 같은, 또는 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 임의의 조작된 핵산에 의해 암호화되는 활성화 조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 하나 이상의 효과기 분자를 생산하도록 세포를 조작하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다, 또는.
일반적으로, 세포는 제1 프로모터 및 ACP를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 및 ACP 반응성 프로모터를 포함하는 제2 발현 카세트 및 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 제2 외인성 서열을 포함하는 본 개시내용의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 세포의 세포질 및/또는 핵 내로의 도입 (즉, 전달)을 통해 ACP 및 효과기 분자를 생산하도록 조작된다. 예를 들어, ACP 폴리펩티드 및 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산일 수 있다. 전달 방법은 바이러스 매개 전달, 지질 매개 형질감염, 나노입자 전달, 전기천공, 초음파 처리 및 물리적 수단에 의한 세포막 변형이 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 전달 방법의 선택이 조작될 특정 세포 유형에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 종양용해성 바이러스를 사용하여 형질도입된다. 종양용해성 바이러스의 예는 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양용해 바이러스는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스이다. 일부 구현예에서, 종양용해 바이러스는 제3 발현 카세트를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 종양용해성 바이러스를 포함하는 바이러스는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산과 같은 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 하나 이상의 이식유전자를 암호화하는 재조합 바이러스일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 종양용해성 바이러스를 포함하는 바이러스는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산과 같은 둘 이상의 효과기 분자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 이식유전자를 암호화하는 재조합 바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작된다.
바이러스 매개 전달
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼을 사용하여 세포를 조작할 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 숙주 세포에 도입 (즉, 전달)을 통해 세포를 조작한다. 예를 들어, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 본원에 기재된 조작된 핵산 중 임의의 것을 도입함으로써 세포를 조작할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 핵산일 수 있고, 따라서 조작된 핵산은 조작된 바이러스 유래 핵산을 포함할 수도 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 핵산일 수 있고, 따라서 조작된 핵산은 조작된 바이러스 유래 핵산을 포함할 수도 있다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 동일한 핵산 내에서 하나 이상의 조작된 핵산, 유전자 또는 이식유전자를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 조작된 바이러스 유래 핵산, 예를 들어, 재조합 바이러스 또는 조작된 바이러스는 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이식유전자를 암호화할 수 있다. 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 하나 이상의 이식유전자는 하나 이상의 효과기 분자를 발현하도록 구성될 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나 이상의 이식유전자 (예를 들어, 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 이식유전자)에 더해 하나 이상의 유전자, 예를 들어 시스 작용 요소 또는 유전자라고 지칭되는, 바이러스 감염성 및/또는 바이러스 생산에 필요한 바이러스 유전자 (예를 들어, 캡시드 단백질, 외피 단백질, 바이러스 중합효소, 바이러스 전사효소 등)를 암호화할 수 있다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 본원에 기술되고 트랜스-작용 요소 또는 유전자로 지칭되는 조작된 핵산, 유전자, 또는 이식유전자를 암호화하는 별도의 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 의존성 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 벡터에 더하여 하나 이상의 추가의 개별 벡터에 대한 바이러스 감염성 및/또는 바이러스 생산에 필요한 추가 유전자를 제공할 수 있다. 하나의 바이러스 벡터는 하나 이상의 조작된 핵산, 예를 들어 둘 이상의 효과기 분자를 생성하도록 구성된 조작된 핵산을 전달하는 하나의 벡터를 전달할 수 있다. 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 조작된 핵산, 예를 들어 하나 이상의 효과기 분자를 생성하도록 구성된 하나 이상의 조작된 핵산을 전달하는 하나 이상의 벡터를 전달할 수 있다. 사용되는 바이러스 벡터의 수는 상기 언급된 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼의 패키징 용량에 의존할 수 있고, 당업자는 적절한 수의 바이러스 벡터를 선택할 수 있다.
일반적으로, 임의의 바이러스 벡터 기반 시스템은 효과기 분자와 같은 분자의 시험관 내 생산에 사용될 수 있거나, 예를 들어, 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 조작된 핵산의 생체 내 전달을 위한 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에서 사용될 수 있다. 적절한 바이러스 벡터 기반 시스템의 선택은 화물/페이로드 크기, 바이러스 시스템의 면역원성, 관심 대상 세포, 유전자 발현 강도 및 시기, 그리고 당업자가 인식하는 기타 요인과 같은 다양한 요인에 따를 것이다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 RNA 기반 바이러스 또는 DNA 기반 바이러스일 수 있다. 예시적인 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인디애나 베시큘로바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 점액종 바이러스, 레오바이러스, 볼거리 바이러스, 마라바 바이러스, 광견병 바이러스, 로타바이러스, 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 모르빌리바이러스, 렌티바이러스, 복제 레트로바이러스, 랍도바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 예를 들어 우두, 계두, 자가 복제 알파바이러스, 마라바바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, Tatsis et al., Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616―629 참조), 또는 2, 3 또는 혼성 2/3세대 렌티바이러스 및 특정 세포 유형 또는 수용체를 표적으로 하도록 설계된 임의의 세대의 재조합 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 렌티바이러스 (예를 들어, Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma et al., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promotor, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880 참조)가 당업계에 기술되어 있다.
서열은 세포하 구획을 표적으로 하는 하나 이상의 서열이 선행될 수 있다. 숙주 세포 내로 도입 (즉 전달) 시, 감염된 세포 (즉, 조작된 세포)는 하나 이상의 효과기 분자를 발현할 수 있고 일부 경우에는 분비할 수 있다. 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG (바실 칼메트 게린)이다. BCG 벡터는 Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))에 기재되어 있다. 조작된 핵산, 예를 들어, 살모넬라 타이피 벡터 등의 도입 (즉, 전달)에 유용한 매우 다양한 다른 벡터는 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 본원에서 종양용해성 바이러스로 지칭되는, 종양 세포를 표적으로 하는 바이러스일 수 있다. 종양용해성 바이러스의 예는 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 임의의 종양용해 바이러스는 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 하나 이상의 이식유전자 (예를 들어, 조작된 핵산)를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스일 수 있다. 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 이식유전자는 하나 이상의 효과기 분자를 발현하도록 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 종양용해성 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 및 바이러스-유사 입자 (VLP)로부터 선택된다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 레트로바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 갖는 시스 작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스 작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하고, 그런 다음 이는 하나 이상의 조작된 핵산 (예를 들어, 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 이식유전자)을 표적 세포에 통합하여 영구적인 이식유전자 발현을 제공하는 데 사용된다. 레트로바이러스 기반 전달 시스템은 유린 백혈병, 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합을 기반으로 하는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et ah, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et ah, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al, J, Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 참조). 다른 레트로바이러스 시스템은 피닉스 레트로바이러스 시스템을 포함한다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 렌티바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 일반적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 ViraPower 시스템 (ThermoFisher) 또는 pLenti 시스템 (Cell Biolabs)과 같은 HIV 기반일 수 있다. 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 SIV, 또는 FIV-기반일 수 있다. 다른 예시적인 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 미국 특허 번호 7,311,907; 7,262,049; 7,250,299; 7,226,780; 7,220,578; 7,211,247; 7,160,721; 7,078,031; 7,070,993; 7,056,699; 6,955,919에 상세히 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 아데노바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하고, 세포 분열이 필요하지 않고, 높은 역가 및 발현 수준을 달성하고, 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스는 숙주의 게놈에 통합되지 않기 때문에 감염된 세포 내에서 전이유전자의 일시적인 발현을 위해 아데노바이러스를 사용할 수 있다. 아데노바이러스 기반 전달 플랫폼은 Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li 및 Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655에 상세히 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다. 다른 예시적인 아데노바이러스 기반 전달 플랫폼은 미국 특허 번호 5585362; 6,083,716, 7,371,570; 7,348,178; 7,323,177; 7,319,033; 7,318,919; 및 7,306,793 및 국제 특허 출원 WO96/13597에 상세히 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 아데노 연관 바이러스 (AAV) 기반일 수 있다. 아데노-연관 바이러스 ("AAV") 벡터는 조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)으로 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 시스템은 효과기 분자의 시험관 내 생산에 사용될 수 있거나, 예를 들어, 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 조작된 핵산의 생체 내 전달을 위해 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에 사용될 수 있다 (예를 들어, West et al., Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 번호 4,797,368; 5,436,146; 6,632,670; 6,642,051; 7,078,387; 7,314,912; 6,498,244; 7,906,111; 미국 특허 공보 US 2003-0138772, US 2007/0036760, 및 US 2009/0197338; Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (June 2004); Gao, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (May 13, 2003); 및 국제 특허 출원 WO 2010/138263 및 WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다). 재조합 AAV 벡터를 구축하기 위한 예시적인 방법은 미국 특허 번호 5,173,414; Tratschin et ah, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et ah, Mol. Cell, Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:64666470 (1984); 및 Samuiski et ah, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)에 상세히 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, AAV-기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.Rh10, AAV11 및 이들의 변이체 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 바이러스 유사 입자 (VLP) 플랫폼일 수 있다. 일반적으로, VLP는 바이러스 구조 단백질을 생성하고 생성된 바이러스 입자를 정제하여 구성된다. 그런 다음, 정제 후, 화물/페이로드 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)는 생체 외에서 정제된 입자 내에 캡슐화된다. 따라서, VLP의 생산은 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 핵산과 화물/페이로드를 암호화하는 핵산의 분리를 유지한다. VLP 생산에 사용되는 바이러스 구조 단백질은 포유동물, 효모, 곤충, 박테리아를 포함하는 다양한 발현 시스템, 또는 생체 내 번역 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 정제된 바이러스 입자는 원하는 화물의 존재하에 변성 및 개질되어 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 VLP를 생성할 수 있다. VLP의 생산은 Seow et al. (Mol Ther. 2009 May; 17(5): 767-777)에 상세히 기재되어 있고, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 세포 범위를 표적화 (즉, 감염)시키거나, 세포의 좁은 부분집합을 표적화하거나, 특정 세포를 표적화하도록 조작될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼에 대해 선택된 외피 단백질은 바이러스 친화성을 결정한다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼에 사용되는 바이러스는 특정 관심 세포를 표적으로 하기 위해 유사형을 지정할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 범친화성일 수 있고 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 범친화성 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 VSV-G 외피를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 양친성일 수 있고 포유동물 세포를 감염시킬 수 있다. 따라서, 당업자는 원하는 세포 유형을 표적화하기 위한 적절한 지향성, 유사형 및/또는 외피 단백질을 선택할 수 있다.
지질 구조 전달 시스템
본 개시내용의 조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)은 지질 매개 전달 시스템을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 지질 매개 전달 시스템은 내부 구획을 감싸는 외부 지질막으로 구성된 구조를 사용한다. 지질 기반 구조의 예는 지질 기반 나노입자, 리포솜, 미셀, 엑소좀, 소포, 세포외 소포, 세포 또는 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 지질 구조 전달 시스템은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 화물/페이로드 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)를 전달할 수 있다.
지질 기반 나노입자는 단층 리포솜, 다중층 리포솜, 및 지질 제제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "리포솜"은 원하는 화물, 예를 들어, 조작된 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 지질 쉘 또는 지질 응집체에 포함하여 형성된 지질 비히클의 시험관 내 제제를 포괄하는 일반 용어이다. 리포솜은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 리포솜은 에멀젼, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 리포솜은 단층 리포솜일 수 있다. 리포솜은 다중층 리포솜일 수 있다. 리포솜은 다소포성 리포솜일 수 있다. 리포솜은 양전하, 음전하 또는 중성으로 하전될 수 있다. 특정 구현예에서, 리포솜은 전하가 중성이다. 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하를 띤 인지질과 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 원하는 목적, 예를 들어 리포솜 크기, 산 불안정성 및 혈류 내 리포솜의 안정성과 같은 생체 내 전달 기준을 고려하여 인도된다. 예를 들어, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980), 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369에 기술된 바와 같이 다양한 방법으로 리포솜을 제조할 수 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
다중층 리포솜은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액에 현탁되어 다중 지질층이 수성 매질에 의해 분리될 때 자발적으로 생성된다. 물과 용해된 용질은 자가 재배열을 겪는 지질 성분에 따라 지질 이중층 사이의 닫힌 구조에 갇힌다. 원하는 화물 (예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 소분자 약물, 조작된 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 바이러스 벡터, 바이러스 기반 전달 시스템 등)은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화, 리포솜 및 폴리펩티드/핵산 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재, 리포솜에 포획, 리포솜과 복합, 또는 표적 개체에 전달될 수 있도록 리포솜과 달리 결합될 수 있다. 친유성 분자 또는 친유성 영역을 가진 분자는 또한 지질 이중층에 용해되거나 결합될 수 있다.
본 구현예에 따라 사용되는 리포솜은 당업자에게 공지된 바와 같이 상이한 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 제조는 WO 2016/201323, 국제 출원 PCT/US85/01161 및 PCT/US89/05040, 및 미국 특허 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505, 및 4,921,706에 추가 세부사항이 기재되어 있고; 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
리포솜은 양이온성 리포솜일 수 있다. 양이온성 리포솜의 예는 미국 특허 번호. 5,962,016; 5,030,453; 6,680,068, 미국 출원 2004/0208921, 및 국제 특허 출원 WO03/015757A1, WO04029213A2, 및 WO02/100435A1에 상세히 기재에 되어 있고, 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
지질 매개 유전자 전달 방법은 예를 들어, WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); 미국 특허 번호 5,279,833 Rose 미국 특허 번호 5,279,833; WO91/06309; 및 Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)에 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
엑소좀은 원형질막과 다소포체의 융합에 따라 세포외 환경으로 방출되는 세포내 이입 기원의 작은 막 소포이다. 엑소좀의 크기는 30 내지 100 nm 직경 범위이다. 이들의 표면은 공여자 세포의 세포막에서 나온 지질 이중층으로 구성되어 있고, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포의 막 단백질을 나타낸다. 핵산의 전달에 유용한 엑소좀 예를 들어, 미국 특허 번호 9,889,210에 상세히 기재된 엑소좀은 당업자에게 공지되어 있고, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포외 소포" 또는 "EV"는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 소포를 지칭한다. 일반적으로, 세포외 소포는 이들이 유래된 세포보다 작은 직경을 갖는 모든 막-결합 소포를 포함한다. 일반적으로 세포외 소포는 직경이 20 nm 내지 1000 nm 범위이고, 세포외 소포의 외부 표면에 표시되는 내부 공간 및/또는 막에 걸쳐 있는 다양한 거대분자 화물을 포함할 수 있다. 화물은 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예로서 및 제한 없이, 세포외 소포는 세포사멸체, 세포의 단편, 직접 또는 간접 조작 (예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리 용액으로 처리)에 의해 세포로부터 유래된 소포, 소포화된 소기관, 및 살아있는 세포에 의해 (예를 들어, 직접적인 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해) 생성된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 유기체 또는 죽은 유기체, 이식된 조직 또는 기관, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "엑소좀"은 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 작은 (직경 20-300 nm, 보다 바람직하게는 직경 40-200 nm) 소포를 지칭하고, 이는 직접적인 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해 생성된다. 지질 또는 지방산 및 폴리펩티드를 포함하고 선택적으로 페이로드 (예를 들어, 치료제), 수용체 (예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 당 (예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래될 수 있고, 그의 크기, 밀도, 생화학적 매개변수, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 엑소좀은 세포외 소포의 일종이다. 일반적으로, 엑소좀 생산/생체발생은 생산자 세포의 파괴를 초래하지 않는다. 엑소좀 및 엑소좀의 제조는 WO 2016/201323에 추가로 상세히 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "나노소포" ("미세소포"로도 지칭됨)는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 작은 (직경 20-250 nm, 보다 바람직하게는 직경 30-150 nm) 소포를 지칭하고, 이는 직접 또는 간접적 조작에 의해 세포로부터 생성되어 상기 나노소포가 상기 조작 없이 상기 생산자 세포에 의해 생성되지 않는다. 일반적으로, 나노소포는 세포외 소포의 아종이다. 생산자 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액 처리, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 나노소포의 생산은 일부 경우에 상기 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 나노소포 집단은 원형질막으로부터의 직접 출아 또는 원형질막과 후기 엔도솜의 융합에 의해 생산자 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 없다. 나노소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩티드, 선택적으로 페이로드 (예를 들어, 치료제), 수용체 (예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 당 (예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 나노소포는 일단 상기 조작에 따라 생산자 세포로부터 유래되면, 이의 크기, 밀도, 생화학적 매개변수, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.
지질 나노입자 (LNP)는 일반적으로, 지질의 양친매성 성질에 의존하여 막 및 소포 유사 구조를 형성하는 합성 지질 구조이다 (Riley 2017). 일반적으로, 이들 소포는 표적 세포의 막으로 흡수되고 화물을 세포질 내로 방출함으로써 본원에 기술된 임의의 조작된 핵산 또는 바이러스 시스템과 같은 화물/페이로드를 전달한다. LNP 형성에 사용되는 지질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 지질은 합성 또는 천연 유래일 수 있고, 경우에 따라 생분해성이다. 지질은 지방, 콜레스테롤, 인지질, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 접합체 (PEG화 지질), 왁스, 오일, 글리세리드 및 지용성 비타민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 지질 접합체를 포함할 수 있다. 지질 조성물은 일반적으로 양이온성, 중성, 음이온성 및 양친매성 지질과 같은 물질의 정의된 혼합물을 포함한다. 일부 예에서, 특정 지질은 LNP 응집을 방지하거나, 지질 산화를 방지하거나, 추가 모이어티의 부착을 용이하게 하는 기능적 화학기를 제공하기 위해 포함된다. 지질 조성물은 전체 LNP 크기와 안정성에 영향을 줄 수 있다. 한 예에서, 지질 조성물은 디리놀레일메틸- 4-디메틸아미노부티레이트 (MC3) 또는 MC3-유사 분자를 포함한다. MC3 및 MC3-유사 지질 조성물은 PEG 또는 PEG- 접합 지질, 스테롤, 또는 중성 지질과 같은 하나 이상의 다른 지질을 포함하도록 제형화될 수 있다. 또한, LNP는 특정 세포 유형의 표적화를 촉진하기 위해 추가로 조작되거나 기능화될 수 있다. LNP 설계에서 또 다른 고려 사항은 표적화 효율성과 세포 독성 간의 균형이다.
미셀은 일반적으로, 단일 사슬 지질을 사용하여 형성되는 구형 합성 지질 구조로, 여기서 단일 사슬 지질의 친수성 머리는 외층 또는 막을 형성하고 단일 사슬 지질의 소수성 꼬리는 미셀 중심을 형성한다. 미셀은 일반적으로 지질 단일층만 포함하는 지질 구조를 지칭한다. 미셀은 Quader et al. (Mol Ther. 2017 Jul 5; 25(7): 1501-1513)에 보다 상세히 기재되어 있고, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
발현 벡터와 같은, 혈청에 직접 노출된 핵산 벡터는 혈청 뉴클레아제에 의한 핵산 분해 또는 유리 핵산에 의한 면역계의 표적외 자극을 포함하여 여러 가지 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다. 유사하게, 혈청에 직접 노출된 바이러스 전달 시스템은 원하지 않는 면역 반응 및/또는 바이러스 전달 시스템의 중화를 유발할 수 있다. 따라서 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템의 캡슐화는 분해를 방지하는 동시에 잠재적인 표적 외 영향을 방지하는 데 사용할 수 있다. 특정 예에서, 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템은 LNP의 수성 내부와 같은 전달 비히클 내에서 완전히 캡슐화된다. LNP 내의 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템의 캡슐화는 미세유체 액적 생성 장치에서 수행되는 미세유체 혼합 및 액적 생성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 이러한 장치는 표준 T-접합 장치 또는 흐름 초점 장치를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 한 예에서, MC3 또는 MC3-유사 함유 조성물과 같은 원하는 지질 제형은 조작된 핵산 또는 바이러스 전달 시스템 및 임의의 다른 원하는 제제와 병행하여 액적 생성 장치에 제공되어, 전달 벡터 및 원하는 제제는 MC3 또는 MC3 유사 기반 LNP의 내부에 완전히 캡슐화된다. 한 예에서, 액적 생성 장치는 생성된 LNP의 크기 범위 및 크기 분포를 제어할 수 있다. 예를 들어, LNP는 직경 1 내지 1000 나노미터, 예를 들어, 1, 10, 50, 100, 500, 또는 1000 나노미터 범위의 크기를 가질 수 있다. 액적 생성 후, 화물/페이로드 (예를 들어, 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템)를 캡슐화하는 전달 비히클은 투여를 위해 준비하도록 추가로 처리되거나 조작될 수 있다.
나노입자 전달
나노물질은 조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 나노물질 비히클은 중요하게는 비면역원성 물질로 만들어질 수 있고 일반적으로 전달 벡터 자체에 대한 면역을 유발하는 것을 피할 수 있다. 이러한 물질은 지질 (이전에 기술된 바와 같음), 무기 나노물질, 및 기타 중합체 물질을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 나노물질 입자는 Riley et al. (Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery―A Review. Nanomaterials 2017, 7(5), 94)에 더욱 자세히 기재되어 있고, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
게놈 편집 시스템
게놈 편집 시스템은 조작된 핵산, 예를 들어 본 개시내용의 조작된 핵산을 암호화하기 위해 숙주 게놈을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, "게놈 편집 시스템"은 외인성 유전자를 숙주 세포의 게놈에 통합하는 모든 시스템을 지칭한다. 게놈 편집 시스템은 트랜스포존 시스템, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템, 및 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
트랜스포존 시스템은 조작된 핵산, 예컨대 본 개시내용의 조작된 핵산을 숙주 게놈 내로 통합하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스포존은 일반적으로 화물/페이로드 핵산 및 트랜스포사제 옆에 있는 말단 역반복체 (TIR)를 포함한다. 트랜스포존 시스템은 TIR-측면 화물과 함께 시스 또는 트랜스로 트랜스포존을 제공할 수 있다. 트랜스포존 시스템은 레트로트랜스포존 시스템 또는 DNA 트랜스포존 시스템일 수 있다. 일반적으로, 트랜스포존 시스템은 화물/페이로드 (예를 들어, 조작된 핵산)를 숙주 게놈에 무작위로 통합한다. 트랜스포존 시스템의 예는 Hudecek et al. (Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017 Aug;52(4):355-380), 및 미국 특허 번호 6,489,458, 6,613,752 및 7,985,739에 더욱 자세히 기술된, Tc1/마리너 트랜스포존 슈퍼패밀리, 예를 들어 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템의 트랜스포존을 사용하는 시스템을 포함하고, 이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다. 트랜스포존 시스템의 다른 예는 미국 특허 번호 6,218,185 및 6,962,810에 상세히 기재된 PiggyBac 트랜스포존 시스템을 포함하고, 이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 조작된 핵산, 예를 들어 본 개시내용의 조작된 핵산을 암호화하도록 숙주 게놈을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 일반적으로, 외인성 유전자를 도입하기 위해 사용되는 뉴클레아제-매개 유전자 편집 시스템은 세포의 천연 DNA 복구 메커니즘, 특히 상동 재조합 (HR) 복구 경로를 이용한다. 간단히, 게놈 DNA에 대한 손상 (일반적으로 이중 가닥 파손) 후, 세포는 병변을 복구하기 위한 DNA 합성 동안 5' 및 3' 말단 모두에서 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 갖는 다른 DNA 공급원을 주형으로 사용하여 손상을 해결할 수 있다. 자연스러운 상황에서, HDR은 세포에 있는 다른 염색체를 주형으로 사용할 수 있다. 유전자 편집 시스템에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합 주형 (HRT 또는 HR 주형)으로 사용하기 위해 세포에 도입된다. 일반적으로, HRT 내의 5'와 3' 상보적 말단 사이에 포함된 병변이 있는 염색체에서 원래 발견되지 않은 임의의 추가 외인성 서열 (예를 들어, 유전자 또는 유전자의 일부)은 템플릿화된 HDR 동안 주어진 게놈 유전자좌에 포함 (즉, "통합")될 수 있다. 따라서, 주어진 게놈 유전자좌에 대한 전형적인 HR 주형은 내인성 게놈 표적 유전자좌의 제1 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열, 내인성 게놈 표적 유전자좌의 제2 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 화물/페이로드 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 예를 들어 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 조작된 핵산 중 하나)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일부 예에서, HR 주형은 선형일 수 있다. 선형 HR 주형의 예는 선형화된 플라스미드 벡터, ssDNA, 합성된 DNA, 및 PCR 증폭된 DNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, HR 주형은 플라스미드와 같은 원형일 수 있다. 원형 주형은 슈퍼코일 주형을 포함할 수 있다.
도입될 외인성 서열과 관련하여, HR 주형의 5' 및 3' 말단에서 발견되는 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 일반적으로 아암(arms) (HR 아암)으로 지칭된다. HR 아암은 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일할 수 있다 (즉, 100% 동일). HR 아암은 일부 예에서 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 실질적으로 동일할 수 있다. 실질적으로 동일한 HR 아암이 사용될 수 있지만, HDR 경로의 효율성이 100% 미만의 동일성을 갖는 HR 아암에 의해 영향을 받을 수 있으므로 HR 아암이 동일한 것이 유리할 수 있다.
각각의 HR 아암, 즉, 5' 및 3' HR 아암은 동일한 크기이거나 다른 크기일 수 있다. 각각의 HR 아암은 각각 길이가 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 염기보다 크거나 같을 수 있다. 일반적으로 HR 아암의 길이는 제한이 없지만, HR 아암 길이 및 전체 주형 크기가 전체 편집 효율성에 미치는 영향과 같은 실용적인 고려 사항도 고려할 수 있다. HR 아암은 절단 부위에 바로 인접한 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 각각의 HR 아암은 절단 부위에 바로 인접한 내인성 게놈 표적 좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 각각의 HR 아암은 서로 1개 염기쌍, 10개 염기쌍 이하, 50개 염기쌍, 또는 100개 이하의 염기쌍과 같은 절단 부위의 특정 거리 내의 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다.
뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 간격이 있는 짧은 회문 반복 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제 또는 이의 유도체, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 또는 이의 유도체, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 이의 유도체, 및 귀소 엔도뉴클레아제 (HE) 또는 이의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 표적 게놈 좌를 절단하기 위한 다양한 뉴클레아제를 사용할 수 있다.
CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은 조작된 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 효과기 분자 중 하나 이상을 암호화하는 조작된 핵산을 암호화하도록 숙주 게놈을 조작하기 위해 사용될 수 있다. CRISPR 시스템은 M. Adli ("The CRISPR tool kit for genome editing and beyond" Nature Communications; volume 9 (2018), Article number: 1911)에 더욱 상세히 기재되어 있고, 본원에 교시하는 모든 내용에 대해 참조로 통합된다. 일반적으로, CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은 CRISPR-연관 (Cas) 뉴클레아제 및 특정 표적 서열로의 절단을 지시하는 RNA(들)를 포함한다. 예시적인 CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은 Cas9 뉴클레아제 및 CRISPR RNA (crRNA) 도메인 트랜스-활성화 CRISPR (tracrRNA) 도메인을 갖는 RNA(들)로 구성된 CRISPR/Cas9 시스템이다. crRNA는 전형적으로 2개의 RNA 도메인을 갖는다: 염기쌍 혼성화를 통해 표적 서열 ("정의된 뉴클레오티드 서열"), 예를 들어, 게놈 서열에 대한 특이성을 지시하는 가이드 RNA 서열 (gRNA); 및 tracrRNA에 혼성화하는 RNA 도메인. tracrRNA는 게놈 유전자좌에 대한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 상호 작용하고 이에 의해 이의 동원을 촉진할 수 있다. crRNA 및 tracrRNA 폴리뉴클레오티드는 별도의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. crRNA 및 tracrRNA 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드 RNA (sgRNA)로도 지칭되는, 단일 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 여기에서는 Cas9시스템이 설명되어 있지만, Cpf1시스템과 같은 다른 CRISPR 시스템을 사용할 수 있다. 뉴클레아제는 이의 유도체, 예를 들어 Cas9 기능적 돌연변이체, 예를 들어, 일반적으로 Cas9 효소에 의해 전형적으로 생성되는 완전한 이중 가닥 파손과 대조적으로 정의된 뉴클레오티드 서열의 단일 가닥의 절단만을 매개하는 Cas9 "니카아제" 돌연변이체를 포함할 수 있다.
일반적으로, CRISPR 시스템의 구성 요소는 서로 상호 작용하여 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성하여 서열 특이적 절단을 매개한다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각 구성 요소를 별도로 생산하여 RNP 복합체를 형성하는 데 사용할 수 있다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각 구성 요소는 시험관 내에서 별도로 생산되고 시험관 내에서 서로 접촉 (즉, "복합")되어 RNP 복합체를 형성할 수 있다. 그런 다음 시험관 내 생성된 RNP는 세포의 세포질 및/또는 핵, 예를 들어, T 세포의 세포질 및/또는 핵으로 도입 (즉, "전달")될 수 있다. 시험관 내에서 생성된 RNP 복합체는 전기천공, 지질 매개 형질감염, 물리적 수단에 의한 세포막 변형, 지질 나노입자 (LNP), 바이러스 유사 입자 (VLP), 및 초음파 처리를 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 수단에 의해 세포에 전달할 수 있다. 특정 예에서, 시험관 내에서 생성된 RNP 복합체는 Nucleofactor/Nucleofection® 전기천공 기반 전달 시스템 (Lonza®)을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 다른 전기천공 시스템은 MaxCyte 전기천공 시스템, Miltenyi CliniMACS 전기천공 시스템, Neon 전기천공 시스템, 및 BTX 전기천공 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CRISPR 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9는 당업자에게 공지된 다양한 단백질 생산 기술을 사용하여 시험관 내에서 생산 (즉, 합성 및 정제)될 수 있다. CRISPR 시스템 RNA, 예를 들어, sgRNA는 시험관 내 전사 또는 화학적 합성과 같은 당업자에게 공지된 다양한 RNA 생산 기술을 사용하여 시험관 내 생산 (즉, 합성 및 정제)될 수 있다.
시험관 내에서 생성된 RNP 복합체는 뉴클레아제 대 gRNA의 다양한 비율로 복합체를 형성할 수 있다. 시험관 내에서 생성된 RNP 복합체는 또한 CRISPR-매개 편집 시스템에서 상이한 양으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 편집하고자 하는 세포의 수에 따라, 반응에서 많은 수의 세포를 편집할 때 첨가되는 RNP 복합체의 양을 줄이는 것과 같이 총 RNP 첨가량을 조절할 수 있다.
일부 CRISPR 시스템에서, 각각의 구성성분 (예를 들어, Cas9 및 sgRNA)은 함께 또는 개별적으로 세포 내로 도입된 각각의 폴리뉴클레오티드와 함께 폴리뉴클레오티드에 의해 별도로 암호화될 수 있다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각각의 구성성분은 단일 폴리뉴클레오티드 (즉, 다중-프로모터 또는 다중시스트론성 벡터, 하기 예시적인 다중시스트론성 시스템의 설명 참조)에 의해 암호화되고 세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내에서 각각의 폴리뉴클레오티드 암호화된 CRISPR 구성요소의 발현 (예를 들어, 뉴클레아제의 번역 및 CRISPR RNA의 전사) 후, RNP 복합체가 세포 내에서 형성될 수 있고 이어서 부위-특이적 절단을 지시할 수 있다.
일부 RNP는 핵으로의 RNP 전달을 촉진하는 부분을 갖도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 핵 국소화 신호 (NLS) 도메인을 가질 수 있으므로 Cas9 RNP 복합체가 세포의 세포질 내로 전달되거나 Cas9의 번역 및 후속 RNP 형성 후에, 후에 NLS가 Cas9 RNP의 핵으로의 추가 트래피킹을 촉진할 수 있다.
본원에 기재된 조작된 세포는 비-바이러스 방법을 사용하여 조작될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레아제 및/또는 CRISPR 매개 유전자 편집 시스템은 비-바이러스 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 본원에 기재된 조작된 세포는 바이러스 방법을 사용하여 조작될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레아제 및/또는 CRISPR 매개 유전자 편집 시스템은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 본원에 기술된 임의의 다른 바이러스성 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
일부 CRISPR 시스템에서, 하나 이상의 CRISPR 조성물이 제공되어 각각이 동일한 유전자 또는 표적 뉴클레오티드 서열보다 많은 일반 게놈 유전자좌를 개별적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 2개의 개별 CRISPR 조성물은 서로의 특정 거리 내에서 2개의 상이한 표적 뉴클레오티드 서열에서 절단을 지시하기 위해 제공될 수 있다. 일부 CRISPR 시스템에서, 동일한 유전자 또는 일반 게놈 유전자좌의 반대 가닥을 각각 별도로 표적화하도록 하나 이상의 CRISPR 조성물이 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 개별 CRISPR "니카아제" 조성물은 동일한 유전자 또는 반대 가닥에서 일반 게놈 유전자좌에서 절단을 지시하기 위해 제공될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 CRISPR-매개 편집 시스템의 특징은 다른 뉴클레아제-기반 게놈 편집 시스템에 적용될 수 있다. TALEN은 조작된 부위 특이적 뉴클레아제이고, 이는 TALE (전사 활성화제 유사 효과기)의 DNA-결합 도메인 및 제한 엔도뉴클레아제 Fokl의 촉매 도메인으로 구성된다. DNA 결합 도메인의 단량체의 고도로 가변적인 잔기 영역에 존재하는 아미노산을 변경함으로써, 상이한 인공 TALEN을 생성하여 다양한 뉴클레오티드 서열을 표적화할 수 있다. DNA 결합 도메인은 후속적으로 뉴클레아제를 표적 서열로 지시하고 이중 가닥 파손을 생성한다. TALEN-기반 시스템은 미국 일련 번호 12/965,590; 미국 특허 번호 8,450,471; 미국 특허 번호 8,440,431; 미국 특허 번호 8,440,432; 미국 특허 번호 10,172,880; 및 미국 일련 번호 13/738,381에 상세히 기재되어 있고, 이들 모두가 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. ZFN-기반 편집 시스템은 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061에 상세히 기재되어 있고, 모두 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 본원에 포함된다.
기타 조작 전달 시스템
조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 세포 또는 다른 표적 수용자 개체로 도입하기 위한 다양한 추가 수단, 예컨대 본원에 기술된 임의의 지질 구조.
전기천공법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 수용자 개체에 전달할 수 있다. 전기천공법은 전기장을 적용하여 표적 세포 또는 개체의 외막 또는 껍질을 일시적으로 투과시켜 화물/페이로드를 표적 세포 또는 개체의 내부 구획으로 내부화하는 방법이다. 일반적으로, 방법은 관심 화물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 함유하는 용액에서 2개의 전극 사이에 세포 또는 표적 개체를 배치하는 것을 포함한다. 그런 다음, 화물이 세포의 세포질과 같은 개체의 내부로 들어갈 수 있도록 하는 일시적인 설정 전압을 적용함으로써 세포의 지질막이 파괴, 즉 투과화된다. 세포의 예에서, 세포의 다수는 아닐지라도 적어도 일부는 생존할 수 있다. 세포 및 다른 개체는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 전기천공될 수 있다. 전기천공 조건 (예를 들어, 세포 수, 화물 농도, 복구 조건, 전압, 시간, 정전용량, 펄스 유형, 펄스 길이, 부피, 큐벳 길이, 전기천공 용액 조성 등)은 세포 또는 다른 수용자 개체의 유형, 전달할 화물, 원하는 내부화의 효율성, 원하는 생존 가능성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 인자에 따라 다르다. 이러한 기준의 최적화는 당업자의 범위 내에 있다. 다양한 장치 및 프로토콜을 전기천공에 사용할 수 있다. 예는 Neon® 형질감염 시스템, MaxCyte® Flow Electroporation™, Lonza® Nucleofector™ 시스템, 및 Bio-Rad® 전기천공 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 세포 또는 다른 표적 수용자 개체로 도입하기 위한 다른 수단은 초음파 처리, 유전자 총, 유체역학적 주입 및 물리적 수단에 의한 세포막 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
생체 내에서 조작된 mRNA, 예를 들어 네이키드 플라스미드 또는 mRNA를 전달하기 위한 조성물 및 방법은 Kowalski et al. (Mol Ther. 2019 Apr 10; 27(4): 710-728) 및 Kaczmarek et al. (Genome Med. 2017; 9: 60.)에 자세히 기재되어 있고, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
사용 방법
질환의 치료 방법이 또한 본 개시내용에 포함된다. 상기 방법은 상기 기재된 치료 유효량의 조작된 핵산, 조작된 세포, 또는 단리된 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 양태에서 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되고, 방법은 종양이 있는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물을 포함하는 조성물을 종양이 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 투여는 전신 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 종양내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 대상체와 관련하여 동종이계이다.
일부 구현예에서, 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 체크포인트 억제제는 하기로부터 선택된다: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체. 일부 구현예에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 종양은 하기로부터 선택된다: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
일부 방법은 종양 (또는 암)이 있는 대상체 (또는 환자 집단)을 선택하고 종양 매개 면역억제 기전을 조절하는 조작된 세포 또는 전달 매개체로 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 또한 조작된 세포의 제제 또는 전달 비히클을 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 조작된 세포 이외의 세포를 예를 들어, 5% 미만 (예를 들어, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만) 함유하는 실질적으로 순수한 제제이다. 제제는 1x105 세포/kg 내지 1x107 세포/kg의 세포를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 ACP가 유도되고/되거나 억제성 프로테아제가 억제되도록 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물과 조합하여 약물 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 타목시펜 또는 이의 대사산물 (예를 들어, 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 또는 엔도시펜)이 ACP를 유도하기 위해 투여될 수 있다. 약물 또는 의약품은 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물의 투여 전에, 투여와 함께, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 투여될 수 있다. 약물 또는 의약품은 연속적으로 투여될 수 있다. 약물 또는 의약품은 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물의 투여와 함께 또는 동시에 투여될 수 있다. 약물 또는 의약품은 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물의 투여보다 별도의 간격으로 (예를 들어, 이전 또는 이후에) 투여될 수 있다. 약물 또는 의약품은 본원에 개시된 임의의 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물과 함께/동시에 뿐만 아니라 별도의 간격으로 투여될 수 있다. 약물 또는 약학 조성물 및 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물은 상이한 경로를 통해 투여될 수 있고, 예를 들어, 약물 또는 약학 조성물은 경구 투여될 수 있고 조작된 세포, 단리된 세포, 또는 조성물은 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 복강내, 정맥내, 피하, 또는 투여에 적절한 임의의 다른 경로로 투여될 수 있다.
특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도는 다양할 수 있고 사용된 특정 화합물의 활성, 해당 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배설 속도, 약물 조합, 특정 상태의 중증도, 치료 중인 숙주를 포함하는 다양한 인자에 따라 다를 것이다.
본원에 제공된 방법은 프로테아제 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다. 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 프로테아제 억제제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 하기로부터 선택된다: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르.
일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르 (C형 간염 바이러스 NS5A 복제 복합체의 NS5A 억제제)의 조합이다. 그라조프레비르 및 엘바스비르는 정제 형태 (예를 들어, 상표명 Zepatier® 하에 이용가능한 정제)와 같은 약학 조성물로서 공동 제형화될 수 있다. 그라조프레비르 및 엘바스비르는 각각 2:1 중량비로, 예를 들어 100 mg 그라조프레비르 50 mg 엘바스비르의 단위 용량으로 (예를 들어, 상표명 Zepatier® 하에 이용 가능한 정제에서와 같이) 공동-제형화될 수 있다. 프로테아제 억제제는 ACP의 억제성 프로테아제 도메인을 억제할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 프로테아제 억제제는 다른 적응증에 대해 승인된 용량으로 투여될 수 있다. 예시적인 비제한적 예로서, Zepatier는 HCV 치료를 위해 승인된 용량으로 투여될 수 있다.
엘바스비르와의 조합을 포함하여 그라조프레비르는 단일 용량 또는 분할 용량으로 1일 포유동물 (예를 들어, 인간) 체중의 0.001 내지 1000 mg/kg 용량 범위로 경구 투여될 수 있다. 1회 투여량 범위는 단일 또는 분할 투여량으로 경구 1일 0.01 내지 500 mg/kg 체중이다. 또 다른 투여량 범위는 단일 또는 분할 투여량으로 경구 1일 0.1 내지 100 mg/kg 체중이다. 경구 투여를 위해, 엘바스비르와의 병용을 포함하여 그라조프레비르는 치료될 환자에 대한 투여량의 증상 조절을 위해 1.0 내지 500 mg의 활성 성분, 특히 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 및 750 mg의 활성 성분을 함유하는 정제 또는 캡슐의 형태로 제공될 수 있다. 일반적으로, 일반적으로 엘바스비르와의 병용을 포함하여 그라조프레비르의 총 1일 투여량은 치료 대상, 환자 및 투여 경로에 따라 반드시 변동이 있을 수 있지만, 1일 약 1 내지 약 2500 mg 범위일 수 있다. 한 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 10 내지 약 1000 mg/일이다. 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 1 내지 약 500 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 1 내지 약 100 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 1 내지 약 50 mg/일이다. 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 500 내지 약 1500 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 500 내지 약 1000 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 엘바스비르와의 병용을 비롯한 그라조프레비르의 투여량은 단일 투여량 또는 2-4회 분할 투여량으로 투여되는 약 100 내지 약 500 mg/일이다.
생체 내 발현
본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 조작된 세포를 생체 내 생성할 수 있는, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 생체 내 세포에 전달할 수 있는 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 이러한 조성물은 임의의 바이러스 매개 전달 플랫폼, 임의의 지질 구조 전달 시스템, 임의의 나노입자 전달 시스템, 임의의 게놈 편집 시스템, 또는 생체 내 세포 조작을 할 수 있는 본원에 기술된 임의의 다른 조작 전달 시스템을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 임의의 효과기 분자를 생성할 수 있는 생체 내 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 효과기 분자 중 2개 이상을 생성할 수 있는 생체 내 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 효과기 분자의 생체 내 생산이 가능한 조성물은 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 효과기 분자의 생체 내 생산이 가능한 조성물은 네이키드 mRNA 또는 네이키드 플라스미드일 수 있다.
약학 조성물
조작된 핵산 또는 조작된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 조작된 핵산 또는 조작된 세포 중 하나 이상에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 근육내, 복강내 경로에 따라 달라질 수 있다.
경구 투여를 위한 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 포도당 또는 기타 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 또는 고통 부위에 주사하는 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 젖산 링거제 주사제와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
개체에게 제공되는 것이 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 핵산, 소분자 또는 기타 약학적으로 유용한 화합물이든 간에, 투여는 바람직하게는 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량" (경우에 따라 예방이 요법으로 간주될 수 있지만), 이것은 개체에게 이익을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 단백질 응집 질환의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 복용량 등의 결정과 같은 치료 처방은 일반의 및 기타 의사의 책임이고 일반적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 실무자에게 알려진 기타 인자를 고려한다. 상기 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다.
추가 구현예
본 발명의 특정 구현예를 기술하는 열거된 실시예가 하기에 제공된다:
구현예 1: 하기를 포함하는 조작된 핵산:
a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 화학식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 그리고
여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 것인, 조작된 핵산.
구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 제2 발현 카세트 (L - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된 것인 조작된 핵산.
구현예 3: 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 4: 구현예 3에 있어서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그가 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 5: 구현예 1 내지 2 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 6: 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 7: 구현예 6에 있어서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드가 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산.
구현예 8: 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트가 각각의 X에 대한 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 9: 구현예 8에 있어서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드가 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된 조작된 핵산.
구현예 10: 구현예 8 또는 구현예 9에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 11: 구현예 8 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드가 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 것인 조작된 핵산.
구현예 12: 구현예 11에 있어서, 비-천연 분비 신호 펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 분비 신호 펩티드인 조작된 핵산: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
구현예 13: 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 ACP 결합 도메인 서열 및 프로모터 서열을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 14: 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래된 것인 조작된 핵산: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도자 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복.
구현예 15: 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 합성 프로모터를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 16: 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 최소 프로모터를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 17: 구현예 12 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 결합 도메인이 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 18: 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 19: 구현예 18에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 20: 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
구현예 21: 구현예 20에 있어서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
구현예 22: 구현예 20에 있어서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
구현예 23: 구현예 20에 있어서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15.
구현예 24: 구현예 20에 있어서, 상기 성장 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: FLT3L 및 GM-CSF.
구현예 25: 구현예 20에 있어서, 상기 공동 활성화 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L.
구현예 26: 구현예 20에 있어서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
구현예 27: 구현예 26에 있어서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
구현예 28: 구현예 26에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 29: 구현예 26에 있어서, 상기 VEGF 억제제가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조작된 핵산.
구현예 30: 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 인간 유래 효과기 분자인 조작된 핵산.
구현예 31: 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 항원 인식 수용체를 추가로 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 32: 하기를 포함하는 조작된 핵산으로서:
a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 그리고
여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 것인, 조작된 핵산.
구현예 33: 하기를 포함하는 조작된 핵산:
a) 제1 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재한 것인, 조작된 핵산.
구현예 34: 구현예 33에 있어서, 상기 ACP가 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 조작된 핵산.
구현예 35: 구현예 33에 있어서, 상기 ACP가 항원 인식 수용체이고 ACP가 동족 항원에 대한 ACP의 결합 후 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 조작된 핵산.
구현예 36: 구현예 35에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 동족 항원에 결합하는 ACP에 의해 유도될 수 있는 유도성 프로모터인 조작된 핵산.
구현예 37: 구현예 36에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 ACP가 동족 항원에 결합한 후 상향 조절된 유전자의 프로모터 영역으로부터 유래된 것인 조작된 핵산.
구현예 38: 구현예 32 내지 34 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 합성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 39: 구현예 32 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 최소 프로모터를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 40: 구현예 32 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 결합 도메인이 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 41: 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 42: 구현예 41에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된 것인 조작된 핵산.
구현예 43: 구현예 31 또는 구현예 32에 있어서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역과 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 44: 구현예 43에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 항원 인식 수용체의 번역과 작동 가능하게 연관된 것인 조작된 핵산.
구현예 45: 구현예 33 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 46: 구현예 45에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별개의 폴리펩티드로서 항원 수용체 및 각각의 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관된 것인 조작된 핵산.
구현예 47: 구현예 41 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 48: 구현예 47에 있어서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그가 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 49: 구현예 41 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 50: 구현예 41 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 51: 구현예 50에 있어서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드가 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산.
구현예 52: 구현예 31 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식하는 조작된 핵산: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범 Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1.
구현예 53: 구현예 31 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 GPC3을 인식하는 조작된 핵산.
구현예 54: 구현예 31 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 메소텔린 (MSLN)을 인식하는 조작된 핵산.
구현예 55: 구현예 31 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 항원 결합 도메인을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 56: 구현예 53 또는 구현예 55에 있어서, 상기 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인이 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
여기서 VH는 하기를 포함하고:
KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1),
RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및
GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 및
여기서 VL은:
KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1),
WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및
QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 57: 구현예 56에 있어서, 상기 VH 영역은EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 58: 구현예 56 또는 구현예 57에 있어서, 상기 VL 영역은 DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 59: 구현예 54 또는 구현예 55에 있어서, 상기 MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인이 하기의 아미노산 서열을 갖는 단일-도메인 단일클론 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 조작된 핵산: QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는
QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130).
구현예 60: 구현예 55 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 61: 구현예 55 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 62: 구현예 61에 있어서, 상기 scFv가 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 63: 구현예 62에 있어서, 상기 VH 및 VL이 펩티드 링커에 의해 분리된 것인 조작된 핵산.
구현예 64: 구현예 63에 있어서, 상기 scFv가 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하고, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인인 조작된 핵산.
구현예 65: 구현예 31 내지 64 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)인 조작된 핵산.
구현예 66: 구현예 31 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 CAR인 조작된 핵산.
구현예 67: 구현예 66에 있어서, 상기 CAR는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, MyD88 세포내 신호전달 도메인, 2B4 세포내 신호전달 도메인, CD16a 세포내 신호전달 도메인, DNAM-1 세포내 신호전달 도메인, KIR2DS1 세포내 신호전달 도메인, KIR3DS1 세포내 신호전달 도메인, NKp44 세포내 신호전달 도메인, NKp46 세포내 신호전달 도메인, FceRlg 세포내 신호전달 도메인, NKG2D 세포내 신호전달 도메인, 및 EAT-2 세포내 신호전달 도메인.
구현예 68: 구현예 66 또는 구현예 67에 있어서, 상기 CAR는 막횡단 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceRlg 막횡단 도메인, 및 NKG2D 막횡단 도메인.
구현예 69: 구현예 66 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAR은 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 70: 구현예 1 내지 69 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 조절제인 조작된 핵산.
구현예 71: 구현예 1 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 억제자인 조작된 핵산.
구현예 72: 구현예 1 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 활성화제인 조작된 핵산.
구현예 73: 구현예 1 내지 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 74: 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인 (ERT2 도메인)을 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 75: 구현예 72 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 인자인 조작된 핵산.
구현예 76: 구현예 74에 있어서, 상기 전사 인자가 징크-핑거 함유 전사 인자인 조작된 핵산.
구현예 77: 구현예 1 내지 76 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 전사 효과기 도메인을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 78: 구현예 77에 있어서, 상기 ZF 단백질 도메인이 모듈식으로 설계되고 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 구성된 것인 조작된 핵산.
구현예 79: 구현예 78에 있어서, 상기 ZF 단백질 도메인이 1 내지 10개의 ZFA를 포함하는 것인 조작된 핵산.
구현예 80: 구현예 77 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효과기 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피를 포함하는 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인 (VPR 활성화 도메인)을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제; 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인 (p300 HAT 코어 활성화 도메인); 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제자 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.
구현예 81: 구현예 77 내지 80 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위가 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화되어 있는 조작된 핵산.
구현예 82: 구현예 73 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 억제성 프로테아제가 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)인 조작된 핵산.
구현예 83: 구현예 82에 있어서, 상기 동족 절단 부위가 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 84: 구현예 83에 있어서, 상기 NS3 프로테아제 절단 부위가 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 85: 구현예 82 내지 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 NS3 프로테아제가 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는 조작된 핵산.
구현예 86: 구현예 85에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르.
구현예 87: 구현예 85에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르인 조작된 핵산.
구현예 88: 구현예 85에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르 및 엘바스비르를 포함하는 조작된 핵산.
구현예 89: 구현예 88에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 약학 조성물로 공동-제형화된 것인 조작된 핵산.
구현예 90: 구현예 89에 있어서, 상기 약학 조성물이 정제인 조작된 핵산.
구현예 91: 구현예 89 또는 90에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 2 대 1 중량비인 조작된 핵산.
구현예 92: 구현예 91에 있어서, 상기 그라조프레비르가 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르가 단위 용량당 50 mg인 조작된 핵산.
구현예 93: 구현예 74 내지 92 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 타목시펜 또는 이의 대사산물에 대한 ERT2 도메인의 결합 시 핵 국소화를 겪을 수 있는 조작된 핵산.
구현예 94: 구현예 93에 있어서, 상기 타목시펜 대사산물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-산화물, 및 엔독시펜.
구현예 95: 구현예 1 내지 92 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 데그론을 추가로 포함하고, 상기 데그론은 ACP에 작동 가능하게 연결된 것인 조작된 핵산.
구현예 96: 구현예 95에 있어서, 상기 데그론은 HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달에서 히록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 97: 구현예 93에 있어서, 상기 데그론이 면역조절 약물 (IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진하는 조작된 핵산.
구현예 98: 구현예 97에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편.
구현예 99: 구현예 97에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물인 조작된 핵산.
구현예 100: 구현예 97에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (서열 번호 131)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물인 조작된 핵산.
구현예 101: 구현예 97 내지 100 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IMiD는 FDA 승인 약물인 조작된 핵산.
구현예 102: 구현예 97 내지 101 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IMiD는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드.
구현예 103: 구현예 93 내지 102 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 데그론은 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', ZF 단백질 도메인의 5', ZF 단백질 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화된 것인 조작된 핵산.
구현예 104: 구현예 1 내지 103 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 핵산이 절연체를 추가로 포함하는 조작된 핵산.
구현예 105: 구현예 104에 있어서, 상기 절연체가 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치하는 조작된 핵산.
구현예 106: 구현예 1 내지 105 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화되어 있는 조작된 핵산.
구현예 107: 구현예 1 내지 106 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 제2 발현 카세트에 대해 반대 방향으로 국소화되어 있는 조작된 핵산.
구현예 108: 구현예 1 내지 107 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 핵산이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드.
구현예 109: 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 조작된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
구현예 110: 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 조작된 핵산, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 111: 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 조작된 핵산 또는 구현예 109의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
구현예 112: 구현예 111에 있어서, 상기 조작된 핵산이 재조합적으로 발현되는 것인 단리된 세포.
구현예 113: 구현예 111 또는 구현예 112에 있어서, 상기 조작된 핵산이 세포의 게놈으로부터 선택된 유전자좌 또는 벡터로부터 발현되는 것인 단리된 세포.
구현예 114: 구현예 111 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 세포: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC-유래된 세포.
구현예 115: 구현예 111 내지 114 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 자연 살해 (NK) 세포인 단리된 세포.
구현예 116: 구현예 111 내지 115 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 자가 조직인 단리된 세포.
구현예 117: 구현예 111 내지 115 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 동종이계인 단리된 세포.
구현예 118: 구현예 111 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 세포인 단리된 세포: 선암종 세포, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경 교종 세포, 신장 종양 세포, 간종양 세포, 폐종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소종양 세포, 췌장 종양 세포, 위종양 세포, 고환 난황낭 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포.
구현예 119: 구현예 118에 있어서, 상기 세포가 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작된 것인 단리된 세포.
구현예 120: 구현예 119에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 세포: 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 베시큘로바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 볼거리 바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구냐 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이의 임의의 변이체 또는 유도체.
구현예 121: 구현예 119 또는 구현예 120에 있어서, 상기 종양용해 바이러스가 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스인 단리된 세포.
구현예 122: 구현예 111 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 세포인 단리된 세포: 클로스트리디움 베이제린키, 클로스트리디움 스포로게네스, 클로스트리디움 노비, 에쉐리히아 콜리, 슈도모나스 에루지노사, 리스테리아 모노사이토게네스, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 콜레라수이스.
구현예 123: 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 124: 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포 또는 구현예 123의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 125: 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포 또는 구현예 123의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 126: 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포 또는 구현예 123의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 127: 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포 또는 구현예 123의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 128: 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예의 단리된 세포를 포함하는 조성물 또는 구현예 123의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 129: 구현예 124 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 방법.
구현예 130: 구현예 124 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 종양내 투여를 포함하는 방법.
구현예 131: 구현예 124 내지 130 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단리된 세포가 대상체로부터 유래되는 것인 방법.
구현예 132: 구현예 124 내지 130 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단리된 세포가 대상체와 관련하여 동종이계인 방법.
구현예 133: 구현예 124 내지 132 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 134: 구현예 133에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 135: 구현예 124 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 136: 구현예 125 내지 135 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장종양, 간종양, 폐종양, 흑색종, 중피종, 난소종양, 췌장종양, 위종양, 고환 난황낭 종양, 전립선종양, 피부종양, 갑상선종양, 및 자궁 종양.
구현예 137: 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 조작된 핵산을 포함하는 지질 기반 구조.
구현예 138: 구현예 137에 있어서, 상기 지질 기반 구조가 세포외 소포를 포함하는 것인 지질 기반 구조.
구현예 139: 구현예 138에 있어서, 상기 세포외 소포가 나노소포 및 엑소솜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질-기반 구조.
구현예 140: 구현예 137에 있어서, 상기 지질 기반 구조가 지질 나노입자 또는 미셀을 포함하는 지질 기반 구조.
구현예 141: 구현예 137에 있어서, 상기 지질-기반 구조가 리포솜을 포함하는 지질-기반 구조.
구현예 142: 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 143: 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조 중 임의의 것 또는 구현예 142의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 144: 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조 중 임의의 것 또는 구현예 142의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 145: 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조 중 임의의 것 또는 구현예 142의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 146: 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조 중 임의의 것 또는 구현예 142의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 147: 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 구현예 137 내지 141 중 어느 한 구현예의 지질 기반 구조 중 임의의 것을 포함하는 조성물 또는 구현예 142의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 148: 구현예 143 내지 147 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 방법.
구현예 149: 구현예 144 내지 147 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 종양내 투여를 포함하는 방법.
구현예 150: 구현예 143 내지 149 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 지질-기반 구조가 대상체에서 세포를 조작할 수 있는 방법.
구현예 151: 구현예 143 내지 150 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 152: 구현예 151에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 153: 구현예 143 내지 152 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 154: 구현예 144 내지 153 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
구현예 155: 구현예 1 내지 108 중 어느 한 구현예의 조작된 핵산을 포함하는 나노입자.
구현예 156: 구현예 155에 있어서, 상기 나노입자가 무기 물질을 포함하는 나노입자.
구현예 157: 구현예 155 또는 구현예 156의 나노입자를 포함하는 조성물.
구현예 158: 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 155 또는 구현예 156의 임의의 나노입자, 또는 구현예 157의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 159: 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 155 또는 구현예 156의 임의의 나노입자, 또는 구현예 157의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 160: 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 155 또는 구현예 156의 임의의 나노입자, 또는 구현예 157의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 161: 암이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 상기 구현예 155 또는 구현예 156의 임의의 나노입자, 또는 구현예 157의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 162: 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양이 있는 대상체에게 구현예 155 또는 구현예 156의 임의의 나노입자를 포함하는 조성물, 또는 구현예 157의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 163: 구현예 158 내지 162 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 방법.
구현예 164: 구현예 159 내지 162 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 종양내 투여를 포함하는 방법.
구현예 165: 구현예 158 내지 164 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 나노입자가 대상체에서 세포를 조작할 수 있는 방법.
구현예 166: 구현예 158 내지 165 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 167: 구현예 166에 있어서, 상기 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 168: 구현예 158 내지 167 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 169: 구현예 159 내지 168 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
구현예 170: 구현예 1 내지 108 중 어느 한 구현예의 조작된 핵산을 포함하도록 조작된 바이러스.
구현예 171: 구현예 170에 있어서, 상기 바이러스가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 바이러스: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 종양용해성 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 및 바이러스-유사 입자 (VLP).
구현예 172: 구현예 170에 있어서, 상기 바이러스가 종양용해성 바이러스인 조작된 바이러스.
구현예 173: 구현예 172에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 종양 세포에서 발현될 수 있는 조작된 바이러스.
구현예 174: 구현예 173에 있어서, 상기 종양이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 바이러스: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁종양.
구현예 175: 구현예 171 내지 174 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 바이러스: 종양용해성 단순 포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 베시큘로바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 볼거리 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 바이러스, 및 이의 임의의 변이체 또는 유도체.
구현예 176: 구현예 170 내지 175 중 어느 한 구현예의 조작된 바이러스, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 177: 대상체에서 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 170 내지 175 중 어느 한 구현예의 조작된 바이러스 중 임의의 것 또는 구현예 176의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 178: 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 170 내지 175 중 어느 한 구현예의 조작된 바이러스 중 임의의 것 또는 구현예 176의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 179: 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 170 내지 175 중 어느 한 구현예의 조작된 바이러스 중 임의의 것 또는 구현예 176의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 180: 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양이 있는 대상체에게 구현예 170 내지 175 중 어느 한 구현예의 조작된 바이러스 중 임의의 것을 포함하는 조성물 또는 구현예 176의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 181: 구현예 177 내지 180 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 방법.
구현예 182: 구현예 177 내지 180 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 종양내 투여를 포함하는 방법.
구현예 183: 구현예 177 내지 182 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 바이러스가 대상체의 세포를 감염시키고 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 발현시키는 방법.
구현예 184: 구현예 177 내지 183 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 185: 구현예 184에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 186: 구현예 177 내지 185 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 187: 구현예 177 내지 186 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
구현예 188: 하기를 포함하는 조작된 세포:
a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 그리고
여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 조작된 세포.
구현예 189: 구현예 188에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 조작된 세포.
구현예 190: 구현예 188에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 단일 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 조작된 세포.
구현예 191: 구현예 188 내지 190 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제2 발현 카세트가 (L 1 - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L1 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되는 것인 조작된 세포.
구현예 192: 구현예 190 또는 구현예 191에 있어서, 상기 조작된 세포는 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 링커 폴리뉴클레오티드는 제1 발현 카세트를 제2 발현 카세트에 연결하는 조작된 세포.
구현예 193: 구현예 192에 있어서, 상기 제2 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별도의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자 및 ACP의 번역과 작동 가능하게 연관되어 있는 조작된 세포.
구현예 194: 구현예 188 내지 193 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 195: 구현예 194에 있어서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그가 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포.
구현예 196: 구현예 188 내지 193 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 197: 구현예 188 내지 196 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 198: 구현예 197에 있어서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드가 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 세포.
구현예 199: 구현예 188 내지 198 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 (L 1 - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트가 각각의 X에 대한 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 200: 구현예 199에 있어서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드가 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된 조작된 세포.
구현예 201: 구현예 199 또는 구현예 200에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 조작된 세포.
구현예 202: 구현예 199 내지 201 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드가 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 조작된 세포.
구현예 203: 구현예 202에 있어서, 상기 비-천연 분비 신호 펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 분비 신호 펩티드인 조작된 세포: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
구현예 204: 구현예 188 내지 203 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 ACP 결합 도메인 및 프로모터 서열을 포함하는 조작된 세포.
구현예 205: 구현예 204에 있어서, 상기 프로모터 서열이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래되는 조작된 세포: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도자 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복.
구현예 206: 구현예 188 내지 205 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 합성 프로모터인 조작된 세포.
구현예 207: 구현예 188 내지 206 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 최소 프로모터를 포함하는 조작된 세포.
구현예 208: 구현예 204 내지 207 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 결합 도메인이 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 조작된 세포.
구현예 209: 구현예 188 내지 208 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터인 조작된 세포.
구현예 210: 구현예 209에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
구현예 211: 구현예 188 내지 210 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치료 부류는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
구현예 212: 구현예 211에 있어서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
구현예 213: 구현예 212에 있어서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
구현예 214: 구현예 211에 있어서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; 및 GPR15.
구현예 215: 구현예 211에 있어서, 상기 성장 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: FLT3L 및 GM-CSF.
구현예 216: 구현예 211에 있어서, 상기 공동 활성화 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: c-Jun, 4-1BBL, 및 CD40L.
구현예 217: 구현예 211에 있어서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
구현예 218: 구현예 217에 있어서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
구현예 219: 구현예 217에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 220: 구현예 217에 있어서, 상기 VEGF 억제제가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하는 조작된 세포.
구현예 221: 구현예 188 내지 217 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 인간 유래 효과기 분자인 조작된 세포.
구현예 222: 구현예 188 내지 221 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 제3 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고, 상기 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 것인 조작된 세포.
구현예 223: 구현예 188 내지 221 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 항원 인식 수용체를 추가로 암호화하는 조작된 세포.
구현예 224: 하기를 포함하는 조작된 세포:
a) 제1 프로모터 및 제1 외인성 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E)X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 그리고
여기서 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 것인, 조작된 세포.
구현예 225: 하기를 포함하는 조작된 세포:
a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트,
여기서 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
b) 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 반응성 (ACP 반응성) 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재한, 조작된 세포.
구현예 226: 구현예 225에 있어서, 상기 세포가 제3 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 추가로 포함하고, 상기 제3 프로모터는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 것인 조작된 세포.
구현예 227: 구현예 226에 있어서, 상기 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 조작된 세포.
구현예 228: 구현예 225에 있어서, 상기 ACP가 항원 인식 수용체이고 ACP는 동족 항원에 대한 ACP의 결합 후 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있는 조작된 세포.
구현예 229: 구현예 228에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 동족 항원에 결합하는 ACP에 의해 유도될 수 있는 유도성 프로모터인 조작된 세포.
구현예 230: 구현예 229에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터는 ACP가 동족 항원에 결합한 후 상향조절된 유전자의 프로모터 영역으로부터 유래된 조작된 세포.
구현예 231: 구현예 224 내지 227 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 합성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포.
구현예 232: 구현예 224 내지 231 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 별개의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 조작된 세포.
구현예 233: 구현예 224 내지 232 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 반응성 프로모터가 최소 프로모터를 포함하는 조작된 세포.
구현예 234: 구현예 224 내지 233 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 결합 도메인이 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 조작된 세포.
구현예 235: 구현예 224 또는 구현예 225에 있어서, 상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 ACP를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역과 항원 인식 수용체를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 영역 사이에 국소화된 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 236: 구현예 235에 있어서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 항원 인식 수용체의 번역과 작동 가능하게 연관되어 있는 조작된 세포.
구현예 237: 구현예 225 내지 234 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 238: 구현예 237에 있어서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 항원 수용체 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되어 있는 조작된 세포.
구현예 239: 구현예 235 내지 238 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 240: 구현예 239에 있어서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그가 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산.
구현예 241: 구현예 235 내지 238 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 242: 구현예 235 내지 241 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제3 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 핵산.
구현예 243: 구현예 242에 있어서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드가 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 244: 구현예 222 내지 243 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식하는 조작된 세포: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카데린 3, 카데린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카데린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레우스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1.
구현예 245: 구현예 222 내지 244 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 GPC3을 인식하는 조작된 세포.
구현예 246: 구현예 222 내지 244 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 메소텔린을 인식하는 조작된 세포.
구현예 247: 구현예 222 내지 246 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 항원 결합 도메인을 포함하는 조작된 세포.
구현예 248: 구현예 245 또는 구현예 247에 있어서, 상기 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
여기서 VH는 하기를 포함하고:
KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1),
RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및
GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 그리고
여기서 VL는 하기를 포함하는 조작된 핵산:
KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1),
WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및
QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3).
구현예 249: 구현예 248에 있어서, 상기 VH 영역은 EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 세포.
구현예 250: 구현예 248 또는 구현예 249에 있어서, 상기 VL 영역은 DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 세포.
구현예 251: 구현예 246 또는 구현예 247에 있어서, 상기 MSLN에 결합하는 항원 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열을 갖는 단일-도메인 단일클론 항체의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 조작된 세포:
QVQLVESGGGTVQAGGSLKLACAASGLPRTYNVMGWFRQAPGKEREGVAIIYTTTGATYYRDSVKGRATISQDNAKKSVSLQMNSLRPEDTAIYYCVARQPNSGPWEYWGQGTQVTVSS (서열 번호 129), 또는
QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGYTNSYKWMGWFRQAPGQEREGVAVIYTGNDRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNMIYLDMTRLRPEDSAVYECAIGHDGAWRYWGQGTQVTVSS (서열 번호 130).
구현예 252: 구현예 247 내지 251 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함하는 조작된 세포.
구현예 253: 구현예 247 내지 251 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 조작된 세포.
구현예 254: 구현예 253에 있어서, 상기 scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 조작된 세포.
구현예 255: 구현예 254에 있어서, 상기 VH 및 VL이 펩티드 링커에 의해 분리되는 조작된 세포.
구현예 256: 구현예 254 또는 구현예 255에 있어서, 상기 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하고, 상기 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인인 조작된 세포.
구현예 257: 구현예 222 내지 256 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)인 조작된 세포.
구현예 258: 구현예 257에 있어서, 상기 항원 인식 수용체가 CAR인 조작된 세포.
구현예 259: 구현예 258에 있어서, 상기 CAR는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 각각은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, MyD88 세포내 신호전달 도메인, 2B4 세포내 신호전달 도메인, CD16a 세포내 신호전달 도메인, DNAM-1 세포내 신호전달 도메인, KIR2DS1 세포내 신호전달 도메인, KIR3DS1 세포내 신호전달 도메인, NKp44 세포내 신호전달 도메인, NKp46 세포내 신호전달 도메인, FceRlg 세포내 신호전달 도메인, NKG2D 세포내 신호전달 도메인, 및 EAT-2 세포내 신호전달 도메인.
구현예 260: 구현예 258 또는 구현예 259에 있어서, 상기 CAR는 막횡단 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceRlg 막횡단 도메인, 및 NKG2D 막횡단 도메인.
구현예 261: 구현예 258 내지 260 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAR이 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함하는 조작된 핵산.
구현예 262: 구현예 188 내지 261 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 조절제인 조작된 세포.
구현예 263: 구현예 188 내지 261 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 억제자인 조작된 세포.
구현예 264: 구현예 188 내지 261 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 활성화제인 조작된 세포.
구현예 265: 구현예 188 내지 264 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 266: 구현예 188 내지 264 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인 (ERT2 도메인)을 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 267: 구현예 264 내지 266 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 전사 인자인 조작된 세포.
구현예 268: 구현예 237에 있어서, 상기 ACP가 징크-핑거-함유 전사 인자인 조작된 세포.
구현예 269: 구현예 268에 있어서, 상기 징크 핑거-함유 전사 인자가 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 효과기 도메인을 포함하는 조작된 세포.
구현예 270: 구현예 269에 있어서, 상기 ZF 단백질 도메인은 설계가 모듈식이고 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 구성된 조작된 세포.
구현예 271: 구현예 270에 있어서, 상기 ZF 단백질 도메인이 1내지 10개의 ZFA를 포함하는 조작된 세포.
구현예 272: 구현예 269 내지 271 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효과기 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피를 포함하는 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인 (VPR 활성화 도메인)을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제; 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인 (p300 HAT 코어 활성화 도메인); 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제자 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 이 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.
구현예 273: 구현예 269 내지 272 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위가 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화되어 있는 조작된 세포.
구현예 274: 구현예 265 내지 273 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 억제성 프로테아제가 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)인 조작된 세포.
구현예 275: 구현예 274에 있어서, 상기 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는 조작된 세포.
구현예 276: 구현예 275에 있어서, 상기 NS3 프로테아제 절단 부위가 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는 조작된 세포.
구현예 277: 구현예 274 내지 276 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 NS3 프로테아제가 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는 조작된 세포.
구현예 278: 구현예 277에 있어서, 상기 프로테아제 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르.
구현예 279: 구현예 277에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르인 조작된 세포.
구현예 280: 구현예 277에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르 및 엘바스비르인 조작된 세포.
구현예 281: 구현예 280에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 약학 조성물로 공동-제형화된 것인 조작된 세포.
구현예 282: 구현예 281에 있어서, 상기 약학 조성물이 정제인 조작된 세포.
구현예 283: 구현예 281 또는 282에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 2 대 1 중량비인 조작된 세포.
구현예 284: 구현예 283에 있어서, 상기 그라조프레비르가 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르가 단위 용량당 50 mg인 조작된 세포.
구현예 285: 구현예 266 내지 284 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 타목시펜 또는 이의 대사산물에 대한 ERT2 도메인의 결합 시 핵 국소화를 겪을 수 있는 조작된 세포.
구현예 286: 구현예 285에 있어서, 상기 타목시펜 대사산물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-산화물, 및 엔독시펜.
구현예 287: 구현예 188 내지 286 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ACP가 데그론을 추가로 포함하고, 상기 데그론이 ACP에 작동 가능하게 연결된 조작된 세포.
구현예 288: 구현예 287에 있어서, 상기 데그론이 HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달의 하이드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포.
구현예 289: 구현예 287에 있어서, 상기 데그론이 면역조절 약물 (IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로-매개 분해를 촉진하는 조작된 세포.
구현예 290: 구현예 289에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물-유도성 결합이 가능한 이의 단편.
구현예 291: 구현예 289에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인이 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물인 조작된 세포.
구현예 292: 구현예 289에 있어서, 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인이 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (서열 번호 131)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물인 조작된 세포.
구현예 293: 구현예 289 내지 292 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IMiD가 FDA 승인 약물인 조작된 세포.
구현예 294: 구현예 289 내지 293 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IMiD가 은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드.
구현예 295: 구현예 285 내지 294 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 데그론이 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', ZF 단백질 도메인의 5', ZF 단백질 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화된 것인 조작된 세포.
구현예 296: 구현예 190 내지 295 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 핵산이 절연체를 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 297: 구현예 296에 있어서, 상기 절연체가 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치하는 조작된 세포.
구현예 298: 구현예 190 내지 297 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화되어 있는 조작된 세포.
구현예 299: 구현예 190 내지 297 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 제2 발현 카세트에 대해 반대 방향으로 국소화되어 있는 조작된 세포.
구현예 300: 구현예 188 내지 299 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 추가의 프로모터 및 하기 식을 갖는 추가 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 발현 카세트를 추가로 포함하고:
(L - E) X
여기서
E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20,
여기서 추가 프로모터는 추가 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재한 것인, 조작된 세포.
구현예 301: 구현예 300에 있어서, 상기 추가 발현 카세트가 (L - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 L 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되는 것인 조작된 세포.
구현예 302: 구현예 300 또는 구현예 301에 있어서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 303 구현예 302에 있어서, 상기 2A 리보솜 스키핑 태그가 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포.
구현예 304: 구현예 300 또는 구현예 301에 있어서, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 305: 구현예 300 내지 304 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 세포.
구현예 306: 구현예 305에 있어서, 상기 절단 가능한 폴리펩티드가 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 세포.
구현예 307: 구현예 300 내지 306 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 추가 발현 카세트가 각각의 X에 대한 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조작된 세포.
구현예 308: 구현예 307에 있어서, 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드가 효과기 분자와 작동 가능하게 연관된 조작된 세포.
구현예 309: 구현예 307 또는 구현예 308에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 조작된 세포.
구현예 310: 구현예 307 내지 309 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 분비 신호 펩티드가 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함하는 조작된 세포.
구현예 311: 구현예 310에 있어서, 상기 비-천연 분비 신호 펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 분비 신호 펩티드인 조작된 세포: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12.
구현예 312: 구현예 300 내지 311 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 추가 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터인 조작된 세포.
구현예 313: 구현예 300 내지 311 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 추가 프로모터가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구성적 프로모터인 조작된 세포: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.
구현예 314: 구현예 300 내지 313 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 치료 부류는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소.
구현예 315: 구현예 314에 있어서, 상기 사이토카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.
구현예 316: 구현예 314에 있어서, 상기 케모카인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.
구현예 317: 구현예 314에 있어서, 상기 귀소 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDFl; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; 및 GPR15.
구현예 318: 구현예 314에 있어서, 상기 성장 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: FLT3L 및 GM-CSF.
구현예 319: 구현예 314에 있어서, 상기 공동 활성화 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: c-Jun, 4-1BBL, 및 CD40L.
구현예 320: 구현예 314에 있어서, 상기 종양 미세환경 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2.
구현예 321: 구현예 320에 있어서, 상기 TGF베타 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합.
구현예 322: 구현예 320에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 323: 구현예 320에 있어서, 상기 VEGF 억제제가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하는 조작된 세포.
구현예 324: 구현예 300 내지 320 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 효과기 분자가 인간 유래 효과기 분자인 조작된 세포.
구현예 325: 구현예 188 내지 324 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC-유래된 세포.
구현예 326: 구현예 188 내지 325 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 자연 살해 (NK) 세포인 조작된 세포.
구현예 327: 구현예 188 내지 326 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 자가 조직인 조작된 세포.
구현예 328: 구현예 188 내지 326 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 동종이계인 조작된 세포.
구현예 329: 구현예 188 내지 324 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 세포인 조작된 세포: 선암종 세포, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장종양 세포, 식도종양 세포, 신경교종 세포, 신장종양 세포, 간종양 세포, 폐종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소종양 세포, 췌장종양 세포, 위종양 세포, 고환 난황낭 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포.
구현예 330: 구현예 329에 있어서, 상기 세포가 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작된 것인 조작된 세포.
구현예 331: 구현예 330에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 세포: 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 베시큘로바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 볼거리 바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구냐 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 또는 이의 임의의 변이체 또는 유도체.
구현예 332: 구현예 330 또는 구현예 331에 있어서, 상기 종양용해 바이러스가 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스인 조작된 세포.
구현예 333: 구현예 188 내지 324 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 세포인 조작된 세포: 클로스트리디움 베이제린키, 클로스트리디움 스포로게네스, 클로스트리디움 노비, 에쉐리히아 콜리, 슈도모나스 에루지노사, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 티피무리움, 및 살모넬라 콜레라수이스.
구현예 334: 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 조작된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
구현예 335: 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 임의의 조작된 세포 또는 구현예 334의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 336: 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 임의의 조작된 세포 또는 구현예 334의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 337: 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 임의의 조작된 세포 또는 구현예 334의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 338: 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 임의의 조작된 세포 또는 구현예 334의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 339: 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양이 있는 대상체에게 구현예 188 내지 333 중 어느 한 구현예의 임의의 조작된 세포를 포함하는 조성물 또는 구현예 334의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 340: 구현예 335 내지 339 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 방법.
구현예 341: 구현예 336 내지 339 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 투여가 종양내 투여를 포함하는 방법.
구현예 342: 구현예 335 내지 341 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 세포가 대상체로부터 유래되는 것인 방법.
구현예 343: 구현예 335 내지 341 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조작된 세포가 대상체와 관련하여 동종이계인 방법.
구현예 344: 구현예 335 내지 343 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 345: 구현예 344에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체.
구현예 346: 구현예 335 내지 345 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 항-CD40 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 347: 구현예 336 내지 346 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위종양, 고환 난황낭 종양, 전립선종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양.
구현예 348: 구현예 335 내지 347 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 프로테아제 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 349: 구현예 348에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 억제성 프로테아제를 억제하기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
구현예 350: 구현예 348 또는 349에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물의 투여 전, 투여와 동시에, 투여 후에 투여되는 것인 방법.
구현예 351: 구현예 350에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르.
구현예 352: 구현예 350에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르인 방법.
구현예 353: 구현예 350에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르 및 엘바스비르를 포함하는 방법.
구현예 354: 구현예 353에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 약학 조성물로 공동-제형화되는 것인 방법.
구현예 355: 구현예 354에 있어서, 상기 약학 조성물이 정제인 방법.
구현예 356: 구현예 354 또는 355에 있어서, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 2 대 1 중량비인 방법.
구현예 357: 구현예 356에 있어서, 상기 그라조프레비르가 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르가 단위 용량당 50 mg인 조작된 핵산.
구현예 358: 구현예 335 내지 347 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법은 타목시펜 또는 이의 대사산물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 359: 구현예 358에 있어서, 상기 타목시펜 대사산물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법: 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-산화물, 및 엔독시펜.
실시예
하기는 본 개시내용을 수행하기 위한 특정 구현예의 실시예이다. 실시예는 단지 예시를 위해 제공되고, 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 약간의 실험 오류 및 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 개시내용의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당 업계의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman 및 Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick 및 N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey 및 Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A 및 B(1992) 참조.
실시예 1: 약물 유도성 조절 가능 전사 인자를 통한 효과기 유전자 발현의 조절
효과기 유전자 발현을 유도하기 위해 억제성 프로테아제 및 프로테아제 절단 부위 (조절 가능 TF)를 갖는 예시적인 징크 핑거 전사 인자를 구축하였다. 조절 가능 TF는 전사 인자의 NS3 프로테아제, NS3 절단 부위, 및 활성화 도메인에 연결된 징크 핑거 (ZF) DNA 결합 도메인이다 (도 1a, ZF 도메인은 상단 패널의 다이어그램 왼쪽에 표시된 원이고, NS3 프로테아제는 상단 패널의 다이어그램 중앙에 표시된 부분 원이고, 활성화 도메인은 상단 패널의 다이어그램 오른쪽에 표시된 사각형임). 도 1a에 기술된 전체 작제물은 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)의 예이다. 조절 가능 TF의 발현은 구성적 SFFV 프로모터를 통해 구동된다. 처리되지 않은 세포에서 (예를 들어, 프로테아제 억제제의 부재하) 조절 가능 TF 단백질이 만들어지지만, NS3 프로테아제는 조절 가능 TF 단백질의 ZF DNA 결합 도메인으로부터 활성화 도메인을 자체 절단하여, TF 단백질이 효과기 유전자의 발현을 유도하는 것을 억제한다. 그러나, 아스나프레비르 (ASV)와 같은, 프로테아제 억제제의 존재하에, NS3 프로테아제가 억제되고 조절 가능 TF 단백질이 안정화된다. 그런 다음 조절 가능 TF는 ZF DNA 결합 도메인을 통해 ZF 특이적 프로모터 영역에 결합하고 효과기 유전자의 발현을 유도한다. ZF 특이적 DNA 서열은 도 1, 2, 3, 4, 및 5에서 BD (결합 도메인)로 명명된다.
이 실시예에서, 조절 가능 TF 이중 벡터 시스템이 합성되었다. 이중 벡터 시스템에서, 조절 가능 TF 유전자는 하나의 발현 벡터에 있는 반면, ZF-BD 및 효과기 유전자는 별도의 발현 벡터에 있다. 이 실시예에서, 2개의 상이한 ZF-BD 및 효과기 유전자 발현 카세트 및 벡터가 제조되고, 하나는 minCMV 프로모터 (도 1a)를 갖고 하나는 minYB_TATA 프로모터 (도 1c)를 갖는다. 도 1, 패널 A는 minCMV 프로모터를 갖는 이중 벡터 조절 가능한 TF 시스템의 예시적인 개략도를 나타낸다.
물질 및 방법
T 세포를 해동하고 10 U/mL hrIL-2가 있는 X-Vivo 10TM (X Lonza) 배지에 휴지시켰다 (0일). 1일차에, T 세포를 3:1 비율로 CD3/CD28 다이나비드 (다이나비드 T-활성화제)로 활성화하고 100 U/mL hrIL-2를 보충하였다. 2일차에, T 세포를 각 렌티바이러스에 대해 1x105 GV (GoStix 값) 단위에서 렌티바이러스 벡터를 사용하여 ACP TF 벡터 및 ACP TF 유도성 mCherry 벡터로 공동 형질도입하였다. 다이나비드를 3일차에 제거하였고 T 세포를 신선한 배지 100 U/mL hrIL-2에 1x106 세포/ml로 희석하였다. 6일차에, T 세포를 2.5 μM 아스나프레비르 (ASV)의 존재 또는 부재하에 100 U/mL hrIL-2가 포함된 신선한 배지 X-vivo 10으로 계대시켰다. T 세포를 추가로 2일 동안 배양한 다음 mCherry 발현을 평가하기 위한 유세포 분석을 위해 8일차에 수확하였다.
결과
이중 벡터 시스템 모두 아스나프레비르 첨가 시 T 세포에서 mCherry 발현의 유도를 나타냈다 (도 1b 및 1d). 각 경우에 높은 수준의 mCherry를 발현하는 세포는 조절 가능 TF 및 mCherry 벡터를 모두 받은 공동 형질도입된 세포를 나타낼 가능성이 있다. minCMV 이중 벡터 시스템은 형질도입되었지만 비-아스나프레비르 처리된 세포가 형질도입되지 않은 세포보다 mCherry 발현을 나타내기 때문에 mCherry의 누출 발현을 나타냈을 가능성이 있다 (도 1b). 대조적으로, minYB_TATA 이중 벡터 시스템은 형질도입되었지만 비-아스나프레비르 처리된 세포가 형질도입되지 않은 세포보다 mCherry 발현이 거의 없었기 때문에 최소 누출 발현을 보여주었다 (도 1d). mCherry는 조절 가능 TF의 분해를 억제하기 위해 아스나프레비르가 첨가되면 형질도입된 세포에서 발현되었으며, 이는 발현이 주로 조절 가능 TF-유도 전사로 인한 것임을 나타낸다.
minCMV 이중 벡터 시스템은 minYB_TATA 시스템보다 유도된 상태 (아스나프레비르 처리된 세포)에서 더 높은 mCherry 발현을 보였다. 따라서, 최소 프로모터를 변경하면 조절 가능 TF에 의해 조절되는 페이로드를 발현하는 세포에서 동적 범위 및 기준선 발현을 제어할 수 있다.
실시예 2: IL-10 및 IL-12 발현의 단일 벡터 조절 가능 전사 인자 조절
단일 벡터 TF 및 효과기 유전자 발현 시스템을 평가하였다.
물질 및 방법
2개의 조절 가능 TF 및 효과기 유전자 발현 카세트를 도 2a 및 도 3a에 나타낸 바와 같이 구축하였다. 도 2a에서, minTK 프로모터 및 4x ZF 결합 서열 (ZF-BD)을 갖는 IL-10 효과기 유전자를 약물 유도성 프로모터 및 조절 가능 TF의 5'말단의 업스트림에 3'에서 5' 방향으로 배열하였다. 도 3a에서, minTK 프로모터 및 4x ZF 결합 서열 (ZF-BD)을 갖는 IL-12 효과기 유전자를 약물 유도성 프로모터 및 조절 가능 TF의 5'말단의 업스트림에 3'에서 5' 방향으로 배열하였다.
T 세포를 해동하고 10 U/mL hrIL-2가 포함된 X-Vivo 10™ 배지에 휴지시켰다 (0일차). 1일차에, T 세포를 CD3/CD28 다이나비드의 3:1 배양으로 활성화하고 100 U/mL hr IL-2로 보충하였다. 2일차에, T 세포를 synTF (프로-다이알로도 지칭됨) 유도성 IL-10 또는 IL-12 벡터를 함유하는 렌티바이러스 벡터의 1x105 GV 단위로 형질도입시켰다. GFP 렌티바이러스 벡터를 음성 대조군으로 사용하였다. CD3/CD28 다이나비드를 4일차에 제거하고 T 세포를 계대하였다. 6일차에, T 세포를 100 U/mL hrIL-2가 포함된 X-Vivo 10 배지에서 2.5 μM 아스나프레비르의 존재 또는 부재하에 웰로 계대하였다. 형질도입된 T 세포를 추가로 2일 동안 배양하고 IL-10 또는 IL-12 정량화를 위해 원심분리를 통해 상청액을 수집하였다.
IL-10의 경우, 상청액을 PBS/BSA에서 1/100로 희석하고 인간 IL-10 Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems, cat # D1000B)를 사용하여 분석하였다.
IL-12의 경우, 상청액을 PBS/BSA에서 1/100로 희석하고 인간 IL-12 p70 Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems, cat # D1200B)를 사용하여 분석하였다.
결과
조절 가능 TF 유도성 IL-10 단일 벡터로 형질도입된 T 세포는 아스나프레비르의 부재하에 형질도입된 T 세포와 비교하여 NS3 프로테아제 활성을 억제하기 위한 아스나프레비르의 첨가 후 분비된 IL-10 수준의 6배 증가를 나타냈다 (도 2b). GFP 벡터로 형질도입된 대조군 세포는 IL-10을 생산하지 않았다. 따라서, 단일 벡터 조절 가능 TF 시스템은 약물 조절 사이토카인 생산이 가능하다.
또한, 조절 가능 TF 유도성 IL-12 단일 벡터로 형질도입된 T 세포는 아스나프레비르의 부재하에 형질도입된 T 세포와 비교하여 NS3 프로테아제 활성을 억제하기 위한 아스나프레비르의 첨가 후 분비된 IL-12 수준의 7.5배 증가를 나타냈다 (도 3b). GFP 벡터로 형질도입된 대조군 세포는 IL-12를 생산하지 않았다. 따라서, 단일 벡터 조절 가능 TF 시스템은 상이한 사이토카인의 약물 조절된 사이토카인 생산을 할 수 있다.
실시예 3: 단일 벡터 조절 가능 전사 인자 및 추가 단백질의 공동 발현
추가의 단백질의 공동 발현을 갖는 단일 벡터 조절 가능 TF 및 효과기 유전자 발현 시스템을 평가하였다.
물질 및 방법
조절 가능 TF 및 리포터 유전자 발현 카세트를 도 4a에 나타낸 바와 같이 구축하였다. 조절 가능 TF 유전자를 조절 가능 TF 유전자의 3' 말단에서 2A 링커를 통해 myc-태그된 키메라 항원 수용체 (CAR)에 연결하였다. minYB_TATA 프로모터 및 4x ZF 결합 서열 (ZF-BD)을 갖는 mCherry 리포터 유전자를 약물 유도성 프로모터 및 연결된 조절 가능 TF-CAR 유전자의 5' 말단의 3'에서 5' 방향으로 배열하였다.
0일차에, 저캇 세포를 24 웰 플레이트 (1ml/웰)에서 1x106 세포/ml로 RPMI (RPMI 배지)에 배치하였다. 저캇 세포를 바이러스/웰의 3x105 GV 단위로 형질도입시켰다. 2일차에, 저캇 세포를 2 μM 아스나프레비르의 존재 또는 부재하에 웰로 계대시켰다. 6일차에, 저캇을 유세포 분석을 위해 수확하였다. CAR의 발현을 평가하기 위해, 세포를 a-Myc-APC 항체 (R&D Systems, cat # IC3696A)로 염색하였다. mCherry 발현을 또한 평가하였다.
결과
도 4b에 나타낸 바와 같이, myc-태그된 CAR은 아스나프레비르-처리된 세포 및 처리되지 않은 세포 모두에서 유사한 수준으로 발현되었고, 조절 가능 TF가 저캇 세포에서 CAR과 공동 발현될 수 있음을 나타낸다. 조절 가능 TF에서 프로테아제의 존재 및 활성은 조절 가능 TF에 연결된 CAR 단백질의 발현 또는 안정성에 영향을 미치지 않았다. 이는 조절 가능한 TF 시스템이 CAR-T 세포에서 기능할 수 있음을 나타낸다.
도 4c에 나타낸 바와 같이, 프로테아제를 억제하기 위한 아스나프레비르의 첨가는 mCherry 리포터 유전자의 조절 가능 TF-유도 발현을 초래하였다. 따라서, 조절 가능 TF 발현 시스템은 효과기 단백질의 발현을 유도하기 위해 추가의 공동-발현된 단백질의 존재하에 올바르게 기능할 수 있다.
실시예 4: CAR 및 페이로드 발현
CAR 및 페이로드/사이토카인 발현을 "아머" 세포를 위한 CAR 작제물 및 효과기 유전자 발현 시스템으로 공동 형질도입된 세포에서 평가하였다. 페이로드/사이토카인 발현을 CAR 작제물이 있거나 없는 효과기 유전자 발현 시스템으로 형질도입된 세포에서 평가하였다.
물질 및 방법
효과기 유전자 (예를 들어, 관심 사이토카인 페이로드) 발현 카세트를 구축하고 바이러스 벡터에 클로닝한 다음 페이로드 바이러스를 생성하는 데 사용하였다, 표 10 참조. 간암에서 고도로 특이적으로 발현되는 단백질 [Sun et al, Medical Science Monitor, 2017], GPC3을 표적으로 하는 CAR 작제물을 도 6a에 나타낸 바와 같이 구축하고 (작제물 "1106") 바이러스 벡터에 클로닝하고 GPC3-CAR 바이러스를 생산하는데 사용하였다. GPC3-CAR을 발현을 모니터링하기 위해 YFP 리포터에 융합시켰다.
0일차에, CD4/CD8 T 세포 (FL00711)를 해동하고 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + IL-2 (100 단위/ml)에서 다이나비드 (3:1)로 활성화시켰다. 1일차에, 세포를 페이로드 바이러스의 1x105 GV +/- GPC3-CAR (작제물 1106) 바이러스의 1x105 GV로 형질도입하였다. 4일차에, CAR 형질도입 효율을 유세포 분석기 (Cytoflex)로 평가하였다. 형광 중앙값 강도 (MFI) 및 GPC3-CAR을 발현하는 세포의 백분율을 FlowJo로 분석하였다. 그런 다음 세포를 추가 확장을 위해 전체 T 세포 배지 + IL2에서 Grex 24 (Wilson Wolf)로 이동시켰다.
8일차에, 세포를 Grex 플레이트에서 수확하고 계수한 다음 1x106 세포를 스핀다운하고 IL-2가 없는 1mL의 전체 T 세포 배지에 재현탁하였다. 세포를 48시간 동안 24 웰 플레이트에 접종하였다. 10일차에, 상층액을 수확하고 24 웰 플레이트에서 세포를 계수하여 생존력을 결정하였다. 세포를 회전시키고 상층액을 페이로드 발현을 위한 Luminex 3plex (IL-12/21/15) 키트 (LXSAHM-03; R&D)를 사용하는 Luminex에 의한 추가 처리를 위해 -80C로 옮겼다.
표적 세포와의 공동 배양 실험을 위해, 2.5x104 HepG2 세포/웰을 전체 EMEM에서 5시간 동안 접종하였다. 그 다음, EMEM을 제거하고 1x106 세포 전체 형질도입된 T 세포를 IL-2이 없는 T 세포 배지에 첨가하였다 (4:1, E:T). 상청액을 48시간 후에 수확하였다. 페이로드 발현 및 T 세포 활성화를 Luminex-6plex 키트 (LXSAHM-06; R&D) (IL-12/21/15/2/TNFa/IFNg)를 사용하여 평가하였다.
표 10 - 효과기 유전자 작제물
Figure pct00028
결과
CAR 발현을 효과기 분자 (예를 들어, 사이토카인) 페이로드를 발현하도록 또한 조작된 세포에서 평가하였다. 도 6b 및 도 7 (하부 패널)에 나타낸 바와 같이, GPC3-CAR은 형질도입 4일 후에 형질도입된 세포의 25.0-58.2%에서 발현되었다. 도 7 (상부 패널)에 나타낸 바와 같이, YFP MFI에 의해 평가된 GPC3-CAR 발현 수준은 일반적으로 GPC3-CAR 바이러스 단독 ("1106")을 사용한 형질도입과 조사된 상이한 페이로드 작제물 사이에서 유사하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 생존력은 또한 일반적으로 GPC3-CAR 바이러스 단독 ("1106")을 사용한 형질도입과 조사된 상이한 페이로드 작제물 사이에서 유사하였다. 따라서, CAR 발현 및 생존력은 아머 효과기 분자 페이로드를 사용한 조작에 의해 유의하게 변경되지 않았다.
표 11- 세포주 사이토카인 페이로드 및 생존력
Figure pct00029
사이토카인의 페이로드 발현을 CAR 작제물을 발현하도록 조작된 세포가 있거나 없는 아머 효과기 분자 발현 시스템으로 형질도입된 세포에서 평가하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 페이로드 사이토카인 발현은 관심 있는 사이토카인 페이로드만을 암호화하는 모든 작제물에서 검출되었다 (왼쪽 패널: 도 8a - IL-12; 도 8b - IL-15; 도 8c - IL-21). 사이토카인의 발현은 또한 단일 사이토카인을 암호화하도록 조작된 작제물에서 일반적으로 더 우수하였다 (왼쪽 패널 대 오른쪽 패널). 특히, GPC3-CAR과 공동 형질도입된 경우, 사이토카인 수준은 일반적으로 로그 배수만큼 감소하거나 검출되지 않았다 (오른쪽 패널: 도 8a - IL-12; 도 8b - IL-15; 도 8c - IL-21).
다음으로 CAR T 세포가 표적 세포와 공동 배양되었을 때 사이토카인의 페이로드 발현을 평가하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, HepG2 세포의 존재하에 IL-12 또는 IL-21에 대한 페이로드 사이토카인 발현의 유의한 변화는 관찰되지 않은 반면, IL-15의 발현은 대략 50% 감소하였다 (상부 패널 대 하부 패널: 도 9a - IL-12; 도 9b - IL-15; 도 9c - IL-21). 페이로드 사이토카인 발현에 더하여, 추가 T 세포 활성화 사이토카인의 생산을 평가하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, HepG2 세포 표적 세포의 존재하에 TNFα, IFNγ, 또는 IL-2 발현의 유의한 변화는 관찰되지 않았다 (상단 패널 대 하단 패널: 도 10a - TNFα; 도 10b - IFNγ; 도 10c - IL-2).
실시예 5: 공동-발현 시스템에서 생체 내 CAR 활성
CAR 발현, 페이로드/사이토카인 발현, 및 항-종양 활성을 "아머" 세포에 대한 CAR 작제물 및 효과기 유전자 발현 시스템으로 공동 형질도입된 세포에서 평가하였다.
물질 및 방법
효과기 유전자 (예를 들어, 관심 사이토카인 페이로드) 발현 카세트를 구축하고 바이러스 벡터로 클로닝한 다음 페이로드 바이러스를 생성하는 데 사용하였다, 표 12 참조. 간암에서 고도로 특이적으로 발현되는 단백질 (Sun et al, Medical Science Monitor, 2017), GPC3을 표적으로 하는, CAR 작제물을 도 11a에 나타낸 바와 같이 구축하고 (작제물 "1108") 바이러스 벡터로 클로닝하고 GPC3-CAR 바이러스를 생산하는데 사용하였다. GPC3-CAR을 발현을 모니터링하기 위해 YFP 리포터에 융합시켰다.
0일차에, 6x106 HepG2 fLuc 세포를 NGS 암컷 마우스에 이식하였다 (IP 공동). 7일차에, 체중 (BW)을 측정하고 마우스를 무작위 추출하였다. 11일차에, 5x106 CAR-T 세포를 IV 주입하였다. 마우스의 전반적인 건강 상태, BLI 측정 및 체중을 일주일에 두 번 관찰하였다. 또한 마우스를 일주일에 한 번 EDTA 튜브에 채혈하고 회전시켜 혈장에서 세포를 분리하였다. 혈장을 Luminex-6plex 키트 (LXSAHM-06; R&D) (IL-12/21/15/2/TNFa/IFNg)를 사용하여 Luminex 분석까지 -80C에 동결하였고 세포 펠렛을 재현탁하고 유세포 분석을 위해 처리하였다. 체중이 원래 체중의 15% 이상 떨어지면 마우스를 희생시켰다. 45일차에, 모든 마우스를 종양으로 희생시키고 폐, 간 및 비장을 수집하고 고정하고 종양의 무게를 측정하였다.
0일차에, CD4/CD8 T 세포 (FL00711)를 해동하고 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + IL-2 (100 단위/ml)에서 다이나비드 (3:1)로 활성화하였다. 1일째에, 세포를 1x105 GV의 페이로드 바이러스 +/- 1x105 GV의 GPC3-CAR 바이러스로 형질도입하였다 (작제물 "1108"). 4일차에, CAR 형질도입 효율을 유세포 분석기 (Cytoflex)로 평가하였다. 형광 중앙값 강도 (MFI) 및 GPC3-CAR을 발현하는 세포의 백분율을 FlowJo로 분석하였다. 그런 다음 세포를 추가 확장을 위해 전체 T 세포 배지 + IL2에서 Grex 24 (Wilson Wolf)로 옮겼다.
9일차에, 세포를 Grex 플레이트에서 수확하고 계수한 다음 1x106 세포를 스핀다운하고 IL-2이 없는 1mL의 전체 T 세포 배지에 재현탁하였다. 세포를 48시간 동안 24 웰 플레이트에 접종하였다. 11일째에, 상청액을 수확하고 24 웰 플레이트에서 세포를 계수하여 생존력을 결정하였다. 세포를 회전시키고 상층액을 페이로드 발현을 위한 Luminex 3plex (IL-12/21/15) 키트 (LXSAHM-03; R&D)를 사용하는 Luminex에 의한 추가 처리를 위해 -80C로 옮겼다.
생체 외 세포 분석을 위해, 1 ml PBS를 혈액 샘플에 첨가하고, 혼합하고 15 ml 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 2 ml/튜브 용해 완충액을 첨가하였다. 튜브를 2회 뒤집어서 혼합하여 실온에서 5분 동안 배양하였다. 다음으로, ~14 ml의 FACS 완충액 세척액을 첨가하고 2회 반복하였다. 마지막 스핀에서, 세포를 ~250-400ul에 재현탁하고 v-바닥 플레이트로 옮긴 다음, 400 ul/웰 PBS로 세척하였다. 다음으로, 100 ul/웰의 생존성 염료 (zombieUV; Biolegend)를 첨가하고 실온 암소에서 15분 동안 배양하였다. 그런 다음 웰에 200ul FACS 완충액을 제공하고, 400g에서 5분 동안 회전시키고, 따라낸 다음, 200 ul/웰 항체 혼합물을 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양하였다. 세포를 200ul FACS 완충액으로 세척하고, 400g에서 5분 회전시키고, 따라내고, 2회 반복하였다 세포를 150 ul/웰 FACS 완충액에 재현탁시키고, u-바닥 플레이트로 옮기고 판독하였다. 항체는 Biolegend에서 구입하였고 하기를 포함하였다: mCD45 클론 30-F11; hCD45 클론 H130; hCD3 클론 OKT3; hCD8 클론 SK1.
표 12 - 효과기 유전자 작제물
Figure pct00030
결과
CAR 발현을 또한 아머 사이토카인 페이로드를 발현하도록 조작된 T 세포에서 평가하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, GPC3-CAR은 형질도입 4일 후에 조사된 모든 작제물의 54% 초과, 6개의 작제물 중 5개의 99% 초과에서 발현되었다. 다음으로 사이토카인의 페이로드 발현을 평가하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 조작된 CAR T 세포는 각각의 페이로드 사이토카인을 발현하였다.
표 13 - 사이토카인 발현 (pg/ml)
Figure pct00031
그런 다음 아머 사이토카인 페이로드로 조작된 CAR T 세포의 효능을 평가하였다. CAR-T 세포 + IL-12 (868)로 처리된 마우스를 21일차에 희생시켰고 CAR-T 세포 + IL-15/IL-21 (1478)로 처리된 마우스를 열악한 건강 상태로 인해 24일차에 희생시켰다. 도 12에 나타내고 요약된 바와 같이, 종양 크기를 바이러스 없이 형질도입된 T 세포 (도 13a - 왼쪽 패널), 사이토카인 없이 GPC3-CAR T 단독 (도 13a - 오른쪽 패널), 또는 아머 사이토카인으로 조작된 GPC3-CAR T (도 13b - IL-12/IL-21 공동-발현; 도 13c - IL-15; 도 13d - IL-12; 도 13e - IL-21)로 처리된 마우스에 대해 11, 14, 21 및 24일에 BLI 측정에 의해 평가하였다. 저용량에서 (5e6 세포/ml), 바이러스 없이 또는 GPC3-CAR 단독으로 형질도입된 T 세포는 종양 부담이 증가하는 것을 입증하였다. 대조적으로, CAR 및 IL-12/IL-21 ("880" 도 12; 도 13b) 또는 IL-15 ("1335" 도 12; 도 13c)를 공동 발현하도록 조작된 T 세포는 24일까지 종양 부담 감소를 입증하였다. CAR 및 IL-12를 공동 발현하도록 조작된 T 세포는 초기 종양 부담 감소를 입증하였지만 ("868" 도 12; 도 13d), 조합은 열악한 건강으로 인해 마우스가 희생됨에 따라 높은 독성을 입증하였다. CAR 및 IL-21을 공동 발현하도록 조작된 T 세포는 잠재적으로 낮은 수준의 사이토카인 때문에, 개별 마우스에서 검출된 종양 부담 감소 (도 13e)와 함께 전체 종양 크기 유지 ("862" 도 12)를 입증하였다. 따라서, 결과는 선택된 사이토카인 및 사이토카인 조합을 공동 발현하는 CAR T 세포가 종양 부담을 감소시키는 효능을 입증했지만, 잠재적으로 높은 독성을 나타내어 아머 사이토카인 발현이 조절의 이점을 얻을 수 있음을 시사한다.
T 세포 활성화 사이토카인을 처리된 마우스의 혈장에서 평가하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 처리 3일 후인, 14일차에 TNFα (도 14a) 또는 IL-2 (도 14c)의 유의미한 검출이 없었다 (상부 패널). IFNγ (도 14b)는 IL-12 단독 발현 ("880") 또는 IL-12/21 공동 발현 ("880") 처리군에서 14일차에 관찰되었다 (도 14b - 상부 패널). 대조적으로, 처리 10일 후인, 21일차에 TNFα (도 14a - 하부 패널)는 종양 감소와 상관관계가 있는 처리군 ("868"/"880"/"1335"; 도 12 및 도 13 참조)에서 관찰되었다 (하부 패널). IFNγ (도 14b - 하단 패널)는 또한 IL-12 및 IL-12/21 시스템에서 현저하게 더 높은 검출 (~10x)이었지만, 21일차에 종양 감소와 상관관계가 있는 처리군에서 관찰되었다. IL-2 (도 14c - 하부 패널)는 또한 21일차에 IL-12 및 IL-12/21 시스템에서 관찰되었고, IL-12 단독 시스템에서 현저하게 더 높은 검출이었다. 따라서, 결과는 아머 사이토카인 및 아머 사이토카인 조합을 발현하도록 조작된 CAR T 세포가 T 세포 활성화 사이토카인의 생산을 입증했음을 나타낸다.
사이토카인의 페이로드 발현을 또한 처리된 마우스의 혈장에서 평가하였다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, IL-12는 IL-12 단독에서 현저하게 더 높은 검출 (~10x)이었지만, IL-12 및 IL-12/21 시스템에서 처리 후 3일인, 14일차 (상부 패널) 및 처리 후 10일인, 21일차에 관찰되었다 (하부 패널). IL-12 발현은 또한 마우스에서 인간 CD45+ 세포의 백분율이 증가함에 따라 증가하였다 (하기 참조). 도 15b에 나타낸 바와 같이, IL-15는 IL-15 시스템에서 처리 후 3일인, 14일차 (상단 패널) 및 처리 후 10일인, 21일차에 관찰되었다 (하부 패널). IL-15 발현은 또한 마우스에서 인간 CD45+ 세포의 백분율이 증가함에 따라 증가했지만 (하기 참조), IL-12보다 더 완만하다. 예기치 못하게, IL-21은 처리 후 10일인, 21일차에 (하부 패널) IL-12 시스템에서 검출되었고 ("868") IL-21 단독 또는 IL-12/IL-21 공동-발현 시스템에서 검출되지 않았다 (도 15c). 따라서, 결과는 아머 사이토카인을 발현하도록 조작된 CAR T 세포가 선택된 시스템에서 페이로드 사이토카인의 생산을 입증했음을 나타낸다.
T 세포 지속성의 생체 외 분석을 평가하였다. 도 16a에 나타낸 바와 같이, 처리 후 3일인, 14일차에 인간 CD45+ CAR T 세포가 전혀 검출되지 않거나 최소로 검출되었고 (오른쪽 패널) 종양 크기의 감소가 관찰되지 않은 것과 상관관계가 있었다 (왼쪽 패널). 대조적으로, 도 16b에 나타낸 바와 같이, CD45+ CAR T 세포가 종양 감소 (왼쪽 패널)를 입증한 아머 CAR 시스템 ("868"/"880"/"1335"; 오른쪽 패널)에서 검출되었지만, 잠재적으로 GvHD 때문에 특히 모든 아머 그룹은 높은 수준의 독성을 나타낸다.
실시예 6: 타목시펜 조절 가능 전사 인자 시스템
페이로드 발현을 조절 가능 TF 발현 시스템을 사용하여 평가하였다.
물질 및 방법
다양한 조절 가능 TF (약물 유도성 형식에 대한 활성화-조건부 제어 폴리펩티드 (ACP) 또는 "synTF"로도 지칭됨) 및 발현 카세트를 도 17a에 나타낸 바와 같이 구축하였다. 전사 인자 활성의 조절을 P65 활성화 모티프를 갖는 징크 핑거 및 조절 가능 TF ("565")의 타목시펜 제어 핵 국소화를 허용하는 ERT2 서열의 융합을 통해 구축하였다. 리포터 페이로드 서열을 반대 방향으로 SFFV 프로모터에 의해 발현되는 GPC3-CAR-YFP 작제물이 있거나 ("2235") 없는 ("1066"), 조절 가능 TF로부터의 별도의 작제물 상의 유도성 제어 (YB-TATA 프로모터 및 4x ZF 결합 서열 "ZFBD"에 의해 구동되는 mCherry) 하에 구축하였다. 카세트를 바이러스 벡터에 클로닝하고 바이러스를 생산하는 데 사용하였다.
0일차에, CD4/CD8 T 세포 (FL00711)를 해동하고 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + IL-2 (100 단위/ml)에서 다이나비드 (3:1)로 활성화시켰다. 2일차에, 세포는 1x105 GV의 바이러스로 형질도입되었다. 7일째에, 4-히드록시타목시펜 (4-OHT), N-데스메틸타목시펜, 또는 엔독시펜을 1uM, 0.25uM, 0.1uM로, 또는 약물 없이 각 웰에 첨가하였다. 9일차에 형광 중앙값 강도 (MFI)를 평가하였다.
결과
ERT2 조절 가능 TF 시스템을 4-히드록시타목시펜 (4-OHT), N-데스메틸타목시펜, 또는 엔독시펜을 사용하여 평가하였다. 도 17b에 나타낸 바와 같이, 4-OHT 처리는 단독으로 발현된 리포터 (왼쪽 패널) 또는 CAR 작제물을 또한 암호화하는 작제물로부터의 발현 (오른쪽 패널)의 조절 가능하고 적정 가능한 발현을 초래하였다. 도 17c에 나타낸 바와 같이, N-데스메틸타목시펜 처리는 비-약물 대조군에 비해, 단독으로 발현된 (왼쪽 패널) 및 CAR 작제물을 또한 암호화하는 작제물로부터 둘 모두의 (오른쪽 패널) 리포터의 발현을 초래하지 않았다. 도 17d에 나타낸 바와 같이, 엔독시펜 처리는 단독으로 발현된 리포터 (왼쪽 패널) 또는 CAR 작제물을 또한 암호화하는 작제물로부터의 발현 (오른쪽 패널)의 조절 가능하고 적정 가능한 발현을 초래하였다. 결과의 요약은 도 17e에 제시된다. 도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, CAR의 발현을 확인하였고 미처리 및 최고 농도의 약물 처리에 걸쳐 유사하였다. 따라서, 결과는 T 세포가 CAR T 시스템을 포함하여, 4-OHT 또는 엔독시펜을 사용하는 페이로드의 조절 가능하고 적정 가능한 발현을 생성하기 위해 ERT2 조절 가능 TF 시스템으로 조작될 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: CAR 발현과 조합된 조절 가능 전사 인자 시스템
CAR 및 조절 가능 TF 발현 시스템의 이중 조작을 위한 다양한 전략을 평가하였다.
물질 및 방법
CAR 및 조절 가능 TF 발현 시스템의 이중 조작을 위한 다양한 전략을 다양한 방향, 구성 요소, 및 조사된 2개의 벡터 구성을 기술하는 도 20 및 도 21에 나타낸다.
0일차에, CD4/CD8 T 세포 (FL00711)를 해동하고 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + IL-2 (100 단위/ml)에서 다이나비드 (3:1)로 활성화시켰다. 2일차에, 세포는 1x105 GV의 바이러스로 형질도입되었다. 7일차에, 2uM 그라조프레비르를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않았다. 9일차에 형광 중앙값 강도 (MFI)를 평가하였다.
결과
CAR의 발현을, 특히 페이로드 벡터, 조절된 TF 벡터, 또는 단독으로 암호화되었을 때 CAR 발현이 개선되는지를 평가하기 위해 다양한 방향, 구성 요소, 및 2개의 벡터 구성을 조사하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 도 21에 기술된 다양한 전략의 평가는 CAR 발현이 조절 가능 TF (ACP)를 암호화하는 벡터에서가 아니라, 리포터 페이로드를 갖는 벡터에서 암호화된 경우에만 검출되었음을 입증하였다. 도 23a 및 도 23b에 나타낸 바와 같이, 하나의 벡터 상의 페이로드 및 CAR 및 별도의 벡터 상의 조절 가능한 TF를 암호화하는 전략은 약 50%의 CAR 및 리포터를 발현하는 형질도입된 세포를 초래하였고, 많은 비율이 둘 모두를 공동 발현하였다. 도 24a 및 도 24b에 나타낸 바와 같이, 하나의 벡터 상의 페이로드 및 조절 가능 TF 및 별도의 벡터 상의 CAR을 암호화하는 전략은 약 65%의 리포터를 공동 발현하는 CAR을 발현하는 형질도입된 세포, 및 약 35%의 유도 후 리포터를 전체적으로 발현하는 형질도입된 세포를 초래하였다. 따라서, 결과는 (1) 페이로드와 동일한 백터 상의 CAR 및 별도의 벡터 상의 조절 가능 TF를 암호화하는 것은 유도된 (페이로드/리포터 양성) 상태에서 더 많은 세포를 생성하고; 그리고 (2) 하나의 벡터 상의 페이로드 및 조절 가능 TF 및 별도의 벡터 상의 CAR을 암호화하는 것은 더 많은 CAR 발현 세포를 생성함을 나타낸다.
실시예 8: 조절 가능 전사 인자 시스템은 시험관 내 및 생체 내 조절된 발현을 입증한다
조절 가능 TF 발현 시스템을 시험관 내 및 생체 내 모두에서 평가하였다.
물질 및 방법
NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (작제물 "1845")을 사용하는 약물 유도성 형식에 대한 ACP ("synTF"로도 지칭됨) 뿐만 아니라 hIL-12 효과기 분자 페이로드를 구동하는 4x BS minYB-TATA ACP 반응성 프로모터를 사용하는 발현 카세트의 개략도를 도 25에 나타낸다. 구성적 SFFV 프로모터에 의해 구동되는 hIL-12를 갖는 작제물 (작제물 "171")을 또한 평가하였다. 작제물의 관련 서열은 표 14에 제공된다.
표 14 - ACP 서열
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
시험관 내 평가를 위해, 0일차에, CD4/CD8 T 세포 (FL00711)를 해동하고 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + IL-2 (100 단위/ml)에서 다이나비드 (3:1)로 활성화시켰다. 2일차에, 세포를 상기 기술한 작제물을 암호화하는 1x105 GV의 바이러스로 형질도입하였다. 7일차에, 0.1uM 그라조프레비르 (GRZ), 0.5uM 그라조프레비르를 추가하거나, 약물을 추가하지 않았다. 형질도입된 T 세포를 추가로 2일 동안 배양하고 상청액을 IL-12 정량화를 위해 원심분리를 통해 수집하였다. IL-12의 경우, 상청액을 PBS/BSA에서 1/100로 희석하고 인간 IL-12 p70 Quantikine ELISA 키트 (R&D 시스템, cat # D1200B)를 사용하여 분석하였다.
생체 내 평가를 위해, T 세포를 SB01845 & SB02357로 형질도입하고, 각각은 HEK 세포에서 바이러스 역가를 기반으로 하여 5의 추정된 MOI였다. 양성 대조군 T 세포를 구성적 hIL-12 (SFFV에 의해 구동됨)를 암호화하는, 5 MOI의 SB00171로 형질도입하였다. 음성 대조군은 형질도입되지 않은 T 세포였다. T 세포에 통합된 렌티바이러스 게놈의 수를 PCR로 대량 분석하였다 (카피 # 분석). NSG 마우스를 -2일차에 무작위화하고 1일째 오후에 비히클 또는 그라조프레비르 (Grz) 투여를 시작하였다 (비히클: 2.5% DMSO, 30% PEG400, 67.5% PBS). 그라조프레비르 칼륨염을 DMSO, PEG400, 및 PBS에 순차적으로 용해시켜 10mg/mL가 되도록 하였다. 투약: 약물 처리된 마우스는 각 투여 시점에서 25mg/kg Grz를 받고; 비히클 처리된 마우스는 동일한 부피의 비히클을 받고; 모든 Grz 투약은 IP 투여되었다. 2-4일차에 BID 투약을 계속하였다. 2일차에, AM 약물 투여 후 꼬리 정맥 주사에 의해 마우스 당 20e6 T 세포를 주입하였다. 마우스를 4일차에 채혈하고 5일차에 희생/채혈하였다. Luminex 분석을 실행하여 마우스 혈장에서 hIL-12의 수준을 평가하였다. 마우스 혈액에서 인간 T 세포의 존재는 유세포 분석에 의해 분석되었다. 처리군은 표 15에 제시되어 있다.
표 15 - 뮤린 조절된 아머 처리군
Figure pct00038
결과
도 26에 나타낸 바와 같이, NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (작제물 "1845")을 사용하는 약물 유도성 형식에 대한 ACP ("synTF"로도 지칭됨)를 갖는 조절된 발현 시스템 뿐만 아니라 hIL-12 효과기 분자 페이로드를 구동하는 4x BS minYB-TATA ACP 반응성 프로모터를 사용하는 발현 카세트는 증가하는 양의 GRZ를 첨가할 때 시험관 내에서 적정 가능한 hIL-12 분비를 초래하였고, 약물 부재시 최소 hIL-12가 검출되었고 바이러스 부재시 hIL-12가 검출되지 않았다.
다음으로, 작제물을 생체 내에서 평가하였다. 실험 설계는 도 27에 도시되어 있다. T 세포를 형질도입 및 주입 후 평가하였다. 표 16에 나타낸 바와 같이, 조절 가능한 시스템을 갖는 T 세포는 구성적 시스템에 비해 ~2.5개의 더 낮은 카피 수 바이러스 카피 수를 나타냈고, 이는 더 낮은 형질도입 효율을 나타낸다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 9일차의 T 세포는 또한 잠재적으로 2개의 바이러스를 사용한 형질도입으로 인해 바이러스가 없는 대조군과 비교하여 조절 가능한 시스템에서 ~2배 확장을 입증하였다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 각 그룹의 T 세포는 유사한 글루코스 프로파일을 입증하였고, T 세포 성장 및 대사가 모든 그룹에 걸쳐 일반적으로 동등함을 나타낸다. 다음으로, 생체 내 hIL-12의 생산을 평가하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, T 세포는 각 그룹에 대해 동일하게 존재하여 조절 가능한 아머 시스템이 생체 내 T 세포 수명을 변경하지 않음을 입증하였다. 도 31에 나타낸 바와 같이, GRZ의 투여는 마우스의 혈장에서 검출 가능한 hIL-12를 유도하고 (비히클보다 ~100배) 조절 가능 시스템이 T 세포의 조절된 아머를 위한 약물-유도성 생체 내 형식을 제공함을 나타낸다.
표 16 - 바이러스 카피 수
Figure pct00039
실시예 9: 활성화 유도성 시스템
CAR-T가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 인핸서를 평가한다.
물질 및 방법
라이브러리 생성: CAR-T가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 인핸서를 선별하기 위해 최소 프로모터 (후기 Ade 최소 프로모터)에 연결된 15,000개 인핸서의 라이브러리를 생성하였다. 활성화된 T 세포의 ATAC-seq가 강화된 인핸서 (Gate et al. Nat Genet. Author manuscript; PMC 2019 Jan 9에서 이용 가능; 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함됨)를 라이브러리를 위해 선택하였다 (<400 bp 모든 인핸서가 사용됨). 라이브러리 구성원의 길이는 199 bp이므로, 199bp보다 긴 인핸서의 경우 타일링을 사용하여 가능한 한 많이 겹치도록 각 인핸서의 2개 영역을 덮었다. 단일 세포 RNA seq 데이터에서 상위 상향 조절된 유전자 (Xhangolli et al. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 Apr;17(2):129-139. doi: 10.1016/j.gpb.2019.03.002; 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함됨)를 인간 인핸서의 HACER 데이터베이스에서 검색하였고 이들 유전자로부터의 인핸서를 선택하였다. 합성 인핸서를 활성화된 T 세포에서 상향 조절되는 것으로 문헌에서 알려진 전사 인자 쌍을 사용하여 설계하였다. 각 TF에 대한 4개의 결합 부위를 사용하여 합성 인핸서 (aaaabbbb 또는 abababab)를 생성하였다. 다음 TF 목록에서 가능한 모든 쌍이 포함되었다: ATF2, ATF7, BACH1, BATF, Bcl-6, Blimp-1, BMI1, CBFB, CREB1, CREM, CTCF, E2F1, EBF1, EGR1, ETV6, FOS, FOXA1, FOXA2, GATA3, HIF1A, IKZF1, IKZF2, IRF4, JUN, JUNB, JUND, Lef1, NFAT, NFIA, NFIB, NFKB, NR2F1, Nur77, PU.1, RELA, RUNX3, SCRT1, SCRT2, SP1, STAT4, STAT5A, T-Bet, Tcf7, ZBED1, ZNF143, 및 ZNF217.
후보 선택: 단일 세포 RNA-seq 데이터 및 활성화된 T 세포 및 휴지 T 세포의 ATAC-seq 데이터에 대한 생물정보학 분석을 사용하여, 라이브러리와 병렬로 선별하기 위해 후보 인핸서를 선택하였다. 단일 세포 RNA-seq 데이터를 사용하여, CAR-T 활성화 동안 상향 조절되는 전사 인자를 확인하였다. ATAC-seq 개방형 인핸서 영역은 이러한 상향 조절된 전사 인자의 결합 부위에 대해 선별되었고 이러한 인핸서의 서브셋이 후보로 선택되었다. 단일 세포 RNA-seq 데이터를 사용하여, 휴지 CAR-T에 비해 활성화된 CAR-T에서 상향 조절된 상위 유전자를 확인하고 게놈에서 이러한 유전자의 업스트림 2kb 영역을 후보 프로모터로 선택하였다.
선별: 라이브러리 및 선택된 후보는 유동 분류에 의해 선별된다 (min 프로모터는 형광 mKate 단백질의 발현을 구동함). 활성화되거나 활성화되지 않은 (휴지) T 세포를 유세포 분석에 의해 분석하고, 고/저 발현에 대해 분류하고, 활성화되었지만 휴지 T 세포가 아닌 높은 빈에서 프로모터가 확인되는 NGS에 의해 비교하였다.
결과
인핸서 및 선택된 후보의 라이브러리는 CAR-T가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 향상시키기 위해 선별된다. CAR-T가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 인핸서가 확인된다.
실시예 10: T 세포에서 IL-12 및 IL-15 약물 유도성 발현 시스템
IL-12 및/또는 IL-15 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략에 대해 T 세포에서 평가하였다. CAR 작제물의 공동 발현 및 CAR 활성을 포함하는 전략을 평가하였다.
물질 및 방법
시험관 내 평가를 위해, 0일차에, CD4/CD8 T 세포 (공여자 유래)를 해동하고, 24 웰 플레이트에 1e6 세포/mL/웰로 접종하고, 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + rhIL-2 (100 단위/ml; Peprotech)에서 항-CD3/CD28 다이나비드 (3:1 비드 대 세포)로 활성화시켰다. 1일차에, 0.5ml 배지를 제거하고 표시된 각 작제물에 대해 3e5 pg의 바이러스로 세포를 형질도입하였다 (작제물의 관련 서열은 표 17에 제공됨). 2일차에, 1.5mL의 최적화기 배지 + 100U/mL rhIL-2를 첨가하였다. 4일차 세포를 계수하고 1e6 세포/웰을 8mL의 최종 부피로 24 웰 Grex 플레이트로 옮겼다. 8일차에, 6mL의 배지를 웰에서 제거하고 세포를 계수한 다음 그라조프레비르 (2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01μM 및 약물 없음)가 포함된 신선한 배지에서 1e6 세포/mL의 농도로 접종하였다. 페이로드 유도 및 T-세포 사멸을 결정하기 위해 두 개의 병행 세포 플레이트를 접종하였다. 8일차에, 세포를 또한 유세포 분석으로 CAR 발현에 대해 평가하였다. 형질도입된 T 세포를 추가로 2일 동안 배양하고 IL-12 및 IL-15 정량화를 위해 원심분리를 통해 상청액을 수집하였다. IL-12 및 IL-15의 경우, 상청액을 Luminex (R&D IL12/IL15)로 분석하였다.
T 세포 사멸 분석의 경우, 0일차에 T 세포를 페이로드를 유도하기 위해 48시간 동안 1e6/mL +/- 2μM의 GRZ로 접종하였다. 2일차에, 표적 세포를 계수하고 표적 세포 배지에서 4-6시간 동안 96웰 플레이트에 웰당 35K를 접종하였다. 그런 다음 표적 세포 배지를 제거하고 T 세포를 계수하고 35K CAR 정규화된 T 세포를 밤새 200ul의 최적화기 배지에서 접종하였다 [E:T - 1:1]. 3일차에, 세포를 V-바닥 플레이트로 옮기고, 회전시키고, 상청액을 수확하여 LDH 분석 (CyQUANT LDH 세포독성 분석; Life Technologies)을 사용하여 사멸활성을 결정하였다.
표 17 - IL-12 및 IL-15 조절 가능 TF 발현 작제물
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
결과
IL-12 및/또는 IL-15 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략 및 작제물에 대해 T 세포에서 평가하였다. NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (SB01845)을 사용하는 약물 유도성 형식 ACP ("synTF"로도 지칭됨) 또는 링커가 단축되고 전체 작제물 코돈이 최적화된 ACP의 변형 버전 (SB02110)을 평가하였다. 모든 페이로드 작제물 (SB02661, SB02662, SB02664, SB02665)은 SFFV 프로모터에 의해 구동되는 GPC3-CAR을 암호화하였고 모든 사이토카인 페이로드는 CAR 카세트와 반대 방향으로 발현을 구동하는 A2 절연체 및 프로모터를 포함하였다 (예를 들어, 도 20의 작제물 "2235"의 리포터 및 CAR 카세트의 방향 참조). 유도성 synTF 프로모터는 YB-TATA 프로모터 (SB02661, SB02662) 또는 minTK (SB02664, SB02665)로부터 유래되었다. 평가된 시스템의 요약을 도 32에 나타낸다. SFFV에 의해 각각 구동되는 각각, 구성적 hIL-12 및 IL-15를 암호화하는 SB00171 및 SB01335를 대조군으로 사용하였다.
도 33에 나타내고 표 18에서 정량화된 바와 같이, IL-12 생산을 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르의 첨가 후 농도 의존적 방식으로 관찰하였다. 도 34에 나타내고 표 19에서 정량화된 바와 같이, IL-15 생산을 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르에 대해 농도 의존적 방식으로 리보솜 스키핑 태그 2A 다중시스트론성 시스템을 사용하여 IL-15를 암호화하는 작제물에 대해 관찰하였고, IL-15는 IL-12에 비해 더 낮은 수준으로 발현되었다. 생산은 IL-12 및 IL-15 모두에 대한 모든 조합에 대해 SB02110에 비해 ACP 작제물 SB01845를 사용할 때 현저하게 더 컸다 (각각, 실선 대 점선 도 33 및 표 18A 대 표 18B). 또한, YB-TATA 기반 유도성 프로모터는 minTK 프로모터보다 더 큰 발현을 입증하였고 (SB02661 대 SB02664 및 SB02662 대 SB02665) 2A/IL-15 펩티드의 일부로 발현될 때 더 적은 IL-12가 관찰되었다. 따라서, 조절된 사이토카인 발현은 SB02661과 함께 ACP 작제물 SB01845를 사용하는 다양한 시스템에 대해 T 세포에서 약물 의존적인 방식으로 관찰되었고 다중시스트론성 시스템에서 IL-12 단독 및 SB02662와 함께 IL-12 및 IL-15의 가장 높은 생산을 입증한다.
다양한 작제물에 대한 CAR 프로필을 또한 평가하였다. 대조군으로서 GPC3-CAR 단독 작제물 ("1106")을 사용하여, 다양한 작제물에 대해 유세포 분석 (YFP)으로 발현을 모니터링하였다. 도 35에 나타낸 바와 같이, 모든 사이토카인 페이로드 작제물은 ~50-70% 범위의 CAR을 발현하였다. 예상한 바와 같이, ACP 작제물 선택은 발현에 눈에 띄게 영향을 미치지 않았다 (1845 대 2110). 그런 다음 CAR 활성을 T 세포 사멸을 통해 평가하였다. 도 36에 나타내고 표 20에서 정량화된 바와 같이, 사멸 (LDH 방출)이 관찰되었고 사용된 ACP에 관계없이, CAR 단독 대조군을 포함하여, CAR을 발현하는 시험된 모든 작제물에 대해 유사하였다 (1845 대 2110). 사멸은 또한 그라조프레비르의 존재 또는 부재하에 평가되었다. 분석은 추가 면역계 구성 요소가 없는 상태에서 수행되었기 때문에 사이토카인 아머 영향을 직접 시험하도록 설계되지 않았지만, 그라조프레비르의 존재 또는 부재하에 사멸의 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 약물 유도성 ACP 형식을 사용하여 조사된 각각의 조절 가능 TF 발현 시스템에 대해 CAR 발현 및 사멸 활성이 입증되었다.
표 18A - T 세포에서 ACP 1845를 사용한 IL-12 생산
Figure pct00048
표 18B - T 세포에서 ACP 2110을 사용한 IL-12 생산
Figure pct00049
표 19 - T 세포에서 IL-15 생산
Figure pct00050
표 20 - T 세포 사멸 (LDH)
Figure pct00051
실시예 11: NK 세포에서 IL-12 약물 유도성 발현 시스템
IL-12 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략에 대해 NK 세포에서 평가하였다. CAR 작제물의 공동 발현 및 CAR 발현을 포함하는 전략을 평가하였다.
물질 및 방법
시험관 내 평가를 위해, 0일째부터, NK 세포 (건강한 공여자 PBMC로부터 단리된 iCD3- CD56 세포)를 mitoC WT K562 세포, 500 U/ml rhIL-2, 및 10 ng/ml rhIL-15로 10일 동안 확장하였다. 10일차에, 세포를 많은 양의 PBS에서 회전시킨 다음 10e6/mL 농도에서 혈청 또는 보충제 없이 NK MACS 배지 (Miltenyi)에 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 48-웰 레트로넥틴 코팅된 비 TC 처리 플레이트에서 30분 동안 1e6 세포 (100ul) 세포 + 1ul의 1:10 BX795 (Tocris Bioscience Cat #4318)로 접종한 다음 MOI = 25 (IU) (표시된 각 작제물에 대한 각 바이러스에 대한 MOI = 12.5; 작제물의 관련 서열은 표 17에 제공됨)의 바이러스에 이어서 200ul의 NK MACS 배지 (혈청/보충제 없음)를 첨가하였다. 그런 다음 세포 및 바이러스를 스핀 접종하였다 (32C에서 800g 2시간, 플레이트를 37C 배양기에서 2시간 동안 휴지 및 세포를 완전 NK MACS 배지 + 500U/mL의 rhIL-2의 24-웰 Grex 플레이트로 이동). 14일차에, 5ml 배지를 제거하고 신선한 배지 + rhIL-2 (500U/mL)로 보충된 배지를 부분적으로 교환하였다. 17일차에, 세포를 계수하고 필요한 수의 세포를 신선한 완전 배지 + 500U/mL rhIL2에서 회전시켰다. 세포를 증가하는 농도의 그라조프레비르 (1, 0.1, 0.01, 0.01μM GRZ 및 약물 없음)로 U-바닥 96 웰-플레이트에서 0.2e6 세포/200ul/웰로 접종하였다. 12, 19, 및 21일차 (각각, 24, 48, 96시간)에, 세포를 V-바닥 플레이트로 옮기고, 회전시키고, Luminex (IL-12 Milliplex 키트)를 사용하는 분석을 위해 상청액을 저장하였다. 세포를 또한 유세포 분석으로 CAR 발현에 대해 평가하였다.
결과
IL-12 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략 및 작제물에 대해 NK 세포에서 평가하였다. NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (SB01845)을 사용하는 약물 유도성 형식 ACP ("synTF"로도 지칭됨) 또는 링커가 단축되고 전체 구성 코돈이 최적화된 ACP의 변형된 버전 (SB02110)을 평가하였다. 페이로드 작제물 SB02661은 SFFV 프로모터에 의해 구동되는 GPC3-CAR을 암호화하고, A2 절연체 및 YB-TATA 프로모터를 포함하는 카세트에서 암호화되는 IL-12 사이토카인 페이로드는 CAR 카세트와 반대 방향으로 발현을 구동한다 (예를 들어, 도 20의 작제물 "2235"에서 리포터 및 CAR 카세트의 방향 참조).
도 37에 나타내고 표 21에서 정량화된 바와 같이, IL-12 생산은 처리 후 24시간에 시작하여 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르의 첨가 후 농도 의존적 방식으로 관찰되었다. IL-12 수준은 48시간에서 96시간 사이에 유사했으며, 이는 생산이 적어도 48시간 동안 최고조에 달했음을 시사한다. 생산은 또한 IL-12 및 IL-15 둘 모두에 대한 모든 조합에 대해 SB02110과 비교하여 ACP 작제물 SB01845를 사용할 때 현저하게 더 컸다 (각각, 정사각형 대 원형 도 37, 및 표 21). CAR 발현은 또한 낮은 전체 YFP 발현이 검출된 유세포 분석 (YFP)에 의해 모니터링되었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 조절된 사이토카인 발현은 ACP 작제물 SB01845과 함께 다양한 시스템에 대해 NK 세포에서 약물 의존적 방식으로 관찰되었고, 작제물 SB02661은 IL-12의 가장 높은 생산을 입증하였다.
표 21 - NK 세포에서 IL-12 생산 (24시간)
Figure pct00052
실시예 12: T 세포에서 추가 IL-12 및 IL-15 약물 유도성 시스템
IL-12 및/또는 IL-15 페이로드 발현을 상이한 전사 활성화제의 평가 및 별도로 또는 다중시스트론성 시스템에서 암호화된 사이토카인의 생산을 포함하여, 추가적인 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략에 대해 T 세포에서 평가하였다.
물질 및 방법
시험관 내 평가를 위해, 0일차에, CD4/CD8 T 세포 (공여자 유래)를 해동하고, 24 웰-플레이트에서1e6 세포/mL/웰로 접종하고, 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + rhIL-2 (100 단위/ml; Peprotech)에서 항-CD3/CD28 다이나비드 (3:1 비드 대 세포)로 활성화시켰다. 1일차에, 0.5ml 배지를 제거하고 세포를 표시된 각 작제물에 대해 3e5 pg의 바이러스로 형질도입하였다 (작제물의 관련 서열은 표 22에 제공됨). 2일차에, 1.5mL의 최적화기 배지 + 100U/mL rhIL-2를 첨가하였다. 4일차 세포를 계수하고 1e6 세포/웰을 8mL의 최종 부피로 24 웰 Grex 플레이트로 옮겼다. 8일차에, 6mL의 배지를 웰에서 제거하고 세포를 계수한 다음 그라조프레비르 (2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01μM 및 약물 없음)가 포함된 신선한 배지에서 1e6 세포/mL로 접종하였다. 형질도입된 T 세포를 추가로 2일 동안 배양하고 IL-12 및 IL-15 정량화를 위해 원심분리를 통해 상청액을 수집하였다. IL-12 및 IL-15의 경우, 상청액을 Luminex (R&D IL12/IL15 키트)로 분석하였다.
표 22 - 추가 IL-12 및 IL-15 조절 가능 TF 발현 작제물
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
결과
IL-12 및/또는 IL-15 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략 및 작제물에 대해 T 세포에서 평가하였다. NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (작제물 SB02667 및 SB02668) 또는 p65 전사 효과기 도메인 (작제물 SB02670 및 SB02671)을 사용하는 약물 유도성 형식 ACP ("synTF"로도 지칭됨)를 평가하였다. 사이토카인 페이로드를 암호화하는 모든 작제물은 ACP 카세트와 반대 방향으로 발현을 구동하는 A2 절연체 및 YB-TATA 프로모터를 포함하였다 (예를 들어, 도 20의 작제물 "1560"에서 리포터 및 ACP/synTF 카세트의 방향 참조). 평가된 시스템의 요약은 도 38에 나타낸다.
도 39에 나타내고 표 23에서 정량화된 바와 같이, IL-12 생산은 p65 전사 효과기 도메인을 사용할 때 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르의 첨가 후 농도 의존적 방식으로 관찰되었고, 리보솜 스키핑 태그 2A 다중시스트론성 시스템 (SB02668)에서와 비교하여 단독으로 발현될 때 (SB02667) 더 큰 생산 (~8배)이 관찰되었다, 도 39의 각각, 원형 대 정사각형, 및 표 23. 도 40 및 도 41에 나타내고 표 24에서 정량화된 바와 같이, IL-15 생산은 또한 IL-15을 암호화하는 작제물에 대해 리보솜 스키핑 태그 2A 다중시스트론성 시스템 (SB02668; 도 40 다이아몬드) 및 단일 페이로드로 발현될 때 (SB02675; 도 41 원) 모두에서 p65 전사 효과기 도메인을 사용할 때 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르에 대해 농도 의존적인 방식으로 관찰되었다. IL-15는 단일 페이로드로 암호화될 때 더 높은 수준으로 표현되지만, 2A 다중시스트론성 시스템에서는 현저히 낮은 수준이다. 특히, 단일 페이로드로서 암호화된 IL-15 이외의 VPR 전사 효과기 도메인을 사용하는 작제물에 대해 관찰 가능한 사이토카인 발현이 없었다 (SB02676; 도 41 삼각형). 따라서, 조절된 사이토카인 발현은 다양한 시스템에 대한 T 세포에서 약물 의존적인 방식으로 관찰되었다.
표 23 - 추가 작제물에 대한 T 세포에서의 IL-12 (pg/mL) 생산
Figure pct00067
표 24 - 추가 작제물에 대한 T 세포에서의 IL-15 (pg/mL) 생산
Figure pct00068
실시예 13: 다양한 그라조프레비르 투약 요법의 생체 내 평가
다양한 Grz 투약 및 T 주사 요법을 포함하는, 조절 가능 TF 발현 시스템을 시험관 내 및 생체 내 모두에서 평가하였다.
물질 및 방법
생체 내 평가를 위해, T 세포를 SB01845 & SB02357 ("유도성 IL-12")로 형질도입하였고, 각각 HEK 세포의 바이러스 역가를 기반으로 하여 5의 추정된 MOI이다. 대조군 T 세포 ("구조적 IL-12")를 5 MOI의 SB00171로 형질도입하였고, SFFV에 의해 구동되는 구조적 hIL-12를 암호화한다. 음성 대조군은 형질도입되지 않은 T 세포였다. T 세포에 통합된 렌티바이러스 게놈의 수를 PCR로 대량으로 분석하였다 (카피 # 분석). NSG 마우스를 -2일에 무작위화하고 비히클 또는 그라조프레비르 (Grz) 투여를 1일 오후에 시작하였다 (비히클: 2.5% DMSO, 30% PEG400, 67.5% PBS). 그라조프레비르 칼륨염을 DMSO, PEG400, 및 PBS에 순차적으로 용해시켜 10mg/mL가 되도록 하였다. 모든 Grz 투여는 IP로 투여되었다. 마우스당 20e6 T 세포를 표시된 바와 같이 꼬리 정맥 주사에 의해 주입하였다. 구체적인 Grz 투약 및 T 세포 주사 요법은 아래 표에 표시되어 있다. Luminex 분석을 마우스 혈장에서 hIL-12 수준을 평가하기 위해 실행하였다. 마우스 혈액에서 인간 T 세포의 존재를 유세포 분석으로 분석하였다.
결과
제1 시리즈의 그라조프레비르 (Grz) 투약 요법을 표 25에 기술된 대로 평가하였다.
표 25 - 그라조프레비르 (Grz) 투약 요법
Figure pct00069
주입된 T 세포의 지속성을 평가하였다. 도 42에 나타내고, 표 26A (4일), 표 26B (8일), 및 표 26C (12일)에 정량화된 바와 같이, 주입된 인간 T 세포의 집단을 12일차까지 혈액에서 관찰하였다 (참고 12 일째의 50mg/kg 및 75mg/kg 세포 그룹은 샘플 손실로 인해 분석에 포함되지 않았음). IL-12 수준을 혈장에서 평가하였다. 도 43에 나타낸 바와 같이, IL-12의 유의한 그라조프레비르 용량 의존 유도는 비히클보다 ~100배 내지 ~700배 범위인 4일차 (Grz 투여 후 2일)에 관찰되었다. 도 44에 나타낸 바와 같이, 혈청 IL-12 수준은 8일째에 기준선으로 복귀하고 (왼쪽 패널) 12일째에 안정하게 유지되었다 (오른쪽 패널). 특히, 75mg/kg의 GRZ를 투여받은 마우스는 2-3일째에 75mg/kg의 일일 투여량 후 중등도에서 중증의 체중 감소와 함께 독성을 경험하였다 (마우스는 각 투여 후 24시간 동안 완만하게 회복됨). 또한, 75mg/kg 그룹의 8마리 중 2마리는 마지막 날 (12일)에 사망한 채로 발견되었고 다른 그룹에서는 사망이 관찰되지 않았으며, 부검 결과 융합된 기관을 갖는 1마리의 마우스를 포함하여 간 및 난소관에 이상이 나타났다. 75mg/kg 그룹의 모든 마우스는 12일째에 비장이 확대되었고 많은 경우 난관에 염증이 생겼다. 따라서, 평가된 그라조프레비르 (Grz) 투약 요법은 약물 의존성 IL-12 생산을 입증하였고, 특정 투여 계획에서 독성이 관찰되었다.
표 26A - 혈액 내 인간 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨); 4일
Figure pct00070
표 26B - 혈액 내 인간 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨); 8일
Figure pct00071
표 26C - 혈액 내 인간 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨); 12일
Figure pct00072
"온/오프/온" 그라조프레비르 (Grz) 투약 요법을 다음으로 평가하였고, 달력은 도 45의 특정 투여 요법을 예시한다. 위의 실험 결과에 따라, 동물에게 1일 1회 60mg/kg을 3일 동안 투여 (IP)하였다. 재조합체 (hIL-2 1x10^4 IU)도 표시된 대로 투여하였다.
주입된 T 세포의 지속성을 평가하였다. 도 46에 나타내고, 표 27A (약물 없음) 및 표 27B (약물 있음)에 정량화된 바와 같이, 주입된 인간 T 세포의 집단은 Grz가 투여된 4일째에 유의하게 적었고, 11, 18, 및 25일에 유도성 시스템 그룹에서 차이가 관찰되지 않았다. 이전에 관찰된 바와 같이, 구조적 IL-12 그룹은 혈액에서 증가된 인간 T 세포 수를 입증하였지만, 특히 이 그룹의 마우스는 독성을 나타내었고 29일까지 희생이 필요하였다.
IL-12 사이토카인 수준을 다양한 그룹의 혈장에서 평가하였다. 도 47에 나타낸 바와 같이, 유도성 시스템에서 4일째에 IL-12의 유의한 그라조프레비르 용량 의존 유도가 관찰되었고, 그룹 간 수준은 "오프" 주 (11일) 동안 동등하였고, 두 번째 "온" 주 (18일) 동안 IL-12의 추가로 유의한 그라조프레비르 용량 의존 유도가 관찰되었다. 투여 첫 주 동안, Grz 처리 그룹의 10마리 중 3마리는 ~15%의 체중을 잃었고 3일째에 30mg/kg만 투여받았다. 비약물에서의 IL-12 혈청 수준은 또한 시간이 지남에 따라 증가된 혈청 IL-12 수준을 입증하였고, 유도성 카세트의 누출 발현을 시사한다. 독성은 또한 다른 그룹에서 모니터링되었다. 도 48에 나타낸 바와 같이, 체중은 약물을 투여하지 않은 유도성 IL-12 그룹에 대해 일반적으로 안정적으로 유지되었고, 단일 비장 비대가 있었고 종료 시점에 이 그룹에서 다른 이상이 관찰되지 않았다. 구조적 IL-12 그룹의 체중은 또한 일반적으로 22일까지 일반적으로 안정적 (또는 약간 증가)했으며 이후 체중 감소와 29일에 그룹의 최종 안락사가 있었고, 24일째 마우스 중 2마리가 사망하여 발견되었고, 26일째 체중 감소로 인해 3마리 마우스가 안락사되었고, 정상 NSG 마우스 비장과 비교하여 모든 마우스의 비장이 상당히 확대되었다 (데이터는 표시되지 않음). 대조적으로, 그라조프레비르를 투여한 유도성 IL-12의 체중은 대부분의 그룹에서 일시적인 체중 감소 후 전반적인 체중 안정화를 입증하였다. 그라조프레비르는 또한 종료 시점에서 창백한 신장, 두꺼운 횡격막, 비대해진 비장, 두꺼운 간엽, 간 내부에서 자라는 흰색/노란색 덩어리, 복막 벽 및 서로에 달라붙는 장기 (간, 위, 비장) 등의 독성 징후를 보였다. 결과는 조사된 시스템에서 그라조프레비르 요법이 구조적 IL-12 발현의 장기간 치사율과 대조적으로 급성 독성과 함께 약물 의존적 IL-12 생산을 입증함을 나타낸다.
표 27A - 혈액 내 인간 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨); 약물 없음
Figure pct00073
표 27B - 혈액 내 인간 T 세포 (hCD3+:hCD45+는 살아있는 세포의 %로 표시됨); w/ Grz
Figure pct00074
실시예 14: 활성화 유도성 시스템
CAR 세포가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 프로모터를 평가하였다.
물질 및 방법
후보 선택: 동족 표적 세포의 유무에 관계없이 배양된 CAR-T 세포에 대한 단일 세포 RNA-seq 데이터를 사용하여 (Xhangolli et al. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 Apr;17(2):129-139. doi: 10.1016/j.gpb.2019.03.002; 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함됨), 휴지 CAR-T 세포에 비해 활성화된 CAR-T 세포에서 상향 조절된 상위 유전자를 확인하고 이러한 확인된 유전자에 대해 -100bp에 대해 2kb 업스트림 영역을 후보 프로모터로 선택하였다.
선별: 범 T 세포를 GPC3-CAR 단독 작제물 ("1106") 및 암호화하는 바이러스 벡터로 기술된 대로 바이러스 형질도입하였다. 후보 프로모터는 (1) YBTATA (서열 번호 155; "YBTATA" 작제물과 쌍을 이루거나; 또는 (2) mKate 리포터의 전사 개시 업스트림을 지시하기 위해 각 유전자의 번역 시작 부위로 트리밍된 ("트리밍된") 작제물이다. 후보 작제물을 24시간 또는 48시간의 단독 배양 후 또는 HepG2 표적 세포와의 공동 배양을 통해 활성화된 후 mKate 발현 (YFP CAR+ 세포에 의해 게이팅됨)에 대한 유속 분류에 의해 선별하였다. 또한, NFAT 전사 인자 결합 부위를 기반으로 한 후보를 평가하였다. 선별 작업흐름은 도 49에 나타낸다. 평가된 작제물을 도 50에 나타낸다.
결과
후보는 CAR-T가 표적 세포와 공동 배양될 때 전사 향상에 대해 선별되었고, 24시간 동안 표적 세포와 배양한 경우의 유세포 분석 결과는 도 51에 나타내고 48시간은 도 52에 나타낸다. 5x NFAT BS min AdePro 작제물 ("2096"; 서열 번호 154)은 24시간 및 48시간 모두에서 표적 세포와 배양될 때 증가된 리포터 발현을 입증하였지만, 특히 작제물은 표적 세포의 부재하에 높은 기저 수준의 리포터 발현이 있었다. 24시간 및 48시간 시점은 트리밍된 CCL3 ("2935")을 표적 세포와 배양할 때 증가된 리포터 발현을 입증하는 것으로 확인하였고, 특히 리포터 발현은 일반적으로 표적 세포의 부재하에 배경과 동등하였다. 24시간 시점은 또한 트리밍된 CCL4 ("2936")를 표적 세포와 배양할 때 증가된 리포터 발현을 입증하는 것으로 확인하였고, 특히 리포터 발현은 일반적으로 표적 세포의 부재하에 배경과 동등하였다. 48시간 시점은 또한 트리밍된 MT2a ("2942")를 표적 세포와 함께 배양할 때 증가된 리포터 발현을 입증하는 것으로 확인하였고, 표적 세포가 없을 때 배경보다 ~3배 높은 리포터 발현을 나타낸다. 리포터 발현을 입증하는 확인된 프로모터 및 이의 대조군 (HepG2 표적 없이 배양된 CAR 단독, HepG2 표적과 함께 배양된 CAR 단독, CAR + HepG2 표적 없이 배양된 프로모터)의 히스토그램을 도 53 및 MFI로 평가한 배수 변화를 표 28에 나타냈다. 확인된 프로모터에 대한 서열이 표 29에 제공된다. 데이터는 CAR 세포가 표적 세포에 의해 활성화될 때 전사를 켜는 프로모터가 확인되었음을 입증하였다.
표 28 - mKate gMFI 표적 세포/무처리의 배수 변화
Figure pct00075
표 29 - 활성화 유도성 프로모터 서열
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
실시예 15: 그라조프레비르/엘바스비르를 갖는 T 세포에서 IL-12 약물 유도성 시스템
IL-12 페이로드 발현을 그라조프레비르 또는 그라조프레비르/엘바스비르 조합을 사용하는 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략에 대해 T 세포에서 평가하였다.
물질 및 방법
시험관 내 평가를 위해, 0일차에, CD4/CD8 T 세포 (공여자 유래)를 해동하고, 24 웰-플레이트에서 1e6 세포/mL/웰로 접종하고, 완전 T 세포 배지 (최적화기+ 보충제-깁코 +5% 인간 혈청) + rhIL-2 (100 단위/ml; Peprotech)에서 항-CD3/CD28 다이나비드 (3:1 비드 대 세포)로 활성화시켰다. 1일차에, 0.5ml 배지를 제거하고 표시된 각 작제물에 대해 세포를 3e5 pg의 바이러스로 형질도입하였다 (작제물의 관련 서열은 표 17에 제공됨). 2일차에, 1.5mL의 최적화기 배지 + 100U/mL rhIL-2를 첨가하였다. 7일차에 세포를 Zepatier®의 화합물 비율에 따라 각각 2:1의 비율로 엘바스비르를 포함하거나 포함하지 않는 그라조프레비르 (2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, .005μM 및 약물 없음)로 처리하였다. 형질도입된 T 세포를 추가로 2일 동안 배양하고 IL-12 정량화를 위해 원심분리를 통해 상청액을 수집하고 Luminex (R&D IL12)로 분석하였다.
결과
IL-12 페이로드 발현을 다양한 조절 가능 TF 발현 시스템 전략 및 작제물에 대해 T 세포에서 평가하였다. NS3/NS4 프로테아제 절단 부위 및 VPR 전사 효과기 도메인 (SB01845)을 사용하는 약물 유도성 형식 ACP ("synTF"로도 지칭됨) 또는 링커가 단축되고 전체 작제물 코돈이 최적화된 ACP의 변형된 버전 (SB02110)을 평가하였다. 페이로드 작제물 SB02661은 SFFV 프로모터에 의해 구동되는 GPC3-CAR을 암호화하였고, A2 절연체 및 YB-TATA 프로모터를 포함하는 카세트에 암호화된 IL-12 사이토카인 페이로드는 CAR 카세트와 반대 방향으로 발현을 구동한다 (예를 들어, 도 20의 작제물 "2235"에서 리포터 및 CAR 카세트의 방향 참조). 대조군 T 세포를 구조적 IL-12 작제물 SB00171로 형질도입시켰다. 도 54에 나타내고 표 30에서 정량화된 바와 같이, IL-12 생산은 NS3 프로테아제 억제제 그라조프레비르의 첨가 후 농도 의존적 방식으로 관찰되었고, 이는 위에서 본 것과 일치한다. IL-12 생산의 동역학은 일반적으로 엘바스비르 첨가에 관계없이 동일하였다. 따라서, 엘바스비르는 약물 유도성 형식 ACP TF 발현 시스템에서 IL-12의 유도에 그라조프레비르 효능에 영향을 미치지 않았다.
표 30 - 엘바스비르가 있거나 없는 그라조프레비르 (Grz)를 사용한 IL-12 생산
Figure pct00079
본 개시내용은 바람직한 구현예 및 다양한 대안적인 구현예를 참조하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용 및 첨부된 청구범위의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서의 본문 내에서 인용된 모든 참고문헌, 발행된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SENTI BIOSCIENCES, INC. <120> METHOD AND COMPOSITIONS FOR REGULATED ARMORING OF CELLS <130> STB-018WO <140> PCT/US2020/064688 <141> 2020-12-11 <150> 63/116,103 <151> 2020-11-19 <150> 62/947,427 <151> 2019-12-12 <160> 177 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 agagggtata taatggaagc tcgacttcca g 31 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc 52 <210> 3 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 caccagacag tgacgtcagc tgccagatcc catggccgtc atactgtgac gtctttcaga 60 caccccattg acgtcaatgg gagaa 85 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179 <210> 21 <211> 1718 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360 accatggtcg 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cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260 ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320 cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380 tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440 gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500 cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560 gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620 gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680 tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattc 1718 <210> 22 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212 <210> 23 <211> 2379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ccactagttc catgtcctta tatggactca tctttgccta ttgcgacaca cactcaatga 60 acacctacta cgcgctgcaa agagccccgc aggcctgagg tgcccccacc tcaccactct 120 tcctattttt gtgtaaaaat ccagcttctt gtcaccacct ccaaggaggg ggaggaggag 180 gaaggcaggt tcctctaggc tgagccgaat gcccctctgt ggtcccacgc cactgatcgc 240 tgcatgccca ccacctgggt acacacagtc tgtgattccc ggagcagaac ggaccctgcc 300 cacccggtct tgtgtgctac tcagtggaca gacccaaggc aagaaagggt gacaaggaca 360 gggtcttccc aggctggctt tgagttccta gcaccgcccc gcccccaatc ctctgtggca 420 catggagtct tggtccccag agtcccccag cggcctccag atggtctggg agggcagttc 480 agctgtggct gcgcatagca gacatacaac ggacggtggg cccagaccca ggctgtgtag 540 acccagcccc cccgccccgc agtgcctagg tcacccacta acgccccagg cctggtcttg 600 gctgggcgtg actgttaccc tcaaaagcag gcagctccag ggtaaaaggt gccctgccct 660 gtagagccca ccttccttcc cagggctgcg gctgggtagg tttgtagcct tcatcacggg 720 ccacctccag ccactggacc gctggcccct gccctgtcct 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gttgatttcc ttcatccctg gcacacgtcc aggcagtgtc gaatccatct ctgctacagg 60 ggaaaacaaa taacatttga gtccagtgga gaccgggagc agaagtaaag ggaagtgata 120 acccccagag cccggaagcc tctggaggct gagacctcgc cccccttgcg tgatagggcc 180 tacggagcca catgaccaag gcactgtcgc ctccgcacgt gtgagagtgc agggccccaa 240 gatggctgcc aggcctcgag gcctgactct tctatgtcac ttccgtaccg gcgagaaagg 300 cgggccctcc agccaatgag gctgcggggc gggccttcac cttgataggc actcgagtta 360 tccaatggtg cctgcgggcc ggagcgacta ggaactaacg tcatgccgag ttgctgagcg 420 ccggcaggcg gggccggggc ggccaaacca atgcgatggc cggggcggag tcgggcgctc 480 tataagttgt cgataggcgg gcactccgcc ctagtttcta aggaccatg 529 <210> 25 <211> 794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 agttccccaa ctttcccgcc tctcagcctt tgaaagaaag aaaggggagg gggcaggccg 60 cgtgcagtcg cgagcggtgc tgggctccgg ctccaattcc ccatctcagt cgctcccaaa 120 gtccttctgt ttcatccaag cgtgtaaggg tccccgtcct tgactcccta gtgtcctgct 180 gcccacagtc cagtcctggg aaccagcacc gatcacctcc catcgggcca atctcagtcc 240 cttcccccct acgtcggggc ccacacgctc ggtgcgtgcc cagttgaacc aggcggctgc 300 ggaaaaaaaa aagcggggag aaagtagggc ccggctacta gcggttttac gggcgcacgt 360 agctcaggcc tcaagacctt gggctgggac tggctgagcc tggcgggagg cggggtccga 420 gtcaccgcct gccgccgcgc ccccggtttc tataaattga gcccgcagcc tcccgcttcg 480 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc aggtgaagac 540 gggcggagag aaacccggga ggctagggac ggcctgaagg cggcaggggc gggcgcaggc 600 cggatgtgtt cgcgccgctg cggggtgggc ccgggcggcc tccgcattgc aggggcgggc 660 ggaggacgtg atgcggcgcg ggctgggcat ggaggcctgg tgggggaggg gaggggaggc 720 gtgggtgtcg gccggggcca ctaggcgctc actgttctct ccctccgcgc agccgagcca 780 catcgctgag acac 794 <210> 26 <211> 532 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 agtgcggtta ccagcggaaa tgcctcgggg tcagaagtcg caggagagat agacagctgc 60 tgaaccaatg ggaccagcgg atggggcgga tgttatctac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 ttccagagct ttcgaggaag gtttcttcaa ctcaaattca tccgcctgat aattttctta 60 tattttccta aagaaggaag agaagcgcat agaggagaag ggaaataatt ttttaggagc 120 ctttcttacg gctatgagga atttggggct cagttgaaaa gcctaaactg cctctcggga 180 ggttgggcgc ggcgaactac tttcagcggc gcacggagac ggcgtctacg tgaggggtga 240 taagtgacgc aacactcgtt gcataaattt gcgctccgcc agcccggagc atttaggggc 300 ggttggcttt gttgggtgag cttgtttgtg tccctgtggg tggacgtggt tggtgattgg 360 caggatcctg gtatccgcta acaggtactg gcccacagcc gtaaagacct gcgggggcgt 420 gagagggggg aatgggtgag gtcaagctgg aggcttcttg gggttgggtg ggccgctgag 480 gggaggggag ggcgaggtga cgcgacaccc ggcctttctg ggagagtggg ccttgttgac 540 ctaagggggg cgagggcagt tggcacgcgc acgcgccgac agaaactaac agacattaac 600 caacagcgat tccgtcgcgt ttacttggga ggaaggcgga aaagaggtag tttgtgtggc 660 ttctggaaac cctaaatttg gaatcccagt atgagaatgg tgtcccttct tgtgtttcaa 720 tgggattttt acttcgcgag tcttgtgggt ttggttttgt tttcagtttg cctaacaccg 780 tgcttaggtt tgaggcagat tggagttcgg tcgggggagt ttgaatatcc ggaacagtta 840 gtggggaaag ctgtggacgc ttggtaagag agcgctctgg attttccgct gttgacgttg 900 aaaccttgaa tgacgaattt cgtattaagt gacttagcct tgtaaaattg aggggaggct 960 tgcggaatat taacgtattt aaggcatttt gaaggaatag ttgctaattt tgaagaatat 1020 taggtgtaaa agcaagaaat acaatgatcc tgaggtgaca cgcttatgtt ttacttttaa 1080 actaggtcac c 1091 <210> 31 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atgtgtcacc agcagctcgt tatatcctgg tttagtttgg tgtttctcgc ttcacccctg 60 gtggca 66 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgcc 66 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 atgcaactgc tgtcatgtat cgcactcatc ctggcgctgg ta 42 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atgtatcgga tgcaactttt gagctgcatc gcattgtctc tggcgctggt gacaaattcc 60 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42 atgaaatggg taacattcat atcacttctc tttctgttca gctctgcgta ttct 54 <210> 43 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atgacaaggc ttactgtttt ggctctcctc gctggactct tggcttcctc ccgagca 57 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 atgagggctt ggattttttt tctgctctgc cttgccggtc gagccctggc g 51 <210> 45 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 atgcctcttc tgcttttgct tcctcttttg tgggcaggtg ccctcgca 48 <210> 46 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 atgaactctt tctcaacctc tgcgtttggt ccggtcgctt tctcccttgg gctcctgctt 60 gtcttgccag cagcgtttcc tgcgcca 87 <210> 47 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 atgacaagta aactggcggt agccttgctc gcggcctttt tgatttccgc agccctttgt 60 <210> 48 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 atgaaggtaa gtgcagcgtt gctttgcctt ctcctcattg cagcgacctt tattcctcaa 60 gggctggcc 69 <210> 49 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 atgggagcgg cagctagaac acttcgactt gcccttgggc tcttgctcct tgcaaccctc 60 cttagacctg ccgacgca 78 <210> 50 <211> 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ccgtgggcct gtttagagcc gccgtgtgta caagaggcgt ggccaaagcc 1320 gtggacttca tccccgtgga aaacctggaa accaccatgc ggagccccgt gttcaccgac 1380 aattctagcc ctccagccgt gacactgaca caccccatca ccaagatcga cagagaggtg 1440 ctgtaccaag agttcgacga gatggaagag tgcagccagc actaccccta cgacgtgcca 1500 gattatgctg gcggcggagg atctggcgga acagaagcct ctggaagcgg cagagctgac 1560 gccctggatg acttcgacct ggatatgctg ggcagcgacg ctctggacga ttttgacctc 1620 gacatgctgg gatctgatgc actcgacgat ttcgatttgg acatgctcgg cagtgatgcc 1680 ttggacgact ttgatcttga tatgctcatc aacagccggt ccagcggcag ccccaagaaa 1740 aaaagaaaag tgggctccca gtacctgcct gacaccgacg acagacaccg gatcgaggaa 1800 aagcggaagc ggacctacga gacattcaag agcatcatga agaagtcccc attcagcggc 1860 cccaccgatc ctagacctcc acctagaaga atcgccgtgc ctagcagatc tagcgcctcc 1920 gtgcctaaac ctgctcctca gccttatcct ttcaccagca gcctgagcac catcaactac 1980 gacgagttcc ctaccatggt gttccccagc ggccagatct ctcaggcttc tgctcttgct 2040 ccagctcctc ctcaggttct gcctcaagct cctgcaccag caccggctcc agctatggtt 2100 tctgctttgg ctcaggcccc tgctcctgtg cctgttcttg ctcctggacc acctcaggct 2160 gttgctcctc ctgctccaaa acctacacag gccggcgaag gcacactgtc tgaagctctg 2220 ctgcagctcc agttcgatga cgaagatctg ggcgccctgc tgggcaattc tacagatcct 2280 gccgtgttta ccgatctggc cagcgtggac aacagcgagt ttcagcagct cctgaatcag 2340 ggcatccctg tggctcctca caccaccgaa cctatgctga tggaataccc cgaggccatc 2400 accagactgg tcaccggtgc tcaaagacca cctgatccag ctccagcacc actgggagca 2460 cctggactgc ctaatggact gctgtctggc gacgaggact tcagctctat cgccgacatg 2520 gatttctctg ccctgctcgg ctctggcagc ggctctagag atagcagaga aggcatgttc 2580 ctgcctaagc ctgaggccgg ctctgccatc tccgatgtgt tcgagggaag agaagtgtgc 2640 cagcctaagc ggatccggcc ttttcaccct cctggaagcc cttgggccaa cagacctctg 2700 cctgcttctc tggcccctac accaacagga cctgtgcacg aacctgtggg cagtctgacc 2760 ccagctcctg ttcctcaacc tctggatccc gctcctgctg tgacacctga agcctctcat 2820 ctgctggaag atcccgacga agagacaagc caggccgtga aggccctgag agaaatggcc 2880 gacacagtga tccctcagaa agaggaagcc gccatctgcg gacagatgga cctgtctcat 2940 cctccaccaa gaggccacct ggacgagctg acaaccacac tggaatccat gaccgaggac 3000 ctgaacctgg acagccctct gacacccgag ctgaacgaga tcctggacac cttcctgaac 3060 gacgagtgtc tgctgcacgc catgcacatc tctaccggcc tgagcatctt cgacaccagc 3120 ctgttttga 3129 <210> 92 <211> 243 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: ACP-binding domain sequence <400> 92 cgggtttcgt aacaatcgca tgaggattcg caacgccttc ggcgtagccg atgtcgcgct 60 cccgtctcag taaaggtcgg cgtagccgat gtcgcgcaat cggactgcct tcgtacggcg 120 tagccgatgt cgcgcgtatc agtcgcctcg gaacggcgta gccgatgtcg cgcattcgta 180 agaggctcac tctcccttac acggagtgga taactagttc tagagggtat ataatggggg 240 cca 243 <210> 93 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu 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gacctgactt tctccgtgaa gtcgtcacgg 480 ggatcaagcg atcctcaggg cgtgacctgt ggagccgcca ctctgtccgc cgagagagtc 540 aggggagaca acaaggaata tgagtactcc gtggaatgcc aggaggacag cgcctgccct 600 gccgcggaag agtccctgcc tatcgaggtc atggtcgatg ccgtgcataa gctgaaatac 660 gagaactaca cttcctcctt ctttatccgc gacatcatca agcctgaccc ccccaagaac 720 ttgcagctga agccactcaa gaactcccgc caagtggaag tgtcttggga atatccagac 780 acttggagca ccccgcactc atacttctcg ctcactttct gtgtgcaagt gcagggaaag 840 tccaaacggg agaagaaaga ccgggtgttc accgacaaaa cctccgccac tgtgatttgt 900 cggaagaacg cgtcaatcag cgtccgggcg caggatagat actactcgtc ctcctggagc 960 gaatgggcca gcgtgccttg ttccggtggc ggatcaggcg gaggttcagg aggaggctcc 1020 ggaggaggtt cccggaacct ccctgtggca acccccgacc ctggaatgtt cccgtgccta 1080 caccactccc aaaacctcct gagggctgtg tcgaacatgt tgcagaaggc ccgccagacc 1140 cttgagttct acccctgcac ctcggaagaa attgatcacg aggacatcac caaggacaag 1200 acctcgaccg tggaagcctg cctgccgctg gaactgacca agaacgaatc gtgtctgaac 1260 tcccgcgaga caagctttat cactaacggc agctgcctgg cgtcgagaaa gacctcattc 1320 atgatggcgc tctgtctttc ctcgatctac gaagatctga agatgtatca ggtcgagttc 1380 aagaccatga acgccaagct gctcatggac ccgaagcggc agatcttcct ggaccagaat 1440 atgctcgccg tgattgatga actgatgcag gccctgaatt tcaactccga gactgtgcct 1500 caaaagtcca gcctggaaga accggacttc tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg 1560 ttgcacgctt tccgcattcg agccgtgacc attgaccgcg tgatgtccta cctgaacgcc 1620 agttaa 1626 <210> 95 <211> 1626 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 atgtgccatc agcagcttgt catatcttgg ttttcacttg tattcctggc cagccctttg 60 gttgcgatct gggagctcaa gaaggatgtg tacgttgtag agctggactg gtaccccgat 120 gctcccggtg agatggtcgt tttgacatgt gacactccag aagaggacgg tattacgtgg 180 actctggacc agtcctccga agttcttggt tctggtaaga ctctgactat ccaggtgaaa 240 gaatttgggg atgcgggaca atacacatgc cacaagggag gcgaggtgtt gtctcatagt 300 ttgctgcttc tccacaagaa agaggatgga atctggagca ccgacatact caaggatcaa 360 aaggaaccca aaaataagac atttctgcga tgtgaggcta agaactatag tggccgcttc 420 acttgttggt ggctgactac catcagcaca gatctcacgt tttcagtaaa aagtagtaga 480 ggttcaagtg atcctcaagg ggtaacgtgc ggtgctgcaa cactgtctgc tgaacgcgta 540 agaggagata ataaggagta cgagtattcc gtagaatgcc aagaggacag tgcttgtcct 600 gcggccgagg agtctctccc aatagaagtg atggtggacg cggtgcataa actgaaatat 660 gagaactaca caagcagttt ttttataaga gatatcatca agcccgatcc gccgaagaat 720 ttgcaactta aaccgcttaa aaactcacgc caggttgaag tatcctggga gtatccggat 780 acatggtcaa caccacacag ctatttttcc cttaccttct gtgtgcaggt ccaagggaag 840 agcaaaaggg agaagaagga cagggtattc actgataaaa cttccgcgac ggtcatctgc 900 cgaaaaaacg ctagtatatc tgtacgggcg caggataggt actatagttc ttcttggtct 960 gagtgggcct cagttccgtg ctctggggga ggaagtggag gagggtccgg cggtggaagc 1020 gggggaggga gtcgcaactt gccagtggct acaccagatc caggcatgtt tccatgtctg 1080 catcattccc agaatctcct gagagcggtg tcaaatatgc tccaaaaagc gagacaaaca 1140 ctggaatttt acccgtgtac cagtgaggag attgatcacg aggacataac caaggacaag 1200 acctcaactg tagaagcgtg tttgccgctg gagttgacta agaatgagtc ctgcctcaat 1260 tccagagaaa cttcattcat tactaacggc agttgtcttg catcccggaa aacgtccttt 1320 atgatggccc tttgccttag ttcaatttac gaggatctta aaatgtatca agtggagttt 1380 aaaaccatga atgctaaact tcttatggac cccaaacgac aaatttttct ggatcagaat 1440 atgcttgccg tgatagacga actcatgcag gcgcttaatt ttaactccga aacagttcca 1500 caaaaatcta gccttgaaga acctgatttt tataaaacga agattaaact gtgtatcctg 1560 ctgcatgcct ttcgcatccg agctgtcaca atcgataggg ttatgtccta ccttaacgcg 1620 agctag 1626 <210> 96 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Arg Thr Leu Val Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu 1 5 10 15 Glu Trp Lys Leu Leu Asp Thr Ala Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val 20 25 30 Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr 35 40 45 Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu 50 55 60 Val 65 <210> 97 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Synthetic polypeptide <400> 100 Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu 1 5 10 15 Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro 20 25 30 Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 40 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Pro Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 105 <211> 86 <212> PRT 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gaaccgaagt cttgtgataa aactcatacg tgcccg 36 <210> 115 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 115 gctgctgctt tcgtacccgt gttcctccct gctaagccta cgactacccc cgcaccgaga 60 ccacccacgc cagcacccac gattgctagc cagcccctta gtttgcgacc agaagcttgt 120 cggcctgctg ctggtggcgc ggtacatacc cgcggccttg attttgcttg cgatatatat 180 atctgggcgc ctctggccgg aacatgcggg gtcctcctcc tttctctggt tattactctc 240 tactgtaatc acaggaat 258 <210> 116 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 116 gcctgcccga ccgggctcta cactcatagc ggggaatgtt gtaaggcatg taacttgggt 60 gagggcgtcg cacagccctg cggagctaac caaacagtgt gcgaaccctg cctcgatagt 120 gtgacgttct ctgatgttgt atcagctaca gagccttgca aaccatgtac tgagtgcgtt 180 ggacttcagt caatgagcgc tccatgtgtg gaggcagatg atgcggtctg tcgatgtgct 240 tacggatact 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acagctaccc agaccttcct ggccacctgt 900 atcaatggcg tgtgctgggc cgtgtatcac ggcgctggca caagaacaat cgcctctcca 960 aagggccccg tgatccagat gtacaccaac gtggaccagg acctcgttgg ctggcctgct 1020 cctcaaggca gcagaagcct gacaccttgc acctgtggct ccagcgatct gtacctggtc 1080 accagacacg ccgacgtgat ccctgtcaga agaagagggg attccagagg cagcctgctg 1140 agccctagac ctatcagcta cctgaagggc agctctggcg gacctctgct ttgtcctgct 1200 ggacatgccg tgggcctgtt tagagccgcc gtgtgtacaa gaggcgtggc caaagccgtg 1260 gacttcatcc ccgtggaaaa cctggaaacc accatgcgga gccccgtgtt caccgacaat 1320 tctagccctc cagccgtgac actgacacac cccatcacca agatcgacag agaggtgctg 1380 taccaagagt tcgacgagat ggaagagtgc agccagcacg aggcctctgg atctggtaga 1440 gccgacgctc tggacgactt cgacctggat atgctgggct ctgacgccct ggatgatttt 1500 gacctcgaca tgctgggaag cgacgccctc gacgatttcg atttggacat gctcggcagt 1560 gatgcactcg atgactttga tcttgatatg ctgatcaaca gccggtccag cggcagccct 1620 aagaaaaaac ggaaagtggg cagccagtat ctgcccgaca ccgacgatcg gcaccggatc 1680 gaggaaaagc ggaagcggac ctacgagaca 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gcaagttctt gggggggtca ggcttgatga 1140 tgtcgcggat aaagaaggag gaagtgtagt tctcgtattt cagcttatgc acggcatcga 1200 ccatgacctc gataggcagg gactcttccg cggcagggca ggcgctgtcc tcctggcatt 1260 ccacggagta ctcatattcc ttgttgtctc ccctgactct ctcggcggac agagtggcgg 1320 ctccacaggt cacgccctga ggatcgcttg atccccgtga cgacttcacg gagaaagtca 1380 ggtcggtgga gattgtcgtc agccaccaac aggtgaaccg accgctgtag ttcttggctt 1440 cgcagcggag gaaggtcttg ttcttcggtt ctttttggtc cttgaggatg tcagtggacc 1500 agattccatc ctctttcttg tgcagcagca gcagggagtg ggacagcact tcgccaccct 1560 tgtggcaagt gtactggccc gcgtcgccga actccttgac ttgaatggtc agggtctttc 1620 cgcttccgag cacctcggag ctctgatcca gggtccaggt tatgccgtcc tcttctggcg 1680 tatcgcaagt cagcacgacc atttctccag gggcgtccgg gtaccaatcc agctcgacca 1740 cgtagacgtc cttcttcagt tcccaaatgg cgaccagagg ggaagcgagg aacacaaggg 1800 agaaccagga gatgacgagt tgctgatggc acatggtggc ggcaccggta cgcgttggcc 1860 cccattatat accctctaga actagttatc cactccgtgt aagggagagt gagcctctta 1920 cgaatgcgcg acatcggcta cgccgttccg 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ggccttgaat gggtcggacg gatcagaaac 660 aagaccaaca actacgccac ctactacgcc gacagcgtga aggccaggtt caccatctcc 720 agagatgaca gcaagaacag cctgtacctc cagatgaact ccctgaaaac cgaggacacc 780 gccgtgtact attgcgtggc cggcaatagc tttgcctact ggggacaggg caccctggtt 840 acagtttctg ctggtggtgg aggctcagga gggggaggtt ccggaggagg cggttcggac 900 atcgtgatga cacagagccc tgacagcctg gccgtgtctc tgggagaaag agccaccatc 960 aactgcaaga gcagccagag cctgctgtac tccagcaacc agaagaacta cctggcctgg 1020 tatcagcaaa agcccggcca gcctcctaag ctgctgatct attgggccag ctccagagaa 1080 agcggcgtgc ccgatagatt ttctggctct ggcagcggca ccgacttcac cctgacaatt 1140 tctagcctgc aagccgagga cgtggccgtg tattactgcc agcagtacta caactaccct 1200 ctgaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaagacca ccacaccagc tcctcggcct 1260 ccaactcctg ctcctacaat tgccagccag cctctgtctc tgaggcccga agcttgtaga 1320 ccagctgccg gcggagctgt gcatacaaga ggactggatt tcgcctgcga catctacata 1380 tgggcccccc tcgccggtac ttgcggtgtt ttgcttttgt cactggtgat tacgaagcgc 1440 ggtcgaaaaa aactcctcta catcttcaaa caacctttca tgcggcctgt ccaaacaact 1500 caagaagagg acgggtgttc atgccgcttt ccagaggaag aggaaggtgg ctgtgaactt 1560 cgggtgaagt tctcacgatc tgcggacgcc cccgcatacc aacagggaca gaaccaactc 1620 tacaatgaac tgaacctggg gcgaagagaa gaatatgacg ttctggataa gcgcagaggc 1680 cgcgaccccg aaatgggagg taagccgaga aggaaaaatc cacaggaagg actgtataat 1740 gagttgcaaa aggataagat ggcggaagca tattcagaga ttgggatgaa aggcgaaaga 1800 agaagaggca aaggacatga tgggctgtat cagggccttt ccacggccac aaaagatacg 1860 tatgacgcgc tgcacatgca agctcttcct cccaggggaa tggtgtccaa aggagaagaa 1920 ctgttcaccg gagtggtgcc gattctggtg gaactggacg gcgatgtcaa cggacacaag 1980 ttctcagtca gcggagaagg ggaaggggat gctacgtacg ggaagctcac cctgaagctc 2040 atctgtacta ctgggaagct gcctgtgccc tggccaactc tggtgacaac cctcggttac 2100 gggttgcagt gcttcgcacg ctaccctgac cacatgaagc agcacgattt cttcaaatcc 2160 gccatgcctg agggttacgt gcaagagcgg accatctttt tcaaggacga tggcaactac 2220 aagactcggg ccgaagtgaa attcgaaggg gacactcttg tgaaccgcat cgagttgaag 2280 ggcattgact tcaaggaaga tggcaacatt ttgggacaca agctggagta caactacaat 2340 tcccataacg tgtacatcac cgccgacaag cagaaaaacg ggatcaaggc caacttcaag 2400 atccgccaca atatcgagga tggcggagtg cagctggctg accactacca gcagaacacc 2460 cccatcggtg atggcccagt tctgctcccc gataaccatt acctgtcgta ccaatcggca 2520 ttgagcaagg accccaacga gaagcgcgat cacatggtgt tgctggaatt tgtgaccgct 2580 gccggcatta ccctcgggat ggacgagctc tacaagtaa 2619 <210> 140 <211> 2849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 140 tccccagcat gcctgctatt ctcttcccaa tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca 60 ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg caatttcctc attttattag 120 gaaaggacag tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca 180 acagatggct ggcaactaga aggcacagtc agctggtgtt gatgaacatc tgcacgatgt 240 gcacgaagct ctgcaggaac tctttgatat tcttttcttc cagttcctcg cattctttgc 300 agccggactc ggtcacattg ccgttggagg acaggctgtt gttggccagg atgatcaggt 360 tttccacggt atcgtggatg gaggcgtcgc cgctttccag gctgatcact tgcagctcga 420 gcagaaagca cttcatggcg gtcactttac agctagggtg cacgtcgctc tcggtgtaca 480 gtgtggcgtc gatgtgcatg ctctggatca gatcctcgat cttcttcaga tcgctgatca 540 cgttgaccca gttgcctgta gagccgggca cccaaagaag cagcacccac agcagcagtg 600 tgtcggtttc cataggtcca gggttttcct ccacgtctcc acacgtcagt agactcccgc 660 gtccctcgcc agatcctctc ttccgtctac tggcgttcag gtaggacatc acgcggtcaa 720 tggtcacggc tcgaatgcgg aaagcgtgca acaggatgca cagcttgatc ttggtcttgt 780 agaagtccgg ttcttccagg ctggactttt gaggcacagt ctcggagttg aaattcaggg 840 cctgcatcag ttcatcaatc acggcgagca tattctggtc caggaagatc tgccgcttcg 900 ggtccatgag cagcttggcg ttcatggtct tgaactcgac ctgatacatc ttcagatctt 960 cgtagatcga ggaaagacag agcgccatca tgaatgaggt ctttctcgac gccaggcagc 1020 tgccgttagt gataaagctt gtctcgcggg agttcagaca cgattcgttc ttggtcagtt 1080 ccagcggcag gcaggcttcc acggtcgagg tcttgtcctt ggtgatgtcc tcgtgatcaa 1140 tttcttccga ggtgcagggg tagaactcaa gggtctggcg ggccttctgc aacatgttcg 1200 acacagccct caggaggttt tgggagtggt gtaggcacgg gaacattcca gggtcggggg 1260 ttgccacagg gaggttccgg gaacctcctc cggagcctcc tcctgaacct ccgcctgatc 1320 cgccaccgga acaaggcacg ctggcccatt cgctccagga ggacgagtag tatctatcct 1380 gcgcccggac gctgattgac gcgttcttcc gacaaatcac agtggcggag gttttgtcgg 1440 tgaacacccg gtctttcttc tcccgtttgg actttccctg cacttgcaca cagaaagtga 1500 gcgagaagta tgagtgcggg gtgctccaag tgtctggata ttcccaagac acttccactt 1560 ggcgggagtt cttgagtggc ttcagctgca agttcttggg ggggtcaggc ttgatgatgt 1620 cgcggataaa gaaggaggaa gtgtagttct cgtatttcag cttatgcacg gcatcgacca 1680 tgacctcgat aggcagggac tcttccgcgg cagggcaggc gctgtcctcc tggcattcca 1740 cggagtactc atattccttg ttgtctcccc tgactctctc ggcggacaga gtggcggctc 1800 cacaggtcac gccctgagga tcgcttgatc cccgtgacga cttcacggag aaagtcaggt 1860 cggtggagat tgtcgtcagc caccaacagg tgaaccgacc gctgtagttc ttggcttcgc 1920 agcggaggaa ggtcttgttc ttcggttctt tttggtcctt gaggatgtca gtggaccaga 1980 ttccatcctc tttcttgtgc agcagcagca gggagtggga cagcacttcg ccacccttgt 2040 ggcaagtgta ctggcccgcg tcgccgaact ccttgacttg aatggtcagg gtctttccgc 2100 ttccgagcac ctcggagctc tgatccaggg tccaggttat gccgtcctct tctggcgtat 2160 cgcaagtcag cacgaccatt tctccagggg cgtccgggta ccaatccagc tcgaccacgt 2220 agacgtcctt cttcagttcc caaatggcga ccagagggga agcgaggaac acaagggaga 2280 accaggagat gacgagttgc tgatggcaca tggtggcggc accggtacgc gttggccccc 2340 attatatacc ctctagaact agttatccac tccgtgtaag ggagagtgag cctcttacga 2400 atgcgcgaca tcggctacgc cgttccgagg cgactgatac gcgcgacatc ggctacgccg 2460 tacgaaggca gtccgattgc gcgacatcgg ctacgccgac ctttactgag acgggagcgc 2520 gacatcggct acgccgaagg cgttgcgaat cctcatgcga ttgttacgaa acccgttaat 2580 taaagagcga gattccgtct caaagaaaaa aaaagtaatg aaatgaataa aatgagtcct 2640 agagccagta aatgtcgtaa atgtctcagc tagtcaggta gtaaaaggtc tcaactaggc 2700 agtggcagag caggattcaa attcagggct gttgtgatgc ctccgcagac tctgagcgcc 2760 acctggtggt aatttgtctg tgcctcttct gacgtggaag aacagcaact aacacactaa 2820 cacggcattt actatgggcc agccattgt 2849 <210> 141 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile 20 25 30 Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu 35 40 45 Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu 50 55 60 Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His 65 70 75 80 Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser 85 90 95 Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu 100 105 110 Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln 115 120 125 Met Phe Ile Asn Thr Ser 130 <210> 142 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 142 Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 143 <211> 2404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 143 tccccagcat gcctgctatt ctcttcccaa tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca 60 ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg caatttcctc attttattag 120 gaaaggacag tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca 180 acagatggct ggcaactaga aggcacagtt aactggcgtt caggtaggac atcacgcggt 240 caatggtcac ggctcgaatg cggaaagcgt gcaacaggat gcacagcttg atcttggtct 300 tgtagaagtc cggttcttcc aggctggact tttgaggcac agtctcggag ttgaaattca 360 gggcctgcat cagttcatca atcacggcga gcatattctg gtccaggaag atctgccgct 420 tcgggtccat gagcagcttg gcgttcatgg tcttgaactc gacctgatac atcttcagat 480 cttcgtagat cgaggaaaga cagagcgcca tcatgaatga ggtctttctc gacgccaggc 540 agctgccgtt agtgataaag cttgtctcgc gggagttcag acacgattcg ttcttggtca 600 gttccagcgg caggcaggct tccacggtcg aggtcttgtc cttggtgatg tcctcgtgat 660 caatttcttc cgaggtgcag gggtagaact caagggtctg gcgggccttc tgcaacatgt 720 tcgacacagc cctcaggagg ttttgggagt ggtgtaggca cgggaacatt ccagggtcgg 780 gggttgccac agggaggttc cgggaacctc ctccggagcc tcctcctgaa cctccgcctg 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Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp His Ser Asn Leu Ser Arg His 100 105 110 Leu Lys Thr His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys 115 120 125 Met Arg Asn Phe Ser Gln Arg Ser Ser Leu Val Arg His Leu Arg Thr 130 135 140 His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe 145 150 155 160 Ser Glu Ser Gly His Leu Lys Arg His Leu Arg Thr His Leu Arg Gly 165 170 175 Ser Thr Cys Arg Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His 180 185 190 Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys 195 200 205 Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Gly Gly Leu Glu Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Ser Gly Gly Thr Glu Asp Val Val Cys Cys His Ser Ile Tyr Gly 225 230 235 240 Lys Lys Lys Gly Asp Ile Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile Gly Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Ser Gly 260 265 270 Thr Ser Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu 275 280 285 Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu 290 295 300 Gly 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 146 tccccagcat gcctgctatt ctcttcccaa tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca 60 ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg caatttcctc attttattag 120 gaaaggacag tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca 180 acagatggct ggcaactaga aggcacagtt aactggcgtt caggtaggac atcacgcggt 240 caatggtcac ggctcgaatg cggaaagcgt gcaacaggat gcacagcttg atcttggtct 300 tgtagaagtc cggttcttcc aggctggact tttgaggcac agtctcggag ttgaaattca 360 gggcctgcat cagttcatca atcacggcga gcatattctg gtccaggaag atctgccgct 420 tcgggtccat gagcagcttg gcgttcatgg tcttgaactc gacctgatac atcttcagat 480 cttcgtagat cgaggaaaga cagagcgcca tcatgaatga ggtctttctc gacgccaggc 540 agctgccgtt agtgataaag cttgtctcgc gggagttcag acacgattcg ttcttggtca 600 gttccagcgg caggcaggct tccacggtcg aggtcttgtc cttggtgatg tcctcgtgat 660 caatttcttc cgaggtgcag gggtagaact caagggtctg gcgggccttc tgcaacatgt 720 tcgacacagc cctcaggagg ttttgggagt ggtgtaggca cgggaacatt ccagggtcgg 780 gggttgccac agggaggttc cgggaacctc 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167 Asp Glu Val Asp 1 <210> 168 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 168 Val Glu His Asp 1 <210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 169 Leu Gly His Asp Xaa 1 5 <210> 170 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 170 Leu Gln Thr Asp Gly 1 5 <210> 171 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 171 Glu His Xaa Gly 1 <210> 172 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 172 Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe 1 5 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 173 Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Gly or Ala <400> 174 Gly Xaa Glu Leu Arg 1 5 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 175 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Abz <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Lys(Dnp) <400> 176 Xaa His Pro Phe His Leu Lys 1 5 <210> 177 <211> 5483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 177 tccccagcat gcctgctatt ctcttcccaa tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca 60 ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg caatttcctc attttattag 120 gaaaggacag tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca 180 acagatggct ggcaactaga aggcacagtt agctggtgtt gatgaacatc tgcacgatgt 240 gcacgaagct ctgcaggaac tctttgatat tcttttcttc cagttcctcg cattctttgc 300 agccggactc ggtcacattg ccgttggagg acaggctgtt gttggccagg atgatcaggt 360 tttccacggt atcgtggatg gaggcgtcgc cgctttccag gctgatcact tgcagctcga 420 gcagaaagca cttcatggcg gtcactttac agctagggtg cacgtcgctc tcggtgtaca 480 gtgtggcgtc gatgtgcatg ctctggatca gatcctcgat cttcttcaga tcgctgatca 540 cgttgaccca gttgcctgta gagccgggca cccaaagaag cagcacccac agcagcagtg 600 tgtcggtttc cataggtcca gggttttcct ccacgtctcc acacgtcagt agactcccgc 660 gtccctcgcc agatcctctc ttccgtctac tggcgttcag gtaggacatc acgcggtcaa 720 tggtcacggc tcgaatgcgg aaagcgtgca acaggatgca cagcttgatc ttggtcttgt 780 agaagtccgg ttcttccagg ctggactttt gaggcacagt ctcggagttg aaattcaggg 840 cctgcatcag ttcatcaatc acggcgagca tattctggtc caggaagatc tgccgcttcg 900 ggtccatgag cagcttggcg ttcatggtct tgaactcgac ctgatacatc ttcagatctt 960 cgtagatcga ggaaagacag agcgccatca tgaatgaggt ctttctcgac gccaggcagc 1020 tgccgttagt gataaagctt gtctcgcggg agttcagaca cgattcgttc ttggtcagtt 1080 ccagcggcag gcaggcttcc acggtcgagg tcttgtcctt ggtgatgtcc tcgtgatcaa 1140 tttcttccga ggtgcagggg tagaactcaa gggtctggcg ggccttctgc aacatgttcg 1200 acacagccct caggaggttt tgggagtggt gtaggcacgg gaacattcca gggtcggggg 1260 ttgccacagg gaggttccgg gaacctcctc cggagcctcc tcctgaacct ccgcctgatc 1320 cgccaccgga acaaggcacg ctggcccatt cgctccagga ggacgagtag tatctatcct 1380 gcgcccggac gctgattgac gcgttcttcc gacaaatcac agtggcggag gttttgtcgg 1440 tgaacacccg gtctttcttc tcccgtttgg actttccctg cacttgcaca cagaaagtga 1500 gcgagaagta tgagtgcggg gtgctccaag tgtctggata ttcccaagac acttccactt 1560 ggcgggagtt cttgagtggc ttcagctgca agttcttggg ggggtcaggc ttgatgatgt 1620 cgcggataaa gaaggaggaa gtgtagttct cgtatttcag cttatgcacg gcatcgacca 1680 tgacctcgat aggcagggac tcttccgcgg cagggcaggc gctgtcctcc tggcattcca 1740 cggagtactc atattccttg ttgtctcccc tgactctctc ggcggacaga gtggcggctc 1800 cacaggtcac gccctgagga tcgcttgatc cccgtgacga cttcacggag aaagtcaggt 1860 cggtggagat tgtcgtcagc caccaacagg tgaaccgacc gctgtagttc ttggcttcgc 1920 agcggaggaa ggtcttgttc ttcggttctt tttggtcctt gaggatgtca gtggaccaga 1980 ttccatcctc tttcttgtgc agcagcagca gggagtggga cagcacttcg ccacccttgt 2040 ggcaagtgta ctggcccgcg tcgccgaact ccttgacttg aatggtcagg gtctttccgc 2100 ttccgagcac ctcggagctc tgatccaggg tccaggttat gccgtcctct tctggcgtat 2160 cgcaagtcag cacgaccatt tctccagggg cgtccgggta ccaatccagc tcgaccacgt 2220 agacgtcctt cttcagttcc caaatggcga ccagagggga agcgaggaac acaagggaga 2280 accaggagat gacgagttgc tgatggcaca tcatggtggc gacaccggta cgcgttggcc 2340 cccattatat accctctaga actagttatc cactccgtgt aagggagagt gagcctctta 2400 cgaatgcgcg acatcggcta cgccgttccg aggcgactga tacgcgcgac atcggctacg 2460 ccgtacgaag gcagtccgat tgcgcgacat cggctacgcc gacctttact gagacgggag 2520 cgcgacatcg gctacgccga aggcgttgcg aatcctcatg cgattgttac gaaacccgtt 2580 aattaaagag cgagattccg tctcaaagaa aaaaaaagta atgaaatgaa taaaatgagt 2640 cctagagcca gtaaatgtcg taaatgtctc agctagtcag gtagtaaaag gtctcaacta 2700 ggcagtggca gagcaggatt caaattcagg gctgttgtga tgcctccgca gactctgagc 2760 gccacctggt ggtaatttgt ctgtgcctct tctgacgtgg aagaacagca actaacacac 2820 taacacggca tttactatgg gccagccatt gtccatctag atggccgata aaataaaaga 2880 ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc 2940 tagctgcagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac caaaccaaga atagagaagt 3000 tcagatcaag ggcgggtaca tgaaaatagc taacgttggg ccaaacagga tatctgcggt 3060 gagcagtttc ggccccggcc cggggccaag aacagatggt caccgcagtt tcggccccgg 3120 cccgaggcca agaacagatg gtccccagat atggcccaac cctcagcagt ttcttaagac 3180 ccatcagatg tttccaggct cccccaagga cctgaaatga ccctgcgcct tatttgaatt 3240 aaccaatcag cctgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gcttcccgag ctctataaaa 3300 gagctcacaa cccctcactc ggcgcgccag tcctccgaca gactgagtcg cccgggggat 3360 ccgccaccat gagtagacct ggcgaaagac catttcagtg cagaatttgt atgcggaact 3420 tcagcagaag gcacggcctg gacagacaca ccagaacaca cacaggcgag aagcctttcc 3480 agtgtagaat ctgtatgcgc aatttcagcg accacagcag cctgaagcgg cacctgagaa 3540 cccataccgg cagccagaaa ccatttcaat gccgcatctg tatgagaaac ttctccgtgc 3600 ggcacaacct gaccagacac ctgaggacac acaccgggga gaaacccttc cagtgccgga 3660 tatgcatgag gaatttctcc gaccactcca acctgagccg ccacctgaaa actcacaccg 3720 gctctcaaaa gccatttcag tgtcgtatat gtatgcggaa tttttcccag cggagcagcc 3780 tcgtgcgcca tctgaggact catactggcg aaaagccctt ccaatgtcgc atatgcatgc 3840 gcaactttag cgagtccggc cacctgaaga gacatctgcg gacacacctg agaggcagca 3900 cctgtagaga ctacaaggac cacgacggcg attataagga tcacgacatc gactacaaag 3960 acgacgatga caagatggcc cctaagaaga agcggaaagt cggcatccat ggcgtgccag 4020 gtggacttga aggtggcgga ggatctggcg gcacagagga tgttgtgtgc tgccacagca 4080 tctacggcaa gaagaagggc gacatcgata cctatcggta catcggcagc agcggcacag 4140 gctgcgttgt gatcgtggga agaatcgtgc tgagcggctc tggcacaagc gcccctatta 4200 cagcctacgc tcagcagaca agaggcctgc tgggctgcat catcacaagc ctgaccggca 4260 gagacaagaa ccaggtggaa ggcgaggtgc agatcgtgtc tacagctacc cagaccttcc 4320 tggccacctg tatcaatggc gtgtgctggg ccgtgtatca cggcgctgga accagaacaa 4380 tcgcctctcc taagggaccc gtgatccaga tgtacaccaa cgtggaccag gacctcgttg 4440 gctggcctgc tcctcaggga agtagaagcc tgacaccttg cacctgtggc tccagcgatc 4500 tgtacctggt caccagacac gccgacgtga tccctgtcag aagaagagga gattccagag 4560 gcagcctgct gagccctaga cctatcagct acctgaaggg cagctctggc ggacctctgc 4620 tttgtcctgc tggacatgcc gtgggcctgt ttagagccgc cgtgtgtaca agaggcgtgg 4680 caaaggccgt ggacttcatc cccgtggaaa acctggaaac caccatgcgg agccccgtgt 4740 tcaccgacaa ttctagccct ccagccgtga cactgacaca ccccatcacc aagatcgaca 4800 gagaggtgct gtaccaagag ttcgacgaga tggaagagtg cagccagcac tacccctacg 4860 acgtgccaga ttatgctggc ggaggtggca gcggaggcac cgatgaattt ccaaccatgg 4920 tgttccccag cggccagatc tctcaggcat ctgctcttgc tccagctcca cctcaggttc 4980 tgcctcaagc tcctgctccg gctcctgcac cagctatggt gtctgcactt gctcaggcac 5040 cagctccagt gcctgttctt gctcctggac ctcctcaggc tgttgctcca ccagcaccta 5100 aacctacaca ggccggcgag ggaacactgt ctgaagccct gctgcaactc cagttcgatg 5160 acgaagatct gggcgccctg ctgggaaact ctacagatcc tgccgtgttt accgatctgg 5220 ccagcgtgga caacagcgag tttcagcagc tcctgaacca gggcatccca gtggctcctc 5280 acaccacaga gcctatgctg atggaatacc ccgaggccat caccagactg gtcaccggcg 5340 cacaaagacc acctgatcct gctccagcac cgcttggagc acctggactg cctaatggac 5400 tgctgtctgg cgacgaggac ttcagttcta tcgctgatat ggatttctct gcccttctgt 5460 ctcagattag tagccagctg taa 5483

Claims (15)

  1. 하기를 포함하는 조작된 발현 시스템:
    (a) 제1 프로모터 및 활성화-조건부 제어 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 발현 카세트,
    상기 제1 프로모터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고; 그리고
    (b) ACP 반응성 프로모터 및 하기 식을 갖는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제2 발현 카세트,
    (L - E) X
    식 중
    E는 효과기 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    X = 1 내지 20이고,
    상기 ACP 반응성 프로모터는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 (L-E) 단위의 제1 반복에 대해, L은 부재하고, 그리고
    상기 ACP는 ACP 반응성 프로모터에 결합함으로써 제2 발현 카세트의 발현을 유도할 수 있고,
    선택적으로 제2 발현 카세트가 (L - E) X 의 2개 이상의 단위를 포함하는 경우, 각각의 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되고,
    선택적으로 (L - E) X 의 하나 이상의 단위를 포함하는 제2 발현 카세트는 각각의 X에 대한 분비 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고,
    선택적으로 각각의 X에 대해 상응하는 분비 신호 펩티드는 효과기 분자와 작동 가능하게 연관되고,
    선택적으로 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 고유한 천연 분비 신호 펩티드를 포함하고,
    선택적으로 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함하고,
    선택적으로 각각의 분비 신호 펩티드는 상응하는 효과기 분자에 대해 고유하지 않은 비-천연 분비 신호 펩티드를 포함하고 선택적으로 비-천연 분비 신호 펩티드는 IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, CD8, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전단백질, 아주로시딘 전단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, GM-CSFR, GM-CSF, 및 CXCL12로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 분비 신호 펩티드이고, 그리고
    선택적으로 상기 제1 발현 카세트는 제1 핵산 내에 포함되고 제2 발현 카세트는 제2 핵산 내에 포함되거나, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 단일 핵산 내에 포함됨.
  2. 제1항에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 국소화된 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하되,
    선택적으로 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별도의 폴리펩티드로서 ACP 및 각 효과기 분자의 번역과 작동 가능하게 연관되고,
    선택적으로 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그(skipping tag)를 암호화하고 선택적으로 상기 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A, 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하고, 그리고
    선택적으로 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단 가능한 폴리펩티드를 암호화하고 선택적으로 상기 절단 가능한 폴리펩티드는 퓨린 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인, 조작된 발현 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) ACP 반응성 프로모터는 ACP 결합 도메인 서열 및 프로모터 서열을 포함하고,
    선택적으로 상기 프로모터 서열은 minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도자 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래되고,
    선택적으로 상기 ACP 반응성 프로모터는 합성 프로모터를 포함하고,
    선택적으로 상기 ACP 반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함하고, 그리고
    선택적으로 상기 ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하고;
    (b) 제1 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 합성 프로모터를 포함하고,
    선택적으로 상기 구조적 프로모터는 CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고/또는
    (c) 각각의 효과기 분자는 치료 부류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치료 부류는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 조절제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 사이토카인은 IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL12p70 융합 단백질, IL15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 케모카인은 CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; CCR9; CXCR4; SDF1; MMP-2; CXCR1; CXCR7; CCR2; CCR4; 및 GPR15로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 성장 인자는 FLT3L 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 공동 활성화 분자는 c-Jun, 4-1BBL 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 종양 미세환경 조절제는 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 상기 TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하고, 그리고
    선택적으로 각각의 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자인, 조작된 발현 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 제1 발현 카세트 및/또는 제2 발현 카세트는 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하거나, 또는
    (b) 조작된 발현 시스템은 추가의 프로모터 및 항원 인식 수용체를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 발현 카세트를 추가로 포함하고,
    상기 추가의 프로모터는 추가 외인성 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 상기 추가 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 제1 발현 카세트 또는 제2 발현 카세트와 동일한 폴리펩티드에 의해 암호화되고, 그리고
    선택적으로 상기 항원 인식 수용체는 GPC3을 인식하고,
    선택적으로 상기 항원 인식 수용체는 항원 결합 도메인을 포함하고,
    선택적으로 상기 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
    상기 VH는
    KNAMN (서열 번호 119)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1),
    RIRNKTNNYATYYADSVKA (서열 번호 120)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 및
    GNSFAY (서열 번호 121)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고, 그리고
    상기 VL은
    KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열 번호 122)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1),
    WASSRES (서열 번호 123)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및
    QQYYNYPLT (서열 번호 124)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하고,
    선택적으로 상기 VH 영역은
    EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA (서열 번호 125) 또는
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호 126)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    선택적으로 상기 VL 영역은
    DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK (서열 번호 127), 또는
    DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK (서열 번호 128)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    선택적으로 상기 항원 결합 도메인은 항체, 항체의 항원 결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함하고,
    선택적으로 상기 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리되고,
    선택적으로 상기 항원 결합 도메인이 scFv를 포함하는 경우, 상기 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이고,
    선택적으로 상기 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이고,
    선택적으로 항원 인식 수용체가 CAR인 경우, 상기 CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 각각은 CD3제타-사슬 세포내 신호전달 도메인, CD97 세포내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호전달 도메인, CD2 세포내 신호전달 도메인, ICOS 세포내 신호전달 도메인, CD27 세포내 신호전달 도메인, CD154 세포내 신호전달 도메인, CD8 세포내 신호전달 도메인, OX40 세포내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, ZAP40 세포내 신호전달 도메인, CD30 세포내 신호전달 도메인, GITR 세포내 신호전달 도메인, HVEM 세포내 신호전달 도메인, DAP10 세포내 신호전달 도메인, DAP12 세포내 신호전달 도메인, MyD88 세포내 신호전달 도메인, 2B4 세포내 신호전달 도메인, CD16a 세포내 신호전달 도메인, DNAM-1 세포내 신호전달 도메인, KIR2DS1 세포내 신호전달 도메인, KIR3DS1 세포내 신호전달 도메인, NKp44 세포내 신호전달 도메인, NKp46 세포내 신호전달 도메인, FceR1g 세포내 신호전달 도메인, NKG2D 세포내 신호전달 도메인, 및 EAT-2 세포내 신호전달 도메인로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 CAR은 막횡단 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 CD3제타-사슬 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인, BTLA 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD16a 막횡단 도메인, DNAM-1 막횡단 도메인, KIR2DS1 막횡단 도메인, KIR3DS1 막횡단 도메인, NKp44 막횡단 도메인, NKp46 막횡단 도메인, FceR1g 막횡단 도메인, 및 NKG2D 막횡단 도메인로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그리고
    선택적으로 상기 CAR은 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함하는 것인, 조작된 발현 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACP는 전사 조절제이고,
    선택적으로 상기 ACP는 전사 억제자이거나 ACP는 전사 활성화제이고,
    선택적으로 상기 ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함하고,
    선택적으로 상기 ACP는 에스트로겐 수용체의 호르몬 결합 도메인 (ERT2 도메인)을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 ACP는 타목시펜 또는 이의 대사산물에 대한 ERT2 도메인의 결합 시 핵 국소화를 겪을 수 있고, 선택적으로 상기 타목시펜 대사산물은 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-산화물, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 ACP는 전사 인자이고, 선택적으로, 상기 전사 인자는 징크-핑거-함유 전사 인자이고,
    선택적으로 상기 ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인 (ZF 단백질 도메인) 및 전사 효과기 도메인을 포함하고, 선택적으로 상기 ZF 단백질 도메인은 모듈식 설계이고 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 구성되고, 선택적으로 상기 ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA를 포함하고,
    선택적으로 상기 효과기 도메인은 단순 포진 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인, VP16의 4개의 탠덤 카피를 포함하는 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인 (VPR 활성화 도메인)을 포함하는 세 부분으로 된 활성화제; 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인 (p300 HAT 코어 활성화 도메인); 크루펠 연관 박스(
    Figure pct00080
    ) (KRAB) 억제 도메인; 절단된 크루펠 연관 박스 (KRAB) 억제 도메인; 억제자 요소 침묵 전사 인자 (REST) 억제 도메인; 털이 관련된(hairy-related) 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 상기 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B (DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화되고,
    선택적으로 상기 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스 (HCV) 비구조 단백질 3 (NS3)이고,
    선택적으로 상기 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하고,
    선택적으로 상기 NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하고,
    선택적으로 상기 NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있고,
    선택적으로 상기 프로테아제 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르, 또는 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이거나, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르를 포함하고,
    선택적으로 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르가 약학 조성물로 공동-제형화되고,
    선택적으로 상기 약학 조성물은 정제이고,
    선택적으로 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르는 2 대 1 중량비이고, 선택적으로 상기 그라조프레비르가 단위 용량당 100 mg이고 엘바스비르가 단위 용량당 50 mg이고,
    선택적으로 상기 ACP는 데그론을 추가로 포함하고, 상기 데그론은 ACP에 작동 가능하게 연결되고,
    선택적으로 상기 데그론은 HCV NS4 데그론, PEST (인간 IκBα의 잔기 277-307의 2개 카피), GRR (인간 p105의 잔기 352-408), DRR (효모 Cdc34의 잔기 210-295), SNS (SP2 및 NB의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB (효모 RPB의 잔기 1688-1702의 4개 카피), SPmix (SP1 및 SP2의 탠덤 반복 (인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2 (인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79-93의 3개 카피), ODC (오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106-142), Nek2A, 마우스 ODC (잔기 422-461), 마우스 ODC_DA (D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422-461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호전달의 히드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 데그론은 면역조절 약물 (IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론 (CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로-매개 분해를 촉진하고,
    선택적으로 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 IKZF1, IKZF3, CK1a, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    선택적으로 상기 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물이고,
    선택적으로 상기 IMiD는 FDA 승인 약물이고,
    선택적으로 상기 IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그리고
    선택적으로 상기 데그론은 억제성 프로테아제의 5', 억제성 프로테아제의 3', ZF 단백질 도메인의 5', ZF 단백질 도메인의 3', 효과기 도메인의 5', 또는 효과기 도메인의 3'에 국소화되는 것인, 조작된 발현 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 조작된 발현 시스템은 절연체를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 절연체는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 존재하는 경우 추가 발현 카세트 사이에 국소화되고;
    (b) 상기 제1 발현 카세트가 상기 제2 발현 카세트에 대해 동일한 배향으로 국소화되거나 제1 발현 카세트가 제2 발현 카세트에 대해 반대 배향으로 국소화되고/되거나;
    (c) 상기 조작된 발현 시스템은 DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산인, 조작된 발현 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조작된 발현 시스템 중 어느 하나의 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 및/또는 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로서,
    선택적으로 여기서 (a) 제1 벡터는 상기 제1 발현 카세트 및 존재하는 경우 상기 추가 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 상기 제2 발현 카세트를 포함하고, (b) 제1 벡터는 상기 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 상기 제2 발현 카세트 및 존재하는 경우 상기 추가 발현 카세트를 포함하고, (c) 제1 벡터는 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하고, 제2 벡터는 존재하는 경우 상기 추가 발현 카세트를 포함하거나, 또는 (d) 벡터는 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트, 존재하는 경우 추가 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조작된 발현 시스템 또는 제7항의 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포로서,
    선택적으로 상기 조작된 발현 시스템이 재조합적으로 발현되고,
    선택적으로 상기 조작된 발현 시스템은 세포의 게놈으로부터 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 선택된 유전자좌로부터 발현되고,
    선택적으로 상기 세포는 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그리고
    선택적으로 상기 세포는 자가조직이거나 상기 세포는 동종이계인, 단리된 세포.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조작된 발현 시스템, 제7항의 하나 이상의 발현 벡터, 또는 제8항의 단리된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물.
  10. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 제8항의 단리된 세포 또는 제9항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 제8항의 단리된 세포의 또는 제9항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제8항의 단리된 세포 또는 제9항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양을 갖는 대상체에게 제8항의 단리된 세포를 포함하는 조성물 또는 제9항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 투여는 전신 투여 또는 종양내 투여를 포함하고;
    (b) 상기 단리된 세포가 대상체로부터 유래되거나 단리된 세포가 대상체와 관련하여 동종이계이고;
    (c) 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고;
    (d) 상기 종양은 선암종, 방광 종양, 뇌종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 중피종, 난소 종양, 췌장 종양, 위 종양, 고환 난황낭 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양, 및 자궁 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (e) 상기 방법은 프로테아제 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하되,
    선택적으로 상기 프로테아제 억제제는 억제성 프로테아제를 억제하기에 충분한 양으로 투여되고,
    선택적으로 상기 프로테아제 억제제는 조작된 세포 또는 상기 조작된 세포를 포함하는 조성물의 투여 전에, 투여와 동시에, 투여 후 투여되고,
    선택적으로 상기 프로테아제 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고: 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르, 또는 프로테아제 억제제는 그라조프레비르이거나, 프로테아제 억제제는 그라조프레비르 및 엘바스비르를 포함하고,
    선택적으로 상기 프로테아제 억제제가 그라조프레비르 및 엘바스비르를 포함하는 경우, 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르는 약학 조성물로 공동-제형화되고,
    선택적으로 상기 약학 조성물은 정제이고
    선택적으로 상기 그라조프레비르 및 엘바스비르는 2 대 1 중량비이고, 그리고 선택적으로 상기 그라조프레비르가 단위 용량당 100mg이고 엘바스비르가 단위 용량당 50mg이고/이거나;
    (f) 상기 방법은 타목시펜 또는 이의 대사산물을 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 선택적으로 상기 타목시펜 대사산물은 4-히드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥시드, 및 엔독시펜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제8항의 단리된 세포 또는 제9항의 약학 조성물을 포함하는 암 치료 및/또는 예방용 키트로서, 선택적으로 상기 키트는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 세포 또는 조성물을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 것인, 키트.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023288220A2 (en) * 2021-07-12 2023-01-19 Children's Hospital Medical Center Differential cxcr4 expression on hematopoietic progenitor cells versus stem cells directs homing and long-term engraftment
EP4377464A1 (en) * 2021-07-29 2024-06-05 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Synthetic nucleic acid elements for enhancing car t cell efficacy
AU2022378576A1 (en) * 2021-10-28 2024-03-28 Atossa Therapeutics, Inc. Endoxifen for treatment of cancers
WO2023086829A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-3 (gpc3) and use thereof
WO2023114910A2 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Senti Biosciences, Inc. Activation responsive promoters and uses thereof
WO2023215724A1 (en) * 2022-05-01 2023-11-09 Factor Bioscience Inc. Methods for reprogramming and gene editing cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9068197B2 (en) * 2005-08-24 2015-06-30 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems
RU2612788C2 (ru) * 2010-03-23 2017-03-13 Интрексон Корпорейшн Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение
WO2017023708A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 California Institute Of Technology Activity-dependent expression of nucleic acids
JP7288401B2 (ja) * 2017-01-10 2023-06-07 プレシゲン，インコーポレイテッド 新規の遺伝子スイッチ発現系を介したポリペプチドの発現のモジュレーション
BR112020012591A2 (pt) * 2017-12-22 2020-11-24 Genentech, Inc. células hospedeiras de integração direcionada (ti), células hospedeiras ti, métodos para preparar uma célula hospedeira ti, métodos para expressar um polipeptídeo de interesse e vetores

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