JP2023506015A

JP2023506015A - 細胞の調節されたアーマリングのための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2023506015A
Application number: JP2022535807A
Authority: JP
Inventors: アヤラマルセラグズマン; ラッセルモリソンゴードリー; ミシェルエリザベスハング; ゲイリーリー; ジャックズ－チャオリン; ティモシークワン－タル; アセンボヤノフログエフ
Original assignee: センティバイオサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-14
Also published as: AU2020399805A1; US20230011052A1; WO2021119539A1; IL293570A; EP4072596A1; CN115087466A; TW202136507A; CA3160614A1; EP4072596A4; KR20220115602A

Abstract

本明細書において、調節性転写因子及び／または活性化誘導性プロモーターを使用してエフェクター分子の発現を調節するための組成物及び方法を提供する。一態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリヌクレオチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む、操作された核酸を提供し、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することにより、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。【選択図】図４Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／９４７，４２７号及び２０２０年１１月１９日に出願された第６３／１１６，１０３号の利益を主張し、これらのそれぞれは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年ＸＸ月ＸＸ日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。

背景
腫瘍は、免疫系による認識及びクリアランスを避けるために、様々な直接的及び間接的な抑制戦略を採用する。これらの回避戦略は、細胞治療を効果的にシャットダウンすることができる。非アーマー治療では固形腫瘍での有効性が低いため、エフェクターを組み合わせて発現させるコンビナトリアルアーマリング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｒｍｏｒｉｎｇ）は、がん免疫サイクル全体に影響を与え、細胞治療の活性を高めることができる。しかしながら、現在の細胞治療製品及び遺伝子治療製品は制御することができない。無秩序なアーマー治療は、対象に毒性を及ぼし得る。したがって、エフェクター分子の組み合わせの発現を制御及び調節する追加の方法が必要である。

概要
一態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

別の態様では、本明細書において、（ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびに（ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された発現系を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、同じポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された発現系は、追加のプロモーター及び抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列を含む追加の発現カセットをさらに含み、追加のプロモーターは追加の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第１の発現カセットまたは第２の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第１の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第２の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセット及び存在する場合は追加の発現カセットを含み、第２のベクターは、第２の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセットを含み、第２のベクターは、第２の発現カセット及び存在する場合は追加の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含み、第２のベクターは、存在する場合は追加の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、操作された発現系は、列挙する実施形態１～３５９に記載される態様、特性、または実施形態のいずれかを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の操作された核酸の態様、特性、または実施形態のいずれかを含む。

いくつかの実施形態では、第２の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各分子の翻訳と作動可能に関連している。

いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする。

いくつかの実施形態では、２Ａリボソームスキッピングタグは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。

いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、切断可能ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、切断可能ポリペプチドは、フューリンポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む第２の発現カセットは、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、各Ｘについて、対応する分泌シグナルペプチドは、エフェクター分子と作動可能に関連している。

いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して天然である天然分泌シグナルペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、非天然分泌シグナルペプチドは、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、ＡＣＰ結合ドメイン及びプロモーター配列を含む。

いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択されるプロモーターに由来する。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、合成プロモーターである。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、最小プロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む。

いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである。

いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、各エフェクター分子は、独立して、治療クラスから選択され、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２；ＣＣＲ４、及びＧＰＲ１５からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、成長因子は、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、共活性化分子は、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境改変因子は、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭｌ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、各エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子である。

いくつかの実施形態では、第１の外来ポリヌクレオチド配列は、抗原認識受容体をさらにコードする。

ある特定の態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

ある特定の態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびに活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在しない。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抗原認識受容体であり、ＡＣＰは、同族の抗原へのＡＣＰの結合に続いて、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、同族の抗原へのＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、同族の抗原へのＡＣＰの結合に続いて上方制御される遺伝子のプロモーター領域に由来する。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び合成プロモーターからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在化されたリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしてのＡＣＰ及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、第１の外来性ポリヌクレオチド配列は、ＡＣＰをコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域と、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域の間に局在するリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしてのＡＣＰ及び抗原認識受容体の翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在化されたリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての抗原受容体及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＣＰ、リンカーポリヌクレオチド配列、及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする。いくつかの実施形態では、２Ａリボソームスキッピングタグは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチド配列は、切断可能ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、切断可能ポリペプチドは、フューリンポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、５Ｔ４、ＡＤＡＭ９、ＡＦＰ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｃ４．４、ＣＡ６、カドヘリン３、カドヘリン６、ＣＣＲ４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１６６、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン１８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ４、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＲα、ＦＲｂ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＦＲａ４、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ｇｐＮＢＭ、ＧＰＲＣ５、ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ１ＲＡＰ、インテグリンａＶ、ＫＩＴ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ１、ルイスＹ、ＬｅＹ、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１Ｃ、ＮａＰｉ２Ｂ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＹＥＳＯ１、Ｏｖａｒｉｎ、Ｐ－カドヘリン、汎Ｅｒｂ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＡｕｒｅｓ、ＳＣＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＤＧＦ１、ＴＩＭ１、ＴＲＯＰ２、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原を認識する。いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＧＰＣ３を認識する。いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、メソテリン（ＭＳＬＮ）を認識する。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、抗原結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、ＶＨは、ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及びＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含み、ＶＬは、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及びＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＭＶＱＰＥＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＩＥＤＴＡＭＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２５）または
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２６）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＩＧＥＫＶＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１２７）、または
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１２８）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＭＳＬＮに結合する抗原結合ドメインは、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
のアミノ酸配列を有する単一ドメインモノクローナル抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーによって分離される。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、Ｌはペプチドリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインである。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれは、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１６ａ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＮＡＭ－１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＥＡＴ－２細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写モジュレーターである。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写抑制因子である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写活性化因子である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抑制性プロテアーゼ、及び抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＥＲＴ２ドメイン）をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写因子である。

いくつかの実施形態では、転写因子は、ジンクフィンガー含有転写因子である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及び転写エフェクタードメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュール式の設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなる。

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のＺＦＡを含む。

いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーからなる活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（トリパータイト活性化因子は、ＶＰＲ活性化ドメインとして知られる）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメインとして知られる）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位は、ＺＦタンパク質ドメインとエフェクタードメインの間に局在化している。

いくつかの実施形態では、抑制性プロテアーゼは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）である。

いくつかの実施形態では、同族切断部位は、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位は、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合点切断部位を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＳ３プロテアーゼは、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得る。

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビルである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビル及びエルバスビルである。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、医薬組成物中に共製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は錠剤である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、２対１の重量比である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビルは単位用量あたり１００ｍｇであり、エルバスビルは単位用量あたり５０ｍｇである。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ＥＲＴ２ドメインがタモキシフェンまたはその代謝産物に結合すると核局在化を受けることができる。

いくつかの実施形態では、タモキシフェン代謝産物は、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、デグロンをさらに含み、デグロンは、作動可能にＡＣＰに連結されている。

いくつかの実施形態では、デグロンは、ＨＣＶＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の２つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２及びＮＢのタンデムリピート（ＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の４つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ１及びＳＰ２のタンデムリピート（ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の３つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３Ａ及びＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２及びＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存性デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、デグロンは、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合することができ、それによってユビキチン経路を介したＡＣＰの分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合が可能な、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳＥ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７、及びＺＮ８２７、またはそれらの断片からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号１３１）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である。

いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤは、ＦＤＡ承認薬である。

いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、デグロンは、抑制性プロテアーゼの５’、抑制性プロテアーゼの３’、ＺＦタンパク質ドメインの５’、ＺＦタンパク質ドメインの３’、エフェクタードメインの５’、またはエフェクタードメインの３’に局在している。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、インシュレーターをさらに含む。

いくつかの実施形態では、インシュレーターは、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在している。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットに対して同じ方向に局在している。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットに対して反対の方向に局在している。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される。

別の態様では、本明細書において、操作された核酸、発現系、または第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または本明細書に開示する追加の発現カセットを含む発現ベクターを提供する。

別の態様では、本明細書において、操作された核酸、発現系、または第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または本明細書に記載の追加の発現カセット、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、操作された核酸、発現系、または第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または本明細書に記載の追加の発現カセットまたは本明細書に記載のベクターを含む単離された細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、操作された核酸を、組換え発現させる。

いくつかの実施形態では、操作された核酸を、ベクター、または細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現させる。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は自家である。

いくつかの実施形態では、細胞は同種異系である。

いくつかの実施形態では、細胞は、腺癌細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、精巣卵黄嚢腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞を、腫瘍溶解性ウイルスによる形質導入を介して操作する。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである。

いくつかの実施形態では、細胞は、クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及びサルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）からなる群から選択される細菌細胞である。

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の単離された細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量の単離された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載の治療有効量の単離された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の治療有効量の単離された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量の単離された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載の単離された細胞または組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。

いくつかの実施形態では、単離された細胞は、対象由来である。

いくつかの実施形態では、単離された細胞は、対象に関して同種異系である。

いくつかの実施形態では、方法は、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、方法は、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される。

別の態様では、本明細書において、脂質ベースの構造体、操作された核酸、発現系、または第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または本明細書に記載の追加の発現カセットを提供する。

いくつかの実施形態では、脂質ベースの構造体は、細胞外小胞を含む。

いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクル及びエキソソームからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、脂質ベースの構造体は、脂質ナノ粒子またはミセルを含む。

いくつかの実施形態では、脂質ベースの構造体は、リポソームを含む。

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の脂質ベースの構造体、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載の脂質ベースの構造体または組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ベースの構造体は、対象の細胞を操作することができる。

別の態様では、本明細書において、ナノ粒子、操作された核酸、発現系、または第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または本明細書に記載の追加の発現カセットを提供する。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、無機材料を含む。

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載のナノ粒子を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量のナノ粒子または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載の治療有効量のナノ粒子または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の治療有効量のナノ粒子または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の治療有効量のナノ粒子または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に記載のナノ粒子または組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、対象の細胞を操作することができる。

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の操作された核酸を含むように操作されたウイルスを提供する。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、腫瘍細胞内で発現することができる。

別の態様では、本明細書において、操作されたウイルスまたは組成物を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、治療有効量の操作されたウイルスまたは組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の操作されたウイルスまたは組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の操作されたウイルスまたは組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、操作されたウイルスまたは組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。

いくつかの実施形態では、操作されたウイルスは、対象の細胞に感染し、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを発現する。

別の態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された細胞を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、単一のポリヌクレオチド配列によってコードされる。

前記第２の発現カセットが（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌ_１リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している、請求項１５３～１５５のいずれか一項に記載の操作された細胞。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第２のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含み、第２のリンカーポリヌクレオチドは、第１の発現カセットを第２の発現カセットに連結する。

いくつかの実施形態では、第２のリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子及びＡＣＰの翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、各リンカーポリヌクレオチド配列は、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする。

いくつかの実施形態では、各リンカーポリヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。

いくつかの実施形態では、（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む第２の発現カセットは、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、及びＧＰＲ１５からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、共活性化分子は、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ、及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞は、第３のプロモーター、及び抗原認識受容体をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３のプロモーターは、第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。

別の態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された細胞を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

別の態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびに活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された細胞を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在しない。

いくつかの実施形態では、細胞は、第３のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第３の発現カセットをさらに含み、第３のプロモーターは、第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抗原認識受容体であり、ＡＣＰは、同族の抗原へのＡＣＰの結合に続いて、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、その同族の抗原へのＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、同族の抗原へのＡＣＰの結合に続いて上方制御される遺伝子のプロモーター領域に由来する。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抗原認識受容体であり、ＡＣＰは、その同族の抗原への結合により、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、その同族の抗原へのＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである。

いくつかの実施形態では、第１の外来性ポリヌクレオチド配列は、ＡＣＰをコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域と、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域の間に局在する第３のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしてのＡＣＰ及び抗原認識受容体の翻訳と作動可能に関連する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＣＰ、第３のリンカーポリヌクレオチド配列、及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、細胞は、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在化された第３のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての抗原受容体及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする。いくつかの実施形態では、２Ａリボソームスキッピングタグは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、切断可能ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、切断可能ポリペプチドは、フューリンポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、第３のリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしてのＡＣＰ及び抗原認識受容体の翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＭＶＱＰＥＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＩＥＤＴＡＭＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２５）、または
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２６）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抑制性プロテアーゼ及び抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写因子である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ジンクフィンガー含有転写因子である。

いくつかの実施形態では、転写因子は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及びエフェクタードメインを含む。

いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーからなる活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインからなるトリパータイト活性化因子（トリパータイト活性化因子は、ＶＰＲ活性化ドメインとして知られる）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメインとして知られる）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル（ｖｏｘｉｌｏｐｒｅｖｉｒ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビルである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビル及びエルバスビルである。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、医薬組成物中に共製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は錠剤である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、２対１の重量比である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビルは単位用量あたり１００ｍｇであり、エルバスビルは単位用量あたり５０ｍｇである。

いくつかの実施形態では、細胞は、第３のプロモーターと、式（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第３の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第３の発現カセットをさらに含み、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、第３のプロモーターは、第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在しない。

いくつかの実施形態では、第３の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している。

いくつかの実施形態では、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む第３の発現カセットは、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、追加のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである。

いくつかの実施形態では、追加のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は自家である。

いくつかの実施形態では、細胞は同種異系である。

いくつかの実施形態では、細胞を、腫瘍溶解性ウイルスによる形質導入を介して操作した。

いくつかの実施形態では、細胞は、クロストリジウム・ベエイジェリンキー、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ノビイ、大腸菌、シュードモナス・エルジノーサ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、及びサルモネラ・コレレスイスからなる群から選択される細菌細胞である。

別の態様では、本明細書において、操作された細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

別の態様では、本明細書において、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の操作された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、治療有効量の操作された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の操作された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の操作された細胞または組成物のいずれかを投与することを含む。

別の態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、操作された細胞または組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象由来である。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に関して同種異系である。

いくつかの実施形態では、方法は、プロテアーゼ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤を、抑制性プロテアーゼを抑制するのに十分な量で投与する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤を、操作された細胞または操作された細胞を含む組成物の投与の前に、同時に、その後に投与する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビルである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビル及びエルバスビルである。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、医薬組成物中に共製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は錠剤である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビル及びエルバスビルは、２対１の重量比である。いくつかの実施形態では、グラゾプレビルは単位用量あたり１００ｍｇであり、エルバスビルは単位用量あたり５０ｍｇである。

いくつかの実施形態では、方法は、タモキシフェンまたはその代謝産物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、タモキシフェン代謝産物は、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される。

本開示のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面に関してより良好に理解されるであろう。

例示的な調節性ＴＦタンパク質ならびにｍｉｎＣＭＶプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有するＴＦ誘導性遺伝子の図を示す。アスナプレビルの存在下または非存在下での調節性ＴＦ及びｍＣｈｅｒｒｙベクターの両方を発現する細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現を示す。例示的な調節性ＴＦタンパク質ならびにｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する調節性ＴＦ誘導性遺伝子の図を示す。アスナプレビルの存在下または非存在下での調節性ＴＦ及びｍＣｈｅｒｒｙベクターの両方を発現する細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現を示す。調節性ＴＦならびにｍｉｎＴＫプロモーター及びＩＬ－１０遺伝子を有する調節性ＴＦ誘導性遺伝子を発現する例示的な単一ベクターの図を示す。アスナプレビルの存在下または非存在下での調節性ＴＦ及びＩＬ－１０ベクターを発現する細胞におけるＩＬ－１０産生を示す。調節性ＴＦならびにｍｉｎＴＫプロモーター及びＩＬ－１２遺伝子を有する調節性ＴＦ誘導性遺伝子を発現する例示的な単一ベクターの図を示す。アスナプレビルの存在下または非存在下での調節性ＴＦ及びＩＬ－１２ベクターの両方を発現する細胞におけるＩＬ－１２産生を示す。ｍｙｃタグ付きＣＡＲ遺伝子に連結された調節性ＴＦならびにｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する調節性ＴＦ誘導性遺伝子を発現する例示的な単一ベクターの図を示す。アスナプレビルの存在下及び非存在下での調節性ＴＦ及びｍＣｈｅｒｒｙベクターを発現する細胞におけるＣＡＲの発現を示す。アスナプレビルの存在下または非存在下での調節性ＴＦ及びｍＣｈｅｒｒｙベクターを発現する細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。単一ベクター系において調節性ＴＦ及びエフェクター遺伝子を発現させるための追加の例示的なベクターを示す。ＧＰＣ３ＣＡＲ構築物（「１１０６」）の概略図を示す。フローサイトメトリーによって評価した、様々な構築物と組み合わせたＣＡＲ形質導入特性を示す。評価したＹＦＰＭＦＩ（上部パネル）及びパーセンテージ（下部パネル）としての様々な構築物の形質導入特性を示す。ＣＡＲの共発現あり（右）または共発現なし（左）での様々な構築物のＩＬ－１２産生を示す。ＣＡＲの共発現あり（右）または共発現なし（左）での様々な構築物のＩＬ－１５産生を示す。ＣＡＲの共発現あり（右）、または共発現なし（左）での様々な構築物のＩＬ－２１産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＩＬ－１２産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＩＬ－１５産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＩＬ－２１産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＴＮＦａ産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＩＦＮｇ産生を示す。標的ＨｅｐＧ２細胞との共培養あり（下）または共培養なし（上）での様々な構築物のＩＬ－２産生を示す。ＧＰＣ３ＣＡＲ構築物（「１１０８」）の概略図を示す。フローサイトメトリーによって評価した、様々な構築物と組み合わせたＣＡＲ形質導入特性を示す。様々な構築物で形質導入したＴ細胞で処置したマウスについて、１１、１４、２１、及び２４日目にＢＬＩ測定によって評価した腫瘍サイズを示す。（図１３Ｃ－ＩＬ－１５、図１３Ｄ－ＩＬ－１２、図１３Ｅ－ＩＬ－２１）ウイルスなしでＴ細胞（図１３Ａ－左パネル）またはサイトカインなしでＧＰＣ３－ＣＡＲＴのみ（図１３Ａ－右パネル）を処置した個々のマウスを示す。ＩＬ－１２／ＩＬ－２１共発現アーマリングで操作されたＧＰＣ３－ＣＡＲＴで処置した個々のマウスを示す。ＩＬ－１５アーマリングで操作されたＧＰＣ３－ＣＡＲＴで処置した個々のマウスを示す。ＩＬ－１２アーマリングで操作されたＧＰＣ３－ＣＡＲＴで処置した個々のマウスを示す。ＩＬ－２１アーマリングで操作されたＧＰＣ３－ＣＡＲＴで処置した個々のマウスを示す。処置後３日目（上のパネル）及び１３日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＴＮＦαの産生を示す。処置後３日目（上のパネル）及び１３日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＩＦＮγの産生を示す。処置後３日目（上のパネル）及び１３日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＩＬ－２の産生を示す。処置後３日目（上のパネル）及び１０日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＩＬ－１２の産生を示す。処置後３日目（上のパネル）及び１０日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＩＬ－１５の産生を示す。処置後３日目（上のパネル）及び１０日目（下のパネル）に様々な構築物で処置したマウスの血漿において評価したＩＬ－２１の産生を示す。腫瘍注射後１４日目（Ｔ細胞処置後３日目）における様々な構築物で操作したＴ細胞の腫瘍サイズ（左パネル）及びヒトＴ細胞持続性（右パネル）を示す。腫瘍注射後２１日目（Ｔ細胞処置後１３日目）における様々な構築物で操作したＴ細胞の腫瘍サイズ（左パネル）及びヒトＴ細胞持続性（右パネル）を示す。タモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用する様々なペイロード発現系の概略図を示す。異なる量の４－ＯＨＴでの処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したレポーター発現を示す。異なる量のＮ－デスメチルタモキシフェンでの処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したレポーター発現を示す。異なる量のエンドキシフェンでの処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したレポーター発現を示す。処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したレポーター発現の概要を示す。処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したＣＡＲ発現の概要を示す。処理後の様々なタモキシフェンベースの調節性ＴＦ発現系を使用したＣＡＲ発現のフローサイトメトリープロットを示す。薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用する様々なペイロード発現系の概略図を示す。薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用する様々なペイロード発現系の概略図を示す。様々な薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用するＣＡＲ発現を示す。特定の薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用するレポーター発現を示す。特定の薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用するＣＡＲ発現を示す。特定の薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用するレポーター発現を示す。特定の薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用するＣＡＲ発現を示す。ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（構築物「１８４５」）を使用する薬物誘導型のＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）、ならびにｈＩＬ－１２エフェクター分子ペイロードを駆動する４ｘＢＳｍｉｎＹＢ－ＴＡＴＡＡＣＰ応答性プロモーターを使用する発現カセットの概略図を示す。ＡＣＰベースの調節性発現系を使用したｈＩＬ－１２のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。コラムは、左から右にそれぞれ、薬物なし、０．１μＭＧＲＺ、及び０．５μＭＧＲＺである。ｉｎｖｉｖｏでのＡＣＰベースの調節性発現系を評価するために使用する実験計画を示す。ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系またはＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞の増殖倍数を示す。ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系またはＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞のグルコース特性を示す。ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系またはＡＣＰベースの調節性発現系で操作された循環Ｔ細胞の割合（％）を示す。ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系またはＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞によって産生される、血漿中のｈＩＬ－１２の産生を示す。薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用する様々なペイロード発現系の概略図を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１２のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１５のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。様々な薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系で形質導入したＴ細胞におけるＣＡＲ発現を示す。標的細胞致死（ＬＤＨ放出）によって評価した、様々な薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用したＣＡＲ活性を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系を形質導入したＮＫ細胞によるｈＩＬ－１２のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性ＴＦ発現系を使用する様々なペイロード発現系の概略図を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１２のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１５のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１５のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。様々なグラゾプレビル投与レジメンに対する、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作された血中Ｔ細胞（ｈＣＤ３＋：ｈＣＤ４５＋を生細胞の％として示す）を、経時的に示す（４日目：上部パネル、８日目：中央パネル、１２日目：下部パネル）。^＊２つの群の試料は失われ、分析には含まれていない。様々なグラゾプレビル投薬レジメンに対する、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞によって産生される、４日目の血漿中のｈＩＬ－１２の産生を示す。様々なグラゾプレビル投薬レジメンに対する、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞によって産生される、８日目（左パネル）及び１２日目（右パネル）の血漿中のｈＩＬ－１２の産生を示す。「オン／オフ／オン」グラゾプレビル（Ｇｒｚ）投薬レジメンを示す。「オン／オフ／オン」グラゾプレビル（Ｇｒｚ）投薬レジメンに対する、示した日における、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作された血中Ｔ細胞（ｈＣＤ３＋：ｈＣＤ４５＋を生細胞の％として示す）を、経時的に示す。「オン／オフ／オン」グラゾプレビル（Ｇｒｚ）投薬レジメンに対する、示した日における、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞によって産生される、血漿中のｈＩＬ－１２の産生を、経時的に示す。「オン／オフ／オン」グラゾプレビル（Ｇｒｚ）投薬レジメンに対する、示した日における、ｉｎｖｉｖｏでの構成的ｈＩＬ－１２発現系または薬物誘導性ＡＣＰベースの調節性発現系で操作されたＴ細胞を投与したマウスの体重を、経時的に示す。ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにするプロモーターを評価することを目的としたスクリーニングのワークフローを示す。ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにするプロモーターを対象としたスクリーニングで評価した構築物及び候補プロモーターを示す。ＨｅｐＧ２標的細胞の存在下（右列）または非存在下（左列）での培養の２４時間後に、ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにするプロモーターを対象としたスクリーニングにおいて評価した構築物及び候補プロモーターについての、フローサイトメトリーによる定量化されたｍＫａｔｅ発現を示す。ＨｅｐＧ２標的細胞の存在下（右列）または非存在下（左列）での培養の４８時間後に、ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにするプロモーターを対象としたスクリーニングにおいて評価した構築物及び候補プロモーターについての、フローサイトメトリーによる定量化されたｍＫａｔｅ発現を示す。ＨｅｐＧ２標的細胞（「プロモーター＋標的」）と共に培養してから２４時間後（上部パネル）及び４８時間後（下部パネル）に、ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにする同定されたプロモーターについての、フローサイトメトリーによるｍＫａｔｅ発現のヒストグラムを示す。また、ＨｅｐＧ２標的の非存在下で培養したＣＡＲのみ（「ＣＡＲのみ」）、ＨｅｐＧ２標的の存在下で培養したＣＡＲのみ（「ＣＡＲ＋標的」）、ＨｅｐＧ２標的の非存在下で培養したＣＡＲ＋プロモーター（「プロモーターのみ」）も示す。エルバスビルの存在下または非存在下での様々な濃度のグラゾプレビルでの処理後の様々なＡＣＰベースの調節性発現系で形質導入したＴ細胞によるｈＩＬ－１２のｉｎｖｉｔｒｏ産生を示す。

詳細な説明
定義
請求項及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載するように定義する。

「改善」という用語は、疾患状態、例えば、がんの疾患状態の治療における任意の治療的に有益な結果を指し、その予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、または治癒を含む。

「ｉｎｓｉｔｕ」という用語は、生物とは別個に増殖する、例えば、組織培養において増殖する生細胞内で生じるプロセスを指す。

「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。

本明細書中で使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。

パーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者が利用できる他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査により測定された、最大対応性について比較し、アラインメントされる場合に、同一である特定された割合（％）のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較する配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって、あるいは、比較する２つの配列の全長にわたって存在し得る。

配列を比較するために、通常、１つの配列が基準配列の役割を果たし、被験配列をこれと比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する被験配列（複数可）のパーセント配列同一性を算出する。

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性探求方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装により（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、以下を参照）により実施され得る。

パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。

「十分な量」という用語は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、細胞内でのタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。

「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療有効量は「予防有効量」であり得る。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

操作された核酸及びポリペプチド
細胞治療における薬物発現の調節は、治療効果のウインドウを探り当てるために必要である。任意の望ましいエフェクター分子またはエフェクター分子の組み合わせの発現を駆動することができる調節性転写因子を使用するそのような方法が、本明細書に記載されている。この系は、例えば、ＯＮまたはＯＦＦ構成を可能にするモジュラープロテアーゼ系を使用することにより、細胞内または膜結合タンパク質を調節できるため、用途が広い。ＦＤＡが承認したプロテアーゼスイッチ薬を使用することができ、良好な薬物動態特性で経口投与することができる。さらに、本明細書に記載の方法及び組成物は、例えば、細胞または遺伝子治療における調節された免疫調節エフェクター発現のために使用してもよい。調節可能な転写因子は、例えば、ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＲＮＫ細胞、ＴＣＲＴ細胞、ＴＩＬ療法、ウイルス特異的Ｔ細胞、または他の適切な免疫細胞療法と組み合わせて使用することができる。

一態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び／または抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）、ならびに活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、任意選択で、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第１の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、テトラサイクリン応答性ドメイン（例えば、ＴｅｔＲドメイン）または抑制性プロテアーゼドメイン（例えば、ＮＳ３プロテアーゼ）などの薬物誘導性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは抗原認識受容体であり、受容体は、その同族抗原への結合（「活性化誘導系」）、例えば、同族抗原へのＣＡＲ結合の後に、第２の発現カセットの発現を誘導することができ、ＡＣＰ応答性プロモーターは、ＣＡＲシグナル伝達に応答して第２の発現カセットの発現を駆動することができるプロモーター配列を含む。

一態様では、本明細書において、（ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

一態様では、本明細書において、第１のプロモーターと、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびに活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された核酸を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在しない。第２の発現カセットの発現は、ＡＣＰ応答性プロモーターへのＡＣＰ結合によって誘導することができる。ＡＣＰは、抗原認識受容体などの受容体であり得、同族リガンド（例えば、同族抗原）へのＡＣＰ結合時に、第２の発現カセットの発現、例えば、ＡＣＰ応答性プロモーターからの発現を誘導するリガンド結合の後の下流シグナル伝達を誘導し得る。非限定的な例示的な例では、ＡＣＰはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得、同族受容体へのＣＡＲ結合時に、下流シグナル伝達（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞受容体シグナル伝達）が、標的抗原のＣＡＲ結合に特異的なＡＣＰ応答性プロモーターからのサイトカインペイロードの発現を誘導し得る（例えば、サイトカインアーマリング）。活性化誘導系に有用なＡＣＰ応答性プロモーターの例を以下に記載する（「プロモーター」を参照のこと）。

Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上であり得る。

いくつかの実施形態では、単一の操作された核酸は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の発現カセットを含む。一般的に、各発現カセットは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを指す。例えば、ＡＣＰ、エフェクター分子、及び抗原認識受容体のそれぞれは、同じ操作された核酸（例えば、ベクター）上の別個の発現カセットによってコードされ得る。発現カセットは、互いに対して任意の方向に向けることができる（例えば、カセットを、同じ向きまたは反対の向きにすることができる）。３つ以上の発現カセットを有する例示的な操作された核酸では、カセットを、同じ方向または混成の方向（例えば、第１及び第２のカセットを同じ方向にすることができ、一方で第３のカセットを反対の方向にする）にすることができる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットに対して同じ方向に局在している。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットに対して反対の方向に局在している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の操作された核酸は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の発現カセットを含み得る。２つ以上の操作された核酸を含む調節されたアーマリングのための戦略は、「操作された発現系」と呼ばれ得る。一態様では、本明細書において、（ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびに（２）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む操作された発現系を提供し、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。発現系のいくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる。発現系のいくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、同じポリヌクレオチド配列によってコードされる。発現系のいくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。発現系のいくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。発現系のいくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含む。発現系のいくつかの実施形態では、操作された発現系は、追加のプロモーター及び抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列を含む追加の発現カセットをさらに含み、追加のプロモーターは追加の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。発現系のいくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第１の発現カセットまたは第２の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。発現系のいくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第１の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。発現系のいくつかの実施形態では、追加の外来性ポリヌクレオチド配列は、第２の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされる。発現系のいくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセット及び存在する場合は追加の発現カセットを含み、第２のベクターは、第２の発現カセットを含む。発現系のいくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセットを含み、第２のベクターは、第２の発現カセット及び存在する場合は追加の発現カセットを含む。発現系のいくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含み、第２のベクターは、存在する場合は追加の発現カセットを含む。

発現系の例示的な非限定的な例として、（１）抗原認識受容体発現カセット及びエフェクター分子発現カセットは、第１の操作された核酸によってコードされ得、ＡＣＰ発現カセットは、第２の操作された核酸によってコードされ得；（２）ＡＣＰ発現カセット及びエフェクター分子発現カセットは、第１の操作された核酸によってコードされ得、抗原認識受容体発現カセットは、第２の操作された核酸によってコード化され得；（３）ＡＣＰ発現カセット及び抗原認識受容体発現カセットは、第１の操作された核酸によってコードされ得、エフェクター分子発現カセットは、第２の操作された核酸によってコード化され得る。追加の例示的な非限定的な例において、エフェクター分子発現カセットは、第１の操作された核酸によってコードされ得、ＡＣＰ発現カセットは、第２の操作された核酸によってコード化され得る。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、マルチシストロン性であり得、すなわち、複数の別個のポリペプチド（例えば、複数の外来性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子）が単一のｍＲＮＡ転写産物から産生され得る。例えば、マルチシストロン性発現カセットは、ＡＣＰ及び抗原認識受容体の両方をコードすることができ、例えば、両方が、構成的プロモーターによって駆動される単一の発現カセットから発現する。別の例では、マルチシストロン性発現カセットは、エフェクター分子と抗原認識受容体の両方をコードすることができ、例えば、両方が、ＡＣＰ応答性プロモーターによって駆動される単一の発現カセットから発現する。発現カセットは、様々なリンカーを使用することによりマルチシストロン性とすることができ、例えば、第１の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、第２の目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結することができる（例えば、５’から３’方向に、第１の遺伝子：リンカー：第２の遺伝子）。マルチシストロンの特徴及びオプションについては、「マルチシストロン及び多重プロモーター系」の節に記載する。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びネイキッドプラスミドから選択される。本明細書において、操作された核酸を含む発現ベクターも提供する。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、インシュレーターをさらに含む。インシュレーターは、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在させることができる。インシュレーターは、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在させることができ、その場合、両方のカセットは、互いに同じ向きである。インシュレーターは、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間に局在させることができ、その場合、カセットは、互いに反対の向きである。インシュレーターは、エンハンサー遮断またはバリア機能を有するシス調節エレメントである。エンハンサー－ブロッカーインシュレーターは、エンハンサーが近位の遺伝子のプロモーターに作用することを遮断する。バリアインシュレーターは、ユークロマチンのサイレンシングを防止する。本開示の好適なインシュレーターの例は、ＬｉｕＭ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｆｅｂ；３３（２）：１９８－２０３に記載されているＡ２インシュレーターである。さらなるインシュレーターは、Ｗｅｓｔｅｔａｌ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ，００２．１６：２７１－２８８に記載されており、これらはいずれもその全体が参照により援用される。好適なインシュレーターの他の例として、Ａ１インシュレーター、ＣＴＣＦインシュレーター、ジプシーインシュレーター、ＨＳ５インシュレーター、及びｃＨＳ４などのβ－グロビン遺伝子座インシュレーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、インシュレーターは、Ａ２インシュレーター、Ａ１インシュレーター、ＣＴＣＦインシュレーター、ＨＳ５インシュレーター、ジプシーインシュレーター、β－グロビン遺伝子座インシュレーター、またはｃＨＳ４インシュレーターである。インシュレーターは、Ａ２インシュレーターであり得る。

活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）
いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写モジュレーターである。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写抑制因子である。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写活性化因子である。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、転写因子である。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写エフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ジンクフィンガー含有転写因子である。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー含有転写因子は、合成転写因子であってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＣＰのＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及びエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、テトラサイクリン（またはその誘導体）リプレッサー（ＴｅｔＲ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、本開示の抗原認識受容体である。

ジンクフィンガータンパク質ドメイン
いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュール式の設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなる。ジンクフィンガーアレイは、互いに連結された複数のジンクフィンガータンパク質モチーフを含む。各ジンクフィンガーモチーフは、異なる核酸モチーフに結合する。これにより、任意の所望の核酸配列に特異的なＺＦＡが得られる。ＺＦモチーフは、互いに直接隣接させることも、柔軟なリンカー配列によって分離することもできる。いくつかの実施形態では、ＺＦＡは、タンデムに配置されたＺＦモチーフのアレイ、ストリング、または鎖である。ＺＦＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１、３、１４、または１５個のジンクフィンガーモチーフを有し得る。ＺＦＡは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、または５～１５個のジンクフィンガーモチーフを有し得る。

ＺＦタンパク質ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のＺＦＡを有し得る。ＺＦドメインは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、または５～１５個のＺＦＡを有し得る。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のＺＦＡ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１つのＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも２つのＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも３つのＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも４つのＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも５つのＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１０個のＺＦＡを含む。

例示的なＺＦタンパク質ドメインを、配列ＳＲＰＧＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＲＨＧＬＤＲＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＳＬＫＲＨＬＲＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＮＬＳＲＨＬＫＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＳＳＬＶＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＥＳＧＨＬＫＲＨＬＲＴＨＬＲＧＳ（配列番号８８）に示す。

ＡＣＰエフェクタードメイン
ＡＣＰはまた、転写エフェクタードメインなどのエフェクタードメインをさらに含み得る。例えば、転写エフェクタードメインは、転写因子のエフェクタードメインまたは活性化ドメインであり得る。転写因子活性化ドメインは、トランス活性化ドメインとしても知られており、遺伝子の転写を活性化または抑制するように作用する転写共調節因子などのタンパク質の骨格ドメインとして機能する。任意の好適な転写エフェクタードメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーからなる活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（トリパータイト活性化因子は、ＶＰＲ活性化ドメインとして知られる）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメインとして知られる）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されないＡＣＰにおいて使用され得る。

いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーからなる活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（トリパータイト活性化因子は、ＶＰＲ活性化ドメインとして知られる）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメインとして知られる）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインから選択される転写エフェクタードメインである。

例示的な転写エフェクタードメインタンパク質配列を表８に示す。例示的な転写エフェクタードメインヌクレオチド配列を表９に示す。

薬物誘導性ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、小分子（例えば、薬物）誘導性ポリペプチドである。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、テトラサイクリン（またはその誘導体）によって誘導され得、ＴｅｔＲドメイン及びＶＰ１６エフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、タモキシフェン、またはその代謝産物、例えば、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）によって誘導され得、ＥＲＴ２などのエストロゲン受容体バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抑制性プロテアーゼ、及び抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位を含む、小分子（例えば、薬物）誘導性ポリペプチドである。

本明細書で使用される「抑制性プロテアーゼ」という用語は、特定の薬剤（例えば、プロテアーゼに結合する）の存在または非存在によって不活性化され得るプロテアーゼを指す。いくつかの実施形態では、抑制性プロテアーゼは、特定の薬剤の非存在下で活性であり（同族切断部位を切断する）、特定の薬剤の存在下で不活性である（同族切断部位を切断しない）。いくつかの実施形態では、特定の薬剤はプロテアーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、本開示の所与の抑制性プロテアーゼを特異的に阻害する。

抑制性プロテアーゼの非限定的な例として、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ（例えば、ＮＳ３及びＮＳ２－３）；シグナルペプチダーゼ；サブチリシン／ケキシンファミリーのプロタンパク質コンバターゼ（フューリン、ＰＣＩ、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５、ＰＣ）；疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＭｅｔ）で切断するプロタンパク質コンバターゼ；ＡｌａまたはＴｈｒなどの小さなアミノ酸残基で切断するプロタンパク質コンバターゼ；プロオピオメラノコルチン変換酵素（ＰＣＥ）；クロマフィン顆粒アスパラギン酸プロテアーゼ（ＣＧＡＰ）；プロホルモンチオールプロテアーゼ；カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＥ／Ｈ、カルボキシペプチダーゼＤ及びカルボキシペプチダーゼＺ）；アミノペプチダーゼ（例えば、アルギニンアミノペプチダーゼ、リジンアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＢ）；プロリルエンドペプチダーゼ；アミノペプチダーゼＮ；インスリン分解酵素；カルパイン；高分子量プロテアーゼ；及び、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、及び９が挙げられる。他のプロテアーゼとして、アミノペプチダーゼＮ；ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ；アンジオテンシン変換酵素；ピログルタミルペプチダーゼＩＩ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；Ｎ－アルギニン二塩基性コンバターゼ；エンドペプチダーゼ２４．１５；エンドペプチダーゼ２４．１６；アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼα、β及びγ；アンジオテンシン変換酵素セクレターゼ；ＴＧＦαセクレターゼ；ＴＦαセクレターゼ；ＦＡＳリガンドセクレターゼ；ＴＮＦ受容体－Ｉ及び－ＩＩセクレターゼ；ＣＤ３０セクレターゼ；ＫＬ１及びＫＬ２セクレターゼ；ＩＬ６受容体セクレターゼ；ＣＤ４３、ＣＤ４４セクレターゼ；ＣＤ１６－１及びＣＤ１６－１１セクレターゼ；Ｌ－セレクチンセクレターゼ；葉酸受容体セクレターゼ；ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５；ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；組織プラスミノーゲン活性化因子；プラスミン；トロンビン；ＢＭＰ－Ｉ（プロコラーゲンＣ－ペプチダーゼ）；ＡＤＡＭ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１；ならびに、グランザイムＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼの検討については、例えば、Ｖ．Ｙ．Ｈ．Ｈｏｏｋ，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅａｎｄｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＲＧＬａｎｄｅｓＣｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ（１９９８）、Ｎ．Ｍ．Ｈｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２６５－２７９（１９９７）、Ｚ．Ｗｅｒｂ，Ｃｅｌｌ９１：４３９－４４２（１９９７）；Ｔ．Ｇ．Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３１：２７５－２７８（１９９５）、Ｋ．ＭｕｒａｋａｍｉａｎｄＪ．Ｄ．Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４６：１２４９－１２５９（１９８７）、Ｔ．Ｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７：３１３－３２６（１９９５）、Ｍ．Ｊ．ＳｍｙｔｈａｎｄＪ．Ａ．Ｔｒａｐａｎｉ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１６：２０２－２０６（１９９５）；Ｒ．Ｖ．Ｔａｌａｎｉａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９６７７－９６８２（１９９７）、及びＮ．Ａ．Ｔｈｏｍｂｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７９０７－１７９１１（１９９７）を参照されたい（これらの開示は本明細書に援用される）。

本明細書中で使用する「同族切断部位」という用語は、抑制性プロテアーゼによって認識され、切断される特定の配列または配列モチーフを指す。プロテアーゼの切断部位は、タンパク質分解切断中にプロテアーゼによって認識される特定のアミノ酸配列またはモチーフを含み、典型的には、プロテアーゼの活性部位に結合し、基質として認識するために使用される、被切断結合のいずれかの側の周囲の１～６個のアミノ酸を含む。

上記及び表１に記載されているものを含む他のプロテアーゼを使用することができる。プロテアーゼが選択される場合、その同族切断部位、及びそのプロテアーゼに結合し、阻害することが当技術分野において公知であるプロテアーゼ阻害剤を組み合わせて使用することができる。使用のための例示的な組み合わせを、以下の表１に示す。プロテアーゼの代表的な配列は、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇウェブサイトを通してＵｎｉＰｒｏｔを含む公的なデータベースから入手可能である。プロテアーゼのＵｎｉＰｒｏｔ登録番号も以下の表１に示す。

いくつかの実施形態では、抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位は、ＡＣＰのＤＮＡ結合ドメインとエフェクタードメインの間に局在化している。いくつかの実施形態では、抑制性プロテアーゼは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）である。いくつかの実施形態では、同族切断部位は、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位は、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合点切断部位を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＳ３プロテアーゼは、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得る。シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の好適なプロテアーゼ阻害剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルから選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビルである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、グラゾプレビルとエルバスビル（Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａ複製複合体のＮＳ５Ａ阻害剤）の組み合わせである。グラゾプレビル及びエルバスビルは、錠剤形態（例えば、商品名Ｚｅｐａｔｉｅｒ（登録商標）で入手可能な錠剤）などの医薬組成物として共製剤化することができる。グラゾプレビル及びエルバスビルは、それぞれ２：１の重量比で、例えば、１００ｍｇのグラゾプレビル、５０ｍｇのエルバスビルの単位用量で（例えば、商品名Ｚｅｐａｔｉｅｒ（登録商標）で入手可能な錠剤のように）共製剤化することができる。例えば、以下の一般式（Ｉ）を有するいずれかの、グラゾプレビルと構造的に類似したプロテアーゼ阻害剤を使用することができ、

式中、

は、以下からなる群から選択される１つ以上の環であり：

Ｒ^１は、－ＣＯ_２Ｒ^１０及び－ＣＯＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^６からなる群から選択され；Ｒ^２は－ＣＨ＝ＣＨ_２であり；Ｒ^３はＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；Ｒ^６はＣ_３シクロアルキルであり；Ｙは、－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され；Ｚは直接結合であり；Ｍは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレン及びＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンからなる群から選択され、Ｍは、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル及び＝ＣＨ_２からなる群から独立して選択される１～２個の置換基Ｆで置換され；Ｘは、－（ＣＨ_２）_０－３Ｏ－からなる群から選択され、存在する場合、

は－（ＣＨ_２）_０－３に結合され、各Ｒ^１０は、独立してＨである。グラゾプレビル、エルバスビル、及びそれらの組み合わせは、米国特許第９，７３８，６６１号；第７，９７３，０４０号；及び第８，８７１，７５９号及び米国特許公開第ＵＳ２０１６０２４３１２８号に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、本開示のＡＣＰは、エストロゲン受容体の小分子（例えば、薬物）誘導性ホルモン結合ドメイン（ＥＲＴ２ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＴ２ドメインは、タモキシフェン及びその代謝産物に結合するが、エストラジオールには結合しないエストロゲン受容体バリアントである。タモキシフェン代謝産物の非限定的な例として、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、細胞内で、かつ小分子（例えば、タモキシフェンまたはその代謝産物）の非存在下で発現する場合、ＥＲＴ２ドメインを含むＡＣＰは、ＨＳＰ９０に結合し、細胞の細胞質において維持される。いくつかの実施形態では、小分子（例えば、タモキシフェンまたはその代謝産物）の導入時に、小分子は、ＥＲＴ２ドメインに結合したＨＳＰ９０を置換し、これにより、ＥＲＴ２ドメインを含むＡＣＰが細胞の核に移動することが可能になる。

したがって、いくつかの実施形態では、ＥＲＴ２ドメインを含む本開示のＡＣＰは、ＥＲＴ２ドメインがタモキシフェンまたはその代謝産物に結合すると核局在化を受けることができる。いくつかの実施形態では、タモキシフェン代謝産物は、４－ヒドロキシ－タモキシフェン（４－ＯＨＴ）、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンから選択される。

分解配列及びデグロン
いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、デグロンをさらに含み、デグロンは、作動可能にＡＣＰに連結されている。いくつかの実施形態では、デグロンは、抑制性プロテアーゼの５’、抑制性プロテアーゼの３’、ＤＮＡ結合ドメインの５’、ＤＮＡ結合ドメインの３’、エフェクタードメインの５’、またはエフェクタードメインの３’に局在している。

本明細書中で使用する「デグロン」「デグロンドメイン」という用語は、タンパク質分解速度の調節で重要であるタンパク質またはその一部を指す。本開示の様々な実施形態において、短いアミノ酸配列、構造モチーフ、及び露出したアミノ酸を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々なデグロンを使用することができる。様々な生物から同定されたデグロンを使用することができる。デグロン及びデグロン経路は一般に知られており、例えば、ＶａｒｓｈａｚｓｋｙＡ．，ＰＮＡＳ２０１９Ｊａｎ８；１１６（２）：３５８－３６６（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。

本明細書中で使用する「分解配列」という用語は、プロテアソームまたはオートファジー－リソソーム経路のいずれかを通じて、結合したタンパク質の分解を促進する配列を指す。当技術分野で公知の分解配列を、本開示の様々な実施形態に使用することができる。いくつかの実施形態では、分解配列は、生物から同定されたデグロン、またはその改変体を含む。いくつかの実施形態では、分解配列は、タンパク質に融合させた場合に、タンパク質の半減期が少なくとも２倍減少するように、タンパク質を不安定化するポリペプチドである。多くの異なる分解配列／シグナル（例えば、ユビキチン－プロテアソーム系の）が当技術分野で公知であり、本明細書中で提供するように、これらのいずれかを使用してもよい。分解配列は、細胞受容体に作動可能に連結させてもよいが、分解配列が依然として細胞受容体の分解を誘導するように機能する限り、それと隣接させる必要はない。いくつかの実施形態では、分解配列は、細胞受容体の急速な分解を誘導する。タンパク質分解における分解配列及びそれらの機能の考察については、例えば、Ｋａｎｅｍａｋｉｅｔａｌ．（２０１３）ＰｆｌｕｇｅｒｓＡｒｃｈ．４６５（３）：４ｌ９－４２５、Ｅｒａｌｅｓｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１８４３（ｌ）：２１６－２２１、Ｓｃｈｒａｄｅｒｅｔａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：８１５－８２２、Ｒａｖｉｄｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（９）：６７９－６９０、Ｔａｓａｋｉｅｔａｌ．（２００７）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．３２（１１）：５２０－５２８、Ｍｅｉｎｎｅｌｅｔａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８７（７）：８３９－８５１、Ｋｉｍｅｔａｌ．（２０１３）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ９（７）：１１００－１１０３、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８３２：１－１１、及びＦａｙａｄａｔｅｔａｌ．（２００３）ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ．１４（３）：１２６８－１２７８を参照されたい；（参照により本明細書に援用される）。

いくつかの実施形態では、デグロンまたは分解配列は、ＨＣＶＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の２つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２及びＮＢのタンデムリピート（ＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の４つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ１及びＳＰ２のタンデムリピート（ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の３つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３Ａ及びＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２及びＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存性デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスから選択される。

いくつかの実施形態では、デグロンは、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合することができ、それによってユビキチン経路を介したＡＣＰの分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合が可能な、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳＥ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７、及びＺＮ８２７、またはそれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である。いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号１３１）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である。

いくつかの実施形態では、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＦＤＡ承認薬である。いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドから選択される。

プロモーター
いくつかの実施形態では、本開示の操作された核酸は、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする外来性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作された核酸は、１つ以上のエフェクター分子をコードする第２の外来性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＡＣＰ応答性プロモーターを含む第２の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットはそれぞれ、本開示の別個の操作された核酸によってコードされる。他の実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、本開示の同じ操作された核酸によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＡＣＰ応答性プロモーターは、ＡＣＰ結合ドメイン及びプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されたＡＣＰ応答性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも２つのエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されたＡＣＰ応答性プロモーターを含む。例えば、操作された核酸は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されたＡＣＰ応答性プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、操作された核酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモーターを含む。

「プロモーター」は、核酸配列の残りの部分の転写の開始及び速度を制御する、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの制御性タンパク質及び分子が結合し得るサブ領域も含み得る。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異的、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、それが制御する核酸配列の発現または転写を駆動する。本明細書において、プロモーターは、それがその配列の転写開始及び／または発現を制御（「駆動」）するために調節する核酸配列に関して正しい機能的位置及び方向にある場合、「作動可能に連結されている」と見なされる。

プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得るように、遺伝子または配列に天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは「内在性」と称され得る。いくつかの実施形態では、コード核酸配列は、組換えまたは異種プロモーターの制御下に配置され得、これは、その天然の環境においてコード化された配列と通常は関連しないプロモーターを指す。そのようなプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；ならびに例えば、当技術分野で公知の遺伝子工学の方法を通じて発現を操作する異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／または変異を含むものなど、「天然」ではない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、組換えクローニング及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。

本開示の操作された核酸のプロモーターは、「誘導性プロモーター」であってもよく、これは、シグナルの存在下であるか、シグナルによる影響を受けるか、またはシグナルと接触した場合に、転写活性を調節する（例えば、開始または活性化する）ことを特徴とするプロモーターを指す。シグナルは、誘導性プロモーターからの転写活性の調節において活性であるような様式で誘導性プロモーターと接触する、内在性もしくは通常は外来性の条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学物質もしくは非化学物質）またはタンパク質（例えば、サイトカイン）であってもよい。転写の活性化は、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモーターが転写を駆動することを妨げている抑制因子を不活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含み得る。逆に、転写の非活性化は、転写を防ぐためにプロモーターに直接的に作用すること、または次にプロモーターに作用する抑制因子を活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含み得る。

プロモーターは、局所腫瘍状態（例えば、炎症または低酸素症）またはシグナルの存在下でプロモーターからの転写が活性化、非活性化、増加、または減少する場合、その状態またはシグナルに「応答」または「調節」される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、応答エレメントを含む。「応答エレメント」は、プロモーターからの遺伝子発現を調節（制御）する特定の分子（例えば、転写因子）と結合するプロモーター領域内のＤＮＡの短い配列である。本開示に従って使用され得る応答エレメントとして、限定されないが、フロレチン調節可能制御エレメント（ＰＥＡＣＥ）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、インターフェロンγ活性化配列（ＧＡＳ）（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔ．ｅｔａｌ．ＪＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１９９７Ｍａｒ；１７（３）：１２１－３４、参照により本明細書に援用される）、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）（Ｈａｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００４Ａｐｒ９；２７９（１５）：１５６５２－６１、参照により本明細書に援用される）、ＮＦ－κＢ応答エレメント（Ｗａｎｇ，Ｖ．ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ．２０１２；２（４）：８２４－８３９、参照により本明細書に援用される）、及びＳＴＡＴ３応答エレメント（Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ｅｔａｌ．ＪｏｆＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９６；２７１：９５０３－９５０９、参照により本明細書に援用される）が挙げられる。他の応答エレメントは本明細書に包含される。応答エレメントは、その同族結合分子に対する応答エレメントの感受性を一般的に増強するためにタンデムリピート（例えば、応答エレメントをコードする同じヌクレオチド配列の連続した繰り返し）を含むこともできる。タンデムリピートは、２×、３×、４×、５×などと表記して、存在するリピートの数を示すことができる。

応答性プロモーター（「誘導性プロモーター」とも称される）（例えば、ＴＧＦ－β応答性プロモーター）の非限定的な例を表２に示し、これは、プロモーター及び転写因子の設計、ならびに転写因子（ＴＦ）及び導入遺伝子転写（Ｔ）に対する誘導因子分子の効果を示す（Ｂ：結合、Ｄ：解離、ｎ．ｄ．：未決定）（Ａ：活性化、ＤＡ：非活性化、ＤＲ：抑制解除）（Ｈｏｒｎｅｒ，Ｍ．＆Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ５８６（２０１２）２０７８４－２０９６ｍ、及びそこに引用される参考文献を参照されたい）。誘導性プロモーターの他の非限定的な例として、表３に示すものが挙げられる。

プロモーターの他の非限定的な例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）プロモーター、伸長因子（ＥＦＳ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う改変ＭｏＭｕＬＶＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、及びユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。例示的な構成的プロモーターを表４に示す。

いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートから選択されるプロモーターに由来する。

いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、合成プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、最小プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む。ＡＣＰ結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のジンクフィンガー結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、１つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、２つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、３つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ結合ドメインは、４つのジンクフィンガー結合部位を含む。ジンクフィンガー結合部位を含む例示的なＡＣＰ結合ドメインを、配列ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａｔｔｃｇｔａａｇａｇｇｃｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｔｔａｃａｃｇｇａｇｔｇｇａｔａＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号９２）に示す。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、抗原認識受容体が同族の抗原、例えば、標的細胞上で発現する抗原と結合する場合に転写を促進するエンハンサーを含む。エンハンサーには、活性化Ｔ細胞のＡＴＡＣ－ｓｅｑ（Ｇａｔｅｅｔａｌ．ＮａｔＧｅｎｅｔ．Ａｕｔｈｏｒｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ；ＰＭＣ２０１９Ｊａｎ９で入手可能、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）において富化されたエンハンサーまたは単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータ（Ｘｈａｎｇｏｌｌｉｅｔａｌ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１９Ａｐｒ；１７（２）：１２９－１３９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｐｂ．２０１９．０３．００２；あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）における上方制御される遺伝子に関連するエンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。エンハンサーは、合成エンハンサー、例えば、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞で上方制御されることが知られているか、または予測されている転写因子のペアであり得る。合成エンハンサーは、転写因子結合部位の複数の反復、例えば、ａａａａｂｂｂｂまたはａｂａｂａｂａｂ組成における２つの異なる転写因子結合部位の４回の反復を含み得る。エンハンサーを誘導することができる遺伝子の例示的な非限定的な例として、ＡＴＦ２、ＡＴＦ７、ＢＡＣＨ１、ＢＡＴＦ、Ｂｃｌ－６、Ｂｌｉｍｐ－１、ＢＭＩ１、ＣＢＦＢ、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＭ、ＣＴＣＦ、Ｅ２Ｆ１、ＥＢＦ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＯＳ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ３、ＨＩＦ１Ａ、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、Ｌｅｆ１、ＮＦＡＴ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ、ＮＲ２Ｆ１、Ｎｕｒ７７、ＰＵ．１、ＲＥＬＡ、ＲＵＮＸ３、ＳＣＲＴ１、ＳＣＲＴ２、ＳＰ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、Ｔ－Ｂｅｔ、Ｔｃｆ７、ＺＢＥＤ１、ＺＮＦ１４３、またはＺＮＦ２１７が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、活性化誘導系などにおいて、受容体が同族のリガンドと結合する場合に転写を促進するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、抗原認識受容体が同族の抗原、例えば、標的細胞上で発現する抗原と結合する場合に転写を促進するプロモーターを含む。例えば、ＡＣＰが抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）である場合、ＡＣＰ応答性プロモーターは、同族の抗原に結合する抗原受容体に続くシグナル伝達によって誘導されるプロモーターを含み得る。ＡＣＰ応答性プロモーターには、活性化Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞で転写活性が増加したプロモーターが含まれる。ＡＣＰ応答性プロモーターには、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞などの活性化細胞において上方制御される遺伝子に由来するプロモーターが含まれ得る。ＡＣＰ応答性プロモーターには、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞などの活性化細胞において転写因子の結合が増加している遺伝子に由来するプロモーターが含まれ得る。誘導されたプロモーターには、遺伝子の２ｋｂ上流のゲノム領域が含まれ得る。誘導されたプロモーターには、遺伝子の転写開始部位の－１００ｂｐ下流のゲノム領域が含まれ得る。誘導されたプロモーターには、遺伝子の２ｋｂｐ上流～遺伝子の転写開始部位の－１００ｂｐ下流のゲノム領域が含まれ得る。誘導されたプロモーターには、遺伝子の翻訳開始部位の上流のゲノム領域が含まれ得る。誘導されたプロモーターには、遺伝子の翻訳開始部位の２ｋｂ上流のゲノム領域が含まれ得る。誘導されたプロモーターには、プロモーター領域で同定された１つ以上のエンハンサーが含まれ得る。ＡＣＰ応答性プロモーターには、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、またはＭＴＡ２遺伝子に由来するプロモーターが含まれ得るが、これらに限定されない。ＡＣＰ応答性プロモーターには、ＣＣＬ３プロモーター領域（例えば、配列番号１５６）、ＣＣＬ４プロモーター領域（例えば、配列番号１５７）、及び／またはＭＴＡ２プロモーター領域（例えば、配列番号１５８）が含まれ得るが、これらに限定されない。ＡＣＰ応答性プロモーターには、ＣＣＬ３プロモーター領域（例えば、配列番号１５６）、ＣＣＬ４プロモーター領域（例えば、配列番号１５７）、及び／またはＭＴＡ２プロモーター領域（例えば、配列番号１５８）に存在するエンハンサーが含まれ得る。ＡＣＰ応答性プロモーターには、合成プロモーターが含まれ得る。例えば、ＡＣＰ応答性プロモーターには、最小プロモーター（例えば、最小ＡｄｅＰまたはＹＢ－ＴＡＴＡ）などの他のプロモーターと組み合わされた抗原誘導エンハンサーまたはプロモーター配列が含まれ得る。ＡＣＰ応答性プロモーターには、合成エンハンサー、例えば、転写因子結合部位の複数の反復を含むプロモーターが含まれ得る。例示的な非限定的な例では、合成プロモーターを含むＡＣＰ応答性プロモーターには、最小のＡｄｅプロモーター（５× ＮＦＡＴ＿ｉｎＡｄｅＰ）と組み合わせて、ＮＦＡＴ転写因子結合部位の５回の反復を含ませることができる。

マルチシストロン及び多重プロモーター系
いくつかの実施形態では、操作された核酸を、複数のエフェクター分子を産生するように構成する。例えば、核酸を、２～２０個の異なるエフェクター分子を産生するように構成してもよい。いくつかの実施形態では、核酸を、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１９、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１３、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１９、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２０、５～１９、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～２０、６～１９、６～１８、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～２０、７～１９、７～１８、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、７～８、８～２０、８～１９、８～１８、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、８～９、９～２０、９～１９、９～１８、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、９～１０、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１０～１２、１０～１１、１１～２０、１１～１９、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１１～１２、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～２０、１３～１９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１３～１４、１４～２０、１４～１９、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１４～１５、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１５～１６、１６～２０、１６～１９、１６～１８、１６～１７、１７～２０、１７～１９、１７～１８、１８～２０、１８～１９、または１９～２０個のエフェクター分子を産生するように構成する。いくつかの実施形態では、核酸を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のエフェクター分子を産生するように構成する。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、マルチシストロン性であり得、すなわち、複数の別個のポリペプチド（例えば、複数の外来性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子）が単一のｍＲＮＡ転写産物から産生され得る。操作された核酸は、様々なリンカーを使用することによりマルチシストロン性であり得、例えば、第１の外来性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を、第２の外来性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に連結することができる（例えば、５’から３’方向に、第１の遺伝子：リンカー：第２の遺伝子）。リンカーポリヌクレオチド配列は、Ｔ２Ａなどの２Ａリボソームスキッピングエレメントをコードし得る。他の２Ａリボソームスキッピングエレメントとして、限定されないが、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａが挙げられる。２Ａリボソームスキッピングエレメントは、翻訳中に第１及び第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドの産生を可能にする。リンカーは、フューリン切断部位またはＴＥＶ切断部位などの切断可能リンカーポリペプチド配列をコードすることができ、発現に続いて、切断可能リンカーポリペプチドは、第１及び第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドが産生されるように切断される。切断可能リンカーは、切断をさらに促進する、柔軟性リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）などのポリペプチド配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、第２の発現カセットが（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌ_１リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している。

リンカーは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードすることができ、翻訳中に第１及び第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドが産生される。リンカーは、ウイルススプライス受容部位などのスプライス受容部位をコードすることができる。

リンカーは、２Ａリボソームスキッピングとそれに続く２Ａ残基の完全な除去を可能にするためのフューリン部位のさらなる切断を通じて別個のポリペプチドを産生することができる、フューリン－２Ａリンカーなどのリンカーの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーの組み合わせは、フューリン配列、柔軟性リンカー、及び２Ａリンカーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－２Ａ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔ２Ａ融合ポリペプチドである。

一般に、マルチシストロン系は、任意の数または組み合わせのリンカーを使用して、任意の数の遺伝子またはその部分を発現することができる（例えば、操作された核酸は、第１、第２、及び第３のエフェクター分子によってコードされる別個のポリペプチドが産生されるように、各々がリンカーによって分離される第１、第２、及び第３のエフェクター分子をコードすることができる）。

本明細書中で使用する「リンカー」は、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列とを連結するポリペプチド、または上記のマルチシストロン性リンカーを指し得る。

エフェクター分子
当技術分野で公知の任意の好適なエフェクター分子が、操作された核酸によってコードされるか、または操作された細胞によって発現され得る。好適なエフェクター分子は、構造の類似性、配列の類似性、または機能に基づいて治療クラスにグループ化することができる。エフェクター分子の治療クラスには、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、各エフェクター分子は、独立して、治療クラスから選択され、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素から選択される。

いくつかの実施形態では、エフェクター分子はケモカインである。ケモカインは、細胞によって分泌される小さなサイトカインまたはシグナル伝達タンパク質であり、細胞内で定向性の走化性を誘導することができる。ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ及びＸＣの４つの主要なサブファミリーに分類することができ、これらのすべてが、標的細胞の表面上に位置するケモカイン受容体と選択的に結合することにより生物学的効果を発揮する。本開示の操作された核酸によってコードされ得るケモカインの非限定的な例として、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１から選択される。

いくつかの実施形態では、エフェクター分子はサイトカインである。本開示の操作された核酸によってコードされ得るサイトカインの非限定的な例として、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αから選択される。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つのホーミング分子を生成するように構成される。「ホーミング」は、標的部位（例えば、細胞、組織（例えば、腫瘍）、または器官）への細胞の能動的ナビゲーション（遊走）を指す。「ホーミング分子」は、細胞を標的部位に向かわせる分子を指す。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、標的部位への操作された細胞の相互作用を認識及び／または開始するように機能する。ホーミング分子の非限定的な例として、ＣＸＣＲ１、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＦＰＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＳＣＲ７、ＰＤＧＦＲ、抗インテグリンα４β７；抗ＭＡｄＣＡＭ；ＣＣＲ９；ＣＸＣＲ４；ＳＤＦ１；ＭＭＰ－２；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ７；ＣＣＲ２；ＣＣＲ４；及びＧＰＲ１５、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、抗インテグリンα４β７；抗ＭＡｄＣＡＭ；ＣＣＲ９；ＣＸＣＲ４；ＳＤＦ１；ＭＭＰ－２；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ７；ＣＣＲ２；ＣＣＲ４；及びＧＰＲ１５から選択される。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つの成長因子を生成するように構成される。エフェクター分子としての使用に好適な成長因子として、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つの共活性化分子を生成するように構成される。エフェクター分子としての使用に好適な共活性化分子として、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、共活性化分子は、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌから選択される。

「腫瘍微小環境」は、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、腫瘍が存在する細胞環境である（例えば、Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ，Ｄ．Ｒ．＆Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ１３，４９７－５１２（２０１４）、Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．Ｒ．ｅｔａｌ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ１２５，５５９１－５５９６，２０１２、及びＬｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ１０１（４），８０５－１５，２００７を参照されたい）。エフェクター分子としての使用に好適な腫瘍微小環境改変因子として、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２、またははそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境改変因子は、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２から選択される。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つのＴＧＦβ阻害剤を生成するように構成される。エフェクター分子としての使用に好適なＴＧＦβ阻害剤として、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を生成するように構成される。エフェクター分子としての使用に好適な免疫チェックポイント阻害剤として、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗－ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭＩ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭＩ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体から選択される。

例示的な免疫チェックポイント阻害剤として、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１；ＭＫ－３４７５／Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（抗ＰＤ－１；Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）－ＢＭＳ）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１抗体；ＣＴ－０１１－Ｔｅｖａ／ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤ－１；ＮＣＩ）、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）－Ｐｆｉｚｅｒ）、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；ＭＥＤＩ４７３６／Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）－Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤ－Ｌ１－ＢＭＳ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）－ＢＭＳ）、リリルマブ（抗ＫＩＲ；ＢＭＳ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ；ＩｎｎａｔｅＰｈａｒｍａ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、少なくとも１つのＶＥＧＦ阻害剤を生成するように構成される。エフェクター分子としての使用に好適なＶＥＧＦ阻害剤として、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

分泌シグナル
一般に、１つ以上のエフェクター分子は、エフェクター分子のＮ末端に分泌シグナルペプチド（シグナルペプチドまたはシグナル配列とも称される）を含み、分泌または膜挿入を目的とした新規合成タンパク質を適切なタンパク質プロセシング経路に向かわせる。２つ以上のエフェクター分子を有する実施形態において、各エフェクター分子に分泌シグナル（Ｓ）を含ませることができる。２つ以上のエフェクター分子を有する実施形態において、操作された細胞から各エフェクター分子が分泌されるように、各エフェクター分子に分泌シグナルを含ませることができる。実施形態において、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む第２の発現カセットは、分泌シグナルペプチド（Ｓ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。実施形態において、各Ｘについて、対応する分泌シグナルペプチドは、エフェクター分子と作動可能に関連している。実施形態において、第２の発現カセットは、ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｓ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む。

エフェクター分子と作動可能に関連する分泌シグナルペプチドは、天然分泌シグナルペプチド、天然分泌シグナルペプチド（例えば、所与のエフェクター分子と一般に内在的に関連する分泌シグナルペプチド）であり得る。エフェクター分子と作動可能に関連する分泌シグナルペプチドは、非天然分泌シグナルペプチド、天然分泌シグナルペプチドであり得る。非天然分泌シグナルペプチドは、腫瘍微小環境などの特定の環境において、分泌の維持などの発現及び機能の改善を促進することができる。非天然分泌シグナルペプチドの非限定的な例を表５に示す。

抗原認識受容体
本開示のある特定の態様は、抗原認識受容体を含む操作された核酸に関する。いくつかの実施形態では、本開示の操作された核酸は、抗原認識受容体をさらに含む第１の発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、ＡＣＰをコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列及び第１のプロモーターに作動可能に連結された抗原認識受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。エフェクター分子としての使用に好適な抗原認識受容体は、５Ｔ４、ＡＤＡＭ９、ＡＤＧＲＥ２、ＡＦＰ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｃ４．４、ＣＡ６、カドヘリン３、カドヘリン６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１６６、ＣＤ２５、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ９３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン１８．２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ｃＭｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＭＢ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ４、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＲアルファ、ＦＲｂ、ＦＬＴ３、ＧＡＰＴ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＦＲａ４、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ｇｐＮＢＭ、ＧＰＲＣ５、ＨＥＲ２、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ１ＲＡＰ、インテグリンａＶ、ＫＩＴ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ１、ＬＡＴ２、ルイスＹ、ＬｅＹ、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＳＰ、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＬＣ１、ＭＳ４Ａ３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１Ｃ、ＭＹＡＤＭ、ＮａＰｉ２Ｂ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＹＥＳＯ１、Ｏｖａｒｉｎ、Ｐ－カドヘリン、汎Ｅｒｂ２、ＰＩＥＺＯ１、ＰＲＡＭ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＡｕｒｅｓ、ＳＣＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ２２Ａ１６、ＳＬＣ１７Ａ９、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＰＮＳ３、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＤＧＦ１、ＴＩＭ１、ＴＲＯＰ２、ＶＳＴＭ１、及びＷＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない抗原を認識する。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、５Ｔ４、ＡＤＡＭ９、ＡＦＰ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｃ４．４、ＣＡ６、カドヘリン３、カドヘリン６、ＣＣＲ４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１６６、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン１８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ４、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＲα、ＦＲｂ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＦＲａ４、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ｇｐＮＢＭ、ＧＰＲＣ５、ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ１ＲＡＰ、インテグリンａＶ、ＫＩＴ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ１、ルイスＹ、ＬｅＹ、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１Ｃ、ＮａＰｉ２Ｂ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＹＥＳＯ１、Ｏｖａｒｉｎ、Ｐ－カドヘリン、汎Ｅｒｂ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＡｕｒｅｓ、ＳＣＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＤＧＦ１、ＴＩＭ１、ＴＲＯＰ２、及びＷＴ１から選択される抗原を認識する。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＧＰＣ３を認識する。ＧＰＣ３を認識する抗原認識受容体は、ＧＰＣ３に結合する抗結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、ＶＨは、ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及びＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含み、ＶＬは、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及びＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＭＶＱＰＥＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＩＥＤＴＡＭＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２５）またはＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗原結合ドメインは、
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＩＧＥＫＶＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１２７）、または
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１２８）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＭＳＬＮを認識する。ＭＳＬＮを認識する抗原認識受容体は、ＭＳＬＮに結合する抗結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＬＮに結合する抗原結合ドメインは、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単一ドメイン結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＬＮに結合する抗原結合ドメインは、アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
を有する単一ドメイン結合ドメイン由来のＣＤＲ配列のそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＬＮに結合する抗原結合ドメインは、アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
を有する単一ドメイン結合ドメイン由来の１つ以上のＣＤＲ配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、ＡＣＰと抗原認識受容体との間に局在化されたリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーによって分離される。

ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖によってそのＣ末端から重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのＮ末端に接続した軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを有する。あるいは、ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖からなり、ＶＨのＣ末端がポリペプチド鎖によってＶＬのＮ末端に接続する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、Ｌはペプチドリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインである。

ｓｄＡｂは、抗体の１つの可変ドメインが、他の可変ドメインの非存在下で抗原に特異的に結合する分子である。

Ｆ（ａｂ）断片は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を、それぞれ軽鎖及び重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨとともに含む。Ｆ（ａｂ）’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂ’断片を含む。

いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１６ａ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＮＡＭ－１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＥＡＴ－２細胞内シグナル伝達ドメインから選択される１つ以上の追加の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインから選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域（例えば、ヒンジドメイン）をさらに含む。スペーサまたはヒンジドメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドである。スペーサーまたはヒンジドメインは、抑制性キメラ受容体もしくは腫瘍標的化キメラ受容体、またはそれらのドメインに柔軟性を提供するか、あるいは抑制性キメラ受容体もしくは腫瘍標的化キメラ受容体、またはそれらのドメインの立体障害を防止する。いくつかの実施形態では、スペーサドメインまたはヒンジドメインは、最大３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、または５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペーサードメイン（複数可）は、抑制性キメラ受容体または腫瘍標的化キメラ受容体の他の領域に含まれ得る。

例示的なスペーサーまたはヒンジドメインとして、ＩｇＧドメイン（ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、またはＩｇＧ４ヒンジなど）、ＩｇＤヒンジドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、及びＣＤ２８ヒンジドメインが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、ＩｇＧドメイン、ＩｇＤドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、またはＣＤ２８ヒンジドメインである。

例示的なスペーサーまたはヒンジドメインのタンパク質配列を表６に示す。例示的なスペーサーまたはヒンジドメインのヌクレオチド配列を表７に示す。

ＣＡＲでの使用に好適な膜貫通ドメイン、スペーサーまたはヒンジドメイン、及び細胞内ドメインは、一般に、Ｓｔｏｉｂｅｒｅｔａｌ，Ｃｅｌｌｓ２０１９，８（５），４７２、Ｇｕｅｄａｎｅｔａｌ，ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔ＆ＣｌｉｎｉｃＤｅｖ，２０１９１２：１４５－１５６、及びＳａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ；２０１３，３（４）；３８８－９８に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、分泌シグナルペプチドをさらに含む。本開示の任意の好適な分泌シグナルペプチドを使用してもよい。

転写後調節エレメント
いくつかの実施形態では、本開示の操作された核酸は、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含む。ＰＲＥは、三次ＲＮＡ構造の安定性と３’末端形成を可能にすることで遺伝子発現を強化することができる。ＰＲＥの非限定的な例として、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥエレメントのα、β、及びγ成分を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥエレメントのα成分を含む。

操作された細胞
本明細書ではまた、本開示の１つ以上の操作された核酸を含む細胞、及び細胞の産生方法も提供する。これらの細胞は、本明細書では「操作された細胞」と称される。一般的に１つ以上の操作された核酸を含むこれらの細胞は、自然界では発生しない。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の操作された核酸を組換え的に発現する単離された細胞である。いくつかの実施形態では、操作された１つ以上の核酸を、１つ以上のベクターまたは細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現させる。いくつかの実施形態では、細胞を、転写因子などの活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）、及び／または抗原認識受容体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の核酸を含むように操作する。いくつかの実施形態では、転写因子は、抑制性プロテアーゼ及び同族切断部位を含む。いくつかの実施形態では、転写因子はデグロンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは抗原認識受容体である。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び／または抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）；ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含み、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。ＡＣＰは抗原認識受容体であり、この受容体は、その同族の抗原への結合により、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。

いくつかの実施形態では、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上であり得る。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、操作された細胞内の別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる。例えば、いくつかの実施形態では、操作された細胞は、２つの操作された核酸、すなわち第１の発現カセットをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸、及び第２の発現カセットをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸を含む。例示的な例では、エフェクター分子発現カセットが、操作された細胞内の第１の操作された核酸によってコードされ得、ＡＣＰ発現カセットが、操作された細胞内の第２の操作された核酸によってコード化され得る。別の例示的な例では、操作された細胞内で、エフェクター分子発現カセットが、第１の操作された核酸によってコードされ得、ＡＣＰ発現カセットが、第２の操作された核酸によってコードされ得、そして抗原認識受容体発現カセットが、第３の操作された核酸によってコードされ得る。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、操作された細胞内の単一のポリヌクレオチド配列によってコードされる。例えば、いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第１の発現カセット及び第２の発現カセットの両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む単一の操作された核酸を含む。他の例示的な例として、（１）抗原認識受容体発現カセット及びエフェクター分子発現カセットが、第１の操作された核酸によってコードされ得、ＡＣＰ発現カセットが、第２の操作された核酸によってコードされ得る、（２）ＡＣＰ発現カセット及びエフェクター分子発現カセットが、第１の操作された核酸によってコードされ得、抗原認識受容体発現カセットが、第２の操作された核酸によってコード化され得る、（３）ＡＣＰ発現カセット及び抗原認識受容体発現カセットが、第１の操作された核酸によってコードされ得、エフェクター分子発現カセットが、第２の操作された核酸によってコード化され得ることが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、操作された細胞内のポリヌクレオチド配列の発現カセットは、マルチシストロン性であり得、すなわち、複数の別個のポリペプチド（例えば、複数の外来性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子）が単一のｍＲＮＡ転写産物から産生され得る。例えば、マルチシストロン性発現カセットは、ＡＣＰ及び抗原認識受容体の両方をコードすることができ、例えば、両方が、構成的プロモーターによって駆動される単一の発現カセットから発現する。別の例では、マルチシストロン性発現カセットは、エフェクター分子と抗原認識受容体の両方をコードすることができ、例えば、両方が、ＡＣＰ応答性プロモーターによって駆動される単一の発現カセットから発現する。発現カセットは、様々なリンカーを使用することによりマルチシストロン性とすることができ、例えば、第１の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、第２の目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結することができる（例えば、５’から３’方向に、第１の遺伝子：リンカー：第２の遺伝子）。マルチシストロンの特徴及びオプションについては、「マルチシストロン及び多重プロモーター系」の節に記載する。

いくつかの実施形態では、第２の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含み、各Ｌリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している。いくつかの実施形態では、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む第２の発現カセットは、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、各Ｘについて、対応する分泌シグナルペプチドは、エフェクター分子と作動可能に関連している。いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して天然である天然分泌シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非天然分泌シグナルペプチドは、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞を、追加のエフェクター分子、例えば、免疫応答を刺激するエフェクター分子をコードする追加の外来性ヌクレオチド配列に作動可能に連結された追加のプロモーターを含む追加の発現カセットを含むように操作する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、追加のプロモーターと、式（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する追加の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む追加の発現カセットをさらに含み、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、追加のプロモーターは、追加の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在しない。

いくつかの実施形態では、追加の発現カセットは、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含み、各Ｌリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している。いくつかの実施形態では、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む追加の発現カセットは、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、各Ｘについて、対応する分泌シグナルペプチドは、エフェクター分子と作動可能に関連している。いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して天然である天然分泌シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、各分泌シグナルペプチドは、対応するエフェクター分子に対して非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非天然分泌シグナルペプチドは、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／または追加のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／または追加のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターである。

本開示の操作された細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた操作された核酸を含み得る。操作された細胞は、例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどの一過性発現系で操作された、細胞のゲノムに組み込まれることなく発現可能な操作された核酸を含み得る。

本開示には、エフェクター分子（複数可）とそれらを産生する操作された細胞との間の相加性及び相乗性も包含される。いくつかの実施形態では、細胞を、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上）のエフェクター分子（それぞれが異なる腫瘍媒介免疫抑制機構を調節し得る）を産生するように操作する。他の実施形態では、細胞を、細胞によって天然には産生されない少なくとも１つのエフェクター分子を産生するように操作する。そのようなエフェクター分子は、例えば、細胞によって天然に産生されるエフェクター分子の機能を補完し得る。

いくつかの実施形態では、細胞（例えば、腫瘍細胞、赤血球、血小板細胞、または細菌細胞）を、１つ以上のエフェクター分子を産生するように操作する。例えば、細胞を、１～２０個の異なるエフェクター分子を産生するように操作してもよい。いくつかの実施形態では、細胞を、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１９、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１３、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１９、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２０、５～１９、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～２０、６～１９、６～１８、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～２０、７～１９、７～１８、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、７～８、８～２０、８～１９、８～１８、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、８～９、９～２０、９～１９、９～１８、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、９～１０、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１０～１２、１０～１１、１１～２０、１１～１９、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１１～１２、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～２０、１３～１９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１３～１４、１４～２０、１４～１９、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１４～１５、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１５～１６、１６～２０、１６～１９、１６～１８、１６～１７、１７～２０、１７～１９、１７～１８、１８～２０、１８～１９、または１９～２０個のエフェクター分子を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のエフェクター分子を産生するように操作する。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）ならびにＡＣＰ応答性プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む１つ以上の操作された核酸を含み、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、細胞を、複数の操作された核酸、例えば、少なくとも２つの操作された核酸を含むように操作し、それぞれが、第１のプロモーター及びＡＣＰをコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列ならびに式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットをコードし、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０である。いくつかの実施形態では、第２の外来性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つまたは３つ）のエフェクター分子をコードする。第２の外来性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０個、またはそれ以上のエフェクター分子をコードし得る。例えば、細胞を、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、またはそれ以上の操作された核酸（それぞれが、ＡＣＰポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の発現カセット、ならびにＡＣＰ応答性プロモーター及び少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のエフェクター分子をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットをコードする）を含むように操作してもよい。いくつかの実施形態では、細胞を、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上の操作された核酸（それぞれが、ＡＣＰポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の発現カセット、ならびにＡＣＰ応答性プロモーター及び少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のエフェクター分子をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットをコードする）を含むように操作する。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第３のプロモーター、及び抗原認識受容体をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３のプロモーターは、第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の外来ポリヌクレオチド配列は、抗原認識受容体をさらにコードする。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び／または抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセット（第１のプロモーターは、第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている）ならびに活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：（Ｌ－Ｅ）_Ｘを有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットを含む１つ以上の操作された核酸を含み、式中、Ｅは、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、Ｌは、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、Ｘ＝１～２０であり、ＡＣＰ応答性プロモーターは、第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌは存在せず、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターへの結合によって第２の発現カセットの発現を誘導することができる。第１の外来性ポリヌクレオチド配列が抗原認識受容体をコードする実施形態において、操作された細胞は、第３のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第３の発現カセットをさらに含んでいてもよく、その場合、第３のプロモーターは、第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。例示的な抗原認識受容体として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰは、抗原認識受容体であり、ＡＣＰは、その同族の抗原への結合により、第２の発現カセットの発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＰ応答性プロモーターは、その同族の抗原へのＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである。

操作された細胞は、上記のリンカーの少なくとも１つをコードする操作された核酸、例えば、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列を連結するポリペプチド、上記の１つ以上のマルチシストロン性リンカー、追加のＯＲＦに作動可能に連結された１つ以上の追加のプロモーター、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、単一のポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットが（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌ_１リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第２のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含み、第２のリンカーポリヌクレオチドは、第１の発現カセットを第２の発現カセットに連結する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子及びＡＣＰの翻訳と作動可能に関連する。

いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、治療クラスから独立して選択されるエフェクター分子を産生するように操作し、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、ケモカインを産生するように操作する。いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、サイトカインを産生するように操作する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αから選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、少なくとも１つのホーミング分子を産生するように操作する。「ホーミング」は、標的部位（例えば、細胞、組織（例えば、腫瘍）、または器官）への細胞の能動的ナビゲーション（遊走）を指す。「ホーミング分子」は、細胞を標的部位に向かわせる分子を指す。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、標的部位への操作された細胞の相互作用を認識及び／または開始するように機能する。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、及びＧＰＲ１５から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、少なくとも１つの成長因子を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、少なくとも１つの共活性化分子を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、共活性化分子は、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌから選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、少なくとも１つのＴＧＦβ阻害剤を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、赤血球、または血小板細胞）を、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭｌ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、腫瘍細胞、赤血球、血小板細胞、または細菌細胞）を、少なくとも１つのＶＥＧＦ阻害剤を産生するように操作する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

操作された細胞のタイプ
本開示の操作された細胞または単離された細胞は、ヒト細胞であり得る。操作された細胞または単離された細胞は、ヒト初代細胞であり得る。操作された初代細胞は、腫瘍浸潤性初代細胞であり得る。操作された初代細胞は、初代Ｔ細胞であり得る。操作された初代細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。操作された初代細胞は、ナチュラルキラー細胞であり得る。操作された初代細胞は、任意の体細胞であり得る。操作された初代細胞は、ＭＳＣであり得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象由来である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に関して同種異系である。

本開示の操作された細胞は、対象、例えば、がんを有することが知られているか、または疑われる対象から単離することができる。細胞単離方法は当業者に公知であり、細胞表面マーカー発現に基づく分取技術、例えば、ＦＡＣＳソーティング、ポジティブアイソレーション技術、及びネガティブアイソレーション、磁気アイソレーション、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。操作された細胞は、治療を受けている対象に関して同種異系であり得る。同種異系改変細胞は、治療を受けている対象にＨＬＡ適合させることができる。操作された細胞は、培養細胞、例えば、ｅｘｖｉｖｏ培養細胞であり得る。操作された細胞は、対象から単離した初代細胞などのｅｘｖｉｖｏ培養細胞であり得る。培養細胞は、１つ以上のサイトカインとともに培養することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の操作または単離された細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞から選択される。いくつかの実施形態では、操作された細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は自家である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は同種異系である。

いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、腺癌細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、精巣卵黄嚢腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞から選択される腫瘍細胞である。

いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、クロストリジウム・ベエイジェリンキー、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ノビイ、大腸菌、シュードモナス・エルジノーサ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、及びサルモネラ・コレレスイスから選択される細菌細胞である。

本明細書ではまた、本開示の操作された細胞を培養することを含む方法をさらに提供する。本明細書に記載の操作された細胞の培養方法は公知である。当業者は、培養条件が目的の特定の操作された細胞に依存することを認識するであろう。当業者は、培養条件が、操作された細胞の特定の下流の使用、例えば、操作された細胞を対象へその後に投与するための特定の培養条件に依存することを認識するであろう。

細胞の操作方法
本明細書ではまた、本明細書に記載の第１及び第２の発現カセットを含む任意の操作された核酸によってコードされる活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び１つ以上のエフェクター分子を生成するように細胞を操作するための組成物及び方法も提供する。

一般的には、第１のプロモーター及びＡＣＰをコードする外来性ポリヌクレオチド配列を含む本開示の１つ以上のポリヌクレオチド、ならびにＡＣＰ応答性プロモーター及び１つ以上のエフェクター分子をコードする第２の外来性配列を含む第２の発現カセットを細胞のサイトゾル及び／または核へ導入（すなわち、送達）することを通じて、ＡＣＰ及びエフェクター分子が産生されるように細胞を操作する。例えば、ＡＣＰポリペプチド及び１つ以上のエフェクター分子をコードするポリヌクレオチド発現カセットは、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかであり得る。送達方法として、ウイルス媒介送達、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、超音波処理、及び物理的手段による細胞膜変形が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、送達方法の選択が、操作しようとする特定の細胞型に依存し得ることを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、操作された細胞を、腫瘍溶解性ウイルスを用いて形質導入する。腫瘍溶解性ウイルスの例として、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、第３の発現カセットをさらに含む。

本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスのいずれかを含むウイルスは、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかなど、１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の導入遺伝子をコードする組換えウイルスであり得る。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスのいずれかを含むウイルスは、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかなど、２つ以上のエフェクター分子のうちの１つ以上をコードする１つ以上の導入遺伝子をコードする組換えウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、細胞を、腫瘍溶解性ウイルスによる形質導入を介して操作する。

ウイルス媒介送達
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、宿主細胞に導入する（すなわち、送達する）ことによって細胞を操作する。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかを導入することによって細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸であり得、したがって、操作された核酸には、操作されたウイルス由来の核酸も包含され得る。そのような操作されたウイルス由来の核酸はまた、組換えウイルスまたは操作されたウイルスとも呼ばれ得る。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、同じ核酸内に複数の操作された核酸、遺伝子、または導入遺伝子をコードし得る。例えば、操作されたウイルス由来の核酸、例えば、組換えウイルスまたは操作されたウイルスは、１つ以上のエフェクター分子をコードする本明細書に記載の操作された核酸のいずれかを含むがこれらに限定されない１つ以上の導入遺伝子をコードし得る。１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の導入遺伝子を、１つ以上のエフェクター分子を発現するように構成することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、１つ以上の導入遺伝子（例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子）に加えて、シス作用エレメントまたはシス作用遺伝子と呼ばれる１つ以上の遺伝子、例えば、ウイルス感染性及び／またはウイルス産生に必要なウイルス遺伝子（例えば、キャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス転写酵素など）をコードし得る。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書に記載され、トランス作用エレメントまたはトランス作用遺伝子と呼ばれる、操作された核酸、遺伝子、または導入遺伝子をコードする別個のウイルスベクターなどの複数のウイルスベクターを含み得る。例えば、ヘルパー依存性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、１つ以上のエフェクター分子をコードするベクターに加えて、１つ以上の追加の別個のベクター上にウイルス感染性及び／またはウイルス産生に必要な追加の遺伝子を提供することができる。２つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された操作された核酸を送達する１つのベクターなど、１つのウイルスベクターが複数の操作された核酸を送達することができる。１つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された１つ以上の操作された核酸を送達する複数のベクターなど、複数のウイルスベクターが複数の操作された核酸を送達することができる。使用するウイルスベクターの数は、上記のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング容量に依存し得、当業者は、適切な数のウイルスベクターを選択することができる。

一般に、ウイルスベクターベースの系のいずれも、エフェクター分子などの分子のｉｎｖｉｔｒｏ産生のために使用することができ、または、例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸をｉｎｖｉｖｏ送達するために、ｉｎｖｉｖｏ及びｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療手順に使用することができる。適切なウイルスベクターベースの系の選択は、カーゴ／ペイロードのサイズ、ウイルス系の免疫原性、目的の標的細胞、遺伝子発現の強度とタイミング、及び当業者が認識する他の要因などの様々な要因に依存する。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＲＮＡベースのウイルスまたはＤＮＡベースのウイルスであり得る。例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームとして、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、はしかウイルス、インフルエンザウイルス、インディアナベシクロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、マラバウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肝炎ウイルス、ルベラウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、モルビリウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、ラブドウイルス、セネカバレーウイルス、シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォーム、例えば、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓｅｔａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または第２、第３、もしくはハイブリッドの第２／第３世代レンチウイルス及び特定の細胞型または受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがこれらに限定されないレンチウイルスが当技術分野で記載されている（例えば、Ｈｕｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＤｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＣａｎｃｅｒａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｒｏｎｌｏｓｓｍａｘｉｍｉｚｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｕｂｉｑｕｉｔｉｎＣｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，Ｓｅｌｆ－ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｆｏｒＳａｆｅａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）。

それらの配列の前に、細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列を配置してもよい。宿主細胞への導入（すなわち、送達）時に、感染細胞（すなわち、操作された細胞）は、１つ以上のエフェクター分子を発現し、いくつかの場合では分泌することができる。免疫化プロトコルに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターはＳｔｏｖｅｒｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。操作された核酸の導入（すなわち、送達）に有用な多種多様な他のベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉベクターなどは、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、腫瘍細胞を標的とするウイルスであり得、本明細書では腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれる。腫瘍溶解性ウイルスの例として、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスのいずれも、１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の導入遺伝子（例えば、操作された核酸）を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであり得る。１つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子を、１つ以上のエフェクター分子を発現するように構成することができる。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）から選択される。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レトロウイルスベースであり得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製とパッケージングに十分であり、その後、１つ以上の操作された核酸（例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子）を標的細胞に組み込んで、永続的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。レトロウイルスベースの送達系として、マウス白血病、ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づく送達系が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎｅｔａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ，Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。他のレトロウイルス系として、Ｐｈｏｅｎｉｘレトロウイルス系が挙げられる。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レンチウイルスベースであり得る。一般的に、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、通常、高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはｐＬｅｎｔｉ系（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）などのＨＩＶベースであり得る。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＳＩＶまたはＦＩＶベースであり得る。他の例示的なレンチウイルスベースの送達プラットフォームは、米国特許第７，３１１，９０７号、第７，２６２，０４９号、第７，２５０，２９９号、第７，２２６，７８０号、第７，２２０，５７８号；第７，２１１，２４７号、第７，１６０，７２１号、第７，０７８，０３１号、第７，０７０，９９３号、第７，０５６，６９９号、第６，９５５，９１９号にさらに詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノウイルスベースであり得る。一般的に、アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要とせず、高い力価と発現レベルを達成し、比較的単純な系で大量に生産することができる。一般的に、アデノウイルスは通常、宿主のゲノムに組み込まれないため、感染細胞内での導入遺伝子の一過性発現に使用することができる。アデノウイルスベースの送達プラットフォームは、Ｌｉｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３５：２５４３２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ６：５１５５２４，１９９９、ＬｉａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ９２：７７００７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＨＧｅｎｅＴｈｅｒ５：１０８８１０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５にさらに詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。他の例示的なアデノウイルスベースの送達プラットフォームは、米国特許第５５８５３６２号、第６，０８３，７１６号、第７，３７１，５７０号、第７，３４８，１７８号、第７，３２３，１７７号、第７，３１９，０３３号、第７，３１８，９１９号、及び第７，３０６，７９３号ならびに国際特許出願ＷＯ９６／１３５９７にさらに詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースであり得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、操作された核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）で細胞を形質導入してもよい。ＡＡＶ系は、エフェクター分子のｉｎｖｉｔｒｏ産生に使用することができ、または、例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸をｉｎｖｉｖｏ送達するために、ｉｎｖｉｖｏ及びｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療手順に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，４３６，１４６号、第６，６３２，６７０号、第６，６４２，０５１号、第７，０７８，３８７号、第７，３１４，９１２号、第６，４９８，２４４号、第７，９０６，１１１号、米国特許公開ＵＳ２００３－０１３８７７２、ＵＳ２００７／００３６７６０、及びＵＳ２００９／０１９７３３８、Ｇａｏ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６３８１－６３８８（Ｊｕｎｅ２００４）、Ｇａｏ，ｅｔａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１００（１０）：６０８１－６０８６（Ｍａｙ１３，２００３）、ならびに国際特許出願ＷＯ２０１０／１３８２６３及びＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと（それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される））。組換えＡＡＶベクターを構築するための例示的な方法は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ８１：６４６６６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｉｓｋｉｅｔａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）にさらに詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。一般的に、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１及びそれらのバリアントのいずれか１つに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームであり得る。一般的に、ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質を生成し、得られたウイルス粒子を精製することによって構築される。次いで、精製に続いて、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を、精製した粒子内にｅｘｖｉｖｏでカプセル化する。したがって、ＶＬＰの生成は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸とカーゴ／ペイロードをコードする核酸の分離を維持する。ＶＬＰ産生に使用するウイルス構造タンパク質は、哺乳動物、酵母、昆虫、細菌、またはｉｎｖｉｖｏ翻訳発現系を含む様々な発現系で産生することができる。精製したウイルス粒子を、当技術分野で公知の方法を使用して、所望のカーゴの存在下で変性及び再形成して、ＶＬＰを生成することができる。ＶＬＰの生成は、Ｓｅｏｗｅｔａｌ．（ＭｏｌＴｈｅｒ．２００９Ｍａｙ；１７（５）：７６７－７７７）にさらに詳細に記載されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ある範囲の細胞を標的とする（すなわち、感染させる）か、細胞の狭いサブセットを標的とするか、または特定の細胞を標的とするように操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォーム用に選択されたエンベロープタンパク質がウイルスの向性を決定する。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームで使用されるウイルスは、目的の特定の細胞を標的とするようにシュードタイプ化することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、汎親和性であり、様々な細胞に感染し得る。例えば、汎親和性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを含み得る。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、広宿主性であり、哺乳動物細胞に感染し得る。したがって、当業者であれば、所望の細胞型を標的とするための適切な向性、シュードタイプ、及び／またはエンベロープタンパク質を選択することができる。

脂質構造体送達系
本開示の操作された核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）は、脂質媒介送達系を使用して細胞に導入することができる。一般的に、脂質媒介送達系は、内部コンパートメントを包む外部脂質膜からなる構造を使用する。脂質ベースの構造体の例として、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、または組織が挙げられるが、これらに限定されない。脂質構造送達系は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏで、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を送達することができる。

脂質ベースのナノ粒子には、単層リポソーム、多層リポソーム、及び脂質調製物が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、「リポソーム」は、脂質シェルまたは脂質凝集体内の所望のカーゴ、例えば、操作された核酸、例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかを封入することによって形成される脂質ビヒクルのｉｎｖｉｔｒｏ調製物を包含する総称である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二分子膜を有する小胞構造、及び一般的に水性組成物を含む内部媒体を有することを特徴とする場合がある。リポソームには、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層状層などが含まれるが、これらに限定されない。リポソームは単層リポソームであり得る。リポソームは多層リポソームであり得る。リポソームは多胞性リポソームであり得る。リポソームは、正に荷電するか、負に荷電するか、または中性に荷電し得る。ある特定の実施形態では、リポソームは中性の電荷を帯びている。リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、これには、一般に、中性及び負に荷電したリン脂質、ならびにコレステロールなどのステロールが含まれる。脂質の選択は、一般に、所望の目的、例えば、リポソームのサイズ、酸の不安定性、及び血流中のリポソームの安定性などのｉｎｖｉｖｏ送達の基準を考慮することによって導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能である。

複数の脂質層が水性媒体によって分離されるように、リン脂質を含む脂質を過剰量の水溶液に懸濁する場合、多層リポソームが自発的に生成される。水と溶解した溶質は、脂質成分が自己再配列した後、脂質二重層の間の閉じた構造に閉じ込められる。所望のカーゴ（例えば、ポリペプチド、核酸、小分子薬、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかなどの操作された核酸、ウイルスベクター、ウイルスベースの送達系など）を、標的実体に送達できるように、リポソームの水性内部にカプセル化するか、リポソームとポリペプチド／核酸の両方に関連する連結分子を介してリポソームに結合させるか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソームに閉じ込めるか、リポソームと複合体を形成させるか、またはリポソームと会合させることができる。親油性分子または親油性領域を有する分子もまた、脂質二重層に溶解または会合し得る。

本実施形態に従って使用するリポソームは、当業者に公知のように、異なる方法によって作製することができる。リポソームの調製は、ＷＯ２０１６／２０１３２３、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１及びＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０、ならびに米国特許第４，７２８，５７８号、第４，７２８，５７５号、第４，７３７，３２３号、第４，５３３，２５４号、第４，１６２，２８２号、第４，３１０，５０５号、及び第４，９２１，７０６号にさらに詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

リポソームはカチオン性リポソームであり得る。カチオン性リポソームの例は、米国特許第５，９６２，０１６号、第５，０３０，４５３号、第６，６８０，０６８号、米国出願２００４／０２０８９２１、ならびに国際特許出願ＷＯ０３／０１５７５７Ａ１、ＷＯ０４０２９２１３Ａ２、及びＷＯ０２／１００４３５Ａ１にさらに詳細に記載されており、それぞれが参照によりその全体が本明細書に援用される。

脂質媒介遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ９６／１８３７２、ＷＯ９３／２４６４０、Ｍａｎｎｉｎｏ＆Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号Ｒｏｓｅ米国特許第５，２７９，８３３号、ＷＯ９１／０６３０９、及びＦｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

エキソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、多胞体と原形質膜との融合に続いて細胞外環境に放出される。エキソソームのサイズは、直径３０～１００ｎｍの範囲である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜由来の脂質二重層からなり、エキソソームを生成した細胞由来のサイトゾルを含み、表面上に親細胞由来の膜タンパク質を提示する。核酸の送達に有用なエキソソームは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第９，８８９，２１０号（あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されている。

本明細書中で使用する場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。一般的に、細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有するすべての膜結合小胞を含む。一般的に、細胞外小胞は、直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間内の、細胞外小胞の外面に提示される、及び／または膜にわたるかのいずれかの、様々な高分子カーゴを含み得る。カーゴは、核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。例として、限定されないが、細胞外小胞には、アポトーシス小体、細胞の断片、直接または間接のマニピュレーション（例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液での処理による）による細胞由来小胞、小胞化オルガネラ、及び生細胞によって生成される小胞（例えば、直接的な原形質膜の出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合による）が含まれる。細胞外小胞は、生存生物または死滅生物、外植された組織または器官、及び／または培養細胞に由来し得る。

本明細書中で使用する場合、「エキソソーム」という用語は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的な原形質膜の出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合によって細胞から生成される細胞由来の小さな（直径２０～３００ｎｍ、より好ましくは直径４０～２００ｎｍの）小胞を指す。エキソソームは、脂質または酪酸及び多糖を含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬）、受容体（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、例えば、本明細書に記載の操作された核酸）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）または他の分子を含む。エキソソームは、プロデューサー細胞に由来し、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離することができる。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。一般的に、エキソソームの産生／生合成は、プロデューサー細胞の破壊をもたらさない。エキソソーム及びエキソソームの調製は、ＷＯ２０１６／２０１３２３にさらに詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

本明細書中で使用する場合、「ナノベシクル」（「マイクロベシクル」とも呼ばれる）とは、内部空間を取り囲む膜を含み、直接または間接のマニピュレーションによって細胞から生成される、細胞由来の小さな（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍの）小胞を指し、当該ナノベシクルは、当該マニピュレーションを行わずに前記プロデューサー細胞によって生成されることはない。一般的に、ナノベシクルは、細胞外小胞の亜種である。プロデューサー細胞の適切なマニピュレーションには、連続押出し、アルカリ性溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ナノベシクルの産生は、いくつかの場合では、当該プロデューサー細胞の破壊をもたらし得る。好ましくは、ナノベシクルの集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合による、プロデューサー細胞由来の小胞を実質的に含まない。ナノベシクルは、脂質または酪酸及び多糖を含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬）、受容体（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、例えば、本明細書に記載の操作された核酸）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）または他の分子を含む。ナノベシクルは、当該マニピュレーションに従ってプロデューサー細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離することができる。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、一般的に、脂質の両親媒性に依存して膜や小胞様の構造を形成する合成脂質構造である（Ｒｉｌｅｙ２０１７）。一般的に、これらの小胞は、標的細胞の膜に吸収され、カーゴをサイトゾルに放出することによって、本明細書に記載の操作された核酸またはウイルス系のいずれかなどのカーゴ／ペイロードを送達する。ＬＮＰ形成に使用される脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であり得る。脂質は、合成または天然由来、いくつかの場合では生分解性であり得る。脂質には、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ＰＥＧ化脂質）を含むがこれらに限定されない脂質コンジュゲート、ワックス、油、グリセリド、及び脂溶性ビタミンが含まれ得る。脂質組成物は、一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質などの材料の定義された混合物を含む。いくつかの場合では、特定の脂質を含めて、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、または追加の部分の結合を促進する官能基を提供する。脂質組成は、全体的なＬＮＰサイズと安定性に影響を与え得る。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質組成物は、１つ以上の他の脂質、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ結合脂質、ステロール、または中性脂質を含むように配合することができる。さらに、ＬＮＰをさらに操作するか、または機能化して、特定の細胞型の標的化を促進することができる。ＬＮＰ設計における別の考慮事項は、標的化効率と細胞毒性のバランスである。

ミセルは、一般的に、単鎖脂質を使用して形成される球状の合成脂質構造であり、単鎖脂質の親水性の頭部が外層または膜を形成し、単鎖脂質の疎水性の尾部がミセルの中心を形成する。ミセルは通常、脂質単層のみを含む脂質構造を指す。ミセルは、Ｑｕａｄｅｒｅｔａｌ．（ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１７Ｊｕｌ５；２５（７）：１５０１－１５１３）にさらに詳細に記載されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解または遊離核酸による免疫系のオフターゲット刺激を含む、いくつかの望ましくない結果をもたらし得る。同様に、血清に直接曝露されたウイルス送達系は、望ましくない免疫応答及び／またはウイルス送達系の中和を引き起こし得る。したがって、操作された核酸及び／またはウイルス送達系のカプセル化を使用して、分解を回避すると同時に、潜在的なオフターゲットの影響を回避することができる。ある特定の例では、操作された核酸及び／またはウイルス送達系は、送達ビヒクル内、例えば、ＬＮＰの水性の内部に完全にカプセル化される。ＬＮＰ内の操作された核酸及び／またはウイルス送達系のカプセル化は、当業者に周知の技術、例えば、マイクロ流体混合及びマイクロ流体液滴生成デバイス上で実行する液滴生成によって実行することができる。そのようなデバイスとして、標準のＴジャンクションデバイスまたはフローフォーカシングデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。一例では、所望の脂質製剤、例えば、ＭＣ３またはＭＣ３様含有組成物を、操作された核酸またはウイルス送達系及び任意の他の所望の薬剤と並行して液滴生成デバイスに提供し、それにより、送達ベクター及び所望の薬剤を、ＭＣ３またはＭＣ３様ベースのＬＮＰの内部に完全にカプセル化する。一例では、液滴生成デバイスは、生成されるＬＮＰのサイズ範囲及びサイズ分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１～１０００ナノメートルの範囲のサイズ、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ナノメートルを有し得る。液滴の生成に続いて、カーゴ／ペイロードをカプセル化する送達ビヒクル（例えば、操作された核酸及び／またはウイルス送達系）をさらに処理または操作して、投与用にそれらを調製することができる。

ナノ粒子送達
ナノ材料を使用して、操作された核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を送達することができる。ナノ材料ビヒクルは、重要なことに、非免疫原性材料で作ることができ、一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を誘発することを回避することができる。これらの材料には、脂質（前述のとおり）、無機ナノ材料、及びその他の高分子材料が含まれるが、これらに限定されない。ナノ材料粒子は、Ｒｉｌｅｙｅｔａｌ．（ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＮａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙ－ＡＲｅｖｉｅｗ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２０１７，７（５），９４）に詳細に記載されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

ゲノム編集系
ゲノム編集系を使用して、操作された核酸、例えば、本開示の操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。一般的に、「ゲノム編集系」は、外来性遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込むための任意の系を指す。ゲノム編集系には、トランスポゾン系、ヌクレアーゼゲノム編集系、及びウイルスベクターベースの送達プラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。

トランスポゾン系を使用して、操作された核酸、例えば、本開示の操作された核酸を宿主ゲノムに組み込むことができる。トランスポゾンは一般的に、カーゴ／ペイロード核酸とトランスポザーゼに隣接する末端逆位配列（ＴＩＲ）を含む。トランスポゾン系は、ＴＩＲに隣接するカーゴを、シスまたはトランスでトランスポゾンに提供することができる。トランスポゾン系は、レトロトランスポゾン系またはＤＮＡトランスポゾン系であり得る。一般的に、トランスポゾン系は、カーゴ／ペイロード（例えば、操作された核酸）をランダムに宿主ゲノムに組み込む。トランスポゾン系の例として、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンスーパーファミリー、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．（ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌ．２０１７Ａｕｇ；５２（４）：３５５－３８０）、及び米国特許第６，４８９，４５８号、第６，６１３，７５２号及び第７，９８５，７３９号（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されているＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙトランスポゾン系のトランスポゾンを使用する系が挙げられる。トランスポゾン系の別の例として、米国特許第６，２１８，１８５号及び第６，９６２，８１０号にさらに詳細に記載されているＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系が挙げられ、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

ヌクレアーゼゲノム編集系を使用して、操作された核酸、例えば、本開示の操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。理論に拘泥することを望むものではないが、一般的に、外来性遺伝子を導入するために使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集系は、細胞の天然のＤＮＡ修復機構、特に相同組換え（ＨＲ）修復経路を利用する。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡへの損傷（通常は二本鎖切断）に続いて、細胞は、損傷を修復するためのＤＮＡ合成時に、５’と３’の両端に同一または実質的に同一の配列を有する別のＤＮＡ供給源をテンプレートとして使用することにより、損傷を解消することができる。天然の状況下では、ＨＤＲは細胞内に存在する他の染色体をテンプレートとして使用することができる。遺伝子編集系では、外来性ポリヌクレオチドを細胞に導入し、相同組換えテンプレート（ＨＲＴまたはＨＲテンプレート）として使用する。一般的に、ＨＲＴ（例えば、遺伝子または遺伝子の一部）内の５’と３’の相補的末端の間に含まれる損傷を有する、染色体に元々存在しない追加の外来性配列を、テンプレート化されたＨＤＲ中に所与のゲノム遺伝子座に組み込む（すなわち、統合する）ことができる。したがって、所与のゲノム遺伝子座の典型的なＨＲテンプレートは、内在性ゲノム標的遺伝子座の第１の領域と同一のヌクレオチド配列、内在性ゲノム標的遺伝子座の第２の領域と同一のヌクレオチド配列、及びカーゴ／ペイロード核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか、例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸のいずれか）をコードするヌクレオチド配列を有する。

いくつかの例では、ＨＲテンプレートは直鎖状であり得る。直鎖状ＨＲテンプレートの例として、直鎖状化したプラスミドベクター、ｓｓＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＰＣＲ増幅したＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、ＨＲテンプレートを、プラスミドなどの環状とすることができる。環状テンプレートには、スーパーコイル状のテンプレートが含まれ得る。

導入する外来性配列に関して、ＨＲテンプレートの５’及び３’末端に存在する同一または実質的に同一の配列は、一般的にアーム（ＨＲアーム）と呼ばれる。ＨＲアームは、内在性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一（すなわち、１００％同一）であり得る。いくつかの例では、ＨＲアームは、内在性ゲノム標的遺伝子座の領域と実質的に同一であり得る。実質的に同一のＨＲアームを使用することができるが、ＨＤＲ経路の効率は１００％未満の同一性を有するＨＲアームによって影響を受ける可能性があるため、ＨＲアームが同一であることが有利であり得る。

各ＨＲアーム、すなわち５’及び３’ＨＲアームは、同じサイズまたは異なるサイズであり得る。各ＨＲアームの長さは、それぞれ５０、１００、２００、３００、４００、または５００塩基以上にすることができる。ＨＲアームは一般的に任意の長さとすることができるが、ＨＲアームの長さ及び全体的なテンプレートサイズが全体的な編集効率に与える影響など、実際的な考慮事項も考慮に入れることができる。ＨＲアームは、切断部位に直接隣接する内在性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一または実質的に同一であり得る。各ＨＲアームは、切断部位に直接隣接する内在性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一または実質的に同一であり得る。各ＨＲアームは、切断部位からある特定の距離内、例えば、互いに１塩基対、１０塩基対以下、５０塩基対以下、または１００塩基対以下にある内在性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一または実質的に同一であり得る。

ヌクレアーゼゲノム編集系は、様々なヌクレアーゼを使用して、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼまたはその誘導体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはその誘導体、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはその誘導体を含むがこれらに限定されない標的ゲノム遺伝子座を切断することができる。

ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集系を使用して、操作された核酸、例えば、本明細書に記載のエフェクター分子の１つ以上をコードする操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｍ．Ａｄｌｉ（“ＴｈｅＣＲＩＳＰＲｔｏｏｌｋｉｔｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇａｎｄｂｅｙｏｎｄ” ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；ｖｏｌｕｍｅ９（２０１８），Ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ：１９１１）にさらに詳細に記載されており、その教示は参照により本明細書に援用される。一般的に、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼと特定の標的配列に切断を指示するＲＮＡ（複数可）を含む。例示的なＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ドメイン及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ドメインを有するＲＮＡ（複数可）からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。ｃｒＲＮＡは、通常、２つのＲＮＡドメイン、すなわち塩基対ハイブリダイゼーションを介して標的配列（「定義されたヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列に特異性を向けるガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）；及びｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡドメインを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と相互作用し、それによってゲノム遺伝子座への動員を促進することができる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる単一のポリヌクレオチドであり得る。本明細書ではＣａｓ９系を示すが、Ｃｐｆ１系などの他のＣＲＩＳＰＲ系を使用することもできる。ヌクレアーゼには、その誘導体、例えば、Ｃａｓ９機能性バリアント、例えば、Ｃａｓ９酵素によって通常、生成される完全な二本鎖切断とは対照的に、一般的に、定義されたヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を媒介するＣａｓ９「ニッカーゼ」変異体が含まれ得る。

一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系の成分は互いに相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、配列特異的な切断を媒介する。いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分を個別に生成し、使用して、ＲＮＰ複合体を形成することができる。いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分をｉｎｖｉｔｒｏで個別に生成し、ｉｎｖｉｔｒｏで相互に接触させて（すなわち、「複合体を形成」して）ＲＮＰ複合体を形成することができる。次いで、ｉｎｖｉｔｒｏで生成したＲＮＰを、細胞の細胞質ゾル及び／または核、例えば、Ｔ細胞の細胞質ゾル及び／または核に導入（すなわち、「送達」）することができる。ｉｎｖｉｔｒｏで生成したＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、物理的手段による細胞膜変形、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及び超音波処理を含むがこれらに限定されない、様々な手段によって細胞に送達することができる。特定の例では、ｉｎｖｉｔｒｏで生成したＲＮＰ複合体を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ／Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションベースの送達系（Ｌｏｎｚａ（登録商標））を使用して細胞に送達することができる。他のエレクトロポレーション系として、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーション系、ＭｉｌｔｅｎｙｉＣｌｉｎｉＭＡＣＳエレクトロポレーション系、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション系、及びＢＴＸエレクトロポレーション系が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、当技術分野で公知の様々なタンパク質産生技術を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏで生成（すなわち、合成及び精製）することができる。ＣＲＩＳＰＲ系ＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写または化学合成などの当業者に公知の様々なＲＮＡ生成技術を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏで生成（すなわち、合成及び精製）することができる。

ｉｎｖｉｔｒｏで生成するＲＮＰ複合体は、ヌクレアーゼとｇＲＮＡの様々な比率で複合体を形成することができる。ｉｎｖｉｔｒｏで生成するＲＮＰ複合体はまた、ＣＲＩＳＰＲを介した編集系において異なる量で使用することもできる。例えば、編集したい細胞の数に応じて、反応で多数の細胞を編集する場合には加えるＲＮＰ複合体の量を減らすなど、加えるＲＮＰの総量を調整することができる。

いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分（例えば、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ）は、個別にポリヌクレオチドによってコードされ、各ポリヌクレオチドを一緒にまたは個別に細胞に導入することができる。いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分は、単一のポリヌクレオチド（すなわち、マルチプロモーターまたはマルチシストロン性ベクター、以下の例示的なマルチシストロン系の説明を参照のこと）によってコードされ、これを細胞に導入することができる。各ポリヌクレオチドにコードされたＣＲＩＳＰＲ成分を細胞内で発現（例えば、ヌクレアーゼを翻訳し、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡを転写し）させた後、ＲＮＰ複合体を細胞内で形成させることができ、次いで、部位特異的切断を誘導することができる。

いくつかのＲＮＰは、核へのＲＮＰの送達を促進する部分を有するように操作され得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを有し得、それにより、Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体を細胞のサイトゾルに送達する場合か、またはＣａｓ９の翻訳及びそれに続くＲＮＰ形成の後に、ＮＬＳは、核へのＣａｓ９ＲＮＰのさらなる輸送を促進することができる。

本明細書に記載の操作された細胞は、非ウイルス法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ及び／またはＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集系は、非ウイルス法を使用して細胞に送達することができる。本明細書に記載の操作された細胞は、ウイルス法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ及び／またはＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集系は、ウイルス法、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、または本明細書に記載の他のウイルスベースの送達方法のいずれかを使用して細胞に送達することができる。

いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、複数のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供し、それにより、それぞれが、同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座を、複数の標的ヌクレオチド配列で、個別に標的にすることができる。例えば、２つの別個のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供して、互いに特定の距離内にある２つの異なる標的ヌクレオチド配列で切断を指示することができる。いくつかのＣＲＩＳＰＲ系では、複数のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供し、それにより、それぞれが、同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座の逆ストランドを、個別に標的にすることができる。例えば、２つの別個のＣＲＩＳＰＲ「ニッカーゼ」組成物を提供して、逆ストランド上の同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座で切断を誘導することができる。

一般的に、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲを介した編集系の機能を、他のヌクレアーゼベースのゲノム編集系に適用することができる。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメインと制限エンドヌクレアーゼＦｏｋｌの触媒ドメインからなる、操作された部位特異的ヌクレアーゼである。ＤＮＡ結合ドメインのモノマーの非常に可変的な残基領域に存在するアミノ酸を変更することにより、様々なヌクレオチド配列を標的とする様々な人工ＴＡＬＥＮを作成することができる。その後、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼを標的配列に向かわせ、二本鎖切断を作成する。ＴＡＬＥＮベースの系は、米国第１２／９６５，５９０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、米国特許第１０，１７２，８８０号、及び米国第１３／７３８，３８１号にさらに詳細に記載されており、これらすべてはその全体が参照により本明細書に援用される。ＺＦＮベースの編集系は、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，５０３，７１７号、第６，６８９，５５８号、第７，０３０，２１５号、第６，７９４，１３６号、第７，０６７，３１７号、第７，２６２，０５４号、第７，０７０，９３４号、第７，３６１，６３５号、第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号、第２００５／０２６７０６１号にさらに詳細に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。

他の操作送達系
操作された核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を細胞または他の標的レシピエント実体、例えば、本明細書に記載の脂質構造のいずれかに導入するための様々な追加の手段。

エレクトロポレーションを使用して、ポリヌクレオチドをレシピエント実体に送達することができる。エレクトロポレーションは、電界を印加して、標的細胞または実体の外膜またはシェルを一時的に透過させることにより、カーゴ／ペイロードを標的細胞または実体の内部コンパートメントに内在化させる方法である。一般的に、この方法は、目的のカーゴ（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を含む溶液中の２つの電極の間に細胞または標的実体を配置することを含む。次いで、細胞の脂質膜を、過渡的な設定電圧を印加することによって破壊、すなわち透過性にし、これにより、カーゴが、実体の内部、例えば、細胞の細胞質に進入することができる。細胞の例では、細胞の大部分ではないにしても、少なくともいくつかは生存し続ける。細胞及び他の実体を、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏでエレクトロポレーションすることができる。エレクトロポレーション条件（例えば、細胞数、カーゴの濃度、回復条件、電圧、時間、容量、パルスタイプ、パルス長、体積、キュベット長、エレクトロポレーション溶液の組成など）は、細胞または他のレシピエント実体のタイプ、送達するカーゴ、所望の内在化効率、及び所望の生存率を含むがこれらに限定されないいくつかの要因によって様々に異なる。そのような基準の最適化は、当業者の技術の範囲内である。エレクトロポレーションのために、様々な装置及びプロトコルを使用することができる。例として、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクション系、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＦｌｏｗＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）、Ｌｏｎｚａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）系、及びＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）エレクトロポレーション系が挙げられるが、これらに限定されない。

操作された核酸（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）を細胞または他の標的レシピエント実体に導入するための他の手段として、超音波処理、遺伝子銃、流体力学的注射、及び物理的手段による細胞膜変形が挙げられるが、これらに限定されない。

裸のプラスミドまたはｍＲＮＡなどの操作されたｍＲＮＡをｉｎｖｉｖｏで送達するための組成物及び方法は、Ｋｏｗａｌｓｋｉｅｔａｌ．（ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１９Ａｐｒ１０；２７（４）：７１０－７２８）及びＫａｃｚｍａｒｅｋｅｔａｌ．（ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ．２０１７；９：６０．）に詳細に記載されており、それぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

使用方法
疾患の治療方法もまた、本開示に包含される。当該方法は、上記のように、治療有効量の操作された核酸、操作された細胞、または単離された細胞を投与することを含む。いくつかの態様では、本明細書において、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に開示する治療有効量の操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかを投与することを含む。

いくつかの態様では、本明細書において、対象の腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、本明細書に開示する治療有効量の操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかを投与することを含む。

いくつかの態様では、本明細書において、対象における抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に開示する治療有効量の操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかを投与することを含む。

いくつかの態様では、本明細書において、がんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に開示する治療有効量の操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかを投与することを含む。

いくつかの態様では、本明細書において、対象における腫瘍体積を低減する方法を提供し、方法は、腫瘍を有する対象に、本明細書に開示する操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、投与は、全身投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内投与を含む。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、対象由来である。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、対象に関して同種異系である。

いくつかの実施形態では、方法は、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍から選択される。

いくつかの方法は、腫瘍（またはがん）を有する対象（または患者集団）を選択し、その対象を、操作された細胞または腫瘍媒介免疫抑制機構を調節する送達ビヒクルで治療することを含む。

本明細書で提供する方法はまた、操作された細胞または送達ビヒクルの調製物を送達することを含む。調製物は、いくつかの実施形態では、例えば、操作された細胞以外の細胞を５％未満（例えば、４％、３％、２％、または１％未満）で含む、実質的に純粋な調製物である。調製物は、１×１０^５細胞／ｋｇ～１×１０^７細胞／ｋｇの細胞を含み得る。

本明細書で提供する方法はまた、ＡＣＰを誘導し、及び／または抑制性プロテアーゼを抑制するように、本明細書に開示する治療有効量の操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかと組み合わせて薬物または医薬組成物を投与することを含む。例えば、タモキシフェンまたはその代謝産物（例えば、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、またはエンドキシフェン）を投与して、ＡＣＰを誘導することができる。薬物または医薬品は、本明細書に開示する操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかの投与の前に、共に、同時に、及び／または後に投与することができる。薬剤または医薬品は、連続して投与することができる。薬物または医薬品は、本明細書に開示する操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかの投与と共に、または同時に投与することができる。薬物または医薬品は、本明細書に開示する操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれの投与とも別の間隔で（例えば、前または後に）投与することができる。薬物または医薬品は、本明細書に開示する操作された細胞、単離された細胞、または組成物のいずれかと共に／同時に、及びそれとは別個の間隔の両方で投与することができる。薬物または医薬組成物及び操作された細胞、単離された細胞、または組成物は、異なる経路を介して投与することができ、例えば、当業者であれば理解するように、薬物または医薬組成物を経口投与することができ、操作された細胞、単離された細胞、または組成物を腹腔内、静脈内、皮下、または投与に適切な他の任意の経路に投与することができる。

特定の患者の特定の用量レベル及び投与頻度は様々に異なっていてもよく、使用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄率、薬剤の組み合わせ、特定の病態の重症度、ならびに治療を受けている宿主を含む様々な要因に依存する。

本明細書で提供する方法は、プロテアーゼ阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３プロテアーゼが、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得る。シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の好適なプロテアーゼ阻害剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルから選択される。

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はグラゾプレビルである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、グラゾプレビルとエルバスビル（Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａ複製複合体のＮＳ５Ａ阻害剤）の組み合わせである。グラゾプレビル及びエルバスビルは、錠剤形態（例えば、商品名Ｚｅｐａｔｉｅｒ（登録商標）で入手可能な錠剤）などの医薬組成物として共製剤化することができる。グラゾプレビル及びエルバスビルは、それぞれ２：１の重量比で、例えば、１００ｍｇのグラゾプレビル、５０ｍｇのエルバスビルの単位用量で（例えば、商品名Ｚｅｐａｔｉｅｒ（登録商標）で入手可能な錠剤のように）共製剤化することができる。プロテアーゼ阻害剤は、ＡＣＰの抑制性プロテアーゼドメインを抑制可能な用量で投与することができる。プロテアーゼ阻害剤は、別の適応症のために承認された用量で投与することができる。例示的な非限定的な例として、Ｚｅｐａｔｉｅｒを、ＨＣＶの治療のために承認された用量で投与することができる。

エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルは、単回投与または分割投与で、１日あたり０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇの哺乳動物（例えば、ヒト）体重の用量範囲で経口投与することができる。１回の用量範囲は、単回投与または分割投与で経口的に１日あたり０．０１～５００ｍｇ／ｋｇ体重である。別の用量範囲は、単回投与または分割投与で経口的に１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。経口投与の場合、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルは、治療しようとする患者に対する用量を対症療法的に調整するために、１．０～５００ｍｇの活性成分、特に１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、及び７５０ｍｇの活性成分を含有する錠剤またはカプセルの形態で提供することができる。一般的に、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの１日の総用量は、１日あたり約１～約２５００ｍｇの範囲であり得るが、治療の対象、患者、及び投与経路によって必然的に変動する。一実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約１０～約１０００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約１～約５００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。さらに別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約１～約１００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。さらに別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約１～約５０ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約５００～約１５００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。さらに別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約５００～約１０００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。さらに別の実施形態では、エルバスビルとの併用を含むグラゾプレビルの用量は、約１００～約５００ｍｇ／日であり、単回投与または２～４回の分割投与で投与する。

ｉｎｖｉｖｏ発現
本明細書で提供する方法はまた、本明細書に記載の操作された細胞を生成することができる（例えば、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかをｉｎｖｉｖｏで細胞に送達することができる）組成物をｉｎｖｉｖｏで送達することを含む。そのような組成物は、ウイルス媒介送達プラットフォームのいずれか、脂質構造送達系のいずれか、ナノ粒子送達系のいずれか、ゲノム編集系のいずれか、または細胞をｉｎｖｉｖｏで操作することができる本明細書に記載の他の操作送達系のいずれかを含む。

本明細書で提供する方法はまた、本明細書に記載のエフェクター分子のいずれかを産生することができる組成物をｉｎｖｉｖｏで送達することを含む。本明細書で提供する方法はまた、本明細書に記載の２つ以上のエフェクター分子を産生することができる組成物をｉｎｖｉｖｏで送達することを含む。エフェクター分子のｉｎｖｉｖｏ産生が可能な組成物には、本明細書に記載の操作された核酸のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。エフェクター分子のｉｎｖｉｖｏ産生が可能な組成物は、裸のｍＲＮＡまたは裸のプラスミドであり得る。

医薬組成物
操作された核酸または操作された細胞を、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、１つ以上の操作された核酸または操作された細胞に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は無毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、経皮または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。

経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含めることができる。

静脈内、経皮または皮下注射、または苦痛を伴う部位での注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、好適な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／または他の添加剤を含めることができる。

個体に投与されるものが、ポリペプチド、核酸、小分子、または本開示による他の薬学的に有用な化合物であるかどうかに関わらず、投与は、好ましくは「治療有効量」または「予防有効量」（場合によっては、予防は治療とみなすことができる）であり、これは個体に利益を示すのに十分である。実際に投与する量、ならびに投与の速度及びタイムコースは、治療しようとするタンパク質凝集疾患の性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば用量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られている他の要因が考慮される。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。

組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時投与または逐次投与することができる。

さらなる実施形態
本発明の特定の実施形態を説明する、列挙された実施形態を以下に示す。

実施形態１：操作された核酸であって、
ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
前記第２の発現カセット
を含み、
前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、
前記操作された核酸。

実施形態２：前記第２の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している、実施形態１に記載の操作された核酸。

実施形態３：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする、実施形態１または実施形態２に記載の操作された核酸。

実施形態４：前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態３に記載の操作された核酸。

実施形態５：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態１～２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態６：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能ポリペプチドをコードする、実施形態１～５のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７：前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、実施形態６に記載の操作された核酸。

実施形態８：（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む前記第２の発現カセットが、各Ｘについて、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態９：各Ｘについて、対応する前記分泌シグナルペプチドが前記エフェクター分子と作動可能に関連している、実施形態８に記載の操作された核酸。

実施形態１０：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって天然である天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態８または実施形態９に記載の操作された核酸。

実施形態１１：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態８～１０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１２：前記非天然分泌シグナルペプチドが、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される分子の分泌シグナルペプチドである、実施形態１１に記載の操作された核酸。

実施形態１３：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、ＡＣＰ結合ドメイン配列及びプロモーター配列を含む、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１４：前記プロモーター配列が、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択されるプロモーターに由来する、実施形態１３に記載の操作された核酸。

実施形態１５：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、合成プロモーターを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１６：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、最小プロモーターを含む、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１７：前記ＡＣＰ結合ドメインが、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態１２～１６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１８：前記第１のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターを含む、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１９：前記構成的プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態１８に記載の操作された核酸。

実施形態２０：各エフェクター分子が、独立して、治療クラスから選択され、前記治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態２１：前記サイトカインが、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２２：前記ケモカインが、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１からなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２３：前記ホーミング分子が、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、及びＧＰＲ１５からなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２４：前記成長因子が、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２５：前記共活性化分子が、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２６：前記腫瘍微小環境改変因子が、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２からなる群から選択される、実施形態２０に記載の操作された核酸。

実施形態２７：前記ＴＧＦβ阻害剤が、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２６に記載の操作された核酸。

実施形態２８：前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭｌ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態２６に記載の操作された核酸。

実施形態２９：前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２６に記載の操作された核酸。

実施形態３０：各エフェクター分子がヒト由来のエフェクター分子である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態３１：前記第１の外来ポリヌクレオチド配列が、抗原認識受容体をさらにコードする、実施形態１～３０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態３２：操作された核酸であって、
ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
前記第２の発現カセット
を含み、
前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、
前記操作された核酸。

実施形態３３：操作された核酸であって、
ａ）第１のプロモーターと、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、
前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
前記第２の発現カセット
を含む、前記操作された核酸。

実施形態３４：前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、実施形態３３に記載の操作された核酸。

実施形態３５：前記ＡＣＰが、前記抗原認識受容体であり、前記ＡＣＰが、同族の抗原への前記ＡＣＰの結合に続いて、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、実施形態３３に記載の操作された核酸。

実施形態３６：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記同族の抗原への前記ＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである、実施形態３５に記載の操作された核酸。

実施形態３７：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記同族の抗原への前記ＡＣＰの結合に続いて上方制御される遺伝子のプロモーター領域に由来する、実施形態３６に記載の操作された核酸。

実施形態３８：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び合成プロモーターからなる群から選択される、実施形態３２～３４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態３９：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、最小プロモーターを含む、実施形態３２～３８のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態４０：前記ＡＣＰ結合ドメインが、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態３２～３９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態４１：前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットの間に局在化されたリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～３０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態４２：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記ＡＣＰ及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する、実施形態４１に記載の操作された核酸。

実施形態４３：前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列が、前記ＡＣＰをコードする前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域と、前記抗原認識受容体をコードする前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域の間に局在するリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３１または実施形態３２に記載の操作された核酸。

実施形態４４：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記ＡＣＰ及び前記抗原認識受容体の翻訳と作動可能に関連する、実施形態４３に記載の操作された核酸。

実施形態４５：前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットの間に局在化されたリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３３～３６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態４６：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記抗原受容体及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する、実施形態４５に記載の操作された核酸。

実施形態４７：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする、実施形態４１～４６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態４８：前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態４７に記載の操作された核酸。

実施形態４９：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態４１～４６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５０：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能ポリペプチドをコードする、実施形態４１～４９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５１：前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、実施形態５０に記載の操作された核酸。

実施形態５２：前記抗原認識受容体が、５Ｔ４、ＡＤＡＭ９、ＡＦＰ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｃ４．４、ＣＡ６、カドヘリン３、カドヘリン６、ＣＣＲ４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１６６、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン１８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ４、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＲα、ＦＲｂ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＦＲａ４、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ｇｐＮＢＭ、ＧＰＲＣ５、ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ１ＲＡＰ、インテグリンａＶ、ＫＩＴ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ１、ルイスＹ、ＬｅＹ、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１Ｃ、ＮａＰｉ２Ｂ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＹＥＳＯ１、Ｏｖａｒｉｎ、Ｐ－カドヘリン、汎Ｅｒｂ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＡｕｒｅｓ、ＳＣＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＤＧＦ１、ＴＩＭ１、ＴＲＯＰ２、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原を認識する、実施形態３１～５１のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５３：前記抗原認識受容体が、ＧＰＣ３を認識する、実施形態３１～５２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５４：前記抗原認識受容体が、メソテリン（ＭＳＬＮ）を認識する、実施形態３１～５２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５５：前記抗原認識受容体が、抗原結合ドメインを含む、実施形態３１～５４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態５６：ＧＰＣ３に結合する前記抗原結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
前記ＶＨが、
ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、
ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び
ＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含み、ならびに
前記ＶＬが、
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、
ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び
ＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、
実施形態５３または実施形態５５に記載の操作された核酸。

実施形態５７：前記ＶＨ領域が、
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＭＶＱＰＥＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＩＥＤＴＡＭＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２５）または
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２６）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５６に記載の操作された核酸。

実施形態５８：前記ＶＬ領域が、
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＩＧＥＫＶＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１２７）、または
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１２８）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５６または実施形態５７に記載の操作された核酸。

実施形態５９：ＭＳＬＮに結合する前記抗原結合ドメインが、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
のアミノ酸配列を有する単一ドメインモノクローナル抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、実施形態５４または実施形態５５に記載の操作された核酸。

実施形態６０：前記抗原結合ドメインが、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、実施形態５５～５９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態６１：前記抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態５５～５９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態６２：前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、実施形態６１に記載の操作された核酸。

実施形態６３：前記ＶＨ及びＶＬが、ペプチドリンカーによって分離される、実施形態６２に記載の操作された核酸。

実施形態６４：前記ｓｃＦｖが、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ＶＨが前記重鎖可変ドメインであり、Ｌが前記ペプチドリンカーであり、ＶＬが前記軽鎖可変ドメインである、実施形態６３に記載の操作された核酸。

実施形態６５：前記抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態３１～６４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態６６：前記抗原認識受容体がＣＡＲである、実施形態３１～６５のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態６７：前記ＣＡＲが、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれが、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１６ａ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＮＡＭ－１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＥＡＴ－２細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される、実施形態６６に記載の操作された核酸。

実施形態６８：前記ＣＡＲが、膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインからなる群から選択される、実施形態６６または実施形態６７に記載の操作された核酸。

実施形態６９：前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含む、実施形態６６～６８のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７０：前記ＡＣＰが、転写モジュレーターである、実施形態１～６９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７１：前記ＡＣＰが、転写抑制因子である、実施形態１～７０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７２：前記ＡＣＰが、転写活性化因子である、実施形態１～７０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７３：前記ＡＣＰが、抑制性プロテアーゼ、及び前記抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位をさらに含む、実施形態１～７２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７４：前記ＡＣＰが、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＥＲＴ２ドメイン）をさらに含む、実施形態１～７３のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７５：前記ＡＣＰが、転写因子である、実施形態７２～７４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７６：前記転写因子が、ジンクフィンガー含有転写因子である、実施形態７４に記載の操作された核酸。

実施形態７７：前記ＡＣＰが、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及び転写エフェクタードメインを含む、実施形態１～７６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態７８：前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュール式の設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなる、実施形態７７に記載の操作された核酸。

実施形態７９：前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のＺＦＡを含む、実施形態７８に記載の操作された核酸。

実施形態８０：前記エフェクタードメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（ＶＰＲ活性化ドメイン）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメイン）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態７７～７９のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態８１：前記抑制性プロテアーゼの前記１つ以上の同族切断部位が、前記ＺＦタンパク質ドメインと前記エフェクタードメインの間に局在化している、実施形態７７～８０のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態８２：前記抑制性プロテアーゼが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）である、実施形態７３～８１のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態８３：前記同族切断部位が、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を含む、実施形態８２に記載の操作された核酸。

実施形態８４：前記ＮＳ３プロテアーゼ切断部位が、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合点切断部位を含む、実施形態８３に記載の操作された核酸。

実施形態８５：前記ＮＳ３プロテアーゼが、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得る、実施形態８２～８４のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態８６：前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、実施形態８５に記載の操作された核酸。

実施形態８７：前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビルである、実施形態８５に記載の操作された核酸。

実施形態８８：前記プロテアーゼ阻害剤が、グラゾプレビル及びエルバスビルを含む、実施形態８５に記載の操作された核酸。

実施形態８９：前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが、医薬組成物中に共製剤化される、実施形態８８に記載の操作された核酸。

実施形態９０：前記医薬組成物が錠剤である、実施形態８９に記載の操作された核酸。

実施形態９１：前記グラゾプレビルと前記エルバスビルが、２：１の重量比である、実施形態８９または９０に記載の操作された核酸。

実施形態９２：前記グラゾプレビルが、単位用量あたり１００ｍｇであり、前記エルバスビルが、単位用量あたり５０ｍｇである、実施形態９１に記載の操作された核酸。

実施形態９３：前記ＡＣＰが、前記ＥＲＴ２ドメインがタモキシフェンまたはその代謝産物に結合すると核局在化を受けることができる、実施形態７４～９２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態９４：前記タモキシフェン代謝産物が、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される、実施形態９３に記載の操作された核酸。

実施形態９５：前記ＡＣＰが、デグロンをさらに含み、前記デグロンが、作動可能に前記ＡＣＰに連結されている、実施形態１～９２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態９６：前記デグロンが、ＨＣＶＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の２つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２及びＮＢのタンデムリピート（ＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２））、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の４つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ１及びＳＰ２のタンデムリピート（ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２））、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の３つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３Ａ及びＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２及びＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存性デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態９５に記載の操作された核酸。

実施形態９７：前記デグロンが、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合することができ、それによってユビキチン経路を介した前記ＡＣＰの分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む、実施形態９３に記載の操作された核酸。

実施形態９８：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合が可能な、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳＥ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７、及びＺＮ８２７、またはそれらの断片からなる群から選択される、実施形態９７に記載の操作された核酸。

実施形態９９：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である、実施形態９７に記載の操作された核酸。

実施形態１００：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、
ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号１３１）
のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である、実施形態９７に記載の操作された核酸。

実施形態１０１：前記ＩＭｉＤがＦＤＡ承認薬である、実施形態９７～１００のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０２：前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドからなる群から選択される、実施形態９７～１０１のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０３：前記デグロンが、前記抑制性プロテアーゼの５’、前記抑制性プロテアーゼの３’、前記ＺＦタンパク質ドメインの５’、前記ＺＦタンパク質ドメインの３’、前記エフェクタードメインの５’、または前記エフェクタードメインの３’に局在している、実施形態９３～１０２のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０４：前記操作された核酸が、インシュレーターをさらに含む、実施形態１～１０３のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０５：前記インシュレーターが、前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットの間に局在している、実施形態１０４に記載の操作された核酸。

実施形態１０６：前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して同じ方向に局在している、実施形態１～１０５のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０７：前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して反対の方向に局在している、実施形態１～１０６のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０８：前記操作された核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態１０９：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む、発現ベクター。

実施形態１１０：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

実施形態１１１：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸または実施形態１０９に記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。

実施形態１１２：前記操作された核酸を、組換え発現させる、実施形態１１１に記載の単離された細胞。

実施形態１１３：前記操作された核酸を、ベクターまたは前記細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現させる、実施形態１１１または実施形態１１２に記載の単離された細胞。

実施形態１１４：前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１１１～１１３のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１１５：前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態１１１～１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１１６：前記細胞が自家である、実施形態１１１～１１５のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１１７：前記細胞が同種異系である、実施形態１１１～１１５のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１１８：前記細胞が、腺癌細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、精巣卵黄嚢腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、実施形態１１１～１１３のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１１９：前記細胞を、腫瘍溶解性ウイルスによる形質導入を介して操作した、実施形態１１８に記載の単離された細胞。

実施形態１２０：前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体からなる群から選択される、実施形態１１９に記載の単離された細胞。

実施形態１２１：前記腫瘍溶解性ウイルスが、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１１９または実施形態１２０に記載の単離された細胞。

実施形態１２２：前記細胞が、クロストリジウム・ベエイジェリンキー、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ノビイ、大腸菌、シュードモナス・エルジノーサ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、及びサルモネラ・コレレスイスからなる群から選択される細菌細胞である、実施形態１１１～１１３のいずれか一項に記載の単離された細胞。

実施形態１２３：実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の単離された細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

実施形態１２４：治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の治療有効量の単離された細胞のいずれか、または実施形態１２３に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１２５：対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の治療有効量の単離された細胞のいずれか、または実施形態１２３に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。

実施形態１２６：対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の治療有効量の単離された細胞のいずれか、または実施形態１２３に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。

実施形態１２７：がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の治療有効量の単離された細胞のいずれか、または実施形態１２３に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１２８：対象における腫瘍体積を低減する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載の単離された細胞のいずれかを含む組成物、または実施形態１２３に記載の組成物を投与することを含む、前記低減方法。

実施形態１２９：前記投与が、全身投与を含む、実施形態１２４～１２８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３０：前記投与が、腫瘍内投与を含む、実施形態１２４～１２８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３１：前記単離された細胞が、前記対象に由来する、実施形態１２４～１３０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３２：前記単離された細胞が、前記対象に関して同種異系である、実施形態１２４～１３０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３３：前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態１２４～１３２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３４：前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態１３３に記載の方法。

実施形態１３５：前記方法が、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む、実施形態１２４～１３４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３６：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態１２５～１３５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３７：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む、脂質ベースの構造体。

実施形態１３８：前記脂質ベースの構造体が、細胞外小胞を含む、実施形態１３７に記載の脂質ベースの構造体。

実施形態１３９：前記細胞外小胞が、ナノベシクル及びエキソソームからなる群から選択される、実施形態１３８に記載の脂質ベースの構造体。

実施形態１４０：前記脂質ベースの構造体が、脂質ナノ粒子またはミセルを含む、実施形態１３７に記載の脂質ベースの構造体。

実施形態１４１：前記脂質ベースの構造体が、リポソームを含む、実施形態１３７に記載の脂質ベースの構造体。

実施形態１４２：実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の脂質ベースの構造体、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

実施形態１４３：治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体のいずれか、または実施形態１４２に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１４４：対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体のいずれか、または実施形態１４２に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。

実施形態１４５：対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体のいずれか、または実施形態１４２に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。

実施形態１４６：がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の治療有効量の脂質ベースの構造体のいずれか、または実施形態１４２に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１４７：対象における腫瘍体積を低減する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１３７～１４１のいずれか一項に記載の脂質ベースの構造体のいずれかを含む組成物、または実施形態１４２に記載の組成物を投与することを含む、前記低減方法。

実施形態１４８：前記投与が、全身投与を含む、実施形態１４３～１４７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１４９：前記投与が、腫瘍内投与を含む、実施形態１４４～１４７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５０：前記脂質ベースの構造体が、前記対象の細胞を操作することができる、実施形態１４３～１４９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５１：前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態１４３～１５０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５２：前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態１５１に記載の方法。

実施形態１５３：前記方法が、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む、実施形態１４３～１５２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５４：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態１４４～１５３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５５：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む、ナノ粒子。

実施形態１５６：前記ナノ粒子が、無機材料を含む、実施形態１５５に記載のナノ粒子。

実施形態１５７：実施形態１５５または実施形態１５６に記載のナノ粒子を含む、組成物。

実施形態１５８：治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１５５または実施形態１５６に記載の治療有効量のナノ粒子のいずれか、または実施形態１５７に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１５９：対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１５５または実施形態１５６に記載の治療有効量のナノ粒子のいずれか、または実施形態１５７に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。

実施形態１６０：対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、実施形態１５５または実施形態１５６に記載の治療有効量のナノ粒子のいずれか、または実施形態１５７に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。

実施形態１６１：がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１５５または実施形態１５６に記載の治療有効量のナノ粒子のいずれか、または実施形態１５７に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１６２：対象における腫瘍体積を低減する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１５５もしくは実施形態１５６に記載のナノ粒子のいずれかを含む組成物、または実施形態１５７に記載の組成物を投与することを含む、前記低減方法。

実施形態１６３：前記投与が、全身投与を含む、実施形態１５８～１６２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６４：前記投与が、腫瘍内投与を含む、実施形態１５９～１６２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６５：前記ナノ粒子が、前記対象の細胞を操作することができる、実施形態１５８～１６４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６６：前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態１５８～１６５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６７：前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態１６６に記載の方法。

実施形態１６８：前記方法が、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む、実施形態１５８～１６７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６９：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態１５９～１６８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１７０：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の操作された核酸を含むように操作されたウイルス。

実施形態１７１：前記ウイルスが、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択される、実施形態１７０に記載の操作されたウイルス。

実施形態１７２：前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１７０に記載の操作されたウイルス。

実施形態１７３：前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、腫瘍細胞内で発現することができる、実施形態１７２に記載の操作されたウイルス。

実施形態１７４：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態１７３に記載の操作されたウイルス。

実施形態１７５：前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体からなる群から選択される、実施形態１７１～１７４のいずれか一項に記載の操作されたウイルス。

実施形態１７６：実施形態１７０～１７５のいずれか一項に記載の操作されたウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

実施形態１７７：対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１７０～１７５のいずれか一項に記載の治療有効量の操作されたウイルスのいずれか、または実施形態１７６に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。

実施形態１７８：対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、実施形態１７０～１７５のいずれか一項に記載の治療有効量の操作されたウイルスのいずれか、または実施形態１７６に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。

実施形態１７９：がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１７０～１７５のいずれか一項に記載の治療有効量の操作されたウイルスのいずれか、または実施形態１７６に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態１８０：対象における腫瘍体積を低減する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１７０～１７５のいずれか一項に記載の操作されたウイルスのいずれかを含む組成物、または実施形態１７６に記載の組成物を投与することを含む、前記低減方法。

実施形態１８１：前記投与が、全身投与を含む、実施形態１７７～１８０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８２：前記投与が、腫瘍内投与を含む、実施形態１７７～１８０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８３：前記操作されたウイルスが、前記対象の細胞に感染し、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットを発現する、実施形態１７７～１８２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８４：前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態１７７～１８３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８５：前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態１８４に記載の方法。

実施形態１８６：前記方法が、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む、実施形態１７７～１８５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８７：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態１７７～１８６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１８８：操作された細胞であって、
ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
第２の発現カセット
を含み、
前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、
前記操作された細胞。

実施形態１８９：前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１８８に記載の操作された細胞。

実施形態１９０：前記第１の発現カセット及び第２の発現カセットが、単一のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１８８に記載の操作された細胞。

実施形態１９１：前記第２の発現カセットが、（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌ_１リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している、請求項１８８～１９０のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態１９２：前記操作された細胞が、第２のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記第２のリンカーポリヌクレオチドが、前記第１の発現カセットを前記第２の発現カセットに連結する、実施形態１９０または実施形態１９１に記載の操作された細胞。

実施形態１９３：前記第２のリンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子及び前記ＡＣＰの翻訳と作動可能に関連する、実施形態１９２に記載の操作された細胞。

実施形態１９４：各リンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする、実施形態１８８～１９３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態１９５：前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態１９４に記載の操作された細胞。

実施形態１９６：各リンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態１８８～１９３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態１９７：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能ポリペプチドをコードする、実施形態１８８～１９６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態１９８：前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、実施形態１９７に記載の操作された細胞。

実施形態１９９：（Ｌ_１－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む前記第２の発現カセットが、各Ｘについて、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１８８～１９８のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２００：各Ｘについて、対応する前記分泌シグナルペプチドが前記エフェクター分子と作動可能に関連している、実施形態１９９に記載の操作された細胞。

実施形態２０１：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって天然である天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態１９９または実施形態２００に記載の操作された細胞。

実施形態２０２：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態１９９～２０１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２０３：前記非天然分泌シグナルペプチドが、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される分子の分泌シグナルペプチドである、実施形態２０２に記載の操作された細胞。

実施形態２０４：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、ＡＣＰ結合ドメイン及びプロモーター配列を含む、実施形態１８８～２０３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２０５：前記プロモーター配列が、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択されるプロモーターに由来する、実施形態２０４に記載の操作された細胞。

実施形態２０６：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、合成プロモーターである、実施形態１８８～２０５のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２０７：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、最小プロモーターを含む、実施形態１８８～２０６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２０８：前記ＡＣＰ結合ドメインが、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態２０４～２０７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２０９：前記第１のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである、実施形態１８８～２０８のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２１０：前記構成的プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態２０９に記載の操作された細胞。

実施形態２１１：各エフェクター分子が、独立して、治療クラスから選択され、前記治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、実施形態１８８～２１０のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２１２：前記サイトカインが、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される、実施形態２１１に記載の操作された細胞。

実施形態２１３：前記ケモカインが、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１からなる群から選択される、実施形態２１２に記載の操作された細胞。

実施形態２１４：前記ホーミング分子が、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、及びＧＰＲ１５からなる群から選択される、実施形態２１１に記載の操作された細胞。

実施形態２１５：前記成長因子が、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される、実施形態２１１に記載の操作された細胞。

実施形態２１６：前記共活性化分子が、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ、及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、実施形態２１１に記載の操作された細胞。

実施形態２１７：前記腫瘍微小環境改変因子が、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２からなる群から選択される、実施形態２１１に記載の操作された細胞。

実施形態２１８：前記ＴＧＦβ阻害剤が、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２１７に記載の操作された細胞。

実施形態２１９：前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭｌ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態２１７に記載の操作された細胞。

実施形態２２０：前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２１７に記載の操作された細胞。

実施形態２２１：各エフェクター分子がヒト由来のエフェクター分子である、実施形態１８８～２１７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２２２：前記細胞が、第３のプロモーター、及び抗原認識受容体をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、前記第３のプロモーターが、前記第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態１８８～２２１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２２３：前記第１の外来ポリヌクレオチド配列が、抗原認識受容体をさらにコードする、実施形態１８８～２２１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２２４：操作された細胞であって、
ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）及び抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
第２の発現カセット
を含み、
前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、
前記操作された細胞。

実施形態２２５：操作された細胞であって、
ａ）第１のプロモーターと、抗原認識受容体をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、ならびに
ｂ）活性化条件付き制御ポリペプチド応答性（ＡＣＰ応答性）プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
第２の発現カセット
を含む、前記操作された細胞。

実施形態２２６：前記細胞が、第３のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第３の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第３の発現カセットをさらに含み、前記第３のプロモーターが、前記第３の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態２２５に記載の操作された細胞。

実施形態２２７：前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、実施形態２２６に記載の操作された細胞。

実施形態２２８：前記ＡＣＰが、前記抗原認識受容体であり、前記ＡＣＰが、同族の抗原への前記ＡＣＰの結合に続いて、前記第２の発現カセットの発現を誘導することができる、実施形態２２５に記載の操作された細胞。

実施形態２２９：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記同族の抗原への前記ＡＣＰの結合によって誘導され得る誘導性プロモーターである、実施形態２２８に記載の操作された細胞。

実施形態２３０：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記同族の抗原への前記ＡＣＰの結合に続いて上方制御される遺伝子のプロモーター領域に由来する、実施形態２２９に記載の操作された細胞。

実施形態２３１：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び合成プロモーターからなる群から選択される、実施形態２２４～２２７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２３２：前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、別個のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２２４～２３１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２３３：前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、最小プロモーターを含む、実施形態２２４～２３２のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２３４：前記ＡＣＰ結合ドメインが、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態２２４～２３３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２３５：前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列が、前記ＡＣＰをコードする前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域と、前記抗原認識受容体をコードする前記第１の外来性ポリヌクレオチド配列の領域の間に局在する第３のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２２４または実施形態２２５に記載の操作された細胞。

実施形態２３６：前記第３のリンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記ＡＣＰ及び前記抗原認識受容体の翻訳と作動可能に関連する、実施形態２３５に記載の操作された細胞。

実施形態２３７：前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットの間に局在化された第３のリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２２５～２３４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２３８：前記第３のリンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記抗原受容体及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連する、実施形態２３７に記載の操作された細胞。

実施形態２３９：前記第３のリンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする、実施形態２３５～２３８のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４０：前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態２３９に記載の操作された細胞。

実施形態２４１：前記第３のリンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態２３５～２３８のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４２：前記第３のリンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能ポリペプチドをコードする、実施形態２３５～２４１のいずれか一項に記載の操作された核酸。

実施形態２４３：前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、実施形態２４２に記載の操作された核酸。

実施形態２４４：前記抗原認識受容体が、５Ｔ４、ＡＤＡＭ９、ＡＦＰ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｃ４．４、ＣＡ６、カドヘリン３、カドヘリン６、ＣＣＲ４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１６６、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン１８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ４、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＲα、ＦＲｂ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＦＲａ４、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ｇｐＮＢＭ、ＧＰＲＣ５、ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ１ＲＡＰ、インテグリンａＶ、ＫＩＴ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ１、ルイスＹ、ＬｅＹ、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１Ｃ、ＮａＰｉ２Ｂ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＹＥＳＯ１、Ｏｖａｒｉｎ、Ｐ－カドヘリン、汎Ｅｒｂ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＡｕｒｅｓ、ＳＣＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＤＧＦ１、ＴＩＭ１、ＴＲＯＰ２、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原を認識する、実施形態２２２～２４３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４５：前記抗原認識受容体が、ＧＰＣ３を認識する、実施形態２２２～２４４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４６：前記抗原認識受容体が、メソテリンを認識する、実施形態２２２～２４４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４７：前記抗原認識受容体が、抗原結合ドメインを含む、実施形態２２２～２４６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２４８：ＧＰＣ３に結合する前記抗原結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
前記ＶＨが、
ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、
ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び
ＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
を含み、ならびに
前記ＶＬが、
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、
ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び
ＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、
実施形態２４５または実施形態２４７に記載の操作された細胞。

実施形態２４９：前記ＶＨ領域が、
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＭＶＱＰＥＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＩＥＤＴＡＭＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２５）または
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＫＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２６）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２４８に記載の操作された細胞。

実施形態２５０：前記ＶＬ領域が、
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＩＧＥＫＶＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１２７）、または
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＳＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１２８）
のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２４８または実施形態２４９に記載の操作された細胞。

実施形態２５１：ＭＳＬＮに結合する前記抗原結合ドメインが、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＴＶＱＡＧＧＳＬＫＬＡＣＡＡＳＧＬＰＲＴＹＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＩＩＹＴＴＴＧＡＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＡＴＩＳＱＤＮＡＫＫＳＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＩＹＹＣＶＡＲＱＰＮＳＧＰＷＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２９）、または
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＹＴＮＳＹＫＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＧＶＡＶＩＹＴＧＮＤＲＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＩＹＬＤＭＴＲＬＲＰＥＤＳＡＶＹＥＣＡＩＧＨＤＧＡＷＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３０）
のアミノ酸配列を有する単一ドメインモノクローナル抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、実施形態２４６または実施形態２４７に記載の操作された細胞。

実施形態２５２：前記抗原結合ドメインが、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、実施形態２４７～２５１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２５３：前記抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態２４７～２５１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２５４：前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、実施形態２５３に記載の操作された細胞。

実施形態２５５：前記ＶＨ及びＶＬが、ペプチドリンカーによって分離される、実施形態２５４に記載の操作された細胞。

実施形態２５６：前記ｓｃＦｖが、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ＶＨが前記重鎖可変ドメインであり、Ｌが前記ペプチドリンカーであり、ＶＬが前記軽鎖可変ドメインである、実施形態２５４または実施形態２５５に記載の操作された細胞。

実施形態２５７：前記抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態２２２～２５６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２５８：前記抗原認識受容体がＣＡＲである、実施形態２５７に記載の操作された細胞。

実施形態２５９：前記ＣＡＲが、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれが、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１６ａ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＮＡＭ－１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＥＡＴ－２細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される、実施形態２５８に記載の操作された細胞。

実施形態２６０：前記ＣＡＲが、膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインからなる群から選択される、実施形態２５８または実施形態２５９に記載の操作された細胞。

実施形態２６１：前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含む、実施形態２５８～２６０のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６２：前記ＡＣＰが、転写モジュレーターである、実施形態１８８～２６１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６３：前記ＡＣＰが、転写抑制因子である、実施形態１８８～２６１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６４：前記ＡＣＰが、転写活性化因子である、実施形態１８８～２６１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６５：前記ＡＣＰが、抑制性プロテアーゼ、及び前記抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位をさらに含む、実施形態１８８～２６４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６６：前記ＡＣＰが、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＥＲＴ２ドメイン）をさらに含む、実施形態１８８～２６４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６７：前記ＡＣＰが、転写因子である、実施形態２６４～２６６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２６８：前記ＡＣＰが、ジンクフィンガー含有転写因子である、実施形態２３７に記載の操作された細胞。

実施形態２６９：前記ジンクフィンガー含有転写因子が、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及びエフェクタードメインを含む、実施形態２６８に記載の操作された細胞。

実施形態２７０：前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュール式の設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなる、実施形態２６９に記載の操作された細胞。

実施形態２７１：前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のＺＦＡを含む、実施形態２７０に記載の操作された細胞。

実施形態２７２：前記エフェクタードメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（ＶＰＲ活性化ドメイン）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメイン）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態２６９～２７１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２７３：前記抑制性プロテアーゼの前記１つ以上の同族切断部位が、前記ＺＦタンパク質ドメインと前記エフェクタードメインの間に局在化している、実施形態２６９～２７２のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２７４：前記抑制性プロテアーゼが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）である、実施形態２６５～２７３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２７５：前記同族切断部位が、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を含む、実施形態２７４に記載の操作された細胞。

実施形態２７６：前記ＮＳ３プロテアーゼ切断部位が、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合点切断部位を含む、実施形態２７５に記載の操作された細胞。

実施形態２７７：前記ＮＳ３プロテアーゼが、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得る、実施形態２７４～２７６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２７８：前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、実施形態２７７に記載の操作された細胞。

実施形態２７９：前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビルである、実施形態２７７に記載の操作された細胞。

実施形態２８０：前記プロテアーゼ阻害剤が、グラゾプレビル及びエルバスビルである、実施形態２７７に記載の操作された細胞。

実施形態２８１：前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが、医薬組成物中に共製剤化される、実施形態２８０に記載の操作された細胞。

実施形態２８２：前記医薬組成物が錠剤である、実施形態２８１に記載の操作された細胞。

実施形態２８３：前記グラゾプレビルと前記エルバスビルが、２：１の重量比である、実施形態２８１または２８２に記載の操作された細胞。

実施形態２８４：前記グラゾプレビルが、単位用量あたり１００ｍｇであり、前記エルバスビルが、単位用量あたり５０ｍｇである、実施形態２８３に記載の操作された細胞。

実施形態２８５：前記ＡＣＰが、前記ＥＲＴ２ドメインがタモキシフェンまたはその代謝産物に結合すると核局在化を受けることができる、実施形態２６６～２８４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２８６：前記タモキシフェン代謝産物が、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される、実施形態２８５に記載の操作された細胞。

実施形態２８７：前記ＡＣＰが、デグロンをさらに含み、前記デグロンが、作動可能に前記ＡＣＰに連結されている、実施形態１８８～２８６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２８８：前記デグロンが、ＨＣＶＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の２つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２及びＮＢのタンデムリピート（ＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２））、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の４つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ１及びＳＰ２のタンデムリピート（ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２））、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の３つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３Ａ及びＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２及びＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存性デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態２８７に記載の操作された細胞。

実施形態２８９：前記デグロンが、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合することができ、それによってユビキチン経路を介した前記ＡＣＰの分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む、実施形態２８７に記載の操作された細胞。

実施形態２９０：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合が可能な、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳＥ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７、及びＺＮ８２７、またはそれらの断片からなる群から選択される、実施形態２８９に記載の操作された細胞。

実施形態２９１：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である、実施形態２８９に記載の操作された細胞。

実施形態２９２：前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、
ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号１３１）
のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である、実施形態２８９に記載の操作された細胞。

実施形態２９３：前記ＩＭｉＤがＦＤＡ承認薬である、実施形態２８９～２９２のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２９４：前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドからなる群から選択される、実施形態２８９～２９３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２９５：前記デグロンが、前記抑制性プロテアーゼの５’、前記抑制性プロテアーゼの３’、前記ＺＦタンパク質ドメインの５’、前記ＺＦタンパク質ドメインの３’、前記エフェクタードメインの５’、または前記エフェクタードメインの３’に局在している、実施形態２８５～２９４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２９６：前記操作された核酸が、インシュレーターをさらに含む、実施形態１９０～２９５のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２９７：前記インシュレーターが、前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットの間に局在している、実施形態２９６に記載の操作された細胞。

実施形態２９８：前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して同じ方向に局在している、実施形態１９０～２９７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態２９９：前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して反対の方向に局在している、実施形態１９０～２９７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３００：前記細胞が、追加のプロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する追加の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む追加の発現カセットをさらに含み、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記追加のプロモーターが、前記追加の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
実施形態１８８～２９９のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３０１：前記追加の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各Ｌリンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連している、実施形態３００に記載の操作された細胞。

実施形態３０２：各リンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードする、実施形態３００または実施形態３０１に記載の操作された細胞。

実施形態３０３：前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態３０２に記載の操作された細胞。

実施形態３０４：各リンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態３００または実施形態３０１に記載の操作された細胞。

実施形態３０５：前記リンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能ポリペプチドをコードする、実施形態３００～３０４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３０６：前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、実施形態３０５に記載の操作された細胞。

実施形態３０７：（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む前記追加の発現カセットが、各Ｘについて、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３００～３０６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３０８：各Ｘについて、対応する前記分泌シグナルペプチドが前記エフェクター分子と作動可能に関連している、実施形態３０７に記載の操作された細胞。

実施形態３０９：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって天然である天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態３０７または実施形態３０８に記載の操作された細胞。

実施形態３１０：各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含む、実施形態３０７～３０９のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３１１：前記非天然分泌シグナルペプチドが、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化ＩＬ２、トリプシノーゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される分子の分泌シグナルペプチドである、実施形態３１０に記載の操作された細胞。

実施形態３１２：前記追加のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターである、実施形態３００～３１１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３１３：前記追加のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態３００～３１１のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３１４：各エフェクター分子が、独立して、治療クラスから選択され、前記治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、実施形態３００～３１３のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３１５：前記サイトカインが、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３１６：前記ケモカインが、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１からなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３１７：前記ホーミング分子が、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、及びＧＰＲ１５からなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３１８：前記成長因子が、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３１９：前記共活性化分子が、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ、及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３２０：前記腫瘍微小環境改変因子が、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２からなる群から選択される、実施形態３１４に記載の操作された細胞。

実施形態３２１：前記ＴＧＦβ阻害剤が、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３２０に記載の操作された細胞。

実施形態３２２：前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭｌ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態３２０に記載の操作された細胞。

実施形態３２３：前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３２０に記載の操作された細胞。

実施形態３２４：各エフェクター分子がヒト由来のエフェクター分子である、実施形態３００～３２０のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３２５：前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１８８～３２４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３２６：前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態１８８～３２５のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３２７：前記細胞が自家である、実施形態１８８～３２６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３２８：前記細胞が同種異系である、実施形態１８８～３２６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３２９：前記細胞が、腺癌細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、精巣卵黄嚢腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、実施形態１８８～３２４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３３０：前記細胞を、腫瘍溶解性ウイルスによる形質導入を介して操作した、実施形態３２９に記載の操作された細胞。

実施形態３３１：前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性はしかウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアントまたは誘導体からなる群から選択される、実施形態３３０に記載の操作された細胞。

実施形態３３２：前記腫瘍溶解性ウイルスが、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態３３０または実施形態３３１に記載の操作された細胞。

実施形態３３３：前記細胞が、クロストリジウム・ベエイジェリンキー、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ノビイ、大腸菌、シュードモナス・エルジノーサ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、及びサルモネラ・コレレスイスからなる群から選択される細菌細胞である、実施形態１８８～３２４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

実施形態３３４：実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の操作された細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

実施形態３３５：治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の治療有効量の操作された細胞のいずれか、または実施形態３３４に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態３３６：対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の治療有効量の操作された細胞のいずれか、または実施形態３３４に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。

実施形態３３７：対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の治療有効量の操作された細胞のいずれか、または実施形態３３４に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。

実施形態３３８：がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の治療有効量の操作された細胞のいずれか、または実施形態３３４に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。

実施形態３３９：対象における腫瘍体積を低減する方法であって、前記方法が、腫瘍を有する対象に、実施形態１８８～３３３のいずれか一項に記載の操作された細胞のいずれかを含む組成物、または実施形態３３４に記載の組成物を投与することを含む、前記低減方法。

実施形態３４０：前記投与が、全身投与を含む、実施形態３３５～３３９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４１：前記投与が、腫瘍内投与を含む、実施形態３３６～３３９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４２：前記操作された細胞が、前記対象に由来する、実施形態３３５～３４１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４３：前記操作された細胞が、前記対象に関して同種異系である、実施形態３３５～３４１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４４：前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態３３５～３４３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４５：前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭ１抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択される、実施形態３４４に記載の方法。

実施形態３４６：前記方法が、抗ＣＤ４０抗体を投与することをさらに含む、実施形態３３５～３４５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４７：前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、実施形態３３６～３４６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４８：前記方法が、プロテアーゼ阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態３３５～３４７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３４９：前記プロテアーゼ阻害剤を、抑制性プロテアーゼを抑制するのに十分な量で投与する、実施形態３４８に記載の方法。

実施形態３５０：前記プロテアーゼ阻害剤を、前記操作された細胞または前記操作された細胞を含む前記組成物の投与の前に、同時に、その後に投与する、実施形態３４８または３４９に記載の方法。

実施形態３５１：前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、実施形態３５０に記載の方法。

実施形態３５２：前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビルである、実施形態３５０に記載の方法。

実施形態３５３：前記プロテアーゼ阻害剤が、グラゾプレビル及びエルバスビルを含む、実施形態３５０に記載の方法。

実施形態３５４：前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが、医薬組成物中に共製剤化される、実施形態３５３に記載の方法。

実施形態３５５：前記医薬組成物が、錠剤である、実施形態３５４に記載の方法。

実施形態３５６：前記グラゾプレビルと前記エルバスビルが、２：１の重量比である、実施形態３５４または３５５に記載の方法。

実施形態３５７：前記グラゾプレビルが、単位用量あたり１００ｍｇであり、前記エルバスビルが、単位用量あたり５０ｍｇである、実施形態３５６に記載の操作された核酸。

実施形態３５８：前記方法が、タモキシフェンまたはその代謝産物を投与することをさらに含む、実施形態３３５～３４７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態３５９：前記タモキシフェン代謝産物が、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される、実施形態３５８に記載の方法。

以下は、本開示を実行するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例証目的で提示されているにすぎず、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、当然いくつかの実験によるエラー及び偏差が許容されるはずである。

本開示の実施では、別途指示のない限り、当業者の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法が用いられるであろう。そのような手法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋａｎｄＮ．Ｋａｐｌａｎｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０）、ＣａｒｅｙａｎｄＳｕｎｄｂｅｒｇＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３^ｒｄＥｄ．（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）ＶｏｌｓＡａｎｄＢ（１９９２）を参照のこと。

実施例１：薬物誘導性の調節性転写因子を介したエフェクター遺伝子の発現の調節
エフェクター遺伝子の発現を駆動するための抑制性プロテアーゼ及びプロテアーゼ切断部位を有する例示的なジンクフィンガー転写因子（調節性ＴＦ）を構築した。調節性ＴＦは、ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ３切断部位、及び転写因子の活性化ドメインに結合したジンクフィンガー（ＺＦ）ＤＮＡ結合ドメインである（図１Ａ、ＺＦドメインは、上部パネルの図の左側に示されている円であり、ＮＳ３プロテアーゼは、上部パネルの図の中央に示されている部分的な円であり、活性化ドメインは上部パネルの図の右側に示されている正方形である）。図１Ａに記載されている完全構築物は、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）の例である。調節性ＴＦの発現は、構成的ＳＦＦＶプロモーターを介して駆動される。未処理の細胞（例えば、プロテアーゼ阻害剤の非存在下）では、調節性ＴＦタンパク質が生成されるが、ＮＳ３プロテアーゼが、調節性ＴＦタンパク質のＺＦＤＮＡ結合ドメインから活性化ドメインを自己切断し、これにより、ＴＦタンパク質がエフェクター遺伝子の発現を誘導することが阻害される。しかしながら、アスナプレビル（ＡＳＶ）などのプロテアーゼ阻害剤の存在下では、ＮＳ３プロテアーゼが阻害され、調節性ＴＦタンパク質が安定化される。次いで、調節性ＴＦが、ＺＦＤＮＡ結合ドメインを介してＺＦ特異的プロモーター領域に結合し、エフェクター遺伝子の発現を促進する。ＺＦ特異的ＤＮＡ配列は、図１、２、３、４、及び５において、ＢＤ（結合ドメイン）と称されている。

本実施例では、調節性ＴＦデュアルベクター系を合成した。デュアルベクター系では、調節性ＴＦ遺伝子は１つの発現ベクター内にあり、一方、ＺＦ－ＢＤとエフェクター遺伝子は別の発現ベクターにある。本実施例では、一方がｍｉｎＣＭＶプロモーターを有し（図１Ａ）、もう一方がｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーターを有する（図１Ｃ）、２つの異なるＺＦ－ＢＤ及びエフェクター遺伝子発現カセットならびにベクターを作製した。図１のパネルＡは、ｍｉｎＣＭＶプロモーターを備えたデュアルベクター調節性ＴＦ系の例示的な概略図を示す。

材料及び方法
Ｔ細胞を解凍し、１０Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を含有するＸ－Ｖｉｖｏ１０（商標）（ＸＬｏｎｚａ）培地中で静置した（０日目）。１日目に、Ｔ細胞を、３：１比率のＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で活性化し、１００Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を補充した。２日目に、各レンチウイルスについて、１×１０^５ＧＶ（ＧｏＳｔｉｘ値）ユニットのレンチウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞にＡＣＰＴＦベクター及びＡＣＰＴＦ誘導性ｍＣｈｅｒｒｙベクターを同時形質導入した。ダイナビーズを３日目に除去し、Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２の新鮮な培地中で１×１０^６細胞／ｍｌに希釈した。６日目に、Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を含有する新鮮な培地Ｘ－ｖｉｖｏ１０中に、２．５μＭアスナプレビル（ＡＳＶ）の存在下または非存在下で継代した。Ｔ細胞をさらに２日間インキュベートし、８日目に回収してフローサイトメトリーでｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価した。

結果
両方のデュアルベクター系は、アスナプレビル添加時にＴ細胞内でｍＣｈｅｒｒｙ発現の誘導を示した（図１Ｂ及び１Ｄ）。いずれの場合も高レベルのｍＣｈｅｒｒｙを発現している細胞は、調節性ＴＦとｍＣｈｅｒｒｙベクターの両方を受け取った、同時形質導入された細胞を表している可能性が高い。形質導入されたがアスナプレビルで処理していない細胞が形質導入されていない細胞を上回るｍＣｈｅｒｒｙ発現を示したことから、ｍｉｎＣＭＶデュアルベクター系は、ｍＣｈｅｒｒｙの漏出発現を示した可能性が高い（図１Ｂ）。対照的に、ｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡデュアルベクター系は、形質導入されたがアスナプレビルで処理していない細胞が形質導入されていない細胞を上回るｍＣｈｅｒｒｙ発現をほとんど示さなかったことから、漏出発現が最小限であることを示している（図１Ｄ）。アスナプレビルを添加して調節性ＴＦの分解を阻害すると、ｍＣｈｅｒｒｙが形質導入細胞内で発現したが、このことは、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が主に調節性ＴＦにより誘導される転写によるものであることを示している。

ｍｉｎＣＭＶデュアルベクター系は、ｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡ系よりも誘導状態（アスナプレビル処理細胞）において高いｍＣｈｅｒｒｙ発現を示した。したがって、最小プロモーターを変更することにより、調節性ＴＦによって調節されるペイロードを発現する細胞のダイナミックレンジ及びベースライン発現を制御することができた。

実施例２：ＩＬ－１０及びＩＬ－１２発現の単一ベクターの調節性転写因子による調節
単一ベクターのＴＦ及びエフェクター遺伝子発現系を評価した。

材料及び方法
図２Ａ及び図３Ａに示すように、２つの調節性ＴＦ及びエフェクター遺伝子発現カセットを構築した。図２Ａでは、ｍｉｎＴＫプロモーター及び４×ＺＦ結合配列（ＺＦ－ＢＤ）を有するＩＬ－１０エフェクター遺伝子を、薬物誘導性プロモーター及び調節性ＴＦの５’末端の上流に、３’から５’方向に配置した。図３Ａでは、ｍｉｎＴＫプロモーター及び４×ＺＦ結合配列（ＺＦ－ＢＤ）を有するＩＬ－１２エフェクター遺伝子を、薬物誘導性プロモーター及び調節性ＴＦの５’末端の上流に、３’から５’方向に配置した。

Ｔ細胞を解凍し、１０Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を含有するＸ－Ｖｉｖｏ１０（商標）培地中で静置した（０日目）。１日目に、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓの３：１インキュベーションで活性化し、１００Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を補充した。２日目に、Ｔ細胞にｓｙｎＴＦ（Ｐｒｏ－Ｄｉａｌとも呼ばれる）誘導性ＩＬ－１０またはＩＬ－１２ベクターを含む１×１０^５ＧＶユニットのレンチウイルスベクターを形質導入した。ＧＦＰレンチウイルスベクターを陰性対照として使用した。ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓを４日目に除去し、Ｔ細胞を継代した。６日目に、１００Ｕ／ｍＬｈｒＩＬ－２を含有するＸ－Ｖｉｖｏ１０培地中で、２．５μＭアスナプレビルの存在下または非存在下で、Ｔ細胞をウェルに継代した。形質導入したＴ細胞をさらに２日間インキュベートし、ＩＬ－１０またはＩＬ－１２の定量化のために遠心分離によって上清を回収した。

ＩＬ－１０について、上清をＰＢＳ／ＢＳＡで１／１００に希釈し、ヒトＩＬ－１０ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ１０００Ｂ）を使用して分析した。

ＩＬ－１２について、上清をＰＢＳ／ＢＳＡで１／１００に希釈し、ヒトＩＬ－１２ｐ７０ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ１２００Ｂ）を使用して分析した。

結果
調節性ＴＦ誘導性ＩＬ－１０単一ベクターで形質導入したＴ細胞は、アスナプレビルの非存在下で形質導入したＴ細胞と比較して、ＮＳ３プロテアーゼ活性を阻害するためにアスナプレビルの添加した後に、分泌ＩＬ－１０レベルの６倍の増加を示した（図２Ｂ）。ＧＦＰベクターで形質導入された対照細胞は、ＩＬ－１０を産生しなかった。したがって、単一ベクターの調節性ＴＦ系は、薬物によって調節されるサイトカイン産生が可能である。

さらに、調節性ＴＦ誘導性ＩＬ－１２単一ベクターで形質導入したＴ細胞は、アスナプレビルの非存在下で形質導入したＴ細胞と比較して、ＮＳ３プロテアーゼ活性を阻害するためにアスナプレビルの添加した後に、分泌ＩＬ－１２レベルの７．５倍の増加を示した（図３Ｂ）。ＧＦＰベクターで形質導入された対照細胞は、ＩＬ－１２を産生しなかった。したがって、単一ベクターの調節性ＴＦ系は、薬物によって調節される異なるサイトカインのサイトカイン産生が可能である。

実施例３：単一ベクターの調節性転写因子と追加のタンパク質の共発現
追加のタンパク質の共発現を伴う単一ベクターの調節性ＴＦ及びエフェクター遺伝子発現系を評価した。

材料及び方法
図４Ａに示すように、調節性ＴＦ及びレポーター遺伝子発現カセットを構築した。調節性ＴＦ遺伝子を、調節性ＴＦ遺伝子の３’末端にある２Ａリンカーを介してｍｙｃタグ付きキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に連結した。ｍｉｎＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーターと４×ＺＦ結合配列（ＺＦ－ＢＤ）を備えたｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を、薬物誘導性プロモーター及び連結された調節性ＴＦ－ＣＡＲ遺伝子の５’末端の上流に３’から５’の方向に配置した。

０日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ培地）に１×１０^６細胞／ｍｌで２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に播種した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、ウイルスを３×１０^５ＧＶユニット／ウェルで形質導入した。２日目に、２μＭのアスナプレビルの存在下または非存在下で、Ｊｕｒｋａｔ細胞をウェルに継代した。６日目に、フローサイトメトリーのためにＪｕｒｋａｔを回収した。細胞をａ－Ｍｙｃ－ＡＰＣ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＣ３６９６Ａ）で染色し、ＣＡＲの発現を評価した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現も評価した。

結果
図４Ｂに示すように、ｍｙｃタグ付きＣＡＲは、アスナプレビル処理細胞と未処理細胞の両方で同様のレベルで発現していたが、このことは、調節性ＴＦがＪｕｒｋａｔ細胞内でＣＡＲと共発現できることを示している。調節性ＴＦにおけるプロテアーゼの存在及び活性は、調節性ＴＦに連結されたＣＡＲタンパク質の発現または安定性に影響を及ぼさなかった。このことは、調節性ＴＦ系がＣＡＲ－Ｔ細胞内で機能できることを示している。

図４Ｃに示すように、プロテアーゼを阻害するためのアスナプレビルの添加は、調節性ＴＦに誘導されたｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の発現をもたらした。したがって、調節性ＴＦ発現系は、追加の共発現タンパク質の存在下で正しく機能して、エフェクタータンパク質の発現を誘導することができる。

実施例４：ＣＡＲ及びペイロードの発現
ＣＡＲ及びペイロード／サイトカインの発現は、「アーマリング」細胞用のＣＡＲ構築物及びエフェクター遺伝子発現系を同時形質導入した細胞で評価した。ペイロード／サイトカイン発現は、ＣＡＲ構築物と共に、または伴わずにエフェクター遺伝子発現系を形質導入した細胞で評価した。

材料及び方法
エフェクター遺伝子（例えば、目的のサイトカインペイロード）発現カセットを構築し、ウイルスベクターにクローニングし、次いでペイロードウイルスを産生するために使用した（表１０を参照のこと）。肝臓癌で高度かつ特異的に発現するタンパク質であるＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ構築物［Ｓｕｎｅｔａｌ，ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅＭｏｎｉｔｏｒ，２０１７］を、図６Ａに示すように構築し（構築物「１１０６」）、ウイルスベクターにクローニングし、ＧＰＣ３－ＣＡＲウイルスを産生するために使用した。ＧＰＣ３－ＣＡＲをＹＦＰレポーターに融合させて発現をモニタリングした。

０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ＦＬ００７１１）を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ）中で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１）を用いて活性化した。１日目に、１×１０^５ＧＶのペイロードウイルス±１×１０^５ＧＶのＧＰＣ３－ＣＡＲ（構築物１１０６）ウイルスを細胞に形質導入した。４日目に、ＣＡＲの形質導入効率をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）で評価した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及びＧＰＣ３－ＣＡＲを発現する細胞の割合をＦｌｏｗＪｏによって分析した。次いで、細胞を完全Ｔ細胞培地＋ＩＬ２中のＧｒｅｘ２４（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ）に移し、さらに増殖させた。

８日目に、Ｇｒｅｘプレートから細胞を回収して計数し、次いで１×１０^６細胞をスピンダウンして、ＩＬ－２を含有しない１ｍＬの完全Ｔ細胞培地に再懸濁した。細胞を、２４ウェルプレートに４８時間播種した。１０日目に、上清を回収し、２４ウェルプレート由来の細胞を計数して生存率を測定した。細胞をスピンダウンし、上清を－８０℃に移して、ペイロードを発現させるために、Ｌｕｍｉｎｅｘ３ｐｌｅｘ（ＩＬ－１２／２１／１５）キット（ＬＸＳＡＨＭ－０３；Ｒ＆Ｄ）を使用してＬｕｍｉｎｅｘでさらに処理した。

標的細胞との共培養実験では、２．５×１０^４ＨｅｐＧ２細胞／ウェルを完全ＥＭＥＭに５時間播種した。その後、ＥＭＥＭを除去し、１×１０^６細胞の総形質導入Ｔ細胞を、ＩＬ－２を含有しないＴ細胞培地（４：１、Ｅ：Ｔ）に加えた。上清を４８時間後に回収した。Ｌｕｍｉｎｅｘ－６ｐｌｅｘキット（ＬＸＳＡＨＭ－０６；Ｒ＆Ｄ）（ＩＬ－１２／２１／１５／２／ＴＮＦａ／ＩＦＮｇ）を使用して、ペイロードの発現及びＴ細胞の活性化を評価した。

結果
ＣＡＲの発現を、エフェクター分子（例えば、サイトカイン）ペイロードを発現するようにさらに操作した細胞で評価した。図６Ｂ及び図７（下部パネル）に示すように、ＧＰＣ３－ＣＡＲは、形質導入の４日後に、形質導入された細胞の２５．０～５８．２％で発現していた。図７（上部パネル）に示すように、ＹＦＰＭＦＩによって評価されるＧＰＣ３－ＣＡＲ発現レベルは、ＧＰＣ３－ＣＡＲウイルスのみ（「１１０６」）による形質導入と、試験した異なるペイロード構築物との間で一般的に同等であった。表１１に示すように、生存率もまた、ＧＰＣ３－ＣＡＲウイルスのみ（「１１０６」）による形質導入と、試験した異なるペイロード構築物との間で一般的に同等であった。したがって、ＣＡＲの発現及び生存率は、アーマリングエフェクター分子ペイロードを使用した操作によって有意に変化することはなかった。

サイトカインのペイロード発現を、ＣＡＲ構築物を発現するようにさらに操作した細胞の存在下または非存在下で、アーマリングエフェクター分子発現系で形質導入した細胞で評価した。図８に示すように、ペイロードサイトカインの発現は、目的のサイトカインペイロードのみをコードするすべての構築物で検出された（左パネル：図８Ａ－ＩＬ－１２、図８Ｂ－ＩＬ－１５、図８Ｃ－ＩＬ－２１）。サイトカインの発現は、単一のサイトカインをコードするように操作した構築物においても、一般的により良好であった（左パネル及び右パネル）。特に、ＧＰＣ３－ＣＡＲと同時形質導入した場合、サイトカインレベルは、一般的に、対数倍率でまたは検出されない程度にまで低下した（右パネル：図８Ａ－ＩＬ－１２、図８Ｂ－ＩＬ－１５、図８Ｃ－ＩＬ－２１）。

次いで、ＣＡＲＴ細胞を標的細胞と共培養した場合の、サイトカインのペイロード発現を評価した。図９に示すように、ＨｅｐＧ２細胞の存在下ではＩＬ－１２またはＩＬ－２１のペイロードサイトカイン発現の有意な変化は観察されなかったが、ＩＬ－１５の発現はおよそ５０％減少した（上部パネル及び下部パネル：図９Ａ－ＩＬ－１２、図９Ｂ－ＩＬ－１５、図９Ｃ－ＩＬ－２１）。ペイロードサイトカインの発現に加えて、追加のＴ細胞活性化サイトカインの産生を評価した。図１０に示すように、ＨｅｐＧ２細胞標的細胞の存在下で、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、またはＩＬ－２発現の有意な変化は観察されなかった（上部パネル対下部パネル：図１０Ａ－ＴＮＦα、図１０Ｂ－ＩＦＮγ、図１０Ｃ－ＩＬ－２）。

実施例５：共発現系におけるｉｎｖｉｖｏＣＡＲ活性
ＣＡＲ発現、ペイロード／サイトカイン発現、及び抗腫瘍活性を、「アーマリング」細胞用のＣＡＲ構築物及びエフェクター遺伝子発現系を同時形質導入した細胞で評価した。

材料及び方法
エフェクター遺伝子（例えば、目的のサイトカインペイロード）発現カセットを構築し、ウイルスベクターにクローニングし、次いでペイロードウイルスを産生するために使用した（表１２を参照のこと）。肝臓癌で高度かつ特異的に発現するタンパク質であるＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ構築物（Ｓｕｎｅｔａｌ，ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅＭｏｎｉｔｏｒ，２０１７）を、図１１Ａに示すように構築し（構築物「１１０８」）、ウイルスベクターにクローニングし、ＧＰＣ３－ＣＡＲウイルスを産生するために使用した。ＧＰＣ３－ＣＡＲをＹＦＰレポーターに融合させて発現をモニタリングした。

０日目に、６×１０^６ＨｅｐＧ２ｆＬｕｃ細胞をＮＧＳ雌マウスに移植した（ＩＰキャビティ）。７日目に、体重（ＢＷ）を測定し、マウスを無作為化した。１１日目に、５×１０^６のＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注射した。マウスを、全体的な健康状態、ＢＬＩ測定、及び体重について週に２回観察した。また、マウスから週に１回ＥＤＴＡチューブに採血し、スピンダウンして細胞を血漿から分離した。血漿は、Ｌｕｍｉｎｅｘ－６ｐｌｅｘキット（ＬＸＳＡＨＭ－０６；Ｒ＆Ｄ）（ＩＬ－１２／２１／１５／２／ＴＮＦａ／ＩＦＮｇ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘ分析まで－８０℃で凍結しておき、細胞ペレットを再懸濁してフローサイトメトリー用に処理した。体重が元の体重から１５％以上低下した場合、マウスを殺処分した。４５日目に、すべてのマウスを殺処分し、腫瘍、肺、肝臓、及び脾臓を回収して固定化し、腫瘍の重さを計量した。

０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ＦＬ００７１１）を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ）中で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１）により活性化した。１日目に、１×１０^５ＧＶのペイロードウイルス±１×１０^５ＧＶのＧＰＣ３－ＣＡＲウイルス（構築物「１１０８」）を細胞に形質導入した。４日目に、ＣＡＲ形質導入効率をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）で評価した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及びＧＰＣ３－ＣＡＲを発現する細胞の割合（％）をＦｌｏｗＪｏによって分析した。次いで、細胞を完全Ｔ細胞培地＋ＩＬ２中のＧｒｅｘ２４（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ）に移し、さらに増殖させた。

９日目に、Ｇｒｅｘプレートから細胞を回収して計数し、次いで１×１０^６細胞をスピンダウンして、ＩＬ－２を含有しない１ｍＬの完全Ｔ細胞培地に再懸濁した。細胞を２４ウェルプレートに４８時間播種した。１１日目に、上清を回収し、２４ウェルプレート由来の細胞を計数して生存率を測定した。細胞をスピンダウンし、上清を－８０℃に移して、ペイロードを発現させるために、Ｌｕｍｉｎｅｘ３ｐｌｅｘ（ＩＬ－１２／２１／１５）キット（ＬＸＳＡＨＭ－０３；Ｒ＆Ｄ）を使用してＬｕｍｉｎｅｘでさらに処理した。

ｅｘｖｉｖｏ細胞分析のために、１ｍｌのＰＢＳを血液試料に加え、混合し、１５ｍｌのコニカルチューブに移し、次いで２ｍｌ／チューブの溶解緩衝液を加えた。チューブを２回反転させて、室温で５分間インキュベートした。次に、約１４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝洗浄液を加え、これを２回繰り返した。最後のスピンで、細胞を約２５０～４００ｕｌに再懸濁し、ｖ－ｂｏｔｔｏｍプレートに移し、４００ｕｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄した。次に、１００ｕｌ／ウェルの生死判定用色素（ｚｏｍｂｉｅＵＶ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、室温暗所で１５分間インキュベートした。次いでウェルに２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液を加え、４００ｇで５分間回転させ、デカントし、次いで２００ｕｌ／ウェルの抗体ミックスを加え、室温で４５分間インキュベートした。細胞を２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４００ｇで５分間回転させ、デカントし、これを２回繰り返した。細胞を１５０ｕｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ｕ－ｂｏｔｔｏｍプレートに移して読み取った。抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し、以下が含まれていた：ｍＣＤ４５クローン３０－Ｆ１１、ｈＣＤ４５クローンＨ１３０、ｈＣＤ３クローンＯＫＴ３、ｈＣＤ８クローンＳＫ１。

結果
ＣＡＲの発現を、アーマリングサイトカインペイロードを発現するようにさらに操作したＴ細胞で評価した。図１１Ｂに示すように、ＧＰＣ３－ＣＡＲは、形質導入の４日後に、試験したすべての構築物の５４％以上で、６つの構築物のうちの５つの構築物の９９％以上で発現していた。次に、サイトカインのペイロード発現を評価した。表１３に示すように、操作されたＣＡＲＴ細胞は、それぞれのペイロードサイトカインを発現した。

次いで、アーマリングサイトカインペイロードで操作したＣＡＲＴ細胞の有効性を評価した。健康状態の悪化により、ＣＡＲ－Ｔ細胞＋ＩＬ－１２（８６８）で処置したマウスを２１日目に殺処分し、ＣＡＲ－Ｔ細胞＋ＩＬ－１５／ＩＬ－２１（１４７８）で処置したマウスを２４日目に殺処分した。図１２に示し、要約されているように、ウイルスなしで形質導入したＴ細胞（図１３Ａ－左パネル）、ＧＰＣ３－ＣＡＲＴのみ（サイトカインなし）（図１３Ａ－右パネル）、またはアーマリングサイトカインで操作されたＧＰＣ３－ＣＡＲＴ（図１３Ｂ－ＩＬ－１２／ＩＬ－２１共発現、図１３Ｃ－ＩＬ－１５、図１３Ｄ－ＩＬ－１２、図１３Ｅ－ＩＬ－２１）で処理したマウスに対する、１１、１４、２１、及び２４日目のＢＬＩ測定によって腫瘍サイズを評価した。低用量（５ｅ６細胞／ｍｌ）では、ウイルスなしで、またはＧＰＣ３－ＣＡＲのみで形質導入したＴ細胞は、腫瘍量の増加を示した。対照的に、ＣＡＲとＩＬ－１２／ＩＬ－２１（「８８０」図１２、図１３Ｂ）またはＩＬ－１５（「１３３５」図１２、図１３Ｃ）を共発現するように操作されたＴ細胞は、２４日目までに腫瘍量の減少を示した。ＣＡＲとＩＬ－１２を共発現するように操作されたＴ細胞は、初期の腫瘍量減少を示した（「８６８」図１２、図１３Ｄ）が、この組み合わせは、健康状態の悪化によりマウスを殺処分したため、高い毒性が示された。ＣＡＲとＩＬ－２１を共発現するように操作されたＴ細胞は、全体的な腫瘍サイズの維持（「８６２」図１２）を示し、おそらくはサイトカインが低レベルであったために、個々のマウスで腫瘍量の減少が検出された（図１３Ｅ）。したがって、結果は、選択されたサイトカイン及びサイトカインの組み合わせを共発現するＣＡＲＴ細胞が腫瘍量を減少させる効果を示したが、潜在的に高い毒性を示し、サイトカイン発現のアーマリングが調節から利益を得る可能性があることを示唆している。

Ｔ細胞活性化サイトカインを、処置したマウスの血漿中で評価した。図１４に示すように、ＴＮＦα（図１４Ａ）またはＩＬ－２（図１４Ｃ）の有意な検出は、処置の３日後の１４日目に観察されなかった（上部パネル）。ＩＦＮγ（図１４Ｂ）は、１４日目に、ＩＬ－１２のみを発現（「８８０」）またはＩＬ－１２／２１を共発現（「８８０」）する処置群で観察された（図１４Ｂ－上部パネル）。対照的に、ＴＮＦα（図１４Ａ－下部パネル）は、２１日目、処置後１０日目に、腫瘍縮小（「８６８」／「８８０」／「１３３５」、図１２及び図１３を参照のこと）と相関する処置群で観察された（下部パネル）。ＩＦＮγ（図１４Ｂ－下部パネル）は、２１日目の腫瘍の縮小と相関する処置群でも観察されたが、ＩＬ－１２及びＩＬ－１２／２１系では特に高い検出率（約１０倍）であった。ＩＬ－２（図１４Ｃ－下部パネル）もまた、２１日目にＩＬ－１２及びＩＬ－１２／２１系で観察され、ＩＬ－１２単独系において特により高い検出を示した。したがって、結果は、選択されたアーマリングサイトカイン及びアーマリングサイトカインの組み合わせを発現するように操作されたＣＡＲＴ細胞が、Ｔ細胞活性化サイトカインの産生を示したことを示している。

サイトカインのペイロード発現もまた、処置したマウスの血漿中で評価した。図１５Ａに示すように、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２及びＩＬ－１２／２１系において、処置の３日後の１４日目（上部パネル）及び処置の１０日後の２１日目（下部パネル）に観察されたが、ＩＬ－１２のみにおいて特に高い検出が観察された（約１０倍）。マウスでヒトＣＤ４５＋細胞の割合が増加すると、ＩＬ－１２の発現も増加した（以下を参照のこと）。図１５Ｂに示すように、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５系において、処置の３日後の１４日目（上部パネル）及び処置の１０日後の２１日目（下部パネル）に観察された。マウスでヒトＣＤ４５＋細胞の割合（％）が増加すると、ＩＬ－１５の発現も増加した（以下を参照のこと）が、ＩＬ－１２に比べてゆるやかであった。予想外に、ＩＬ－２１は、処置の１０日後の２１日目に、ＩＬ－１２系（「８６８」）でのみ検出され（下部パネル）、ＩＬ－２１単独またはＩＬ－１２／ＩＬ－２１共発現系では検出されなかった（図１５Ｃ）。したがって、結果は、アーマリングサイトカインを発現するように操作されたＣＡＲＴ細胞が、選択された系においてペイロードサイトカインの産生を示したことを示している。

Ｔ細胞持続性のｅｘｖｉｖｏ分析を評価した。図１６Ａに示すように、腫瘍サイズの観察された減少（左パネル）と相関して、処置の３日後の１４日目（右パネル）に、ヒトＣＤ４５＋ＣＡＲＴ細胞は検出されなかったか、または最小限であった。対照的に、図１６Ｂに示すように、アーマリングＣＡＲ系（「８６８」／「８８０」／「１３３５」、右パネル）において、ＣＤ４５＋ＣＡＲＴ細胞が検出され、腫瘍の減少が示されたが（左パネル）、すべてのアーマリングされた群は、おそらくはＧｖＨＤが原因で、高度の毒性を示す。

実施例６：タモキシフェン調節性転写因子系
ペイロードの発現を、調節性ＴＦ発現系を使用して評価した。

材料及び方法
様々な調節性ＴＦ（薬物誘導型の活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）または「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）及び発現カセットを、図１７Ａに示すように構築した。転写因子活性の調節は、ジンクフィンガー及びＰ６５活性化モチーフ、ならびに調節性ＴＦ（「５６５」）のタモキシフェン制御核局在化を可能にするＥＲＴ２配列を融合させることによって構築した。レポーターペイロード配列は、調節性ＴＦとは別の構築物上の誘導性制御（ＹＢ－ＴＡＴＡプロモーターによって駆動されるｍＣｈｅｒｒｙ及び４×ＺＦ結合配列「ＺＦＢＤ」）の下で、反対方向のＳＦＦＶプロモーターによって発現するＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＹＦＰ構築物と共に（「２２３５」）または含めずに（「１０６６」）構築した。カセットをウイルスベクターにクローニングし、ウイルスを産生するために使用した。

０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ＦＬ００７１１）を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ）中で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１）により活性化した。２日目に、細胞に１ｘ１０^５ＧＶのウイルスを形質導入した。７日目に、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、またはエンドキシフェンを各ウェルに１ｕＭ、０．２５ｕＭ、０．１ｕＭで添加するか、または薬物を添加しなかった。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、９日目に評価した。

結果
ＥＲＴ２の調節性ＴＦ系を、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、またはエンドキシフェンを使用して評価した。図１７Ｂに示すように、４－ＯＨＴ処理は、単独での発現（左パネル）またはＣＡＲ構築物もコードする構築物からの発現（右パネル）のいずれにおいても、調節可能かつ滴定可能なレポーター発現をもたらした。図１７Ｃに示すように、Ｎ－デスメチルタモキシフェン処理は、単独での発現（左パネル）及びＣＡＲ構築物もコードする構築物からの発現（右パネル）の両方で、薬物なしの対照と比較して、レポーターの発現をもたらさなかった。図１７Ｄに示すように、エンドキシフェン処理は、単独での発現（左パネル）またはＣＡＲ構築物もコードする構築物からの発現（右パネル）のいずれにおいても、調節可能かつ滴定可能なレポーター発現をもたらした。結果の概要を図１７Ｅに示す。図１８及び図１９に示すように、ＣＡＲの発現が確認され、未処置のものから最高濃度の薬物を処置したものにわたって同等であった。したがって、結果は、Ｔ細胞をＥＲＴ２調節性ＴＦ系で操作して、ＣＡＲＴ系を含め、４－ＯＨＴまたはエンドキシフェンを使用してペイロードの調節可能で滴定可能な発現を生成することができることを示している。

実施例７：ＣＡＲ発現と組み合わせた調節性転写因子系
ＣＡＲ及び調節性ＴＦ発現系のデュアル操作のための様々な戦略を評価した。

材料及び方法
ＣＡＲ及び調節性ＴＦ発現系のデュアル操作のための様々な戦略を図２０及び図２１に示し、試験した様々な方向、成分、及び２つのベクター構築物を記載する。

０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ＦＬ００７１１）を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ）中で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１）により活性化した。２日目に、細胞に１ｘ１０^５ＧＶのウイルスを形質導入した。７日目に、２ｕＭグラゾプレビルを加えるか、または薬物を加えなかった。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、９日目に評価した。

結果
様々な方向、成分、及び２つのベクター構築物を試験して、ＣＡＲの発現、特にペイロードベクター、調節性ＴＦベクター上に、または単独でエンコードした場合にＣＡＲの発現が向上するかどうかを評価した。図２２に示すように、図２１に記載する様々な戦略を評価することにより、調節性ＴＦ（ＡＣＰ）をコードするベクター上ではなく、レポーターペイロードを有するベクター上にコードされた場合にのみ、ＣＡＲ発現が検出されたことが示された。図２３Ａ及び図２３Ｂに示すように、１つのベクター上にペイロード及びＣＡＲをコードし、別のベクター上に調節性ＴＦをコードする戦略により、ＣＡＲ及びレポーターを発現する形質導入細胞が約５０％得られ、その大部分が両方を共発現していた。図２４Ａ及び図２４Ｂに示すように、１つのベクター上でペイロード及び調節性ＴＦをコードし、別のベクター上にＣＡＲをコードする戦略により、ＣＡＲとレポーターを共発現する形質導入細胞が約６５％得られ、誘導後にレポーターを発現する形質導入細胞が全体として約３５％得られた。したがって、この結果は、（１）ペイロードと同じベクター上にＣＡＲを、別のベクター上に調節性ＴＦをコードすると、誘導（ペイロード／レポーター陽性）状態の細胞がより多く生成され、（２）ペイロードと調節性ＴＦを１つのベクター上にコードし、ＣＡＲを別のベクターにコードすると、より多くのＣＡＲ発現細胞が生成されたことを示している。

実施例８：調節性転写因子系はｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで調節された発現を示す
調節性ＴＦ発現系をｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方で評価した。

材料及び方法
ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（構築物「１８４５」）を使用する薬物誘導型のＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）、ならびにｈＩＬ－１２エフェクター分子ペイロードを駆動する４ｘＢＳｍｉｎＹＢ－ＴＡＴＡＡＣＰ応答性プロモーターを使用する発現カセットの概略図を図２５に示す。構成的ＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるｈＩＬ－１２を有する構築物（構築物「１７１」）も評価した。構築物の関連する配列を表１４に示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ評価のために、０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ＦＬ００７１１）を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ）中で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１）により活性化した。２日目に、細胞に、上記の構築物をコードする１ｘ１０^５ＧＶのウイルスを形質導入した。７日目に、０．１ｕＭグラゾプレビル（ＧＲＺ）、０．５ｕＭグラゾプレビルを加えるか、または薬物を加えなかった。形質導入したＴ細胞をさらに２日間インキュベートし、ＩＬ－１２の定量化のために遠心分離によって上清を回収した。ＩＬ－１２について、上清をＰＢＳ／ＢＳＡで１／１００に希釈し、ヒトＩＬ－１２ｐ７０ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ１２００Ｂ）を使用して分析した。

ｉｎｖｉｖｏ評価のために、Ｔ細胞にＳＢ０１８４５及びＳＢ０２３５７を形質導入し、ＨＥＫ細胞でのウイルス力価測定に基づいて、それぞれ推定ＭＯＩを５とした。陽性対照Ｔ細胞に、構成的ｈＩＬ－１２（ＳＦＦＶによって駆動される）をコードする５ＭＯＩのＳＢ００１７１を形質導入した。陰性対照は非形質導入Ｔ細胞であった。Ｔ細胞に組み込まれたレンチウイルスゲノムの数を、ＰＣＲによってまとめて分析した（コピー数アッセイ）。ＮＳＧマウスを－２日目に無作為化し、ビヒクルまたはグラゾプレビル（Ｇｒｚ）の投与を１日目の午後に開始した（ビヒクル：２．５％ＤＭＳＯ、３０％ＰＥＧ４００、６７．５％ＰＢＳ）。グラゾプレビルカリウム塩を、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ４００、及びＰＢＳに順次溶解し、１０ｍｇ／ｍＬにした。投薬：各投薬時点で、薬物処置したマウスに２５ｍｇ／ｋｇのＧｒｚを投与し；ビヒクル処置したマウスに等量のビヒクルを投与し；すべてのＧｒｚ投与は腹腔内に投与した。投薬は、２～４日目に１日２回継続した。２日目に、ＡＭ薬の投与後、マウスあたり２０ｅ６個のＴ細胞を尾静脈注射によって注射した。マウスから４日目に採血し、５日目に殺処分／採血した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実行して、マウス血漿中のｈＩＬ－１２のレベルを評価した。マウス血液中のヒトＴ細胞の存在をフローサイトメトリーで分析した。処置群を表１５に示す。

結果
図２６に示すように、ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（構築物「１８４５」）を使用する、薬物誘導型のＡＣＰを有する調節性発現系（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）ならびにｈＩＬ－１２エフェクター分子ペイロードを駆動する４×ＢＳｍｉｎＹＢ－ＴＡＴＡＡＣＰ応答性プロモーターを使用する発現カセットは、ＧＲＺの量を増やして加えると、ｉｎｖｉｔｒｏで滴定可能なｈＩＬ－１２分泌をもたらし、薬物の非存在下では最小限のｈＩＬ－１２が検出され、ウイルスの非存在下ではｈＩＬ－１２は検出されなかった。

次に、構築物をｉｎｖｉｖｏで評価した。実験計画を図２７に示す。形質導入し、注射した後に、Ｔ細胞を評価した。表１６に示すように、調節可能な系を備えたＴ細胞は、構成的な系と比較して約２．５の低いコピー数のウイルスコピー数を示し、より低い形質導入効率を示している。図２８に示すように、９日目のＴ細胞はまた、おそらくは２つのウイルスで形質導入したことにより、ウイルスなしの対照と比較して、調節可能な系において約２倍の増殖を示した。図２９に示すように、各群由来のＴ細胞は、同様のグルコース特性を示し、Ｔ細胞の増殖及び代謝がすべての群にわたって一般的に同等であることを示している。次に、ｉｎｖｉｖｏでのｈＩＬ－１２の産生を評価した。図３０に示すように、Ｔ細胞は各群に等しく存在しており、調節可能なアーマリング系がｉｎｖｉｖｏでＴ細胞の寿命を変化させなかったことを示している。図３１に示すように、ＧＲＺの投与は、マウスの血漿中の検出可能なｈＩＬ－１２（ビヒクルの約１００倍）をもたらし、調節可能な系が、Ｔ細胞の調節性アーマリングのための薬物誘導性ｉｎｖｉｖｏ形式を提供したことを示す。

実施例９：活性化誘導系
ＣＡＲ－Ｔが標的細胞によって活性化された場合に転写をオンにするエンハンサーを評価する。

材料及び方法
ライブラリー生成：最小プロモーター（後期Ａｄｅ最小プロモーター）に連結した１５，０００種のエンハンサーのライブラリーを生成し、ＣＡＲ－Ｔが標的細胞によって活性化された場合に転写をオンにするエンハンサーをスクリーニングした。活性化Ｔ細胞のＡＴＡＣ－ｓｅｑで富化したエンハンサー（Ｇａｔｅｅｔａｌ．ＮａｔＧｅｎｅｔ．Ａｕｔｈｏｒｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ；ＰＭＣ２０１９Ｊａｎ９で入手可能；あらゆる目的で参照により本明細書に援用される）をライブラリー用に選択した（＜４００ｂｐのすべてのエンハンサーを使用した）。ライブラリーメンバーの長さは１９９ｂｐであるため、１９９ｂｐより長いエンハンサーの場合、タイリングを使用して、各エンハンサーの２つの領域を可能な限りオーバーラップさせた。単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータ（Ｘｈａｎｇｏｌｌｉｅｔａｌ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１９Ａｐｒ；１７（２）：１２９－１３９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｐｂ．２０１９．０３．００２；あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）における上位の上方制御された遺伝子を、ヒトエンハンサーのＨＡＣＥＲデータベースで検索し、それらの遺伝子からエンハンサーを選択した。合成エンハンサーは、活性化Ｔ細胞で上方制御されることが文献から知られている転写因子のペアを使用して設計した。各ＴＦの４つの結合部位を使用して、合成エンハンサー（ａａａａｂｂｂｂまたはａｂａｂａｂａｂのいずれか）を生成した。以下のＴＦのリストに由来する可能なすべてのペアが含められた：ＡＴＦ２、ＡＴＦ７、ＢＡＣＨ１、ＢＡＴＦ、Ｂｃｌ－６、Ｂｌｉｍｐ－１、ＢＭＩ１、ＣＢＦＢ、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＭ、ＣＴＣＦ、Ｅ２Ｆ１、ＥＢＦ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＯＳ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ３、ＨＩＦ１Ａ、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、Ｌｅｆ１、ＮＦＡＴ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ、ＮＲ２Ｆ１、Ｎｕｒ７７、ＰＵ．１、ＲＥＬＡ、ＲＵＮＸ３、ＳＣＲＴ１、ＳＣＲＴ２、ＳＰ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、Ｔ－Ｂｅｔ、Ｔｃｆ７、ＺＢＥＤ１、ＺＮＦ１４３、及びＺＮＦ２１７。

候補の選択：単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータと活性化Ｔ細胞及び休止Ｔ細胞のＡＴＡＣ－ｓｅｑデータのバイオインフォマティック分析を使用して候補エンハンサーを選択し、ライブラリーと並行してスクリーニングした。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、ＣＡＲ－Ｔ活性化中に上方制御された転写因子を同定した。これらの上方制御された転写因子の結合部位について、ＡＴＡＣ－ｓｅｑオープンエンハンサー領域をスクリーニングし、これらのエンハンサーのサブセットを候補として選択した。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、休止ＣＡＲ－Ｔに比べて活性化ＣＡＲ－Ｔで上方制御された上位遺伝子を同定し、ゲノム内のそれらの遺伝子の上流の２ｋｂ領域を候補プロモーターとして選択した。

スクリーニング：ライブラリー及び選択した候補を、フローソーティングによってスクリーニングする（ｍｉｎプロモーターは、蛍光ｍＫａｔｅタンパク質の発現を駆動する）。活性化または非活性化（休止）Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析し、高／低発現を分類し、ＮＧＳで比較し、どのプロモーターが、活性化Ｔ細胞において高発現のビンにあるが休止Ｔ細胞においてはそうではないかを同定する。

結果
ＣＡＲ－Ｔが標的細胞によって活性化された場合の転写の増強について、エンハンサーのライブラリー及び選択した候補をスクリーニングする。ＣＡＲ－Ｔが標的細胞によって活性化された場合に転写をオンにするエンハンサーを評価する。

実施例１０：Ｔ細胞におけるＩＬ－１２及びＩＬ－１５薬物誘導性発現系
様々な調節性ＴＦ発現系戦略について、ＩＬ－１２及び／またはＩＬ－１５ペイロードの発現をＴ細胞で評価した。戦略には、ＣＡＲ構築物の共発現が含まれており、ＣＡＲ活性を評価した。

材料及び方法
ｉｎｖｉｔｒｏ評価のために、０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ドナー由来）を解凍し、２４ウェルプレートに１ｅ６細胞／ｍＬ／ウェルで播種し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ｒｈＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）中で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１ビーズ対細胞）で活性化した。１日目に、０．５ｍｌの培地を除去し、示された構築物ごとに３ｅ５ｐｇのウイルスを細胞に形質導入した（構築物の関連配列を表１７に示す）。２日目に、１．５ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ培地＋１００Ｕ／ｍＬｒｈＩＬ－２を加えた。４日目の細胞を計数し、１ｅ６細胞／ウェルを最終容量８ｍＬで２４ウェルＧｒｅｘプレートに移した。８日目に、６ｍＬの培地をウェルから取り出し、細胞を計数し、グラゾプレビル（２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１μＭ、及び薬物なし）を含有する新鮮な培地に１ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種した。ペイロード誘導及びＴ細胞傷害を測定するために、２枚並列で細胞プレートに播種した。８日目に、フローサイトメトリーによって細胞のＣＡＲ発現も評価した。形質導入したＴ細胞をさらに２日間インキュベートし、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５の定量化のために遠心分離によって上清を回収した。ＩＬ－１２及びＩＬ－１５について、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｒ＆ＤＩＬ１２／ＩＬ１５）によって上清を分析した。

Ｔ細胞傷害アッセイでは、０日目にＴ細胞に１ｅ６／ｍＬ±２μＭのＧＲＺを４８時間播種して、ペイロードを誘導した。２日目に、標的細胞を計数し、標的細胞培地に４～６時間、９６ウェルプレートのウェルごとに３５０００個を播種した。次いで、標的細胞培地を除去し、Ｔ細胞を計数し、３５０００個のＣＡＲで正規化したＴ細胞を２００ｕｌのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ培地に一晩播種した［Ｅ：Ｔ－１：１］。３日目に、細胞をＶ底プレートに移し、スピンダウンし、上清を回収して、ＬＤＨアッセイ（ＣｙＱＵＡＮＴＬＤＨ細胞傷害性アッセイ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して傷害活性を測定した。

結果
様々な調節性ＴＦ発現系戦略及び構築物について、ＩＬ－１２及び／またはＩＬ－１５ペイロードの発現をＴ細胞で評価した。ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（ＳＢ０１８４５）を使用した薬物誘導型ＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）、またはリンカーを短縮し、構築物のコドン全体を最適化したＡＣＰの修正バージョン（ＳＢ０２１１０）を評価した。すべてのペイロード構築物（ＳＢ０２６６１、ＳＢ０２６６２、ＳＢ０２６６４、ＳＢ０２６６５）は、ＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるＧＰＣ３－ＣＡＲをコードし、すべてのサイトカインペイロードには、Ａ２インシュレーター、及びＣＡＲカセットとは反対方向に発現を駆動するプロモーターが含まれていた（例えば、図２０中の構築物「２２３５」内のレポーター及びＣＡＲカセットを参照のこと）。誘導性ｓｙｎＴＦプロモーターは、ＹＢ－ＴＡＴＡプロモーター（ＳＢ０２６６１、ＳＢ０２６６２）またはｍｉｎＴＫ（ＳＢ０２６６４、ＳＢ０２６６５）のいずれかに由来した。系の概要を、図３２に示すように評価した。それぞれＳＦＦＶによって駆動される構成的ｈＩＬ－１２及びＩＬ－１５をそれぞれコードするＳＢ００１７１及びＳＢ０１３３５を対照として使用した。

図３３に示し、表１８に定量化されるように、ＩＬ－１２産生が、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルの添加後に濃度依存的に観察された。図３４に示し、表１９に定量化されるように、リボソームスキッピングタグ２Ａマルチシストロン系を使用した、ＩＬ－１５をコードする構築物において、ＩＬ－１５産生が、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルに対して濃度依存的に観察されたが、ＩＬ－１５はＩＬ－１２に比べて低いレベルであった。ＩＬ－１２及びＩＬ－１５の両方のすべての組み合わせについて、ＳＢ０２１１０と比較してＡＣＰ構築物ＳＢ０１８４５を使用した場合、産生は著しく大きかった（実線対破線、それぞれ、図３３及び表１８Ａ対表１８Ｂ）。さらに、ＹＢ－ＴＡＴＡベースの誘導性プロモーターは、ｍｉｎＴＫプロモーターよりも高い発現を示し（ＳＢ０２６６１対ＳＢ０２６６４及びＳＢ０２６６２対ＳＢ０２６６５）、２Ａ／ＩＬ－１５ペプチドの一部として発現した場合により少ないＩＬ－１２が観察された。したがって、調節されたサイトカイン発現が、ＡＣＰ構築物ＳＢ０１８４５とＳＢ０２６６１を組み合わせた様々な系について、Ｔ細胞で薬物依存的に観察され、このことは、マルチシストロン系でのＳＢ０２６６２ＩＬ－１２及びＩＬ－１５とともに、ＩＬ－１２単独の最も高い産生を示している。

様々な構築物のＣＡＲ特性も評価した。対照としてＧＰＣ３－ＣＡＲのみの構築物（「１１０６」）を使用して、様々な構築物についてフローサイトメトリー（ＹＦＰ）によって発現をモニタリングした。図３５に示すように、すべてのサイトカインペイロード構築物は、約５０～７０％の範囲のＣＡＲを発現した。予想通り、ＡＣＰ構築物の選択は発現に目立った影響を与えなかった（１８４５対２１１０）。次いで、Ｔ細胞傷害によってＣＡＲ活性を評価した。図３６に示し、表２０に定量化されるように、傷害（ＬＤＨ放出）が観察され、それは、使用したＡＣＰに関係なく、ＣＡＲのみの対照を含むＣＡＲを発現する試験したすべての構築物について同等であった（１８４５対２１１０）。傷害を、グラゾプレビルの存在下または非存在下でも評価した。グラゾプレビルの存在下または非存在下で傷害に顕著な違いは観察されなかったが、追加の免疫系成分の非存在下でアッセイを実施したため、サイトカインアーマリングの影響を直接試験するようにはアッセイは設計されていなかった。したがって、薬物誘導型ＡＣＰを使用して調べた各調節性ＴＦ発現系について、ＣＡＲの発現及び傷害活性を示した。

実施例１１：ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２薬物誘導性発現系
様々な調節性ＴＦ発現系戦略について、ＩＬ－１２ペイロードの発現をＮＫ細胞で評価した。戦略には、ＣＡＲ構築物の共発現が含まれており、ＣＡＲ発現を評価した。

材料及び方法
ｉｎｖｉｔｒｏ評価のために、０日目に開始し、ＮＫ細胞（健康なドナーのＰＢＭＣから単離したｉＣＤ３－ＣＤ５６細胞）をｍｉｔｏＣＷＴＫ５６２細胞、５００Ｕ／ｍｌｒｈＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍｌｒｈＩＬ－１５の存在下で１０日間増殖させた。１０日目に、細胞を大量のＰＢＳでスピンダウンし、血清またはサプリメントを含まない１０ｅ６／ｍＬ濃度のＮＫＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁した。次いで、細胞を１ｅ６細胞（１００ｕｌ）細胞＋１ｕｌの１：１０ＢＸ７９５（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号４３１８）に４８ウェルレトロネクチンコーティング非ＴＣ処理プレートに３０分間播種し、ＭＯＩ＝２５（ＩＵ）でウイルスを加え（示された各構築物の各ウイルスのＭＯＩ＝１２．５；構築物の関連する配列を表１７に示す）、続いて２００ｕｌのＮＫＭＡＣＳ培地（血清／サプリメントなし）を加えた。次いで、細胞とウイルスをスピノキュレートした（３２℃で８００ｇ２時間、３７℃インキュベーターで２時間プレートを静置し、完全ＮＫＭＡＣＳ培地＋５００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２の２４ウェルＧｒｅｘプレートに細胞を移す）。１４日目に、培地を部分的に交換して５ｍｌの培地を除去し、新鮮な培地＋ｒｈＩＬ－２（５００Ｕ／ｍＬ）を補充した。１７日目に細胞を計数し、必要な数の細胞を新鮮な完全培地＋５００Ｕ／ｍＬｒｈＩＬ２でスピンダウンした。細胞を、漸増濃度のグラゾプレビル（１、０．１、０．０１、０．０１μＭＧＲＺ、薬物なし）中で、Ｕ底９６ウェルプレートに０．２ｅ６細胞／２００ｕｌ／ウェルで播種した。１２、１９、及び２１日目（それぞれ２４、４８、９６時間）に、細胞をＶ底プレートに移し、スピンダウンし、Ｌｕｍｉｎｅｘ（ＩＬ－１２Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘキット）を使用した分析のために上清を保存した。フローサイトメトリーによって細胞のＣＡＲ発現も評価した。

結果
様々な調節性ＴＦ発現系戦略及び構築物について、ＩＬ－１２ペイロードの発現をＮＫ細胞で評価した。ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（ＳＢ０１８４５）を使用した薬物誘導型ＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）、またはリンカーを短縮し、構築物のコドン全体を最適化したＡＣＰの修正バージョン（ＳＢ０２１１０）を評価した。ペイロード構築物ＳＢ０２６６１は、ＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるＧＰＣ３－ＣＡＲをコードし、ＩＬ－１２サイトカインペイロードは、Ａ２インシュレーター及びＣＡＲカセットとは反対方向に発現を駆動するＹＢ－ＴＡＴＡプロモーターを含むカセットにコードした（例えば、図２０中の構築物「２２３５」内のレポーター及びＣＡＲカセットを参照のこと）。

図３７に示し、表２１に定量化されるように、ＩＬ－１２産生が、処置の２４時間後に開始するＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルの添加後に濃度依存的に観察された。ＩＬ－１２レベルは、４８時間から９６時間の間で類似しており、産生が少なくとも４８時間でピークに達したことを示唆している。また、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５の両方のすべての組み合わせについて、ＳＢ０２１１０と比較してＡＣＰ構築物ＳＢ０１８４５を使用した場合、産生は著しく大きかった（四角対円それぞれ図３７、及び表２１）。ＣＡＲの発現はフローサイトメトリー（ＹＦＰ）でもモニタリングし、全体的に低いＹＦＰの発現が検出された（データは示さず）。したがって、調節されたサイトカイン発現は、ＡＣＰ構築物ＳＢ０１８４５と構築物ＳＢ０２６６１を組み合わせた様々な系について、ＮＫ細胞で薬物依存的に観察され、このことは、ＩＬ－１２の最も高い産生を示している。

実施例１２：Ｔ細胞における追加のＩＬ－１２及びＩＬ－１５薬物誘導系
ＩＬ－１２及び／またはＩＬ－１５ペイロード発現を、異なる転写活性化因子の評価及び別個にまたはマルチシストロン系でコードされるサイトカインの産生を含む、追加の様々な調節性ＴＦ発現系戦略について、Ｔ細胞で評価した。

材料及び方法
ｉｎｖｉｔｒｏ評価のために、０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ドナー由来）を解凍し、２４ウェルプレートに１ｅ６細胞／ｍＬ／ウェルで播種し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ｒｈＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）中で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１ビーズ対細胞）で活性化した。１日目に、０．５ｍｌの培地を除去し、示された構築物ごとに３ｅ５ｐｇのウイルスを細胞に形質導入した（構築物の関連配列を表２２に示す）。２日目に、１．５ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ培地＋１００Ｕ／ｍＬｒｈＩＬ－２を加えた。４日目の細胞を計数し、１ｅ６細胞／ウェルを最終容量８ｍＬで２４ウェルＧｒｅｘプレートに移した。８日目に、６ｍＬの培地をウェルから取り出し、細胞を計数し、グラゾプレビル（２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１μＭ、及び薬物なし）を含有する新鮮な培地に１ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種した。形質導入したＴ細胞をさらに２日間インキュベートし、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５の定量化のために遠心分離によって上清を回収した。ＩＬ－１２及びＩＬ－１５について、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｒ＆ＤＩＬ１２／ＩＬ１５キット）によって上清を分析した。

結果
様々な調節性ＴＦ発現系戦略及び構築物について、ＩＬ－１２及び／またはＩＬ－１５ペイロードの発現をＴ細胞で評価した。ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（構築物ＳＢ０２６６７及びＳＢ０２６６８）またはｐ６５転写エフェクタードメイン（構築物ＳＢ０２６７０及びＳＢ０２６７１）のいずれかを使用する薬物誘導型ＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）を評価した。サイトカインペイロードをコードするすべての構築物は、Ａ２インシュレーター及びＡＣＰカセットとは反対の方向に発現を駆動するＹＢ－ＴＡＴＡプロモーターを含んでいた（例えば、図２０中の構築物「１５６０」内のレポーター及びＡＣＰ／ｓｙｎＴＦカセットの方向を参照のこと）。系の概要を、図３８に示すように評価した。

図３９にし、表２３に定量化されているように、ｐ６５転写エフェクタードメインを使用した場合、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルの添加後に濃度依存的にＩＬ－１２産生が観察され、単独で発現（ＳＢ０２６６７）させた場合に、リボソームスキッピングタグ２Ａマルチシストロン系（ＳＢ０２６６８）に比べて大量に発現した（約８倍）（それぞれ図３９の円対四角、及び表２３を参照のこと）。図４０及び図４１に示し、表２４に定量化されるように、ＩＬ－１５をコードする構築物についてもまた、リボソームスキッピングタグ２Ａマルチシストロン系（ＳＢ０２６６８；図４０のひし形）及び単一のペイロードとして発現させた場合（ＳＢ０２６７５；図４１の円）の両方において、ｐ６５転写エフェクタードメインを使用する場合に、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルについて濃度依存的にＩＬ－１５産生が観察された。ＩＬ－１５は、単一のペイロードとしてコードした場合、より高いレベルで発現したが、２Ａマルチシストロン系では特に低レベルであった。特に、単一のペイロードとしてコードしたＩＬ－１５以外のＶＰＲ転写エフェクタードメインを使用する構築物については、観測可能なサイトカイン発現はなかった（ＳＢ０２６７６；図４１の三角形）。したがって、様々な系について、Ｔ細胞において調節されたサイトカイン発現が薬物依存的に観察された。

実施例１３：様々なグラゾプレビル投与レジメンのｉｎｖｉｖｏ評価
様々なＧｒｚ投与及びＴ細胞注射レジメンを含む調節性ＴＦ発現系を、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方で評価した。

材料及び方法
ｉｎｖｉｖｏ評価のために、Ｔ細胞にＳＢ０１８４５及びＳＢ０２３５７（「誘導性ＩＬ－１２」）を形質導入し、ＨＥＫ細胞でのウイルス力価測定に基づいて、それぞれ推定ＭＯＩを５とした。対照Ｔ細胞（「構成的ＩＬ－１２」）に、ＳＦＦＶによって駆動される構成的ｈＩＬ－１２をコードする５ＭＯＩのＳＢ００１７１を形質導入した。陰性対照は非形質導入Ｔ細胞であった。Ｔ細胞に組み込まれたレンチウイルスゲノムの数を、ＰＣＲによってまとめて分析した（コピー数アッセイ）。ＮＳＧマウスを－２日目に無作為化し、ビヒクルまたはグラゾプレビル（Ｇｒｚ）の投与を１日目の午後に開始した（ビヒクル：２．５％ＤＭＳＯ、３０％ＰＥＧ４００、６７．５％ＰＢＳ）。グラゾプレビルカリウム塩を、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ４００、及びＰＢＳに順次溶解し、１０ｍｇ／ｍＬにした。すべてのＧｒｚ投与は腹腔内投与した。示されているように、マウスあたり２０ｅ６個のＴ細胞を尾静脈注射によって注射した。特定のＧｒｚ投与及びＴ細胞注射レジメンを以下の表に示す。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実行して、マウス血漿中のｈＩＬ－１２のレベルを評価した。マウス血液中のヒトＴ細胞の存在をフローサイトメトリーで分析した。

結果
表２５に記載されているように、最初の一連のグラゾプレビル（Ｇｒｚ）投与レジメンを評価した。

注入したＴ細胞の持続性を評価した。図４２に示し、表２６Ａ（４日目）、表２６Ｂ（８日目）、及び表２６Ｃ（１２日目）で定量化されるように、注入したヒトＴ細胞の集団は、１２日目まで血液中に観察された（注記：１２日目からの５０ｍｇ／ｋｇ及び７５ｍｇ／ｋｇ群の細胞は、試料が失われたため、分析に含めなかった。ＩＬ－１２レベルを血漿中で評価した。図４３に示すように、ＩＬ－１２の有意なグラゾプレビル用量依存的誘導が４日目（Ｇｒｚ投与の２日後）に観察され、ビヒクルの約１００倍～約７００倍の範囲であった。図４４に示すように、血清ＩＬ－１２レベルは８日目（左パネル）までにベースラインに戻り、１２日目（右パネル）でも安定したままであった。特に、７５ｍｇ／ｋｇのＧＲＺを投与したマウスは、７５ｍｇ／ｋｇの毎日投与後、２～３日目に、中等度～重度の体重減少を伴う毒性を経験した（マウスは各投与の２４時間後に軽度に回復した）。さらに、７５ｍｇ／ｋｇ群の８匹中２匹のマウスが最終日（１２日目）に死亡し、他の群では死亡は見られず、剖検により肝臓と卵巣管の異常が明らかになり、１匹のマウスは臓器が癒合していた。７５ｍｇ／ｋｇ群のすべてのマウスは、１２日目に脾臓の肥大を示し、その多くは炎症を起こした卵管を呈した。したがって、評価したグラゾプレビル（Ｇｒｚ）投与レジメンは、薬物依存的なＩＬ－１２産生を示し、特定の投与スキームで毒性が観察された。

次に、「オン／オフ／オン」グラゾプレビル（Ｇｒｚ）投与レジメンを評価し、カレンダーは、図４５の特定の投薬レジメンを示している。上記の実験の結果に続いて、動物に６０ｍｇ／ｋｇを１日１回、３日間投与（腹腔内）した。示されているように、組換え体（ｈＩＬ－２１×１０＾４ＩＵ）も投与した。

注入したＴ細胞の持続性を評価した。図４６に示し、表２７Ａ（薬物なし）及び表２７Ｂ（薬物あり）で定量化されるように、注入したヒトＴ細胞の集団は、Ｇｒｚを投与した４日目で有意に少なく、１１、１８、及び２５日目に、誘導性系の群で差異は認められなかった。以前に観察されたように、構成的ＩＬ－１２群は血中のヒトＴ細胞数の増加を示したが、特にこの群のマウスは毒性を示し、２９日目までに殺処分する必要があった。

ＩＬ－１２サイトカインレベルを、様々な群の血漿で評価した。図４７に示すように、誘導系において、４日目にＩＬ－１２の有意なグラゾプレビル用量依存的誘導が観察され、「オフ」週（１１日目）の間、群間のレベルは同等であり、第２の「オン」週（１８日目）の間、さらに有意なＩＬ－１２のグラゾプレビル用量依存的誘導が観察された。投与の第１の週の間に、Ｇｒｚ処置群の１０匹のマウスのうち３匹は約１５％の体重を失い、３日目に３０ｍｇ／ｋｇしか投与されなかった。薬物なしにおけるＩＬ－１２血清レベルはまた、時間の経過とともに増加した血清ＩＬ－１２レベルを示し、誘導性カセットの漏出性発現を示唆している。毒性も、異なる群においてモニタリングした。図４８に示すように、体重は、薬物を投与していない誘導性ＩＬ－１２群について一般的に安定したままであり、単一の肥大した脾臓を有し、終了時点でこの群に他の異常は観察されなかった。２２日目に体重が減少し、最終的に２９日目までに群を安楽死させるまで、構成的ＩＬ－１２群の体重も一般的に安定していた（またはわずかに増加した）。２４日目に２匹のマウスの死亡が認められ、体重減少のために２６日目に３匹のマウスを安楽死させたが、すべてのマウスの脾臓は、正常なＮＳＧマウスの脾臓と比較して有意に肥大化していた（データは示さず）。対照的に、グラゾプレビルを投与した誘導性ＩＬ－１２群の体重は、ほとんどの群で一過性の体重減少を示し、その後、一般的な体重の安定化が認められた。グラゾプレビルはまた、最終時点で毒性の兆候を示し、これには、薄い腎臓、厚い横隔膜、脾臓の肥大、厚い肝葉、肝臓内で成長する白／黄色のしこり、及び腹膜壁に相互に付着した臓器（肝臓、胃、脾臓）が含まれる。結果は、試験した系における構成的ＩＬ－１２発現の長期致死性とは対照的に、グラゾプレビルレジメンが、急性毒性を伴う薬物依存的ＩＬ－１２産生を示したことを示している。

実施例１４：活性化誘導系
ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化された場合に転写をオンにするプロモーターを評価する。

材料及び方法
候補の選択：同族の標的細胞の存在下または非存在下で培養したＣＡＲ－Ｔ細胞の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Ｘｈａｎｇｏｌｌｉｅｔａｌ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１９Ａｐｒ；１７（２）：１２９－１３９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｐｂ．２０１９．０３．００２、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）を使用して、休止ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞で上方制御された上位遺伝子を同定し、同定したそれらの遺伝子の２ｋｂ上流から－１００ｂｐまでの領域を候補プロモーターとして選択した。

スクリーニング：汎Ｔ細胞に、ＧＰＣ３－ＣＡＲのみの構築物（「１１０６」）を、記載されるようにウイルス形質導入し、候補プロモーターをコードするウイルスベクターは、（１）ＹＢＴＡＴＡ（配列番号１５５、「ＹＢＴＡＴＡ」構築物、または（２）ｍＫａｔｅレポーターの上流で転写開始を誘導するために、それぞれの遺伝子の翻訳開始部位までトリミングされた（「トリミング」）構築物のいずれかであった。候補構築物を、２４時間または４８時間の単独培養後、またはＨｅｐＧ２標的細胞との共培養により活性化した後、ｍＫａｔｅ発現（ＹＦＰＣＡＲ＋細胞によってゲーティング）のフローソーティングによってスクリーニングした。さらに、ＮＦＡＴ転写因子結合部位に基づく候補も評価した。スクリーニングのワークフローを図４９に示す。評価した構築物を図５０に示す。

結果
ＣＡＲ－Ｔを標的細胞と共培養した場合、転写を増強するために候補をスクリーニングし、フローサイトメトリーの結果を、図５１に示す２４時間及び図５２に示す４８時間の標的細胞との培養について示した。５×ＮＦＡＴＢＳｍｉｎＡｄｅＰｒｏ構築物（「２０９６」、配列番号１５４）は、２４時間と４８時間の両方で標的細胞と共に培養した場合、レポーター発現の増加を示したが、特に、この構築物は、標的細胞の非存在下で高いベースレベルのレポーター発現を有していた。２４時間及び４８時間の時点で、トリミングされたＣＣＬ３（「２９３５」）が、標的細胞と共に培養した場合にレポーター発現の増加を示し、特に、全般的に標的細胞の非存在下でのバックグラウンドと同等のレポーター発現を示すものとして同定された。２４時間の時点では、トリミングされたＣＣＬ４（「２９３６」）もまた、標的細胞と共に培養した場合にレポーター発現の増加を示し、特に、全般的に標的細胞の非存在下でのバックグラウンドと同等のレポーター発現を示すものとして同定された。４８時間の時点では、トリミングされたＭＴ２ａ（「２９４２」）もまた、標的細胞と共に培養した場合にレポーター発現の増加を示し、標的細胞の非存在下でのバックグラウンドを約３倍上回るレポーター発現を示すものとして同定された。レポーター発現及びそれらの対照（ＨｅｐＧ２標的なしで培養したＣＡＲのみ、ＨｅｐＧ２標的とともに培養したＣＡＲのみ、ＨｅｐＧ２標的なしで培養したＣＡＲ＋プロモーター）を示す同定されたプロモーターのヒストグラムを図５３に示し、ＭＦＩによって評価した倍率変化を表２８に示す。同定したプロモーターの配列を表２９に示す。データは、ＣＡＲ細胞が標的細胞によって活性化される場合に転写をオンにするプロモーターが同定されたことを示した。

実施例１５：グラゾプレビル／エルバスビルを用いたＴ細胞におけるＩＬ－１２薬物誘導系
グラゾプレビルまたはグラゾプレビル／エルバスビルの組み合わせのいずれかを使用して、様々な調節性ＴＦ発現系戦略について、ＩＬ－１２ペイロードの発現をＴ細胞で評価した。

材料及び方法
ｉｎｖｉｔｒｏ評価のために、０日目に、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞（ドナー由来）を解凍し、２４ウェルプレートに１ｅ６細胞／ｍＬ／ウェルで播種し、完全Ｔ細胞培地（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ＋Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ－Ｇｉｂｃｏ＋５％ヒト血清）＋ｒｈＩＬ－２（１００ユニット／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）中で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１ビーズ対細胞）で活性化した。１日目に、０．５ｍｌの培地を除去し、示された構築物ごとに３ｅ５ｐｇのウイルスを細胞に形質導入した（構築物の関連配列を表１７に示す）。２日目に、１．５ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ培地＋１００Ｕ／ｍＬｒｈＩＬ－２を加えた。７日目の細胞を、グラゾプレビル（２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、００５μＭ、及び薬物なし）で、Ｚｅｐａｔｉｅｒ（登録商標）中の化合物の比率に合わせて、それぞれ２：１の比率でエルバスビルの存在下または非存在下で処理した。形質導入したＴ細胞をさらに２日間インキュベートし、ＩＬ－１２の定量化のために遠心分離によって上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｒ＆ＤＩＬ１２）で評価した。

結果
様々な調節性ＴＦ発現系戦略及び構築物について、ＩＬ－１２ペイロードの発現をＴ細胞で評価した。ＮＳ３／ＮＳ４プロテアーゼ切断部位及びＶＰＲ転写エフェクタードメイン（ＳＢ０１８４５）を使用した薬物誘導型ＡＣＰ（「ｓｙｎＴＦ」とも呼ばれる）、またはリンカーを短縮し、構築物のコドン全体を最適化したＡＣＰの修正バージョン（ＳＢ０２１１０）を評価した。ペイロード構築物ＳＢ０２６６１は、ＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるＧＰＣ３－ＣＡＲをコードし、ＩＬ－１２サイトカインペイロードは、Ａ２インシュレーター及びＣＡＲカセットとは反対方向に発現を駆動するＹＢ－ＴＡＴＡプロモーターを含むカセットにコードした（例えば、図２０中の構築物「２２３５」内のレポーター及びＣＡＲカセットを参照のこと）。対照Ｔ細胞に構成的ＩＬ－１２構築物ＳＢ００１７１を形質導入した。図５４に示し、表３０に定量化されるように、上記で認められたものと一致して、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤グラゾプレビルを添加した後に、ＩＬ－１２産生が濃度依存的に観察された。ＩＬ－１２産生の速度は、エルバスビルの添加に関係なく、一般的に同等であった。したがって、エルバスビルは、薬物誘導型のＡＣＰＴＦ発現系におけるＩＬ－１２の誘導におけるグラゾプレビルの有効性に影響を与えなかった。

本開示は、好ましい実施形態及びさまざまな代替実施形態を参照して特に示され、説明されたが、本開示及び特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細におけるさまざまな変更が本明細書になされ得ることは、関連する技術分野の当業者には理解されよう。

本明細書の本文中で引用したすべての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。

Claims

（ａ）第１のプロモーターと、活性化条件付き制御ポリペプチド（ＡＣＰ）をコードする第１の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第１の発現カセットであって、
前記第１のプロモーターが、前記第１の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、
前記第１の発現カセット、
ならびに
（ｂ）ＡＣＰ応答性プロモーターと、式：
（Ｌ－Ｅ）_Ｘ
を有する第２の外来性ポリヌクレオチド配列とを含む第２の発現カセットであって、
式中、
Ｅが、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
Ｌが、リンカーポリヌクレオチド配列を含み、
Ｘ＝１～２０であり、
前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、前記第２の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、前記（Ｌ－Ｅ）ユニットの第１の反復では、Ｌが存在しない、
前記第２の発現カセット
を含む、操作された発現系であって、
前記ＡＣＰが、前記ＡＣＰ応答性プロモーターに結合することによって前記第２の発現カセットの発現を誘導することができ、
任意選択で、前記第２の発現カセットが（Ｌ－Ｅ）_Ｘの２つ以上のユニットを含む場合、各リンカーポリヌクレオチド配列は、別個のポリペプチドとしての各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連し、
任意選択で、（Ｌ－Ｅ）_Ｘの１つ以上のユニットを含む前記第２の発現カセットが、各Ｘについて分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、
任意選択で、各Ｘについて対応する前記分泌シグナルペプチドが、前記エフェクター分子と作動可能に関連し、
任意選択で、各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって天然である天然分泌シグナルペプチドを含み、
任意選択で、各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含み、
任意選択で、各分泌シグナルペプチドが、対応する前記エフェクター分子にとって非天然である非天然分泌シグナルペプチドを含み、任意選択で、
前記非天然分泌シグナルペプチドが、ＩＬ１２、ＩＬ２、最適化されたＩＬ２、トリプシオンゲン－２、ガウシアルシフェラーゼ、ＣＤ５、ＣＤ８、ヒトＩｇＫＶＩＩ、マウスＩｇＫＶＩＩ、ＶＳＶ－Ｇ、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、ＣＤ３３、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦＢ、オステオプロテゲリン、セルピンＥ１、ＧＲＯα、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＸＣＬ１２からなる群から選択される分子の分泌シグナルペプチドであり、
任意選択で、前記第１の発現カセットが第１の核酸内に含まれ、前記第２の発現カセットが第２の核酸内に含まれるか、または前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが単一の核酸内に含まれる、
前記操作された発現系。
前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとの間に局在するリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含み、
任意選択で、前記リンカーポリヌクレオチド配列が、別個のポリペプチドとしての前記ＡＣＰ及び各エフェクター分子の翻訳と作動可能に関連し、
任意選択で、前記リンカーポリヌクレオチド配列が、２Ａリボソームスキッピングタグをコードし、任意選択で、前記２Ａリボソームスキッピングタグが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択され、
任意選択で、前記リンカーポリヌクレオチド配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードし、ならびに
任意選択で、前記リンカーポリヌクレオチド配列が、切断可能なポリペプチドをコードし、任意選択で、前記切断可能なポリペプチドが、フューリンポリペプチド配列を含む、
請求項１に記載の操作された発現系。
（ａ）前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、ＡＣＰ結合ドメイン配列及びプロモーター配列を含み、
任意選択で、前記プロモーター配列が、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、インデューサー分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択されるプロモーターに由来し、
任意選択で、前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、合成プロモーターを含み、
任意選択で、前記ＡＣＰ応答性プロモーターが、最小プロモーターを含み、ならびに
任意選択で、前記ＡＣＰ結合ドメインが、１つ以上の亜鉛フィンガー結合部位を含む、
（ｂ）前記第１のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターを含み、
任意選択で、前記構成的プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される、及び／または
（ｃ）各エフェクター分子が、治療クラスから独立して選択され、前記治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境改変因子、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択され、
任意選択で、前記サイトカインが、ＩＬ１－β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－γ、及びＴＮＦ－αからなる群から選択され、
任意選択で、前記ケモカインが、ＣＣＬ２１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＬ１１融合タンパク質、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ９、及びＸＣＬ１からなる群から選択され、
任意選択で、前記ホーミング分子が、抗インテグリンα４β７、抗ＭＡｄＣＡＭ、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＭＭＰ－２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、及びＧＰＲ１５からなる群から選択され、
任意選択で、前記成長因子が、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択され、
任意選択で、前記共活性化分子が、ｃ－Ｊｕｎ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択され、
任意選択で、前記腫瘍微小環境改変因子が、アデノシンデアミナーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びＨＰＧＥ２からなる群から選択され、任意選択で、前記ＴＧＦβ阻害剤が、抗ＴＧＦβペプチド、抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦｂ－ＴＲＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
任意選択で、前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＲＥＭＩ抗体、及び抗ＴＲＥＭ２抗体からなる群から選択され、
任意選択で、前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦペプチド、またはそれらの組み合わせを含み、ならびに
任意選択で、各エフェクター分子がヒト由来のエフェクター分子である、
請求項１または２に記載の操作された発現系。
（ａ）前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットが、抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列をさらに含むか、または
（ｂ）前記操作された発現系が、追加のプロモーター及び抗原認識受容体をコードする追加の外来性ポリヌクレオチド配列を含む追加の発現カセットをさらに含み、
前記追加のプロモーターが、前記追加の外来性ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、任意選択で、前記追加の外来性ポリヌクレオチド配列が、前記第１の発現カセットまたは前記第２の発現カセットと同じポリヌクレオチドによってコードされ、
任意選択で、前記抗原認識受容体が、ＧＰＣ３を認識し、
任意選択で、前記抗原認識受容体が、抗原結合ドメインを含み、
任意選択で、ＧＰＣ３に結合する前記抗原結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
前記ＶＨが、
ＫＮＡＭＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、
ＲＩＲＮＫＴＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＡ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び
ＧＮＳＦＡＹ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
を含み、ならびに
前記ＶＬが、
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、
ＷＡＳＳＲＥＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び
ＱＱＹＹＮＹＰＬＴ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含み、
任意選択で、前記ＶＨ領域が、

のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＶＬ領域が、

のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記抗原結合ドメインが、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み、
任意選択で、前記ＶＨ及びＶＬが、ペプチドリンカーによって分離され、
任意選択で、前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含む場合、前記ｓｃＦｖが構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ＶＨが前記重鎖可変ドメインであり、Ｌがペプチドリンカーであり、ＶＬが軽鎖可変ドメインであり、
任意選択で、前記抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、
任意選択で、前記抗原認識受容体がＣＡＲである場合、前記ＣＡＲが、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれが、ＣＤ３ζ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ９７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１５４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＺＡＰ４０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１６ａ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＤＮＡＭ－１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＥＡＴ－２細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＣＡＲが、膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ鎖膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＬＡＧ－３膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、ＣＤ１６ａ膜貫通ドメイン、ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＳ１膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＦｃｅＲｌｇ膜貫通ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインからなる群から選択され、ならびに
任意選択で、前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載の操作された発現系。
前記ＡＣＰが転写モジュレーターであり、
任意選択で、前記ＡＣＰが転写抑制因子であるか、または前記ＡＣＰが転写活性化因子であり、
任意選択で、前記ＡＣＰが、抑制性プロテアーゼ、及び前記抑制性プロテアーゼの１つ以上の同族切断部位をさらに含み、
任意選択で、前記ＡＣＰが、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＥＲＴ２ドメイン）をさらに含み、任意選択で、前記ＥＲＴ２ドメインがタモキシフェンまたはその代謝産物に結合すると、前記ＡＣＰが核局在化を受けることができ、任意選択で、前記タモキシフェン代謝産物が、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＡＣＰが転写因子であり、任意選択で、前記転写因子がジンクフィンガー含有転写因子であり、
任意選択で、前記ＡＣＰが、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦタンパク質ドメイン）及び転写エフェクタードメインを含み、任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインがモジュール式であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなり、かつ任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のＺＦＡを含み、
任意選択で、前記エフェクタードメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメインであるＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメインを含むトリパータイト活性化因子（ＶＰＲ活性化ドメイン）；ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ＨＡＴコア活性化ドメイン）；Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；Ｈａｉｒｙ関連塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（このモチーフはＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；及びＨＰ１αクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択され、
任意選択で、前記抑制性プロテアーゼの前記１つ以上の同族切断部位が、前記ＺＦタンパク質ドメインと前記エフェクタードメインの間に局在し、
任意選択で、前記抑制性プロテアーゼが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）であり、
任意選択で、前記同族切断部位が、ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を含み、
任意選択で、前記ＮＳ３プロテアーゼ切断部位が、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合点切断部位を含み、
任意選択で、前記ＮＳ３プロテアーゼが、プロテアーゼ阻害剤によって抑制され得、
任意選択で、前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択されるか、または前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビルであるか、または前記プロテアーゼ阻害剤が、グラゾプレビル及びエルバスビルを含み、
任意選択で、前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが医薬組成物に共製剤化され、
任意選択で、前記医薬組成物が錠剤であり、
任意選択で、前記グラゾプレビルと前記エルバスビルが２対１の重量比であり、
任意選択で、前記グラゾプレビルが単位用量あたり１００ｍｇであり、前記エルバスビルが単位用量あたり５０ｍｇであり、
任意選択で、前記ＡＣＰがデグロンをさらに含み、前記デグロンが、前記ＡＣＰに作動可能に連結され、
任意選択で、前記デグロンが、ＨＣＶＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の２つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２とＮＢのタンデムリピート（インフルエンザＡまたはインフルエンザＢのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２））、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の４つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１とＳＰ２のタンデムリピート（インフルエンザＡウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２））、ＮＳ２（インフルエンザＡウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の３つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３Ａ及びＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２及びＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存性ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存性デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰＳＢＣドッキングモチーフ、及びＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択され、
任意選択で、前記デグロンが、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合可能なセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含み、それによってユビキチン経路を介したＡＣＰの分解を促進し、
任意選択で、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳＥ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７、及びＺＮ８２７、またはＣＲＢＮの薬物誘導性結合が可能なそれらの断片からなる群から選択され、
任意選択で、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物であり、
任意選択で、前記ＩＭｉＤがＦＤＡ承認薬であり、
任意選択で、前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドからなる群から選択され、ならびに
任意選択で、前記デグロンが、前記抑制性プロテアーゼの５’、前記抑制性プロテアーゼの３’、前記ＺＦタンパク質ドメインの５’、前記ＺＦタンパク質ドメインの３’、前記エフェクタードメインの５’、または前記エフェクタードメインの３’に局在している、
請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された発現系。
（ａ）前記操作された発現系がインシュレーターをさらに含み、任意選択で、前記インシュレーターが、前記第１の発現カセット、前記第２の発現カセット、及び／または存在する場合は追加の発現カセットの間に局在する、
（ｂ）前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して同じ方向に局在化するか、または前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットに対して反対の方向に局在化する、及び／または
（ｃ）前記操作された発現系が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される核酸である、
請求項１～５のいずれか一項に記載の操作された発現系。
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された発現系のいずれか１つの前記第１の発現カセット、前記第２の発現カセット、及び／または存在する場合は前記追加の発現カセットを含み、ならびに
任意選択で、（ａ）第１のベクターが、前記第１の発現カセット及び存在する場合は前記追加の発現カセットを含み、第２のベクターが、前記第２の発現カセットを含むか、（ｂ）第１のベクターが、前記第１の発現カセットを含み、第２のベクターが、前記第２の発現カセット及び存在する場合は前記追加の発現カセットを含むか、（ｃ）第１のベクターが、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットを含み、第２のベクターが、存在する場合は前記追加の発現カセットを含むか、または（ｄ）ベクターが、前記第１の発現カセット、前記第２の発現カセット、及び存在する場合は前記追加の発現カセットを含む、
１つ以上の発現ベクター。
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された発現系、または請求項７に記載の１つ以上の発現ベクターを含む単離された細胞であって、
任意選択で、前記操作された発現系が組換え発現され、
任意選択で、前記操作された発現系が、１つ以上のベクターまたは前記細胞のゲノム由来の１つ以上の選択された遺伝子座から発現され、
任意選択で、前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球系細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択され、ならびに
任意選択で、前記細胞が自家であるか、または前記細胞が同種異系である、
前記単離された細胞。
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された発現系、請求項７に記載の１つ以上の発現ベクター、または請求項８に記載の単離された細胞、及び薬学的に許容される担体、薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの組み合わせを含む、医薬組成物。
治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項８に記載の単離された細胞または請求項９に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。
対象における腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を刺激する方法であって、腫瘍を有する対象に、治療有効量の請求項８に記載の単離された細胞または請求項９に記載の組成物を投与することを含む、前記刺激方法。
対象における抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項８に記載の単離された細胞または請求項９に記載の組成物を投与することを含む、前記提供方法。
対象における腫瘍体積を低減する方法であって、請求項８に記載の単離された細胞を含む組成物または請求項９に記載の組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む、前記低減方法。
（ａ）前記投与が、全身投与または腫瘍内投与を含む、
（ｂ）前記単離された細胞が、前記対象に由来するか、または前記単離された細胞が、前記対象に関して同種異系である、
（ｃ）前記方法が、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、
（ｄ）前記腫瘍が、腺癌、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、大腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、中皮腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、精巣卵黄嚢腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び子宮腫瘍からなる群から選択される、
（ｅ）前記方法が、プロテアーゼ阻害剤を投与することをさらに含み、
任意選択で、前記プロテアーゼ阻害剤が、抑制性プロテアーゼを抑制するのに十分な量で投与され、
任意選択で、前記プロテアーゼ阻害剤が、前記操作された細胞または前記操作された細胞を含む前記組成物の投与の前に、同時に、またはその後に投与され、
任意選択で、前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択されるか、または前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビルであるか、または前記プロテアーゼ阻害剤が、グラゾプレビル及びエルバスビルを含み、
任意選択で、前記プロテアーゼ阻害剤がグラゾプレビル及びエルバスビルを含む場合、前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが、医薬組成物中に共製剤化され、
任意選択で、前記医薬組成物が錠剤であり、
任意選択で、前記グラゾプレビル及び前記エルバスビルが、２対１の重量比であり、ならびに
任意選択で、前記グラゾプレビルが単位用量あたり１００ｍｇであり、前記エルバスビルが単位用量あたり５０ｍｇである、ならびに／または
（ｆ）前記方法が、タモキシフェンまたはその代謝産物を投与することをさらに含み、
任意選択で、前記タモキシフェン代謝産物が、４－ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ－デスメチルタモキシフェン、タモキシフェン－Ｎ－オキシド、及びエンドキシフェンからなる群から選択される、
請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項８に記載の単離された細胞または請求項９に記載の医薬組成物を含む、がんの治療及び／または予防用のキットであって、任意選択で、対象におけるがんを治療及び／または予防するために前記細胞または組成物を使用するための書面による説明書をさらに含む、前記キット。