TW202346326A - 多順反子嵌合蛋白表現系統 - Google Patents

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Abstract

本文闡述多順反子表現系統，其編碼嵌合蛋白，特定而言膜可切割嵌合系統及嵌合抗原受體。本文亦闡述核酸、細胞及關於其之方法。

Description

多順反子嵌合蛋白表現系統
基於細胞之治療平臺為治療各種疾病提供有前景之途徑。一種此類有前景之平臺係基於CAR-T之治療癌症之療法。鑑於其前景，需要改良基於細胞之療法。一個活躍的探索領域係工程改造基於細胞之療法以產生及/或分泌效應分子，諸如細胞介素，該過程被稱為裝甲(armoring)，其增強基於細胞之療法。舉例而言，未裝甲之CAR-T療法在實體瘤中功效不佳，且裝甲可影響整個癌症免疫週期並增強CAR-T之活性。然而，不受控制或不受調控之裝甲策略可對治療產生負面影響，諸如個體之脫靶效應及毒性。因此，需要控制及調控基於細胞之療法之裝甲(諸如調控酬載(payload)效應分子之產生及/或分泌)之額外方法。
在一些實施例中，本文提供基於細胞之療法平臺，其涉及基於細胞之療法之受調控裝甲，包括基於嵌合抗原受體(CAR)之療法(例如NK CAR)，諸如酬載效應分子之受調控分泌。在一些實施例中，本文亦提供基於細胞之組合免疫療法，其涉及用於靶向治療癌症(諸如卵巢癌、乳癌、結腸癌、肺癌及胰臟癌)之受調控裝甲。
然而，本文所提供之療法可限制裝甲之全身毒性。舉例而言，本文所提供之免疫療法可為腫瘤特異性的及有效的，同時限制全身毒性及/或由於裝甲引起之其他脫靶效應。該等療法以受調控之方式(包括分泌動力學、細胞狀態特異性及細胞或組織特異性之調控)遞送所關注蛋白，諸如免疫調節效應分子，尤其是IL-15。將遞送媒劑之設計最佳化以改良基於細胞之療法(諸如癌症療法)之總體功能，包括但不限於免疫調節效應分子之膜切割位點、啟動子、連接體、信號肽、遞送方法、組合、調控及順序之最佳化。
亦對遞送媒劑之設計進行最佳化，以在多順反子系統中表現用於基於CAR之療法之多種組分，包括嵌合抗原受體(活化性aCAR及抑制性iCAR二者)及膜可切割嵌合蛋白。
本文提供多順反子表現系統，其包含經工程改造之核酸，該經工程改造之核酸包含：(A)編碼膜可切割嵌合蛋白之外源性多核苷酸，該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有下式：S - C - MT或MT - C - S，其中S包含可分泌效應分子，其中該可分泌效應分子包含IL-15，C包含蛋白酶切割位點，且MT包含細胞膜系鏈結構域，其中S - C - MT或MT - C - S經構形以表現為單一多肽；(B)編碼抑制性嵌合抗原受體(iCAR)之外源性多核苷酸，該iCAR包含：(i)對內皮黏蛋白(endomucin, EMCN)特異之抗原結合結構域；(ii)一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性結構域，及(iii)一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合；及(C)編碼二價活化性嵌合抗原受體(aCAR)之外源性多核苷酸，該aCAR包含：(i)對FLT3特異之抗原結合結構域；(ii)對CD33特異之抗原結合結構域；(iii)一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊結構域，及(iv)一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合。
在一些態樣中，編碼膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR中每一者之外源性多核苷酸係由編碼2A核糖體跳躍元件(skipping element)之多核苷酸連接體連接在一起。在一些態樣中，2A核糖體跳躍元件係選自由以下組成之群：T2A核糖體跳躍元件、E2A核糖體跳躍元件、P2A核糖體跳躍元件、F2A核糖體跳躍元件、其核糖體跳躍元件融合物及其組合。在一些態樣中，核糖體跳躍元件融合物包含E2A/T2A核糖體跳躍元件。在一些態樣中，E2A/T2A核糖體跳躍元件包含胺基酸序列QCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCGDV EENPGP (SEQ ID NO: 221)。在一些態樣中，E2A/T2A核糖體跳躍元件係由包含序列CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATC TAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 222)或序列CAGTGCAC AAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT (SEQ ID NO: 223)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR係以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。在一些態樣中，膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR係以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii) iCAR；及(iii)二價aCAR。
在一些態樣中，可分泌效應分子包含信號肽或信號錨序列。在一些態樣中，信號肽包含可分泌效應分子天然之天然信號肽。在一些態樣中，信號肽包含非天然信號肽，或信號錨序列包含可分泌效應分子非天然之非天然信號錨序列。在一些態樣中，非天然信號肽或非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶(Gaussia luciferase)、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa。在一些態樣中，非天然信號肽包含IgE信號肽。在一些態樣中，IgE信號肽包含胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)。在一些態樣中，IgE信號肽係由包含序列ATGGACTGGACTTGGATA CTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，IL-15包含胺基酸序列NWVNVISDLKKIEDLIQSMH IDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 224)。在一些態樣中，IL-15係由包含序列AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTG AAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA (SEQ ID NO: 225)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之N末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS GGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGG GGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPG SGEGSTKG；及EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。在一些態樣中，蛋白酶切割位點進一步包含N末端肽連接體SGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 230)。
在一些態樣中，蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之C末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSG GGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSG GGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPG SGEGSTKG；及EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。在一些態樣中，蛋白酶切割位點進一步包含C末端連接體GGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 231)。
在一些態樣中，蛋白酶切割位點包含腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)特異性切割位點。在一些態樣中，TACE特異性切割位點包含胺基酸序列VTPEPIFSLI (SEQ ID NO: 191)。在一些態樣中，TACE特異性切割位點包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 250)。在一些態樣中，TACE特異性切割位點係由包含序列TCAGGCGGCGG TGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，細胞膜系鏈結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、LIR1、B7-1及BTLA。在一些態樣中，細胞膜系鏈結構域包含B7-1跨膜結構域。在一些態樣中，B7-1跨膜結構域包含胺基酸序列LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRE RRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 204)。在一些態樣中，B7-1跨膜結構域係由包含序列TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGC ATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有式S - C - MT。在一些態樣中，膜可切割嵌合蛋白包含胺基酸序列MDWTWILFLV AAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 226)。在一些態樣中，膜可切割嵌合蛋白係由包含序列ATGGACTGGACTTGG ATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 227)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，對EMCN特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：EMCN-VH包含：具有RYDMH (SEQ ID NO: 291)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有VIWGNGNTHYHSALKS (SEQ ID NO: 296)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有RIKD (SEQ ID NO: 298)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且EMCN-VL包含：具有KSSQSLVASDENTYLN (SEQ ID NO: 299)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有QVSKLDS (SEQ ID NO: 300)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有LQGIHLPWT (SEQ ID NO: 301)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。在一些態樣中，EMCN-VH包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 302)；且EMCN-VL包含胺基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDEN TYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 310)。
在一些態樣中，EMCN-VH及EMCN-VL係由肽連接體隔開。在一些態樣中，對EMCN特異之抗原結合結構域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中L係肽連接體。在一些態樣中，肽連接體包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSG GGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；或EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。在一些態樣中，肽連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)。在一些態樣中，肽連接體係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 253)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，對EMCN特異之抗原結合結構域包含結構VH-L-VL且包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWV RQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 311)。在一些態樣中，對EMCN特異之抗原結合結構域係由包含序列GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO: 312)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，細胞內抑制性結構域包含LIR1細胞內抑制性結構域。在一些態樣中，LIR1細胞內抑制性結構域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 285)。在一些態樣中，LIR1細胞內抑制性結構域係由包含序列CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGC ACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，信號肽存在於iCAR中。在一些態樣中，iCAR之信號肽包含天然信號肽或非天然信號肽，視情況其中該非天然信號肽或該非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2及GMCSF。在一些態樣中，iCAR之信號肽包含CD8信號肽。在一些態樣中，CD8信號肽包含胺基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 137)。在一些態樣中，CD8信號肽係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTG CTGCTGCATGCTGCTAGACCA (SEQ ID NO: 416)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，鉸鏈結構域存在於iCAR中。在一些態樣中，iCAR之鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。在一些態樣中，iCAR之鉸鏈結構域包含LIR1鉸鏈。在一些態樣中，LIR1鉸鏈包含胺基酸序列HPSDPLELVVSGPSGGPSSP TTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (SEQ ID NO: 417)。在一些態樣中，LIR1鉸鏈係由包含序列CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCT GGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)之多核苷酸序列編碼。在一些態樣中，iCAR之鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈。在一些態樣中，CD8鉸鏈包含胺基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF ACD (SEQ ID NO: 271)。在一些態樣中，CD8鉸鏈係由包含序列ACAACAACA CCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，存在iCAR之跨膜結構域。在一些態樣中，iCAR之跨膜結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1、LIR1及BTLA。在一些態樣中，iCAR之跨膜結構域包含LIR1跨膜結構域。在一些態樣中，LIR1跨膜結構域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 259)。在一些態樣中，LIR1跨膜結構域係由包含序列GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGC TCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，iCAR包含胺基酸序列 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 430)；或 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKngaaHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 419)。
在一些態樣中，iCAR係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGC TTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCACACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTTGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 420)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，iCAR包含胺基酸序列 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 431)；或 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKngaaTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 421)。
在一些態樣中，iCAR係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGC TTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCAACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 422)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，對FLT3特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：FLT3-VH包含：具有GGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 360)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 361)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有FALFGFREQAFDI (SEQ ID NO: 362)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且FLT3-VL包含：具有RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 363)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有AASSLQS (SEQ ID NO: 364)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 365)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。在一些態樣中，FLT3-VH包含胺基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315)；且FLT3-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)。
在一些態樣中，對CD33特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：CD33-VH包含：具有DYNMH (SEQ ID NO: 402)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有YIYPYNGGTG YNQKFKSKA (SEQ ID NO: 403)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有GRPAMDYWGQ (SEQ ID NO: 404)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且CD33-VL包含：具有RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 405)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有AASNQGS (SEQ ID NO: 406)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有QQSKEVPWT (SEQ ID NO: 407)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。在一些態樣中，CD33-VH包含胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329)；且CD33-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 330)。
在一些態樣中，FLT3-VH、FLT3-VL、CD33-VH及CD33-VL係由肽連接體隔開。在一些態樣中，aCAR抗原結合結構域包含結構(FLT3-VH) - L1 - (CD33-VH) - L2 - (CD33-VL) - L3 - (FLT3-VL)，其中L1、L2及L3分別係第一肽連接體、第二肽連接體及第三肽連接體。在一些態樣中，L1、L2及/或L3各自獨立地選自由以下組成之群：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGG GGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；及EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。在一些態樣中，L1肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。在一些態樣中，L1肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)之多核苷酸序列編碼，或L1肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT (SEQ ID NO: 256)之多核苷酸序列編碼。在一些態樣中，L2肽連接體係胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)。在一些態樣中，L2肽連接體係由包含序列GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)之多核苷酸序列編碼。在一些態樣中，L2肽連接體係胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。在一些態樣中，L2肽連接體係由包含序列GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)之多核苷酸序列編碼。在一些態樣中，L3肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。在一些態樣中，L3肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)之多核苷酸序列編碼，或L3肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 258)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域係選自由以下組成之群：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、CD97、CD2、ICOS、CD27、CD154、CD8、OX40、4-1BB、CD28、ZAP40、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、MyD88、2B4、CD40、PD-1、LFA-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、SLAM蛋白、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、CDS、ICAM-1、(CD11a/CD18)、BAFFR、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及其組合。在一些態樣中，刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域包含CD28共刺激結構域及CD3ζ傳訊結構域。在一些態樣中，CD28共刺激結構域包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 287)。在一些態樣中，CD28共刺激結構域係由包含序列AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)之多核苷酸序列編碼。在一些態樣中，CD3ζ傳訊結構域包含胺基酸序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)。在一些態樣中，CD3ζ傳訊結構域係由包含序列AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，存在aCAR之鉸鏈結構域。在一些態樣中，aCAR之鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。在一些態樣中，aCAR之鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈。在一些態樣中，CD8鉸鏈包含胺基酸序列ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 272)。在一些態樣中，CD8鉸鏈係由包含序列GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，存在aCAR之跨膜結構域。在一些態樣中，aCAR之跨膜結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。在一些態樣中，aCAR之跨膜結構域包含CD8鉸鏈。在一些態樣中，CD8跨膜包含胺基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITL YCNHR (SEQ ID NO: 206)。在一些態樣中，CD8跨膜係由包含序列ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，存在aCAR之aCAR信號肽。在一些態樣中，aCAR之信號肽係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa。在一些態樣中，aCAR之信號肽包含GM-CSFRa信號肽。在一些態樣中，GM-CSFRa信號肽包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 423)。在一些態樣中，GM-CSFRa信號肽係由包含序列ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGA GCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT (SEQ ID NO: 424)之多核苷酸序列編碼。
在一些態樣中，aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 414)。
在一些態樣中，aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 415)。
本文亦提供包含本文所提供之任何多順反子表現系統之表現載體。在一些態樣中，表現載體包含SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 433、SEQ ID NO: 432或SEQ ID NO: 429之多核苷酸。
本文亦提供包含本文所提供之任何多順反子表現系統或本文所提供之任何表現載體之經分離細胞。在一些態樣中，細胞包含免疫細胞。在一些態樣中，細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調控性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、骨髓細胞、巨噬細胞、人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC源細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞(iPSC)以及iPSC源細胞。在一些態樣中，細胞係NK細胞。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 433、SEQ ID NO: 432或SEQ ID NO: 429之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 425之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 426之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 427之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 428之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 429之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 432之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供包含SEQ ID NO: 433之核酸序列之多核苷酸。
本文亦提供治療有需要之個體之方法，該方法包括投與治療有效劑量之本文所提供之任何經分離細胞或本文所提供之任何多核苷酸。
本文亦提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向該個體投與包含本文所提供之任何經分離細胞或本文所提供之任何多核苷酸的免疫療法。
在個體中刺激細胞介導的對腫瘤細胞之免疫反應之方法，該方法包括向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量的本文所提供之任何經分離細胞或本文所提供之任何多核苷酸。在一些態樣中，經分離細胞源自個體。在一些態樣中，經分離細胞就個體而言係同種異體的。
本文亦提供製備經工程改造之細胞之方法，其包括用本文所提供之任何多順反子表現系統、本文所提供之任何表現載體或本文所提供之任何多核苷酸轉導經分離細胞。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2022年4月21日提出申請之美國臨時申請案第63/333,483號、2022年8月2日提出申請之美國臨時申請案第63/370,219號及2023年1月23日提出申請之美國臨時申請案第63/440,668號中每一者之權益，該等美國臨時申請案中之每一者皆特此以全文引用方式併入。 序列表
本申請案含有序列表，其係以ASCII格式以電子方式提交，且其全文特此以引用方式併入。該ASCII複本創建於20XX年XXXX，命名為XXX-XXX_sequencelisting.txt且大小為###,###位元組。
本揭示案提供多順反子表現系統。多順反子系統編碼(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。多順反子系統包括FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR及編碼IL-15之膜可切割嵌合蛋白。
提供多順反子表現系統，其包括經工程改造之核酸，該經工程改造之核酸編碼： (A) 編碼膜可切割嵌合蛋白之外源性多核苷酸，該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有下式：S - C - MT或MT - C - S，其中S包括可分泌效應分子，其中該可分泌效應分子包括IL-15，C包括蛋白酶切割位點，且MT包括細胞膜系鏈結構域。S - C - MT或MT - C - S經構形以表現為單一多肽； (B) 編碼抑制性嵌合抗原受體(iCAR)之外源性多核苷酸，該iCAR包括：(i)對內皮黏蛋白(EMCN)特異之抗原結合結構域；(ii)一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性結構域，及(iii)一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合；及 (C) 編碼二價活化性嵌合抗原受體(aCAR)之外源性多核苷酸，該aCAR包括：(i)對FLT3特異之抗原結合結構域；(ii)對CD33特異之抗原結合結構域；(iii)一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊結構域，及(iv)一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合。
本文所述之表現系統係多順反子，亦即，可自單一mRNA轉錄本產生超過一種單獨多肽(例如，多種嵌合蛋白)。藉助使用各種連接體，經工程改造之核酸可為多順反子，例如，編碼第一嵌合蛋白之多核苷酸序列可連接至編碼第二嵌合蛋白之核苷酸序列，諸如在第一基因:連接體:第二基因5’至3’定向上進行連接。連接體可編碼2A核糖體跳躍元件，諸如T2A。其他2A核糖體跳躍元件包括但不限於E2A、P2A及F2A。2A核糖體跳躍元件容許在轉譯期間產生由第一及第二基因編碼之單獨多肽之產生。2A核糖體跳躍元件可包括2A核糖體跳躍元件之融合肽，包括但不限於E2A/T2A核糖體跳躍元件。在某些實施例中，E2A/T2A核糖體跳躍元件包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRG SLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 219)之胺基酸序列。一種編碼E2A/T2A核糖體跳躍元件之例示性核酸係GGTAGCGGCCAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 220)。在某些實施例中，編碼E2A/T2A核糖體跳躍元件之核酸包括與SEQ ID NO: 220至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，本文所揭示經工程改造之核酸包含E2A/T2A核糖體跳躍元件。在某些實施例中，E2A/T2A核糖體跳躍元件包含QCTNYALLKLAGDVESNPG PGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 221)之胺基酸序列。一種編碼E2A/T2A核糖體跳躍元件之例示性核酸係CAGTGTACCAACTACGCCCTG CTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 222)。另一種編碼E2A/T2A核糖體跳躍元件之例示性核酸係CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT (SEQ ID NO: 223)。在某些實施例中，編碼E2A/T2A核糖體跳躍元件之核酸包括與SEQ ID NO: 222或SEQ ID NO: 223至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
連接體可編碼可切割連接體多肽序列，諸如弗林蛋白酶(Furin)切割位點或TEV切割位點，其中在表現後，切割可切割連接體多肽，使得產生由第一及第二基因編碼之單獨多肽。可切割連接體可包括進一步促進切割之多肽序列，諸如撓性連接體(例如，Gly-Ser-Gly序列)。
連接體可編碼內部核糖體進入位點(IRES)，使得在轉譯期間產生由第一及第二基因編碼之單獨多肽。連接體可編碼剪接受體，諸如病毒剪接受體。
連接體可為連接體之組合，諸如弗林蛋白酶-2A連接體，其可藉助2A核糖體跳躍、之後進一步切割弗林蛋白酶位點以容許完全去除2A殘基來產生單獨多肽。在一些實施例中，連接體之組合可包括弗林蛋白酶序列、撓性連接體及2A連接體。因此，在一些實施例中，連接體係弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些實施例中，本揭示案之連接體係弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般而言，多順反子系統可使用任何數目或組合之連接體來表現任何數目之基因或其部分(例如，經工程改造之核酸可編碼第一、第二及第三嵌合蛋白，各自由連接體隔開，使得產生由第一、第二及第三嵌合蛋白編碼之單獨多肽)。
一般而言，可以任何順序編碼編碼膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR中每一者之外源性多核苷酸。舉例而言，膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR可藉由多順反子系統以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。在另一實例中，膜可切割嵌合蛋白、iCAR及二價aCAR可藉由多順反子系統以5’至3’之如下順序編碼：i)膜可切割嵌合蛋白；(ii) iCAR；及(iii)二價aCAR。 膜可切割嵌合蛋白
本文中之多順反子系統編碼膜可切割嵌合蛋白，其具有式 S - C - MT或 MT - C - S，自N末端至C末端定向且表現為單一多肽。 S係指可分泌效應分子。C係指蛋白酶切割位點。MT係指細胞膜系鏈結構域。膜可切割嵌合蛋白經工程改造，使得效應分子之分泌可以蛋白酶依賴性方式來調控。特定而言，膜可切割嵌合蛋白經工程改造，使得效應分子之分泌可作為「膜可切割」系統之一部分來調控，其中蛋白酶切割位點(「C」)及細胞膜系鏈結構域(「MT」)之併入容許以蛋白酶依賴性方式調控效應分子之分泌。不希望受理論束縛，存在於膜可切割嵌合蛋白中之膜可切割系統之組分一般藉助以下細胞過程來調控分泌： -   MT：細胞膜系鏈結構域含有跨膜結構域(或跨膜-細胞內結構域)，該跨膜結構域引導嵌合蛋白之細胞轉運，使得該蛋白插入細胞膜中或以其他方式與細胞膜締合(「系鏈」) -   C：在嵌合蛋白表現並定位至細胞膜中後，蛋白酶切割位點引導嵌合蛋白之切割，使得效應分子釋放(「分泌」)至細胞外空間中。一般地，蛋白酶切割位點係蛋白酶特異性的，包括經工程改造成蛋白酶特異性之位點。可對蛋白酶切割位點加以選擇或工程改造以達成最佳蛋白表現、細胞類型特異性切割、細胞狀態特異性切割及/或酬載以期望動力學(例如，膜結合嵌合蛋白水準與經分泌嵌合蛋白水準之比率)之切割及釋放
圖 17圖解說明本文所述膜可切割系統之示意圖，其中期望之酬載表現為嵌合蛋白，其中蛋白酶切割位點插入酬載與膜系鏈結構域之間。左圖圖解說明使用跨膜架構(例如，嵌合蛋白含有跨膜結構域)之膜可切割系統之示意圖。右圖圖解說明使用膜締合架構(例如，嵌合蛋白含有容許與細胞膜締合之轉譯後修飾標籤)之膜可切割系統之示意圖。 圖 18圖解說明用於IL-15之受調控分泌之代表性膜可切割系統，其中IL-15表現為具有切割位點之嵌合蛋白，該切割位點能夠被插入IL-15酬載與膜系鏈結構域之間之TACE切割。左圖藉助使用I型跨膜結構域(諸如PDGFR-β及CD8)圖解說明I型跨膜架構(例如，S - C - MT)。右圖藉助使用II型跨膜結構域(諸如NKG2D及TNFR2)圖解說明II型跨膜架構(例如，MT - C - S)。
在一些態樣中，本文提供具有所關注蛋白(例如，本文所述之任何效應分子)、蛋白酶切割位點及細胞膜系鏈結構域之膜可切割嵌合蛋白(或編碼膜可切割嵌合蛋白之經工程改造之核酸)。
「效應分子」係指結合至另一分子並調節其所結合之該分子之生物活性的分子(例如，核酸，諸如DNA或RNA，或蛋白(多肽)或肽)。舉例而言，效應分子可用作配位體以增加或減少酶活性、基因表現或細胞傳訊。因此，在一些實施例中，效應分子調節(活化或抑制)不同免疫調節機制。藉由直接結合並調節分子，效應分子亦可間接調節第二下游分子。
在本文所述之某些實施例(例如，一般而言，對於本文所述之所有膜可切割嵌合蛋白而言)中，效應分子係可分泌效應分子(例如，在用於本文所述之膜可切割嵌合蛋白之式 S - C - MT或 MT - C - S中，稱為「S」)。效應分子之非限制性實例包括細胞介素、趨化介素、調節代謝物水準之酶、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、配位體、肽、酶、抗體、調節細胞介素之抗體或誘餌分子、歸巢分子及/或整聯蛋白。
術語「調節」涵蓋生物活性之維持、生物活性之抑制(部分或完全)及生物活性之刺激/活化(部分或完全)。該術語亦涵蓋降低或增加(例如，增強)生物活性。當一種效應分子調節的腫瘤介導之免疫抑制機制(例如，刺激T細胞傳訊)不同於由另一效應分子調節的腫瘤介導之免疫抑制機制(例如，刺激抗原呈現及/或加工)時，認為該兩種不同的效應分子「調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制」。
藉由效應分子之調節可為直接或間接的。當效應分子結合至另一分子並調節該分子之活性時，發生直接調節。當效應分子結合至另一分子，調節該分子之活性，且作為該調節之結果，再一分子(效應分子未與之結合)之活性受到調節時，發生間接調節。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應(例如，全身性地或在腫瘤微環境中)增加至少10% (例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或200%)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節可導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。應當理解，免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應例如全身性地或在腫瘤微環境中之「增加」係相對於在不存在一或多種效應分子之情況下原本會發生的免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應而言。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應(例如，全身性地或在腫瘤微環境中)增加至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節可導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫刺激及/或抗腫瘤免疫機制之非限制性實例包括T細胞傳訊、活性及/或募集；抗原呈現及/或加工；自然殺手細胞介導之細胞毒性傳訊、活性及/或募集；樹突細胞分化及/或成熟；免疫細胞募集；促炎性巨噬細胞傳訊、活性及/或募集；基質降解；免疫刺激代謝物之產生；干擾素基因刺激物(STING)傳訊(其增加IFN之分泌及Th1極化，促進抗腫瘤免疫反應)及/或I型干擾素傳訊。效應分子可刺激上述免疫刺激機制中之至少一種(一或多種)，因而導致免疫刺激反應之增加。可例如使用用於T細胞增殖或細胞毒性之活體外分析、活體外抗原呈現分析、表現分析(例如，關於特定標記物)及/或細胞分泌分析(例如，細胞介素)來評估前述免疫刺激及/或抗腫瘤免疫機制之變化。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫抑制反應(例如，全身性或在腫瘤微環境中)降低至少10% (例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或200%)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節可導致免疫抑制反應降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫抑制反應降低10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。應當理解，免疫抑制反應例如全身性地或在腫瘤微環境中之「降低」係相對於在不存在一或多種效應分子之情況下原本會發生的免疫抑制反應而言。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫抑制反應(例如，全身性地或在腫瘤微環境中)降低至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節可導致免疫抑制反應降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制之調節導致免疫抑制反應降低2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫抑制機制之非限制性實例包括負共刺激傳訊、細胞毒性細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之促凋亡傳訊、T調控性(Treg)細胞傳訊、腫瘤檢查點分子產生/維持、髓源性抑制性細胞傳訊、活性及/或募集、免疫抑制因子/代謝物產生及/或血管內皮生長因子傳訊。效應分子可抑制上述免疫抑制機制中之至少一種(一或多種)，因而導致免疫抑制反應之降低。可例如藉由分析以下來評估前述免疫抑制機制之變化：T細胞增殖之增加及/或IFNγ產生之增加(負共刺激信號、T reg細胞傳訊及/或MDSC)；膜聯蛋白V/PI流式染色(促凋亡傳訊)；用於表現(例如，PDL1表現)之流式染色(腫瘤檢查點分子產生/維持)；ELISA、LUMINEX®、經由qPCR之RNA、酶促分析，例如，IDO色胺酸分解代謝(免疫抑制因子/代謝物產生)；及PI3K、Akt、p38之磷酸化(VEGF傳訊)。 在一些實施例中，效應分子加性地發揮功能：兩種效應分子之作用可例如等於兩種效應分子單獨發揮功能之作用之總和。在其他實施例中，效應分子協同地發揮功能：兩種效應分子之作用可例如大於兩種效應分子之組合功能。
調節腫瘤介導之免疫抑制機制及/或改變腫瘤微環境之效應分子可為例如分泌因子(例如，調節參與免疫系統之細胞外機制之細胞介素、趨化介素、抗體及/或誘餌受體)、抑制劑(例如，抗體、抗體片段、配位體TRAP及/或小阻斷肽)、控制細胞狀態之細胞內因子(例如，調節細胞狀態以增強促炎性質之微小RNA及/或轉錄因子)、包裝至胞外體中之因子(例如，微小RNA、細胞溶質因子及/或細胞外因子)、表面展示因子(例如，檢查點抑制劑、TRAIL)及/或代謝基因(例如，產生/調節或降解代謝物或胺基酸之酶)。
在一些實施例中，至少一種效應分子刺激腫瘤微環境中之免疫刺激機制及/或抑制腫瘤微環境中之免疫抑制機制。
在一些實施例中，至少一種效應分子(a)刺激T細胞傳訊、活性及/或募集，(b)刺激抗原呈現及/或加工，(c)刺激自然殺手細胞介導之細胞毒性傳訊、活性及/或募集，(d)刺激樹突細胞分化及/或成熟，(e)刺激免疫細胞募集，(f)刺激促炎性巨噬細胞傳訊、活性及/或募集或抑制抗炎性巨噬細胞傳訊、活性及/或募集，(g)刺激基質降解，(h)刺激免疫刺激代謝物產生，(i)刺激I型干擾素傳訊，(j)抑制負共刺激傳訊，(k)抑制抗腫瘤免疫細胞之促凋亡傳訊，(l)抑制T調控性(T reg)細胞傳訊、活性及/或募集，(m)抑制腫瘤檢查點分子，(n)刺激干擾素基因刺激物(STING)傳訊，(o)抑制髓源性抑制性細胞傳訊、活性及/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代謝物，(q)抑制血管內皮生長因子傳訊，及/或(r)直接殺傷腫瘤細胞。
在一些實施例中，效應分子可選自以下非限制性類別之分子：細胞介素、抗體、趨化介素、核苷酸、肽及酶。上述類別之效應分子之非限制性實例列於 表 1中，且編碼例示性效應分子之特定序列列於 表 2中。效應分子可為人類的，諸如列於 表 1或 表 2中之彼等，或列於 表 1或 表 2中之鼠類效應分子之人類等效物。效應分子可為人類來源的，諸如內源性人類效應分子，或針對功能加以修飾及/或最佳化(例如，經密碼子最佳化以改良表現，經修飾以改良穩定性，或於其信號序列處修飾)之效應分子(參見下文)。用於最佳化功能之各種程式及算法為熟習此項技術者已知且可基於期望之改良來選擇，諸如針對特定物種(例如，人類、小鼠、細菌等)之密碼子最佳化。
在一些實施例中，效應分子包含介白素12 (IL-12)，例如，作為二聚物之p35及p40，該二聚物在此項技術中一般稱為IL12p70。在一些實施例中，第一效應分子包含IL12p70融合蛋白。在一些實施例中，IL12p70融合蛋白係人類IL12p70融合蛋白。在一些實施例中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 203中所示之序列。
在一些實施例中，效應分子包含介白素15 (IL-15)。在一些實施例中，效應分子由IL-15 (參見例如SEQ ID NO: 199)組成。在一些實施例中，效應分子包含融合蛋白，該融合蛋白包括IL-15及IL-15受體α (IL-15Rα)之細胞外部分，諸如如SEQ ID NO: 201中所示之sushi結構域。例示性IL-15/IL-15Rα sushi結構域融合物提供為SEQ ID NO: 202。在一些實施例中，效應分子包括具有胺基酸序列NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 224)之IL-15。在一些實施例中，IL-15係由包含序列AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA (SEQ ID NO: 225)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，IL-15係由包括與AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA (SEQ ID NO: 225)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列之多核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白包括胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 226)。在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白係由包含序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 227)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白係由包括與ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 227)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列之多核苷酸序列編碼。 表 1. 例示性效應分子
效應物名稱 類別 功能
抗CD40或CD40配位體 促效劑抗體 刺激B細胞及抗原呈現細胞。
Flt3L 配位體促效劑 刺激骨髓細胞及抗原呈現細胞
CXCL10-11融合物 趨化介素 吸引T細胞
TGFb阻斷肽 拮抗劑肽 抑制TGFb路徑，TME調節劑
腺苷去胺酶(ADA) TME調節劑 TME中抑制性腺苷之降解
犬尿胺酸酶(Kyneurinase) TME調節劑 犬尿胺酸(kyneurine)之降解
HPGE2 TME調節劑 PGE2之降解
CXCL13 趨化介素 吸引B細胞
抗PD-1/PD-L1 促效劑抗體 去除檢查點
抗CTLA-4 促效劑抗體 去除檢查點
抗VEGF 拮抗劑抗體 中和免疫抑制/血管生成因子
抗TNFa 拮抗劑抗體 中和細胞介素/促腫瘤因子
抗IL-10 拮抗劑抗體 中和免疫抑制性細胞介素
抗SDF1/CXCL12 拮抗劑抗體 中和促腫瘤趨化介素
(TβRII)2阱 捕捉阱(Capture trap) 中和免疫抑制性細胞介素
CCL21 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL1 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL17 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL19 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL21 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL20 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL21a 趨化介素 吸引白血球/NK
MIP1b (CCL5) 趨化介素 吸引白血球/NK
CXCL10 趨化介素 吸引白血球/NK
CXCL11 趨化介素 吸引白血球/NK
CCL2 趨化介素 吸引單核球
MIP-1α (CCL3) 趨化介素 吸引白血球/NK
XCL1 趨化介素 吸引白血球/NK
IFNβ 細胞介素 T細胞反應，腫瘤細胞殺傷
IFNγ 細胞介素 T細胞反應，腫瘤細胞殺傷
IL-12 細胞介素 T細胞、NK細胞
IL-1β 細胞介素 T細胞、NK細胞
IL-15 細胞介素 刺激T細胞及NK
IL-2 細胞介素 刺激T細胞及NK
IL-21 細胞介素 刺激T細胞
IL-24 細胞介素 刺激T細胞
IL36-γ 細胞介素 刺激T細胞
IL-7 細胞介素 刺激T細胞
IL-22 細胞介素 刺激T細胞
IL-18 細胞介素 刺激T細胞
顆粒酶/穿孔蛋白 酶 直接殺傷腫瘤細胞
OX86 (抗OX40) 配位體 刺激T細胞
抗TGFβ 中和抗體 中和免疫抑制性細胞介素
TRAIL 受體/配位體 直接殺傷腫瘤細胞
FASL (CD49L) 受體/配位體 直接殺傷腫瘤細胞
OX40-L 受體/配位體 刺激T細胞
cGAS 經分泌分子 刺激抗原呈現細胞
41BBL 經分泌分子 T細胞之共活化
CD40L 經分泌分子 刺激T細胞
GM-CSF 經分泌分子 單核球生長因子
STING 經分泌分子 刺激抗原呈現細胞
HAC-V『微體』_PD1 拮抗劑抗體 抑制檢查點
yCD 前藥 活化後轉化為細胞毒性分子
CpG/核苷酸 核苷酸 STING促效劑
表2 ：例示性效應分子序列
IL-12 (人類) (SEQ ID NO: 56)
ATGTGCCATCAGCAGCTTGTCATATCTTGGTTTTCACTTGTATTCCTGGCCAGCCCTTTGGTTGCGATCTGGGAGCTCAAGAAGGATGTGTACGTTGTAGAGCTGGACTGGTACCCCGATGCTCCCGGTGAGATGGTCGTTTTGACATGTGACACTCCAGAAGAGGACGGTATTACGTGGACTCTGGACCAGTCCTCCGAAGTTCTTGGTTCTGGTAAGACTCTGACTATCCAGGTGAAAGAATTTGGGGATGCGGGACAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGTTGTCTCATAGTTTGCTGCTTCTCCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGAGCACCGACATACTCAAGGATCAAAAGGAACCCAAAAATAAGACATTTCTGCGATGTGAGGCTAAGAACTATAGTGGCCGCTTCACTTGTTGGTGGCTGACTACCATCAGCACAGATCTCACGTTTTCAGTAAAAAGTAGTAGAGGTTCAAGTGATCCTCAAGGGGTAACGTGCGGTGCTGCAACACTGTCTGCTGAACGCGTAAGAGGAGATAATAAGGAGTACGAGTATTCCGTAGAATGCCAAGAGGACAGTGCTTGTCCTGCGGCCGAGGAGTCTCTCCCAATAGAAGTGATGGTGGACGCGGTGCATAAACTGAAATATGAGAACTACACAAGCAGTTTTTTTATAAGAGATATCATCAAGCCCGATCCGCCGAAGAATTTGCAACTTAAACCGCTTAAAAACTCACGCCAGGTTGAAGTATCCTGGGAGTATCCGGATACATGGTCAACACCACACAGCTATTTTTCCCTTACCTTCTGTGTGCAGGTCCAAGGGAAGAGCAAAAGGGAGAAGAAGGACAGGGTATTCACTGATAAAACTTCCGCGACGGTCATCTGCCGAAAAAACGCTAGTATATCTGTACGGGCGCAGGATAGGTACTATAGTTCTTCTTGGTCTGAGTGGGCCTCAGTTCCGTGCTCTGGGGGAGGAAGTGGAGGAGGGTCCGGCGGTGGAAGCGGGGGAGGGAGTCGCAACTTGCCAGTGGCTACACCAGATCCAGGCATGTTTCCATGTCTGCATCATTCCCAGAATCTCCTGAGAGCGGTGTCAAATATGCTCCAAAAAGCGAGACAAACACTGGAATTTTACCCGTGTACCAGTGAGGAGATTGATCACGAGGACATAACCAAGGACAAGACCTCAACTGTAGAAGCGTGTTTGCCGCTGGAGTTGACTAAGAATGAGTCCTGCCTCAATTCCAGAGAAACTTCATTCATTACTAACGGCAGTTGTCTTGCATCCCGGAAAACGTCCTTTATGATGGCCCTTTGCCTTAGTTCAATTTACGAGGATCTTAAAATGTATCAAGTGGAGTTTAAAACCATGAATGCTAAACTTCTTATGGACCCCAAACGACAAATTTTTCTGGATCAGAATATGCTTGCCGTGATAGACGAACTCATGCAGGCGCTTAATTTTAACTCCGAAACAGTTCCACAAAAATCTAGCCTTGAAGAACCTGATTTTTATAAAACGAAGATTAAACTGTGTATCCTGCTGCATGCCTTTCGCATCCGAGCTGTCACAATCGATAGGGTTATGTCCTACCTTAACGCGAGCtaG
IL-12p70 (人類；經密碼子最佳化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 57)
ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCCATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGT
IL-12 (小鼠) (SEQ ID NO: 58)
ATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGtaG
IL21 (人類；經密碼子最佳化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 59)
ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGCCAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCA
IL-12p70_T2A_IL21 (人類；經密碼子最佳化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 60)
ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCCATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGTAGACGGAAACGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGCTCGCTGCTTACATGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCG ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGCCAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCA
IL-12_2A_CCL21a (人類) (SEQ ID NO: 61)
ATGTGCCATCAGCAGCTTGTCATATCTTGGTTTTCACTTGTATTCCTGGCCAGCCCTTTGGTTGCGATCTGGGAGCTCAAGAAGGATGTGTACGTTGTAGAGCTGGACTGGTACCCCGATGCTCCCGGTGAGATGGTCGTTTTGACATGTGACACTCCAGAAGAGGACGGTATTACGTGGACTCTGGACCAGTCCTCCGAAGTTCTTGGTTCTGGTAAGACTCTGACTATCCAGGTGAAAGAATTTGGGGATGCGGGACAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGTTGTCTCATAGTTTGCTGCTTCTCCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGAGCACCGACATACTCAAGGATCAAAAGGAACCCAAAAATAAGACATTTCTGCGATGTGAGGCTAAGAACTATAGTGGCCGCTTCACTTGTTGGTGGCTGACTACCATCAGCACAGATCTCACGTTTTCAGTAAAAAGTAGTAGAGGTTCAAGTGATCCTCAAGGGGTAACGTGCGGTGCTGCAACACTGTCTGCTGAACGCGTAAGAGGAGATAATAAGGAGTACGAGTATTCCGTAGAATGCCAAGAGGACAGTGCTTGTCCTGCGGCCGAGGAGTCTCTCCCAATAGAAGTGATGGTGGACGCGGTGCATAAACTGAAATATGAGAACTACACAAGCAGTTTTTTTATAAGAGATATCATCAAGCCCGATCCGCCGAAGAATTTGCAACTTAAACCGCTTAAAAACTCACGCCAGGTTGAAGTATCCTGGGAGTATCCGGATACATGGTCAACACCACACAGCTATTTTTCCCTTACCTTCTGTGTGCAGGTCCAAGGGAAGAGCAAAAGGGAGAAGAAGGACAGGGTATTCACTGATAAAACTTCCGCGACGGTCATCTGCCGAAAAAACGCTAGTATATCTGTACGGGCGCAGGATAGGTACTATAGTTCTTCTTGGTCTGAGTGGGCCTCAGTTCCGTGCTCTGGGGGAGGAAGTGGAGGAGGGTCCGGCGGTGGAAGCGGGGGAGGGAGTCGCAACTTGCCAGTGGCTACACCAGATCCAGGCATGTTTCCATGTCTGCATCATTCCCAGAATCTCCTGAGAGCGGTGTCAAATATGCTCCAAAAAGCGAGACAAACACTGGAATTTTACCCGTGTACCAGTGAGGAGATTGATCACGAGGACATAACCAAGGACAAGACCTCAACTGTAGAAGCGTGTTTGCCGCTGGAGTTGACTAAGAATGAGTCCTGCCTCAATTCCAGAGAAACTTCATTCATTACTAACGGCAGTTGTCTTGCATCCCGGAAAACGTCCTTTATGATGGCCCTTTGCCTTAGTTCAATTTACGAGGATCTTAAAATGTATCAAGTGGAGTTTAAAACCATGAATGCTAAACTTCTTATGGACCCCAAACGACAAATTTTTCTGGATCAGAATATGCTTGCCGTGATAGACGAACTCATGCAGGCGCTTAATTTTAACTCCGAAACAGTTCCACAAAAATCTAGCCTTGAAGAACCTGATTTTTATAAAACGAAGATTAAACTGTGTATCCTGCTGCATGCCTTTCGCATCCGAGCTGTCACAATCGATAGGGTTATGTCCTACCTTAACGCGAGCCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCTGCCGAAAAGATAGAGGCGCCTCAAAAACCGGAAAAAAGGGCAAAGGTTCTAAAGGATGTAAGCGGACTGAACGCTCTCAAACGCCTAAAGGGCCGtaG
IL-12_2A_CCL21a (小鼠) (SEQ ID NO: 62)
ATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCtaG
CCL21a_2A_IL-12 (小鼠) (SEQ ID NO: 63)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGtaG
IL7 (小鼠) (SEQ ID NO: 64)
ATGTTTCATGTGTCCTTCAGGTACATATTTGGTATCCCACCACTTATATTGGTGCTCTTGCCTGTAACCAGCTCTGAATGTCATATAAAAGACAAGGAGGGCAAAGCATACGAGTCCGTATTGATGATCTCAATCGATGAACTTGACAAGATGACAGGGACCGATTCTAATTGTCCAAATAACGAGCCAAACTTCTTTCGGAAACACGTGTGTGATGATACAAAAGAAGCTGCTTTTCTTAACAGAGCTGCCAGAAAACTCAAGCAGTTCCTCAAGATGAATATATCCGAGGAATTTAACGTGCATCTCCTCACAGTATCTCAGGGAACTCAAACCCTTGTAAACTGCACTTCTAAGGAGGAGAAGAATGTCAAAGAGCAGAAGAAAAATGATGCATGTTTTTTGAAACGGCTGTTGAGGGAGATCAAAACATGCTGGAATAAAATCCTCAAGGGCTCAATTtaG
IL-15 (人類) (SEQ ID NO: 65)
ATGGAAACAGACACATTGCTGCTTTGGGTATTGTTGCTCTGGGTGCCTGGATCAACAGGAAACTGGGTAAACGTAATTTCAGATCTGAAGAAGATCGAGGACCTTATTCAATCCATGCACATCGATGCCACTCTCTACACCGAAAGCGACGTTCACCCATCTTGCAAGGTGACCGCTATGAAATGTGAATTGTTGGAACTTCAGGTAATTTCTCTGGAGAGCGGCGATGCCTCAATACATGACACCGTTGAAAATCTTATCATCCTTGCTAATGATTCACTCTCTAGTAATGGGAACGTAACAGAGAGCGGGTGTAAGGAGTGTGAAGAACTGGAGGAGAAAAACATTAAGGAATTTTTGCAGTCATTCGTCCATATAGTGCAAATGTTCATAAACACTTCCAGAAGAAAGCGAGGCTCTGGGGAGGGGCGAGGCTCTCTGCTGACCTGTGGGGATGTAGAAGAGAATCCAGGTCCCATGGACCGGCTGACCAGCTCATTCCTGCTTCTGATTGTGCCAGCCTACGTGCTCTCCATCACATGTCCTCCCCCAATGAGCGTCGAGCATGCTGACATCTGGGTGAAGTCATACTCCTTGTACAGCAGAGAGAGATACATTTGTAATTCCGGATTCAAGCGCAAGGCCGGCACCTCCTCTCTGACAGAGTGCGTCCTTAACAAAGCAACCAACGTAGCACATTGGACCACACCATCCTTGAAGTGCATACGAGAACCTAAATCTTGCGATAAGACTCATACTTGTCCACCTTGTCCAGCCCCAGAACTGCTTGGCGGACCCTCAGTATTTTTGTTCCCACCAAAGCCAAAAGACACACTCATGATATCCAGAACTCCTGAGGTGACCTGTGTCGTTGTAGACGTTTCCCACGAAGATCCTGAAGTAAAATTCAACTGGTACGTGGATGGGGTCGAAGTCCATAACGCCAAGACTAAACCAAGGGAGGAACAGTATAACTCTACTTACCGAGTAGTTTCTGTGTTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGTTGAACGGGAAGGAGTACAAATGCAAGGTGAGCAATAAAGCTCTGCCCGCACCAATCGAAAAGACAATATCTAAGGCCAAGGGGCAGCCACGAGAGCCCCAGGTATACACACTGCCACCCTCACGCGATGAATTGACTAAGAACCAGGTTTCCCTGACCTGTCTTGTAAAAGGTTTCTACCCTTCCGACATAGCTGTTGAGTGGGAAAGTAACGGGCAGCCAGAGAACAATTACAAGACAACTCCACCCGTTCTTGATAGCGATGGATCATTTTTTCTGTATTCCAAACTCACTGTCGATAAAAGTCGCTGGCAGCAAGGCAATGTTTTTAGCTGCTCAGTCATGCACGAAGCACTGCATAATCACTACACACAAAAAAGTTTGTCCCTTAGCCCTGGTAAGtaG
IL-15 (人類) (SEQ ID NO: 66)
ATGTACTCAATGCAGTTGGCCTCCTGTGTAACATTGACCTTGGTCCTCTTGGTCAACAGCAATTGGATCGATGTACGCTACGACTTGGAGAAGATTGAGTCCCTTATACAGAGTATACACATAGATACAACCTTGTATACTGACAGTGACTTCCATCCCAGCTGTAAAGTGACTGCAATGAACTGTTTTTTGTTGGAGTTGCAAGTAATTCTGCATGAATACAGCAACATGACCCTCAATGAAACCGTTAGGAATGTCCTTTATCTCGCAAATTCTACTCTGAGTAGCAATAAGAATGTTGCCGAAAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAACTGGAGGAAAAAACTTTCACCGAGTTTCTCCAGAGTTTCATCAGAATTGTCCAAATGTTCATTAATACAAGTAGTGGTGGTGGGAGCGGGGGTGGAGGCAGTGGGGGAGGTGGGAGCGGAGGTGGAGGGTCCGGAGGGGGGAGCCTTCAAGGCACTACTTGTCCTCCACCCGTATCCATCGAGCACGCCGATATTCGAGTTAAAAATTATAGTGTTAATAGCAGAGAACGATACGTCTGCAACTCAGGGTTTAAGAGAAAGGCCGGAACTTCAACTCTCATAGAATGCGTGATTAATAAGAATACTAACGTCGCACATTGGACTACTCCCAGTCTCAAGTGCATACGCGATCCATCTCTCGCTCATTACTCACCAGTACCTACAGTGGTTACTCCTAAGGTGACCTCTCAGCCCGAATCACCATCTCCCAGCGCAAAAGAGCCTGAGGCCTTTTCTCCTAAATCAGACACTGCTATGACTACAGAAACAGCCATAATGCCAGGAAGCCGGCTGACACCATCTCAAACTACCAGCGCAGGCACAACTGGGACTGGCTCCCACAAAAGCTCACGCGCACCAAGTCTCGCCGCAACAATGACATTGGAGCCTACAGCCAGCACATCTCTTAGAATCACAGAAATTTCTCCCCACAGTAGCAAGATGACCAAGGTGGCAATTAGTACCAGCGTCCTTCTTGTAGGAGCTGGAGTTGTGATGGCATTTTTGGCATGGTATATCAAAAGCAGGtaG
IL-15 (小鼠) (SEQ ID NO: 67)
ATGAAGATCCTCAAGCCATACATGCGAAACACTAGTATTAGCTGTTACTTGTGTTTTCTGCTGAATAGTCATTTTTTGACTGAAGCAGGAATCCATGTATTTATACTCGGTTGTGTGTCTGTAGGTCTGCCAAAGACTGAGGCTAATTGGATTGACGTGCGCTATGATCTTGAAAAAATAGAGTCCTTGATTCAATCAATACACATCGATACCACTCTCTACACCGACAGTGATTTCCATCCTTCCTGCAAGGTAACAGCTATGAATTGCTTCCTCCTGGAGCTCCAAGTCATTCTCCATGAGTACTCCAACATGACTTTGAACGAAACTGTAAGAAACGTATTGTATCTGGCTAATAGCACCTTGTCTAGTAACAAAAATGTGGCAGAGAGCGGCTGCAAAGAATGTGAAGAATTGGAAGAGAAAACATTTACAGAGTTCCTGCAATCCTTTATTCGCATCGTCCAAATGTTTATCAATACCTCTtaG
IL-15 (小鼠) (SEQ ID NO: 68)
ATGTATTCCATGCAACTTGCCAGTTGTGTAACCCTTACTCTCGTCCTGCTCGTTAATTCCGCTGGTGCTAACTGGATAGATGTTCGATACGATCTGGAAAAGATTGAGTCCCTTATCCAATCCATTCATATAGATACCACCCTTTATACTGACAGCGACTTCCATCCTTCTTGCAAGGTGACCGCTATGAATTGTTTCCTGCTGGAACTCCAAGTTATTCTGCATGAATACTCTAATATGACACTTAACGAGACCGTAAGAAATGTTCTCTATCTCGCTAATAGTACTTTGAGCTCAAATAAGAACGTGGCCGAGTCTGGGTGTAAGGAATGCGAAGAGCTGGAAGAAAAGACATTCACCGAGTTTCTCCAGTCTTTCATACGGATTGTGCAGATGTTTATCAACACATCAGATTACAAAGACGACGATGATAAGtaG
IL-18 (小鼠) (SEQ ID NO: 69)
ATGGCAGCCATGTCTGAGGACTCTTGTGTGAACTTTAAAGAAATGATGTTCATAGACAATACACTCTACTTTATACCTGAGGAGAATGGAGATTTGGAATCTGACAACTTTGGCAGGCTGCATTGCACTACCGCAGTTATCCGAAACATCAACGATCAGGTACTGTTTGTTGATAAAAGACAACCTGTATTCGAGGACATGACCGACATAGATCAGTCTGCCTCAGAGCCCCAGACTAGGCTTATCATCTATATGTACAAGGACAGCGAAGTACGAGGCCTGGCTGTTACACTCTCAGTCAAAGACTCTAAGATGAGCACCCTGTCATGCAAGAACAAAATTATCAGTTTTGAGGAGATGGACCCACCTGAAAACATAGATGACATTCAGTCAGACCTCATTTTTTTTCAAAAGCGGGTACCAGGACACAACAAAATGGAATTTGAATCATCACTCTACGAAGGACATTTCCTTGCATGCCAGAAAGAGGATGACGCATTCAAATTGATCCTGAAAAAAAAGGACGAAAATGGTGATAAATCAGTCATGTTTACATTGACCAATCTTCACCAAAGTtaG
IL-18 (小鼠) (SEQ ID NO: 70)
ATGGCTGCAATGTCTGAAGATAGCTGTGTCAACTTTAAGGAGATGATGTTCATTGATAATACTTTGTACTTTATACCTGAAGAAAATGGAGACCTTGAGTCAGACAACTTCGGGAGACTGCACTGCACAACTGCCGTTATCCGAAACATAAATGATCAAGTATTGTTCGTGGACAAAAGACAACCAGTCTTTGAGGATATGACAGACATCGACCAATCCGCATCTGAACCTCAGACTAGGCTGATCATCTATATGTACGCCGACTCCGAAGTAAGAGGCCTTGCTGTGACACTTAGTGTTAAGGATAGTAAGATGAGCACACTGTCCTGTAAGAATAAGATTATATCTTTTGAAGAGATGGACCCTCCCGAGAACATAGATGACATCCAGAGCGACTTGATCTTCTTTCAGAAGCGAGTGCCAGGCCATAACAAGATGGAATTTGAATCATCTCTTTATGAAGGCCATTTCCTCGCATGTCAAAAGGAGGACGATGCCTTCAAGCTCATTCTGAAAAAAAAAGACGAGAACGGTGATAAGAGCGTGATGTTCACTCTGACAAATCTGCACCAGTCAtaG
IL-18 (人類) (SEQ ID NO: 71)
ATGTATCGCATGCAACTCCTGTCCTGCATTGCTCTGAGCTTGGCTTTGGTAACCAACTCATACTTCGGGAAACTGGAGAGTAAACTCTCCGTAATCAGGAATCTTAATGACCAAGTATTGTTTATTGACCAGGGCAACCGCCCGTTGTTCGAGGATATGACTGATTCTGACTGTCGGGATAACGCTCCGAGAACTATCTTTATCATTTCAATGTACAAGGACAGCCAACCGCGGGGTATGGCTGTGACAATCAGTGTCAAATGTGAGAAGATTTCCACGCTGTCCTGCGAAAACAAGATAATTTCTTTCAAAGAAATGAACCCCCCTGACAATATAAAGGATACAAAGAGTGATATCATCTTCTTTCAGAGGTCCGTGCCCGGCCACGATAATAAGATGCAATTTGAAAGTTCATCTTATGAGGGGTACTTTTTGGCATGCGAGAAAGAAAGGGATCTCTTCAAGTTGATCCTGAAGAAGGAGGACGAATTGGGCGACCGCTCCATCATGTTCACAGTCCAGAACGAGGACtaG
IL-18 (人類) (SEQ ID NO: 72)
ATGTACCGCATGCAGCTCCTGAGTTGTATTGCCCTTTCCCTCGCTCTCGTTACCAATTCTTACTTCGGTAAGCTTGCCTCTAAACTCTCTGTTATTAGGAACTTGAACGACCAAGTCCTTTTCATAGACCAAGGGAACAGACCACTGTTTGAAGATATGACGGATAGCGATTGCCGAGATAATGCCCCTAGGACGATTTTTATCATTAGTATGTATGCGGACTCTCAACCGAGGGGGATGGCCGTTACTATAAGTGTGAAATGCGAGAAAATATCAACGCTCAGTTGTGAGAACAAAATCATAAGTTTCAAGGAGATGAATCCACCTGATAACATCAAAGACACTAAGTCTGATATTATATTTTTCCAACGAAGTGTTCCGGGACACGATAACAAAATGCAATTTGAGAGCTCCTCATACGAGGGCTACTTCCTCGCGTGTGAGAAAGAAAGGGATTTGTTTAAGCTTATCCTCAAGAAAGAGGACGAGTTGGGGGATCGGAGCATAATGTTTACCGTACAGAATGAGGACtaG
IL-21 (小鼠) (SEQ ID NO: 73)
ATGGAGCGGACACTCGTGTGTCTTGTCGTAATTTTTCTCGGGACAGTCGCACACAAGTCCTCACCCCAGGGTCCTGATCGCCTTCTCATACGCCTCCGACATTTGATCGACATTGTAGAGCAGCTCAAAATTTACGAGAATGACCTCGATCCCGAGCTTTTGAGTGCTCCCCAAGACGTTAAGGGTCATTGCGAGCACGCAGCTTTTGCTTGCTTCCAGAAGGCCAAGTTGAAACCAAGCAACCCTGGTAATAATAAGACTTTCATCATCGACTTGGTCGCCCAACTCCGAAGGAGGCTGCCTGCCCGGCGCGGAGGAAAAAAACAAAAGCATATTGCAAAGTGTCCTTCATGTGATTCATACGAAAAGCGGACTCCCAAAGAGTTCTTGGAAAGGTTGAAATGGCTTCTTCAGAAGATGATTCATCAACATTTGTCAtaG
IFN-β (人類) (SEQ ID NO: 74)
ATGACCAACAAATGCCTTTTGCAAATTGCCCTGCTTTTGTGTTTTAGCACTACCGCATTGAGCATGTCATATAACCTCCTCGGCTTCCTTCAGAGATCATCAAACTTTCAGTGTCAGAAACTGCTTTGGCAACTTAATGGCAGGCTCGAATATTGTCTGAAAGATCGGATGAATTTCGACATTCCAGAAGAAATAAAACAGCTTCAACAATTCCAGAAAGAGGACGCCGCCCTGACTATTTACGAGATGCTCCAGAATATCTTCGCCATTTTCCGGCAGGACAGCTCATCCACGGGGTGGAATGAGACTATTGTAGAAAATCTTCTGGCTAATGTGTACCATCAAATTAATCACCTCAAAACGGTGCTTGAGGAAAAACTTGAAAAGGAAGATTTCACACGGGGCAAGTTGATGTCCTCCCTGCACCTTAAACGATACTACGGCAGGATTCTTCATTACTTGAAGGCTAAGGAGTATAGCCATTGCGCGTGGACAATTGTACGGGTAGAAATACTGCGAAACTTTTATTTCATCAACCGGCTCACTGGATACCTTAGAAATtaG
IFN-β (小鼠) (SEQ ID NO: 75)
ATGAACAATCGGTGGATACTCCACGCCGCATTTCTCCTCTGCTTTAGCACGACGGCCCTGTCCATCAACTACAAACAGCTTCAGTTGCAGGAGCGGACTAACATAAGGAAGTGCCAGGAACTGCTGGAACAGCTTAATGGTAAAATTAATCTTACATACCGAGCTGACTTCAAAATTCCTATGGAAATGACCGAGAAGATGCAGAAATCCTACACGGCATTCGCCATCCAGGAAATGCTCCAGAACGTATTTCTCGTGTTCCGCAATAATTTCTCTTCTACGGGTTGGAACGAAACCATTGTTGTTAGACTGCTTGACGAACTGCATCAGCAAACCGTGTTCCTTAAAACCGTGCTTGAGGAGAAGCAGGAGGAGCGCCTGACTTGGGAGATGTCTAGTACCGCACTTCACTTGAAATCCTACTACTGGCGCGTTCAGCGGTATCTGAAGCTGATGAAGTATAACTCATACGCCTGGATGGTAGTGCGCGCAGAGATCTTCAGAAACTTTCTTATCATCCGGCGACTGACCCGAAACTTTCAGAATtaG
IFN-γ (人類) (SEQ ID NO: 76)
ATGAAGTACACTAGCTATATATTGGCCTTCCAGCTTTGCATCGTATTGGGTAGCCTCGGATGCTATTGCCAAGACCCGTATGTCAAAGAAGCCGAAAATCTCAAAAAGTATTTCAATGCCGGACACTCAGACGTCGCGGATAACGGTACACTGTTTCTTGGCATCCTGAAAAATTGGAAGGAAGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGTCACAAATAGTGTCCTTTTACTTTAAGCTGTTCAAAAATTTCAAGGATGACCAAAGTATCCAGAAGAGTGTTGAAACTATCAAAGAGGACATGAATGTGAAATTCTTTAACAGTAATAAGAAGAAGCGCGATGACTTCGAGAAACTCACTAATTACAGCGTAACGGATCTTAACGTCCAACGCAAGGCAATCCACGAGCTTATACAGGTAATGGCTGAGCTTAGTCCCGCAGCCAAGACAGGGAAGAGAAAAAGGTCTCAAATGCTTTTTCGGGGCCGGCGAGCTTCACAAtaG
IFN-γ (小鼠) (SEQ ID NO: 77)
ATGAACGCTACGCATTGCATCCTCGCACTCCAATTGTTCCTCATGGCTGTGTCAGGGTGTTACTGTCACGGTACTGTCATAGAAAGCCTCGAATCCCTGAATAACTATTTTAACAGTAGCGGTATAGATGTAGAAGAAAAGTCTCTCTTTCTTGACATCTGGAGGAATTGGCAAAAGGATGGAGACATGAAGATTCTCCAATCTCAGATTATATCATTTTACTTGAGGCTTTTTGAGGTTCTGAAGGATAACCAGGCGATCAGCAATAATATCAGCGTAATTGAATCTCACCTTATTACAACATTTTTCTCAAATTCCAAGGCAAAGAAAGATGCTTTCATGTCTATCGCGAAATTTGAGGTGAACAATCCTCAGGTACAAAGGCAAGCCTTTAACGAGCTGATTAGAGTTGTACATCAGTTGTTGCCCGAAAGTAGTCTTAGAAAACGCAAACGGAGCCGATGCtaG
IFN-α (小鼠) (SEQ ID NO: 78)
ATGGCAAGGTTGTGCGCTTTTCTCATGGTACTGGCTGTGCTCTCCTATTGGCCTACTTGTTCTCTGGGATGCGACTTGCCACAGACCCACAATCTGCGGAATAAGAGGGCTCTGACTCTGCTGGTGCAAATGAGACGGCTCTCTCCACTTAGCTGTTTGAAAGATAGAAAGGATTTCGGGTTCCCCCAGGAGAAGGTGGATGCCCAGCAGATCAAGAAGGCACAGGCTATCCCCGTCCTTTCCGAGCTGACCCAGCAAATTTTGAACATCTTTACAAGTAAGGATAGTTCAGCTGCATGGAATACCACACTTTTGGATTCTTTTTGTAACGATCTGCATCAGCAGCTGAACGATCTCCAGGGATGCCTGATGCAGCAAGTCGGCGTGCAAGAATTTCCACTCACCCAGGAGGACGCTCTGCTCGCAGTGCGAAAGTATTTTCACCGAATTACCGTGTACCTCCGGGAGAAAAAGCATTCACCCTGCGCTTGGGAAGTAGTCAGGGCCGAAGTATGGAGAGCCCTTAGTAGCTCCGCTAATGTACTGGGCCGGTTGCGGGAAGAGAAAtaG
CCL21 (人類) (SEQ ID NO: 79)
ATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCTGCCGAAAAGATAGAGGCGCCTCAAAAACCGGAAAAAAGGGCAAAGGTTCTAAAGGATGTAAGCGGACTGAACGCTCTCAAACGCCTAAAGGGCCGtaG
CCL21a (小鼠) (SEQ ID NO: 80)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCtaG
無尾CCL21 (人類) (SEQ ID NO: 81)
ATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCtaG
無尾CCL21 (小鼠) (SEQ ID NO: 82)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGtaG
CCL19 (小鼠) (SEQ ID NO: 83)
ATGGCACCCCGCGTCACACCCTTGCTTGCTTTTTCTCTGCTTGTCCTCTGGACCTTCCCCGCTCCTACCCTTGGAGGAGCCAATGATGCCGAGGATTGCTGCCTGAGTGTTACACAAAGGCCAATACCAGGGAATATAGTGAAGGCATTCCGGTATCTGCTCAATGAAGATGGGTGCAGAGTCCCCGCAGTTGTCTTTACAACATTGCGAGGTTACCAGCTTTGTGCTCCCCCAGACCAGCCTTGGGTAGATCGCATTATTCGCCGGTTGAAGAAGAGCTCAGCAAAGAATAAGGGCAATTCCACACGGAGAAGCCCCGTCTCCtaG
CCL19 (小鼠) (SEQ ID NO: 84)
ATGAAATCAGCAGTCCTTTTCTTGCTCGGGATTATTTTTCTGGAACAATGTGGAGTGAGGGGAACACTCGTAATAAGAAACGCTCGGTGCTCATGCATATCAACATCACGGGGCACTATCCACTACAAATCCCTGAAGGATCTGAAGCAGTTCGCCCCAAGCCCTAACTGTAACAAGACCGAAATTATCGCAACTCTCAAAAATGGAGATCAGACTTGTCTTGACCCAGATTCAGCAAATGTCAAGAAGCTGATGAAAGAGTGGGAAAAGAAGATTTCACAAAAAAAAAAGCAAAAACGCGGCAAGAAACATCAAAAGAACATGAAAAACAGGAAACCTAAGACTCCCCAGTCAAGGAGAAGATCCCGCAAGACAACCtaG
CXCL11 (小鼠) (SEQ ID NO: 85)
ATGAACAGAAAAGTTACCGCTATAGCACTTGCTGCCATAATATGGGCCACCGCAGCTCAAGGGTTCCTGATGTTCAAGCAGGGCCGATGCCTCTGCATTGGCCCTGGAATGAAGGCCGTGAAAATGGCCGAAATAGAAAAAGCTAGTGTCATATACCCCTCTAACGGTTGCGATAAAGTCGAGGTTATAGTCACAATGAAAGCTCATAAACGCCAACGCTGCCTCGACCCCCGGTCTAAGCAGGCTAGGCTCATAATGCAAGCAATCGAGAAGAAAAACTTTCTTAGACGGCAAAACATGtaG
CXCL10 (小鼠) (SEQ ID NO: 86)
ATGAACCCATCTGCCGCCGTTATTTTCTGTCTGATACTCCTTGGGCTGAGTGGCACACAAGGCATACCCCTCGCCCGCACAGTCCGGTGTAATTGTATACATATTGACGACGGCCCTGTTAGAATGCGGGCCATCGGTAAGCTGGAGATTATACCAGCAAGCCTTAGTTGTCCCAGGGTTGAAATCATAGCAACTATGAAAAAAAACGACGAACAAAGATGTTTGAATCCCGAGAGCAAGACAATCAAAAACCTTATGAAAGCATTTAGTCAAAAACGCTCTAAACGCGCTCCAtaG
CXCL10 (人類) (SEQ ID NO: 87)
ATGAATCAGACGGCAATCCTTATATGCTGCCTTATATTCCTTACTCTCTCAGGGATACAAGGGGTACCACTTTCTCGGACTGTTCGCTGCACTTGCATTTCAATATCTAACCAACCTGTAAATCCGCGGAGCCTGGAAAAATTGGAGATTATACCTGCTTCTCAATTCTGCCCTCGGGTGGAAATCATCGCCACTATGAAGAAGAAGGGCGAGAAAAGGTGTCTGAATCCAGAGTCAAAGGCAATCAAAAACCTGCTGAAAGCGGTGTCAAAGGAACGGTCCAAGAGATCACCCtaG
CXCL11-CXCL10 (小鼠) (SEQ ID NO: 88)
ATGAACAGGAAAGTAACAGCCATTGCATTGGCTGCCATCATCTGGGCCACCGCAGCACAGGGTTTTCTGATGTTTAAGCAAGGGCGCTGTCTCTGTATAGGCCCAGGCATGAAGGCCGTGAAGATGGCAGAGATTGAGAAGGCATCTGTGATTTATCCTTCTAACGGGTGCGATAAAGTCGAAGTTATTGTGACAATGAAGGCACACAAACGCCAACGGTGTTTGGACCCACGATCTAAACAGGCAAGATTGATTATGCAAGCCATCGAGAAAAAGAACTTTCTCCGAAGGCAAAATATGATCCCTTTGGCTCGGACAGTGCGGTGTAACTGTATTCACATCGACGATGGGCCAGTACGGATGAGAGCAATAGGAAAGCTCGAAATCATACCCGCCTCATTGTCTTGTCCCAGGGTGGAAATAATCGCCACTATGAAAAAGAACGATGAACAGAGGTGTCTCAACCCAGAGAGTAAGACTATCAAGAACCTTATGAAGGCATTCAGTCAGAAGAGGTCAAAGCGAGCACCAtaG
XCL1 (人類) (SEQ ID NO: 89)
ATGAGACTTCTCATATTGGCGCTTCTCGGGATATGTTCTCTTACGGCATACATAGTTGAGGGGGTGGGATCTGAGGTTAGCGATAAACGAACTTGTGTTAGTCTTACAACACAGAGGCTTCCAGTCTCCAGGATAAAAACATATACGATAACTGAGGGATCTCTCAGAGCGGTCATCTTCATAACGAAGAGGGGCCTGAAGGTCTGTGCTGACCCACAAGCGACTTGGGTAAGGGACGTTGTGCGGAGCATGGACAGGAAGAGCAATACTCGCAACAACATGATCCAAACCAAACCTACGGGCACCCAACAGTCAACCAATACTGCGGTAACATTGACGGGGtaG
XCL1 (小鼠) (SEQ ID NO: 90)
ATGCGCCTCCTTCTGCTGACTTTTCTGGGTGTATGTTGCCTGACACCCTGGGTCGTAGAAGGAGTAGGAACCGAGGTTCTGGAAGAGTCCTCATGTGTAAACTTGCAGACACAACGACTCCCCGTCCAAAAAATCAAGACCTATATAATCTGGGAGGGGGCAATGCGGGCCGTCATTTTCGTGACTAAACGAGGTCTCAAAATCTGCGCCGACCCCGAGGCTAAGTGGGTGAAGGCAGCCATTAAGACCGTGGATGGGAGAGCCAGCACCAGAAAGAACATGGCCGAAACAGTACCTACTGGCGCACAGCGGTCAACCTCAACTGCTATAACCTTGACAGGAtaG
m_sCD40L 1號(SEQ ID NO: 91)
ATGGAGACTGACACTCTGCTTCTGTGGGTGTTGCTGCTGTGGGTGCCTGGCAGTACAGGCGATATGCAACGAGGTGACGAGGACCCTCAAATCGCCGCCCATGTAGTCTCTGAAGCTAATAGCAACGCTGCATCCGTCTTGCAGTGGGCAAAGAAAGGCTACTATACTATGAAGTCCAACTTGGTAATGCTTGAAAACGGCAAGCAGTTGACTGTCAAGAGAGAGGGACTTTATTACGTCTATACCCAAGTCACATTCTGTAGCAATCGAGAACCCTCCTCACAGAGGCCTTTTATAGTGGGACTCTGGCTTAAACCAAGTAGCGGCTCTGAGCGCATACTGTTGAAAGCCGCAAACACACACAGCTCTTCCCAACTCTGCGAGCAGCAATCCGTGCATCTCGGTGGAGTATTTGAGCTTCAAGCCGGTGCCTCAGTGTTTGTGAACGTCACTGAGGCCTCCCAGGTCATACATCGAGTTGGGTTCAGCTCCTTCGGCTTGCTCAAGCTCtaG
m_sCD40L 2號(SEQ ID NO: 92)
ATGGAAACTGATACATTGCTGCTCTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTGCCTGGGAGTACAGGCGACATGAGGAGGCAGTTCGAGGATCTCGTTAAGGATATTACCCTTAATAAGGAGGAGAAGAAAGAAAACTCTTTTGAGATGCAACGAGGGGACGAAGATCCTCAGATCGCTGCTCACGTGGTCTCTGAAGCTAACAGCAACGCCGCTTCTGTCCTCCAGTGGGCCAAGAAAGGTTATTACACCATGAAATCAAACCTTGTAATGCTTGAAAACGGGAAACAGCTTACAGTGAAGAGGGAAGGTCTTTACTACGTCTATACCCAGGTAACCTTCTGCTCAAACAGAGAACCATCAAGCCAGAGGCCATTCATAGTGGGGCTCTGGCTCAAACCTTCCAGTGGCAGCGAGAGAATCTTGTTGAAAGCTGCTAATACACATAGTAGTAGCCAGCTTTGCGAGCAACAGTCAGTCCACCTCGGGGGGGTGTTTGAGTTGCAAGCAGGGGCCTCAGTATTCGTGAATGTCACTGAGGCTTCCCAGGTAATTCACAGGGTAGGCTTTAGTTCATTCGGTTTGCTGAAGCTTtaG
m_sCD40L 3號(SEQ ID NO: 93)
ATGCGAAGAATGCAGCTTCTGCTCCTTATTGCTCTGAGTCTCGCCCTTGTCACCAACTCCGGGGACAGAATGAAACAAATCGAGGACAAAATTGAAGAAATACTGAGTAAAATATATCACATCGAAAACGAAATTGCACGCATTAAGAAATTGATTGGCGAACGCACCAGTGGCGGCTCTGGTGGCACCGGAGGTTCAGGCGGGACCGGGGGCTCTGACAAAGTCGAAGAGGAGGTTAACCTTCATGAGGACTTTGTGTTCATCAAGAAGCTGAAACGGTGCAATAAAGGAGAAGGTTCTTTGAGCCTCCTTAATTGCGAAGAGATGCGACGACAGTTCGAGGATCTGGTTAAGGACATTACACTTAATAAGGAAGAGAAAAAGGAGAACTCTTTCGAAATGCAGCGCGGCGATGAAGATCCCCAGATAGCCGCCCATGTCGTCTCTGAGGCCAACTCTAACGCAGCATCCGTCCTCCAGTGGGCTAAGAAAGGATATTATACTATGAAAAGCAATTTGGTCATGCTCGAAAACGGTAAACAGCTCACTGTTAAGAGAGAAGGCCTCTATTACGTATATACTCAAGTAACTTTCTGTTCTAATAGGGAACCCTCCTCTCAAAGACCTTTTATCGTAGGACTCTGGTTGAAACCAAGTAGCGGTAGTGAAAGGATTCTGCTCAAAGCAGCTAATACTCACTCCAGCAGTCAACTGTGCGAACAACAAAGCGTTCACCTCGGGGGCGTCTTTGAACTTCAGGCAGGTGCCAGTGTTTTCGTCAACGTAACAGAAGCATCCCAGGTAATTCATCGAGTAGGGTTTTCTAGCTTTGGTTTGCTGAAGCTGtaG
抗CD40_FGK4.5 (SEQ ID NO: 94)
ATGGAAACTGATCGCCTGTTGCTCTGGGTACTTCTTCTGTGGGTGCCTGGGTCCACTGGTGACACTGTACTTACACAATCACCCGCTTTGGCCGTTTCTCCTGGTGAACGGGTCACAATTAGTTGCCGAGCTTCCGATTCTGTATCTACTCTTATGCATTGGTATCAACAAAAACCTGGTCAGCAGCCAAAATTGCTCATTTATCTTGCTAGTCACTTGGAGTCCGGCGTACCTGCTCGATTCAGCGGTAGTGGGTCTGGCACAGATTTCACTTTGACCATAGATCCCGTGGAGGCCGATGACACTGCAACCTACTATTGCCAGCAATCCTGGAACGACCCTTGGACTTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAACTCAAGCGAGCAGATGCTGCCCCAACCGTTAGTATATTCCCACCCTCAACCGAACAACTCGCCACAGGAGGCGCTAGTGTCGTGTGTCTTATGAACAATTTCTATCCACGAGACATTAGCGTCAAGTGGAAAATTGATGGGACAGAAAGGCGAGATGGAGTTTTGGATTCAGTAACAGACCAGGATTCAAAGGATTCTACCTATAGCATGAGCTCCACCTTGAGCCTGACCAAAGCTGATTATGAATCTCATAACCTGTATACTTGTGAAGTGGTGCATAAGACTTCTAGCTCACCAGTGGTTAAATCTTTTAACCGCAACGAATGTCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGACATTCGGCTCTCTTTGGTATTCCTGGTACTTTTTATAAAGGGGGTGCAATGTGAAGTCCAGCTCGTGGAAAGCGGTGGGGGCCTGGTTCAGCCCGGTCGCAGCCTTAAACTTAGTTGCGCAGCATCCGGATTTACATTTTCTGACTATAACATGGCCTGGGTTCGACAGGCACCCAAAAAAGGGCTGGAGTGGGTCGCAACTATCATATACGATGGTTCCCGGACATACTATAGAGATTCAGTGAAGGGGCGCTTTACAATAAGCAGGGACAATGCTAAGTCTACCTTGTATCTTCAGATGGACTCCCTGAGGAGCGAAGATACAGCAACATATTATTGTGCTACAAACCGCTGGTTGCTGCTTCATTATTTCGACTACTGGGGTCAGGGCGTCATGGTAACTGTATCAAGCGCCGAGACCACAGCCCCTTCTGTATATCCATTGGCACCAGGTACTGCTCTGAAATCCAACTCAATGGTAACCCTTGGATGTCTGGTTAAGGGTTATTTTCCCGAGCCCGTCACAGTTACTTGGAACTCTGGGGCCCTTTCTAGCGGAGTCCATACCTTTCCCGCCGTTTTGCAGAGTGGTCTGTACACCCTTACCTCAAGCGTCACAGTTCCATCTAGCACATGGAGCTCCCAGGCAGTAACTTGTAATGTGGCCCATCCAGCCTCCTCAACTAAGGTAGATAAAAAGATCGTTCCCAGAGAATGCAATCCATGTGGATGCACCGGGTCTGAGGTCAGCAGTGTGTTCATTTTCCCACCCAAGACTAAAGATGTATTGACTATTACTCTTACACCCAAAGTAACCTGCGTGGTGGTTGATATTAGTCAAAATGATCCCGAGGTACGGTTCTCTTGGTTTATCGACGACGTCGAAGTACATACAGCTCAGACACACGCTCCCGAGAAACAAAGCAATTCCACTCTTAGGAGCGTGTCCGAGTTGCCAATCGTACATAGGGATTGGCTTAATGGCAAGACCTTTAAGTGTAAGGTCAATTCAGGGGCATTCCCCGCACCAATAGAGAAGAGTATAAGCAAACCCGAGGGGACACCCAGAGGTCCACAGGTCTATACAATGGCTCCCCCCAAGGAAGAGATGACCCAAAGTCAAGTCTCAATTACATGTATGGTGAAGGGCTTTTATCCACCCGACATATACACTGAGTGGAAGATGAATGGACAGCCCCAAGAGAATTATAAAAACACTCCCCCTACCATGGACACCGACGGGTCCTATTTTCTTTATAGTAAATTGAACGTGAAAAAGGAGACCTGGCAACAAGGCAACACTTTCACCTGCTCCGTTCTTCACGAGGGCCTGCATAATCATCATACCGAAAAGTCTCTCAGTCATTCTCCAGGTAAGtaG
CD40L_2 (人類) (SEQ ID NO: 95)
ATGGAAACAGATACGTTGCTGTTGTGGGTACTTCTCCTTTGGGTCCCTGGCAGCACAGGGGACGAGAATAGTTTCGAAATGCAGAAGGGCGACCAGAACCCACAGATCGCGGCTCACGTTATATCAGAAGCAAGTAGTAAGACCACTTCCGTACTTCAGTGGGCTGAAAAAGGATATTACACCATGTCCAACAATCTCGTGACACTGGAGAACGGTAAACAACTTACGGTGAAACGACAGGGCCTCTATTACATCTACGCTCAGGTGACATTCTGCTCAAATAGGGAGGCTTCTAGTCAAGCGCCCTTCATCGCCAGCCTGTGCCTCAAATCTCCCGGCCGGTTCGAACGAATCCTGTTGCGAGCGGCCAATACCCATAGCTCAGCTAAACCTTGCGGCCAGCAGAGTATTCATCTTGGTGGTGTGTTTGAACTTCAGCCGGGAGCATCTGTGTTCGTCAACGTAACGGACCCTAGCCAAGTGTCTCATGGGACAGGTTTTACATCCTTCGGACTCCTCAAGTTGtaG
Flt3L (人類) (SEQ ID NO: 96)
ATGACAGTTCTCGCGCCAGCTTGGAGTCCCACCACATACTTGCTTTTGCTTCTGCTTCTGTCCTCTGGCCTGAGTGGGACCCAAGATTGTTCCTTTCAACATTCCCCAATTAGTTCTGATTTTGCAGTGAAGATTAGAGAGCTCTCAGACTATCTGCTGCAAGATTATCCTGTCACAGTCGCTTCAAACCTGCAAGACGAAGAGCTCTGCGGTGCCTTGTGGCGGTTGGTCTTGGCTCAAAGATGGATGGAGAGACTGAAAACCGTAGCAGGCAGCAAGATGCAGGGTCTCCTGGAAAGGGTGAACACGGAAATCCATTTTGTGACCAAGTGCGCGTTCCAGCCCCCACCGAGTTGTCTCCGGTTTGTTCAAACGAATATATCCCGGTTGCTCCAGGAAACCTCAGAACAACTGGTGGCTTTGAAACCCTGGATCACAAGACAAAACTTTAGTCGGTGCCTCGAACTCCAGTGCCAACCAGATTCTTCTACACTTCCCCCCCCGTGGTCCCCGCGCCCGTTGGAAGCAACGGCCCCAtaG
TGFb TRAP (人類) (SEQ ID NO: 97)
ATGGCCTGGAGTCCTCTGTTTCTGACTCTTATAACTCACTGTGCCGGCAGTTGGGCTATACCCCCTCATGTACAGAAGTCTGTAAACAACGACATGATTGTAACCGACAATAATGGCGCAGTGAAATTCCCACAACTGTGTAAGTTCTGTGATGTACGGTTTAGTACATGCGACAATCAAAAAAGCTGTATGTCTAACTGCTCTATTACATCCATATGTGAAAAACCTCAGGAGGTGTGTGTTGCCGTTTGGCGAAAAAATGATGAGAATATCACACTGGAGACAGTATGTCATGACCCTAAACTGCCATACCATGATTTCATACTGGAGGACGCCGCCAGTCCTAAGTGCATTATGAAAGAGAAAAAGAAACCCGGTGAAACATTCTTTATGTGCTCTTGTAGCTCTGACGAGTGTAACGACAACATTATATTCAGCGAGGAGTACAATACAAGCAACCCCGATATACCACCTCACGTACAAAAAAGTGTCAACAACGATATGATTGTTACCGACAATAACGGAGCTGTTAAGTTTCCTCAGTTGTGCAAGTTCTGCGATGTACGATTCTCTACCTGCGACAACCAAAAGTCATGTATGTCTAACTGTTCCATAACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAAGTCTGCGTCGCCGTGTGGCGGAAAAACGACGAGAATATCACTCTTGAAACCGTTTGTCATGATCCTAAACTGCCCTATCACGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCCCCTAAGTGTATCATGAAAGAAAAGAAGAAACCTGGGGAGACATTCTTTATGTGTTCATGCTCCTCCGATGAGTGTAACGACAATATCATCTTCTCTGAGGAATACAACACTTCTAACCCTGATtaG
非蘇木單抗(Fresolimumab) (人類) (SEQ ID NO: 98)
ATGGCCTGGTCCCCTCTTTTTCTGACCCTCATCACACACTGTGCAGGCTCATGGGCTGAGACCGTCTTGACCCAGTCCCCAGGAACTTTGTCTCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCTACCCTTAGTTGTCGAGCCTCTCAGTCCCTTGGTTCTAGCTATCTCGCTTGGTACCAGCAAAAGCCAGGCCAGGCCCCACGACTGCTGATCTACGGAGCATCTTCACGGGCTCCCGGCATTCCCGATCGATTTTCCGGATCTGGTAGTGGTACAGATTTCACACTGACCATATCTCGCCTGGAGCCCGAGGACTTTGCTGTTTATTATTGTCAGCAGTACGCCGATTCTCCTATCACTTTTGGACAGGGAACCCGCCTGGAGATTAAGCGCACAGTAGCAGCTCCATCCGTCTTTATCTTTCCACCATCAGATGAACAGCTCAAGAGTGGGACCGCAAGTGTAGTATGCCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAGAGTGGCAATAGTCAAGAAAGTGTTACTGAGCAAGATAGTAAGGACTCTACATACTCTTTGAGTTCTACTTTGACCCTGTCAAAAGCAGATTATGAAAAACATAAGGTGTATGCATGTGAAGTTACACACCAAGGGTTGTCCTCTCCAGTTACAAAATCTTTTAATAGAGGAGAGTGCCGCCGCAAACGCGGTAGTGGAGAAGGTCGAGGCTCACTCTTGACCTGTGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCTATGGATTGGACTTGGAGGGTATTTTGTCTTTTGGCAGTAACACCTGGAGCTCACCCCCAAGTACAGCTCGTCCAATCTGGTGCCGAGGTTAAAAAGCCTGGAAGTTCAGTGAAGGTCTCTTGCAAGGCATCTGGATACACCTTTTCATCTAACGTCATATCCTGGGTACGGCAAGCCCCAGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGAGGGGTCATCCCCATCGTGGACATTGCTAATTACGCTCAGCGATTCAAAGGGCGGGTTACTATAACTGCCGACGAGTCTACCTCAACTACCTACATGGAGTTGTCCTCTCTCCGCTCCGAGGACACTGCTGTATATTACTGTGCCAGCACTCTCGGGTTGGTGTTGGATGCCATGGACTATTGGGGACAAGGAACCCTGGTGACAGTTAGCTCCGCAAGCACTAAAGGCCCTTCTGTTTTTCCCTTGGCACCTTGTAGTAGGTCTACCTCTGAGTCTACAGCAGCACTTGGATGCTTGGTTAAGGACTATTTTCCCGAGCCAGTTACAGTCTCTTGGAACAGTGGTGCCCTCACAAGTGGGGTTCATACCTTCCCCGCAGTCCTCCAGAGTAGTGGCCTTTACAGCCTCTCATCAGTTGTGACTGTTCCTAGTTCATCACTCGGTACTAAGACATATACATGTAACGTAGACCACAAGCCAAGCAACACAAAAGTAGACAAACGAGTCGAATCTAAGTATGGACCCCCTTGTCCCTCCTGTCCTGCTCCCGAGTTCCTTGGGGGCCCTTCCGTGTTCTTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACCCTCATGATCTCACGAACCCCAGAGGTAACATGTGTGGTTGTTGACGTAAGTCAGGAAGATCCCGAAGTGCAATTTAATTGGTACGTGGATGGCGTCGAAGTCCATAACGCTAAAACAAAACCCCGAGAGGAACAATTCAATTCCACATATCGGGTGGTGAGTGTATTGACCGTTCTTCACCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAAGTAAGCAACAAAGGTCTGCCAAGTAGCATAGAAAAAACAATATCTAAAGCTAAGGGCCAACCAAGGGAACCACAAGTATATACATTGCCCCCCTCTCAGGAAGAGATGACAAAGAATCAAGTTAGCCTGACCTGTTTGGTAAAGGGGTTCTATCCCTCAGATATAGCAGTCGAGTGGGAATCTAACGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACCCCCCCTGTGTTGGACTCAGACGGCAGCTTCTTTCTCTATTCACGGCTCACTGTTGATAAGTCCCGATGGCAGGAGGGGAATGTTTTCAGCTGTAGCGTGATGCACGAAGCTCTCCACAACCACTATACACAGAAAAGTTTGTCTTTGTCCCTTGGAAAAtaG
TGFb中和肽(人類) (SEQ ID NO: 99)
ATGAGTACATCCTTTCCAGAGCTGGATCTGGAGAATTTTGAGTATGACGACAGTGCCGAAGCCTGCTACCTCGGGGACATAGTCGCATTCGGGACAATCTTTTTGTCTGTATTTTACGCCCTGGTGTTTACATTTGGCCTGGTTGGAAATCTGTTGGTCGTACTCGCTCTCACCAATTCCCGAAAACCCAAAAGTATAACAGACATATACCTGTTGAATCTGGCACTGAGTGACCTTTTGTTCGTCGCCACCCTTCCTTTTTGGACACACTACCTTATCAGTCACGAGGGGCTTCATAATGCTATGTGCAAGCTCACTACTGCCTTCTTCTTTATCGGATTCTTCGGGGGTATCTTTTTTATCACAGTTATTAGCATTGACCGATACCTTGCCATAGTGCTCGCAGCCAACTCAATGAACAACCGCACCGTGCAGCATGGAGTGACTATTTCCTTGGGTGTGTGGGCCGCTGCTATACTTGTCGCCAGCCCTCAATTCATGTTTACCAAAAGGAAAGACAATGAGTGCCTCGGAGATTACCCTGAGGTGTTGCAAGAAATGTGGCCTGTACTTCGAAATAGCGAAGTGAATATACTCGGCTTTGCTCTTCCTCTGCTCATCATGTCATTCTGTTATTTTCGAATAATCCAAACATTGTTCAGCTGTAAGAACCGAAAGAAAGCCCGCGCCGTACGCCTGATTCTGCTCGTTGTGTTCGCCTTTTTTCTGTTTTGGACTCCTTACAACATAATGATATTCCTGGAGACTCTCAAATTCTATAACTTTTTTCCCTCCTGTGATATGAAAAGGGACCTTAGATTGGCTCTCAGTGTCACTGAAACAGTAGCCTTTAGCCATTGTTGTCTCAACCCTTTCATATATGCATTTGCAGGGGAAAAGTTCCGGCGGTATCTCGGACATTTGTATCGGAAGTGCTTGGCCGTGTTGTGTGGTCATCCTGTCCATACCGGATTCTCTCCTGAGAGTCAACGGAGCCGCCAAGATTCAATCCTGTCCAGTTTCACTCACTATACTTCAGAGGGGGATGGCAGCCTTCTGCTC
犬尿胺酸酶1號(SEQ ID NO: 100)
ATGGAGACCGACACTTTGTTGCTGTGGGTACTTTTGTTGTGGGTCCCAGGATCTACCGGGGATATGGAACCCTCTCCTCTTGAACTGCCAGTAGACGCCGTGCGCCGCATTGCAGCCGAGTTGAATTGCGATCCAACAGATGAACGCGTTGCCCTGAGGCTCGACGAAGAGGATAAATTGTCACATTTCAGGAACTGCTTTTACATTCCAAAGATGAGGGATCTTCCATCCATAGATCTTAGCCTCGTGTCCGAGGATGACGATGCCATATATTTTCTTGGGAACAGTCTTGGGTTGCAGCCAAAAATGGTACGGACATATCTCGAAGAGGAGCTGGACAAATGGGCTAAAATGGGTGCTTACGGCCACGACGTGGGAAAACGCCCCTGGATAGTTGGCGACGAATCTATCGTGAGTCTTATGAAAGATATAGTTGGAGCACATGAGAAAGAAATTGCACTGATGAATGCCCTTACTATCAATCTGCATCTCCTCTTGCTTTCATTCTTTAAGCCCACTCCTAAACGCCACAAAATACTTTTGGAAGCAAAAGCCTTTCCAAGCGACCACTACGCTATTGAGTCACAAATACAACTCCATGGACTTGATGTGGAAAAGTCTATGCGGATGGTAAAACCACGCGAAGGCGAGGAGACCCTTCGAATGGAGGACATACTTGAGGTCATCGAAGAAGAAGGAGATAGTATAGCAGTTATCCTTTTCAGCGGGCTGCACTTCTACACAGGTCAACTCTTTAACATTCCAGCTATTACTAAGGCAGGCCACGCTAAAGGATGCTTCGTGGGCTTTGACCTTGCACACGCAGTAGGAAACGTAGAGCTCCGCTTGCACGATTGGGGCGTTGATTTCGCCTGCTGGTGTTCATATAAGTATCTTAACTCAGGAGCTGGTGGGTTGGCAGGCGCATTCGTACACGAGAAACACGCTCATACCGTAAAGCCTGCACTGGTAGGGTGGTTCGGACACGATCTCTCTACCCGCTTCAATATGGATAATAAACTCCAGCTTATACCTGGCGCCAATGGATTCAGGATCTCAAATCCTCCTATTTTGCTCGTTTGCAGTTTGCACGCATCTCTTGAGGTGTTCCAGCAGGCTACCATGACTGCACTCCGCCGGAAGTCAATCCTTTTGACCGGATACTTGGAGTATATGCTGAAACATTATCACTCAAAAGATAACACTGAGAATAAGGGCCCCATAGTAAACATTATCACTCCATCTCGGGCTGAAGAGCGCGGCTGCCAACTCACATTGACTTTTTCCATTCCCAAGAAGTCAGTGTTCAAAGAGTTGGAGAAACGGGGGGTTGTATGTGATAAGCGGGAGCCAGATGGAATCCGCGTTGCCCCAGTCCCCCTCTATAATTCTTTTCACGATGTATACAAGTTTATTAGACTGCTGACAAGTATCTTGGACTCATCTGAGCGATCTtaG
犬尿胺酸酶2號(SEQ ID NO: 101)
ATGGAACCCTCTCCTCTTGAACTGCCAGTAGACGCCGTGCGCCGCATTGCAGCCGAGTTGAATTGCGATCCAACAGATGAACGCGTTGCCCTGAGGCTCGACGAAGAGGATAAATTGTCACATTTCAGGAACTGCTTTTACATTCCAAAGATGAGGGATCTTCCATCCATAGATCTTAGCCTCGTGTCCGAGGATGACGATGCCATATATTTTCTTGGGAACAGTCTTGGGTTGCAGCCAAAAATGGTACGGACATATCTCGAAGAGGAGCTGGACAAATGGGCTAAAATGGGTGCTTACGGCCACGACGTGGGAAAACGCCCCTGGATAGTTGGCGACGAATCTATCGTGAGTCTTATGAAAGATATAGTTGGAGCACATGAGAAAGAAATTGCACTGATGAATGCCCTTACTATCAATCTGCATCTCCTCTTGCTTTCATTCTTTAAGCCCACTCCTAAACGCCACAAAATACTTTTGGAAGCAAAAGCCTTTCCAAGCGACCACTACGCTATTGAGTCACAAATACAACTCCATGGACTTGATGTGGAAAAGTCTATGCGGATGGTAAAACCACGCGAAGGCGAGGAGACCCTTCGAATGGAGGACATACTTGAGGTCATCGAAGAAGAAGGAGATAGTATAGCAGTTATCCTTTTCAGCGGGCTGCACTTCTACACAGGTCAACTCTTTAACATTCCAGCTATTACTAAGGCAGGCCACGCTAAAGGATGCTTCGTGGGCTTTGACCTTGCACACGCAGTAGGAAACGTAGAGCTCCGCTTGCACGATTGGGGCGTTGATTTCGCCTGCTGGTGTTCATATAAGTATCTTAACTCAGGAGCTGGTGGGTTGGCAGGCGCATTCGTACACGAGAAACACGCTCATACCGTAAAGCCTGCACTGGTAGGGTGGTTCGGACACGATCTCTCTACCCGCTTCAATATGGATAATAAACTCCAGCTTATACCTGGCGCCAATGGATTCAGGATCTCAAATCCTCCTATTTTGCTCGTTTGCAGTTTGCACGCATCTCTTGAGGTGTTCCAGCAGGCTACCATGACTGCACTCCGCCGGAAGTCAATCCTTTTGACCGGATACTTGGAGTATATGCTGAAACATTATCACTCAAAAGATAACACTGAGAATAAGGGCCCCATAGTAAACATTATCACTCCATCTCGGGCTGAAGAGCGCGGCTGCCAACTCACATTGACTTTTTCCATTCCCAAGAAGTCAGTGTTCAAAGAGTTGGAGAAACGGGGGGTTGTATGTGATAAGCGGGAGCCAGATGGAATCCGCGTTGCCCCAGTCCCCCTCTATAATTCTTTTCACGATGTATACAAGTTTATTAGACTGCTGACAAGTATCTTGGACTCATCTGAGCGATCTtaG
VEGF (SEQ ID NO: 102)
ATGAATTTCTTGCTGAGCTGGGTGCATTGGACACTCGCATTGTTGCTGTACTTGCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACTACTGAGGGCGAGCAAAAGTCTCATGAGGTGATTAAATTTATGGACGTTTACCAACGATCATACTGTCGGCCAATCGAAACCCTCGTAGATATATTCCAGGAGTACCCAGACGAGATCGAATACATTTTCAAGCCCTCATGTGTCCCATTGATGCGATGTGCTGGGTGCTGTAACGACGAAGCACTTGAATGTGTCCCCACCTCCGAGAGTAACATCACAATGCAAATAATGAGAATCAAGCCCCACCAATCCCAACATATCGGTGAAATGTCATTCCTTCAGCATTCCCGCTGCGAGTGCCGGCCTAAGAAGGACCGCACCAAACCAGAGAACCATTGTGAACCCTGTTCTGAGAGACGGAAGCACTTGTTCGTACAGGACCCTCAAACATGCAAGTGCAGCTGTAAGAATACCGACTCACGGTGTAAAGCTAGGCAACTGGAGCTTAATGAAAGGACCTGCCGATGCGATAAACCCAGGAGGtaa
GM-CSF(SEQ ID NO: 103)
ATGTGGTTGCAGAATTTGCTCTTCCTGGGGATTGTGGTCTACAGCCTCTCCGCACCTACCCGCTCTCCTATCACAGTTACAAGACCCTGGAAACATGTGGAGGCCATTAAAGAAGCATTGAATTTGTTGGACGATATGCCCGTCACCCTGAATGAAGAAGTAGAAGTTGTTTCTAATGAGTTCAGCTTTAAAAAATTGACCTGTGTGCAGACACGGCTTAAAATTTTTGAACAGGGACTTAGAGGAAACTTTACTAAGCTGAAGGGGGCACTTAACATGACAGCTTCTTATTATCAGACCTATTGTCCTCCAACACCTGAAACCGACTGTGAAACACAGGTAACCACTTACGCCGATTTTATTGATTCTTTGAAAACATTCCTCACCGATATACCATTTGAGTGTAAGAAGCCAGGCCAAAAGtaG
抗PD1 (SEQ ID NO: 104)
ATGGAAACTGACACACTTCTTCTGTGGGTCTTGCTCCTGTGGGTCCCAGGCTCTACTGGTGACAGTCCTGATAGGCCATGGAACCCACCTACCTTTAGTCCAGCCTTGCTCGTCGTAACCGAAGGGGACAACGCTACATTCACCTGCTCTTTTAGCAATACTTCTGAGAGTTTTCATGTAGTCTGGCATCGGGAGAGTCCATCCGGACAAACAGATACTTTGGCCGCTTTTCCAGAGGATAGGTCTCAACCTGGGCAAGACGCAAGGTTTCGAGTCACACAGCTTCCTAACGGGAGAGATTTTCACATGTCTGTAGTTCGGGCACGCCGAAATGATTCTGGCACATATGTTTGCGGTGTGATCTCACTTGCTCCAAAGATTCAAATAAAGGAGAGCCTTCGCGCCGAGTTGCGGGTGACTGAGCGGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCATACTTGTCCACCCTGTGGCGGCGGGTCATCCGGTGGCGGGTCTGGGGGGCAACCAAGAGAGCCACAGGTATATACTCTTCCCCCCAGCAGAGAAGAAATGACAAAAAACCAAGTGTCCCTGACATGTCTGGTTAAAGGATTTTATCCCAGTGACATTGCTGTAGAATGGGAATCCAATGGTCAACCCGAGAATAACTACAAAACCACTCCTCCAGTATTGGACAGTGACGGTTCCTTCTTCCTCTATTCCAAACTTACAGTGGATAAATCCCGCTGGCAGCAAGGGAATGTATTCAGCTGTAGTGTCATGCACGAAGCTCTTCATAACCATTATACACAGAAATCTCTTTCCCTGAGCCCAGGTAAAtaG
腺苷去胺酶(ADA) 1號(小鼠) (SEQ ID NO: 105)
ATGGAGACTGATACACTTTTGCTCTGGGTTTTGCTCTTGTGGGTACCAGGGTCTACTGGAGATGCACAAACTCCTGCATTCAACAAGCCTAAGGTAGAGCTTCATGTCCATTTGGACGGAGCCATAAAACCTGAAACCATACTCTATTTCGGCAAGAAACGGGGTATAGCACTTCCCGCTGATACCGTGGAAGAGTTGAGAAATATCATTGGCATGGACAAACCTCTTAGCCTGCCTGGCTTTCTTGCAAAGTTCGACTACTATATGCCAGTTATAGCAGGGTGTAGAGAAGCAATAAAGCGAATCGCCTATGAGTTCGTTGAGATGAAGGCTAAAGAAGGAGTTGTTTACGTGGAAGTCCGGTACTCACCTCATCTGCTTGCTAATAGCAAGGTGGACCCAATGCCATGGAATCAAACTGAAGGTGATGTAACCCCTGACGATGTGGTCGATTTGGTCAATCAAGGTCTCCAAGAAGGCGAGCAGGCTTTCGGCATTAAGGTAAGAAGTATATTGTGCTGTATGCGACATCAACCTTCATGGTCCCTGGAGGTCCTCGAATTGTGCAAAAAGTACAATCAAAAAACAGTGGTCGCAATGGATCTCGCTGGAGATGAGACCATAGAAGGTTCCTCTCTTTTCCCCGGTCATGTCGAAGCATATGAAGGGGCTGTCAAAAATGGTATCCACCGCACCGTCCACGCAGGGGAAGTAGGGTCCCCAGAAGTAGTCAGGGAAGCCGTTGACATTTTGAAAACAGAAAGAGTCGGGCATGGCTACCATACAATAGAGGACGAAGCCTTGTACAATCGACTTTTGAAAGAAAATATGCACTTCGAGGTCTGTCCCTGGAGTTCATATCTCACCGGAGCATGGGACCCCAAAACAACCCACGCCGTCGTACGCTTCAAGAATGATAAGGCAAACTACAGTTTGAATACAGATGATCCACTGATATTCAAGTCAACACTTGACACTGACTACCAGATGACAAAAAAAGATATGGGTTTCACCGAAGAAGAGTTCAAGAGATTGAACATTAACGCAGCAAAAAGCTCCTTCCTGCCAGAGGAAGAGAAAAAAGAATTGCTTGAAAGGTTGTATCGAGAATACCAA
腺苷去胺酶(ADA) 2號(小鼠) (SEQ ID NO: 106)
ATGGCACAAACTCCAGCTTTTAATAAGCCCAAAGTGGAACTTCATGTTCATCTGGATGGGGCAATTAAGCCCGAAACTATATTGTACTTTGGCAAAAAGAGGGGTATTGCCCTGCCAGCAGATACCGTTGAGGAGCTTCGCAACATCATTGGGATGGACAAGCCCCTCTCTCTGCCAGGTTTTCTCGCTAAATTCGATTATTATATGCCTGTTATTGCTGGTTGCCGGGAGGCCATCAAGAGGATAGCCTACGAGTTTGTTGAGATGAAGGCCAAAGAGGGCGTGGTGTACGTAGAGGTCAGATACAGCCCTCACCTGCTTGCCAACAGCAAGGTGGACCCAATGCCCTGGAACCAAACCGAGGGGGATGTCACTCCCGACGACGTTGTAGACCTCGTAAATCAGGGCCTTCAAGAGGGCGAGCAGGCATTTGGCATAAAAGTCCGGTCTATACTCTGCTGTATGAGGCACCAACCCTCCTGGTCTTTGGAGGTACTTGAGTTGTGTAAGAAATACAATCAAAAGACTGTAGTCGCCATGGATCTTGCAGGCGATGAAACCATCGAGGGTAGCTCCTTGTTCCCTGGACATGTTGAAGCCTACGAGGGGGCCGTAAAAAATGGGATACACAGGACTGTCCACGCTGGTGAAGTCGGAAGCCCAGAGGTGGTAAGGGAGGCAGTTGACATACTCAAGACAGAGCGGGTTGGACACGGATACCACACAATTGAGGACGAGGCCCTGTATAACCGCCTCCTCAAAGAGAACATGCATTTTGAGGTGTGTCCTTGGTCCAGCTACCTGACTGGTGCTTGGGACCCTAAAACAACTCACGCCGTGGTCCGGTTCAAGAACGATAAAGCCAATTACTCTTTGAATACCGACGACCCCCTCATATTCAAATCAACATTGGATACCGACTACCAAATGACCAAAAAGGATATGGGGTTTACTGAAGAGGAGTTCAAGAGGCTCAACATAAATGCCGCTAAATCCTCCTTTCTCCCCGAGGAAGAAAAAAAAGAACTCCTTGAGCGGCTGTATAGGGAGTATCAA
4-1BBL 1號(小鼠) (SEQ ID NO: 107)
ATGGAAACAGATACACTCTTGCTCTGGGTACTGCTTCTGTGGGTCCCCGGCTCTACTGGGGATGAAGATGATGTAACTACTACAGAAGAACTCGCTCCCGCTCTTGTCCCCCCACCCAAGGGTACCTGCGCCGGTTGGATGGCTGGCATCCCAGGACATCCAGGTCACAACGGTACCCCCGGAAGAGATGGTCGGGATGGAACTCCCGGCGAGAAGGGCGAAAAAGGGGATGCAGGGCTTCTGGGACCTAAAGGTGAAACAGGGGACGTTGGAATGACTGGTGCAGAAGGGCCTCGCGGCTTTCCTGGCACCCCTGGGAGGAAAGGAGAGCCCGGAGAGCTCCAGAGAACTGAACCTCGGCCTGCACTCACTATAACTACTTCCCCTAATCTTGGGACCCGCGAGAACAACGCCGATCAGGTTACACCTGTAAGCCATATCGGGTGCCCCAATACTACCCAGCAAGGGAGTCCCGTGTTCGCAAAGCTTTTGGCTAAAAACCAAGCATCCCTGTGTAACACTACTCTTAATTGGCATTCACAAGACGGTGCTGGTAGCTCTTATCTTTCTCAGGGGCTGCGGTACGAAGAAGATAAGAAGGAATTGGTTGTGGATTCTCCAGGACTCTATTATGTCTTTCTCGAATTGAAGCTCAGTCCCACCTTCACAAACACTGGACACAAAGTCCAGGGCTGGGTAAGTCTGGTACTCCAAGCAAAGCCCCAGGTTGACGATTTCGACAATTTGGCACTCACCGTAGAGCTTTTCCCATGCTCCATGGAAAATAAACTTGTTGATCGGTCATGGTCACAGCTCTTGCTGCTTAAGGCAGGGCATCGCCTCTCAGTGGGTCTGAGAGCTTATTTGCATGGTGCACAAGATGCTTACAGGGATTGGGAATTGTCCTACCCAAACACTACAAGTTTCGGGTTGTTCCTTGTCAAACCTGATAACCCATGGGAGtaG
4-1BBL 2號(小鼠) (SEQ ID NO: 108)
ATGGAAACTGATACACTCCTCCTGTGGGTCCTTCTTTTGTGGGTGCCCGGATCAACCGGCGATGGCTGGATGGCAGGCATCCCAGGACACCCAGGACACAACGGTACTCCAGGTCGAGACGGTCGGGATGGGACTCCTGGGGAGAAAGGCGAGAAAGGGGACGCTGGTTTGCTCGGTCCTAAGGGGGAAACCGGGGATGTAGGAATGACAGGGGCTGAAGGGCCTCGGGGATTTCCTGGGACACCAGGCAGGAAGGGTGAACCAGGGGAGGCCCTCCAGCGCACCGAGCCACGGCCAGCTCTGACCATAACAACAAGTCCAAACCTGGGCACACGCGAAAACAATGCTGACCAGGTGACTCCTGTAAGTCACATCGGATGCCCTAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTATTTGCAAAGCTTCTCGCAAAAAATCAAGCATCACTTTGTAATACAACCCTGAACTGGCATTCTCAGGACGGAGCAGGGTCCTCTTATTTGTCTCAAGGGCTCCGCTACGAAGAAGATAAAAAGGAATTGGTTGTTGACAGTCCAGGTTTGTATTATGTGTTTTTGGAACTTAAGCTGTCACCAACCTTCACTAACACCGGCCACAAGGTCCAAGGCTGGGTTAGTCTTGTTTTGCAAGCCAAACCTCAAGTGGATGATTTTGACAATCTGGCTTTGACTGTTGAGCTTTTTCCATGCAGTATGGAGAATAAACTGGTTGATCGGTCATGGTCACAGCTCCTTCTGCTCAAGGCCGGACATAGGCTGAGTGTGGGACTTCGGGCCTACTTGCACGGCGCCCAGGACGCATACCGAGACTGGGAACTCAGCTACCCTAACACAACTTCTTTTGGGTTGTTCCTTGTCAAACCCGATAATCCTTGGGAAtaG
HPGE2 1號(小鼠) (SEQ ID NO: 109)
ATGGAGACTGATACTTTGCTCCTGTGGGTTCTTCTCCTGTGGGTTCCTGGTTCCACAGGGGATATGCATGTCAATGGCAAGGTAGCACTCGTGACTGGGGCTGCACAGGGTATCGGGAAAGCTTTTGCCGAGGCCCTGTTGCTGCATGGCGCCAAGGTCGCTTTGGTAGATTGGAACTTGGAGGCTGGAGTTAAATGCAAAGCTGCACTCGACGAACAATTTGAGCCTCAAAAAACCCTCTTTGTGCAGTGTGACGTTGCTGACCAAAAGCAACTCAGGGACACATTCAGGAAGGTCGTAGACCATTTCGGACGCCTCGATATACTCGTTAATAATGCCGGGGTAAACAACGAAAAGAACTGGGAACAAACATTGCAAATCAACCTGGTAAGTGTCATTAGCGGAACTTATCTGGGTCTTGATTATATGAGCAAGCAGAACGGGGGCGAGGGCGGGATCATTATCAACATGTCAAGTCTTGCCGGATTGATGCCAGTTGCTCAGCAGCCTGTTTACTGTGCCAGCAAGCACGGTATTATTGGGTTTACCCGGAGTGCCGCCATGGCCGCAAATCTTATGAAGAGTGGGGTAAGACTGAATGTTATCTGCCCAGGTTTCGTAGATACCCCAATCCTGGAGAGCATCGAGAAGGAGGAAAATATGGGACAATACATTGAATATAAAGATCAAATCAAGGCTATGATGAAGTTCTACGGGGTTCTGCATCCATCCACAATTGCCAACGGGCTCATTAATCTGATTGAGGACGACGCCTTGAACGGAGCTATAATGAAAATCACAGCTTCCAAAGGCATTCACTTCCAAGATTATGATATATCACCCTTGCTTGTCAAGGCTCCTCTGACAAGT
HPGE2 2號(小鼠) (SEQ ID NO: 110)
ATGCATGTCAATGGCAAGGTAGCACTCGTGACTGGGGCTGCACAGGGTATCGGGAAAGCTTTTGCCGAGGCCCTGTTGCTGCATGGCGCCAAGGTCGCTTTGGTAGATTGGAACTTGGAGGCTGGAGTTAAATGCAAAGCTGCACTCGACGAACAATTTGAGCCTCAAAAAACCCTCTTTGTGCAGTGTGACGTTGCTGACCAAAAGCAACTCAGGGACACATTCAGGAAGGTCGTAGACCATTTCGGACGCCTCGATATACTCGTTAATAATGCCGGGGTAAACAACGAAAAGAACTGGGAACAAACATTGCAAATCAACCTGGTAAGTGTCATTAGCGGAACTTATCTGGGTCTTGATTATATGAGCAAGCAGAACGGGGGCGAGGGCGGGATCATTATCAACATGTCAAGTCTTGCCGGATTGATGCCAGTTGCTCAGCAGCCTGTTTACTGTGCCAGCAAGCACGGTATTATTGGGTTTACCCGGAGTGCCGCCATGGCCGCAAATCTTATGAAGAGTGGGGTAAGACTGAATGTTATCTGCCCAGGTTTCGTAGATACCCCAATCCTGGAGAGCATCGAGAAGGAGGAAAATATGGGACAATACATTGAATATAAAGATCAAATCAAGGCTATGATGAAGTTCTACGGGGTTCTGCATCCATCCACAATTGCCAACGGGCTCATTAATCTGATTGAGGACGACGCCTTGAACGGAGCTATAATGAAAATCACAGCTTCCAAAGGCATTCACTTCCAAGATTATGATATATCACCCTTGCTTGTCAAGGCTCCTCTGACAAGT
人類IL-15多肽序列(SEQ ID NO: 199)
MVLGTIDLCSCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
人類IL-15多肽序列(SEQ ID NO: 224)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
人類IL-15Rα多肽序列(SEQ ID NO: 200)
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
人類IL-15Rα sushi結構域多肽序列(SEQ ID NO: 201)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
人類IL-15/IL-15Rα sushi結構域多肽序列(SEQ ID NO: 202)
MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
IL-12 (IL-12p70)多肽序列(SEQ ID NO: 203)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
分泌信號及信號錨
本文所提供之嵌合蛋白之一或多種效應分子可為在嵌合蛋白之N末端(例如， S - C - MT之效應分子之N末端)具有分泌信號肽(亦稱為信號肽或信號序列)之可分泌效應分子，該分泌信號肽將預定用於分泌或膜定位(亦稱為膜插入)之新合成蛋白引導至適當的蛋白加工路徑。對於具有式 MT - C - S之嵌合蛋白而言，膜系鏈結構域一般具有將預定用於膜定位之新合成蛋白引導至適當的蛋白加工路徑之信號錨序列(例如，II型跨膜蛋白之信號錨序列)。對於具有式 S - C - MT之嵌合蛋白而言，可使用具有反向信號錨序列(例如，某些III型跨膜蛋白之信號錨序列)之膜系鏈結構域，其一般沒有將預定用於膜定位之新合成蛋白引導至適當的蛋白加工路徑之單獨分泌信號肽。
一般而言，對於本文所述之所有膜可切割嵌合蛋白而言，一或多種效應分子係可分泌效應分子(在式 S - C - MT或 MT - C - S中稱為「S」)。在具有兩種或更多種嵌合蛋白之實施例中，每一嵌合蛋白皆可包含分泌信號。在具有兩種或更多種嵌合蛋白之實施例中，每一嵌合蛋白皆可包含分泌信號，使得每一效應分子皆能夠在蛋白酶切割位點切割後自經工程改造之細胞中分泌。
與效應分子可操作地締合之分泌信號肽可為天然分泌信號肽(例如，一般與給定效應分子內源性締合之分泌信號肽)。與效應分子可操作地締合之分泌信號肽可為非天然分泌信號肽天然分泌信號肽。非天然分泌信號肽可促進特定環境(諸如腫瘤微環境)中之改良表現及功能，諸如維持分泌。非天然分泌信號肽之非限制性實例示於 表 3中。
分泌信號肽可為IgE信號肽。IgE信號肽可包括胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)。IgE信號肽可由包括序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)之多核苷酸序列編碼。IgE信號肽可由包括與ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列之多核苷酸序列編碼。
膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之分泌信號肽可為IgE信號肽。膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之IgE信號肽可包括胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)。膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之IgE信號肽可由包括序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)之多核苷酸序列編碼。膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之IgE信號肽可由包括與ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列之多核苷酸序列編碼。 表 3. 例示性信號分泌肽
名稱 蛋白序列 來源(Uniprot) DNA 序列
IL-12 MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA (SEQ ID NO: 112) P29460 ATGTGTCACCAGCAGCTCGTTATATCCTGGTTTAGTTTGGTGTTTCTCGCTTCACCCCTGGTGGCA (SEQ ID NO: 31)
IL-12 ( 經密碼子最佳化) MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA (SEQ ID NO: 112) - ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCC (SEQ ID NO: 32)
IL-2 ( 經最佳化) MQLLSCIALILALV (SEQ ID NO: 113) - ATGCAACTGCTGTCATGTATCGCACTCATCCTGGCGCTGGTA (SEQ ID NO: 33)
IL-2 ( 天然) MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 114) P60568 ATGTATCGGATGCAACTTTTGAGCTGCATCGCATTGTCTCTGGCGCTGGTGACAAATTCC (SEQ ID NO: 34)
胰蛋白酶原-2 MNLLLILTFVAAAVA (SEQ ID NO: 115) P07478 ATGAATCTCTTGCTCATACTTACGTTTGTCGCTGCTGCCGTTGCG (SEQ ID NO: 35)
高斯螢光素酶 MGVKVLFALICIAVAEA (SEQ ID NO: 116) - ATGGGCGTGAAGGTCTTGTTTGCCCTTATCTGCATAGCTGTTGCGGAGGCG (SEQ ID NO: 36)
CD5 MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG (SEQ ID NO: 117) P06127 ATGCCGATGGGGAGCCTTCAACCTTTGGCAACGCTTTATCTTCTGGGGATGTTGGTTGCTAGTTGCCTTGGG (SEQ ID NO: 37)
IgKVII ( 小鼠) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID NO: 118)    ATGGAAACTGACACGTTGTTGCTGTGGGTATTGCTCTTGTGGGTCCCAGGATCTACGGGCGAC (SEQ ID NO: 38)
IgKVII ( 人類) MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 119) P01597 ATGGATATGAGGGTTCCCGCCCAGCTTTTGGGGCTGCTTTTGTTGTGGCTTCGAGGGGCTCGGTGT (SEQ ID NO: 39)
VSV-G MKCLLYLAFLFIGVNC (SEQ ID NO: 120) - ATGAAGTGTCTGTTGTACCTGGCGTTTCTGTTCATTGGTGTAAACTGT (SEQ ID NO: 40)
泌乳素 MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP (SEQ ID NO: 121) P01236 ATGAATATCAAAGGAAGTCCGTGGAAGGGTAGTCTCCTGCTGCTCCTCGTATCTAACCTTCTCCTTTGTCAATCCGTGGCACCC (SEQ ID NO: 41)
血清白蛋白前蛋白原 MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO: 122) P02768 ATGAAATGGGTAACATTCATATCACTTCTCTTTCTGTTCAGCTCTGCGTATTCT (SEQ ID NO: 42)
天青殺素前蛋白原 MTRLTVLALLAGLLASSRA (SEQ ID NO: 123) 20160 ATGACAAGGCTTACTGTTTTGGCTCTCCTCGCTGGACTCTTGGCTTCCTCCCGAGCA (SEQ ID NO: 43)
骨結合素(BM40) MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 124) P09486 ATGAGGGCTTGGATTTTTTTTCTGCTCTGCCTTGCCGGTCGAGCCCTGGCG (SEQ ID NO: 44)
CD33 MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 125) P20138 ATGCCTCTTCTGCTTTTGCTTCCTCTTTTGTGGGCAGGTGCCCTCGCA (SEQ ID NO: 45)
IL-6 MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAP (SEQ ID NO: 126) P05231 ATGAACTCTTTCTCAACCTCTGCGTTTGGTCCGGTCGCTTTCTCCCTTGGGCTCCTGCTTGTCTTGCCAGCAGCGTTTCCTGCGCCA (SEQ ID NO: 46)
IL-8 MTSKLAVALLAAFLISAALC (SEQ ID NO: 127) P10145 ATGACAAGTAAACTGGCGGTAGCCTTGCTCGCGGCCTTTTTGATTTCCGCAGCCCTTTGT (SEQ ID NO: 47)
CCL2 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA (SEQ ID NO: 128) P13500 ATGAAGGTAAGTGCAGCGTTGCTTTGCCTTCTCCTCATTGCAGCGACCTTTATTCCTCAAGGGCTGGCC (SEQ ID NO: 48)
TIMP2 MGAAARTLRLALGLLLLATLLRPADA (SEQ ID NO: 129) P16035 ATGGGAGCGGCAGCTAGAACACTTCGACTTGCCCTTGGGCTCTTGCTCCTTGCAACCCTCCTTAGACCTGCCGACGCA (SEQ ID NO: 49)
VEGFB MSPLLRRLLLAALLQLAPAQA (SEQ ID NO: 130) P49765 ATGTCACCGTTGTTGCGGAGATTGCTGTTGGCCGCACTTTTGCAACTGGCTCCTGCTCAAGCC (SEQ ID NO: 50)
骨保護素 MNNLLCCALVFLDISIKWTTQ (SEQ ID NO: 131) O00300 ATGAATAACCTGCTCTGTTGTGCGCTCGTGTTCCTGGACATTTCTATAAAATGGACAACGCAA (SEQ ID NO: 51)
絲胺酸蛋白酶抑制劑E1 MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSA (SEQ ID NO: 132) P05121 ATGCAAATGTCTCCTGCCCTTACCTGTCTCGTACTTGGTCTTGCGCTCGTATTTGGAGAGGGATCAGCC (SEQ ID NO: 52)
GROα MARAALSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAAGRRAAG (SEQ ID NO: 133) P09341 ATGGCAAGGGCTGCACTCAGTGCTGCCCCGTCTAATCCCAGATTGCTTCGAGTTGCATTGCTTCTTCTGTTGCTGGTTGCAGCTGGTAGGAGAGCAGCGGGT (SEQ ID NO: 53)
CXCL12 MNAKVVVVLVLVLTALCLSDG (SEQ ID NO: 134) P48061 ATGAATGCAAAAGTCGTGGTCGTGCTGGTTTTGGTTCTGACGGCGTTGTGTCTTAGTGATGGG (SEQ ID NO: 54)
IL-21 ( 經密碼子最佳化) MERIVICLMVIFLGTLVHKSSS (SEQ ID NO: 135) Q9HBE4 ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGC (SEQ ID NO: 55)
CD8 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 136) - ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 139)
CD8 ( 經密碼子最佳化) MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 137) - ATGGCGCTCCCGGTGACAGCACTTCTCTTGCCTCTTGCCCTGCTGTTGCATGCCGCGCGCCCA (SEQ ID NO: 140) 或 ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCA (SEQ ID NO: 416)
GMCSF MLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 138) - ATGTTGCTCGTGACATCCCTCTTGCTTTGTGAGTTGCCTCATCCCGCATTCCTGCTCATCCCA (SEQ ID NO: 141)
NKG2D PFFFCCFIAVAMGIRFIIMVA (SEQ ID NO: 192)    CCCTTCTTCTTCTGTTGCTTTATCGCCGTGGCCATGGGCATCCGCTTCATCATTATGGTGGCC (SEQ ID NO: 193)
IgE MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)    ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)
GM-CSFRa MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID 423).    ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT (SEQ ID NO: 424)
蛋白酶切割位點
在某些實施例中，本文所提供之嵌合蛋白(例如，一般而言，對於本文所述之所有膜可切割嵌合蛋白而言)含有蛋白酶切割位點(例如，在用於本文所述之膜可切割嵌合蛋白之式 S - C - MT或 MT - C - S中，稱為「C」)。一般而言，蛋白酶切割位點可為能夠被蛋白酶切割之任何胺基酸序列模體。蛋白酶切割位點之實例包括但不限於1型跨膜蛋白酶切割位點、II型跨膜蛋白酶切割位點、GPI錨定蛋白酶切割位點、ADAM8蛋白酶切割位點、ADAM9蛋白酶切割位點、ADAM10蛋白酶切割位點、ADAM12蛋白酶切割位點、ADAM15蛋白酶切割位點、ADAM17蛋白酶切割位點、ADAM19蛋白酶切割位點、ADAM20蛋白酶切割位點、ADAM21蛋白酶切割位點、ADAM28蛋白酶切割位點、ADAM30蛋白酶切割位點、ADAM33蛋白酶切割位點、BACE1蛋白酶切割位點、BACE2蛋白酶切割位點、SIP蛋白酶切割位點、MT1-MMP蛋白酶切割位點、MT3-MMP蛋白酶切割位點、MT5-MMP蛋白酶切割位點、弗林蛋白酶切割位點、PCSK7蛋白酶切割位點、蛋白裂解酶蛋白酶切割位點、蛋白裂解酶-2蛋白酶切割位點、MMP9蛋白酶切割位點或NS3蛋白酶切割位點。
蛋白酶切割位點之一個實例係C型肝炎病毒(HCV)非結構蛋白3 (NS3)蛋白酶切割位點，包括但不限於NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B切割位點。對於各種HCV毒株之NS3蛋白酶及其切割位點之代表性序列之描述，參見例如Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology (S.L. Tan編輯，Taylor及Francis，2006)，第6章，第163-206頁；其以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，提供HCV NS4A/4B蛋白酶切割位點、HCV NS5A/5B蛋白酶切割位點、具有NS4A/4B蛋白酶切割位點之C末端降解決定子、具有HCV NS5A/5B蛋白酶切割位點之N末端降解決定子之序列。代表性NS3序列列於國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)資料庫中。參見例如NCBI條目：登錄號YP_001491553、YP_001469631、YP_001469632、NP_803144、NP_671491、YP_001469634、YP_001469630、YP_001469633、ADA68311、ADA68307、AFP99000、AFP98987、ADA68322、AFP99033、ADA68330、AFP99056、AFP99041、CBF60982、CBF60817、AHH29575、AIZ00747、AIZ00744、ABI36969、ABN05226、KF516075、KF516074、KF516056、AB826684、AB826683、JX171009、JX171008、JX171000、EU847455、EF154714、GU085487、JX171065、JX171063；所有該等序列(如以該申請案之提交日期輸入)皆以引用方式併入本文中。
蛋白酶切割位點之另一實例係ADAM17特異性蛋白酶(亦稱為腫瘤壞死因子-α轉化酶[TACE])切割位點。ADAM17特異性蛋白酶切割位點可為被ADAM17自然切割之受質之內源序列。ADAM17特異性蛋白酶切割位點可為能夠被ADAM17切割之經工程改造之序列。經工程改造之ADAM17特異性蛋白酶切割位點可針對特定期望性質經工程改造，該等性質包括但不限於嵌合蛋白之最佳表現、對ADAM17之特異性、藉由ADAM17之切割速率、經分泌嵌合蛋白水準與膜結合嵌合蛋白水準之比率，以及在不同細胞狀態下之切割。可針對藉由ADAM17之特異性切割來選擇蛋白酶切割位點。舉例而言，某些能夠被ADAM17切割之蛋白酶切割位點亦能夠被額外ADAM家族蛋白酶(諸如ADAM10)切割。因此，ADAM17特異性蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得減少或消除藉由諸如ADAM10等其他蛋白酶之切割。可針對藉由ADAM17之切割速率來選擇蛋白酶切割位點。舉例而言，可能期望選擇表現出藉由ADAM17之特定切割速率(諸如相對於被ADAM17自然切割之受質之內源序列降低之切割動力學)之蛋白酶切割位點。在該等情況下，一般而言，可選擇特定切割速率以調控嵌合蛋白之加工速率，此進而調控酬載效應分子之釋放/分泌速率。因此，ADAM17特異性蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得該序列表現出藉由ADAM17之期望切割速率。可針對藉由ADAM17之特異性切割及藉由ADAM17之切割速率二者來選擇蛋白酶切割位點。例示性ADAM17特異性蛋白酶切割位點(包括彼等表現出特定特異性及切割速率動力學者)參考切割位點示於下 表 4A中(P5-P1：N末端；P1'-P5'：C末端)。ADAM17及ADAM10之其他細節(包括表現及蛋白酶切割位點)闡述於以下文獻中：Sharma等人(J Immunol 2017年10月15日，199 (8) 2865-2872)；Pham等人(Anticancer Res. 2017年10月；37(10):5507-5513)；Caescu等人(Biochem J. 2009年10月23日；424 (1):79-88)及Tucher等人(J. Proteome Res. 2014, 13, 4, 2205-2214)，每篇皆出於目的以引用方式併入本文中。 表 4A - 各種 ADAM17 蛋白酶切割位點序列
P5 P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3' P4' P5' FULL SEQ SEQ ID NO
P R A E A V K G G       PRAEAVKGG 179
P R A E A L K G G       PRAEALKGG 180
P R A E Y S K G G       PRAEYSKGG 181
P R A E P I K G G       PRAEPIKGG 182
P R A E A Y K G G       PRAEAYKGG 183
P R A E S S K G G       PRAESSKGG 184
P R A E F T K G G       PRAEFTKGG 185
D E P H Y S Q R R       DEPHYSQRR 187
P P L G P I F N P G    PPLGPIFNPG 188
P L A Q A Y R S S       PLAQAYRSS 189
T P I D S S F N P D    TPIDSSFNPD 190
V T P E P I F S L I    VTPEPIFSLI 191
在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含具有PRAE (SEQ ID NO: 176)之胺基酸序列之第一區。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含具有KGG (SEQ ID NO: 177)之胺基酸序列之第二區。在一些實施例中，第一區定位於第二區之N末端。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEX 1X 2KGG (SEQ ID NO: 178)之胺基酸序列，其中X 1係A、Y、P、S或F，且其中X 2係V、L、S、I、Y、T或A。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEX 1X 2KGG (SEQ ID NO: 178)之胺基酸序列，其中X 1係A、Y、P、S或F，且其中X 2係V、L、S、I、Y或T。 在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEAVKGG (SEQ ID NO: 179)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEALKGG (SEQ ID NO: 180)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEYSKGG (SEQ ID NO: 181)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEPIKGG (SEQ ID NO: 182)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEAYKGG (SEQ ID NO: 183)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAESSKGG (SEQ ID NO: 184)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEFTKGG (SEQ ID NO: 185)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PRAEAAKGG (SEQ ID NO: 186)之胺基酸序列。
在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含DEPHYSQRR (SEQ ID NO: 187)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PPLGPIFNPG (SEQ ID NO: 188)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含PLAQAYRSS (SEQ ID NO: 189)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含TPIDSSFNPD (SEQ ID NO: 190)之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含VTPEPIFSLI (SEQ ID NO: 191)之胺基酸序列。SEQ ID NO: 187、189及191之蛋白酶切割位點可由ADAM17切割。
在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括N末端肽連接體，諸如SGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 230)。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括C末端肽連接體，諸如GGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 231)。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括N末端肽連接體及C末端肽連接體，諸如表(SEQ ID NO: 230)及GGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 231)二者。
在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)特異性切割位點(亦稱為ADAM17)、N末端肽連接體及C末端肽連接體。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括TACE特異性切割位點VTPEPIFSLI (SEQ ID NO: 191)、N末端肽連接體及C末端肽連接體。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括TACE特異性切割位點、N末端肽連接體及C末端肽連接體且具有胺基酸序列SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 250)。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括TACE特異性切割位點、N末端肽連接體及C末端肽連接體，其由包含序列TCAGGCGGCGGTGGTAGT GGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，蛋白酶切割位點可包括TACE特異性切割位點、N末端肽連接體及C末端肽連接體，其由與TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，蛋白酶切割位點包含ITQGLAVSTISSFF (SEQ ID NO: 198)之胺基酸序列，其係CD16天然之切割位點且可由ADAM17切割。
蛋白酶切割位點可為可分泌效應分子之C末端。蛋白酶切割位點可為可分泌效應分子之N末端。一般而言，對於本文所述之所有膜可切割嵌合蛋白而言，蛋白酶切割位點係：(1)可分泌效應分子之C末端及細胞膜系鏈結構域之N末端(換言之，蛋白酶切割位點在可分泌效應分子與細胞膜系鏈結構域之間)；或(2)可分泌效應分子之N末端及細胞膜系鏈結構域之C末端(亦在可分泌效應分子與顛倒結構域定向之細胞膜系鏈結構域之間)。蛋白酶切割位點可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為效應分子或蛋白酶切割位點之一部分之多肽序列)連接至可分泌效應分子。蛋白酶切割位點可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為細胞膜系鏈結構域或蛋白酶切割位點之一部分之多肽序列)連接至細胞膜系鏈結構域。多肽連接體可為連接第一多肽序列及第二多肽序列之任何胺基酸序列。多肽連接體可為撓性連接體(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽連接體之實例包括但不限於GSG連接體(例如，[GS] 4GG [SEQ ID NO: 182])、A(EAAAK) 3A (SEQ ID NO: 183)及Whitlow連接體(例如，「KEGS」連接體，諸如胺基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 184)，eGK連接體，諸如胺基酸序列EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 185)，及更詳細地闡述於已頒佈之美國專利第5,990,275號中之連接體，該美國專利以引用方式併入本文中)。額外例示性多肽連接體包括SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196及SEQ ID NO: 197。其他多肽連接體可基於期望之性質(例如，長度、撓性、胺基酸組成等)來選擇且係熟習此項技術者已知的。
在膜可切割系統中，在嵌合蛋白表現並定位至細胞膜中後，蛋白酶切割位點引導嵌合蛋白之切割，使得效應分子釋放(「分泌」)至細胞之細胞外空間中。
一般而言，切割蛋白酶切割位點之蛋白酶係對該特異性蛋白酶切割位點特異之蛋白酶。舉例而言，在去整聯蛋白及金屬蛋白酶(「ADAM」)家族蛋白酶之情況下，切割特定ADAM蛋白酶切割位點之蛋白酶一般限於一或多種特異性識別特定ADAM蛋白酶切割位點模體之ADAM蛋白酶。蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得減少或消除藉由不期望蛋白酶之切割。蛋白酶可為膜結合或膜締合的。蛋白酶可分泌，例如，在特定細胞環境(諸如腫瘤微環境(「TME」))中分泌。
切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶可在表現嵌合蛋白之同一細胞中表現。切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶對於表現嵌合蛋白之細胞而言可為內源性的。換言之，經工程改造以表現嵌合蛋白之細胞可內源性地表現對存在於嵌合蛋白中之蛋白酶切割位點特異之蛋白酶。蛋白酶之內源性表現係指在一般穩態條件下之表現(例如，一般視為健康之細胞)，且亦係指在非穩態條件下之差異表現(例如，腫瘤細胞中之上調表現)。蛋白酶切割位點可基於由期望細胞群體內源表現之已知蛋白酶來選擇。在該等情況下，一般而言，蛋白酶切割位點之切割(及因此酬載之釋放/分泌)可僅限於彼等所關注細胞，此乃因細胞限制性蛋白酶需要與同一細胞中表現之嵌合蛋白之蛋白酶切割位點接觸。舉例而言，但不希望受理論束縛，鹹信ADAM17之內源性表現受限於NK細胞及T細胞。因此，ADAM17特異性蛋白酶切割位點之選擇可將蛋白酶切割位點之切割限制於共表現嵌合蛋白之NK細胞及T細胞。在其他實例中，可針對已知在所關注具體腫瘤群體中(例如，在經工程改造以表現嵌合蛋白之特定腫瘤細胞中)表現之特定腫瘤相關蛋白酶來選擇蛋白酶切割位點。蛋白酶及/或表現資料庫可用於選擇適當蛋白酶切割位點，諸如藉助諮詢Oncomine (www.oncomine.org)、歐洲生物資訊研究院(European Bioinformatic Institute) (www.ebi.ac.uk) (具體而言(www.ebi.ac.uk/gxa))、PMAP (www.proteolysis.org)、ExPASy Peptide Cutter (ca.expasy.org/tools/peptide cutter)及PMAP.Cut DB (cutdb.burnham.org) (其每一者皆出於所有目的以引用方式併入)來選擇由腫瘤相關蛋白酶切割之蛋白酶切割位點。
切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶對於表現嵌合蛋白之細胞而言可為異源性的。舉例而言，經工程改造以表現嵌合蛋白之細胞亦可經工程改造以表現該細胞一般不表現的對存在於嵌合蛋白中之蛋白酶切割位點特異之蛋白酶。經工程改造以表現嵌合蛋白及蛋白酶二者之細胞可經工程改造以自單獨的經工程改造之核酸或多順反子系統(多順反子及多啟動子系統更詳細地闡述於本文標題為「多順反子及多啟動子系統」之部分中」)表現每一者。異源蛋白酶及其對應蛋白酶切割位點可如上文所述參考內源蛋白酶來選擇。
切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶可在與表現嵌合蛋白之細胞不同之單獨細胞上表現。舉例而言，蛋白酶一般可在特定細胞環境(諸如腫瘤微環境)中表現。在該等情況下，一般而言，蛋白酶切割位點之切割可僅限於彼等所關注細胞環境(例如，腫瘤微環境)，此乃因環境限制性蛋白酶需要與蛋白酶切割位點接觸。在具有膜可切割嵌合蛋白之實施例中，一般而言，效應分子之分泌可僅限於彼等所關注細胞環境(例如，腫瘤微環境)，此乃因環境限制性蛋白酶需要與蛋白酶切割位點接觸。切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶對於單獨之不同細胞而言可為內源性的。切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之蛋白酶對於單獨之不同細胞而言可為異源性的。舉例而言，單獨之不同細胞可經工程改造以表現一般不被單獨之不同細胞表現之蛋白酶。
蛋白酶包括但不限於1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI錨定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶及MMP9蛋白酶。蛋白酶可為NS3蛋白酶。蛋白酶可為ADAM17蛋白酶。
蛋白酶可為腫瘤相關蛋白酶，諸如細胞自溶酶、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺醯基蛋白酶、絲胺酸蛋白酶或金屬蛋白酶。腫瘤相關蛋白酶之特定實例包括細胞自溶酶B、細胞自溶酶L、細胞自溶酶S、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶A、細胞自溶酶G、凝血酶、纖維蛋白溶酶、尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、金屬蛋白酶1 (MMP1)、MMP2、MMP3、MMP4、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP20、MMP21、MMP23、MMP24、MMP25、MMP26、MMP28、ADAM、ADAMTS、CD10 (CALLA)或前列腺特異性抗原。蛋白酶亦可包括但不限於下 表 4B中列出之蛋白酶。用於某些蛋白酶之例示性同源蛋白酶切割位點亦列於 表 4B中。 表 4B ：例示性蛋白酶與同源切割位點及抑制劑
蛋白酶 (UniProt 登錄號) 同源切割位點 蛋白酶抑制劑
HCV NS4A/4B DEMEECSQHL (SEQ ID NO: 142) EDVVPCSMG (SEQ ID NO: 143) 西美瑞韋(simeprevir)、達諾瑞韋(danoprevir)、阿舒瑞韋(asunaprevir)、西魯瑞韋(ciluprevir)、波普瑞韋(boceprevir)、索伐瑞韋(sovaprevir)、帕利瑞韋(paritaprevir)、替拉瑞韋(telaprevir)、格拉瑞韋(grazoprevir)
HCV NS5A/5B DEMEECSQHL (SEQ ID NO: 142) EDVVPCSMG (SEQ ID NO: 143) 西美瑞韋、達諾瑞韋、阿舒瑞韋、西魯瑞韋、波普瑞韋、索伐瑞韋、帕利瑞韋、替拉瑞韋、格拉瑞韋
HCV NS3 DEMEECSQHL (SEQ ID NO: 142) EDVVPCSMG (SEQ ID NO: 143) 西美瑞韋、達諾瑞韋、阿舒瑞韋、西魯瑞韋、波普瑞韋、索伐瑞韋、帕利瑞韋、替拉瑞韋、格拉瑞韋
HCV NS2-3 DEMEECSQHL (SEQ ID NO: 142) EDVVPCSMG (SEQ ID NO: 143) 西美瑞韋、達諾瑞韋、阿舒瑞韋、西魯瑞韋、波普瑞韋、索伐瑞韋、帕利瑞韋、替拉瑞韋、格拉瑞韋
HIV-1蛋白酶 (SEQ ID NO: 144)    安普那韋(Amprenavir)、阿紮那韋(Atazanavir)、達蘆那韋(Darunavir)、福沙那韋(Fosamprenavir)、茚地那韋(Indinavir)、洛匹那韋(Lopinavir)、奈非那韋(Nelfinavir)、利托那韋(Ritonavir)、沙奎那韋(Saquinavir)、替拉那韋(Tipranavir)
信號肽酶(P67812、P15367、P00804、P0803) 真核信號肽酶在pre(Δpro)apoA-II之殘基20 (Xaa 20↓)後切割較佳：Ala、Cys ＞ Gly ＞ Ser、Thr ＞ Pro ＞ Asn、Val、Ile、Leu、Tyr、His、Arg、Asp。   
在疏水性殘基(例如，Leu、Phe、Val或Met)處切割之蛋白原轉化酶(Q16549、Q8NBP7、Q92824、P29120、Q6UW60、P29122、Q9QXV0) (R/K)-X-(疏水性)-X↓，其中X係任何胺基酸   
在諸如Ala或Thr等小胺基酸殘基處切割之蛋白原轉化酶(Q16549、Q8NBP7、Q92824、P29120、Q6UW60、P29122) (K/R)-(X)n-(K/R)↓，其中n係0、2、4或6且X係任何胺基酸   
阿黑皮素原(proopiomelanocortin)轉化酶(PCE) (Q9UO77615、O776133) 在某些激素原中之配對鹼性殘基處或在其之間或在羧基側切割   
嗜鉻顆粒天冬胺酸蛋白酶(CGAP) 傾向於切割具有疏水性殘基以及β-亞甲基之二肽鍵   
激素原硫醇蛋白酶(細胞自溶酶L1) (P07154、P07711、P06797、P25975、Q28944)      
羧肽酶(例如，羧肽酶E/H、羧肽酶D及羧肽酶Z) (Q9M099、P15169、Q04609、P08819、P08818、O77564、P70627、O35409、P07519、Q8VZU3、P22792、P15087、P16870、Q9JHH6、Q96IY4、Q7L8A9) 在蛋白或肽之羧基末端(C末端)處切割肽鍵   
胺肽酶(例如，精胺酸胺肽酶、離胺酸胺肽酶、胺肽酶B) 在蛋白或肽之胺基末端(N末端)處切割肽鍵   
脯胺醯基內肽酶(Q12884、P48147、P97321、Q4J6C6) 寡肽中之Pro-|-Xaa ＞＞ Ala-|-Xaa之水解。 當Yaa係Pro時，優先自多肽釋放N末端二肽(Xaa-Yaa-|-Zaa-)，條件係Zaa既非Pro，亦非羥脯胺酸   
胺肽酶N (P97449、P15144、P15145、P15684) 自肽、醯胺或芳基醯胺釋放N末端胺基酸(Xaa-|-Yaa-)。Xaa較佳係Ala，但可為大多數胺基酸，包括Pro (緩慢作用)。當末端疏水性殘基後跟脯胺醯基殘基時，二者可作為完整的Xaa-Pro二肽釋放   
胰島素降解酶(P14735、P35559、Q9JHR7、P22817、Q24K02) 降解胰島素、升糖素及其他多肽。對蛋白無作用。 切割多個序列變化相當大之短多肽   
鈣蛋白酶(O08529、P17655、Q07009、Q27971、P20807、P07384、O35350、O14815、P04632、Q9Y6Q1、O15484、Q9HC96、A6NHC0、Q9UMQ6) 無特定胺基酸序列由鈣蛋白酶唯一地識別。在蛋白受質中，三級結構元件而非一級胺基酸序列似乎負責將切割引導至特定受質。在肽及小分子受質中，最一致報導之特異性係針對P2位之小的疏水性胺基酸(例如，白胺酸、纈胺酸及異白胺酸)及P1位之大的疏水性胺基酸(例如，苯丙胺酸及酪胺酸)。一種螢光鈣蛋白酶受質係(EDANS)-Glu-Pro-Leu-Phe=Ala-Glu-Arg-Lys-(DABCYL), (EDANSEPLFAERKDABCYL (SEQ ID NO: 145))，在Phe=Ala鍵處發生切割。   
半胱天冬酶1 (P29466、P29452) P1位嚴格要求為Asp殘基且具有Tyr-Val-Ala-Asp-|- (YVAD; SEQ ID NO: 146)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶2 (P42575、P29594) P1位嚴格要求為Asp殘基，316-asp對於蛋白分解活性至關重要，且具有Val-Asp-Val-Ala-Asp-|- (VDVAD; SEQ ID NO: 147)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶3 (P42574、P70677) P1位及P4位嚴格要求為Asp殘基。其具有Asp-Xaa-Xaa-Asp-|-之較佳切割序列，在P2處具有疏水性胺基酸殘基且在P3處具有親水性胺基酸殘基，儘管在該位亦接受Val或Ala。   
半胱天冬酶4 (P70343、P49662) P1位嚴格要求為Asp。其具有Tyr-Val-Ala-Asp-|- (YVAD; SEQ ID NO: 146)之較佳切割序列，但亦在Asp-Glu-Val-Asp-|-(DEVD; SEQ ID NO: 148)處切割。   
半胱天冬酶5 (P51878) P1位嚴格要求為Asp。其具有Tyr-Val-Ala-Asp-|-(YVAD；SEQ ID NO: 146)之較佳切割序列，但亦在Asp-Glu-Val-Asp-|--|-(DEVD；SEQ ID NO: 148)處切割。   
半胱天冬酶6 (P55212) P1位嚴格要求為Asp且具有Val-Glu-His-Asp-|-(VEHD; SEQ ID NO: 149)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶7 (P97864、P55210) P1位嚴格要求為Asp殘基且具有Asp-Glu-Val-Asp-|- (DEVD; SEQ ID NO: 148)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶8 (Q8IRY7、O89110、Q14790) P1位嚴格要求為Asp且具有(Leu/Asp/Val)-Glu-Thr-Asp-|-(Gly/Ser/Ala)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶9 (P55211、Q8C3Q9、Q5IS54) P1位嚴格要求為Asp殘基且P2位明顯較佳為His。其具有Leu-Gly-His-Asp-|-Xaa (LGHD; SEQ ID NO: 150)之較佳切割序列。   
半胱天冬酶10 (Q92851) P1位嚴格要求為Asp且具有Leu-Gln-Thr-Asp-|-Gly (LQTDG; SEQ ID NO: 151)之較佳切割序列。   
嘌呤黴素敏感性胺肽酶(P55786、Q11011) 自寬範圍之肽、醯胺及芳基醯胺釋放N末端胺基酸，優先係丙胺酸。   
血管收縮素轉化酶(ACE) (P12821、P09470、Q9BYF1) SEQ ID NO: 156 當Xaa不為Pro，且Yaa既非Asp亦非Glu時，釋放C末端二肽(寡肽-|-Xaa-Yaa)。 貝那普利(Benazepril) (洛汀新(Lotensin))、卡托普利(Captopril)、伊那拉普利(Enalapril) (凡索特(Vasotec))、福辛普利(Fosinopril)、賴諾普利(Lisinopril) (心甯衛(Prinivil)、捷賜瑞(Zestril))、莫西普利(Moexipril)、培哚普利(Perindopril) (阿司昂(Aceon))、喹那普利(Quinapril) (恩久平(Accupril))、雷米普利(Ramipril) (阿爾塔斯(Altace))、群多普利(Trandolapril) (馬維克(Mavik))、佐芬普利(Zofenopril)
焦麩胺醯基肽酶II (Q9NXJ5) 自pGlu--His-Xaa三肽及pGlu--His-Xaa-Gly四肽釋放N末端焦麩胺醯基   
二肽基肽酶IV (P27487、P14740、P28843) 當Yaa係Pro時，優先自多肽釋放N末端二肽(Xaa-Yaa-|-Zaa-)，條件係Zaa既非Pro，亦非羥脯胺酸   
N-精胺酸二元轉化酶(O43847、Q8BHG1) 較佳在-Xaa-|-Arg-Lys-處且較不常見地在-Arg-|-Arg-Xaa-處水解多肽，其中Xaa不為Arg或Lys   
內肽酶24.15 (thimet寡肽酶) (P52888、P24155) 在5至15個殘基之受質中優先切割在P1、P2及P3'處具有疏水性殘基以及P1'處具有小殘基之鍵   
內肽酶24.16 (溶神經素) (Q9BYT8、Q91YP2) 神經調壓素之優先切割：10-Pro-|-Tyr-11   
類澱粉前驅物蛋白分泌酶α (P05067、P12023、Q9Y5Z0、P56817) 具有廣泛特異性之內肽酶。   
類澱粉前驅物蛋白分泌酶β (P05067、P12023、Q9Y5Z0、P56817) 廣泛內肽酶特異性。在阿茲海默氏澱粉樣前驅物蛋白之瑞典變異體中切割Glu-Val-Asn-Leu-|-Asp-Ala-Glu-Phe (EVNLDAEF; SEQ ID NO: 152)   
類澱粉前驅物蛋白分泌酶γ (P05067、P12023、Q9Y5Z0、P56817) 整合膜蛋白之膜內切割   
MMP 1 (P03956、Q9EPL5uy) 在α-1(I)鏈中之775-Gly-|-Ile-776處，自N末端開始，在分子長度之約四分之三處切割膠原之三螺旋。在P1'係疏水性殘基之鍵處切割合成受質及α-巨球蛋白。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 2 (P08253、P33434) 切割I型明膠及IV、V、VII、X型膠原。切割膠原樣序列Pro-Gln-Gly-|-Ile-Ala-Gly-Gln (PQGIAGQ; SEQ ID NO: 153)。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 3 (P08254、P28862) 優先切割P1'、P2'及P3'係疏水性殘基處。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 7 (P09237、Q10738) 胰島素B鏈中14-Ala-|-Leu-15及16-Tyr-|-Leu-17之切割。對I、II、IV、V型膠原無作用。切割明膠鏈α-2(I) ＞ α-1(I)。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 8 (P22894、O70138) 可降解纖維性I、II及III型膠原。 三螺旋結構域中間質膠原之切割。與EC 3.4.24.7不同，該酶比I型更慢地切割III型膠原。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 9 (P14780、P41245) 切割I型及V型明膠以及IV型及V型膠原。 於Gly-|-Leu鍵處切割KiSS1。 將IV型及V型膠原切割成大的C末端四分之三片段及較短的N末端四分之一片段。降解纖網蛋白，但不降解層黏連蛋白或Pz肽。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 10 (P09238、O55123) 可降解纖網蛋白、I型、III型、IV型及V型明膠；較弱地降解膠原III、IV及V。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 11 (P24347、Q02853) A(A/Q)(N/A)↓(L/Y)(T/V/M/R)(R/K)    G(G/A)E↓LR    ↓表示切割位點 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 12 (P39900、P34960) 可溶性及不溶性彈性蛋白之水解。在胰島素B鏈中之14-Ala-|-Leu-15及16-Tyr-|-Leu-17處亦產生特異性切割 具有顯著的彈性蛋白分解活性。在P1'位點處可接受大胺基酸及小胺基酸，但白胺酸較佳。P1位點處芳族或疏水性殘基較佳，其中小的疏水性殘基(較佳丙胺酸)佔據P3 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 13 (P45452、P33435) 切割三螺旋膠原，包括I型、II型及III型膠原，但對可溶性II型膠原之活性最高。亦可降解IV型、XIV型及X型膠原 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
MMP 14 (P50281、P53690) 藉由在37-Asn-|-Leu-38處切割原肽來活化明膠酶原A。其他水解之鍵包括膠原酶3之前肽中之35-Gly-|-Ile-36，以及聚集蛋白聚糖小球間結構域中之341-Asn-|-Phe-342、441-Asp-|-Leu-442及354-Gln-|-Thr-355。 SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
尿激酶纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA) (P00749、P06869) 特異性切割纖維蛋白溶酶原中之Arg-|-Val鍵以形成纖維蛋白溶酶。 纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑(PAI)
組織纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA) (P00750、P11214) 特異性切割纖維蛋白溶酶原中之Arg-|-Val鍵以形成纖維蛋白溶酶。 纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑(PAI)
組織纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA) (P00750、P11214) 特異性切割纖維蛋白溶酶原中之Arg-|-Val鍵以形成纖維蛋白溶酶。 纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑(PAI)
纖維蛋白溶酶(P00747、P20918) 優先切割：Lys-|-Xaa ＞ Arg-|-Xaa，選擇性高於胰蛋白酶。將纖維蛋白轉化為可溶性產物。 α-2-抗纖維蛋白溶酶(AP)
凝血酶(P00734、P19221) 在Arg及Lys之後切割鍵 將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白並活化因子V、VII、VIII、XIII，且與血栓調節蛋白(蛋白C)複合。   
BMP-1 (原膠原C-肽酶) (P13497、P98063) 在I型及II型原膠原中之Ala-|-Asp以及III型中之Arg-|-Asp處切割C末端原肽。   
ADAM (Q9P0K1、Q9UKQ2、Q9JLN6、O14672、Q13444、P78536、Q13443、O43184、P78325、Q9UKF5、Q9BZ11、Q9H2U9、Q99965、O75077、Q9H013、O43506)    SB-3CT p-OH SB-3CT O-磷酸SB-3CT酯 RXP470.1
顆粒酶A (P12544、P11032) 優先切割：在小分子受質中，-Arg-|-Xaa-、-Lys-|-Xaa- ＞＞ -Phe-|-Xaa-。   
顆粒酶B (P10144、P04187) P1位處龐大芳族殘基較佳，且P3'及P4'位點處酸性殘基較佳。   
顆粒酶M (P51124、Q03238) 在甲硫胺酸、白胺酸及正白胺酸之後切割肽受質。   
菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶(P04517、P0CK09) E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-(G/S)，其中切割發生在Q與G/S之間。最常見的序列係ENLYFQS (SEQ ID NO: 154)   
胰凝乳蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶(P08217、Q9UNI1、Q91X79、P08861、P09093、P08218)    -褐色高溫雙岐菌( Thermobifida fusca) Thermopin -好氧熱棒菌( Pyrobaculum aerophilum) Aeropin -柯達卡拉熱球菌( Thermococcus kodakaraensis) Tk-絲胺酸蛋白酶抑制劑 -交替單胞菌屬種( Alteromonas sp.)海藻抑素(Marinostatin) -米修鏈黴菌( Streptomyces misionensis) SMTI -鏈黴菌屬種胰凝乳蛋白酶抑制劑(chymostatin)
α病毒蛋白酶(P08411、P03317、P13886、Q8JUX6、Q86924、Q4QXJ8、Q8QL53、P27282、Q5XXP4)      
胰凝乳蛋白酶樣半胱胺酸蛋白酶(Q86TL0、Q14790、Q99538、O15553)    -褐色高溫雙岐菌Thermopin -好氧熱棒菌Aeropin -柯達卡拉熱球菌Tk-絲胺酸蛋白酶抑制劑 -交替單胞菌屬種海藻抑素 -米修鏈黴菌SMTI -鏈黴菌屬種胰凝乳蛋白酶抑制劑
木瓜酶樣半胱胺酸蛋白酶(P25774、P53634、Q96K76)      
微小RNA病毒前導蛋白酶(P03305、P03311、P13899)      
HIV蛋白酶(P04585、P03367、P04584、P03369、P12497、P03366、P04587)      
疱疹病毒蛋白酶(P10220、Q2HRB6、O40922、Q69527)      
腺病毒蛋白酶(P03252、P24937、Q83906、P68985、P09569、P11825、P10381)      
灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)蛋白酶A (SGPA) (P00776)      
灰色鏈黴菌蛋白酶B (SGPB) (P00777)      
α-裂解蛋白酶(P85142、P00778)      
絲胺酸蛋白酶(P48740、P98064、Q9UL52、P05981、O60235)      
半胱胺酸蛋白酶(Q86TL0、Q14790、Q8WYN0、Q96DT6、P55211)      
天冬胺酸蛋白酶(Q9Y5Z0、P56817、Q00663、Q53RT3、P0CY27)      
蘇胺酸蛋白酶(Q9UI38、Q16512、Q9H6P5、Q8IWU2)      
肥大細胞(MC)凝乳酶(CMA1) (NM_001836) Abz-HPFHL(SEQ ID NO: 155)-Lys(Dnp)-NH2 BAY 1142524 SUN13834
大鼠肥大細胞蛋白酶-1、-2、-3、-4、-5 (NM_017145、NM_172044、NM_001170466、NM_019321、NM_013092) Abz-HPFHL(SEQ ID NO: 155)-Lys(Dnp)-NH2 TY-51469
大鼠血管凝乳酶(RVCH) (O70500) Abz-HPFHL(SEQ ID NO: 155)-Lys(Dnp)-NH2   
DENV NS3pro (NS2B/NS3) SEQ ID NO:157、158、159、160 觀察到P1位極佳(strong preference)為鹼性胺基酸殘基(Arg/Lys)，而P2-4位點之優先性按以下順序：P2為Arg ＞ Thr ＞ Gln/Asn/Lys，P3為Lys ＞ Arg ＞ Asn，且P4為Nle ＞ Leu ＞ Lys ＞ Xaa。主要位點受質特異性係針對P1及P3中之小極性胺基酸。 蒽醌 BP13944 ZINC04321905 MB21 聚甲酚磺醛 SK-12 NSC135618 膽綠素
蛋白酶可為以下人類蛋白酶中之任一種(於括號中提供MEROPS肽酶資料庫編號；Rawlings N. D., Morton F. R., Kok, C. Y., Kong, J.及Barrett A. J. (2008) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 36 Database issue, D320-325；其出於所有目的以引用方式併入本文中)：胃蛋白酶A (MER000885)、胃亞蛋白酶(MER000894)、memapsin-2 (MER005870)、腎素(MER000917)、細胞自溶酶D (MER000911)、細胞自溶酶E (MER000944)、memapsin-1 (MER005534)、胃酶樣天冬胺酸蛋白酶(napsin) A (MER004981)、Mername-AA034肽酶(MER014038)、胃蛋白酶A4 (MER037290)、胃蛋白酶A5 (智人) (MER037291)、hCG1733572 (智人)型推定肽酶(MER107386)、胃酶樣天冬胺酸蛋白酶B偽基因(MER004982)、CYMP g.p. (智人) (MER002929)、亞家族A1A未指定肽酶(MER181559)、小鼠乳房腫瘤病毒逆轉錄胃蛋白酶(retropepsin) (MER048030)、兔內源性逆轉錄病毒內肽酶(MER043650)、S71相關人類內源性逆轉錄胃蛋白酶(MER001812)、RTVL-H型推定肽酶(MER047117)、RTVL-H型推定肽酶(MER047133)、RTVL-H型推定肽酶(MER047160)、RTVL-H型推定肽酶(MER047206)、RTVL-H型推定肽酶(MER047253)、RTVL-H型推定肽酶(MER047260)、RTVL-H型推定肽酶(MER047291)、RTVL-H型推定肽酶(MER047418)、RTVL-H型推定肽酶(MER047440)、RTVL-H型推定肽酶(MER047479)、RTVL-H型推定肽酶(MER047559)、RTVL-H型推定肽酶(MER047583)、RTVL-H型推定肽酶(MER015446)、人類內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶同源物1 (MER015479)、人類內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶同源物2 (MER015481)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因1 (智人染色體14) (MER029977)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因2 (智人染色體8) (MER029665)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因3 (智人染色體17) (MER002660)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因3 (智人染色體17) (MER030286)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因3 (智人染色體17) (MER047144)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因5 (智人染色體12) (MER029664)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因6 (智人染色體7) (MER002094)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因7 (智人染色體6) (MER029776)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因8 (智人染色體Y) (MER030291)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因9 (智人染色體19) (MER029680)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因10 (智人染色體12) (MER002848)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因11 (智人染色體17) (MER004378)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因12 (智人染色體11) (MER003344)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因13 (智人染色體2及類似) (MER029779)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因14 (智人染色體2) (MER029778)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因15 (智人染色體4) (MER047158)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因15 (智人染色體4) (MER047332)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因15 (智人染色體4) (MER003182)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER047165)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER047178)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER047200)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER047315)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER047405)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因16 (MER030292)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因17 (智人染色體8) (MER005305)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因18 (智人染色體4) (MER030288)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因19 (智人染色體16) (MER001740)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因21 (智人) (MER047222)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因21 (智人) (MER047454)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因21 (智人) (MER047477)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因21 (智人) (MER004403)、內源性逆轉錄病毒逆轉錄胃蛋白酶偽基因22 (智人染色體X) (MER030287)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047046)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047052)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047076)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047080)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047088)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047089)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047091)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047092)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047093)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047094)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047097)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047099)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047101)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047102)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047107)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047108)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047109)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047110)、亞家族A2A非肽酶同源物MER047111)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047114)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047118)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047121)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047122)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047126)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047129)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047130)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047134)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047135)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047137)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047140)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047141)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047142)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047148)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047149)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047151)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047154)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047155)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047156)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047157)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047159)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047161)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047163)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047166)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047171)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047173)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047174)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047179)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047183)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047186)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047190)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047191)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047196)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047198)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047199)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047201)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047202)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047203)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047204)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047205)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047207)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047208)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047210)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047211)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047212)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047213)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047215)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047216)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047218)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047219)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047221)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047224)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047225)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047226)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047227)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047230)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047232)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047233)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047234)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047236)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047238)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047239)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047240)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047242)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047243)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047249)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047251)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047252)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047254)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047255)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047263)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047265)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047266)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047267)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047268)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047269)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047272)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047273)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047274)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047275)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047276)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047279)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047280)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047281)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047282)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047284)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047285)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047289)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047290)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047294)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047295)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047298)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047300)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047302)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047304)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047305)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047306)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047307)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047310)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047311)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047314)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047318)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047320)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047321)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047322)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047326)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047327)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047330)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047333)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047362)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047366)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047369)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047370)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047371)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047375)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047376)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047381)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047383)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047384)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047385)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047388)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047389)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047391)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047394)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047396)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047400)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047401)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047403)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047406)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047407)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047410)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047411)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047413)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047414)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047416)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047417)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047420)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047423)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047424)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047428)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047429)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047431)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047434)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047439)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047442)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047445)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047449)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047450)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047452)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047455)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047457)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047458)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047459)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047463)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047468)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047469)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047470)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047476)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047478)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047483)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047488)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047489)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047490)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047493)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047494)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047495)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047496)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047497)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047499)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047502)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047504)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047511)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047513)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047514)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047515)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047516)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047520)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047533)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047537)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047569)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047570)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047584)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047603)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047604)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047606)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047609)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047616)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER047619)、亞家族A2A非肽酶同源物(MER04764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(MER043126)、芳基乙醯胺去乙醯基酶(MER033237)、KIAA1363樣蛋白(MER033242)、激素敏感性脂肪酶(MER033274)、神經連接蛋白1 (MER033280)、神經連接蛋白2 (MER033283)、家族S9非肽酶同源物(MER212939)、家族S9非肽酶同源物(MER211490)、亞家族S9C未指定肽酶(MER192341)、家族S9未指定肽酶(MER209181)、家族S9未指定肽酶(MER200434)、家族S9未指定肽酶(MER209507)、家族S9未指定肽酶(MER209142)、絲胺酸羧肽酶A (MER000430)、卵黃羧肽酶樣蛋白(MER005492)、RISC肽酶(MER010960)、家族S15未指定肽酶(MER199442)、家族S15未指定肽酶(MER200437)、家族S15未指定肽酶(MER212825)、溶酶體Pro-Xaa羧肽酶(MER000446)、二肽基-肽酶II (MER004952)、胸腺物異性絲胺酸肽酶(MER005538)、環氧化物水解酶樣推定肽酶(MER031614)、Loc328574樣蛋白(MER033246)、含α/β-水解酶(abhydrolase)結構域之蛋白4 (MER031616)、環氧化物水解酶(MER000432)、中胚層特異性轉錄物蛋白(MER199890)、中胚層特異性轉錄物蛋白(MER017123)、細胞溶質環氧化物水解酶(MER029997)、細胞溶質環氧化物水解酶(MER213866)、類似於假定蛋白FLJ22408 (MER031608)、CGI-58推定肽酶(MER030163)、Williams-Beuren症候群臨界區蛋白21環氧化物水解酶(MER031610)、環氧化物水解酶(MER031612)、假定蛋白922408 (環氧化物水解酶) (MER031617)、單甘油酯脂肪酶(MER033247)、假定蛋白(MER033249)、伐昔洛韋(valacyclovir)水解酶(MER033259)、Ccg1相互作用因子b (MER210738)、糖基天冬醯胺酸酶前驅物(MER003299)、異天冬胺醯基二肽酶(蘇胺酸型) (MER031622). 蘇胺酸天冬胺酸酶-1 (MER016969)、γ-麩胺醯基轉移酶5 (哺乳動物型) (MER001977)、γ-麩胺醯基轉移酶1 (哺乳動物型) (MER001629)、γ-麩胺醯基轉移酶2 (智人) (MER001976)、γ-麩胺醯基轉移酶樣蛋白4 (MER002721). γ-麩胺醯基轉移酶樣蛋白3 (MER016970). 類似於γ-麩胺醯基轉移酶1前驅物(智人) (MER026204). 類似於γ-麩胺醯基轉移酶1前驅物(智人) (MER026205). Mername-AA211推定肽酶(MER026207). γ-麩胺醯基轉移酶6 (MER159283). γ-麩胺醯基轉肽酶同源物(染色體2，智人) (MER037241). 多囊蛋白-1 (MER126824)、KIAA1879蛋白(MER159329). 多囊腎病1樣3 (MER172554). γ-麩胺醯基水解酶(MER002963). 鳥嘌呤5″-單磷酸合成酶(MER043387). 胺基甲醯基-磷酸合成酶(智人型) (MER078640). 二氫乳清酸酶(N末端單元) (智人型) (MER060647). DJ-1推定肽酶(MER003390). Mername-AA100推定肽酶(MER014802). Mername-AA101非肽酶同源物(MER014803). KIAA0361蛋白(智人型) (MER042827). F1134283蛋白(智人) (MER044553). 非肽酶同源物染色體21開讀框33 (智人) (MER160094). 家族C56非肽酶同源物(MER177016)、家族C56非肽酶同源物(MER176613). 家族C56非肽酶同源物(MER176918). 含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (MER037230). CD97抗原(人類型) (MER037286). 含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣3 (MER037288). 含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣1 (MER037278). 含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣4 (MER037294). 鈣黏蛋白EGF LAG七經G型受體2前驅物(智人) (MER045397)、Gpr64 (家鼷鼠)型蛋白(MER123205). GPR56 (智人)型蛋白(MER122057). 蜘蛛毒素親和蛋白2 (MER122199). 蜘蛛毒素親和蛋白-1 (MER126380). 蜘蛛毒素親和蛋白3 (MER124612). 原鈣黏蛋白紅鸛2 (MER124239). ETL蛋白(MER126267). G蛋白偶聯受體112 (MER126114). 七次跨膜螺旋受體(MER125448). Gpr114蛋白(MER159320). GPR126血管誘導型G蛋白偶聯受體(MER140015). GPR125 (智人)型蛋白(MER159279). GPR116 (智人)型G蛋白偶聯受體(MER159280). GPR128 (智人)型G蛋白偶聯受體(MER162015). GPR133 (智人)型蛋白(MER159334) GPR110 G蛋白偶聯受體(MER159277)、GPR97蛋白(MER159322)、KPG_006蛋白(MER161773) KPG_008蛋白(MER161835)、KPG_009蛋白(MER159335)、未指定同源物(MER166269)、GPR113蛋白(MER159352)、腦特異性血管生成抑制劑2 (MER159746)、PIDD自動加工蛋白單元1 (MER020001)、PIDD自動加工蛋白單元2 (MER063690)、MUC1自切割黏蛋白(MER074260)、肌萎縮蛋白聚糖(MER054741)、蛋白原轉化酶9 (MER022416)、位點-1肽酶(MER001948)、弗林蛋白酶(MER000375)、蛋白原轉化酶1 (MER000376)、蛋白原轉化酶2 (MER000377)、蛋白原轉化酶4 (MER028255)、PACE4蛋白原轉化酶(MER000383)、蛋白原轉化酶5 (MER002578)、蛋白原轉化酶7 (MER002984)、三肽基-肽酶II (MER000355)、亞家族S8A非肽酶同源物(MER201339)、亞家族S8A非肽酶同源物(MER191613)、亞家族S8A未指定肽酶(MER191611)、亞家族S8A未指定肽酶(MER191612)、亞家族S8A未指定肽酶(MER191614)、三肽基-肽酶I (MER003575)、脯胺醯基寡肽酶(MER000393)、二肽基-肽酶IV (真核生物) (MER000401)、醯基胺基醯基-肽酶(MER000408)、纖維母細胞活化蛋白α次單元(MER000399)、PREPL A蛋白(MER004227)、二肽基-肽酶8 (MER013484)、二肽基-肽酶9 (MER004923)、FLJ1推定肽酶(MER017240)、Mername-AA194推定肽酶(MER017353)、Mername-AA195推定肽酶(MER017367)、Mername-AA196推定肽酶(MER017368)、Mername-AA197推定肽酶(MER017371)、C14orf29蛋白(MER033244)、假定蛋白(MER033245)、假定酯酶/脂肪酶/硫酯酶(MER047309)、蛋白bat5 (MER037840)、假定蛋白flj40219 (MER033212)、假定蛋白flj37464 (MER033240)、假定蛋白flj33678 (MER033241)、二肽基肽酶同源物DPP6 (MER000403)、二肽基肽酶同源物DPP10 (MER005988)、類似於家鼷鼠染色體20開讀框135之蛋白(MER037845)、犬尿胺酸甲醯胺酶(MER046020)、甲狀腺球蛋白前驅物(MER011604)、乙醯膽鹼酯(MER033188)、膽鹼酯酶(MER033198)、羧基酯酶D1 (MER033213)、肝臟羧基酯酶(MER033220)、羧基酯酶3 (MER033224)、羧基酯酶2 (MER033226)、膽鹽依賴性脂肪酶(MER033227)、羧基酯酶相關蛋白(MER033231)、神經連接蛋白3 (MER033232)、神經連接蛋白4, X連鎖(MER033235)、神經連接蛋白4, Y連鎖(MER033236)、酯酶D (MER043126)、芳基乙醯胺去乙醯基酶(MER033237)、KIAA1363樣蛋白(MER033242)、激素敏感性脂肪酶(MER033274)、神經連接蛋白1 (MER033280)、神經連接蛋白2 (MER033283)、家族S9非肽酶同源物(MER212939)、家族S9非肽酶同源物(MER211490)、亞家族S9C未指定肽酶(MER192341)、家族S9未指定肽酶(MER209181)、家族S9未指定肽酶(MER200434)、家族S9未指定肽酶(MER209507)、家族S9未指定肽酶(MER209142)、絲胺酸羧肽酶A (MER000430)、卵黃羧肽酶樣蛋白(MER005492)、RISC肽酶(MER010960)、家族S15未指定肽酶(MER199442)、家族S15未指定肽酶(MER200437)、家族S15未指定肽酶(MER212825)、溶酶體Pro-Xaa羧肽酶(MER000446)、二肽基-肽酶II (MER004952)、胸腺物異性絲胺酸肽酶(MER005538)、環氧化物水解酶樣推定肽酶(MER031614)、Loc328574樣蛋白(MER033246)、含α/β-水解酶結構域之蛋白4 (MER031616)、環氧化物水解酶(MER000432)、中胚層特異性轉錄物蛋白(MER199890)、中胚層特異性轉錄物蛋白(MER017123)、細胞溶質環氧化物水解酶(MER029997)、細胞溶質環氧化物水解酶(MER213866)、類似於假定蛋白FLJ22408 (MER031608)、CGI-58推定肽酶(MER030163)、Williams-Beuren症候群臨界區蛋白21環氧化物水解酶(MER031610)、環氧化物水解酶(MER031612)、假定蛋白flj22408 (環氧化物水解酶) (MER031617)、單甘油酯脂肪酶(MER033247)、假定蛋白(MER033249)、伐昔洛韋水解酶(MER033259)、Ccg1相互作用因子b (MER210738)。
可調控蛋白酶酶促活性。舉例而言，某些蛋白酶可藉由特定劑(例如，結合至蛋白酶之劑，諸如特定小分子抑制劑)之存在或缺失而失活。該等蛋白酶可稱為「阻遏性蛋白酶」。用於某些蛋白酶之例示性抑制劑列於 表 4B中。舉例而言，NS3蛋白酶可被包括但不限於以下之蛋白酶抑制劑阻遏：西美瑞韋、達諾瑞韋、阿舒瑞韋、西魯瑞韋、波普瑞韋、索伐瑞韋、帕利瑞韋、替拉瑞韋、格拉瑞韋、格卡瑞韋及伏西瑞韋。在另一實例中，蛋白酶活性可藉助調控蛋白酶本身之表現來調控，諸如對細胞進行工程改造以使用誘導型啟動子系統(例如，Tet On/Off系統)或細胞特異性啟動子(可用於表現異源性蛋白酶之啟動子更詳細地闡述於本文標題為「啟動子」之部分中)表現蛋白酶。蛋白酶亦可含有降解決定子，諸如本文所述之任何降解決定子，且可使用本文所述之任何降解決定子系統來調控。
蛋白酶之酶促活性亦可藉助選擇特異性蛋白酶切割位點來調控。舉例而言，蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得該序列表現出藉由期望蛋白酶之期望切割速率，諸如相對於被期望蛋白酶自然切割之受質之內源序列降低之切割動力學。作為另一實例，蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得該序列以細胞狀態特異性方式表現出期望切割速率。舉例而言，各種細胞狀態(例如，在細胞傳訊之後，諸如免疫細胞活化)可影響某些蛋白酶之表現及/或定位。作為說明性實例，已知ADAM17蛋白水準及定位受傳訊影響，諸如藉助蛋白激酶C (PKC)傳訊路徑(例如，由PKC活化劑(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯[Phorbol-12-myristat-13-acetat, PMA])活化)傳訊。因此，蛋白酶切割位點可經選擇及/或工程改造，使得蛋白酶切割位點之切割及效應分子之隨後釋放視需要增加或減少，此取決於特定細胞狀態下之蛋白酶性質(例如，表現及/或定位)。作為另一實例，蛋白酶切割位點(尤其是與特定膜系鏈結構域組合)可經選擇及/或工程改造以達成嵌合蛋白之最佳蛋白表現。 細胞膜系鏈結構域
本文所提供之膜可切割嵌合蛋白含有細胞膜系鏈結構域(在式 S - C - MT或 MT - C - S中稱為「MT」)。一般而言，細胞膜系鏈結構域可為能夠引導嵌合蛋白定位至(例如，插入)表現嵌合蛋白之細胞之細胞膜中或以其他方式與該細胞膜締合之任何胺基酸序列模體。細胞膜系鏈結構域可為跨膜-細胞內結構域。細胞膜系鏈結構域可為跨膜結構域。細胞膜系鏈結構域可為整合膜蛋白結構域(例如，跨膜結構域)。細胞膜系鏈結構域可源自I型、II型或III型跨膜蛋白。細胞膜系鏈結構域可包括轉譯後修飾標籤、或能夠進行轉譯後修飾以修飾嵌合蛋白以包括轉譯後修飾標籤之模體，其中該轉譯後修飾標籤容許與細胞膜締合。轉譯後修飾標籤之實例包括但不限於脂質錨結構域(例如，GPI脂質錨、肉豆蔻醯化標籤或棕櫚醯化標籤)。細胞膜系鏈結構域之實例包括但不限於源自PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1或BTLA之跨膜-細胞內結構域及/或跨膜結構域。細胞膜系鏈結構域可為細胞表面受體或其細胞膜結合部分。
在一些實施例中，細胞膜系鏈結構域包含源自B7-1多肽之跨膜結構域。在一些實施例中，B7-1跨膜結構域包含序列LLPSWAITLISVNGIFVICCLT YCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 204)。在一些實施例中，B7-1跨膜結構域係由具有序列TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，B7-1跨膜結構域係由與TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之細胞膜系鏈結構域包括源自B7-1多肽之跨膜結構域。在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之B7-1跨膜結構域包括序列LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPR CRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 204)。在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之B7-1跨膜結構域係由具有序列TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，膜可切割嵌合蛋白(例如，IL-15)之B7-1跨膜結構域係由與TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞膜系鏈結構域包含源自CD8多肽之跨膜結構域。可使用任何適宜CD8多肽。例示性CD8多肽包括但不限於NCBI參考號NP_001139345及AAA92533.1。CD8跨膜結構域之實例包括IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 205)、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVI TLYCNHR (SEQ ID NO: 206)及IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 207)。在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLL SLVIT (SEQ ID NO: 205)。在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)。在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 207)。在一些實施例中，細胞膜系鏈結構域包含源自CD8之鉸鏈及跨膜結構域。在一些實施例中，CD8鉸鏈包含序列TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEA CRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 271)。在一些實施例中，CD8鉸鏈包含序列AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVH TRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 209)。
一般而言，對於本文所述之所有膜可切割嵌合蛋白而言，細胞膜系鏈結構域係：(1)蛋白酶切割位點之C末端及任何細胞內結構域之N末端(若存在) (換言之，細胞膜系鏈結構域在蛋白酶切割位點與細胞內結構域(若存在)之間)；或(2)蛋白酶切割位點之N末端及任何細胞內結構域之C末端(若存在) (亦在蛋白酶切割位點與倒轉結構域定向之細胞內結構域(若存在)之間)。在以與嵌合蛋白締合之降解決定子為特徵之實施例中，降解決定子結構域係末端細胞質定向結構域，特定而言關於細胞膜系鏈(換言之，細胞膜系鏈結構域在蛋白酶切割位點與降解決定子之間)。細胞膜系鏈結構域可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為細胞膜系鏈結構域或蛋白酶切割位點之一部分之多肽序列)連接至蛋白酶切割位點。細胞膜系鏈結構域可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為細胞膜系鏈結構域或細胞內結構域之一部分之多肽序列)連接至細胞內結構域(若存在)。細胞膜系鏈結構域可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為細胞膜系鏈結構域或降解決定子之一部分之多肽序列)連接至降解決定子(若存在)。多肽連接體可為連接第一多肽序列及第二多肽序列之任何胺基酸序列。多肽連接體可為撓性連接體(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽連接體之實例包括但不限於GSG連接體(例如，[GS] 4GG [SEQ ID NO: 182])、A(EAAAK) 3A (SEQ ID NO: 183)及Whitlow連接體(例如，「KEGS」連接體，諸如胺基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 184)，eGK連接體，諸如胺基酸序列EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 185)，及更詳細地闡述於已頒佈之美國專利第5,990,275號中之連接體，該美國專利以引用方式併入本文中)。額外多肽連接體包括SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196及SEQ ID NO: 197。其他多肽連接體可基於期望之性質(例如，長度、撓性、胺基酸組成等)來選擇且係熟習此項技術者已知的。
一般而言，細胞膜系鏈結構域定向成使得經分泌效應分子及蛋白酶切割位點在插入細胞膜中或與細胞膜締合後暴露於細胞外，使得蛋白酶切割位點能夠被其各別蛋白酶切割且將效應分子釋放(「分泌」)至細胞外空間中。 降解決定子系統及結構域
在一些實施例中，本文所述之任何蛋白可包括降解決定子結構域，包括但不限於蛋白酶、轉錄因子、啟動子或啟動子系統之組成部分(例如，ACP)，及/或本文所述之任何膜可切割嵌合蛋白。一般而言，降解決定子結構域可為能夠引導受調控降解(諸如藉助泛素介導之路徑之受調控降解)之任何胺基酸序列模體。在存在免疫調節藥物(IMiD)之情況下，降解決定子結構域引導泛素介導之降解決定子融合蛋白之降解。
降解決定子結構域可為能夠因應免疫調節藥物(IMiD)而結合羥腦苷脂(CRBN)之CRBN多肽受質結構域，包括但不限於IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787及ZN827或其能夠藥物誘導性結合CRBN之片段。CRBN多肽受質結構域可為天然CRBN多肽序列之嵌合融合產物，諸如具有FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL (SEQ ID NO: 175)之胺基酸序列之IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合產物。降解決定子結構域且具體而言CRBN降解決定子系統更詳細地闡述於國際申請公開案第WO2019/089592Al號中，該國際申請公開案出於所有目的以引用方式併入本文中。降解決定子結構域之其他實例包括但不限於HCV NS4降解決定子、PEST (人類IκBα之殘基277-307之兩個拷貝；SEQ ID NO: 161)、GRR (人類p105之殘基352-408；SEQ ID NO: 162)、DRR (酵母Cdc34之殘基210-295；SEQ ID NO: 163)、SNS (SP2及NB之銜接重複(A型流感或B型流感之SP2-NB-SP2；例如，SEQ ID NO: 164)、RPB (酵母RPB之殘基1688-1702之四個拷貝；SEQ ID NO: 165)、SPmix (SP1及SP2之銜接重複(A型流感病毒M2蛋白之SP2-SP1-SP2-SP1-SP2；SEQ ID NO: 166)、NS2 (A型流感病毒NS蛋白之殘基79-93之三個拷貝；SEQ ID NO: 167)、ODC (鳥胺酸去羧酶之殘基106-142；SEQ ID NO: 168)、Nek2A、小鼠ODC (殘基422-461；SEQ ID NO: 169)、小鼠ODC_DA (mODC之殘基422-461，包括D433A及D434A點突變)、APC/C降解決定子、COP1 E3連接酶結合降解決定子模體、CRL4-Cdt2結合PIP降解決定子、actinfilin結合降解決定子、KEAP1結合降解決定子、KLHL2及KLHL3結合降解決定子、MDM2結合模體、N-降解決定子、缺氧傳訊中之羥脯胺酸修飾、植物激素依賴性SCF-LRR結合降解決定子、SCF泛素連接酶結合磷酸化降解決定子、植物激素依賴性SCF-LRR-結合降解決定子、DSGxxS磷酸依賴性降解決定子、Siah結合模體、SPOP SBC對接模體或PCNA結合PIP框。
受調控之降解可為藥物誘導型。能夠介導/調控降解之藥物可為小分子化合物。能夠介導/調控降解之藥物可包括「免疫調節藥物」(IMiD)。一般而言，如本文所用，IMiD係指一類含有醯亞胺基團之小分子免疫調節藥物。羥腦苷脂(CRBN)係IMiD之已知靶標，且IMiD結合至CRBN或CRBN多肽受質結構域改變CRBN E3泛素連接酶複合物之受質特異性，導致具有CRBN多肽受質結構域之蛋白(例如，本文所述之任何可分泌效應分子或其他所關注蛋白)之降解。對於具有CRBN多肽受質結構域之降解決定子結構域而言，含醯亞胺之IMiD之實例包括但不限於沙利竇邁(thalidomide)、雷利竇邁(lenalidomide)或泊馬竇邁(pomalidomide)。IMiD可為經FDA批准之藥物。
本文所述之嵌合蛋白可含有降解決定子結構域(例如，在用於本文所述之膜可切割嵌合蛋白之式 S - C - MT - D或 D - MT - C - S中，稱為「D」)。在不存在IMiD之情況下，不會發生降解決定子/泛素介導之嵌合蛋白降解。在嵌合蛋白表現並定位至細胞膜中後，蛋白酶切割位點引導嵌合蛋白之切割，使得效應分子釋放(「分泌」)至細胞外空間中。在存在免疫調節藥物(IMiD)之情況下，降解決定子結構域引導泛素介導之嵌合蛋白之降解，使得效應分子之分泌減少或消除。一般而言，對於融合至降解決定子結構域之膜可切割嵌合蛋白而言，降解決定子結構域係末端細胞質定向結構域，特定而言關於細胞膜系鏈結構域，例如，式 S - C - MT - D中之最C末端結構域或式 D - MT - C - S中之最N末端結構域。降解決定子結構域可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為細胞膜系鏈結構域或降解決定子結構域之一部分之多肽序列)連接至細胞膜系鏈結構域。多肽連接體可為連接第一多肽序列及第二多肽序列之任何胺基酸序列。多肽連接體可為撓性連接體(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽連接體之實例包括但不限於GSG連接體(例如，[GS] 4GG [SEQ ID NO: 182])、A(EAAAK) 3A (SEQ ID NO: 183)及Whitlow連接體(例如，「KEGS」連接體，諸如胺基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 184)，eGK連接體，諸如胺基酸序列EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 185)，及更詳細地闡述於已頒佈之美國專利第5,990,275號中之連接體，該美國專利以引用方式併入本文中)。額外多肽連接體包括SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196及SEQ ID NO: 197。其他多肽連接體可基於期望之性質(例如，長度、撓性、胺基酸組成等)來選擇且係熟習此項技術者已知的。一般而言，降解決定子相對於細胞膜系鏈結構域定向，使得降解決定子在定位至細胞膜後暴露於細胞溶質，使得降解決定子結構域能夠介導降解(例如，暴露於細胞溶質及細胞溶質)且能夠介導泛素介導之降解。
對於降解決定子融合蛋白，降解決定子結構域可為所關注蛋白(例如，效應分子)之N末端或C末端。降解決定子結構域可藉由多肽連接體(亦即，一般不視為所關注蛋白或降解決定子結構域之一部分之多肽序列)連接至所關注蛋白。多肽連接體可為連接第一多肽序列及第二多肽序列之任何胺基酸序列。多肽連接體可為撓性連接體(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽連接體之實例包括但不限於GSG連接體(例如，[GS] 4GG [SEQ ID NO: 182])、A(EAAAK) 3A (SEQ ID NO: 183)及Whitlow連接體(例如，「KEGS」連接體，諸如胺基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 184)，eGK連接體，諸如胺基酸序列EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 185)，及更詳細地闡述於已頒佈之美國專利第5,990,275號中之連接體，該美國專利以引用方式併入本文中)。額外多肽連接體包括SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196及SEQ ID NO: 197。其他多肽連接體可基於期望之性質(例如，長度、撓性、胺基酸組成等)來選擇且係熟習此項技術者已知的。多肽連接體可為可切割的，例如，本文所述之任何蛋白酶切割位點。 歸巢分子 (Homing Molecule)
「腫瘤微環境」係存在腫瘤之細胞環境，包括周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、骨髓來源之發炎細胞、淋巴球、傳訊分子及細胞外基質(ECM) (參見例如Pattabiraman, D.R.及Weinberg, R.A. Nature Reviews Drug Discovery13, 497-512 (2014)；Balkwill, F.R.等人， J Cell Sci125, 5591-5596, 2012；及Li, H.等人， J Cell Biochem101(4), 805-15, 2007)。
在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生至少一種歸巢分子。舉例而言，在本文所述之含有經分泌效應分子之膜可切割嵌合蛋白中，經分泌效應分子可為歸巢分子。「歸巢」係指細胞主動導航(遷移)至靶位點(例如，細胞、組織(例如，腫瘤)或器官)。「歸巢分子」係指將細胞引導至靶位點之分子。在一些實施例中，歸巢分子之功能係識別及/或起始經工程改造之細胞與靶位點之相互作用。歸巢分子之非限制性實例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7及PDGFR。
在一些實施例中，歸巢分子係趨化介素受體(結合至趨化介素之細胞表面分子)。趨化介素係由細胞分泌之小的細胞介素或傳訊蛋白，其可在細胞中誘導定向趨化性。趨化介素可分為四個主要亞家族：CXC、CC、CX3C及XC，其皆藉由選擇性地結合至位於靶細胞表面上之趨化介素受體來發揮生物效應。在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生CXCR4，此係一種趨化介素受體，其容許經工程改造之細胞沿著趨化介素梯度向表現基質細胞衍生因子1 (亦稱為SDF1、C-X-C模體趨化介素12及CXCL12)之細胞、組織或腫瘤歸巢。可由本揭示案之經工程改造之核酸編碼之趨化介素受體的非限制性實例包括：CXC趨化介素受體(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6及CXCR7)、CC趨化介素受體(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10及CCR11)、CX3C趨化介素受體(例如，CX3CR1，其結合至CX3CL1)及XC趨化介素受體(例如，XCR1)。在一些實施例中，趨化介素受體係G蛋白連接之跨膜受體，或腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之成員(包括但不限於TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生CXCL8、CXCL9及/或CXCL10 (促進T細胞募集)、CCL3及/或CXCL5、CCL21 (Th1募集及極化)。
在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生偵測含N-甲醯基化之寡肽之G蛋白偶聯受體(GPCR) (包括但不限於FPR2及FPRL1)。
在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生偵測介白素之受體(包括但不限於IL6R)。
在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生偵測自其他細胞、組織或腫瘤分泌之生長因子之受體(包括但不限於FGFR、PDGFR、EGFR及VEGF家族(包括但不限於VEGF-C及VEGF-D)之受體)。
在一些實施例中，歸巢分子係整聯蛋白。整聯蛋白係促進細胞-細胞外基質(ECM)黏附之跨膜受體。整聯蛋白係具有兩個次單元(α (阿爾法)及β (貝他))之專性異二聚物。整聯蛋白之α次單元可為但不限於：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整聯蛋白之β次單元可為但不限於：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7及ITGB8。經工程改造之核酸可經構形以產生整聯蛋白α及β次單元之任一組合。
在一些實施例中，歸巢分子係基質金屬蛋白酶(MMP)。MMP係切割內皮細胞壁下方基底膜之組分之酶。MMP之非限制性實例包括MMP-2、MMP-9及MMP。在一些實施例中，經工程改造之核酸經構形以產生抑制MMP之分子(例如，蛋白)之抑制劑。舉例而言，經工程改造之核酸可經構形以表現膜1型MMP (MT1-MMP)之抑制劑(例如，RNAi分子)或TIMP金屬肽酶抑制劑1 (TIMP-1)。
在一些實施例中，歸巢分子係例如在靶組織之內皮上結合至選擇蛋白之配位體(例如，造血細胞E-/L-選擇蛋白配位體(HCELL)，Dykstran等人，Stem Cells. 2016年10月；34(10):2501-2511)。
術語「歸巢分子」亦涵蓋調控改良/增強細胞歸巢之分子之產生的轉錄因子。
在一些實施例中，歸巢分子包括抗體，諸如抗整聯蛋白α4,β7或抗MAdCAM。 嵌合抗原受體 (CAR)
本揭示案之某些態樣係關於嵌合受體，其具有本文所述之任一種抗原特異性結合結構域(例如，EMCN特異性、FLT3特異性及/或CD33特異性)且能夠特異性結合至蛋白、抗原來源抗原或抗原來源抗原決定基。
在一些實施例中，嵌合受體係嵌合抗原受體(CAR)。一般而言，CAR係嵌合蛋白，其包括抗原結合結構域及與抗原結合結構域異源之多肽分子，諸如與可衍生出抗原結合結構域之抗體異源之肽。與抗原結合結構域異源之多肽分子可包括但不限於跨膜結構域、一或多個細胞內傳訊結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多個肽連接體或其組合。
在一些實施例中，CAR係經工程改造之受體，其將所關注之特異性(例如，EMCN、FLT3或CD33)移植或賦予給免疫效應細胞。在某些實施例中，CAR可用於將抗體之特異性移植至免疫反應性細胞(諸如T細胞)上。在一些實施例中，本揭示案之CAR包含與跨膜結構域融合之細胞外抗原結合結構域(例如，scFv)，該跨膜結構域與一或多個細胞內傳訊結構域融合。
在一些實施例中，嵌合抗原受體係活化性嵌合抗原受體(aCAR，且除非另外指定，否則通常亦稱為CAR)。在一些實施例中，嵌合抗原受體與其同源配位體之結合足以誘導免疫反應性細胞之活化。在一些實施例中，嵌合抗原受體與其同源配位體之結合足以誘導免疫反應性細胞之刺激。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化導致靶細胞之殺傷。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化導致免疫反應性細胞表現及/或分泌細胞介素或趨化介素。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激導致免疫反應性細胞表現及/或分泌細胞介素或趨化介素。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激誘導免疫反應性細胞之分化。在一些實施例中，免疫反應性細胞之刺激誘導免疫反應性細胞之增殖。在一些實施例中，免疫反應性細胞之活化及/或刺激可為以上反應之組合。
結合分子(諸如本文所述之嵌合蛋白)中ABD之數目定義結合分子之「化合價」。具有單一ABD之結合分子係「單價」。具有複數個ABD之結合分子視為「多價」。具有兩個ABD之多價結合分子係「二價」。具有三個ABD之多價結合分子係「三價」。具有四個ABD之多價結合分子係「四價」。在各種多價實施例中，複數個ABD全部具有相同識別特異性且可稱為「單特異性多價」結合分子。在其他多價實施例中，複數個ABD中之至少兩者具有不同識別特異性。該等結合分子係多價及「多特異性」的。在ABD共同具有兩種識別特異性之多價實施例中，結合分子係「雙特異性的」。在ABD共同具有三種識別特異性之多價實施例中，結合分子係「三特異性的」。在ABD對存在於相同抗原上之不同抗原決定基共同具有複數種識別特異性之多價實施例中，結合分子係「多互補位的」。ABD共同識別相同抗原上之兩個抗原決定基之多價實施例係「雙互補位的」。
在各種多價實施例中，結合分子之多價性改良結合分子對特定靶標之親合力。如本文所述，「親合力」係指兩個或更多個分子(例如，針對特定靶標之多價結合分子)之間之相互作用之總強度，其中親合力係由多個ABD之親和力提供的相互作用之累積強度。親合力可藉由與如上文所述用於確定親和力之彼等方法相同之方法來量測。在某些實施例中，結合分子對特定靶標之親合力使得相互作用係特異性結合相互作用，其中兩個分子之間之親合力具有低於10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M或10 -10M之KD值。在某些實施例中，結合分子對特定靶標之親合力具有KD值，使得相互作用係特異性結合相互作用，其中個別ABD之一或多種親和力不具有單獨符合特異性結合其各別抗原或抗原決定基之條件的KD值。在某些實施例中，親合力係由多個ABD對共有特異性靶標或複合物上之單獨抗原(諸如在個別細胞上發現之單獨抗原)之親和力提供的相互作用之累積強度。在某些實施例中，親合力係由多個ABD對共有個別抗原上之單獨抗原決定基之親和力提供的相互作用之累積強度。
在一些實施例中，aCAR可為二價雙特異性CAR。在一些實施例中，aCAR可為在本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)上表現之二價雙特異性CAR，其作為或邏輯閘(例如，靶向多個腫瘤靶標之或邏輯閘)以增加活化性嵌合受體之潛在靶標。二價雙特異性aCAR可包括對FLT3特異之抗原結合結構域及對CD33特異之抗原結合結構域。二價雙特異性aCAR可包括i)對FLT3特異之抗原結合結構域；(ii)對CD33特異之抗原結合結構域；(iii)一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊結構域，及(iv)一或多種包括但不限於以下之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合。
本揭示案之CAR可為第一、第二或第三代CAR。「第一代」 CAR包含通常源自T細胞受體鏈之單一細胞內傳訊結構域。「第一代」CAR通常具有來自CD3-ζ (CD3ζ)鏈之細胞內傳訊結構域，該結構域係來自內源性TCR之信號之主要遞質。「第一代」CAR可提供從頭抗原識別，且藉助其於單一融合分子中之CD3ζ鏈傳訊結構域引起CD4 +及CD8 +T細胞二者之活化，而不依賴於HLA介導之抗原呈現。「第二代」CAR將來自各種共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40)中之一者之第二細胞內傳訊結構域添加至CAR之細胞質尾部，以向T細胞提供額外信號。「第二代」CAR提供共刺激(例如，CD28或4-1BB)及活化(CD3ζ)二者。臨床前研究已指示，「第二代」CAR可改良免疫反應性細胞(諸如T細胞)之抗腫瘤活性。「第三代」CAR具有多個細胞內共刺激傳訊結構域(例如，CD28及4-1BB)及細胞內活化傳訊結構域(CD3ζ)。
在一些實施例中，嵌合抗原受體係嵌合抑制性受體(iCAR)。在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體結合在源自選自由以下組成之群之組織之非腫瘤細胞上表現的抗原：腦、神經元組織、內分泌、骨、骨髓、免疫系統、內皮組織、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體(例如，EMCN特異性嵌合抑制性受體)可例如與在本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)上表現之一或多種活化性嵌合受體(例如，活化性嵌合TCR或CAR，諸如FLT3及/或CD33 aCAR)一起用作非邏輯閘，以控制、調節或以其他方式抑制一或多種活化性嵌合受體之一或多種活性。舉例而言，若健康細胞表現由腫瘤靶向性嵌合受體識別之抗原及由嵌合抑制性受體識別之抗原二者，則表現腫瘤抗原之免疫反應性細胞可結合至健康細胞。在該情況下，抑制性嵌合抗原亦將結合其在健康細胞上之同源配位體，且嵌合抑制性受體之抑制功能將經由腫瘤靶向性嵌合受體減少、降低、阻止或抑制免疫反應性細胞之活化(「非邏輯閘控」)。在一些實施例中，本揭示案之嵌合抑制性受體可抑制本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)之一或多種活性。在一些實施例中，免疫反應性細胞可包含一或多種腫瘤靶向性嵌合受體及一或多種靶向腫瘤上不表現或通常認為表現之抗原(例如，EMCN)之嵌合抑制性受體。腫瘤靶向性嵌合受體及嵌合抑制性受體在相同免疫反應性細胞中之組合可用於降低中靶脫腫瘤毒性。
在一些實施例中，本揭示案之CAR之細胞外抗原結合結構域以約2×10 -7M或更小、約1×10 -7M或更小、約9×10 -8M或更小、約1×10 -8M或更小、約9×10 -9M或更小、約5×10 -9M或更小、約4×10 -9M或更小、約3×10 -9M或更小、約2×10 -9M或更小或約1×10 -9M或更小之解離常數(K d)結合至一或多種抗原(例如，EMCN、FLT3或CD33)。在一些實施例中，K d在約2×10 -7M至約1×10 -9M之範圍內。
本揭示案之CAR之細胞外抗原結合結構域之結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如，生長抑制)、生物層干涉術(例如，Octet/FORTEBIO®)、表面電漿子共振(SPR)技術(例如，Biacore®)或西方墨點(Western Blot)分析來確定。該等分析中之每一者通常藉由採用對所關注複合物特異之經標記試劑(例如，抗體或scFv)來偵測所特別關注蛋白-抗體複合物之存在。舉例而言，scFv可經放射性標記且用於RIA分析中。放射性同位素可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器等手段或藉由放射自顯影術來偵測。在某些實施例中，用螢光標記物標記CAR之細胞外抗原結合結構域。螢光標記物之非限制性實例包括綠色螢光蛋白(GFP)、藍色螢光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite及mKalamal)、青色螢光蛋白(例如，ECFP、Cerulean及CyPet)及黃色螢光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus及YPet)。在某些實施例中，將CAR之細胞外抗原結合結構域用對細胞外抗原結合結構域特異之二級抗體標記，且其中將二級抗體標記(例如放射性標記或用螢光標記物標記)。
在一些實施例中，本揭示案之CAR包含結合至EMCN、FLT3或CD33之細胞外抗原結合結構域。在一些實施例中，本揭示案之CAR包含結合至EMCN蛋白、EMCN來源抗原或EMCN來源抗原決定基之細胞外抗原結合結構域。在一些實施例中，本揭示案之CAR包含結合至FLT3蛋白、FLT3來源抗原或FLT3來源抗原決定基之細胞外抗原結合結構域。在一些實施例中。在一些實施例中，本揭示案之CAR包含結合至CD33蛋白、CD33來源抗原或CD33來源抗原決定基之細胞外抗原結合結構域。本揭示案之CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及一或多個細胞內傳訊結構域。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含scFv。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含可經交聯之Fab片段。在某些實施例中，細胞外結合結構域係F(ab) 2片段。 細胞外抗原結合結構域
本揭示案之抗原結合結構域可包括結合至抗原之任何結構域，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、雙特異性抗體、偶聯抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括但不限於單結構域抗體(sdAb)，諸如重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)及駱駝科動物來源之奈米抗體之可變結構域(VHH)，以及此項技術中已知用作抗原結合結構域之替代性支架，諸如重組纖網蛋白結構域、T細胞受體(TCR)、具有增強之親和力之重組TCR或其片段，例如單鏈TCR及諸如此類。在一些情況下，抗原結合結構域源自最終將使用CAR之相同物種係有益的。
在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含抗體。在某些實施例中，抗體係人類抗體。在某些實施例中，抗體係嵌合抗體。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含抗體之抗原結合片段。
在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含F(ab)片段。在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含F(ab')片段。
在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含scFv。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含兩個單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，兩個scFv中之每一者結合至相同抗原上之不同抗原決定基。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含第一scFv及第二scFv。在一些實施例中，第一scFv及第二scFv結合相同抗原之不同抗原決定基。在某些實施例中，scFv係哺乳動物scFv。在某些實施例中，scFv係嵌合scFv。在某些實施例中，scFv包含重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。
在某些實施例中，VH及VL係由肽連接體隔開。在某些實施例中，肽連接體包含 表 6中所示之任何胺基酸序列。
在某些實施例中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH係重鏈可變結構域，L係肽連接體，且VL係輕鏈可變結構域。在一些實施例中，一或多個scFv中之每一者包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH係重鏈可變結構域，L係肽連接體，且VL係輕鏈可變結構域。當存在兩個或更多個連接在一起之scFv時，每一scFv可利用所連接之肽連接至下一個scFv。在一些實施例中，一或多個scFv中之每一者係由肽連接體隔開。
在一些實施例中，肽連接體包括胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)。在一些實施例中，iCAR之抗原結合結構域之間之肽連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)。在一些實施例中，肽連接體係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGC GGAGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 253)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，編碼肽連接體之核酸包括與GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGT GGCGGAGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 253)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，肽連接體包括胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)。在一些實施例中，aCAR之抗原結合結構域之間之肽連接體包含胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)。在一些實施例中，肽連接體係由包含序列GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)或GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，編碼肽連接體之核酸包括與GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)或GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，肽連接體包括胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。在一些實施例中，aCAR之抗原結合結構域之間之肽連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。在一些實施例中，肽連接體係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT (SEQ ID NO: 256)、GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)或GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 258)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，編碼肽連接體之核酸包括與GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT (SEQ ID NO: 256)、GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)或GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGG CAGT (SEQ ID NO: 258)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，肽連接體包括胺基酸序列GSTSGSGKPG SGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)。在一些實施例中，aCAR之抗原結合結構域之間之肽連接體包含胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)。在一些實施例中，肽連接體係由包含序列GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，編碼肽連接體之核酸包括與GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。 表 6. 肽連接體
連接體 胺基酸序列 SEQ ID NO:
GS-連接體 SGGGGSGGGGSG 230
GS-連接體 GGGSGGGGSGGGSLQ 231
(G 2S) 1scFv連接體 GGS 232
(G 2S) 2scFv連接體 GGSGGS 233
(G 2S) 3scFv連接體 GGSGGSGGS 234
(G 2S) 4scFv連接體 GGSGGSGGSGGS 235
(G 2S) 5scFv連接體 GGSGGSGGSGGSGGS 236
(G 3S) 1scFv連接體 GGGS 237
(G 3S) 2scFv連接體 GGGSGGGS 238
(G 3S) 3scFv連接體 GGGSGGGSGGGS 239
(G 3S) 4scFv連接體 GGGSGGGSGGGSGGGS 240
(G 3S) 5scFv連接體 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 241
(G 4S) 1連接體 GGGGS 242
(G 4S) 2連接體 GGGGSGGGGS 243
(G 4S) 3連接體 GGGGSGGGGSGGGGS 244
(G 4S) 4連接體 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 245
(G 4S) 5連接體 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 246
Whitlow連接體 [「環6」連接體] GSTSGSGKPGSGEGSTKG 247
scFv連接體2 EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK 248
在一些實施例中，免疫效應細胞包含第一嵌合受體及第二嵌合受體。第一嵌合受體之抗原結合結構域及第二嵌合受體之抗原結合結構域可為本文所述或此項技術中已知之適當抗原結合結構域。舉例而言，第一或第二抗原結合結構域可為一或多種抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單結構域抗體(sdAb)。在一些實施例中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體之抗原結合結構域包含兩個單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，兩個scFv中之每一者結合至相同抗原上之不同抗原決定基。在一些實施例中，第一嵌合受體之抗原結合結構域可對EMCN特異，且嵌合受體可對第二不同抗原，諸如癌抗原(例如，在諸如AML細胞等骨髓細胞上表現之抗原)特異。
在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域包含單結構域抗體(sdAb)。在某些實施例中，sdAb係人類化sdAb。在某些實施例中，sdAb係嵌合sdAb。
在一些實施例中，本揭示案之CAR可包含兩個或更多個抗原結合結構域、三個或更多個抗原結合結構域、四個或更多個抗原結合結構域、五個或更多個抗原結合結構域、六個或更多個抗原結合結構域、七個或更多個抗原結合結構域、八個或更多個抗原結合結構域、九個或更多個抗原結合結構域或十個或更多個抗原結合結構域。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合結構域中之每一者結合相同抗原。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合結構域中之每一者結合相同抗原之不同抗原決定基。在一些實施例中，兩個或更多個抗原結合結構域中之每一者結合不同抗原。
在一些實施例中，CAR包含兩個抗原結合結構域。在一些實施例中，兩個抗原結合結構域經由撓性連接體彼此連接。在一些實施例中，兩個抗原結合結構域中之每一者皆可獨立地選自抗體、抗體之抗原結合片段、scFv、sdAb、重組纖網蛋白結構域、T細胞受體(TCR)、具有增強之親和力之重組TCR及單鏈TCR。在一些實施例中，包含兩個抗原結合結構域之CAR係雙特異性CAR或銜接CAR (tanCAR)。
在某些實施例中，雙特異性CAR或tanCAR包含包括雙特異性抗體或抗體片段(例如，scFv)之抗原結合結構域。在一些實施例中，在雙特異性抗體分子之每一抗體或抗體片段(例如，scFv)內，VH可在VL之上游或下游。在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)排布為其VH (VH 1)在其VL (VL 1)上游，且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)排布為其VL (VL 2)在其VH (VH 2)上游，使得整個雙特異性抗體分子具有排布VH 1-VL 1-VL 2-VH 2。在其他實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)排布為其VL (VL 1)在其VH (VH 1)上游，且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)排布為其VH (VH 2)在其VL (VL 2)上游，使得整個雙特異性抗體分子具有排布VL 2-VH 2-VH 2-VL 2。在一些實施例中，連接體設置在兩個抗體或抗體片段(例如，scFv)之間，舉例而言，若構築體排布為VH 1-VL 1-VL 2-VH 2，則連接體設置在VL 1與VL 2之間，或者若構築體排布為VL 1-VH 1-VH 2-VL 2，則連接體設置在VH 1與VH 2之間。連接體可為如本文所述之連接體，例如，(Gly 4-Ser)n連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。一般而言，兩個scFv之間之連接體應足夠長以避免兩個scFv之結構域之間之錯配。在一些實施例中，連接體設置在第一scFv之VL與VH之間。在一些實施例中，連接體設置在第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接體之構築體中，任兩個或更多個連接體可相同或不同。因此，在一些實施例中，雙特異性CAR或tanCAR包含VL、VH，且可進一步包含一或多個如本文所述佈置之連接體。
在說明性非限制性實例中，CD33/FLT3雙特異性二價aCAR可具有按以下順序編碼之抗原結合結構域：(FLT3-VH) - L1 - (CD33-VH) - L2 - (CD33-VL) - L3 - (FLT3-VL)，其中L1、L2及L3分別係第一肽連接體、第二肽連接體及第三肽連接體。L1、L2及L3可為相同肽連接體。L1、L2及L3可為由相同多核苷酸序列編碼之相同肽連接體。L1、L2及L3可為由不同多核苷酸序列編碼之相同肽連接體。L1及L3可為相同肽連接體且L2可為不同肽連接體。L1及L3可為由相同多核苷酸序列編碼之相同肽連接體。L1及L3可為由不同多核苷酸序列編碼之相同肽連接體。L1、L2及L3各自可為不同的肽連接體。 CAR 跨膜結構域
在一些實施例中，本揭示案之CAR (例如，本文所述之EMCN特異性CAR、FLT3特異性CAR及/或CD33特異性CAR)之跨膜結構域包含跨越細胞膜之至少一部分之疏水性α螺旋。已顯示不同跨膜結構域可產生不同的受體穩定性。在抗原識別後，受體簇集且信號傳遞至細胞。在一些實施例中，本揭示案之CAR之跨膜結構域可包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、LIR-1 (LILRB1)多肽之跨膜結構域，或可為合成肽，或其任一組合。
在一些實施例中，跨膜結構域源自CD8多肽。可使用任何適宜CD8多肽。例示性CD8多肽包括但不限於NCBI參考號NP_001139345及AAA92533.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自CD28多肽。可使用任何適宜CD28多肽。例示性CD28多肽包括但不限於NCBI參考號NP_006130.1及NP_031668.3。在一些實施例中，跨膜結構域源自CD3ζ多肽。可使用任何適宜CD3ζ多肽。例示性CD3ζ多肽包括但不限於NCBI參考號NP_932170.1及NP_001106862.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自CD4多肽。可使用任何適宜CD4多肽。例示性CD4多肽包括但不限於NCBI參考號NP_000607.1及NP_038516.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自4-1BB多肽。可使用任何適宜4-1BB多肽。例示性4-1BB多肽包括但不限於NCBI參考號NP_001552.2及NP_001070977.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自OX40多肽。可使用任何適宜OX40多肽。例示性OX40多肽包括但不限於NCBI參考號NP_003318.1及NP_035789.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自ICOS多肽。可使用任何適宜ICOS多肽。例示性ICOS多肽包括但不限於NCBI參考號NP_036224及NP_059508。在一些實施例中，跨膜結構域源自CTLA-4多肽。可使用任何適宜CTLA-4多肽。例示性CTLA-4多肽包括但不限於NCBI參考號NP_005205.2及NP_033973.2。在一些實施例中，跨膜結構域源自PD-1多肽。可使用任何適宜PD-1多肽。例示性PD-1多肽包括但不限於NCBI參考號NP_005009及NP_032824。在一些實施例中，跨膜結構域源自LAG-3多肽。可使用任何適宜LAG-3多肽。例示性LAG-3多肽包括但不限於NCBI參考號NP_002277.4及NP_032505.1。在一些實施例中，跨膜結構域源自2B4多肽。可使用任何適宜2B4多肽。例示性2B4多肽包括但不限於NCBI參考號NP_057466.1及NP_061199.2。在一些實施例中，跨膜結構域源自BTLA多肽。可使用任何適宜BTLA多肽。例示性BTLA多肽包括但不限於NCBI參考號NP_861445.4及NP_001032808.2。可使用任何適宜LIR-1 (LILRB1)多肽。例示性LIR-1 (LILRB1)多肽包括但不限於NCBI參考號NP_001075106.2及NP_001075107.2。
在一些實施例中，跨膜結構域包含多肽，該多肽包含與NCBI參考號NP_001139345、AAA92533.1、NP_006130.1、NP_031668.3、NP_932170.1、NP_001106862.1、NP_000607.1、NP_038516.1、NP_001552.2、NP_001070977.1、NP_003318.1、NP_035789.1、NP_036224、NP_059508、NP_005205.2、NP_033973.2、NP_005009、NP_032824、NP_002277.4、NP_032505.1、NP_057466.1、NP_061199.2、NP_861445.4或NP_001032808.2之序列或其片段至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，同源性可使用諸如BLAST或FASTA等標準軟體確定。在一些實施例中，多肽可包含一個保守胺基酸取代、至多兩個保守胺基酸取代或至多三個保守胺基酸取代。在一些實施例中，多肽可具有作為NCBI參考號NP_001139345、AAA92533.1、NP_006130.1、NP_031668.3、NP_932170.1、NP_001106862.1、NP_000607.1、NP_038516.1、NP_001552.2、NP_001070977.1、NP_003318.1、NP_035789.1、NP_036224、NP_059508、NP_005205.2、NP_033973.2、NP_005009、NP_032824、NP_002277.4、NP_032505.1、NP_057466.1、NP_061199.2、NP_861445.4或NP_001032808.2之連續部分之胺基酸序列，該胺基酸序列之長度為至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少110個、至少120個、至少130個、至少140個、至少150個、至少160個、至少170個、至少180個、至少190個、至少200個、至少210個、至少220個、至少230個或至少240個胺基酸。
可衍生出跨膜結構域之適宜多肽之其他實例包括但不限於T細胞受體之α、β或ζ鏈之一或多個跨膜區、CD27、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D及NG2C。
在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSL VIT (SEQ ID NO: 205)。在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)。在一些實施例中，跨膜結構域包含序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 207)。
在一些實施例中，iCAR跨膜結構域包括LIR1跨膜結構域。在一些實施例中，iCAR跨膜結構域包括具有序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 259)之LIR1跨膜結構域。在一些實施例中，iCAR跨膜結構域包括由具有序列GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)之多核苷酸序列編碼之LIR1跨膜結構域。在一些實施例中，iCAR跨膜結構域包括由與GTGATCGGCATTCTGG TCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之LIR1跨膜結構域。
在一些實施例中，aCAR跨膜結構域包括CD8跨膜結構域。在一些實施例中，aCAR跨膜結構域包括具有序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)之CD8跨膜結構域。在一些實施例中，aCAR跨膜結構域包括由具有序列ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)之多核苷酸序列編碼之CD8跨膜結構域。在一些實施例中，aCAR跨膜結構域包括由與ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之CD8跨膜結構域。 間隔區
在一些實施例中，本揭示案之CAR (例如，本文所述之EMCN特異性CAR、FLT3特異性CAR及/或CD33特異性CAR)亦可包含將細胞外抗原結合結構域連接至跨膜結構域之間隔區。間隔區可足夠撓性以容許抗原結合結構域以不同方向定向，以促進抗原識別。在一些實施例中，間隔區可為來自人類蛋白之鉸鏈。舉例而言，鉸鏈可為人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈，包括但不限於IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈。在一些實施例中，間隔區可包含IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、IgD鉸鏈、CD28鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈或PDGFR-β細胞外連接體。在一些實施例中，間隔區定位於抗原結合結構域與跨膜結構域之間。在一些實施例中，間隔區可包含 表 7中所列出之任何胺基酸序列，或與 表 7中所列出之任何胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼本揭示案之任何間隔區之核酸可包含 表 8中所列出之任何核酸序列，或與 表 8中所列出之任何核酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。
在一些實施例中，aCAR鉸鏈結構域包括CD8鉸鏈。在一些實施例中，aCAR鉸鏈結構域包括具有胺基酸序列ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTT PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 272)之CD8鉸鏈。在一些實施例中，aCAR鉸鏈結構域包括由具有序列GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)之多核苷酸序列編碼之CD8鉸鏈。在一些實施例中，aCAR鉸鏈結構域包括由與GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之CD8鉸鏈。
在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括CD8鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括具有胺基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEA CRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 271)之CD8鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括由具有序列ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)之多核苷酸序列編碼之CD8鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括由與ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之CD8鉸鏈。
在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括LIR1鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括具有胺基酸序列HPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGP TSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (SEQ ID NO: 417)之LIR1鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括由具有序列CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)之多核苷酸序列編碼之LIR1鉸鏈。在一些實施例中，iCAR鉸鏈結構域包括由與CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之LIR1鉸鏈。 表 7. 間隔胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 說明
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP 262 CD28鉸鏈
ESKYGPPCPSCP 263 IgG4最小鉸鏈
ESKYGPPAPSAP 264 無二硫化物之IgG4最小鉸鏈
ESKYGPPCPPCP 265 增強二硫化物形成之IgG4 S228P最小鉸鏈
EPKSCDKTHTCP 266 IgG1最小鉸鏈
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 267 延伸之CD8a鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC 268 LNGFR鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC 269 截短之LNGFR鉸鏈(TNFR-Cys1)
AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV 270 PDGFR-β細胞外連接體
TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 271 源自CD8鉸鏈之實例性間隔物
ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 272 源自CD8鉸鏈之實例性間隔物
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 273 實例性間隔物
HPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV 417 LIR1鉸鏈
表 8. 間隔核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 說明
GCAGCAGCTATCGAGGTGATGTATCCTCCGCCCTACCTGGATAATGAAAAGAGTAATGGGACTATCATTCATGTAAAAGGGAAGCATCTTTGTCCTTCTCCCCTTTTCCCCGGTCCGTCTAAACCT 274 CD28鉸鏈
GAAAGCAAGTACGGTCCACCTTGCCCTAGCTGTCCG 275 IgG4最小鉸鏈
GAATCCAAGTACGGCCCCCCAGCGCCTAGTGCCCCA 276 無二硫化物之IgG4最小鉸鏈
GAATCTAAATATGGCCCGCCATGCCCGCCTTGCCCA 277 增強二硫化物形成之IgG4 S228P最小鉸鏈
GAACCGAAGTCTTGTGATAAAACTCATACGTGCCCG 278 IgG1最小鉸鏈
GCTGCTGCTTTCGTACCCGTGTTCCTCCCTGCTAAGCCTACGACTACCCCCGCACCGAGACCACCCACGCCAGCACCCACGATTGCTAGCCAGCCCCTTAGTTTGCGACCAGAAGCTTGTCGGCCTGCTGCTGGTGGCGCGGTACATACCCGCGGCCTTGATTTTGCTTGCGATATATATATCTGGGCGCCTCTGGCCGGAACATGCGGGGTCCTCCTCCTTTCTCTGGTTATTACTCTCTACTGTAATCACAGGAAT 279 延伸之CD8a鉸鏈
GCCTGCCCGACCGGGCTCTACACTCATAGCGGGGAATGTTGTAAGGCATGTAACTTGGGTGAGGGCGTCGCACAGCCCTGCGGAGCTAACCAAACAGTGTGCGAACCCTGCCTCGATAGTGTGACGTTCTCTGATGTTGTATCAGCTACAGAGCCTTGCAAACCATGTACTGAGTGCGTTGGACTTCAGTCAATGAGCGCTCCATGTGTGGAGGCAGATGATGCGGTCTGTCGATGTGCTTACGGATACTACCAAGACGAGACAACAGGGCGGTGCGAGGCCTGTAGAGTTTGTGAGGCGGGCTCCGGGCTGGTGTTTTCATGTCAAGACAAGCAAAATACGGTCTGTGAAGAGTGCCCTGATGGCACCTACTCAGACGAAGCAGATGCAGAATGC 280 LNGFR鉸鏈
GCCTGCCCTACAGGACTCTACACGCATAGCGGTGAGTGTTGTAAAGCATGCAACCTCGGGGAAGGTGTAGCCCAGCCATGCGGGGCTAACCAAACCGTTTGC 281 截短之LNGFR鉸鏈(TNFR-Cys1)
GCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTG 282 PDGFR-β細胞外連接體
ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC 283 源自CD8鉸鏈之實例性間隔物
GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC 284 源自CD8鉸鏈之實例性間隔物
CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT 418 LIR1鉸鏈
在一些實施例中，本揭示案之CAR可進一步包括短寡肽或多肽連接體，其長度在2個胺基酸殘基與10個胺基酸殘基之間，且可形成CAR之跨膜結構域與胞質區之間之連接。適宜連接體之非限制性實例係甘胺酸-絲胺酸雙聯體。在一些實施例中，連接體包含GGCKJSGGCKJS (SEQ ID NO: 208)之胺基酸序列。
在一些態樣中，跨膜結構域進一步包含相同蛋白之至少一部分細胞外結構域。 細胞內傳訊結構域
在一些實施例中，本揭示案之CAR (例如，本文所述之EMCN特異性CAR、FLT3特異性CAR及/或CD33特異性CAR)包含一或多個細胞質結構域或區域。CAR之細胞質結構域或區域可包括細胞內傳訊結構域。
可用於本揭示案之CAR中之適宜細胞內傳訊結構域之實例包括但不限於T細胞受體(TCR)及在抗原受體接合後協同起作用以調節信號轉導之共受體的細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變異體及具有相同功能性能力之任何重組序列。
不希望受理論束縛，據信藉助單獨TCR生成之信號不足以完全活化T細胞，且因此完全活化通常亦需要二級及/或共刺激信號。因此，T細胞活化可藉由兩類不同的細胞質傳訊序列來介導：經由TCR (初級細胞內傳訊結構域)起始抗原依賴性初級活化之彼等，及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或共刺激信號(二級細胞質結構域，例如共刺激結構域)之彼等。另外，T細胞傳訊及功能(例如，活化傳訊級聯)可藉助細胞內抑制性共傳訊結構域，由存在於T細胞中之抑制性受體負調控。
在一些實施例中，本揭示案之CAR之細胞內傳訊結構域可包括抑制性細胞內傳訊結構域。可使用的抑制性細胞內結構域之實例包括PD-1、CTLA4、TIGIT、BTLA及LIR-1 (LILRB1)、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、SLAP1、SLAP2、Dok-1、Dok-2、LAIR1、GRB-2、CD200R、SIRPα、HAVR、GITR、PD-L1、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。 表 10及 表 11分別提供例示性抑制性細胞內傳訊結構域之胺基酸及核苷酸序列。在一些實施例中，抑制性細胞內傳訊結構域包括一或多個細胞內抑制性共傳訊結構域(例如，參見 表 10及 表 11)。在一些實施例中，一或多個細胞內抑制性共傳訊結構域藉助肽連接體(例如，參見 表 6)或間隔物或鉸鏈序列(例如，參見 表 7 及表 8)連接至其他結構域(例如，跨膜結構域)。在一些實施例中，當存在兩個或更多個細胞內抑制性共傳訊結構域時，兩個或更多個細胞內抑制性共傳訊結構域可藉助肽連接體(例如，參見 表 6)或間隔物或鉸鏈序列(例如，參見 表 7 及表 8)連接。在一些實施例中，細胞內抑制性共傳訊結構域係抑制性結構域。在一些實施例中，嵌合蛋白之一或多個細胞內抑制性共傳訊結構域包含一或多個含ITIM之蛋白或其片段。ITIM係見於許多抑制性免疫受體之細胞質尾部中之保守胺基酸序列。含ITIM之蛋白之實例包括但不限於PD-1、TIGIT、BTLA及LIR-1 (LILRB1)、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、LAIR1、SIRPα、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。 表 10 - 例示性抑制性細胞內傳訊結構域胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 說明
CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL 435 PD-1細胞內傳訊結構域
AVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN 436 CTLA4細胞內傳訊結構域
RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS 437 BTLA細胞內傳訊結構域
LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH 285 LIR1細胞內傳訊結構域
HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP 438 KIR3DL1細胞內傳訊結構域
AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN 439 CTLA4細胞內傳訊結構域
KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM 440 NKG2A (反向)細胞內傳訊結構域
LTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG 441 TIGIT細胞內傳訊結構域
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK 442 NKG2A細胞內傳訊結構域
MEAIAKYDFKATADDELSFKRGDILKVLNEECDQNWYKAELNGKDGFIPKNYIEMKPHPWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIEQVPQQPTYVQALFDFDPQEDGELGFRRGDFIHVMDNSDPNWWKGACHGQTGMFPRNYVTPVNRNV 443 GRB2細胞內傳訊結構域
MDGAVMEGPLFLQSQRFGTKRWRKTWAVLYPASPHGVARLEFFDHKGSSSGGGRGSSRRLDCKVIRLAECVSVAPVTVETPPEPGATAFRLDTAQRSHLLAADAPSSAAWVQTLCRNAFPKGSWTLAPTDNPPKLSALEMLENSLYSPTWEGSQFWVTVQRTEAAERCGLHGSYVLRVEAERLTLLTVGAQSQILEPLLSWPYTLLRRYGRDKVMFSFEAGRRCPSGPGTFTFQTAQGNDIFQAVETAIHRQKAQGKAGQGHDVLRADSHEGEVAEGKLPSPPGPQELLDSPPALYAEPLDSLRIAPCPSQDSLYSDPLDSTSAQAGEGVQRKKPLYWDLYEHAQQQLLKAKLTDPKEDPIYDEPEGLAPVPPQGLYDLPREPKDAWWCQARVKEEGYELPYNPATDDYAVPPPRSTKPLLAPKPQGPAFPEPGTATGSGIKSHNSALYSQVQKSGASGSWDCGLSRVGTDKTGVKSEGST 444 Dok-1細胞內傳訊結構域
MGDGAVKQGFLYLQQQQTFGKKWRRFGASLYGGSDCALARLELQEGPEKPRRCEAARKVIRLSDCLRVAEAGGEASSPRDTSAFFLETKERLYLLAAPAAERGDWVQAICLLAFPGQRKELSGPEGKQSRPCMEENELYSSAVTVGPHKEFAVTMRPTEASERCHLRGSYTLRAGESALELWGGPEPGTQLYDWPYRFLRRFGRDKVTFSFEAGRRCVSGEGNFEFETRQGNEIFLALEEAISAQKNAAPATPQPQPATIPASLPRPDSPYSRPHDSLPPPSPTTPVPAPRPRGQEGEYAVPFDAVARSLGKNFRGILAVPPQLLADPLYDSIEETLPPRPDHIYDEPEGVAALSLYDSPQEPRGEAWRRQATADRDPAGLQHVQPAGQDFSASGWQPGTEYDNVVLKKGPK 448 Dok-2細胞內傳訊結構域
PAPAERPLPNPEGLDSDFLAVLSDYPSPDISPPIFRRGEKLRVISDEGGWWKAISLSTGRESYIPGICVARVYHGWLFEGLGRDKAEELLQLPDTKVGSFMIRESETKKGFYSLSVRHRQVKHYRIFRLPNNWYYISPRLTFQCLEDLVNHYSEVADGLCCVLTTPCLTQSTAAPAVRASSSPVTLRQKTVDWRRVSRLQEDPEGTENPLGVDESLFSYGLRESIASYLSLTSEDNTSFDRKKKSISLMYGGSKRKSSFFSSPPYFED 446 SLAP1 aa8-aa276細胞內傳訊結構域
PAPAERPLPNPEGLDSDFLAVLSDYPSPDISPPIFRRGEKLRVISDEGGWWKAISLSTGRESYIPGICVARVYHGWLFEGLGRDKAEELLQLPDTKVGSFMIRESETKKGFYSLSVRHRQVKHYRIFRLPNNWYYISPRLTFQCLEDLVNHYSEVADGLCCVLTTPCLTQSTAAPAVRASSSPVTLRQKTVDWRRVSRLQEDPEGTENPLGVDESLFSYGLRESIASYLSLTSEDNTSF 447 SLAP1 aa8-aa247細胞內傳訊結構域
RKSLPSPSLSSSVQGQGPVTMEAERSKATAVALGSFPAGGPAELSLRLGEPLTIVSEDGDWWTVLSEVSGREYNIPSVHVAKVSHGWLYEGLSREKAEELLLLPGNPGGAFLIRESQTRRGSYSLSVRLSRPASWDRIRHYRIHCLDNGWLYISPRLTFPSLQALVDHYSELADDICCLLKEPCVLQRAGPLPGKDIPLPVTVQRTPLNWKELDSSLLFSEAATGEESLLSEGLRESLSFYISLNDEAVSLDDA 448 SLAP2 aa8-aa261細胞內傳訊結構域
KVNGCRKYKLNKTESTPVVEEDEMQPYASYTEKNNPLYDTTNKVKASEALQSEVDTDLHTL 449 CD200R細胞內傳訊結構域
RIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK 450 SIRPα細胞內傳訊結構域
HRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP 451 KIR2DL1細胞內傳訊結構域
MTDSVIYSMLELPTATQAQNDYGPQQKSSSSRPSCSCLGSG 452 KLRG1細胞內傳訊結構域
HRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH 453 LAIR1細胞內傳訊結構域
LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQPEDGVEMDTRAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH 454 LIR2細胞內傳訊結構域
RRQRHSKHRTSDQRKTDFQRPAGAAETEPKDRGLLRRSSPAADVQEENLYAAVKDTQSEDRVELDSQSPHDEDPQAVTYAPVKHSSPRREMASPPSSLSGEFLDTKDRQVEEDRQMDTEAAASEASQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEGEPPAEPSIYATLAIH 455 LIR3細胞內傳訊結構域
QHWRQGKHRTLAQRQADFQRPPGAAEPEPKDGGLQRRSSPAADVQGENFCAAVKNTQPEDGVEMDTRQSPHDEDPQAVTYAKVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSFTLRQKATEPPPSQEGASPAEPSVYATLAIH 456 LIR5細胞內傳訊結構域
KLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH 457 SIGLEC-2細胞內傳訊結構域
KILPKRRTQTETPRPRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQKATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQYQLPSFPEPKSSTQAPESQESQEELHYATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEVKFQ 458 SIGLEC-10細胞內傳訊結構域
表 11 - 例示性抑制性細胞內傳訊結構域核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 說明
TGTAGCAGAGCCGCCAGAGGAACAATCGGCGCCAGAAGAACAGGCCAGCCTCTGAAAGAGGACCCCTCTGCCGTTCCTGTGTTCAGCGTGGACTATGGCGAGCTGGATTTCCAGTGGCGGGAAAAGACACCCGAGCCTCCAGTGCCTTGTGTGCCTGAGCAGACAGAGTACGCCACCATCGTGTTCCCTAGCGGCATGGGCACATCTAGCCCTGCCAGAAGAGGATCTGCCGACGGACCTAGATCTGCCCAGCCTCTTAGACCTGAGGACGGCCACTGTTCTTGGCCTCTT 459 PD-1細胞內傳訊結構域
TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG 460 PD-1細胞內傳訊結構域
GCCGTGTCTCTGAGCAAGATGCTGAAGAAGCGGAGCCCTCTGACCACCGGCGTGTACGTGAAAATGCCTCCTACCGAGCCTGAGTGCGAGAAGCAGTTCCAGCCTTACTTCATCCCCATCAAC 461 CTLA4細胞內傳訊結構域
AGGAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT 462 BTLA細胞內傳訊結構域
AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT 463 BTLA細胞內傳訊結構域
AGAAGGCACCAGGGAAAGCAGAACGAGCTGAGCGATACCGCCGGCAGAGAAATCAACCTGGTGGACGCCCACCTGAAAAGCGAGCAGACAGAGGCCAGCACCAGACAGAATAGCCAGGTGCTGCTGAGCGAGACAGGCATCTACGACAACGACCCCGACCTGTGCTTCCGGATGCAAGAGGGAAGCGAGGTGTACAGCAACCCCTGCCTGGAAGAGAACAAGCCCGGCATCGTGTACGCTAGCCTGAACCACTCTGTGATCGGCCCCAATTCCAGACTGGCCCGGAACGTGAAAGAGGCCCCTACAGAGTACGCCAGCATCTGCGTCAGAAGC 464 BTLA細胞內傳訊結構域
TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC 465 LIR1細胞內傳訊結構域
CTGCGGCACAGACGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACACAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCACCCTGCTGGTGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATATGCCGAAGTGAAGCACTCCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGATAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCATCTGAGGCCCCACAGGATGTGACTTATGCCCAGCTGCACAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCCCATCTCCAGCCGTGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATCCAC 466 LIR1細胞內傳訊結構域
GCCGTGTCACTTAGTAAGATGCTGAAGAAGAGGTCACCACTGACGACAGGGGTTGGAGTGAAGATGCCACCCACAGAACCCGAATGTGAGAAGCAATTCCAGCCTTATTTCATTCCAATAAAT 467 CTLA4細胞內傳訊結構域
CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG 468 KIR3DL1細胞內傳訊結構域
CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGATTTTCAGCACCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCTGCCGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCTGAAGTGAAGCACTCCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGATAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCCTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCCCATCTCCAGCCGTGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATTCAC 469 LIR1細胞內傳訊結構域
AAGGAGCCTGCGTCCCCGTTGGATAAATGCCACTATACTAAGGATAACGGTCAGTTCGATCAGAGTGCAAAGCAACTTAACTTGGAGGCTTACACTATAGAGCAAGAAACAGCGCTGATAAGTAATAAGAACGGTAAGCCAAAGCGACAGCAGAGGAAACCCAATCCTCCGCTTAACTTGGATAGCTACATCGTCGGGCAAAATGACATG 470 NKG2A (反向)細胞內傳訊結構域
CTGACCAGAAAGAAGAAGGCCCTGAGAATCCACAGCGTGGAAGGCGACCTGCGGAGAAAGTCTGCCGGACAAGAAGAGTGGTCCCCTAGCGCTCCATCTCCACCTGGATCTTGTGTGCAGGCCGAAGCAGCTCCTGCTGGACTGTGTGGCGAACAGAGAGGCGAAGATTGCGCCGAGCTGCACGACTACTTCAACGTGCTGAGCTACAGAAGCCTGGGCAACTGCAGCTTCTTCACCGAGACAGGA 471 TIGIT細胞內傳訊結構域
ATGGACAACCAGGGCGTGATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCTAAGCGGCAGCAGAGAAAGCCCAAGGGCAACAAGAACAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGACTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCCGAGAAG 472 NKG2A細胞內傳訊結構域
ATGGACAACCAGGGCGTCATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCAAAGCGGCAGCAGCGGAAGCCCAAGGGCAACAAGAATAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGATTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCTGAGAAA 473 NKG2A細胞內傳訊結構域(經密碼子最佳化)
        
ATGGAAGCCATTGCCAAATACGACTTCAAGGCCACCGCCGACGACGAGCTGAGCTTCAAGAGAGGCGACATCCTGAAGGTGCTGAACGAGGAATGCGACCAGAACTGGTACAAGGCCGAGCTGAACGGCAAGGACGGCTTCATCCCCAAGAACTACATCGAGATGAAGCCCCATCCATGGTTCTTCGGCAAGATCCCCAGAGCCAAGGCCGAAGAGATGCTGAGCAAGCAGAGACACGACGGCGCCTTTCTGATCCGGGAATCTGAATCTGCCCCTGGCGACTTCAGCCTGAGCGTGAAGTTCGGCAACGACGTGCAGCACTTCAAGGTCCTGAGAGATGGCGCCGGAAAGTACTTCCTGTGGGTCGTGAAGTTTAACAGCCTGAACGAGCTGGTGGACTACCACAGATCCACCAGCGTGTCCCGGAACCAGCAGATCTTCCTGCGGGACATCGAACAGGTGCCACAGCAGCCAACATACGTGCAGGCCCTGTTCGACTTCGACCCTCAAGAGGATGGCGAGCTGGGCTTTAGACGGGGCGATTTCATCCACGTGATGGACAACAGCGACCCCAACTGGTGGAAGGGCGCTTGTCATGGACAGACCGGCATGTTCCCCAGAAACTACGTGACCCCTGTGAACCGGAACGTG 474 GRB2細胞內傳訊結構域
ATGGATGGCGCCGTGATGGAAGGCCCTCTGTTTCTCCAGAGCCAGAGATTCGGCACCAAGCGGTGGCGGAAAACATGGGCCGTTCTGTACCCTGCCTCTCCTCATGGCGTGGCCCGGCTGGAATTTTTCGATCACAAGGGCTCTAGCAGCGGCGGAGGCAGAGGATCTAGTAGACGGCTGGACTGCAAAGTGATCCGGCTGGCCGAGTGTGTGTCTGTGGCTCCTGTGACCGTGGAAACCCCTCCTGAACCTGGCGCCACAGCCTTCAGACTGGATACAGCCCAGAGAAGCCATCTGCTGGCCGCCGATGCTCCTTCTTCTGCTGCTTGGGTGCAGACCCTGTGCCGGAACGCTTTTCCTAAAGGCAGCTGGACACTGGCCCCTACCGACAATCCTCCTAAGCTGAGCGCCCTGGAAATGCTGGAAAACAGCCTGTACAGCCCCACCTGGGAGGGCTCTCAGTTTTGGGTCACCGTGCAGAGAACAGAGGCCGCCGAAAGATGTGGCCTGCACGGCTCTTATGTGCTGAGAGTGGAAGCCGAGAGACTGACCCTGCTGACAGTGGGAGCCCAGTCTCAGATCCTGGAACCTCTGCTGAGCTGGCCCTACACACTGCTGAGAAGATACGGCCGGGACAAAGTGATGTTCAGCTTCGAGGCCGGCAGAAGATGTCCTTCTGGCCCTGGCACATTCACATTTCAGACAGCCCAGGGCAACGACATCTTCCAGGCTGTGGAAACCGCCATCCACAGACAGAAGGCCCAGGGAAAAGCCGGCCAGGGACACGATGTTCTGAGAGCCGATTCTCACGAGGGCGAAGTGGCCGAGGGAAAGCTTCCTTCTCCACCTGGACCTCAAGAGCTGCTGGATAGCCCTCCTGCTCTGTATGCCGAGCCTCTGGACAGCCTGAGAATCGCCCCTTGTCCAAGCCAGGACTCTCTGTACAGCGATCCCCTGGATAGCACATCTGCCCAAGCTGGCGAAGGCGTGCAGAGGAAGAAGCCCCTGTACTGGGATCTGTACGAGCACGCTCAGCAGCAACTGCTGAAGGCCAAGCTGACAGACCCCAAAGAGGACCCCATCTACGACGAGCCTGAAGGACTTGCTCCAGTGCCACCTCAGGGCCTGTACGATCTGCCTAGAGAGCCTAAAGACGCCTGGTGGTGTCAGGCCAGAGTGAAAGAGGAAGGCTACGAGCTGCCTTACAACCCCGCCACCGATGATTATGCCGTGCCTCCTCCAAGAAGCACCAAACCACTGCTGGCCCCAAAGCCTCAGGGACCTGCTTTTCCTGAGCCTGGAACAGCCACAGGCAGCGGCATCAAGAGCCACAATAGCGCCCTGTATAGCCAGGTGCAGAAAAGCGGCGCCAGCGGCTCTTGGGATTGTGGACTTAGCAGAGTGGGCACCGACAAGACCGGCGTGAAGTCTGAGGGAAGCACA 475 Dok-1細胞內傳訊結構域
ATGGGAGATGGCGCCGTGAAGCAGGGCTTTCTGTATCTCCAGCAGCAGCAGACCTTCGGCAAGAAGTGGCGGAGATTTGGCGCCTCTCTGTACGGCGGCTCTGATTGTGCTCTGGCCCGACTGGAACTGCAAGAGGGACCTGAGAAGCCCAGAAGATGCGAGGCCGCCAGAAAAGTGATCCGGCTGAGCGATTGTCTGAGAGTGGCTGAAGCAGGCGGCGAAGCCAGCTCTCCTAGAGATACCAGCGCATTCTTCCTGGAAACAAAAGAGCGGCTGTACCTGCTGGCCGCTCCTGCTGCTGAAAGAGGCGATTGGGTCCAAGCCATCTGCCTGCTGGCTTTTCCCGGCCAGAGAAAAGAGCTGTCTGGCCCTGAGGGCAAGCAGAGCAGGCCTTGCATGGAAGAGAACGAGCTGTACTCCAGCGCCGTGACAGTGGGCCCTCACAAAGAATTTGCCGTGACCATGAGGCCCACCGAGGCCAGCGAAAGATGTCACCTGAGAGGCAGCTACACCCTGAGAGCCGGCGAATCTGCTCTGGAACTTTGGGGAGGACCTGAGCCTGGCACACAGCTGTACGACTGGCCCTACAGATTCCTGCGGAGATTCGGCCGGGACAAAGTGACCTTCAGCTTTGAGGCTGGCCGCAGATGTGTGTCCGGCGAGGGCAATTTCGAGTTCGAGACAAGACAGGGCAACGAGATCTTCCTGGCTCTGGAAGAGGCCATCAGCGCCCAGAAAAATGCTGCCCCTGCTACACCTCAGCCTCAGCCTGCTACAATCCCTGCCTCTCTGCCCAGACCTGACAGCCCTTATAGCAGACCCCACGACTCTCTGCCTCCACCTTCTCCAACAACACCCGTGCCTGCTCCTAGACCTAGAGGACAAGAGGGCGAGTACGCCGTGCCTTTTGATGCCGTGGCTAGAAGCCTGGGCAAGAACTTCAGAGGCATCCTGGCTGTGCCTCCACAGCTGCTGGCTGACCCTCTGTACGACAGCATCGAGGAAACCCTGCCTCCAAGACCTGACCACATCTACGACGAGCCTGAAGGCGTGGCAGCCCTGTCTCTGTATGACTCCCCTCAAGAGCCTAGAGGCGAAGCCTGGCGTAGACAGGCTACCGCCGATAGAGATCCTGCCGGACTGCAACATGTGCAGCCAGCCGGCCAGGATTTTTCTGCCTCTGGATGGCAGCCAGGCACCGAGTACGATAACGTGGTGCTGAAGAAGGGCCCCAAG 476 Dok-2細胞內傳訊結構域
CCAGCCCCAGCGGAGCGACCGCTGCCAAACCCTGAAGGGCTCGACAGTGACTTTTTGGCTGTCCTCTCCGACTATCCTAGTCCCGATATCAGCCCCCCGATATTCAGGCGCGGTGAAAAACTCCGAGTCATCAGCGATGAGGGGGGTTGGTGGAAAGCCATCAGCCTGAGTACCGGACGAGAGTCATACATTCCTGGAATATGTGTAGCGAGGGTGTACCACGGTTGGCTGTTCGAGGGTCTGGGAAGAGATAAGGCCGAGGAACTTCTCCAACTCCCAGATACAAAAGTCGGTAGTTTTATGATTCGGGAAAGTGAAACTAAAAAGGGGTTCTATAGCCTCTCAGTTCGGCATAGGCAGGTCAAGCATTATCGGATATTTCGCTTGCCTAACAACTGGTACTACATAAGTCCCCGACTCACATTCCAATGCCTGGAGGACCTCGTGAATCACTATTCAGAAGTTGCAGATGGCCTCTGCTGCGTACTCACGACACCCTGCCTTACCCAGAGTACAGCGGCCCCGGCTGTTCGGGCATCTTCCAGCCCAGTAACACTCAGGCAAAAAACTGTGGATTGGCGCAGAGTCTCACGCCTTCAGGAAGATCCTGAGGGTACGGAAAATCCGCTCGGTGTGGACGAGTCACTGTTCTCCTATGGCTTGAGGGAATCTATAGCGTCTTACCTTTCCTTGACGTCTGAAGATAATACGTCTTTCGATCGCAAAAAAAAATCAATATCTCTTATGTATGGCGGAAGCAAAAGGAAATCATCATTCTTTTCCTCTCCACCATATTTCGAAGAT 477 SLAP1 aa8-aa276細胞內傳訊結構域
CCAGCCCCAGCGGAGCGACCGCTGCCAAACCCTGAAGGGCTCGACAGTGACTTTTTGGCTGTCCTCTCCGACTATCCTAGTCCCGATATCAGCCCCCCGATATTCAGGCGCGGTGAAAAACTCCGAGTCATCAGCGATGAGGGGGGTTGGTGGAAAGCCATCAGCCTGAGTACCGGACGAGAGTCATACATTCCTGGAATATGTGTAGCGAGGGTGTACCACGGTTGGCTGTTCGAGGGTCTGGGAAGAGATAAGGCCGAGGAACTTCTCCAACTCCCAGATACAAAAGTCGGTAGTTTTATGATTCGGGAAAGTGAAACTAAAAAGGGGTTCTATAGCCTCTCAGTTCGGCATAGGCAGGTCAAGCATTATCGGATATTTCGCTTGCCTAACAACTGGTACTACATAAGTCCCCGACTCACATTCCAATGCCTGGAGGACCTCGTGAATCACTATTCAGAAGTTGCAGATGGCCTCTGCTGCGTACTCACGACACCCTGCCTTACCCAGAGTACAGCGGCCCCGGCTGTTCGGGCATCTTCCAGCCCAGTAACACTCAGGCAAAAAACTGTGGATTGGCGCAGAGTCTCACGCCTTCAGGAAGATCCTGAGGGTACGGAAAATCCGCTCGGTGTGGACGAGTCACTGTTCTCCTATGGCTTGAGGGAATCTATAGCGTCTTACCTTTCCTTGACGTCTGAAGATAATACGTCTTTC 478 SLAP1 aa8-aa247細胞內傳訊結構域
AGAAAATCCCTCCCCAGTCCAAGCCTGTCTAGTAGCGTTCAGGGTCAGGGCCCAGTTACTATGGAAGCGGAACGATCCAAGGCTACCGCAGTTGCTCTGGGTTCATTCCCGGCTGGAGGGCCAGCGGAACTCTCCTTGCGCCTGGGTGAGCCACTTACCATCGTTTCTGAGGACGGAGATTGGTGGACGGTTCTTTCTGAAGTATCTGGGAGAGAATACAACATACCGTCAGTTCATGTCGCAAAAGTTTCACACGGTTGGCTTTACGAGGGACTCAGCAGGGAAAAAGCGGAGGAATTGTTGCTTTTGCCCGGCAATCCTGGCGGAGCATTTTTGATAAGAGAGAGTCAGACCCGGAGAGGCAGTTATTCCCTGTCAGTTAGACTCAGCAGACCTGCGAGTTGGGATAGGATTCGGCACTACAGGATTCACTGCCTTGATAACGGCTGGCTGTATATATCTCCTCGCCTGACATTCCCTAGCCTCCAAGCGTTGGTTGATCATTACTCTGAACTGGCAGACGATATCTGCTGCCTGCTCAAGGAACCGTGCGTCCTCCAGAGGGCAGGCCCACTTCCTGGCAAGGATATTCCACTTCCAGTCACGGTTCAAAGAACCCCCCTCAATTGGAAGGAGCTGGATAGCTCTCTCCTCTTTTCCGAGGCCGCTACAGGTGAAGAATCTCTGTTGTCTGAAGGATTGAGAGAGAGTCTCTCCTTCTACATCTCTCTGAATGATGAAGCAGTGTCATTGGACGACGCA 479 SLAP2 aa8-aa261細胞內傳訊結構域
AAAGTGAACGGCTGCCGGAAGTACAAGCTGAACAAGACCGAGAGCACCCCTGTGGTGGAAGAGGACGAGATGCAGCCTTACGCCAGCTACACCGAGAAGAACAACCCTCTGTACGACACCACCAACAAAGTGAAGGCCAGCGAGGCCCTCCAGAGCGAGGTTGACACAGATCTGCACACCCTG 480 CD200R細胞內傳訊結構域
CACCGGTGGTGCAGCAACAAGAAAAACGCCGCCGTGATGGACCAAGAGAGCGCCGGAAATAGAACCGCCAACAGCGAGGATAGCGACGAGCAGGACCCTCAAGAAGTGACCTACACACAGCTGAACCACTGCGTGTTCACCCAGCGGAAGATCACCAGACCTAGCCAGCGGCCTAAGACACCACCTACCGACATCATCGTGTACACCGAGCTGCCCAACGCCGAGAGCAGATCCAAGGTCGTGTCCTGTCCT 481 KIR2DL1細胞內傳訊結構域
ATGACCGACAGCGTGATCTACAGCATGCTCGAGCTGCCTACAGCCACACAGGCCCAGAATGATTACGGCCCTCAGCAGAAGTCCAGCTCCAGCAGACCTAGCTGTAGCTGTCTTGGCTCCGGC 482 KLRG1細胞內傳訊結構域
CACCGGCAGAACCAGATCAAGCAGGGCCCTCCTAGAAGCAAGGACGAGGAACAGAAGCCTCAGCAGAGGCCTGATCTGGCCGTGGACGTGCTGGAAAGAACAGCCGATAAGGCCACCGTGAACGGCCTGCCTGAGAAGGACAGAGAGACAGACACATCTGCCCTGGCCGCTGGCAGCTCCCAAGAAGTGACATACGCCCAGCTGGACCACTGGGCCCTGACACAGAGAACTGCCAGAGCTGTGTCCCCTCAGAGCACCAAACCTATGGCCGAGAGCATCACCTATGCCGCCGTGGCCAGACAT 483 LAIR1細胞內傳訊結構域
CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGATTTTCAGCACCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCTGCCGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGGACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGAGCCGCCGCATCTGAAGCCCCTCAGGATGTGACATACGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGAGGCGGAAAGCCACAGAGCCTCCACCTAGCCAAGAGAGAGAGCCTCCTGCCGAGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATTCAC 484 LIR2細胞內傳訊結構域
CGGAGACAGAGACACAGCAAGCACAGAACCAGCGACCAGAGAAAGACCGACTTCCAGAGGCCTGCTGGCGCCGCTGAGACAGAGCCTAAAGATAGAGGACTGCTGCGGAGAAGCAGCCCTGCTGCCGATGTGCAAGAGGAAAATCTGTACGCCGCCGTGAAGGACACCCAGAGCGAGGATAGAGTGGAACTGGACAGCCAGTCTCCTCACGACGAAGATCCTCAGGCCGTGACATACGCCCCTGTGAAGCACAGCAGCCCTCGGAGAGAAATGGCCTCTCCACCTTCTAGCCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGACAGACAGGTGGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCCTCTGAAGCCAGCCAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGCGGAAAGCTACAGAGCCTCCTCCATCTCAAGAGGGCGAGCCTCCAGCCGAGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATTCAC 485 LIR3細胞內傳訊結構域
CAGCATTGGAGACAGGGAAAGCACAGAACACTGGCCCAGCGGCAGGCCGATTTCCAAAGACCTCCAGGTGCCGCCGAACCTGAGCCTAAAGATGGTGGCCTGCAGCGGAGATCTTCTCCTGCTGCCGATGTGCAGGGCGAGAATTTTTGTGCCGCCGTGAAGAACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGACAGAGCCCTCACGACGAGGATCCACAGGCCGTGACATACGCCAAAGTGAAGCACAGCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCCTCTGAAGCCCCTCAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCTTCACCCTGCGGCAGAAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCGCTTCTCCAGCCGAGCCATCTGTGTATGCCACACTGGCCATTCAC 486 LIR5細胞內傳訊結構域
AAGCTGCAGCGGAGATGGAAGAGAACACAGAGCCAGCAGGGCCTGCAAGAGAATAGCAGCGGCCAGAGCTTCTTCGTGCGGAACAAGAAAGTGCGGAGAGCCCCTCTGTCTGAGGGACCTCATAGCCTGGGCTGTTACAACCCCATGATGGAAGATGGCATCAGCTACACCACACTGCGGTTCCCCGAGATGAACATCCCTAGAACAGGCGACGCCGAGAGCAGCGAAATGCAAAGACCTCCTCCTGACTGCGACGACACCGTGACATATAGCGCCCTGCACAAGAGACAAGTGGGCGACTACGAGAACGTGATCCCTGACTTCCCTGAGGACGAGGGCATCCACTACAGCGAGCTGATCCAGTTTGGCGTGGGCGAAAGACCCCAGGCTCAAGAGAATGTGGACTACGTGATCCTGAAGCAC 487 SIGLEC-2細胞內傳訊結構域
AAGATCCTGCCTAAGCGGCGCACCCAGACCGAGACTCCTAGACCTAGATTCAGCCGGCACAGCACCATCCTGGACTACATCAACGTGGTGCCTACCGCCGGACCACTGGCTCAGAAGAGAAACCAGAAGGCCACACCTAACAGCCCCAGAACACCTCTTCCACCTGGCGCACCTTCTCCAGAGAGCAAGAAGAACCAGAAGAAGCAGTACCAGCTGCCTAGCTTCCCCGAGCCTAAGAGCAGTACACAGGCCCCTGAGAGCCAAGAGTCCCAAGAGGAACTGCACTACGCCACACTGAACTTCCCCGGCGTCAGACCTAGACCTGAGGCCAGAATGCCTAAGGGCACCCAGGCCGATTACGCCGAAGTGAAGTTTCAA 488 SIGLEC-10細胞內傳訊結構域
在一些實施例中，iCAR包括LIR1細胞內抑制性結構域。在一些實施例中，iCAR包括具有胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAV GPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 285)之LIR1細胞內抑制性結構域。在一些實施例中，iCAR包括由包含序列CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)之多核苷酸序列編碼之LIR1細胞內抑制性結構域。在一些實施例中，iCAR包括由與CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之LIR1細胞內抑制性結構域。
在一些實施例中，一或多個細胞內抑制性共傳訊結構域包含一或多個非ITIM支架蛋白或其片段。在一些實施例中，一或多個非ITIM支架蛋白或其片段係選自Grb-2、Dok-1、Dok-2、SLAP、LAG3、HAVR、GITR及PD-L1。
抑制性細胞內傳訊結構域可進一步包括酶促抑制性結構域。在一些實施例中，酶促抑制性結構域包含酶催化結構域。在一些實施例中，酶催化結構域源自選自由以下組成之群之酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。傳訊之酶促調控之實例更詳細地闡述於Pavel Otáhal等人(Biochim Biophys Acta. 2011年2月；1813(2):367-76)、Kosugi A.等人(Involvement of SHP-1 tyrosine phosphatase in TCR-mediated signaling pathways in lipid rafts, Immunity，2001年6月；14(6): 669-80)及Stanford等人(Regulation of TCR signaling by tyrosine phosphatases: from immune homeostasis to autoimmunity, Immunology，2012年9月；137(1): 1-19)中，該等文獻中之每一者出於所有目的以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，本揭示案之CAR之細胞內傳訊結構域可包含以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初級活化的初級傳訊結構域。以刺激方式起作用之初級細胞內傳訊結構域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)之傳訊模體。可用於本揭示案之CAR中之適宜的含ITAM之初級細胞內傳訊結構域之實例包括但不限於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之彼等。
在一些實施例中，本揭示案之CAR包含細胞內傳訊結構域，例如CD3ζ多肽之初級傳訊結構域。本揭示案之CD3ζ多肽可具有與NCBI參考號NP_932170或NP_001106864.2之序列或其片段至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ多肽可包含一個保守胺基酸取代、至多兩個保守胺基酸取代或至多三個保守胺基酸取代。在一些實施例中，多肽可具有作為NCBI參考號NP_932170或NP_001106864.2之連續部分之胺基酸序列，該胺基酸序列之長度為至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少110個、至少120個、至少130個、至少140個、至少150個、或至少160個、至少170個或至少180個胺基酸。
在其他實施例中，初級傳訊結構域包含經修飾之ITAM結構域，例如與天然ITAM結構域相比具有改變(例如，增加或降低)之活性之突變ITAM結構域。在一個實施例中，初級傳訊結構域包含經修飾之含有ITAM之初級細胞內傳訊結構域，例如，經最佳化及/或截短的含有ITAM之初級細胞內傳訊結構域。在一個實施例中，初級傳訊結構域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM模體。
在一些實施例中，本揭示案之CAR之細胞內傳訊結構域可包含CD3ζ傳訊結構域本身，或者其可與可用於本揭示案之CAR之背景下之任何一或多個其他期望細胞內傳訊結構域組合。舉例而言，CAR之細胞內傳訊結構域可包含CD3ζ鏈部分及共刺激傳訊結構域。共刺激傳訊結構域可係指包含共刺激分子之細胞內結構域之CAR部分。本揭示案之共刺激分子係淋巴球有效因應抗原可能需要的除抗原受體或其配位體之外之細胞表面分子。適宜共刺激分子之實例包括但不限於CD97、CD2、ICOS、CD27、CD154、CD8、OX40、4-1BB、CD28、ZAP40、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、MyD88、2B4、CD40、PD-1、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴球活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、CDS、ICAM-1、(CD11a/CD18)、BAFFR、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及諸如此類。
在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括CD28共刺激結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括具有胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 287)之CD28共刺激結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括由包含序列AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)之多核苷酸序列編碼之CD28共刺激結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括由與AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之CD28共刺激結構域。
在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括CD3ζ傳訊結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括具有胺基酸序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)之CD3ζ傳訊結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括由具有序列AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)之多核苷酸序列編碼之CD3ζ傳訊結構域。在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括由與AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼之CD3ζ傳訊結構域。
在一些實施例中，aCAR細胞內傳訊結構域包括CD28共刺激結構域及CD3ζ傳訊結構域。在一些實施例中，aCAR傳訊結構域包括具有胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 287)之CD28共刺激結構域及具有胺基酸序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)之CD3ζ傳訊結構域。
在一些實施例中，本揭示案之CAR之細胞質部分內之細胞內傳訊序列可以隨機或指定順序彼此連接。在一些實施例中，例如長度在2個胺基酸與10個胺基酸之間(例如，2個胺基酸、3個胺基酸、4個胺基酸、5個胺基酸、6個胺基酸、7個胺基酸、8個胺基酸、9個胺基酸或10個胺基酸)之短寡肽或多肽連接體可形成細胞內傳訊序列之間之連接。在一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可用作適宜連接體。在一個實施例中，單一胺基酸(例如，丙胺酸或甘胺酸)可用作適宜連接體。
在一些實施例中，細胞內傳訊結構域包含兩個或更多個共刺激傳訊結構域，例如，兩個共刺激傳訊結構域、三個共刺激傳訊結構域、四個共刺激傳訊結構域、五個共刺激傳訊結構域、六個共刺激傳訊結構域、七個共刺激傳訊結構域、八個共刺激傳訊結構域、九個共刺激傳訊結構域、10個共刺激傳訊結構域或更多個共刺激傳訊結構域。在一個實施例中，細胞內傳訊結構域包含兩個共刺激傳訊結構域。在一些實施例中，兩個或更多個共刺激傳訊結構域係由本揭示案之連接體(例如，闡述於 表 6中之任何連接體)隔開。在一個實施例中，連接體係甘胺酸殘基。在另一實施例中，連接體係丙胺酸殘基。
在一些實施例中，本揭示案之細胞表現CAR，該CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域、初級傳訊結構域及一或多個共刺激傳訊結構域。
在一些實施例中，跨膜結構域源自與一或多個細胞內傳訊結構域中之一者相同的蛋白。在一些實施例中，CAR係抑制性CAR且包括跨膜結構域及至少一個細胞內抑制性共傳訊結構域，各自源自選自以下之蛋白：PD-1、CTLA4、TIGIT、BTLA及LIR1 (LILRB1)、TIM3、KIR3DL1、NKG2A、LAG3、SLAP1、SLAP2、Dok-1、Dok-2、LAIR1、GRB-2、CD200R、SIRPα、HAVR、GITR、PD-L1、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、CD94、KLRG-1、CEACAM1、LIR2、LIR3、LIR5、SIGLEC-2及SIGLEC-10。
在一些實施例中，跨膜結構域源自第一蛋白，且一或多個細胞內傳訊結構域源自與第一蛋白不同之第二蛋白。 自然殺手細胞受體 (NKR) CAR
在一些實施例中，本揭示案之CAR包含自然殺手細胞受體(NKR)之一或多種組分，由此形成NKR-CAR。NKR組分可為來自任何適宜自然殺手細胞受體之跨膜結構域、鉸鏈結構域或細胞質結構域，該自然殺手細胞受體包括但不限於殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，諸如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及KIRS DPI；自然細胞毒性受體(NCR)，諸如NKp30、NKp44、NKp46；免疫細胞受體之傳訊淋巴球活化分子(SLAM)家族，諸如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及CD2F-10；Fc受體(FcR)，諸如CD16及CD64；及Ly49受體，諸如LY49A及LY49C。在一些實施例中，NKR-CAR可與銜接分子或細胞內傳訊結構域(諸如DAP12)相互作用。包含NKR組分之CAR之例示性構形及序列闡述於2014年9月18日公開之國際專利公開案WO2014/145252中。 免疫反應性細胞
本揭示案之某些態樣係關於細胞，諸如免疫反應性細胞，其已經遺傳工程改造以包含本揭示案之一或多種嵌合受體或一或多種編碼該等嵌合受體之核酸，且係關於使用該等細胞治療骨髓惡性腫瘤(例如，AML)之方法。
在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞係原代細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞係細胞株。在一些實施例中，哺乳動物細胞係骨髓細胞、血細胞、皮膚細胞、骨細胞、肌細胞、神經元細胞、脂肪細胞、肝細胞或心臟細胞。在一些實施例中，細胞係幹細胞。例示性幹細胞包括但不限於胚胎幹細胞(ESC)、誘導性富潛能幹細胞(iPSC)、成體幹細胞及組織特異性幹細胞，諸如造血幹細胞(血液幹細胞)、間質幹細胞(MSC)、神經幹細胞、上皮幹細胞或皮膚幹細胞。在一些實施例中，細胞係自本揭示案之幹細胞衍生或分化之細胞。在一些實施例中，細胞係免疫細胞。本揭示案之免疫細胞可自本揭示案之幹細胞(例如，自ESC或iPSC)分離或分化。例示性免疫細胞包括但不限於T細胞(例如，輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調控性T細胞、自然殺手T細胞、αβT細胞及γδT細胞)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突細胞、骨髓細胞、巨噬細胞及單核球。在一些實施例中，細胞係神經元細胞。本揭示案之神經元細胞可自本揭示案之幹細胞(例如，自ESC或iPSC)分離或分化。例示性神經元細胞包括但不限於神經前驅細胞、神經元(例如感覺神經元、運動神經元、膽鹼能神經元、GABA能神經元、麩胺酸能神經元、多巴胺能神經元或血清基能神經元)、星狀細胞、寡樹突細胞及小神經膠質細胞。
在一些實施例中，細胞係免疫反應性細胞。本揭示案之免疫反應性細胞可自本揭示案之幹細胞(例如，自ESC或iPSC)分離或分化。本揭示案之例示性免疫反應性細胞包括但不限於淋巴譜系之細胞。包含B細胞、T細胞及自然殺手(NK)細胞之淋巴譜系提供抗體之產生、細胞免疫系統之調控、血液中外來物質之偵測、宿主外來細胞之偵測及諸如此類。淋巴譜系之免疫反應性細胞之實例包括但不限於T細胞、自然殺手(NK)細胞、胚胎幹細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞(例如，可衍生或分化淋巴樣細胞之彼等)。T細胞可為在胸腺中成熟之淋巴球，且主要負責細胞介導之免疫。T細胞參與適應性免疫系統。在一些實施例中，本揭示案之T細胞可為任何類型之T細胞，包括但不限於T輔助細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞(包括中央記憶T細胞、幹細胞樣記憶T細胞(stem-cell-like memory T cell或stem-like memory T cell)及兩種類型之效應記憶T細胞：例如T EM細胞及T EMRA細胞)、調控性T細胞(亦稱為抑制性T細胞)、自然殺手T細胞、黏膜相關恆定T細胞及γδ T細胞。細胞毒性T細胞(CTL或殺手T細胞)係能夠誘導受感染體細胞或腫瘤細胞死亡之T淋巴球子集。可藉助引入一或多種嵌合受體，諸如嵌合TCR或CAR，對患者自身之T細胞實施遺傳修飾以靶向特定抗原。
自然殺手(NK)細胞可為作為細胞介導免疫一部分且在先天免疫反應期間起作用之淋巴球。NK細胞無需預先活化以對靶細胞發揮其細胞毒性作用。
在一些實施例中，本揭示案之免疫反應性細胞係T細胞。本揭示案之T細胞可為自體的，同種異體的或活體外源自經工程改造之前驅細胞或幹細胞。
在一些實施例中，本揭示案之免疫反應性細胞係具有缺乏型TCR-αβ之通用T細胞。開發通用T細胞之方法闡述於此項技術中，例如，闡述於Valton等人，Molecular Therapy (2015)；23 9, 1507-1518及Torikai等人，Blood 2012 119:5697-5705中。
在一些實施例中，本揭示案之免疫反應性細胞係包含一或多種本揭示案之嵌合受體之經分離免疫反應性細胞。在一些實施例中，免疫反應性細胞包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種或者十種或更多種本揭示案之嵌合受體。
在一些實施例中，免疫反應性細胞係T細胞。在一些實施例中，免疫反應性細胞係自然殺手(NK)細胞。
在一些實施例中，免疫反應性細胞表現或能夠表現免疫受體。免疫受體通常能夠誘導表現免疫受體之細胞中之信號轉導或蛋白表現之變化，此導致在結合至同源配位體後對免疫反應之調節(例如，調控、活化、起始、刺激、增加、預防、減弱、抑制、減少、降低、抑制或阻制免疫反應)。舉例而言，當CD3鏈因應配位體結合而存在於TCR/CAR簇中時，產生基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)介導之信號轉導級聯。特定而言，在某些實施例中，當內源性TCR、外源性TCR、嵌合TCR或CAR (特定而言活化性CAR)結合其各別抗原時，發生免疫突觸之形成，該免疫突觸包括經結合受體附近之許多分子(例如，CD4或CD8，CD3γ/δ/ε/ζ等)之成簇。膜結合傳訊分子之該成簇容許CD3鏈內所含ITAM模體變得磷酸化，此進而可起始T細胞活化路徑且最終活化轉錄因子，諸如NF-κB及AP-1。該等轉錄因子能夠誘導T細胞之全域基因表現，以增加IL-2產生，用於主調控物T細胞蛋白之增殖及表現，以便起始T細胞介導之免疫反應，諸如細胞介素產生及/或T細胞介導之殺傷。 表現多種嵌合受體之細胞
在一些實施例中，本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)包含兩種或更多種本揭示案之嵌合受體。在一些實施例中，細胞包含兩種或更多種嵌合受體，其中兩種或更多種嵌合受體中之一種係嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含三種或更多種嵌合受體，其中三種或更多種嵌合受體中之至少一種係嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含四種或更多種嵌合受體，其中四種或更多種嵌合受體中之至少一種係嵌合抑制性受體。在一些實施例中，細胞包含五種或更多種嵌合受體，其中五種或更多種嵌合受體中之至少一種係嵌合抑制性受體。
在一些實施例中，兩種或更多種嵌合受體中之每一種包含例如結合至相同抗原或不同抗原之不同抗原結合結構域。在一些實施例中，由兩種或更多種嵌合受體結合之每一抗原在相同細胞(諸如骨髓細胞類型(例如，相同AML細胞類型))上表現。在一些實施例中，由兩種或更多種嵌合受體結合之每一抗原係AML相關抗原(例如，FLT3、CD33、CD123、CLEC12A、CXCR4、EphA3等)。
在本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)表現兩種或更多種不同嵌合受體之實施例中，可設計每種不同嵌合受體之抗原結合結構域，使得抗原結合結構域彼此不相互作用。舉例而言，表現第一嵌合受體(例如，EMCN特異性嵌合受體)及第二嵌合受體之本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)可包含第一嵌合受體，該第一嵌合受體包含不與第二嵌合受體之抗原結合結構域形成締合之抗原結合結構域。舉例而言，第一嵌合受體之抗原結合結構域可包含抗體片段，諸如scFv，而第二嵌合受體之抗原結合結構域可包含VHH。
不希望受理論束縛，據信在具有複數種各自包含抗原結合結構域之嵌合膜嵌入受體之細胞中，每種受體之抗原結合結構域之間之相互作用可能係不期望的，此乃因該等相互作用可能抑制一或多個抗原結合結構域結合其同源抗原之能力。因此，在本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)表現兩種或更多種嵌合受體之實施例中，嵌合受體包含使該等抑制性相互作用最小化之抗原結合結構域。在一個實施例中，一種嵌合受體之抗原結合結構域包含scFv，且第二種嵌合受體之抗原結合結構域包含單一VH結構域，例如駱駝科動物、鯊魚或八目鰻單一VH結構域，或源自人類或小鼠序列之單一VH結構域。
在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一嵌合受體之抗原結合結構域與其同源抗原之結合實質上不因第二嵌合受體之存在而降低。在一些實施例中，在第二嵌合受體存在下第一嵌合受體之抗原結合結構域與其同源抗原之結合係在第二嵌合受體缺失下第一嵌合受體之抗原結合結構域與其同源抗原之結合之85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一嵌合受體及第二嵌合受體之抗原結合結構域彼此締合之程度小於二者皆為scFv抗原結合結構域時。在一些實施例中，第一嵌合受體及第二嵌合受體之抗原結合結構域彼此締合之程度比二者皆為scFv抗原結合結構域時小85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。 嵌合抑制性受體
在一些實施例中，本揭示案之細胞(例如免疫反應性細胞)包含一或多種本揭示案之嵌合抑制性受體。在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體中之每一種包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域結合通常在正常細胞(例如，通常認為健康之細胞)上但不在腫瘤細胞(諸如AML細胞)上表現之抗原。在一些實施例中，嵌合抑制性受體包括結合EMCN之抗原結合結構域(例如，具有 表 1中所列出之一或多種胺基酸序列之EMCN特異性抗原結合結構域)。
在一些實施例中，一或多種嵌合抑制性受體結合在源自選自由以下組成之群之組織之非腫瘤細胞上表現的抗原：腦、神經元組織、內分泌、骨、骨髓、免疫系統、內皮組織、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體(例如，EMCN特異性嵌合抑制性受體)可例如與在本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)上表現之一或多種活化性嵌合受體(例如，活化性嵌合TCR或CAR)一起用作非邏輯閘，以控制、調節或以其他方式抑制一或多種活化性嵌合受體之一或多種活性。在一些實施例中，本揭示案之嵌合抑制性受體可抑制本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)之一或多種活性。
在一些實施例中，本揭示案之細胞包含本揭示案之一或多種嵌合抑制性受體且進一步包含結合至一或多種腫瘤相關抗原之腫瘤靶向性嵌合受體。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括AML相關抗原。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括CD33。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括FLT3。在一些實施例中，一或多種腫瘤相關抗原包括CD33及FLT3。 共刺激配位體
在一些實施例中，本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)可進一步包括一或多種重組或外源性共刺激配位體。舉例而言，可用一或多種共刺激配位體進一步轉導細胞，使得細胞共表現或經誘導以共表現本揭示案之一或多種嵌合受體(例如，本文所述之EMCN特異性CAR、FLT3特異性CAR及/或CD33特異性CAR)及一或多種共刺激配位體。不希望受理論束縛，據信一或多種嵌合受體與一或多種共刺激配位體之間之相互作用可提供對於細胞之完全活化而言重要之非抗原特異性信號。適宜共刺激配位體之實例包括但不限於腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員及免疫球蛋白(Ig)超家族配位體。TNF係參與全身發炎之細胞介素且刺激急性期反應。其主要作用係調控免疫細胞。TNF超家族成員共有許多共同特徵。大多數TNF超家族成員合成為含有短細胞質區段及相對長之細胞外區域之II型跨膜蛋白(細胞外C末端)。適宜TNF超家族成員之實例包括但不限於神經生長因子(NGF)、CD40L (CD40L)/CD 154、CD137L/4-1BBL、TNF-a、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配位體(FasL)、CD30L/CD153、腫瘤壞死因子β (TNFP)/淋巴毒素-α (LTa)、淋巴毒素-β (LTP)、CD257/B細胞活化因子(B AFF)/Bly s/THANK/Tall- 1、糖皮質激素誘導性TNF受體配位體(GITRL)及TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL)、LIGHT (TNFSF 14)。免疫球蛋白(Ig)超家族係參與細胞之識別、結合或黏附過程的一大群細胞表面及可溶性蛋白。該等蛋白與免疫球蛋白共有結構特徵且具有免疫球蛋白結構域(摺疊)。適宜免疫球蛋白超家族配位體之實例包括但不限於CD80及CD86 (二者皆為CD28之配位體)、PD-L1/(B7-H1) (PD-1之配位體)。在某些實施例中，一或多種共刺激配位體係選自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14、PD-L1及其組合。 趨化介素受體
在一些實施例中，本揭示案之細胞(例如，免疫反應性細胞)包含一或多種嵌合受體(例如，本文所述之EMCN特異性CAR、FLT3特異性CAR及/或CD33特異性CAR)，且可進一步包括一或多種趨化介素受體。舉例而言，趨化介素受體CCR2b或CXCR2在細胞(諸如T細胞)中之基因轉殖表現增強向分泌CCL2或分泌CXCL1之實體瘤之轉運(Craddock等人，J Immunother. 2010年10月；33(8):780-8及Kershaw等人，Hum Gene Ther. 2002年11月1日；13(16): 1971-80)。不希望受理論束縛，據信在本揭示案之表現嵌合受體之細胞上表現的趨化介素受體可識別由腫瘤分泌之趨化介素且改良細胞對腫瘤之靶向，此可促進細胞向腫瘤之浸潤且增強細胞之抗腫瘤功效。本揭示案之趨化介素受體可包括天然存在之趨化介素受體、重組趨化介素受體或其趨化介素結合片段。可在本揭示案之細胞上表現的適宜趨化介素受體之實例包括但不限於CXC趨化介素受體，諸如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7；CC趨化介素受體，諸如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11；CX3C趨化介素受體，諸如CX3CR1；XC趨化介素受體，諸如XCR1；及其趨化介素結合片段。在一些實施例中，欲在細胞上表現之趨化介素受體基於由腫瘤分泌之趨化介素來選擇。 嵌合受體調控
本揭示案之一些實施例係關於調控本揭示案之表現嵌合受體(例如，本文所述之EMCN特異性CAR)之細胞的一或多種嵌合受體活性。有若干方式可調控嵌合受體活性。在一些實施例中，可能期望可控制一或多種嵌合受體活性之可調控嵌合受體，以最佳化嵌合受體療法之安全性及/或功效。舉例而言，使用與二聚化結構域融合的半胱天冬酶誘導細胞凋亡(參見，例如，Di等人，N Engl. J. Med. 2011年11月3日；365(18): 1673-1683)可用作嵌合受體療法中之安全開關。在一些實施例中，本揭示案之表現嵌合受體之細胞亦可表現誘導型半胱天冬酶-9 (iCaspase-9)，在投與諸如雷米杜西(rimiducid) (IUPAC名稱：(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁醯基]六氫吡啶-2-甲酸[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁醯基]六氫吡啶-2-羰基]氧基丙基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙基胺基]-2-側氧基乙氧基]苯基]丙基]酯)等二聚物藥物後，該iCaspase-9誘導半胱天冬酶-9之活化且導致細胞凋亡。在一些實施例中，iCaspase-9含有結合結構域，該結合結構域包含在CID存在下介導二聚化之二聚化化學誘導劑(CID)，此導致表現嵌合受體之細胞之誘導性及選擇性耗竭。
或者，在一些實施例中，可藉由利用使嵌合受體活性去活化或以其他方式抑制嵌合受體活性之小分子或抗體來調控本揭示案之嵌合受體。舉例而言，抗體可藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)來消除表現嵌合受體之細胞。在一些實施例中，本揭示案之表現嵌合受體之細胞可進一步表現由能夠誘導藉由ADCC之細胞死亡或補體誘導之細胞死亡之分子識別的抗原。舉例而言，本揭示案之表現嵌合受體之細胞可進一步表現能夠由抗體或抗體片段靶向之受體。可由抗體或抗體片段靶向之適宜受體之實例包括但不限於EpCAM、VEGFR、整聯蛋白(例如，αvβ3、α4、αΙ¾β3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受體超家族成員(例如，TRAIL-R1及TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR及其截短形式。
在一些實施例中，本揭示案之表現嵌合受體之細胞亦可表現截短之表皮生長因子受體(EGFR)，該EGFR缺乏傳訊能力，但保留由能夠誘導ADCC之分子識別之抗原決定基(例如，WO2011/056894)。
在一些實施例中，本揭示案之表現嵌合受體之細胞進一步包括在表現嵌合受體之細胞中組合來自CD32及CD20抗原之靶抗原決定基的高度表現之小型標記物/自殺基因，其結合抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗(rituximab))，導致藉由ADCC對表現嵌合受體之細胞之選擇性耗竭。用於耗竭本揭示案之表現嵌合受體之細胞的其他方法可包括但不限於投與單株抗CD52抗體，該單株抗CD52抗體選擇性結合且靶向表現嵌合受體之細胞以藉由誘導ADCC實施破壞。在一些實施例中，可使用嵌合受體配位體(諸如抗獨特型抗體)選擇性靶向表現嵌合受體之細胞。在一些實施例中，抗獨特型抗體可引起效應細胞活性，諸如ADCC或ADC活性。在一些實施例中，嵌合受體配位體可進一步與誘導細胞殺傷之劑(諸如毒素)偶合。在一些實施例中，本揭示案之表現嵌合受體之細胞可進一步表現由本揭示案之細胞耗竭劑識別之靶蛋白。在一些實施例中，靶蛋白係CD20且細胞耗竭劑係抗CD20抗體。在該等實施例中，一旦期望減少或消除表現嵌合受體之細胞，即投與細胞耗竭劑。在一些實施例中，細胞耗竭劑係抗CD52抗體。
在一些實施例中，受調控嵌合受體包含一組多肽，其中本揭示案之嵌合受體之組分分配於單獨多肽或成員上。舉例而言，該組多肽可包括二聚化開關，當存在二聚化分子時，該二聚化開關可將多肽彼此偶合以形成功能性嵌合受體。 內皮黏蛋白特異性抗原結合結構域
本揭示案提供結合至內皮黏蛋白(EMCN)之抗原結合結構域(例如，單鏈可變片段)、包括結合至EMCN之抗原結合結構域(例如本文所述之任何iCAR)之嵌合蛋白，以及編碼該等抗原結合結構域及嵌合蛋白之核酸。不希望受理論束縛，EMCN係唾液酸糖蛋白，其干擾點狀黏著複合物(focal adhesion complex)之裝配且抑制細胞與細胞外基質之間之相互作用。EMCN特異性抗原結合結構域結合至人類EMCN (例如，UniProt Q9ULC0，出於所有目的以引用方式併入本文中)或其抗原決定基片段。EMCN可在通常認為健康之細胞(諸如健康造血幹細胞(HSC)、HSPC、健康多潛能前驅細胞(MPP)、健康淋巴-髓樣經引發前驅細胞(LMPP)及健康造血前驅細胞(HPC))上表現。EMCN可在造血幹/前驅細胞(HSPC)上表現。EMCN可在HSC上表現。EMCN可在MPP上表現。EMCN可在LMPP上表現。EMCN可在HPC上表現。先前已闡述EMCN特異性抗體，包括CBFYE-0213、V.7.C7.1、L4B1、L5F12、L10B5、L3F12、L6H3、L9H8及L10F12，如Samulowitz U.等人，Am. J. Path.，2002年5月，160(5):1669-1681中所述，該文獻出於所有目的以引用方式併入本文中。
本揭示案提供包括 表 1中所列出之一或多種胺基酸序列之EMCN特異性抗原結合結構域。 表 1.
胺基酸序列 SEQ ID NO: 說明
RYDMH 291 經Kabat註釋之CDR之CDR-H1
GFTFSRY 292 經Chothia註釋之CDR之CDR-H1形式1
GFTLSRY 293 經Chothia註釋之CDR之CDR-H1形式2
GFSFSRY 294 經Chothia註釋之CDR之CDR-H1形式3
GFSLSRY 295 經Chothia註釋之CDR之CDR-H1形式4
VIWGNGNTHYHSALKS 296 經Kabat註釋之CDR之CDR-H2
WGNGN 297 經Chothia註釋之CDR之CDR-H2
RIKD 298 CDR-H3 (經Kabat及Chothia註釋之CDR)
KSSQSLVASDENTYLN 299 CDR-L1 (經Kabat及Chothia註釋之CDR)
QVSKLDS 300 CDR-L2 (經Kabat及Chothia註釋之CDR)
LQGIHLPWT 301 CDR-L3 (經Kabat及Chothia註釋之CDR)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 302 VH 3-23形式1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 303 VH 3-23形式2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 304 VH 3-23形式3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 305 VH 3-23形式4
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 306 VH 3-33形式1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 307 VH 3-33形式2
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFSFSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 308 VH 3-33形式3
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFSLSRY DMHWVRQAPGKGLEWVAVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS 309 VH 3-33形式4
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK 310 VL 2-30
在一些實施例中，對EMCN特異之抗原結合結構域包括重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：EMCN-VH包括具有RYDMH (SEQ ID NO: 291)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有VIWGNGNTHYHSALKS (SEQ ID NO: 296)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有RIKD (SEQ ID NO: 298)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且EMCN-VL包括具有KSSQSLVASDENTYLN (SEQ ID NO: 299)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有QVSKLDS (SEQ ID NO: 300)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有LQGIHLPWT (SEQ ID NO: 301)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
在一些實施例中，對EMCN特異之抗原結合結構域包括重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：EMCN-VH包括胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 302)；且EMCN-VL包括胺基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 310)。
在一些實施例中，對EMCN特異之抗原結合結構域包括胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 311)。在一些實施例中，對EMCN特異之抗原結合結構域係由包含序列GAGGTGCAGCTGG TTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO: 312)之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，對EMCN特異之抗原結合結構域係由與GAGGTGCAGCTGGTTGAA TCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO: 312)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多核苷酸序列編碼。 FLT3 及 CD33 特異性抗原結合結構域
本揭示案提供結合至FLT3及CD33之抗原結合結構域(例如，單鏈可變片段)、包括結合至FLT3及CD33之抗原結合結構域(例如本文所述之任何aCAR)之嵌合蛋白，以及編碼該等抗原結合結構域及嵌合蛋白之核酸。
在一些實施例中，嵌合受體包含表A1或表A2中所列出之一或多種胺基酸序列。在一些實施例中，活化性嵌合受體(aCAR)包含表A1或表A2中所列出之一或多種胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性二價aCAR包含表A1或表A2中所列出之一或多種胺基酸序列。表A1提供抗體重鏈或輕鏈之可變結構域。CDR係使用Kabat方法確定，且對於每一可變重鏈或可變輕鏈在表A1中以 粗斜體表示，且顯示在表A2中。在一些實施例中，編碼本揭示案之任何嵌合受體之核酸包含表B中所列出之一或多種核酸序列。
表A1
胺基酸序列 SEQ ID NO: 說明
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYYMH WARQAPGQGLEWMG IINPSGGSTSYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR VVAAAVADY WGQGTLVTVSS 313 抗FLT3抗體D4-3之重鏈可變結構域
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLHSNGYNYLD WYLQKPGQSPQLLIY LGSNRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPFTFGPGTKVDIK 314 抗FLT3抗體D4-3之輕鏈可變結構域
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GGTFSSYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT FALFGFREQAFDI WGQGTTVTVSS 315 抗FLT3抗體NC7之重鏈可變結構域
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYC QQSYSTPFT FGPGTKVDIK 316 抗FLT3抗體NC7之輕鏈可變結構域
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYYMH WVRQAPGQGLEWMG IINPSGGSTSYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GVGAHDAFDI WGQGTTVTVSS 317 抗FLT3抗體EB10之重鏈可變結構域
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLHSNGNNYLD WYLQKPGQSPQLLIY LGSNRAS GVPDRFSGSGSDTDFTLQISRVEAEDVGVYYC MQGTHPAIS FGQGTRLEIK 318 抗FLT3抗體EB10之輕鏈可變結構域
QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFT SYWMH WVRQRPGHGLEWIG EIDPSDSYKDYNQKFKD KATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCAR AITTTPFDF WGQGTTLTVSS 319 抗FLT3抗體4G8之重鏈可變結構域
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSC RASQSISNNLH WYQQKSHESPRLLIK YASQSIS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFC QQSNTWPYT FGGGTKLEIKR 320 抗FLT3抗體4G8之輕鏈可變結構域
QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLN NARMGVS WIRQPPGKCLEWLA HIFSNDEKSYSTSLKN RLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCAR IVGYGSGWYGFFDY WGQGTLVTVSS 321 抗FLT3抗體FL_39之重鏈可變結構域
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC LQHNSYPLT FGCGTKVEIK 322 抗FLT3抗體FL_39之輕鏈可變結構域
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLR NARMAVS WIRQPPGKTLEWLA HIFSNDEKSYSTSLKS RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR IVGYGSGWYGYFDY WGQGTLVTVSS 323 抗FLT3抗體FL_16之重鏈可變結構域
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQDIRYDLA WYQQKPGKAPKRLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNFYPLTFGGGTKVEIK 324 抗FLT3抗體FL_16之輕鏈可變結構域
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYG MHWVRQAPGKGLEWVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ANLAPWAAYW GQGTLVTVSS 325 抗FLT3抗體ml0006之重鏈可變結構域
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS QSLLHSNGYNY LDWYLQKPGQSPQLLIY LGS NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC MQALQTPHT FGQGTKLEIK 326 抗FLT3抗體ml0006之輕鏈可變結構域
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT NYGLH WVRQSPGKGLEWLG VIWSGGSTDYNAAFIS RLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAR KGGIYYANHYYAMDY WGQGTSVTVSS 327 抗FLT3抗體BV10之重鏈可變結構域
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYMA WYQQKPGQPPKLLIY GASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDHSYPLT FGAGTKLELKR 328 抗FLT3抗體BV10之輕鏈可變結構域
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT DYNMH WVRQAPGQGLEWIG YIYPYNGGTGYNQKFKSKA TITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GRPAMDYWGQ GTLVTVSS 329 抗CD33抗體林妥珠單抗(lintuzumab)之重鏈可變結構域
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDNYGISFMN WFQQKPGKAPKLLIY AASNQGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYC QQSKEVPWT FGQGTKVEIK 330 抗CD33抗體林妥珠單抗之輕鏈可變結構域
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTITDSN IHWVRQAPGQSLEWIGY IYPYNGGT DYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYC VNGNPWLAY WGQGTLVTVSS 331 抗CD33抗體吉妥珠單抗(gemtuzumab)之重鏈可變結構域
DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS ESLDNYGIRF LTWFQQKPGKAPKLLMY AAS NQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQTKEVPWS FGQGTKVEVKR 332 抗CD33抗體吉妥珠單抗之輕鏈可變結構域
表B
核酸序列 SEQ ID NO: 說明
GAAGTGCAACTTGTTCAGAGCGGGGCAGAAGTTAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTCAAGGTGAGTTGCAAGGCAAGTGGATACACCTTTACGAGTTATTATATGCACTGGGCACGGCAGGCCCCTGGTCAGGGCCTCGAATGGATGGGGATTATAAATCCTTCTGGCGGGTCAACCAGCTACGCACAAAAATTTCAAGGTCGGGTGACAATGACGCGCGACACGTCAACGAGTACAGTGTATATGGAATTGTCTAGCCTGAGGTCCGAGGATACTGCTGTCTATTATTGTGCTCGCGTGGTCGCTGCTGCTGTGGCAGACTACTGGGGTCAGGGTACACTTGTGACGGTAAGCAGC 333 抗FLT3抗體D4-3之重鏈可變結構域
GACGTAGTTATGACACAGTCTCCACTGTCATTGCCAGTAACACCAGGTGAGCCCGCCTCCATCTCATGTAGATCCTCCCAATCTCTCCTTCATTCAAACGGGTATAATTATCTCGACTGGTATTTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCTCAACTGCTCATCTATTTGGGGAGCAACCGGGCCTCTGGTGTCCCTGATAGATTCTCCGGGAGTGGATCAGGTACGGATTTTACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCAGAAGATGTTGGTGTGTATTACTGTATGCAATCACTCCAGACCCCGTTTACCTTTGGGCCTGGAACAAAGGTAGATATTAAA 334 抗FLT3抗體D4-3之輕鏈可變結構域
GAGGTTCAACTGGTACAAAGCGGAGCCGAGGTAAAGAAACCAGGGAGTAGCGTCAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGCGGCACATTCAGTAGCTATGCTATTTCATGGGTACGCCAAGCACCAGGACAGGGGCTGGAGTGGATGGGCGGGATTATCCCCATCTTCGGTACGGCAAACTATGCACAAAAGTTCCAGGGACGAGTCACCATCACGGCTGATAAGTCCACCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGTTCCCTTCGGAGCGAGGATACTGCTGTGTATTATTGTGCCACGTTCGCACTGTTCGGTTTTCGGGAGCAGGCGTTTGATATTTGGGGACAAGGCACAACGGTCACGGTCAGTTCA 335 抗FLT3抗體NC7之重鏈可變結構域
GACATTCAGATGACCCAGAGTCCCTCTTCATTGAGTGCGAGCGTCGGTGATCGGGTTACGATAACCTGTAGGGCCTCCCAAAGTATATCATCATATTTGAACTGGTACCAACAGAAACCTGGGAAAGCGCCGAAGCTCCTTATCTATGCTGCCAGCTCTTTGCAAAGCGGTGTGCCCTCACGGTTCTCCGGTAGTGGGTCCGGGACCGACTTCACTTTGACCATCAGCAGCCTTCAGCCAGAGGATCTTGCCACTTATTACTGCCAGCAATCTTATAGCACACCGTTTACATTCGGTCCAGGCACAAAGGTAGACATTAAG 336 抗FLT3抗體NC7之輕鏈可變結構域
GAGGTACAGCTTGTGCAGAGTGGAGCAGAAGTTAAAAAACCCGGAGCTTCCGTGAAGGTAAGCTGCAAGGCTTCAGGATATACATTTACTAGCTACTACATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCGGGCCAAGGCCTTGAATGGATGGGCATCATAAATCCCAGTGGAGGCTCAACGAGCTATGCACAAAAGTTCCAAGGGCGCGTTACCATGACGCGCGACACCAGCACGTCCACCGTCTATATGGAACTCTCAAGTTTGCGATCTGAAGATACGGCTGTCTACTATTGCGCACGAGGGGTCGGAGCGCATGACGCCTTCGACATCTGGGGACAAGGGACTACAGTAACTGTGTCAAGC 337 抗FLT3抗體EB10之重鏈可變結構域
GATGTTGTTATGACACAGTCTCCCCTCTCTTTGCCTGTTACGCCTGGCGAGCCCGCCTCTATTTCTTGTCGATCTAGTCAGAGCCTGCTGCATTCTAATGGAAACAACTATTTGGACTGGTACTTGCAAAAGCCGGGTCAAAGTCCC 338 抗FLT3抗體EB10之輕鏈可變結構域
CAAGTCCAACTTCAGCAGCCAGGCGCTGAGTTGGTTAAACCGGGCGCAAGCCTCAAACTTAGTTGCAAGTCATCCGGATATACTTTCACGTCTTATTGGATGCATTGGGTACGACAAAGACCTGGTCACGGCCTCGAATGGATTGGCGAAATCGACCCGTCAGACAGCTACAAGGATTACAACCAGAAATTCAAAGATAAGGCAACACTTACTGTGGATCGCTCAAGTAACACGGCTTACATGCACCTCTCTTCACTCACGTCTGACGACAGTGCGGTGTATTATTGCGCCCGCGCTATTACAACAACCCCTTTCGATTTCTGGGGCCAGGGTACTACGCTCACAGTCTCATCC 339 抗FLT3抗體4G8之重鏈可變結構域
GATATCGTCCTCACCCAATCCCCGGCTACTTTGAGTGTAACACCAGGCGACAGCGTGTCACTGTCATGCCGAGCCTCCCAGTCAATCAGCAATAATCTGCATTGGTATCAACAGAAATCACACGAATCCCCCCGACTTTTGATAAAGTATGCGTCACAGTCCATATCAGGCATTCCCAGTAGGTTTTCAGGCAGTGGTTCAGGTACTGACTTCACCCTCTCCATTAACTCTGTAGAAACAGAGGACTTTGGCGTCTACTTCTGTCAGCAATCCAACACCTGGCCTTATACATTCGGCGGCGGCACTAAGCTGGAAATTAAGAGA 340 抗FLT3抗體4G8之輕鏈可變結構域
CAAGTAACCCTTAAAGAGTCCGGCCCCACTTTGGTTAAACCTACTGAAACACTTACACTCACATGCACATTGTCCGGCTTTTCACTCAACAACGCAAGGATGGGTGTGTCCTGGATTCGCCAGCCCCCTGGAAAATGTTTGGAATGGCTCGCTCATATATTTAGCAACGACGAGAAAAGTTACTCAACTTCACTCAAGAACCGCCTCACTATTAGCAAAGATTCCTCCAAAACCCAAGTAGTTCTGACAATGACGAATGTAGACCCAGTCGATACTGCAACTTACTATTGCGCACGAATAGTCGGTTACGGGAGTGGCTGGTATGGGTTTTTCGACTATTGGGGACAGGGCACTCTTGTAACAGTAAGTAGC 341 抗FLT3抗體FL39之重鏈可變結構域
GACATCCAGATGACTCAATCTCCATCTAGCCTCTCAGCGTCTGTGGGCGATCGAGTCACCATCACCTGTAGGGCTTCCCAGGGTATAAGGAATGATTTGGGCTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCGAAACGACTGATATACGCAGCTTCTACGTTGCAATCCGGGGTGCCATCCAGATTTAGTGGCAGCGGGAGCGGTACTGAGTTTACGCTGACTATCTCCTCACTTCAGCCAGAGGATTTCGCCACGTACTATTGTCTGCAACACAACTCCTATCCGCTGACCTTCGGGTGCGGGACAAAGGTGGAAATTAAA 342 抗FLT3抗體FL39之輕鏈可變結構域
CAAGTGACCTTGAAGGAGTCAGGGCCAGTGTTGGTAAAACCTACTGAGACTCTCACGTTGACATGCACGGTATCAGGTTTCAGCCTGAGGAACGCTCGGATGGCCGTCAGTTGGATACGCCAGCCGCCAGGCAAAACTCTTGAATGGTTGGCGCACATATTCAGTAACGACGAGAAATCTTACTCTACATCCCTTAAGTCTCGCCTCACCATTTCTAAAGACACATCCAAATCACAAGTGGTACTCACGATGACAAACATGGACCCTGTTGACACTGCTACATATTATTGTGCTAGGATAGTGGGCTACGGTAGCGGATGGTACGGTTATTTTGATTACTGGGGACAAGGGACGCTTGTTACGGTGTCCTCA 343 抗FLT3抗體FL16之重鏈可變結構域
GACATTCAGATGACCCAGTCTCCGTCCAGCGTTAGCGCAAGCGTGGGGGATAGAGTCACTATTACGTGTAGAGCCAGTCAAGATATACGGTACGATCTTGCTTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAAGCCCCGAAGAGACTTATATATGCAGCTTCCTCCTTGCAAAGCGGGGTCCCATCCCGGTTTAGTGGTAGTGGTTCCGGAACAGAGTTCACGCTGACTATTTCATCACTGCAACCCGAAGATTTTGCCACCTACTACTGCCTTCAACACAATTTCTATCCTCTTACCTTCGGCGGAGGTACTAAGGTAGAGATTAAG 345 抗FLT3抗體FL16之輕鏈可變結構域
GAAGTACAGTTGGTTGAGAGTGGTGGAGGACTCGTTCAACCTGGCGGTAGTTTGCGACTCAGCTGCGCGGCTTCCGGTTTCACCTTCTCATCCTATGGGATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCTGGAAAGGGCCTCGAATGGGTTGCTGTGATTAGCTATGACGGCTCTAATAAATACTATGCAGATAGTGTAAAGGGGAGATTTACGATTTCTCGCGATAATAGCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGGAAACCAACAGCCTGCGAGCGGAAGATACGGCGGTTTATTACTGCGCGAATCTTGCCCCGTGGGCAGCATACTGGGGACAGGGGACGTTGGTGACGGTAAGCAGT 346 抗FLT3抗體ml0006之重鏈可變結構域
GAGATTGTGCTCACCCAGTCTCCACTCAGCCTTCCTGTAACGCCCGGTGAGCCTGCCTCTATATCATGCCGAAGTTCCCAAAGCCTTCTGCACTCAAACGGCTATAACTACTTGGACTGGTACCTCCAGAAGCCCGGCCAAAGTCCTCAACTGTTGATATACCTGGGGTCCAACCGGGCATCAGGAGTACCTGATAGATTCTCAGGAAGTGGGTCAGGAACCGACTTCACGCTGAAAATTAGTCGCGTAGAGGCGGAAGATGTAGGTGTGTATTACTGTATGCAGGCGTTGCAAACACCGCACACTTTTGGACAGGGAACCAAACTGGAAATAAAGACCAGTAGTGGT 347 抗FLT3抗體ml0006之輕鏈可變結構域
CAGGTCCAACTGAAACAAAGCGGTCCCGGTCTTGTCCAGCCCTCCCAATCTCTCAGTATTACTTGCACTGTGTCAGGTTTCAGCCTCACGAACTACGGTCTGCATTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGAAAAGGCCTGGAGTGGCTCGGTGTTATCTGGAGTGGTGGAAGTACGGATTACAATGCTGCCTTTATCTCTCGGCTCAGTATCTCCAAAGATAACTCTAAGTCCCAAGTCTTTTTCAAAATGAACTCTTTGCAGGCAGATGATACGGCCATATACTATTGCGCACGCAAGGGTGGGATCTACTATGCAAACCACTATTACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGCACGAGTGTTACCGTGTCAAGC 348 抗FLT3抗體BV10之重鏈可變結構域
GACATAGTGATGACTCAGTCTCCGTCCTCTCTTTCCGTGAGTGCGGGCGAAAAGGTTACCATGTCCTGCAAAAGTTCACAGTCACTTCTCAATTCTGGCAACCAAAAAAATTACATGGCATGGTATCAACAGAAACCAGGTCAGCCGCCAAAGCTCCTCATATATGGTGCATCAACGCGAGAGTCAGGCGTACCTGACAGGTTTACCGGATCTGGCAGCGGTACAGACTTTACTCTTACCATATCAAGTGTGCAGGCAGAGGACTTGGCGGTATACTATTGTCAAAACGATCATAGTTACCCTCTTACATTTGGCGCGGGCACTAAACTGGAGCTGAAACGC 349 抗FLT3抗體BV10之輕鏈可變結構域
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAATGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATCACCGCCGACGAGAGCACAAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCAGACCCGCCATGGATTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTAGC 350 抗CD33抗體林妥珠單抗之重鏈可變結構域
GATATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTCCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACATTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAAATCAAG 351 抗CD33抗體林妥珠單抗之輕鏈可變結構域
GAAGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGCCAGTCTCTTGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACACTGACCGTGGACAACCCTACCAATACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTTTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTCACAGTGTCTAGC 352 抗CD33抗體吉妥珠單抗之重鏈可變結構域
GATATTCAGCTGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCAGATTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGAGTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTCCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGG 353 抗CD33抗體吉妥珠單抗之輕鏈可變結構域
表A2
Ab SEQ ID NO CDR-H1 SEQ ID NO CDR-H2 SEQ ID NO CDR-H3 SEQ ID NO CDR-L1 SEQ ID NO CDR-L2 SEQ ID NO CDR-L3
FLT3 D4-3 354 GYTFTSYYMH 355 IINPSGGSTSYAQKFQG 356 VVAAAVADY 357 RSSQSLLHSNGYNYLD 358 LGSNRA 359 MQSLQTPFT
FLT3 NC7 360 GGTFSSYAIS 361 GIIPIFGTANYAQKFQG 362 FALFGFREQAFDI 363 RASQSISSYLN 364 AASSLQS 365 QQSYSTPFT
FLT3 EB10 366 GYTFTSYYMH 367 IINPSGGSTSYAQKFQG 368 GVGAHDAFDI 369 RSSQSLLHSNGNNYLD 370 LGSNRA 371 MQGTHPAIS
FLT3 4G8 372 SYWMH 373 EIDPSDSYKDYNQKFKD 374 AITTTPFDF 375 RASQSISNNLH 376 YASQSIS 377 QQSNTWPYT
FLT3 FL_39 378 NARMGVS 379 HIFSNDEKSYSTSLKN 380 IVGYGSGWYGFFDY 381 RASQGIRNDLG 382 AASTLQS 383 LQHNSYPLT
FLT3 FL_16 384 NARMAVS 385 HIFSNDEKSYSTSLKS 386 IVGYGSGWYGYFDY 387 RASQDIRYDLA 388 AASSLQS 389 LQHNFYPLT
FLT3 ml0006 390 GFTFSSYG 391 ISYDGSNK 392 ANLAPWAAYW 393 QSLLHSNGYNY 394 LGS 395 MQALQTPHT
FLT3 BV10 396 NYGLH 397 VIWSGGSTDYNAAFIS 398 KGGIYYANHYYAMDY 399 KSSQSLLNSGNQKNYMA 400 GASTRES 401 QNDHSYPLT
CD33 抗體林妥珠單抗 402 DYNMH 403 YIYPYNGGTGYNQKFKSKA 404 GRPAMDYWGQ 405 RASESVDNYGISFMN 406 AASNQGS 407 QQSKEVPWT
CD33 抗體吉妥珠單抗 408 GYTITDSN 409 IYPYNGGT 410 VNGNPWLAY 411 ESLDNYGIRF 412 AAS 413 QQTKEVPWS
在一些實施例中，對CD33特異之抗原結合結構域包括重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：CD33-VH包括：具有DYNMH (SEQ ID NO: 402)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有YIYPYNGGTGYNQ KFKSKA (SEQ ID NO: 403)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有GRPAMDYWGQ (SEQ ID NO: 404)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且CD33-VL包括：具有RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 405)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有AASNQGS (SEQ ID NO: 406)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有QQSKEVPWT (SEQ ID NO: 407)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
在一些實施例中，對CD33特異之抗原結合結構域包括具有胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLE WIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329)之CD33-VH及具有胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 330)之CD33-VL。
在一些實施例中，對FLT3特異之抗原結合結構域包括重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：FLT3-VH包括具有GGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 360)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、具有GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 361)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及具有FALFGFREQAFDI (SEQ ID NO: 362)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且FLT3-VL包括具有RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 363)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、具有AASSLQS (SEQ ID NO: 364)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及具有QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 365)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且其中參考抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
在一些實施例中，對FLT3特異之抗原結合結構域包括具有胺基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315)之FLT3-VH及具有胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)之FLT3-VL。
在一些實施例中，二價雙特異性aCAR包括對FLT3特異之抗原結合結構域及對CD33特異之抗原結合結構域。
在一些實施例中，對FLT3及CD33特異之二價雙特異性aCAR包括胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 414)。
在一些實施例中，對FLT3及CD33特異之二價雙特異性aCAR包括胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 415)。 經工程改造之核酸
本文提供多順反子表現系統，其包括編碼以下之經工程改造之核酸：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。
在本文所述之某些實施例中，多順反子表現系統包括編碼表現盒之經工程改造之核酸，該表現盒含有啟動子以及編碼(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之外源性多核苷酸序列。
啟動子可操作地連接至多順反子系統之表現盒，使得編碼膜可切割嵌合蛋白、二價aCAR及iCAR中之每一者之外源性多核苷酸序列經構形以表現為單一多肽。
「經工程改造之核酸」係指自然界中不存在之核酸。然而，應當理解，雖然經工程改造之核酸整體上並非天然存在的，但其可包括天然存在之核苷酸序列。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含來自不同生物體(例如 ，來自不同物種)之核苷酸序列。舉例而言，在一些實施例中，經工程改造之核酸包括鼠類核苷酸序列、細菌核苷酸序列、人類核苷酸序列及/或病毒核苷酸序列。術語「經工程改造之核酸」包括重組核酸及合成核酸。「重組核酸」係指藉由接合核酸分子構築之分子，且在一些實施例中，可在活細胞中複製。「合成核酸」係指經擴增或以化學方式或藉由其他手段合成之分子。合成核酸包括經化學修飾或以其他方式修飾、但可與天然存在之核酸分子鹼基配對之彼等。修飾包括但不限於一或多種經修飾之核苷酸間鍵聯及非天然核酸。修飾進一步詳細闡述於美國專利第6,673,611號及美國申請公開案2004/0019001中，且該等專利中之每一者皆以全文引用方式併入。經修飾之核苷酸間鍵聯可為二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯鍵聯。非天然核酸可為鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、磷二醯胺(phosphorodiamidate)嗎啉代寡聚物(PMO或「嗎啉代」)及蘇糖核酸(TNA)。非天然核酸進一步詳細地闡述於國際申請案WO 1998/039352、美國申請公開案第2013/0156849號及美國專利第6,670,461號、第5,539,082號、第5,185,444號中，各自全文以引用方式併入本文中。重組核酸及合成核酸亦包括由前述中任一者之複製產生之彼等分子。本揭示案之經工程改造之核酸可由單一分子(例如，包括在同一質體或另一載體中)或由多種不同分子(例如，多種獨立複製之不同分子)編碼。經工程改造之核酸可為經分離核酸。經分離核酸包括但不限於cDNA多核苷酸、RNA多核苷酸、RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、shRNA等)、mRNA多核苷酸、環狀質體、線性DNA片段、載體、微環、ssDNA、細菌人工染色體(BAC)及酵母人工染色體(YAC)以及寡核苷酸。
本揭示案之經工程改造之核酸可使用標準分子生物學方法產生(參見，例如，Green及Sambrook，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press)。在一些實施例中，經工程改造之核酸構築體係使用GIBSON ASSEMBLY® Cloning (參見例如Gibson, D.G.等人，Nature Methods, 343-345, 2009；及Gibson, D.G.等人，Nature Methods, 901-903, 2010，每篇以引用方式併入本文中)來產生。GIBSON ASSEMBLY®通常在單管反應中使用三種酶活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶之Ύ延伸活性及DNA連接酶活性。5'核酸外切酶活性回切(chew back) 5'端序列並暴露互補序列用於退火。接著聚合酶活性填充退火區域上之間隙。接著DNA連接酶密封切口並將DNA片段共價地連接在一起。毗連片段之重疊序列比用於Golden Gate Assembly中之序列長得多，且因此產生更高百分比之正確組裝。在一些實施例中，經工程改造之核酸構築體係使用IN-FUSION®選殖(Clontech)產生。 啟動子
一般而言，在本文所述之所有實施例中，編碼膜可切割嵌合蛋白、二價aCAR及iCAR之經工程改造之核酸編碼含有啟動子之表現盒。在一些實施例中，經工程改造之核酸(例如，包含表現盒之經工程改造之核酸)包含可操作地連接至編碼至少2種不同蛋白之核苷酸序列(例如，外源性多核苷酸序列)之啟動子。舉例而言，經工程改造之核酸可包含可操作地連接至編碼至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少8種、至少9種或至少10種不同蛋白之核苷酸序列之啟動子。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含可操作地連接至編碼1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種不同蛋白之核苷酸序列之啟動子。在一些實施例中，經工程改造之核酸(例如，包含表現盒之經工程改造之核酸)包含可操作地連接至編碼至少2種膜可切割嵌合蛋白之核苷酸序列(例如，外源性多核苷酸序列)之啟動子。舉例而言，經工程改造之核酸可包含可操作地連接至編碼至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少8種、至少9種或至少10種膜可切割嵌合蛋白之核苷酸序列之啟動子。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含可操作地連接至編碼1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種膜可切割嵌合蛋白之核苷酸序列之啟動子。
「啟動子」係指核酸序列之控制區，在該區控制核酸序列其餘部分之轉錄起始及速率。啟動子亦可含有調控蛋白及分子(諸如RNA聚合酶及其他轉錄因子)可結合之次區。啟動子可為組成型、誘導型、阻遏型、組織特異性的或其任一組合。啟動子驅動其調控之核酸序列之表現或轉錄。在本文中，當啟動子相對於其調控之核酸序列處於正確功能位置及定向以控制(「驅動」)該序列之轉錄起始及/或表現時，認為該啟動子「可操作地連接」。
啟動子可為與基因或序列天然締合之啟動子，如可藉由分離位於給定基因或序列之編碼區段上游之5'非編碼序列而獲得。該啟動子可稱為「內源性的」。在一些實施例中，編碼核酸序列可位於受重組或異源啟動子之控制下，該啟動子係指在其天然環境中通常不與編碼序列締合之啟動子。該等啟動子可包括其他基因之啟動子；自任何其他細胞分離之啟動子；及非「天然存在」之合成啟動子或增強子，諸如例如含有不同轉錄調控區之不同元件及/或藉助此項技術中已知之基因工程改造方法改變表現之突變之彼等。除了合成產生啟動子及增強子之核酸序列外，亦可使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括聚合酶鏈反應(PCR))產生序列(參見例如美國專利第4,683,202號及美國專利第5,928,906號)。
經工程改造之核酸之啟動子可為「誘導型啟動子」，其係指特徵在於當存在信號、受信號影響或被信號接觸時調控(例如，起始或活化)轉錄活性之啟動子。信號可為內源性或通常外源性條件(例如，光)、化合物(例如，化學或非化學化合物)或蛋白(例如，細胞介素)，其以在自誘導型啟動子調控轉錄活性方面有活性之方式接觸誘導型啟動子。轉錄之活化可涉及直接作用於啟動子以驅動轉錄，或藉由使阻止啟動子驅動轉錄之阻遏物不活化而間接作用於啟動子。反之，轉錄之去活化可涉及直接作用於啟動子以阻止轉錄，或藉由活化接著作用於啟動子之阻遏物而間接作用於啟動子。
若在存在局部腫瘤狀態(例如，發炎或缺氧)或信號之情況下，使來自啟動子之轉錄活化、去活化、增加或減少，則啟動子對該狀態或信號「有反應」或「受其調節」。在一些實施例中，啟動子包含反應元件。「反應元件」係啟動子區內之短DNA序列，其結合調節(調控)自啟動子之基因表現之特定分子(例如，轉錄因子)。可根據本揭示案使用之反應元件包括但不限於根皮素可調控制元件(PEACE)、鋅指DNA結合結構域(DBD)、干擾素-γ活化序列(GAS) (Decker, T.等人， J Interferon Cytokine Res. 1997年3月；17(3):121-34，其以引用方式併入本文中)、干擾素刺激反應元件(ISRE) (Han, K. J.等人， J Biol Chem. 2004年4月9日；279(15):15652-61，其以引用方式併入本文中)、NF-κB反應元件(Wang, V.等人，Cell Reports. 2012; 2(4): 824-839，其以引用方式併入本文中)及STAT3反應元件(Zhang, D.等人， J of Biol Chem. 1996; 271: 9503-9509，其以引用方式併入本文中)。本文中亦涵蓋其他反應元件。反應元件亦可含有銜接重複(例如，編碼反應元件之相同核苷酸序列之連續重複)以大體增加反應元件對其同源結合分子之敏感性。銜接重複可標記為2X、3X、4X、5X等以表示存在之重複數。
反應性啟動子(亦稱為「誘導型啟動子」) (例如，TGF-β反應性啟動子)之非限制性實例列於表5A中，該表顯示啟動子及轉錄因子之設計，以及顯示誘導分子對轉錄因子(TF)及轉基因轉錄(T)之作用(B，結合；D，解離；n.d.，未確定) (A，活化；DA，去活化；DR，去阻遏) (參見Horner, M.及Weber, W. FEBS Letters586 (2012) 20784-2096m，以及其中引用之參考文獻)。誘導型啟動子之組分之非限制性實例包括 表 5B中呈現之彼等。 表 5A. 反應性啟動子之實例
系統 啟動子及操縱子 轉錄因子(TF) 誘導物分子 對誘導物之反應
            TF T
轉錄活化劑反應性啟動子   
AIR PAIR (OalcA-PhCMVmin) AlcR 乙醛 n.d. A
ART PART (OARG-PhCMVmin) ArgR-VP16 l-精胺酸 B A
BIT PBIT3 (OBirA3-PhCMVmin) BIT (BirA-VP16) 生物素 B A
Cumate-活化劑 PCR5 (OCuO6-PhCMVmin) cTA (CymR-VP16) Cumate D DA
Cumate-反向活化劑 PCR5 (OCuO6-PhCMVmin) rcTA (rCymR-VP16) Cumate B A
E-OFF PETR (OETR-PhCMVmin) ET (E-VP16) 紅黴素 D DA
NICE-OFF PNIC (ONIC-PhCMVmin) NT (HdnoR-VP16) 6-羥基-菸鹼 D DA
PEACE PTtgR1 (OTtgR-PhCMVmin) TtgA1 (TtgR-VP16) 根皮素 D DA
PIP-OFF PPIR (OPIR-Phsp70min) PIT (PIP-VP16) 原始黴素(Pristinamycin) I D DA
QuoRex PSCA (OscbR-PhCMVmin)PSPA (OpapRI-PhCMVmin) SCA (ScbR-VP16) SCB1 D DA
Redox PROP (OROP-PhCMVmin) REDOX (REX-VP16) NADH D DA
TET-OFF PhCMV∗-1 (OtetO7-PhCMVmin) tTA (TetR-VP16) 四環素 D DA
TET-ON PhCMV∗-1 (OtetO7-PhCMVmin) rtTA (rTetR-VP16) 去氧羥四環素 B A
TIGR PCTA (OrheO-PhCMVmin) CTA (RheA-VP16) 熱 D DA
TraR O7x(tra box)-PhCMVmin p65-TraR 3-側氧基-C8-HSL B A
VAC-OFF P1VanO2 (OVanO2-PhCMVmin) VanA1 (VanR-VP16) 香草酸 D DA
轉錄阻遏物反應性啟動子   
Cumate-阻遏物 PCuO (PCMV5-OCuO) CymR Cumate D DR
E-ON PETRON8 (PSV40-OETR8) E-KRAB 紅黴素 D DR
NICE-ON PNIC (PSV40-ONIC8) NS (HdnoR-KRAB) 6-羥基-菸鹼 D DR
PIP-ON PPIRON (PSV40-OPIR3) PIT3 (PIP-KRAB) 原始黴素I D DR
Q-ON PSCAON8 (PSV40-OscbR8) SCS (ScbR-KRAB) SCB1 D DR
基於TET-ON阻遏物 OtetO-PHPRT tTS-H4 (TetR-HDAC4) 去氧羥四環素 D DR
T-REX PTetO (PhCMV-OtetO2) TetR 四環素 D DR
UREX PUREX8 (PSV40-OhucO8) mUTS (KRAB-HucR) 尿酸 D DR
VAC-ON PVanON8 (PhCMV-OVanO8) VanA4 (VanR-KRAB) 香草酸 D DR
雜合啟動子            
QuoRexPIP-ON(反若閘(NOT IF gate)) OscbR8-OPIR3-PhCMVmin SCAPIT3 SCB1原始黴素I DD DADR
QuoRexE-ON(反若閘) OscbR-OETR8-PhCMVmin SCAE-KRAB SCB1紅黴素 DD DADR
TET-OFFE-ON(反若閘) OtetO7-OETR8-PhCMVmin tTAE-KRAB 四環素紅黴素 DD DADR
TET-OFFPIP-ONE-ON OtetO7-OPIR3-OETR8-PhCMVmin tTAPIT3E-KRAB 四環素原始黴素I紅黴素 DDD DADRDR
表 5B. 誘導型啟動子之例示性組分
名稱 DNA 序列
最小啟動子；minP AGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAG (SEQ ID NO: 1)
NFkB反應元件蛋白啟動子；5× NFkB-RE GGGAATTTCCGGGGACTTTCCGGGAATTTCCGGGGACTTTCCGGGAATTTCC (SEQ ID NO: 2)
CREB反應元件蛋白啟動子；4× CRE CACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAA (SEQ ID NO: 3)
NFAT反應元件蛋白啟動子；3× NFAT結合位點 GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 4)
SRF反應元件蛋白啟動子；5× SRE AGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCT (SEQ ID NO: 5)
SRF反應元件蛋白啟動子2；5× SRF-RE AGTATGTCCATATTAGGACATCTACCATGTCCATATTAGGACATCTACTATGTCCATATTAGGACATCTTGTATGTCCATATTAGGACATCTAAAATGTCCATATTAGGACATCT (SEQ ID NO: 6)
AP1反應元件蛋白啟動子；6× AP1-RE TGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAG (SEQ ID NO: 7)
TCF-LEF反應元件啟動子；8× TCF-LEF-RE AGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGTATAAGATCAAAGGGCCTAAGATCAAAGGGACTAAGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGCCTA (SEQ ID NO: 8)
SBE×4 GTCTAGACGTCTAGACGTCTAGACGTCTAGAC (SEQ ID NO: 9)
SMAD2/3 - CAGACA ×4 CAGACACAGACACAGACACAGACA (SEQ ID NO: 10)
STAT3結合位點 Ggatccggtactcgagatctgcgatctaagtaagcttggcattccggtactgttggtaaagccac (SEQ ID NO: 11)
minCMV taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctgga (SEQ ID NO: 170)
YB_TATA TCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA (SEQ ID NO: 171)
minTK Ttcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcagcgacccgcttaa (SEQ ID NO: 172)
啟動子之非限制性實例包括細胞巨大病毒(CMV)啟動子、延長因子1-α (EF1a)啟動子、延長因子(EFS)啟動子、MND啟動子(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增強子之經修飾MoMuLV LTR之U3區的合成啟動子)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子、脾病灶形成病毒(SFFV)啟動子、猿猴病毒40 (SV40)啟動子及泛素C (UbC)啟動子(參見表 5C)。 表 5C. 例示性組成型啟動子
名稱 DNA 序列
CMV GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC (SEQ ID NO: 12)
EF1a GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGCCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGACCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGTCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCCGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGTCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (SEQ ID NO: 13)
EFS GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC (SEQ ID NO: 14)
MND TTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCA (SEQ ID NO: 15)
PGK GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCGGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO: 16)
SFFV GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGG (SEQ ID NO: 17)
SV40 CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCT (SEQ ID NO: 18)
UbC GCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGGAGCGTTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTTGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCACAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTAAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGGTTTGTCGTCTGGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAAGCTTCTGCAGGTCGACTCTAGAAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGAC (SEQ ID NO: 19)
hEF1aV1 GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGTCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (SEQ ID NO: 20)
hCAGG ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC (SEQ ID NO: 21)
hEF1aV2 Gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag (SEQ ID NO: 22)
hACTb CCACTAGTTCCATGTCCTTATATGGACTCATCTTTGCCTATTGCGACACACACTCAATGAACACCTACTACGCGCTGCAAAGAGCCCCGCAGGCCTGAGGTGCCCCCACCTCACCACTCTTCCTATTTTTGTGTAAAAATCCAGCTTCTTGTCACCACCTCCAAGGAGGGGGAGGAGGAGGAAGGCAGGTTCCTCTAGGCTGAGCCGAATGCCCCTCTGTGGTCCCACGCCACTGATCGCTGCATGCCCACCACCTGGGTACACACAGTCTGTGATTCCCGGAGCAGAACGGACCCTGCCCACCCGGTCTTGTGTGCTACTCAGTGGACAGACCCAAGGCAAGAAAGGGTGACAAGGACAGGGTCTTCCCAGGCTGGCTTTGAGTTCCTAGCACCGCCCCGCCCCCAATCCTCTGTGGCACATGGAGTCTTGGTCCCCAGAGTCCCCCAGCGGCCTCCAGATGGTCTGGGAGGGCAGTTCAGCTGTGGCTGCGCATAGCAGACATACAACGGACGGTGGGCCCAGACCCAGGCTGTGTAGACCCAGCCCCCCCGCCCCGCAGTGCCTAGGTCACCCACTAACGCCCCAGGCCTGGTCTTGGCTGGGCGTGACTGTTACCCTCAAAAGCAGGCAGCTCCAGGGTAAAAGGTGCCCTGCCCTGTAGAGCCCACCTTCCTTCCCAGGGCTGCGGCTGGGTAGGTTTGTAGCCTTCATCACGGGCCACCTCCAGCCACTGGACCGCTGGCCCCTGCCCTGTCCTGGGGAGTGTGGTCCTGCGACTTCTAAGTGGCCGCAAGCCACCTGACTCCCCCAACACCACACTCTACCTCTCAAGCCCAGGTCTCTCCCTAGTGACCCACCCAGCACATTTAGCTAGCTGAGCCCCACAGCCAGAGGTCCTCAGGCCCTGCTTTCAGGGCAGTTGCTCTGAAGTCGGCAAGGGGGAGTGACTGCCTGGCCACTCCATGCCCTCCAAGAGCTCCTTCTGCAGGAGCGTACAGAACCCAGGGCCCTGGCACCCGTGCAGACCCTGGCCCACCCCACCTGGGCGCTCAGTGCCCAAGAGATGTCCACACCTAGGATGTCCCGCGGTGGGTGGGGGGCCCGAGAGACGGGCAGGCCGGGGGCAGGCCTGGCCATGCGGGGCCGAACCGGGCACTGCCCAGCGTGGGGCGCGGGGGCCACGGCGCGCGCCCCCAGCCCCCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGgtaagcccggccagccgaccggggcaggcggctcacggcccggccgcaggcggccgcggccccttcgcccgtgcagagccgccgtctgggccgcagcggggggcgcatggggggggaaccggaccgccgtggggggcgcgggagaagcccctgggcctccggagatgggggacaccccacgccagttcggaggcgcgaggccgcgctcgggaggcgcgctccgggggtgccgctctcggggcgggggcaaccggcggggtctttgtctgagccgggctcttgccaatggggatcgcagggtgggcgcggcggagcccccgccaggcccggtgggggctggggcgccattgcgcgtgcgcgctggtcctttgggcgctaactgcgtgcgcgctgggaattggcgctaattgcgcgtgcgcgctgggactcaaggcgctaactgcgcgtgcgttctggggcccggggtgccgcggcctgggctggggcgaaggcgggctcggccggaaggggtggggtcgccgcggctcccgggcgcttgcgcgcacttcctgcccgagccgctggccgcccgagggtgtggccgctgcgtgcgcgcgcgccgacccggcgctgtttgaaccgggcggaggcggggctggcgcccggttgggagggggttggggcctggcttcctgccgcgcgccgcggggacgcctccgaccagtgtttgccttttatggtaataacgcggccggcccggcttcctttgtccccaatctgggcgcgcgccggcgccccctggcggcctaaggactcggcgcgccggaagtggccagggcgggggcgacctcggctcacagcgcgcccggctat (SEQ ID NO: 23)
heIF4A1 GTTGATTTCCTTCATCCCTGGCACACGTCCAGGCAGTGTCGAATCCATCTCTGCTACAGGGGAAAACAAATAACATTTGAGTCCAGTGGAGACCGGGAGCAGAAGTAAAGGGAAGTGATAACCCCCAGAGCCCGGAAGCCTCTGGAGGCTGAGACCTCGCCCCCCTTGCGTGATAGGGCCTACGGAGCCACATGACCAAGGCACTGTCGCCTCCGCACGTGTGAGAGTGCAGGGCCCCAAGATGGCTGCCAGGCCTCGAGGCCTGACTCTTCTATGTCACTTCCGTACCGGCGAGAAAGGCGGGCCCTCCAGCCAATGAGGCTGCGGGGCGGGCCTTCACCTTGATAGGCACTCGAGTTATCCAATGGTGCCTGCGGGCCGGAGCGACTAGGAACTAACGTCATGCCGAGTTGCTGAGCGCCGGCAGGCGGGGCCGGGGCGGCCAAACCAATGCGATGGCCGGGGCGGAGTCGGGCGCTCTATAAGTTGTCGATAGGCGGGCACTCCGCCCTAGTTTCTAAGGACCATG (SEQ ID NO: 24)
hGAPDH AGTTCCCCAACTTTCCCGCCTCTCAGCCTTTGAAAGAAAGAAAGGGGAGGGGGCAGGCCGCGTGCAGTCGCGAGCGGTGCTGGGCTCCGGCTCCAATTCCCCATCTCAGTCGCTCCCAAAGTCCTTCTGTTTCATCCAAGCGTGTAAGGGTCCCCGTCCTTGACTCCCTAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAGTCCTGGGAACCAGCACCGATCACCTCCCATCGGGCCAATCTCAGTCCCTTCCCCCCTACGTCGGGGCCCACACGCTCGGTGCGTGCCCAGTTGAACCAGGCGGCTGCGGAAAAAAAAAAGCGGGGAGAAAGTAGGGCCCGGCTACTAGCGGTTTTACGGGCGCACGTAGCTCAGGCCTCAAGACCTTGGGCTGGGACTGGCTGAGCCTGGCGGGAGGCGGGGTCCGAGTCACCGCCTGCCGCCGCGCCCCCGGTTTCTATAAATTGAGCCCGCAGCCTCCCGCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAGgtgaagacgggcggagagaaacccgggaggctagggacggcctgaaggcggcaggggcgggcgcaggccggatgtgttcgcgccgctgcggggtgggcccgggcggcctccgcattgcaggggcgggcggaggacgtgatgcggcgcgggctgggcatggaggcctggtgggggaggggaggggaggcgtgggtgtcggccggggccactaggcgctcactgttctctccctccgcgcagCCGAGCCACATCGCTGAGACAC (SEQ ID NO: 25)
hGRP78 AGTGCGGTTACCAGCGGAAATGCCTCGGGGTCAGAAGTCGCAGGAGAGATAGACAGCTGCTGAACCAATGGGACCAGCGGATGGGGCGGATGTTATCTACCATTGGTGAACGTTAGAAACGAATAGCAGCCAATGAATCAGCTGGGGGGGCGGAGCAGTGACGTTTATTGCGGAGGGGGCCGCTTCGAATCGGCGGCGGCCAGCTTGGTGGCCTGGGCCAATGAACGGCCTCCAACGAGCAGGGCCTTCACCAATCGGCGGCCTCCACGACGGGGCTGGGGGAGGGTATATAAGCCGAGTAGGCGACGGTGAGGTCGACGCCGGCCAAGACAGCACAGACAGATTGACCTATTGGGGTGTTTCGCGAGTGTGAGAGGGAAGCGCCGCGGCCTGTATTTCTAGACCTGCCCTTCGCCTGGTTCGTGGCGCCTTGTGACCCCGGGCCCCTGCCGCCTGCAAGTCGGAAATTGCGCTGTGCTCCTGTGCTACGGCCTGTGGCTGGACTGCCTGCTGCTGCCCAACTGGCTGGCAC (SEQ ID NO: 26)
hGRP94 TAGTTTCATCACCACCGCCACCCCCCCGCCCCCCCGCCATCTGAAAGGGTTCTAGGGGATTTGCAACCTCTCTCGTGTGTTTCTTCTTTCCGAGAAGCGCCGCCACACGAGAAAGCTGGCCGCGAAAGTCGTGCTGGAATCACTTCCAACGAAACCCCAGGCATAGATGGGAAAGGGTGAAGAACACGTTGCCATGGCTACCGTTTCCCCGGTCACGGAATAAACGCTCTCTAGGATCCGGAAGTAGTTCCGCCGCGACCTCTCTAAAAGGATGGATGTGTTCTCTGCTTACATTCATTGGACGTTTTCCCTTAGAGGCCAAGGCCGCCCAGGCAAAGGGGCGGTCCCACGCGTGAGGGGCCCGCGGAGCCATTTGATTGGAGAAAAGCTGCAAACCCTGACCAATCGGAAGGAGCCACGCTTCGGGCATCGGTCACCGCACCTGGACAGCTCCGATTGGTGGACTTCCGCCCCCCCTCACGAATCCTCATTGGGTGCCGTGGGTGCGTGGTGCGGCGCGATTGGTGGGTTCATGTTTCCCGTCCCCCGCCCGCGAGAAGTGGGGGTGAAAAGCGGCCCGACCTGCTTGGGGTGTAGTGGGCGGACCGCGCGGCTGGAGGTGTGAGGATCCGAACCCAGGGGTGGGGGGTGGAGGCGGCTCCTGCGATCGAAGGGGACTTGAGACTCACCGGCCGCACGTC (SEQ ID NO: 27)
hHSP70 GGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCC (SEQ ID NO: 28)
hKINb GCCCCACCCCCGTCCGCGTTACAACCGGGAGGCCCGCTGGGTCCTGCACCGTCACCCTCCTCCCTGTGACCGCCCACCTGATACCCAAACAACTTTCTCGCCCCTCCAGTCCCCAGCTCGCCGAGCGCTTGCGGGGAGCCACCCAGCCTCAGTTTCCCCAGCCCCGGGCGGGGCGAGGGGCGATGACGTCATGCCGGCGCGCGGCATTGTGGGGCGGGGCGAGGCGGGGCGCCGGGGGGAGCAACACTGAGACGCCATTTTCGGCGGCGGGAGCGGCGCAGGCGGCCGAGCGGGACTGGCTGGGTCGGCTGGGCTGCTGGTGCGAGGAGCCGCGGGGCTGTGCTCGGCGGCCAAGGGGACAGCGCGTGGGTGGCCGAGGATGCTGCGGGGCGGTAGCTCCGGCGCCCCTCGCTGGTGACTGCTGCGCCGTGCCTCACACAGCCGAGGCGGGCTCGGCGCACAGTCGCTGCTCCGCGCTCGCGCCCGGCGGCGCTCCAGGTGCTGACAGCGCGAGAGAGCGCGGCCTCAGGAGCAACAC (SEQ ID NO: 29)
hUBIb TTCCAGAGCTTTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTCAAATTCATCCGCCTGATAATTTTCTTATATTTTCCTAAAGAAGGAAGAGAAGCGCATAGAGGAGAAGGGAAATAATTTTTTAGGAGCCTTTCTTACGGCTATGAGGAATTTGGGGCTCAGTTGAAAAGCCTAAACTGCCTCTCGGGAGGTTGGGCGCGGCGAACTACTTTCAGCGGCGCACGGAGACGGCGTCTACGTGAGGGGTGATAAGTGACGCAACACTCGTTGCATAAATTTGCGCTCCGCCAGCCCGGAGCATTTAGGGGCGGTTGGCTTTGTTGGGTGAGCTTGTTTGTGTCCCTGTGGGTGGACGTGGTTGGTGATTGGCAGGATCCTGGTATCCGCTAACAGgtactggcccacagccgtaaagacctgcgggggcgtgagaggggggaatgggtgaggtcaagctggaggcttcttggggttgggtgggccgctgaggggaggggagggcgaggtgacgcgacacccggcctttctgggagagtgggccttgttgacctaaggggggcgagggcagttggcacgcgcacgcgccgacagaaactaacagacattaaccaacagcgattccgtcgcgtttacttgggaggaaggcggaaaagaggtagtttgtgtggcttctggaaaccctaaatttggaatcccagtatgagaatggtgtcccttcttgtgtttcaatgggatttttacttcgcgagtcttgtgggtttggttttgttttcagtttgcctaacaccgtgcttaggtttgaggcagattggagttcggtcgggggagtttgaatatccggaacagttagtggggaaagctgtggacgcttggtaagagagcgctctggattttccgctgttgacgttgaaaccttgaatgacgaatttcgtattaagtgacttagccttgtaaaattgaggggaggcttgcggaatattaacgtatttaaggcattttgaaggaatagttgctaattttgaagaatattaggtgtaaaagcaagaaatacaatgatcctgaggtgacacgcttatgttttacttttaaactagGTCACC (SEQ ID NO: 30)
CAG gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg (SEQ ID NO: 173)
HLP Tgtttgctgcttgcaatgtttgcccattttagggtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaat (SEQ ID NO: 174)
啟動子可為組織特異性啟動子。一般而言，組織特異性啟動子引導核酸(例如，編碼嵌合蛋白(諸如具有式 S - C - MT或 MT - C - S之膜可切割嵌合蛋白)之經工程改造之核酸)之轉錄，使得表現限於特定細胞類型、細胞器或組織。 組織特異性啟動子包括但不限於白蛋白(肝臟特異性，Pinkert等人，(1987))、淋巴特異性啟動子(Calame及Eaton，1988)、T細胞受體之特定啟動子(Winoto及Baltimore，(1989))及免疫球蛋白之特定啟動子(Banerji等人，(1983)；Queen及Baltimore，1983)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne及Ruddle，1989)、胰臟特異性啟動子(Edlund等人，(1985))或乳腺特異性啟動子(乳清啟動子，美國專利第4,873,316號及歐洲申請公開案第264,166號)以及發育調控之啟動子，諸如鼠類hox啟動子(Kessel及Gruss，Science 249:374-379 (1990))或α-甲胎蛋白啟動子(Campes及Tilghman，Genes Dev. 3:537-546 (1989))，該等文獻中之每一者之內容皆以引用方式完全併入本文中。啟動子在各別特定細胞類型、細胞器或組織中可為組成型。組織特異性啟動子及/或調控元件亦可包括來自以下之啟動子：對結腸上皮細胞特異之肝臟脂肪酸結合(FAB)蛋白基因；對胰臟細胞特異之胰島素基因；對肝臟細胞特異之轉甲狀腺素蛋白(transphyretin)、.α1.-抗胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑1型(PAI-I)、脂蛋白元AI及LDL受體基因；對寡樹突細胞特異之髓磷脂鹼性蛋白(MBP)基因；對膠質細胞特異之神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)基因；對靶向眼特異之OPSIN；以及對神經細胞特異之神經特異性烯醇酶(NSE)啟動子。組織特異性啟動子之實例包括但不限於用於肌酸激酶之啟動子(其已用於引導在肌肉及心臟組織中之表現)及用於在B細胞中表現之免疫球蛋白重鏈或輕鏈啟動子。其他組織特異性啟動子包括人類平滑肌α-肌動蛋白啟動子。用於肝臟之例示性組織特異性表現元件包括但不限於HMG-COA還原酶啟動子、固醇調控元件1、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)啟動子、人類C-反應蛋白(CRP)啟動子、人類葡萄糖激酶啟動子、膽固醇L 7-α羥化酶(hydroylase) (CYP-7)啟動子、β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸轉移酶(sialylkansferase)啟動子、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP-I)啟動子、醛縮酶B啟動子、人類轉鐵蛋白啟動子及I型膠原啟動子。用於前列腺之例示性組織特異性表現元件包括但不限於前列腺酸性磷酸酶(PAP)啟動子、前列腺分泌蛋白94 (PSP 94)啟動子、前列腺特異性抗原複合物啟動子及人類腺激肽釋放酶基因啟動子(hgt-1)。用於胃組織之例示性組織特異性表現元件包括但不限於人類H+/K+-ATP酶α次單元啟動子。用於胰臟之例示性組織特異性表現元件包括但不限於胰臟炎相關蛋白啟動子(PAP)、彈性蛋白酶1轉錄增強子、胰臟特異性澱粉酶及彈性蛋白酶增強子啟動子以及胰臟膽固醇酯酶基因啟動子。用於子宮內膜之例示性組織特異性表現元件包括但不限於子宮珠蛋白啟動子。用於腎上腺細胞之例示性組織特異性表現元件包括但不限於膽固醇側鏈切割(SCC)啟動子。用於一般神經系統之例示性組織特異性表現元件包括但不限於γ-γ烯醇酶(神經元特異性烯醇酶，NSE)啟動子。用於腦之例示性組織特異性表現元件包括但不限於神經絲重鏈(NF-H)啟動子。用於淋巴球之例示性組織特異性表現元件包括但不限於人類CGL-1/顆粒酶B啟動子、末端去氧轉移酶(TdT)、λ 5、VpreB及lck (淋巴球特異性酪胺酸蛋白激酶p561ck)啟動子、人類CD2啟動子及其3'轉錄增強子，以及人類NK及T細胞特異性活化(NKG5)啟動子。用於結腸之例示性組織特異性表現元件包括但不限於pp60c-src酪胺酸激酶啟動子、器官特異性新抗原(OSN)啟動子及結腸特異性抗原-P啟動子。用於乳房細胞之組織特異性表現元件係例如但不限於人類α-乳白蛋白啟動子。用於肺之例示性組織特異性表現元件包括但不限於囊性纖維化跨膜傳導調控物(CFTR)基因啟動子。
在一些實施例中，本揭示案之啟動子受腫瘤微環境內之信號調節。若在存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低至少10%，則認為腫瘤微環境調節啟動子。在一些實施例中，啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。舉例而言，啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。
在一些實施例中，啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，啟動子之活性相對於不存在腫瘤微環境之情況下啟動子之活性增加或降低2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
在一些實施例中，本揭示案之啟動子在缺氧條件下受到活化。「缺氧條件」係身體或身體區域在組織水準上缺乏足夠氧供應之條件。缺氧條件可引起發炎(例如，在缺氧條件下炎性細胞介素之水準增加)。在一些實施例中，在缺氧條件下活化之啟動子可操作地連接至編碼嵌合蛋白之核苷酸，該蛋白降低炎性細胞介素活性之表現，因而減少缺氧條件引起之發炎。在一些實施例中，在缺氧條件下活化之啟動子包含缺氧反應性元件(HRE)。「缺氧反應性元件(HRE)」係對缺氧誘導因子(HIF)作出反應之反應元件。在一些實施例中，HRE包含共有模體NCGTG (其中N係A或G)。 活化條件控制多肽 (ACP) 啟動子系統
在一些實施例中，合成啟動子係包括活化條件控制多肽- (ACP-)結合結構域序列及啟動子序列之啟動子系統。該系統在本文中亦稱為「ACP反應性啟動子」。一般而言，ACP啟動子系統包括編碼活化條件控制多肽(ACP)之第一表現盒及編碼ACP反應性啟動子之第二表現盒，該ACP反應性啟動子可操作地連接至外源性多核苷酸序列，諸如編碼本文所述之膜可切割嵌合蛋白或任何其他所關注蛋白(例如，蛋白酶)之外源性多核苷酸序列。在一些實施例中，第一表現盒及第二表現盒各自由單獨的經工程改造之核酸編碼。在其他實施例中，第一表現盒及第二表現盒由相同的經工程改造之核酸編碼。ACP反應性啟動子可以可操作地連接至編碼單一所關注蛋白或多種所關注蛋白之核苷酸序列。
ACP啟動子系統之啟動子(例如，驅動ACP表現之啟動子或ACP反應性啟動子之啟動子序列)可包括本文所述之任何啟動子序列(參見上文之「啟動子」)。ACP反應性啟動子可源自minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應性元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、minCMV、YB_TATA、minTK、誘導物分子反應性啟動子及其銜接重複。在一些實施例中，ACP反應性啟動子包括最小啟動子。
在一些實施例中，ACP結合結構域包括一或多個鋅指結合位點。在一些實施例中，ACP反應性啟動子包括最小啟動子且ACP結合結構域包括一或多個鋅指結合位點。ACP結合結構域可包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個鋅指結合位點。在一些實施例中，轉錄因子係含鋅指之轉錄因子。在一些實施例中，含鋅指之轉錄因子係合成轉錄因子。在一些實施例中，ACP結合結構域包括一或多個鋅指結合位點且ACP具有結合DNA之鋅指蛋白結構域(ZF蛋白結構域)。在一些實施例中，ACP具有結合DNA之鋅指蛋白結構域(ZF蛋白結構域)及效應物結構域。在一些實施例中，ACP結合結構域包括一或多個鋅指結合位點且ACP具有結合DNA之鋅指蛋白結構域(ZF蛋白結構域)及效應物結構域。在一些實施例中，ZF蛋白結構域在設計上係模組化的且由鋅指陣列(ZFA)構成。鋅指陣列包含多個連接在一起之鋅指蛋白模體。每一鋅指模體結合至不同的核酸模體。此導致對任何期望核酸序列具有特異性之ZFA，例如，對具有特定鋅指結合位點組成及/或構形之ACP結合結構域具有期望特異性之ZFA。ZF模體可彼此直接相鄰，或由撓性連接體序列隔開。在一些實施例中，ZFA係串聯佈置之ZF模體之陣列、串或鏈。ZFA可具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個鋅指模體。ZFA可具有1-10個、1-15個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、2-3個、2-4個、2-5個、2-6個、2-7個、2-8個、2-9個、2-10個、3-4個、3-5個、3-6個、3-7個、3-8個、3-9個、3-10個、4-5個、4-6個、4-7個、4-8個、4-9個、4-10個、5-6個、5-7個、5-8個、5-9個、5-10個或5-15個鋅指模體。ZF蛋白結構域可具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或更多個ZFA。ZF結構域可具有1-10個、1-15個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、2-3個、2-4個、2-5個、2-6個、2-7個、2-8個、2-9個、2-10個、3-4個、3-5個、3-6個、3-7個、3-8個、3-9個、3-10個、4-5個、4-6個、4-7個、4-8個、4-9個、4-10個、5-6個、5-7個、5-8個、5-9個、5-10個或5-15個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含1至10個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少一個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少2個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少3個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少4個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少5個ZFA。在一些實施例中，ZF蛋白結構域包含至少10個ZFA。
在一些實施例中，ACP係轉錄調節劑。在一些實施例中，ACP係轉錄阻遏物。在一些實施例中，ACP係轉錄活化劑。在一些實施例中，ACP係轉錄因子。在一些實施例中，ACP包含DNA結合結構域及轉錄效應物結構域。在一些實施例中，DNA結合結構域包含四環素(或其衍生物)阻遏物(TetR)結構域。在一些實施例中，ACP係本揭示案之抗原識別受體。
ACP亦可進一步包括效應物結構域，諸如轉錄效應物結構域。舉例而言，轉錄效應物結構域可為轉錄因子之效應物或活化劑結構域。轉錄因子活化結構域亦稱為反式活化結構域，且充當用於蛋白(諸如用於活化或阻遏基因轉錄之轉錄共調控劑)之支架結構域。任何適宜轉錄效應物結構域皆可用於ACP，包括但不限於單純疱疹病毒蛋白16 (VP16)活化結構域；由VP16之四個串聯拷貝組成之活化結構域，即VP64活化結構域；NFκB之p65活化結構域；艾司坦-巴爾病毒R反式活化劑(Rta)活化結構域；包含VP64、p65及Rta活化結構域之三重活化劑，該三重活化劑稱為VPR活化結構域；人類E1A相關蛋白p300之組蛋白乙醯基轉移酶(HAT)核心結構域，稱為p300 HAT核心活化結構域；Krüppel相關框(KRAB)阻遏結構域；阻遏物元件沈默轉錄因子(REST)阻遏結構域；毛狀相關鹼性螺旋-環-螺旋阻遏蛋白之WRPW模體，該模體稱為WRPW阻遏結構域；DNA (胞嘧啶-5)-甲基轉移酶3B (DNMT3B)阻遏結構域；及HP1α色影阻遏結構域或其任一組合。
在一些實施例中，效應物結構域係選自以下之轉錄效應物結構域：單純疱疹病毒蛋白16 (VP16)活化結構域；由VP16之四個串聯拷貝組成之活化結構域，即VP64活化結構域；NFκB之p65活化結構域；艾司坦-巴爾病毒R反式活化劑(Rta)活化結構域；包含VP64、p65及Rta活化結構域之三重活化劑，該三重活化劑稱為VPR活化結構域；人類E1A相關蛋白p300之組蛋白乙醯基轉移酶(HAT)核心結構域，稱為p300 HAT核心活化結構域；Krüppel相關框(KRAB)阻遏結構域；阻遏物元件沈默轉錄因子(REST)阻遏結構域；毛狀相關鹼性螺旋-環-螺旋阻遏蛋白之WRPW模體，該模體稱為WRPW阻遏結構域；DNA (胞嘧啶-5)-甲基轉移酶3B (DNMT3B)阻遏結構域；及HP1α色影阻遏結構域。
在一些實施例中，ACP係小分子(例如，藥物)誘導型多肽。舉例而言，在一些實施例中，ACP可由四環素(或其衍生物)誘導，且包含TetR結構域及VP16效應物結構域。在一些實施例中，ACP包括雌激素受體變異體，諸如ERT2，且可由他莫昔芬(tamoxifen)或其代謝物(諸如4-羥基-他莫昔芬[4-OHT]、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物或內昔芬)，藉助他莫昔芬控制之核定位來調控。
在一些實施例中，ACP係小分子(例如，藥物)誘導型多肽，其包括阻遏性蛋白酶及阻遏性蛋白酶之一或多個同源切割位點。在一些實施例中，阻遏性蛋白酶在不存在特定劑之情況下係有活性(切割同源切割位點)，且在存在特定劑之情況下無活性(不切割同源切割位點)。在一些實施例中，特定劑係蛋白酶抑制劑。在一些實施例中，蛋白酶抑制劑特異性地抑制本揭示案之給定阻遏性蛋白酶。阻遏性蛋白酶可為能夠藉由特定劑之存在或缺失而不活化之本文所述任何蛋白酶(關於例示性阻遏性蛋白酶、同源切割位點及蛋白酶抑制劑，參見上文之「蛋白酶切割位點」)。
在一些實施例中，ACP具有降解決定子結構域(關於例示性降解決定子序列，參見上文之「降解決定子系統及結構域」)。降解決定子結構域可相對於ACP之個別結構域處於任何順序或位置。舉例而言，降解決定子結構域可為阻遏性蛋白酶之N末端、阻遏性蛋白酶之C末端、ZF蛋白結構域之N末端、ZF蛋白結構域之C末端、效應物結構域之N末端或效應物結構域之C末端。 多順反子及多啟動子系統
在一些實施例中，經工程改造之核酸(例如，包含表現盒之經工程改造之核酸)經構形以產生多種嵌合蛋白。舉例而言，核酸可經構形以產生2-20種不同的嵌合蛋白。在一些實施例中，核酸經構形以產生2-20種、2-19種、2-18種、2-17種、2-16種、2-15種、2-14種、2-13種、2-12種、2-11種、2-10種、2-9種、2-8種、2-7種、2-6種、2-5種、2-4種、2-3種、3-20種、3-19種、3-18種、3-17種、3-16種、3-15種、3-14種、3-13種、3-12種、3-11種、3-10種、3-9種、3-8種、3-7種、3-6種、3-5種、3-4種、4-20種、4-19種、4-18種、4-17種、4-16種、4-15種、4-14種、4-13種、4-12種、4-11種、4-10種、4-9種、4-8種、4-7種、4-6種、4-5種、5-20種、5-19種、5-18種、5-17種、5-16種、5-15種、5-14種、5-13種、5-12種、5-11種、5-10種、5-9種、5-8種、5-7種、5-6種、6-20種、6-19種、6-18種、6-17種、6-16種、6-15種、6-14種、6-13種、6-12種、6-11種、6-10種、6-9種、6-8種、6-7種、7-20種、7-19種、7-18種、7-17種、7-16種、7-15種、7-14種、7-13種、7-12種、7-11種、7-10種、7-9種、7-8種、8-20種、8-19種、8-18種、8-17種、8-16種、8-15種、8-14種、8-13種、8-12種、8-11種、8-10種、8-9種、9-20種、9-19種、9-18種、9-17種、9-16種、9-15種、9-14種、9-13種、9-12種、9-11種、9-10種、10-20種、10-19種、10-18種、10-17種、10-16種、10-15種、10-14種、10-13種、10-12種、10-11種、11-20種、11-19種、11-18種、11-17種、11-16種、11-15種、11-14種、11-13種、11-12種、12-20種、12-19種、12-18種、12-17種、12-16種、12-15種、12-14種、12-13種、13-20種、13-19種、13-18種、13-17種、13-16種、13-15種、13-14種、14-20種、14-19種、14-18種、14-17種、14-16種、14-15種、15-20種、15-19種、15-18種、15-17種、15-16種、16-20種、16-19種、16-18種、16-17種、17-20種、17-19種、17-18種、18-20種、18-19種或19-20種嵌合蛋白。在一些實施例中，核酸經構形以產生1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種或20種嵌合蛋白。
一般而言，本文所述之經工程改造之核酸係多順反子，亦即，如上文所述。
經工程改造之核酸亦可使用多個啟動子自多個ORF表現基因，亦即，可自單一經工程改造之核酸產生超過一種單獨的mRNA轉錄本。舉例而言，第一啟動子可以可操作地連接至編碼第一嵌合蛋白之多核苷酸序列，且第二啟動子可以可操作地連接至編碼第二嵌合蛋白之多核苷酸序列。一般而言，可使用任何數目之啟動子來表現任何數目之嵌合蛋白。在一些實施例中，自多個啟動子表現之ORF中之至少一個可為多順反子。
如本文所用之「連接體」可指連接第一多肽序列及第二多肽序列之多肽、上述多順反子連接體或可操作地連接至上述額外ORF之額外啟動子。 經工程改造之細胞
本文提供經工程改造之細胞，以及產生經工程改造之細胞之方法，其產生(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者。一般而言，本揭示案之經工程改造之細胞可經工程改造以表現本文所提供之嵌合蛋白，諸如本文所述之膜可切割嵌合蛋白、二價aCAR及iCAR中之每一者。 該等細胞在本文中稱為「經工程改造之細胞」。該等通常含有經工程改造之核酸之細胞在自然界中並不存在。在一些實施例中，細胞經工程改造以包括包含啟動子之核酸，該啟動子可操作地連接至編碼嵌合蛋白(例如膜可切割嵌合蛋白)之核苷酸序列。經工程改造之細胞可包含整合至細胞基因體中之經工程改造之核酸。經工程改造之細胞可包含能夠在不整合至細胞基因體(例如，用諸如質體或mRNA等瞬時表現系統工程改造)中之情況下表現的經工程改造之核酸。
本揭示案亦涵蓋一或多種嵌合蛋白與產生其之經工程改造之細胞之間的相加性及協同作用。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少兩種(例如，2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)嵌合蛋白，例如至少兩種膜可切割嵌合蛋白。在其他實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白具有並非由細胞天然產生之效應分子。該效應分子可例如補充由細胞天然產生之效應分子之功能。
在一些實施例中，細胞經工程改造以表現膜系鏈之抗CD3及/或抗CD28促效劑細胞外結構域。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生多種嵌合蛋白。舉例而言，細胞可經工程改造以產生2-20種不同的嵌合蛋白，諸如2-20種不同的膜可切割嵌合蛋白。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生2-20種、2-19種、2-18種、2-17種、2-16種、2-15種、2-14種、2-13種、2-12種、2-11種、2-10種、2-9種、2-8種、2-7種、2-6種、2-5種、2-4種、2-3種、3-20種、3-19種、3-18種、3-17種、3-16種、3-15種、3-14種、3-13種、3-12種、3-11種、3-10種、3-9種、3-8種、3-7種、3-6種、3-5種、3-4種、4-20種、4-19種、4-18種、4-17種、4-16種、4-15種、4-14種、4-13種、4-12種、4-11種、4-10種、4-9種、4-8種、4-7種、4-6種、4-5種、5-20種、5-19種、5-18種、5-17種、5-16種、5-15種、5-14種、5-13種、5-12種、5-11種、5-10種、5-9種、5-8種、5-7種、5-6種、6-20種、6-19種、6-18種、6-17種、6-16種、6-15種、6-14種、6-13種、6-12種、6-11種、6-10種、6-9種、6-8種、6-7種、7-20種、7-19種、7-18種、7-17種、7-16種、7-15種、7-14種、7-13種、7-12種、7-11種、7-10種、7-9種、7-8種、8-20種、8-19種、8-18種、8-17種、8-16種、8-15種、8-14種、8-13種、8-12種、8-11種、8-10種、8-9種、9-20種、9-19種、9-18種、9-17種、9-16種、9-15種、9-14種、9-13種、9-12種、9-11種、9-10種、10-20種、10-19種、10-18種、10-17種、10-16種、10-15種、10-14種、10-13種、10-12種、10-11種、11-20種、11-19種、11-18種、11-17種、11-16種、11-15種、11-14種、11-13種、11-12種、12-20種、12-19種、12-18種、12-17種、12-16種、12-15種、12-14種、12-13種、13-20種、13-19種、13-18種、13-17種、13-16種、13-15種、13-14種、14-20種、14-19種、14-18種、14-17種、14-16種、14-15種、15-20種、15-19種、15-18種、15-17種、15-16種、16-20種、16-19種、16-18種、16-17種、17-20種、17-19種、17-18種、18-20種、18-19種或19-20種嵌合蛋白。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種或20種嵌合蛋白。
在一些實施例中，經工程改造之細胞包含一或多種編碼啟動子之經工程改造之核酸，該啟動子可操作地連接至編碼嵌合蛋白之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞經工程改造以包括複數種經工程改造之核酸，例如，至少兩種經工程改造之核酸，各自編碼可操作地連接至編碼至少一種(例如，1種、2種或3種)嵌合蛋白之核苷酸序列的啟動子。舉例而言，細胞可經工程改造以包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少8種、至少9種或至少10種經工程改造之核酸，各自編碼可操作地連接至編碼至少一種(例如，1種、2種或3種)嵌合蛋白之核苷酸序列的啟動子。在一些實施例中，細胞經工程改造以包含2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種經工程改造之核酸，各自編碼可操作地連接至編碼至少一種(例如，1種、2種或3種)嵌合蛋白之核苷酸序列的啟動子。經工程改造之細胞可包含編碼至少一種上述連接體之經工程改造之核酸，該等連接體諸如連接第一多肽序列及第二多肽序列之多肽、一或多種上述多順反子連接體、一或多種可操作地連接至額外ORF之額外啟動子或其組合。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以表現蛋白酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以表現對於細胞而言異源之蛋白酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以表現對於表現嵌合蛋白之細胞而言異源之蛋白酶，諸如切割膜可切割嵌合蛋白之蛋白酶切割位點之異源性蛋白酶。在一些實施例中，經工程改造之細胞包含一或多種編碼啟動子之經工程改造之核酸，該啟動子可操作地連接至編碼蛋白酶(諸如異源性蛋白酶)之核苷酸序列。蛋白酶及蛋白酶切割位點更詳細地闡述於本文標題為「蛋白酶切割位點」之部分中。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生至少一種歸巢分子。「歸巢」係指細胞主動導航(遷移)至靶位點(例如，細胞、組織(例如，腫瘤)或器官)。「歸巢分子」係指將細胞引導至靶位點之分子。在一些實施例中，歸巢分子之功能係識別及/或起始經工程改造之細胞與靶位點之相互作用。歸巢分子之非限制性實例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7及PDGFR。
在一些實施例中，歸巢分子係趨化介素受體(結合至趨化介素之細胞表面分子)。可由本揭示案之經工程改造之細胞產生之趨化介素受體的非限制性實例包括：CXC趨化介素受體(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6及CXCR7)、CC趨化介素受體(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10及CCR11)、CX3C趨化介素受體(例如，CX3CR1，其結合至CX3CL1)及XC趨化介素受體(例如，XCR1)。在一些實施例中，趨化介素受體係G蛋白連接之跨膜受體，或腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之成員(包括但不限於TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生CXCL8、CXCL9及/或CXCL10 (促進T細胞募集)、CCL3及/或CXCL5、CCL21 (Th1募集及極化)。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生CXCR4。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生偵測含N-甲醯基化之寡肽之G蛋白偶聯受體(GPCR) (包括但不限於FPR2及FPRL1)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生偵測介白素之受體(包括但不限於IL6R)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生偵測自其他細胞、組織或腫瘤分泌之生長因子之受體(包括但不限於FGFR、PDGFR、EGFR及VEGF家族(包括但不限於VEGF-C及VEGF-D)之受體)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生一或多種整聯蛋白。本揭示案之細胞可經工程改造以產生整聯蛋白α及β次單元之任一組合。整聯蛋白之α次單元可為但不限於：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整聯蛋白之β次單元可為但不限於：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7及ITGB8。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生一或多種基質金屬蛋白酶(MMP)。MMP之非限制性實例包括MMP-2、MMP-9及MMP。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生抑制MMP之分子(例如，蛋白)之抑制劑。舉例而言，細胞可經工程改造以表現膜1型MMP (MT1-MMP)之抑制劑(例如，RNAi分子)或TIMP金屬肽酶抑制劑1 (TIMP-1)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生例如在靶組織之內皮上結合至選擇蛋白之配位體(例如，造血細胞E-/L-選擇蛋白配位體(HCELL)，Dykstran等人，Stem Cells. 2016年10月；34(10):2501-2511)。
術語「歸巢分子」亦涵蓋調控改良/增強細胞歸巢之分子之產生的轉錄因子。
本文亦提供經工程改造以產生多種嵌合蛋白之經工程改造之細胞，該等蛋白中之至少兩種包括調節不同腫瘤介導之免疫抑制機制之效應分子。在一些實施例中，至少一種(例如，1種、2種、3種、4種、5種或更多種)嵌合蛋白包括刺激腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制或抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制之效應分子。在一些實施例中，至少一種(例如，1種、2種、3種、4種、5種或更多種)嵌合蛋白包括抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制之效應分子，且至少一種嵌合蛋白(例如，1種、2種、3種、4種、5種或更多種)抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制。在其他實施例中，至少兩種(例如，2種、3種、4種、5種或更多種)嵌合蛋白包括刺激腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制之效應分子。在其他實施例中，至少兩種(例如，1種、2種、3種、4種、5種或更多種)嵌合蛋白包括抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制之效應分子。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激T細胞傳訊、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激抗原呈現及/或加工之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激自然殺手細胞介導之細胞毒性傳訊、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激樹突細胞分化及/或成熟之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激免疫細胞募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激M1巨噬細胞傳訊、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激Th1極化之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激基質降解之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激免疫刺激代謝物產生之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括刺激I型干擾素傳訊之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制負共刺激傳訊之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制抗腫瘤免疫細胞之促凋亡傳訊(例如，經由TRAIL)之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制T調控性(T reg)細胞傳訊、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制腫瘤檢查點分子之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括活化干擾素基因刺激物(STING)傳訊之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制髓源性抑制性細胞傳訊、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括降解免疫抑制因子/代謝物之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括抑制血管內皮生長因子傳訊之效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括直接殺傷腫瘤細胞之效應分子(例如，顆粒酶、穿孔蛋白、溶瘤病毒、溶細胞肽及酶、抗腫瘤抗體，該等抗腫瘤抗體例如觸發ADCC)。
在一些實施例中，至少一種嵌合蛋白，其包括效應分子，該效應分子刺激T細胞傳訊、活性及/或募集，刺激抗原呈現及/或加工，刺激自然殺手細胞介導之細胞毒性傳訊、活性及/或募集，刺激樹突細胞分化及/或成熟，刺激免疫細胞募集，刺激巨噬細胞傳訊，刺激基質降解，刺激免疫刺激代謝物產生，或刺激I型干擾素傳訊；及至少一種嵌合蛋白，其包括效應分子，該效應分子抑制負共刺激傳訊，抑制抗腫瘤免疫細胞之促凋亡傳訊，抑制T調控性(Treg)細胞傳訊、活性及/或募集，抑制腫瘤檢查點分子，活化干擾素基因刺激物(STING)傳訊，抑制髓源性抑制性細胞傳訊、活性及/或募集，降解免疫抑制因子/代謝物，抑制血管內皮生長因子傳訊，或直接殺傷腫瘤細胞。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自以下之效應分子：IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及CD40L；及/或至少一種檢查點抑制劑。可靶向阻斷或抑制之說明性免疫檢查點分子包括但不限於CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬於CD2分子家族且在所有NK、γδT及記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (亦稱為BY55)以及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括結合至以下中之一或多種且阻斷或抑制其活性之抗體或其抗原結合片段或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。例示性檢查點抑制劑包括但不限於抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、抗TIGIT抗體、抗VISTA抗體、抗KIR抗體、抗B7-H3抗體、抗B7-H4抗體、抗HVEM抗體、抗BTLA抗體、抗GAL9抗體、抗A2AR抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗體、抗CD27抗體、抗TNFa抗體、抗TREMl抗體及抗TREM2抗體。說明性免疫檢查點抑制劑包括派姆單抗(pembrolizumab) (抗PD-1；MK-3475/Keytruda® - Merck)、納武單抗(nivolumamb) (抗PD-1；Opdivo® - BMS)、匹利珠單抗(pidilizumab) (抗PD-1抗體；CT-011 - Teva/CureTech)、AMP224 (抗PD-1；NCI)、阿維單抗(avelumab)(抗PD-L1；Bavencio® - Pfizer)、德瓦魯單抗(durvalumab) (抗PD-L1；MEDI4736/ Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca)、阿替珠單抗(atezolizumab) (抗PD-L1；Tecentriq® - Roche/Genentech)、BMS-936559 (抗PD-L1 - BMS)、替西木單抗(tremelimumab) (抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、伊匹單抗(ipilimumab) (抗CTLA-4；Yervoy ® - BMS)、利瑞魯單抗(lirilumab) (抗KIR；BMS)、莫納珠單抗(monalizumab) (抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自以下之效應分子：IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及CD40L；及/或至少一種選自以下之檢查點抑制劑：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及抗IL-35抗體；及/或至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自MIP1α (CCL3)、MIP1β (CCL5)及CCL21之效應分子；及/或至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自CpG寡去氧核苷酸之效應分子；及/或至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自微生物肽之效應分子。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生IFN-β及至少一種嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括選自以下之效應分子：細胞介素、抗體、趨化介素、核苷酸、肽、酶及干擾素基因刺激物(STING)。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生IFN-β及至少一種細胞介素或受體/配位體(例如，IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及/或CD40L)。
在一些實施例中，細胞(例如，免疫細胞或幹細胞)經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子(例如，式 S - C - MT或 MT - C - S中之「S」)係細胞介素、趨化介素、歸巢分子、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、配位體、抗體、肽或酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係細胞介素。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係趨化介素。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係歸巢分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係生長因子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係共活化分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係腫瘤微環境調節劑。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係配位體。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係肽。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係酶。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子(例如，式 S - C - MT或 MT - C - S中之「S」)係IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-12p70融合蛋白、IL-15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干擾素、干擾素-γ或TNF-α。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合蛋白、CCL19、CXCL9或XCL1。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係抗整聯蛋白α4,β7、抗MAdCAM、SDF1或MMP-2。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係4-1BBL或CD40L。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑或HPGE2。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP或其組合。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、抗TIGIT抗體、抗VISTA抗體、抗KIR抗體、抗B7-H3抗體、抗B7-H4抗體、抗HVEM抗體、抗BTLA抗體、抗GAL9抗體、抗A2AR抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗體、抗CD27抗體、抗TNFa抗體、抗TREMl抗體或抗TREM2抗體。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子(例如，式 S - C - MT或 MT - C - S中之「S」)包含IL-15。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15及IL-15Rα之sushi結構域之融合物。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應物由IL-15組成。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生一或多種額外效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生一或多種額外可分泌效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生細胞介素、趨化介素、歸巢分子、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、配位體、抗體、多核苷酸、肽或酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體或CD40L。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-12。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IFN-γ。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-2。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-7。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-36γ。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-18。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生IL-1β。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生OX40-配位體。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生CD40L。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，且細胞進一步經工程改造以產生一或多種額外之膜可切割嵌合蛋白。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子(例如，式 S - C - MT或 MT - C - S中之「S」)係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生一或多種額外之膜可切割嵌合蛋白。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係細胞介素、趨化介素、歸巢分子、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、配位體、抗體、多核苷酸、肽或酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體或CD40L。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-12。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IFN-γ。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-2。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-7。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-36γ。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-18。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係IL-1β。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係OX40-配位體。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效應分子係IL-15，且細胞進一步經工程改造以產生額外膜可切割嵌合蛋白，其中額外可分泌效應分子係CD40L。
細胞亦可進一步經工程改造以表現除本文所述嵌合蛋白(例如，本文所述具有式 S - C - MT或 MT - C - S之膜可切割嵌合蛋白)、所關注蛋白或效應分子之外之額外蛋白。細胞可進一步經工程改造以表現一或多種抗原識別受體。可被一或多種抗原識別受體靶向之抗原之實例包括但不限於5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BCMA、C4.4、CA6、鈣黏蛋白3、鈣黏蛋白6、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD33、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、密連蛋白18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、蝶素A4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FLT3、FRα、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC2、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、整聯蛋白aV、KIT、L1CAM、LAMP1、Lewis Y、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、間皮素、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、連接素4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、卵巢素、P-鈣黏蛋白、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、存活素、TDGF1、TIM1、TROP2及WT1。
抗原識別受體可包括抗原結合結構域，諸如抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)、或單結構域抗體(sdAb)。抗原識別受體可包括scFv。scFv可包括可由肽連接體隔開之重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。舉例而言，scFv可包括結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH係重鏈可變結構域，L係肽連接體，且VL係輕鏈可變結構域。
抗原識別受體可為嵌合抗原受體(CAR)。CAR可具有一或多個細胞內傳訊結構域，諸如CD3ζ鏈細胞內傳訊結構域、CD97細胞內傳訊結構域、CD11a-CD18細胞內傳訊結構域、CD2細胞內傳訊結構域、ICOS細胞內傳訊結構域、CD27細胞內傳訊結構域、CD154細胞內傳訊結構域、CD8細胞內傳訊結構域、OX40細胞內傳訊結構域、4-1BB細胞內傳訊結構域、CD28細胞內傳訊結構域、ZAP40細胞內傳訊結構域、CD30細胞內傳訊結構域、GITR細胞內傳訊結構域、HVEM細胞內傳訊結構域、DAP10細胞內傳訊結構域、DAP12細胞內傳訊結構域、MyD88細胞內傳訊結構域、其片段、其組合或其片段之組合。CAR可具有跨膜結構域，諸如CD8跨膜結構域、CD28跨膜結構域、CD3ζ鏈跨膜結構域、CD4跨膜結構域、4-1BB跨膜結構域、OX40跨膜結構域、ICOS跨膜結構域、CTLA-4跨膜結構域、PD-1跨膜結構域、LAG-3跨膜結構域、2B4跨膜結構域、BTLA跨膜結構域、其片段、其組合或其片段之組合。CAR可具有介於抗原結合結構域與跨膜結構域之間之間隔區。
抗原識別受體可為T細胞受體(TCR)。 經工程改造之細胞類型
本文亦提供經工程改造之細胞。細胞可經工程改造以包含本文所述之任何經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之膜可切割嵌合蛋白、二價aCAR及iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。 細胞可經工程改造以具有本文所述之任何經工程改造之細胞之任何特徵。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生以下中之每一者之細胞：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。 在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種嵌合蛋白之細胞。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種本文所述嵌合蛋白之細胞，其中每一嵌合蛋白係不同的所關注蛋白或效應分子。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生本文所述任何嵌合蛋白且經工程改造以單獨產生不同效應分子或所關注蛋白(例如，歸巢分子、抗原受體等)之細胞。
經工程改造之細胞可為免疫細胞，包括但不限於T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、γ-δ (γδ) T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調控性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球或樹突細胞。經工程改造之細胞可為T細胞。經工程改造之細胞可為NK細胞。經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞亦稱為CAR細胞。舉例而言，經工程改造以表現CAR之T細胞亦稱為CAR-T細胞且同樣經工程改造以表現CAR之NK細胞亦稱為CAR-NK細胞。
經工程改造之細胞可為幹細胞，包括但不限於人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC源細胞、富潛能幹細胞、間質基質細胞(MSC)、誘導性富潛能幹細胞(iPSC)或iPSC源細胞。
經工程改造之細胞可為腫瘤源細胞。腫瘤細胞之實例包括但不限於膀胱腫瘤細胞、腦腫瘤細胞、乳房腫瘤細胞、子宮頸腫瘤細胞、結腸直腸腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、神經膠質瘤細胞、腎腫瘤細胞、肝腫瘤細胞、肺腫瘤細胞、黑色素瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、皮膚腫瘤細胞、甲狀腺腫瘤細胞及子宮腫瘤細胞。
可使用熟習此項技術者已知之方法對細胞進行工程改造以產生嵌合蛋白。舉例而言，可轉導細胞以對腫瘤進行工程改造。在實施例中，使用病毒轉導細胞。
在具體實施例中，使用溶瘤病毒轉導細胞。溶瘤病毒之實例包括但不限於溶瘤單純疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安納水疱病毒(Indiana vesiculovirus)、溶瘤新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、溶瘤牛痘病毒、溶瘤脊髓灰白質炎病毒、溶瘤黏液瘤病毒、溶瘤里奧病毒(reovirus)、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤馬拉巴病毒(Maraba virus)、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤輪狀病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤風疹病毒、溶瘤登革熱病毒(dengue virus)、溶瘤屈公病病毒(chikungunya virus)、溶瘤呼吸道融合細胞病毒、溶瘤淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒屬(morbillivirus)、溶瘤慢病毒、溶瘤複製逆轉錄病毒、溶瘤棒狀病毒、溶瘤塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus)、溶瘤辛德比病毒(sindbis virus)及其任一變異體或衍生物。
病毒(包括本文所述之任何溶瘤病毒)可為編碼一或多種編碼一或多種嵌合蛋白之轉基因(諸如本文所述任何經工程改造之核酸)之重組病毒。病毒(包括本文所述之任何溶瘤病毒)可為編碼一或多種編碼兩種或更多種嵌合蛋白中一或多種之轉基因(諸如本文所述任何經工程改造之核酸)之重組病毒。
本文亦提供經工程改造之紅血球。紅血球可經工程改造以包含本文所述之任何經工程改造之核酸。紅血球可經工程改造以具有本文所述之任何經工程改造之細胞之任何特徵。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生一或多種本文所述嵌合蛋白之紅血球。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種本文所述嵌合蛋白之紅血球。
本文亦提供經工程改造之血小板細胞。血小板細胞可經工程改造以包含本文所述之任何經工程改造之核酸。血小板細胞可經工程改造以具有本文所述之任何經工程改造之細胞之任何特徵。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生一或多種本文所述嵌合蛋白之血小板細胞。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種本文所述嵌合蛋白之血小板細胞。
本文亦提供經工程改造之細菌細胞。細菌細胞可經工程改造以包含本文所述之任何經工程改造之核酸。細菌細胞可經工程改造以具有本文所述之任何經工程改造之細胞之任何特徵。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種本文所述嵌合蛋白之細菌細胞。細菌細胞可經工程改造以產生一或多種哺乳動物來源之嵌合蛋白。細菌細胞可經工程改造以產生兩種或更多種哺乳動物來源之嵌合蛋白。細菌細胞之實例包括但不限於拜氏梭菌( Clostridium beijerinckii)、產芽孢梭菌( Clostridium sporogenes)、諾維氏梭菌( Clostridium novyi)、大腸桿菌( Escherichia coli)、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)、單核球增多性李氏菌( Listeria monocytogenes)、鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhimurium)及豬霍亂沙氏桿菌( Salmonella choleraesuis)。
經工程改造之細胞可為人類細胞。經工程改造之細胞可為人類原代細胞。經工程改造之原代細胞可為腫瘤浸潤性原代細胞。經工程改造之原代細胞可為原代T細胞。經工程改造之原代細胞可為造血幹細胞(HSC)。經工程改造之原代細胞可為自然殺手(NK)細胞。經工程改造之原代細胞可為任何體細胞。經工程改造之原代細胞可為MSC。人類細胞(例如，免疫細胞)可經工程改造以包含本文所述之任何經工程改造之核酸。人類細胞(例如，免疫細胞)可經工程改造以具有本文所述之任何經工程改造之細胞之任何特徵。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生一或多種本文所述嵌合蛋白之人類細胞(例如，免疫細胞)。在具體態樣中，本文提供經工程改造以產生兩種或更多種本文所述蛋白嵌合之人類細胞(例如，免疫細胞)。
經工程改造之細胞可自個體(自體) (諸如已知或懷疑患有癌症之個體)分離。細胞分離方法係熟習此項技術者已知的且包括但不限於基於細胞表面標記物表現之分選技術(諸如FACS分選)、陽性分離技術及陰性分離、磁分離及其組合。就投與治療之個體而言，經工程改造之細胞可為同種異體的。同種異體修飾細胞可與投與治療之個體進行HLA匹配。經工程改造之細胞可為經培養細胞，諸如離體培養細胞。經工程改造之細胞可為離體培養細胞，諸如自個體分離之原代細胞。經培養細胞可與一或多種細胞介素一起培養。
本文亦提供包括培養本揭示案之經工程改造之細胞之方法。已知培養本文所述之經工程改造之細胞之方法。熟習此項技術者將認識到培養條件將取決於所關注具體經工程改造之細胞。熟習此項技術者將認識到培養條件將取決於經工程改造之細胞之特定下游用途，例如用於隨後將經工程改造之細胞投與個體之特定培養條件。 工程改造細胞之方法
本文亦提供用於工程改造細胞以產生一或多種所關注蛋白或效應分子(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之多順反子表現系統)之組成物及方法。
一般而言，細胞藉助以下方式經工程改造以產生所關注蛋白或效應分子：將編碼一或多種所關注蛋白或效應分子(例如，包括所關注蛋白或效應分子之本文所述嵌合蛋白)之多核苷酸引入(亦即，遞送)至細胞之細胞溶質及/或細胞核中。舉例而言，編碼一或多種嵌合蛋白之多核苷酸可為編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子表現系統。遞送方法包括但不限於病毒介導之遞送、脂質介導之轉染、奈米粒子遞送、電穿孔、音波處理及藉由物理手段之細胞膜變形。熟習此項技術者將瞭解遞送方法之選擇可取決於欲工程改造之特定細胞類型。 病毒介導之遞送
基於病毒載體之遞送平臺可用於對細胞進行工程改造。一般而言，基於病毒載體之遞送平臺藉助引入(亦即遞送)至宿主細胞中來工程改造細胞。舉例而言，基於病毒載體之遞送平臺可藉助引入本文所述之任何經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統，及/或含有啟動子及編碼嵌合蛋白(自N末端至C末端定向)之外源性多核苷酸序列之本文所述任何表現盒)來工程改造細胞。 基於病毒載體之遞送平臺可為核酸，且因此，經工程改造之核酸亦可涵蓋經工程改造之病毒來源之核酸。該等經工程改造之病毒來源之核酸亦可稱為重組病毒或經工程改造之病毒。
基於病毒載體之遞送平臺可在同一核酸內編碼超過一種之經工程改造之核酸、基因或轉基因。舉例而言，經工程改造之病毒來源之核酸(例如，重組病毒或經工程改造之病毒)可編碼一或多種轉基因，包括但不限於編碼一或多種本文所述嵌合蛋白的本文所述任何經工程改造之核酸。一或多種編碼一或多種嵌合蛋白之轉基因可經構形以表現一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白。基於病毒載體之遞送平臺亦可編碼一或多種除一或多種轉基因(例如，編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之轉基因)之外之基因，諸如病毒感染性及/或病毒產生所需之病毒基因(例如，衣殼蛋白、包膜蛋白、病毒聚合酶、病毒轉錄酶等)，稱為順式作用元件或基因。
基於病毒載體之遞送平臺可包含超過一種病毒載體，諸如編碼本文所述且稱為反式作用元件或基因之經工程改造之核酸、基因或轉基因的單獨病毒載體。舉例而言，基於輔助病毒(helper)依賴型病毒載體之遞送平臺可在一或多種除編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之載體之外之額外單獨載體上提供病毒感染性及/或病毒產生所需之額外基因。一種病毒載體可遞送超過一種經工程改造之核酸，諸如一種遞送經工程改造之核酸之載體，該等經工程改造之核酸經構形以產生兩種或更多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白。超過一種病毒載體可遞送超過一種經工程改造之核酸，諸如超過一種遞送一或多種經工程改造之核酸之載體，該經工程改造之核酸經構形以產生一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白。所用病毒載體之數目可取決於上述基於病毒載體之疫苗平臺之包裝能力，且熟習此項技術者可選擇適當數目之病毒載體。
一般而言，任何基於病毒載體之系統皆可用於分子(諸如本文所述之嵌合蛋白、效應分子及/或其他所關注蛋白)之活體外產生，或用於活體內及離體基因療法程序，例如，用於活體內遞送編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之經工程改造之核酸。適當的基於病毒載體之系統之選擇將取決於多種因素，諸如貨物(cargo)/酬載大小、病毒系統之免疫原性、所關注靶細胞、基因表現強度及定時，以及熟習此項技術者所瞭解之其他因素。
基於病毒載體之遞送平臺可為基於RNA之病毒或基於DNA之病毒。例示性基於病毒載體之遞送平臺包括但不限於單純疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒、流感病毒、印第安納水疱病毒、新城雞瘟病毒、牛痘病毒、脊髓灰白質炎病毒、黏液瘤病毒、里奧病毒、腮腺炎病毒、馬拉巴病毒、狂犬病病毒、輪狀病毒、肝炎病毒、風疹病毒、登革熱病毒、屈公病病毒、呼吸道融合細胞病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、麻疹病毒屬、慢病毒、複製逆轉錄病毒、棒狀病毒、塞尼卡谷病毒、辛德比病毒及其任一變異體或衍生物。此項技術中闡述了其他例示性的基於病毒載體之遞送平臺，諸如牛痘、禽痘、自複製α病毒、馬拉巴病毒、腺病毒(參見例如Tatsis等人，Adenoviruses, Molecular Therapy(2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括但不限於第二代、第三代或雜交第二代/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒(其經設計以靶向特定細胞類型或受體) (參見例如Hu等人，Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev.(2011) 239(1): 45-61；Sakuman等人，Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J.(2012) 443(3):603-18；Cooper等人，Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res.(2015) 43 (1): 682-690；Zufferey等人，Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In vivoGene Delivery, J. Virol.(1998) 72 (12): 9873-9880)。
序列之前可有一或多個靶向亞細胞區室之序列。在引入(亦即遞送)至宿主細胞中後，受感染細胞(亦即，經工程改造之細胞)可表現嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白。可用於免疫方案中之牛痘載體及方法闡述於例如美國專利第4,722,848號中。另一載體係BCG (卡介苗，Bacille Calmette Guerin)。BCG載體闡述於Stover等人(Nature 351:456-460 (1991))中。熟習此項技術者根據本文中之描述將明瞭可用於引入(亦即，遞送)經工程改造之核酸之眾多種其他載體，例如，傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)載體及諸如此類。
基於病毒載體之遞送平臺可為靶向細胞之病毒，在本文中稱為溶瘤病毒。溶瘤病毒之實例包括但不限於溶瘤單純疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安納水疱病毒、溶瘤新城雞瘟病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤脊髓灰白質炎病毒、溶瘤黏液瘤病毒、溶瘤里奧病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤馬拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤輪狀病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤風疹病毒、溶瘤登革熱病毒、溶瘤屈公病病毒、溶瘤呼吸道融合細胞病毒、溶瘤淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒屬、溶瘤慢病毒、溶瘤複製逆轉錄病毒、溶瘤棒狀病毒、溶瘤塞尼卡谷病毒、溶瘤辛德比病毒及其任一變異體或衍生物。本文所述之任何溶瘤病毒可為重組溶瘤病毒，其包含一或多種編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之轉基因(例如，經工程改造之核酸)。編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之轉基因可經構形以表現嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白。
基於病毒載體之遞送平臺可基於逆轉錄病毒。一般而言，逆轉錄病毒載體包含包裝容量高達6-10 kb外源序列之順式作用之長末端重複。最小順式作用之LTR足以複製及包裝載體，接著將其用於將一或多種經工程改造之核酸(例如，編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之轉基因)整合至靶細胞中以提供永久性轉基因表現。基於逆轉錄病毒之遞送系統包括但不限於基於鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺失病毒(SIV)、人類免疫缺失病毒(HIV)及其組合之彼等(參見例如Buchscher等人，J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johann等人，J. Virol. 66:1635-1640 (1992)；Sommnerfelt等人，Virol. 176:58-59 (1990)；Wilson等人，J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Miller等人，J, Virol. 65:2220-2224 (1991)；PCT/US94/05700)。其他逆轉錄病毒系統包括Phoenix逆轉錄病毒系統。
基於病毒載體之遞送平臺可基於慢病毒。一般而言，慢病毒載體係能夠轉導或感染非分裂細胞且通常產生高病毒效價之逆轉錄病毒載體。基於慢病毒之遞送平臺可基於HIV，諸如ViraPower系統(ThermoFisher)或pLenti系統(Cell Biolabs)。基於慢病毒之遞送平臺可基於SIV或FIV。其他例示性的基於慢病毒之遞送平臺更詳細地闡述於美國專利第7,311,907號、第7,262,049號、第7,250,299號、第7,226,780號、第7,220,578號、第7,211,247號、第7,160,721號、第7,078,031號、第7,070,993號、第7,056,699號、第6,955,919號中，該等美國專利各自出於所有目的以引用方式併入本文中。
基於病毒載體之遞送平臺可基於腺病毒。一般而言，基於腺病毒之載體能夠在許多細胞類型中具有非常高之轉導效率，無需細胞分裂，達成高效價及高水準之表現，且可在相對簡單之系統中大量生產。一般而言，腺病毒可用於轉基因在受感染細胞內之瞬時表現，此乃因腺病毒通常不會整合至宿主基因體中。基於腺病毒之遞送平臺詳細地闡述於以下文獻中：Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524, 1999；Li及Davidson，PNAS 92:7700 7704, 1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:1088 1097, 1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655，該等文獻各自出於所有目的以引用方式併入本文中。其他例示性的基於腺病毒之遞送平臺更詳細地闡述於美國專利第5585362號、第6,083,716號、第7,371,570號、第7,348,178號、第7,323,177號、第7,319,033號、第7,318,919號及第7,306,793號以及國際專利申請案WO96/13597中，該等專利及申請案各自出於所有目的以引用方式併入本文中。
基於病毒載體之遞送平臺可基於腺相關病毒(AAV)。腺相關病毒(「AAV」)載體可用於用經工程改造之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)轉導細胞。AAV系統可用於所關注蛋白(諸如本文所述嵌合蛋白及/或效應分子)之活體外產生，或用於活體內及離體基因療法程序，例如，用於活體內遞送編碼一或多種嵌合蛋白及/或其他所關注蛋白之經工程改造之核酸(參見例如West等人，Virology 160:38-47 (1987)；美國專利第4,797,368號、第5,436,146號、第6,632,670號、第6,642,051號、第7,078,387號、第7,314,912號、第6,498,244號、第7,906,111號；美國專利公開案US 2003-0138772、US 2007/0036760及US 2009/0197338；Gao等人，J. Virol, 78(12):6381-6388 (2004年6月)；Gao等人，Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (2003年5月13日)；及國際專利申請案WO 2010/138263及WO 93/24641；Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)，該等文獻各自出於所有目的以引用方式併入本文中)。構築重組AAV載體之例示性方法更詳細地闡述於以下文獻中：美國專利第5,173,414號；Tratschin等人，Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschin等人，Mol. Cell, Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat及Muzyczka，PNAS 81:64666470 (1984)；及Samuiski等人，J. Virol. 63:03822-3828 (1989)，該等文獻各自出於所有目的以引用方式併入本文中。一般而言，基於AAV之載體包含具有對應於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及其變異體中之任一種之胺基酸序列之衣殼蛋白。在具體實例中，基於AAV之載體具有具對應於AAV2之胺基酸序列之衣殼蛋白。在具體實例中，基於AAV之載體具有具對應於AAV8之胺基酸序列之衣殼蛋白。
AAV載體可經工程改造以具有編碼本文所述具有式 S - C - MT或 MT - C - S之膜可切割嵌合蛋白之任何外源性多核苷酸序列。
基於病毒載體之遞送平臺可為病毒樣粒子(VLP)平臺。一般而言，VLP係藉由產生病毒結構蛋白並純化所得病毒粒子來構築。接著，在純化之後，將貨物/酬載(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)離體囊封在經純化之粒子內。因此，VLP之產生維持了編碼病毒結構蛋白之核酸與編碼貨物/酬載之核酸之分離。用於VLP產生中之病毒結構蛋白可在多種表現系統(包括哺乳動物、酵母、昆蟲、細菌或活體內轉譯表現系統)中產生。可使用熟習此項技術者已知之方法，在期望貨物存在下使經純化之病毒粒子變性及重整以產生VLP。VLP之產生更詳細地闡述於Seow等人(Mol Ther. 2009年5月；17(5): 767-777)中，該文獻出於所有目的以引用方式併入本文中。
基於病毒載體之遞送平臺可經工程改造以靶向(亦即，感染)一定範圍之細胞，靶向窄子集之細胞或靶向特定細胞。一般而言，為基於病毒載體之遞送平臺選擇之包膜蛋白將決定病毒向性。用於基於病毒載體之遞送平臺中之病毒可經假型化以靶向所關注特定細胞。基於病毒載體之遞送平臺可為泛向性的且感染一定範圍之細胞。舉例而言，泛向性的基於病毒載體之遞送平臺可包括VSV-G包膜。基於病毒載體之遞送平臺可為雙向性的且感染哺乳動物細胞。因此，熟習此項技術者可選擇適當向性、假型及/或包膜蛋白以用於靶向期望細胞類型。 脂質結構遞送系統
可使用脂質介導之遞送系統將經工程改造之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)引入細胞中。一般而言，脂質介導之遞送系統使用由包封內部區室之外部脂質膜構成之結構。基於脂質之結構之實例包括但不限於基於脂質之奈米粒子、脂質體、膠束、胞外體、囊泡、細胞外囊泡、細胞或組織。脂質結構遞送系統可活體外、活體內或離體遞送貨物/酬載(例如，本文所述任何經工程改造之核酸)。
基於脂質之奈米粒子可包括但不限於單層脂質體、多層脂質體及脂質製劑。如本文所用，「脂質體」係涵蓋脂質媒劑之活體外製劑之一般術語，該等脂質媒劑係藉由將期望貨物(例如，經工程改造之核酸，諸如本文所述任何經工程改造之核酸)封閉在脂質殼或脂質聚集物內而形成。脂質體可表徵為具有囊泡結構，其具有一般包含磷脂之雙層膜，以及一般包含水性組成物之內部介質。脂質體包括但不限於乳液、發泡體、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、層狀層及諸如此類。脂質體可為單層脂質體。脂質體可為多層脂質體。脂質體可為多泡脂質體。脂質體可帶正電荷、帶負電荷或帶電中性。在某些實施例中，脂質體在電荷上係中性的。可自標準囊泡形成脂質形成脂質體，該等脂質一般包括中性及帶負電荷之磷脂及固醇，諸如膽固醇。脂質之選擇一般藉由考慮期望目的(例如，用於活體內遞送之準則，諸如脂質體大小、酸不穩定性及脂質體在血流中之穩定性)來指導。多種方法可用於製備脂質體，如例如以下文獻中所述：Szokan等人，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)；美國專利第4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號，各自出於所有目的以引用方式併入本文中。
當包含磷脂之脂質懸浮於過量水溶液中，使得多個脂質層由水性介質分開時，自發生成多層脂質體。在脂質組分經受自我重排後，水及溶解之溶質包埋在脂質雙層之間之閉合結構中。期望貨物(例如，多肽、核酸、小分子藥物、經工程改造之核酸(諸如本文所述之任何經工程改造之核酸)、病毒載體、基於病毒之遞送系統等)可囊封在脂質體之水性內部，經由與脂質體及多肽/核酸締合之連接分子附接至脂質體，散佈在脂質體之脂質雙層內，包埋在脂質體中，與脂質體複合，或以其他方式與脂質體締合，使得可將其遞送至靶實體。親脂性分子或具有親脂性區域之分子亦可溶解於脂質雙層中或與脂質雙層締合。
根據本實施例使用之脂質體可藉由如熟習此項技術者已知之不同方法制得。脂質體之製備進一步詳細闡述於WO 2016/201323、國際申請案PCT/US85/01161及PCT/US89/05040，以及美國專利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505及4,921,706中；該等申請案及專利各自出於所有目的以引用方式併入本文中。
脂質體可為陽離子脂質體。陽離子脂質體之實例更詳細地闡述於美國專利第5,962,016號、第5,030,453號、第6,680,068號、美國申請案2004/0208921及國際專利申請案WO03/015757A1、WO04029213A2及WO02/100435A1中，該等專利各自全文特此以引用方式併入。
脂質介導之基因遞送方法闡述於例如以下文獻中：WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino及Gould-Fogerite，BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)；美國專利第5,279,833號；Rose，美國專利第5,279,833號；WO91/06309；及Felgner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)，該等文獻各自出於所有目的以引用方式併入本文中。
胞外體係內吞來源之小膜囊泡，其在多泡體與質膜融合後釋放至細胞外環境中。胞外體之直徑大小在介於30 nm與100 nm之間之範圍內。其表面由來自供體細胞之細胞膜之脂質雙層組成，且其含有來自產生胞外體之細胞之細胞溶質，且在表面上展示來自親代細胞之膜蛋白。可用於遞送核酸之胞外體係熟習此項技術者已知的，例如，更詳細地闡述於美國專利第9,889,210號中之胞外體，該美國專利出於所有目的以引用方式併入本文中。
如本文所用，術語「細胞外囊泡」或「EV」係指包含封閉內部空間之膜之細胞來源囊泡。一般而言，細胞外囊泡包含直徑小於其所來源之細胞之所有膜結合囊泡。一般地，細胞外囊泡在20 nm至1000 nm之直徑範圍內，且可包含在內部空間內、展示在細胞外囊泡之外表面上及/或跨越膜之各種大分子貨物。貨物可包含核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)、蛋白、碳水化合物、脂質、小分子及/或其組合。舉例而言且不受限制，細胞外囊泡包括凋亡體、細胞碎片、藉由直接或間接操作(例如，藉由系列擠出或用鹼性溶液處理)自細胞獲得之囊泡、囊泡化細胞器及由活細胞產生(例如，藉由直接質膜出芽或晚期內體與質膜融合)之囊泡。細胞外囊泡可源自活的或死的生物體、經外植組織或器官及/或經培養細胞。
如本文所用，術語「胞外體」係指細胞來源之小(直徑在20-300 nm之間，更佳直徑為40-200 nm)囊泡，其包含封閉內部空間之膜，且係藉由直接質膜出芽或藉由晚期內體與質膜融合，由細胞生成。胞外體包含脂質或脂肪酸及多肽，且視情況包含酬載(例如，治療劑)、接收體(receiver) (例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，諸如本文所述任何經工程改造之核酸)、糖(例如，單糖、多糖或聚糖)或其他分子。胞外體可源自生產細胞，且基於其大小、密度、生物化學參數或其組合自生產細胞分離。胞外體係一種細胞外囊泡。一般地，胞外體之產生/生體合成不會導致生產細胞之破壞。胞外體及胞外體之製備進一步詳細地闡述於WO 2016/201323中，該專利特此以全文引用方式併入。
如本文所用，術語「奈米囊泡」(亦稱為「微泡」)係指細胞來源之小(直徑在20-250 nm之間，更佳直徑為30-150 nm)囊泡，其包含封閉內部空間之膜，且係藉由直接或間接操作，自細胞生成，使得在沒有該操作之情況下該奈米囊泡將不會由該生產細胞產生。一般而言，奈米囊泡係細胞外囊泡之亞種。生產細胞之適當操作包括但不限於系列擠出、用鹼性溶液處理、音波處理或其組合。在一些情況下，奈米囊泡之產生可導致該生產細胞之破壞。較佳地，奈米囊泡群體實質上不含藉由自質膜直接出芽或晚期內體與質膜融合而自生產細胞獲得之囊泡。奈米囊泡包含脂質或脂肪酸及多肽，且視情況包含酬載(例如，治療劑)、接收體(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，諸如本文所述任何經工程改造之核酸)、糖(例如，單糖、多糖或聚糖)或其他分子。奈米囊泡在其根據該操作自生產細胞獲得後，可基於其大小、密度、生物化學參數或其組合自生產細胞分離。
一般而言，脂質奈米粒子(LNP)係合成脂質結構，其依靠脂質之兩親性質以形成膜及囊泡樣結構(Riley 2017)。一般而言，該等囊泡藉由吸收至靶細胞之膜中並將貨物釋放至細胞溶質中來遞送貨物/酬載，諸如本文所述之任何經工程改造之核酸或病毒系統。用於LNP形成中之脂質可為陽離子、陰離子或中性的。脂質可為合成的或天然來源的，且在一些情況下係可生物降解的。脂質可包括脂肪、膽固醇、磷脂、脂質偶聯物(包括但不限於聚乙二醇(PEG)偶聯物(聚乙二醇化脂質))、蠟、油、甘油酯及脂溶性維生素。脂質組成物一般包括諸如陽離子脂質、中性脂質、陰離子脂質及兩親脂質等材料之限定混合物。在一些情況下，包括特定脂質以防止LNP聚集，防止脂質氧化或提供促進額外部分連接之官能性化學基團。脂質組成物可影響總體LNP大小及穩定性。在實例中，脂質組成物包含4-二甲基胺基丁酸二亞油醯基甲酯(MC3)或MC3樣分子。MC3及MC3樣脂質組成物可經調配以包括一或多種其他脂質，諸如PEG或PEG偶聯之脂質、固醇或中性脂質。另外，LNP可進一步經工程改造或官能化，以促進特定細胞類型之靶向。LNP設計中之另一考慮因素係靶向效率與細胞毒性之間之平衡。
一般而言，膠束係使用單鏈脂質形成之球形合成脂質結構，其中單鏈脂質之親水頭部形成外層或外膜，且單鏈脂質之疏水尾部形成膠束中心。膠束通常係指僅含有脂質單層之脂質結構。膠束更詳細地闡述於Quader等人(Mol Ther. 2017年7月5日；25(7): 1501-1513)中，該文獻出於所有目的以引用方式併入本文。
直接暴露於血清之核酸載體(諸如表現載體)可具有若干不期望後果，包括血清核酸酶對核酸之降解或游離核酸對免疫系統之脫靶刺激。類似地，直接暴露於血清之病毒遞送系統可觸發不期望之免疫反應及/或病毒遞送系統之中和。因此，經工程改造之核酸及/或病毒遞送系統之囊封可用於避免降解，同時亦避免潛在脫靶效應。在某些實例中，將經工程改造之核酸及/或病毒遞送系統完全囊封在遞送媒劑內，諸如囊封在LNP之水性內部內。可藉由熟習此項技術者熟知之技術(諸如在微流體液滴生成裝置上實施之微流體混合及液滴生成)來實施在LNP內囊封經工程改造之核酸及/或病毒遞送系統。該等裝置包括但不限於標準T型接合部裝置或流動聚焦裝置。在實例中，將期望脂質調配物(諸如含有MC3或MC3樣之組成物)與經工程改造之核酸或病毒遞送系統及任何其他期望劑平行地提供給液滴生成裝置，使得遞送載體及期望劑完全囊封在基於MC3或MC3樣之LNP之內部內。在實例中，液滴生成裝置可控制所產生之LNP之大小範圍及大小分佈。舉例而言，LNP之直徑大小可在1至1000奈米範圍內，例如，1、10、50、100、500或1000奈米。在液滴生成之後，囊封貨物/酬載(例如 ，經工程改造之核酸及/或病毒遞送系統)之遞送媒劑可進一步經處理或工程改造以準備其用於投與。 奈米粒子遞送
奈米材料可用於遞送經工程改造之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)。重要的是，奈米材料媒劑可由非免疫原性材料製成，且一般避免誘發對遞送載體本身之免疫性。該等材料可包括但不限於脂質(如先前所述)、無機奈米材料及其他聚合物材料。奈米材料粒子更詳細地闡述於Riley等人(Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery—A Review. Nanomaterials 2017, 7(5), 94)中，該文獻出於所有目的以引用方式併入本文中。 基因體編輯系統
基因體編輯系統可用於對宿主基因體進行工程改造以編碼經工程改造之核酸，諸如編碼一或多種嵌合蛋白之經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。 一般而言，「基因體編輯系統」係指用於將外源基因整合至宿主細胞基因體中之任何系統。基因體編輯系統包括但不限於轉位子系統、核酸酶基因體編輯系統及基於病毒載體之遞送平臺。
轉位子系統可用於將經工程改造之核酸整合至宿主基因體中，諸如編碼一或多種嵌合蛋白之經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。 轉位子一般包含側接貨物/酬載核酸及轉位酶之末端反向重複(TIR)。轉位子系統可提供與TIR側接貨物呈順式或反式之轉位子。轉位子系統可為逆轉錄轉位子系統或DNA轉位子系統。一般而言，轉位子系統將貨物/酬載(例如，經工程改造之核酸)隨機整合至宿主基因體中。轉位子系統之實例包括使用Tc1/mariner轉位子超家族轉位子之系統，諸如更詳細地闡述於以下文獻中之睡美人轉位子系統(Sleeping Beauty transposon system)：Hudecek等人(Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017年8月；52(4):355-380)；以及美國專利第6,489,458號、第6,613,752號及第7,985,739號，該等文獻中之每一者皆出於所有目的以引用方式併入本文中。轉位子系統之另一實例包括更詳細地闡述於美國專利第6,218,185號及第6,962,810號中之PiggyBac轉位子系統，該等美國專利中之每一者皆出於所有目的以引用方式併入本文中。
核酸酶基因體編輯系統可用於對宿主基因體進行工程改造以編碼經工程改造之核酸，諸如編碼一或多種嵌合蛋白之經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。不希望受理論束縛，一般而言，用於引入外源基因之核酸酶介導之基因編輯系統利用細胞之天然DNA修復機制，特別是同源重組(HR)修復路徑。簡言之，在基因體DNA受到傷害(通常係雙鏈斷裂)之後，細胞可藉由在DNA合成期間使用在5’及3’端二者處皆具有一致或實質上一致之序列的另一DNA源作為模板以修復損傷來解決該傷害。在天然背景下，HDR可使用存在於細胞中之另一染色體作為模板。在基因編輯系統中，將外源性多核苷酸引入細胞中以用作同源重組模板(HRT或HR模板)。一般而言，包括在HRT內之5’及3’互補端之間的任何最初未在具有損傷之染色體中發現之額外外源序列(例如，基因或基因之一部分)皆可在模板化HDR期間併入(亦即，「整合」)至給定基因體基因座中。因此，用於給定基因體基因座之典型HR模板具有與內源性基因體靶基因座之第一區一致之核苷酸序列、與內源性基因體靶基因座之第二區一致之核苷酸序列及編碼貨物/酬載核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸，諸如編碼一或多種嵌合蛋白之任何經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統))之核苷酸序列。
在一些實例中，HR模板可為線性。線性HR模板之實例包括但不限於線性化質體載體、ssDNA、合成DNA及PCR擴增之DNA。在具體實例中，HR模板可為環狀，諸如質體。環狀模板可包括超螺旋模板。
在HR模板之5’及3’端發現之一致或實質上一致之序列就欲引入之外源性序列而言一般稱為臂(HR臂)。HR臂可與內源性基因體靶基因座之區域一致(亦即，100%一致)。一些實例中之HR臂可與內源性基因體靶基因座之區域實質上一致。雖然可使用實質上一致之HR臂，但HR臂一致可能有利，此乃因HDR路徑之效率可能受到具有小於100%一致性之HR臂影響。
每一HR臂(亦即，5’及3’ HR臂)可為相同大小或不同大小。每一HR臂之長度可各自大於或等於50個、100個、200個、300個、400個或500個鹼基。儘管HR臂一般而言可為任何長度，但亦可慮及實際考慮因素，諸如HR臂長度及總體模板大小對總體編輯效率之影響。HR臂可與緊鄰切割位點之內源性基因體靶基因座之區域一致或實質上一致。每一HR臂皆可與緊鄰切割位點之內源性基因體靶基因座之區域一致或實質上一致。每一HR臂皆可與內源性基因體靶基因座在切割位點一定距離(諸如彼此為1個鹼基對、小於或等於10個鹼基對、小於或等於50個鹼基對或小於或等於100個鹼基對)內之區域一致或實質上一致。
核酸酶基因體編輯系統可使用多種核酸酶來切割靶基因體基因座，包括但不限於成簇規則間隔短迴文重複(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或其衍生物、鋅指核酸酶(ZFN)或其衍生物及歸巢內核酸酶(HE)或其衍生物。
CRISPR介導之基因編輯系統可用於對宿主基因體進行工程改造以編碼經工程改造之核酸，諸如編碼一或多種嵌合蛋白之經工程改造之核酸(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。 CRISPR系統更詳細地闡述於M. Adli (「The CRISPR tool kit for genome editing and beyond」Nature Communications；第9卷(2018年)，論文編號：1911)中，該文獻教示之所有內容以引用方式併入本文中。一般而言，CRISPR介導之基因編輯系統包含CRISPR相關(Cas)核酸酶及一或多個引導切割成特定靶序列之RNA。例示性CRISPR介導之基因編輯系統係CRISPR/Cas9系統，其包含Cas9核酸酶及一或多種RNA，該RNA具有CRISPR RNA (crRNA)結構域及反式活化CRISPR (tracrRNA)結構域。crRNA通常具有兩個RNA結構域：嚮導RNA序列(gRNA)，其藉助鹼基對雜交引導對靶序列(「所定義之核苷酸序列」) (例如，基因體序列)之特異性；及與tracrRNA雜交之RNA結構域。tracrRNA可與核酸酶(例如，Cas9)相互作用，且由此促進其募集至基因體基因座。crRNA及tracrRNA多核苷酸可為單獨之多核苷酸。crRNA及tracrRNA多核苷酸可為單一多核苷酸，亦稱為單一嚮導RNA (sgRNA)。雖然此處說明Cas9系統，但可使用其他CRISPR系統，諸如Cpf1/Cas12或Cas13系統。核酸酶可包括其衍生物，諸如Cas9功能突變體，例如，Cas9「切口酶」突變體，其一般介導所限定核苷酸序列之單鏈之切割，而非通常由Cas9酶產生之完全雙鏈斷裂。
一般而言，CRISPR系統之組分彼此相互作用以形成核糖核蛋白(RNP)複合物，以介導序列特異性切割。在一些CRISPR系統中，每一組分皆可單獨產生且用於形成RNP複合物。在一些CRISPR系統中，每一組分皆可在活體外單獨產生且在活體外相互接觸(亦即，「複合」)以形成RNP複合物。接著可將活體外產生之RNP引入(亦即，「遞送」)至細胞之細胞溶質及/或細胞核(例如，T細胞之細胞溶質及/或細胞核)中。可藉由多種手段將活體外產生之RNP複合物遞送至細胞，該等手段包括但不限於電穿孔、脂質介導之轉染、藉由物理手段之細胞膜變形、脂質奈米粒子(LNP)、病毒樣粒子(VLP)及音波處理。在具體實例中，可使用基於Nucleofactor/Nucleofection®電穿孔之遞送系統(Lonza®)將活體外產生之RNP複合物遞送至細胞。其他電穿孔系統包括但不限於MaxCyte電穿孔系統、Miltenyi CliniMACS電穿孔系統、Neon電穿孔系統及BTX電穿孔系統。CRISPR核酸酶(例如，Cas9)可使用熟習此項技術者已知之多種蛋白產生技術在活體外產生(亦即，合成且純化)。CRISPR系統RNA (例如，sgRNA)可使用熟習此項技術者已知之多種RNA產生技術(諸如活體外轉錄或化學合成)在活體外產生(亦即，合成且純化)。
活體外產生之RNP複合物可以不同比率之核酸酶與gRNA進行複合。活體外產生之RNP複合物亦可以不同量用於CRISPR介導之編輯系統中。舉例而言，取決於期望編輯之細胞之數目，可調整所添加之總RNP量，諸如在反應中編輯大量細胞時減少所添加之RNP複合物之量。
在一些CRISPR系統中，每一組分(例如，Cas9及sgRNA)皆可由多核苷酸單獨編碼，每一多核苷酸係一起或單獨引入細胞中。在一些CRISPR系統中，每一組分皆可由單一多核苷酸(亦即，多啟動子或多順反子載體，參見下文之例示性多順反子系統之描述)編碼且引入細胞中。在細胞內表現每一多核苷酸編碼之CRISPR組分(例如，核酸酶之轉譯及CRISPR RNA之轉錄)後，RNP複合物可在細胞內形成，且接著可引導位點特異性切割。
一些RNP可經工程改造以具有促進RNP遞送至細胞核中之部分。舉例而言，Cas9核酸酶可具有核定位信號(NLS)結構域，使得若Cas9 RNP複合物遞送至細胞之細胞溶質中或在Cas9轉譯及隨後之RNP形成之後，NLS可促進Cas9 RNP進一步轉運至細胞核中。
可使用非病毒方法對本文所述之經工程改造之細胞進行工程改造，例如，可使用非病毒方法將本文所述之核酸酶及/或CRISPR介導之基因編輯系統遞送至細胞。可使用病毒方法對本文所述之經工程改造之細胞進行工程改造，例如，可使用病毒方法(諸如本文所述之腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒或任何其他基於病毒之遞送方法)將本文所述之核酸酶及/或CRISPR介導之基因編輯系統遞送至細胞。
在一些CRISPR系統中，可提供超過一種CRISPR組成物，使得各自單獨地靶向相同基因或一般基因體基因座處之超過一種靶核苷酸序列。舉例而言，可提供兩種單獨的CRISPR組成物以引導在彼此相距一定距離內的兩種不同靶核苷酸序列處之切割。在一些CRISPR系統中，可提供超過一種CRISPR組成物，使得各自單獨地靶向相同基因或一般基因體基因座之相對鏈。舉例而言，可提供兩種單獨的CRISPR「切口酶」組成物以引導相同基因或一般基因體基因座相對鏈處之切割。
一般而言，本文所述之CRISPR介導之編輯系統之特徵可應用於其他基於核酸酶之基因體編輯系統。TALEN係經工程改造之位點特異性核酸酶，其係由TALE (轉錄活化劑樣效應物)之DNA結合結構域及限制性內核酸酶Fokl之催化結構域構成。藉由改變存在於DNA結合結構域單體之高度可變殘基區中之胺基酸，可產生不同人工TALEN以靶向各種核苷酸序列。DNA結合結構域隨後將核酸酶引導至靶序列並產生雙鏈斷裂。基於TALEN之系統更詳細地闡述於美國系列第12/965,590號；美國專利第8,450,471號；美國專利第8,440,431號；美國專利第8,440,432號；美國專利第10,172,880號；及美國系列第13/738,381號中，該等美國專利之全文皆以引用方式併入本文中。基於ZFN之編輯系統更詳細地闡述於美國專利第6,453,242號、第6,534,261號、第6,599,692號、第6,503,717號、第6,689,558號、第7,030,215號、第6,794,136號、第7,067,317號、第7,262,054號、第7,070,934號、第7,361,635號、第7,253,273號；及美國專利公開案第2005/0064474號、第2007/0218528號、第2005/0267061號中，該等美國專利及公開案之全文出於所有目的全部以引用方式併入本文中。 其他工程改造遞送系統
將經工程改造之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)引入細胞或其他靶接受者實體(諸如本文所述之任何脂質結構)中之各種額外手段。
電穿孔可用於將多核苷酸遞送至接受者實體。電穿孔係藉助施加電場以瞬時透化靶細胞或實體之外膜或外殼，將貨物/酬載內化至該靶細胞或實體之內部區室中之方法。一般而言，該方法涉及將細胞或靶實體置於含有所關注貨物(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)之溶液中的兩個電極之間。接著藉由施加容許貨物進入實體內部(諸如細胞之細胞質)之瞬時設定電壓來破壞細胞之脂質膜，亦即，使其透化。在細胞之實例中，至少一些(若非大部分)細胞保持存活。可在活體外、活體內或離體對細胞及其他實體進行電穿孔。電穿孔條件(例如，細胞數目、貨物濃度、回收條件、電壓、時間、電容、脈衝類型、脈衝長度、體積、比色管長度、電穿孔溶液組成等)取決於若干因素而變化，包括但不限於細胞或其他接受者實體之類型、欲遞送之貨物、期望之內化效率及期望之活力。該等準則之最佳化在熟習此項技術者之範圍內。多種裝置及方案可用於電穿孔。實例包括但不限於Neon ®轉染系統、MaxCyte ®Flow Electroporation™、Lonza ®Nucleofector™系統及Bio-Rad ®電穿孔系統。
用於將經工程改造之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸)引入細胞或其他靶接受者實體之其他手段包括但不限於音波處理、基因槍、流體動力學注射及藉由物理手段之細胞膜變形。
用於活體內遞送經工程改造之mRNA (諸如裸質體或mRNA)之組成物及方法詳細闡述於Kowalski等人(Mol Ther. 2019年4月10日；27(4): 710-728)及Kaczmarek等人(Genome Med. 2017; 9: 60.)中，該等文獻各自出於所有目的以引用方式併入本文中。 遞送媒劑
本文亦提供用於遞送貨物/酬載之組成物(「遞送媒劑」)。
貨物可包含如上文所述之核酸(例如，本文所述之任何經工程改造之核酸，諸如編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。貨物可包含蛋白、碳水化合物、脂質、小分子及/或其組合。貨物可為本文所提供之任何嵌合蛋白(例如，編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統)。貨物可為本文所述嵌合蛋白之組合，例如，本文所述嵌合蛋白中之兩種或更多種。貨物可為本文所述嵌合蛋白及另一所關注貨物(諸如另一蛋白、碳水化合物、脂質、小分子及/或其組合)之組合。
遞送媒劑可包含適於遞送貨物之任何組成物。遞送媒劑可包含適於遞送蛋白(例如，本文所述之嵌合任何蛋白)之任何組成物。遞送媒劑可為本文所述之任何脂質結構遞送系統。舉例而言，遞送媒劑可為基於脂質之結構，包括但不限於基於脂質之奈米粒子、脂質體、膠束、胞外體、囊泡、細胞外囊泡、細胞或組織。遞送媒劑可為本文所述之任何奈米粒子，諸如包含脂質(如先前所述)、無機奈米材料及其他聚合物材料之奈米粒子。
遞送媒劑可以能夠將貨物遞送至細胞，諸如將本文所述之任何嵌合蛋白遞送至細胞。遞送媒劑可以能夠將貨物遞送至細胞，諸如將本文所述之任何嵌合蛋白遞送至細胞。遞送媒劑可經構形以靶向特定細胞，諸如用重定向抗體構形以靶向特定細胞。遞送媒劑可以能夠將貨物遞送至活體內細胞。
遞送媒劑可以能夠將貨物遞送至組織或組織環境(例如，腫瘤微環境)，諸如將本文所述之任何嵌合蛋白活體內遞送至組織或組織環境。遞送貨物可包括分泌貨物，諸如分泌本文所述之任何嵌合蛋白。因此，遞送媒劑可以能夠分泌貨物，諸如分泌本文所述之任何嵌合蛋白。遞送媒劑可以能夠將貨物分泌至組織或組織環境(例如，腫瘤微環境)，諸如將本文所述之任何嵌合蛋白分泌至組織或組織環境中。遞送媒劑可經構形以靶向特定組織或組織環境(例如，腫瘤微環境)，諸如用重定向抗體構形以靶向特定組織或組織環境。 治療方法
本文進一步提供如下方法，其包括向個體(例如，人類個體)遞送或投與如本文所提供之經工程改造之細胞以在活體內產生至少一種由經工程改造之細胞產生的所關注蛋白(例如，本文所提供之任何嵌合蛋白，諸如編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統，或在蛋白酶切割嵌合蛋白之後為本文所提供之經分泌效應分子)。本文進一步提供如下方法，其包括向個體(例如，人類個體)遞送或投與如本文所提供之經工程改造之細胞以在活體內產生至少兩種由經工程改造之細胞產生的所關注蛋白，例如，至少兩種本文所提供之嵌合蛋白，諸如本文所述之(i)膜可切割之嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者。
本文進一步提供如下方法，其包括向個體(例如，人類個體)遞送或投與本文所述之任何遞送媒劑，諸如包含如下蛋白之本文所述任何遞送媒劑：本文所述之任何所關注蛋白，例如，本文所提供之任何嵌合蛋白，諸如本文所述之(i)膜可切割之嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者。本文進一步提供如下方法，其包括向個體(例如，人類個體)遞送或投與本文所述之任何遞送媒劑，諸如包含如下蛋白之本文所述任何遞送媒劑：兩種或更多種蛋白，例如，至少兩種本文所提供之嵌合蛋白，諸如本文所述之(i)膜可切割之嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者。
在一些實施例中，經工程改造之細胞或遞送媒劑係經由靜脈內、腹膜內、氣管內、皮下、腫瘤內、經口、肛門、鼻內(例如，填充在遞送粒子中)或動脈(例如，頸內動脈)途徑投與。因此，經工程改造之細胞或遞送媒劑可經全身或局部投與(例如，至TME或經由腫瘤內投與)。經工程改造之細胞可自個體(諸如已知或懷疑患有癌症之個體)分離。就投與治療之個體而言，經工程改造之細胞可為同種異體的。同種異體修飾細胞可與投與治療之個體進行HLA匹配。遞送媒劑可為本文所述之任何脂質結構遞送系統。遞送媒劑可為本文所述之任何奈米粒子。
取決於欲治療之疾患，經工程改造之細胞或遞送媒劑可單獨或與其他治療組合，同時或依序投與。舉例而言，經工程改造之細胞或遞送媒劑可與本文所述之一或多種IMiD組合投與。FDA批准之IMiD可以其經批准之方式投與。在另一實例中，經工程改造之細胞或遞送媒劑可與檢查點抑制劑療法組合投與。例示性檢查點抑制劑包括但不限於抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、抗TIGIT抗體、抗VISTA抗體、抗KIR抗體、抗B7-H3抗體、抗B7-H4抗體、抗HVEM抗體、抗BTLA抗體、抗GAL9抗體、抗A2AR抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗體、抗CD27抗體、抗TNFa抗體、抗TREMl抗體及抗TREM2抗體。說明性免疫檢查點抑制劑包括派姆單抗(抗PD-1；MK-3475/Keytruda® - Merck)、納武單抗(抗PD-1；Opdivo® - BMS)、匹利珠單抗(抗PD-1抗體；CT-011 - Teva/CureTech)、AMP224 (抗PD-1；NCI)、阿維單抗(抗PD-L1；Bavencio® - Pfizer)、德瓦魯單抗(抗PD-L1；MEDI4736/Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca)、阿替珠單抗(抗PD-L1；Tecentriq® - Roche/Genentech)、BMS-936559 (抗PD-L1 - BMS)、替西木單抗(抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、伊匹單抗(抗CTLA-4；Yervoy ® - BMS)、利瑞魯單抗(抗KIR；BMS)、莫納珠單抗(抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)。在其他實例中，經工程改造之細胞或遞送媒劑可與TGFβ抑制劑、VEGF抑制劑或HPGE2組合投與。在另一實例中，經工程改造之細胞或遞送媒劑可與抗CD40抗體組合投與。
一些方法包括選擇患有腫瘤(或癌症)之個體(或患者群體)及用調節腫瘤介導之免疫抑制機制之經工程改造之細胞或遞送媒劑治療該個體。
在一些情況下，本揭示案之經工程改造之細胞或遞送媒劑可用於治療癌症，諸如卵巢癌。本文闡述其他癌症。舉例而言，經工程改造之細胞可用於治療膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸瘤、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、黑色素瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及/或子宮腫瘤。本揭示案之經工程改造之細胞或遞送媒劑可用於治療具有位於個體腹膜空間中之腫瘤之癌症。
本文所提供之方法亦包括遞送經工程改造之細胞或遞送媒劑之製劑。在一些實施例中，製劑係實質上純之製劑，其含有例如小於5% (例如，小於4%、3%、2%或1%)之除經工程改造之細胞外之細胞。製劑可包含1×10 5個細胞/kg至1×10 7個細胞/kg。經工程改造之細胞或遞送媒劑之製劑可包括具有一或多種醫藥學上可接受之載劑之醫藥組成物。舉例而言，經工程改造之細胞或遞送媒劑之製劑可包括本文所述之任何經工程改造之病毒，諸如經工程改造之AAV病毒，或任何經工程改造之病毒載體，諸如AAV載體。 活體內表現
本文所提供之方法亦包括活體內遞送能夠產生本文所述之經工程改造之細胞(例如，能夠將本文所述之任何經工程改造之核酸活體內遞送至細胞)之組成物。該等組成物包括任何病毒介導之遞送平臺、任何脂質結構遞送系統、任何奈米粒子遞送系統、任何基因體編輯系統或本文所述能夠在活體內對細胞進行工程改造之任何其他工程改造遞送系統。
本文所提供之方法亦包括活體內遞送能夠產生本文所述之任何所關注蛋白之組成物，例如編碼本文所述之(i)膜可切割嵌合蛋白、(ii)二價aCAR及(iii) iCAR中之每一者之任何多順反子系統。 本文所提供之方法亦包括活體內遞送能夠產生兩種或更多種本文所述所關注蛋白之組成物。能夠活體內產生所關注蛋白之組成物包括但不限於本文所述之任何經工程改造之核酸。能夠活體內產生所關注蛋白之組成物可為裸mRNA或裸質體。 所列舉之實施例
實施例1：一種多順反子表現系統，其包含經工程改造之核酸，該經工程改造之核酸包含： (A)    編碼膜可切割嵌合蛋白之外源性多核苷酸，該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有下式： 1. S - C - MT或 MT - C - Sii.  其中 iii. S包含可分泌效應分子，其中該可分泌效應分子包含IL-15， iv. C包含蛋白酶切割位點，且 v.  MT包含細胞膜系鏈結構域， vi. 其中 S - C - MT或 MT - C - S經構形以表現為單一多肽； (B)    編碼抑制性嵌合抗原受體(iCAR)之外源性多核苷酸，該iCAR包含： (i)    對內皮黏蛋白(EMCN)特異之抗原結合結構域； (ii)   一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性結構域；及 (iii)  一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合；及 (C)    編碼二價活化性嵌合抗原受體(aCAR)之外源性多核苷酸，該aCAR包含： (i)    對FLT3特異之抗原結合結構域； (ii)   對CD33特異之抗原結合結構域； (iii)  一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊結構域；及 (iv)  一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合。
實施例2：如實施例1之多順反子表現系統，其中該等編碼該膜可切割嵌合蛋白、該iCAR及該二價aCAR中每一者之外源性多核苷酸係由編碼2A核糖體跳躍元件之多核苷酸連接體連接在一起。
實施例3：如實施例2之多順反子表現系統，其中該2A核糖體跳躍元件係選自由以下組成之群：T2A核糖體跳躍元件、E2A核糖體跳躍元件、P2A核糖體跳躍元件、F2A核糖體跳躍元件、其核糖體跳躍元件融合物及其組合。
實施例4：如實施例3之多順反子表現系統，其中該核糖體跳躍元件融合物包含E2A/T2A核糖體跳躍元件。
實施例5：如實施例4之多順反子表現系統，其中該E2A/T2A核糖體跳躍元件包含胺基酸序列QCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCG DVEENPGP (SEQ ID NO: 221)。
實施例6：如實施例5之多順反子表現系統，其中該E2A/T2A核糖體跳躍元件係由包含序列CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 222)或序列CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT (SEQ ID NO: 223)之多核苷酸序列編碼。
實施例7：如實施例1至7中任一項之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白、該iCAR及該二價aCAR係以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR。
實施例8：如實施例1至7中任一項之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白、該iCAR及該二價aCAR係以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii) iCAR；及(iii)二價aCAR。
實施例9：如實施例1至8中任一項之多順反子表現系統，其中該可分泌效應分子包含信號肽或信號錨序列。
實施例10：如實施例9之多順反子表現系統，其中該信號肽包含該可分泌效應分子天然之天然信號肽。
實施例11：如實施例9之多順反子表現系統，其中該信號肽包含非天然信號肽，或該信號錨序列包含該可分泌效應分子非天然之非天然信號錨序列。
實施例12：如實施例11之多順反子表現系統，其中該非天然信號肽或該非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa。
實施例13：如實施例11之多順反子表現系統，其中該非天然信號肽包含IgE信號肽。
實施例14：如實施例13之多順反子表現系統，其中該IgE信號肽包含胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)。
實施例15：如實施例14之多順反子表現系統，其中該IgE信號肽係由包含序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)之多核苷酸序列編碼。
實施例16：如實施例1至15中任一項之多順反子表現系統，其中該IL-15包含胺基酸序列NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 224)。
實施例17：如實施例16之多順反子表現系統，其中該IL-15係由包含序列AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTG ATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA (SEQ ID NO: 225)之多核苷酸序列編碼。
實施例18：如實施例1至17中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之N末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGS GGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；及EAAA KEAAAKEAAAKEAAAK。
實施例19：如實施例1至17中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點進一步包含N末端肽連接體SGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 230)。
實施例20：如實施例1至19中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之C末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGS GGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；及EAAA KEAAAKEAAAKEAAAK。
實施例21：如實施例1至19中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點進一步包含C末端連接體GGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 231)。
實施例22：如實施例1至21中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點包含腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)特異性切割位點。
實施例23：如實施例22之多順反子表現系統，其中該TACE特異性切割位點包含胺基酸序列VTPEPIFSLI (SEQ ID NO: 191)。
實施例24：如實施例22之多順反子表現系統，其中該TACE特異性切割位點包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGG SLQ (SEQ ID NO: 250)。
實施例25：如實施例24之多順反子表現系統，其中該TACE特異性切割位點係由包含序列TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)之多核苷酸序列編碼。
實施例26：如實施例1至25中任一項之多順反子表現系統，其中該細胞膜系鏈結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、LIR1、B7-1及BTLA。
實施例27：如實施例1至25中任一項之多順反子表現系統，其中該細胞膜系鏈結構域包含B7-1跨膜結構域。
實施例28：如實施例27之多順反子表現系統，其中該B7-1跨膜結構域包含胺基酸序列LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERL RRESVRPV (SEQ ID NO: 204)。
實施例29：如實施例28之多順反子表現系統，其中該B7-1跨膜結構域係由包含序列TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAA CGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)之多核苷酸序列編碼。
實施例30：如實施例1至29中任一項之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有式 S - C - MT。
實施例31：如實施例30之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白包含胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 226)。
實施例32：如實施例31之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白係由包含序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 227)之多核苷酸序列編碼。
實施例33：如實施例1至32中任一項之多順反子表現系統，其中該對EMCN特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： (A)    該EMCN-VH包含： (B)    具有RYDMH (SEQ ID NO: 291)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 (C)    具有VIWGNGNTHYHSALKS (SEQ ID NO: 296)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 (D)    具有RIKD (SEQ ID NO: 298)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 (E)     該EMCN-VL包含： (F)     具有KSSQSLVASDENTYLN (SEQ ID NO: 299)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 (G)    具有QVSKLDS (SEQ ID NO: 300)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 (H)    具有LQGIHLPWT (SEQ ID NO: 301)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 (I) 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
實施例34：如實施例33之多順反子表現系統，其中： (A) 該EMCN-VH包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 302)；且 (B) 該EMCN-VL包含胺基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 310)。
實施例35：如實施例33或34之多順反子表現系統，其中該EMCN-VH及該EMCN-VL係由肽連接體隔開。
實施例36：如實施例35之多順反子表現系統，其中該對EMCN特異之抗原結合結構域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中L係該肽連接體。
實施例37：如實施例36之多順反子表現系統，其中該肽連接體包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS GGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGG GSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPG SGEGSTKG；或EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。
實施例38：如實施例36之多順反子表現系統，其中該肽連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)。
實施例39：如實施例38之多順反子表現系統，其中該肽連接體係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGT TCT (SEQ ID NO: 253)之多核苷酸序列編碼。
實施例40：如實施例1至39中任一項之多順反子表現系統，其中該對EMCN特異之抗原結合結構域包含結構VH-L-VL且包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 311)。
實施例41：如實施例40之多順反子表現系統，其中該對EMCN特異之抗原結合結構域係由包含序列GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGG AGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO: 312)之多核苷酸序列編碼。
實施例42：如實施例1至41中任一項之多順反子表現系統，其中該細胞內抑制性結構域包含LIR1細胞內抑制性結構域。
實施例43：如實施例42之多順反子表現系統，其中該LIR1細胞內抑制性結構域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPE PTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 285)。
實施例44：如實施例43之多順反子表現系統，其中該LIR1細胞內抑制性結構域係由包含序列CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGA CAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)之多核苷酸序列編碼。
實施例45：如實施例1至44中任一項之多順反子表現系統，其中該信號肽存在於該iCAR中。
實施例46：如實施例45之多順反子表現系統，其中該iCAR之該信號肽包含天然信號肽或非天然信號肽，視情況其中該非天然信號肽或該非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2及GMCSF。
實施例47：如實施例45之多順反子表現系統，其中該iCAR之該信號肽包含CD8信號肽。
實施例48：如實施例47之多順反子表現系統，其中該CD8信號肽包含胺基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 137)。
實施例49：如實施例48之多順反子表現系統，其中該CD8信號肽係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACT GCTGCTGCATGCTGCTAGACCA (SEQ ID NO: 416)之多核苷酸序列編碼。
實施例50：如實施例1至49中任一項之多順反子表現系統，其中該鉸鏈結構域存在於該iCAR中。
實施例51：如實施例50之多順反子表現系統，其中該iCAR之該鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。
實施例52：如實施例50之多順反子表現系統，其中該iCAR之該鉸鏈結構域包含LIR1鉸鏈。
實施例53：如實施例52之多順反子表現系統，其中該LIR1鉸鏈包含胺基酸序列HPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQS GLGRHLGV (SEQ ID NO: 417)。
實施例54：如實施例53之多順反子表現系統，其中該LIR1鉸鏈係由包含序列CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCT GGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)之多核苷酸序列編碼。
實施例55：如實施例50之多順反子表現系統，其中該iCAR之該鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈。
實施例56：如實施例55之多順反子表現系統，其中該CD8鉸鏈包含胺基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA CD (SEQ ID NO: 271)。
實施例57：如實施例56之多順反子表現系統，其中該CD8鉸鏈係由包含序列ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACA ATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)之多核苷酸序列編碼。
實施例58：如實施例1至57中任一項之多順反子表現系統，其中存在該iCAR之該跨膜結構域。
實施例59：如實施例58之多順反子表現系統，其中該iCAR之該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1、LIR1及BTLA。
實施例60：如實施例58之多順反子表現系統，其中該iCAR之該跨膜結構域包含LIR1跨膜結構域。
實施例61：如實施例60之多順反子表現系統，其中該LIR1跨膜結構域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 259)。
實施例62：如實施例61之多順反子表現系統，其中該LIR1跨膜結構域係由包含序列GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTT GCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)之多核苷酸序列編碼。
實施例63：如實施例1至62中任一項之多順反子表現系統，其中該iCAR包含胺基酸序列 (A) MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 430)；或 (B) MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKngaaHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 419)。
實施例64：如實施例63之多順反子表現系統，其中該iCAR係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTG CTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCACACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTTGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 420)之多核苷酸序列編碼。
實施例65：如實施例1至62中任一項之多順反子表現系統，其中該iCAR包含胺基酸序列 (A) MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 431)；或 (B) MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKngaaTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 421)。
實施例66：如實施例65之多順反子表現系統，其中該iCAR係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGC TGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCAACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 422)之多核苷酸序列編碼。
實施例67：如實施例1至66中任一項之多順反子表現系統，其中該對FLT3特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： (A)    該FLT3-VH包含： (B)    具有GGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 360)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 (C)    具有GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 361)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 (D)    具有FALFGFREQAFDI (SEQ ID NO: 362)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 (E)     該FLT3-VL包含： (F)     具有RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 363)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 (G)    具有AASSLQS (SEQ ID NO: 364)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 (H)    具有QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 365)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 (I) 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
實施例68：如實施例67之多順反子表現系統，其中： (A)    該FLT3-VH包含胺基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315)；且 (B)    該FLT3-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)。
實施例69：如實施例1至68中任一項之多順反子表現系統，其中該對CD33特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： (A)    該CD33-VH包含： (B)    具有DYNMH (SEQ ID NO: 402)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 (C)    具有YIYPYNGGTGYNQKFKSKA (SEQ ID NO: 403)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 (D)    具有GRPAMDYWGQ (SEQ ID NO: 404)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 (E)     該CD33-VL包含： (F)     具有RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 405)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 (G)    具有AASNQGS (SEQ ID NO: 406)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 (H)    具有QQSKEVPWT (SEQ ID NO: 407)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 (I) 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義。
實施例70：如實施例69之多順反子表現系統，其中： (A)    該CD33-VH包含胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329)；且 (B)    該CD33-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVD NYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 330)。
實施例71：如實施例67至70中任一項之多順反子表現系統，其中該FLT3-VH、該FLT3-VL、該CD33-VH及該CD33-VL係由肽連接體隔開。
實施例72：如實施例71之多順反子表現系統，其中該aCAR抗原結合結構域包含結構(FLT3-VH) - L1 - (CD33-VH) - L2 - (CD33-VL) - L3 - (FLT3-VL)，其中L1、L2及L3分別係第一肽連接體、第二肽連接體及第三肽連接體。
實施例73：如實施例72之多順反子表現系統，其中該等L1、L2及/或L3各自獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID No 230 - 248。
實施例74：如實施例72之多順反子表現系統，其中該L1肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。
實施例75：如實施例73之多順反子表現系統，其中該L1肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)之多核苷酸序列編碼，或該L1肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT (SEQ ID NO: 256)之多核苷酸序列編碼。
實施例76：如實施例72至75中任一項之多順反子表現系統，其中該L2肽連接體係胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)。
實施例77：如實施例76之多順反子表現系統，其中該L2肽連接體係由包含序列GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)之多核苷酸序列編碼。
實施例78：如實施例72至75中任一項之多順反子表現系統，其中該L2肽連接體係胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。
實施例79：如實施例76之多順反子表現系統，其中該L2肽連接體係由包含序列GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)之多核苷酸序列編碼。
實施例80：如實施例72至79中任一項之多順反子表現系統，其中該L3肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)。
實施例81：如實施例80之多順反子表現系統，其中該L3肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)之多核苷酸序列編碼，或該L3肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 258)之多核苷酸序列編碼。
實施例82：如實施例1至81中任一項之多順反子表現系統，其中該等刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域係選自由以下組成之群：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、CD97、CD2、ICOS、CD27、CD154、CD8、OX40、4-1BB、CD28、ZAP40、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、MyD88、2B4、CD40、PD-1、LFA-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、SLAM蛋白、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、CDS、ICAM-1、(CD11a/CD18)、BAFFR、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及其組合。
實施例83：如實施例1至81中任一項之多順反子表現系統，其中該等刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域包含CD28共刺激結構域及CD3ζ傳訊結構域。
實施例84：如實施例83之多順反子表現系統，其中該CD28共刺激結構域包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO: 287)。
實施例85：如實施例84之多順反子表現系統，其中該CD28共刺激結構域係由包含序列AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTA CATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)之多核苷酸序列編碼。
實施例86：如實施例83之多順反子表現系統，其中該CD3ζ傳訊結構域包含胺基酸序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)。
實施例87：如實施例86之多順反子表現系統，其中該CD3ζ傳訊結構域係由包含序列AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGT ACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)之多核苷酸序列編碼。
實施例88：如實施例1至87中任一項之多順反子表現系統，其中存在該aCAR之該鉸鏈結構域。
實施例89：如實施例88之多順反子表現系統，其中該aCAR之該鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。
實施例90：如實施例88之多順反子表現系統，其中該aCAR之該鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈。
實施例91：如實施例90之多順反子表現系統，其中該CD8鉸鏈包含胺基酸序列ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRP EACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 272)。
實施例92：如實施例91之多順反子表現系統，其中該CD8鉸鏈係由包含序列GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCC GTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)之多核苷酸序列編碼。
實施例93：如實施例1至92中任一項之多順反子表現系統，其中存在該aCAR之該跨膜結構域。
實施例94：如實施例93之多順反子表現系統，其中該aCAR之該跨膜結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合。
實施例95：如實施例93之多順反子表現系統，其中該aCAR之該跨膜結構域包含CD8鉸鏈。
實施例96：如實施例95之多順反子表現系統，其中該CD8跨膜包含胺基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)。
實施例97：如實施例96之多順反子表現系統，其中該CD8跨膜係由包含序列ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTG CTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)之多核苷酸序列編碼。
實施例98：如實施例1至97中任一項之多順反子表現系統，其中存在該aCAR之該aCAR信號肽。
實施例99：如實施例98之多順反子表現系統，其中該aCAR之該信號肽係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa。
實施例100：如實施例98之多順反子表現系統，其中該aCAR之該信號肽包含GM-CSFRa信號肽。
實施例101：如實施例100之多順反子表現系統，其中該GM-CSFRa信號肽包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 423)。
實施例102：如實施例101之多順反子表現系統，其中該GM-CSFRa信號肽係由包含序列ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT (SEQ ID NO: 424)之多核苷酸序列編碼。
實施例103：如實施例1至103中任一項之多順反子表現系統，其中該aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 414)。
實施例104：如實施例1至103中任一項之多順反子表現系統，其中該aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 415)。
實施例105：一種表現載體，其包含如實施例1至104中任一項之多順反子表現系統。
實施例106：如實施例105之表現載體，其中該表現載體包含SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 429、SEQ ID NO: 433或SEQ ID NO: 432之多核苷酸。
實施例107：一種經分離細胞，其包含如實施例1至104中任一項之多順反子表現系統或如實施例105或106之表現載體。
實施例108：如實施例107之經分離細胞，其中該細胞包含免疫細胞。
實施例109：如實施例107之經分離細胞，其中該細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調控性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、骨髓細胞、巨噬細胞、人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC源細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞(iPSC)以及iPSC源細胞。
實施例110：如實施例107之經分離細胞，其中該細胞係NK細胞。
實施例111：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 429、SEQ ID NO: 433或SEQ ID NO: 432之核酸序列。
實施例112：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 425之核酸序列。
實施例113：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 426之核酸序列。
實施例114：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 427之核酸序列。
實施例115：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 428之核酸序列。
實施例116：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 429之核酸序列。
實施例117：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 432之核酸序列。
實施例118：一種治療有需要之個體之方法，該方法包括投與治療有效劑量之如實施例107至110中任一項之經分離細胞中之任一者或如實施例111至117及124中任一項之多核苷酸。
實施例119：一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向該個體投與包含如實施例107至110中任一項之經分離細胞中之任一者或如實施例111至117及124中任一項之多核苷酸的免疫療法。
實施例120：一種在個體中刺激細胞介導的對腫瘤細胞之免疫反應之方法，該方法包括向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之如實施例107至110中任一項之經分離細胞中之任一者或如實施例111至117及124中任一項之多核苷酸。
實施例121：如實施例111至120中任一項之方法，其中該經分離細胞源自該個體。
實施例122：如實施例111至121中任一項之方法，其中該經分離細胞就該個體而言係同種異體的。
實施例123：一種製備經工程改造之細胞之方法，其包括用如實施例1至104中任一項之多順反子表現系統、如實施例105或106之表現載體或如實施例111至117及124中任一項之多核苷酸轉導經分離細胞。
實施例124：一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 433之核酸序列。 實例
以下係用於實施本發明之特定實施例之實例。實例僅係出於說明目的而提供，且並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。舉例而言，下面闡述及實施之實驗證實對細胞進行工程改造以分泌酬載(例如，效應分子)及遞送彼等細胞以誘導針對腫瘤之免疫原性反應之一般效用。
已努力確保所用數值(例如，量、溫度等)之精確性，但當然應當容許一些實驗誤差及偏差。 實例 1 - FLT3 或 CD33 非 EMCN 邏輯閘控之 CAR-NK 細胞迴路最佳化
評估用於FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR-NK細胞療法之各種組分、組織及方法。總體FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR-NK細胞系統圖解說明於 圖 1中，顯示包括靶向FLT3之scFv及靶向CD33之scFv之二價活化性CAR (aCAR)、包括靶向EMCN之scFv之抑制性CAR (iCAR)，以及條件釋放IL-15 (crIL-15)。EMCN iCAR表示「非邏輯閘」。二價FLT3/CD33 aCAR表示「或邏輯閘」。
在多順反子系統中之構築體中編碼所有組分，其中在能夠作為單一mRNA轉錄本轉錄且由2A核糖體跳躍元件隔開之單一經工程改造之核酸中編碼每一組分。轉錄後，每一編碼之蛋白將轉譯為不同肽。
所評估之各種組分及組織示於 圖 2中。評估編碼EMCN iCAR及FLT3/CD33二價aCAR之順序、各種抑制性細胞內抑制性結構域、標籤存在、各種鉸鏈、抗體結合結構域之間之各種連接體及不同的基於逆轉錄病毒之載體。總共，初始篩選評估90種構築體。 方法 用於構築體篩選之轉導：使用以下轉導程序： •   添加1e6個NK細胞/孔 •   效價：1e10基因體效價/1e6個細胞或1e9基因體效價/1e6個細胞 •   無血清轉導 •   僅具有IL-2之NK MACS •   旋轉接種2小時 •   使細胞靜息2+小時，接著添加NK MACS +人類Ab血清+ IL-2 • 第 2 天：轉移至24孔G-Rex • 選項 1 ( 第 8 天 ) ：檢查表面上之FLT3/CD33及EMCN表現+ IL-15表現，且在 第 10 天以1:1 E:T比率實施細胞毒性分析(靶細胞=在IMDM培養基中孵育18-20小時之MV4-11 +/- EMCN) • 選項 2 ( 第 15 天 ) ：檢查表面上之FLT3/CD33及EMCN表現+ IL-15表現，且在 第 17 天以1:2 E:T比率實施細胞毒性分析(靶細胞=在IMDM培養基中孵育18-20小時之MV4-11 +/- EMCN) •   藉由流式細胞術評估表現及靶標殺傷 構築體：
所用對照構築體之組分及其順序示於 表 A中。來自初始篩選之極佳構築體之組分及其順序示於 表 B中。 表 A
對照 構築體 載體
SB05438 crIL15 E2A/T2A Myc二價環6 aCAR E2A/T2A EMCN iCAR Retrovec
SB05977 crIL-15_ E2A/T2A _ Myc二價環6 fitzer attas CD8鉸鏈/TM CD28 ICD ”ALT CD3z"_ E2A/T2A thermo fisher密碼子最佳化之EMCN V5 LIR1 iCAR Retrovec
SB05439 crIL15 E2A/T2A Myc CEA aCAR E2A/T2A EMCN iCAR Retrovec
表 B
SB 編號 載體 定向 標籤 ICD
SB06461 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 標籤+ 來自ICD 之天然鉸鏈 LIR-1
SB06462 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 LIR-1
SB06541 Retrovec crIL-15- iCAR- aCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 LIR-1
SB06467 Retrovec crIL-15- aCAR- iCAR 標籤+ 來自ICD 之天然鉸鏈 LIR-1
SB06433 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 KIR3DL1
SB06511 Retrovec crIL-15- iCAR- aCAR 標籤+ 來自ICD 之天然鉸鏈 KIR3DL1
SB06512 Retrovec crIL-15- iCAR- aCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 KIR3DL1
SB06447 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 標籤+ 來自ICD 之天然鉸鏈 LAIR-1
SB06448 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 LAIR-1
SB06472 Sinvec crIL-15- aCAR- iCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 SIGLEC2
SB06557 Retrovec crIL-15- iCAR- aCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 SIGLEC2
SB06417 Sinvec SV40 crIL-15- aCAR- iCAR 標籤+ 來自ICD 之天然鉸鏈 CEACAM1
SB06487 Sinvec SV40 crIL-15- iCAR- aCAR 僅iCAR 標籤 + CD8 CEACAM1
組分序列：
所評估主要構築體之組分序列示於 表 C( 表 C1顯示胺基酸序列，且 表 C2顯示核苷酸序列)中。 表 C1
組分 胺基酸序列
IgGE信號序列 MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)
Il15 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 224)
LR1分割N末端連接體+ Tace10 SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 250)
B7-1 TM LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 204)
E2A/T2A核糖體跳躍元件 QCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 221)
GM-CSFRa信號序列 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 423)
GGGGS連接體 GGGGS (SEQ ID NO: 242)
FLT3 VH EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315)
CD33 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329)
6環連接體 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)
CD33 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 330)
FLT3 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)
CD8鉸鏈1號 ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 272)
CD8 TM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)
CD28共刺激結構域 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 287)
CD3z ICD RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)
CD8信號序列 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 137)
EMCN VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 302)
(GGGGS)3連接體 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)
EMCN VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 310)
CD8鉸鏈2號 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 271)
LIR1 TM VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 259)
LIR1 ICD LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 285)
LIR1鉸鏈 HPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (SEQ ID NO: 417)
(GGGGS)2連接體 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)
表 C2
組分 核酸序列
IgGE信號序列 ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT
Il15 AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA (SEQ ID NO: 225)
LR1分割N末端連接體+ Tace10 TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)
B7-1 TM TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)
E2A/T2A核糖體跳躍元件 CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 222)；或 CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT (SEQ ID NO: 223)   
GM-CSFRa信號序列 ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT (SEQ ID NO: 424)
GGGGS連接體 GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)；或 GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)
FLT3 VH GAAGTTCAGCTGGTTCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCTCTTGGGTTCGACAGGCACCTGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCTATCTTCGGCACCGCCAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGAAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCTGTGTATTACTGCGCCACATTCGCCCTGTTCGGCTTCAGAGAGCAGGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTTTCATCT
CD33 VH CAGGTTCAGCTTGTGCAATCTGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAATATGCATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGCCAGGGACTTGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACAATCACAGCCGACGAGTCCACCAATACTGCTTATATGGAACTGTCTAGCCTTCGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGAGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCCAGC
6環連接體 GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)
CD33 VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCCTCAAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACATTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAA
FLT3 VL GATATTCAGATGACTCAGTCCCCAAGCAGCCTGTCAGCCTCCGTGGGCGATAGAGTCACCATTACATGCAGAGCCAGCCAGTCCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCCGGAAAGGCTCCAAAGCTCCTCATCTACGCCGCTTCTAGCCTGCAGTCTGGCGTGCCATCTAGATTCTCTGGCTCCGGAAGCGGGACCGACTTCACACTGACCATATCTTCTCTGCAGCCCGAAGATCTGGCCACGTACTATTGTCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGACCCGGAACAAAGGTGGACATTAAG
CD8鉸鏈1號 GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)
CD8 TM ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)
CD28 共刺激結構域 AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)
CD3z ICD AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)
CD8信號序列 ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCA (SEQ ID NO: 416)
EMCN VH GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCT
(GGGGS)3連接體 GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 253)
EMCN VL GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG
CD8鉸鏈 ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)
LIR1 TM GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)
LIR1 ICD CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)
LIR1鉸鏈 CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)
(GGGGS)2連接體 GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT (SEQ ID NO: 256)；或 GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)；或 GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 258)
CAR 及 crIL-15 表現評估
藉由流式細胞術針對各種構築體評估EMCN iCAR、FLT3/CD33二價aCAR及IL-15之表現。篩選中之每一構築體皆具有標籤且使用「環6」連接體。用於iCAR及aCAR表現之閘控策略示於 圖 3中。CEA對照用作基線。
顯示RetroVec ( 圖 4)及自失活(SIN) γ-逆轉錄病毒SINvec ( 圖 5)系列構築體於第15天之aCAR及iCAR表現之代表性流式細胞術圖。顯示RetroVec ( 圖 6)及SINvec ( 圖 7)系列構築體於第15天之膜結合IL-15表現之代表性流式細胞術圖。第一系列表現比較示於 圖 8中。第二系列表現比較示於 圖 9中。第三系列表現比較示於 圖 10中。如藉由MFI所評估之aCAR及iCAR之概述示於 圖 11中。Retrovec亦具有比SINvec SV40更高之病毒產率(資料未顯示)。
結果顯示，在相同基因體效價MOI下，SINvec SV40構築體表現出與Retrovec系統相似之CAR表現百分比，而MFI較低。不同SINvec系統(SINvec NFAT)通常具有較低之CAR表現。結果亦顯示，在相同基因體效價MOI下，SINvec SV40構築體顯示出比RetroVec系統更低之膜結合IL-15表現。對於具有來自細胞內結構域(ICD) LIR1之天然鉸鏈之構築體，表現通常傾向於更高。各種組分及組織之表現考慮因素之一般概述示於 圖 12中，包括不同鉸鏈及載體組合可能影響表現及/或影響活體外/活體內功效。 細胞毒性評估
針對表現EMCN iCAR、FLT3/CD33二價aCAR及IL-15之多順反子系統評估FLT3或CD33非EMCN邏輯閘之細胞毒性(例如，CD33/FLT3靶標殺傷及EMCN保護)。篩選中之每一構築體皆具有標籤且使用「環6」連接體。
使用LIR1 ICD之構築體針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的總細胞毒性示於 圖 13中。亦評估正規化之細胞毒性，如 圖 14中所示。LIR1構築體表現出最高達55%之總殺傷(內源性+aCAR介導之殺傷)。LIR1構築體亦表現出最高達約50%免於總殺傷之保護(24%絕對保護；100%對於aCAR介導之殺傷之保護)。如 圖 15中所示，亦在轉導後第17天評估不同效應物:靶標比率之細胞毒性，且在1:2及1:4比率下表現出良好的細胞毒性特徵。如 圖 16中所示，亦在1:2效應物:靶標比率下轉導後第10天評估各種LIR1-ICD構築體之正規化細胞毒性，且證實最高達18%之絕對保護。細胞毒性特徵指示具有來自細胞內結構域(ICD) LIR1之天然鉸鏈之構築體通常效果最佳。 實例 2 - 小鼠模型中之 CAR-NK 細胞評估
在小鼠模型中，與單特異性CAR-NK細胞相比，評估二價FLT3或CD33 CAR-NK細胞。亦評估使用「環4」或「環6」連接體序列之aCAR。 方法
構築體之組分及其順序示於 表 D中。CAR構築體之組織示於 圖 19中。以單次CAR-NK注射投與總共35e6個NK細胞，每組5隻小鼠。在注射前將CAR NK細胞與腫瘤細胞預混合。所有構築體皆為RetroVec載體系統。所評估之靶細胞(腫瘤模型)係：(1) MV4-11 [FLT3表現高；CD33表現高]；(2) Molm13 [FLT3表現中等；CD33表現高]；及SEM [FLT3表現高；CD33表現低]。 表 D
組 SB 編號 組分 靶細胞及 潛在殺傷水準
1 無 僅腫瘤細胞 MV4-11，無殺傷
2 無 未經工程改造之NK細胞 MV4-11，基礎殺傷
3 SB05413 FLT3/CD33二價環6 aCAR_HER2 iCAR MV4-11，高
4 SB05414 FLT3 aCAR_雙重2A_HER2 iCAR MV4-11，中高
5 SB05973 CD33 aCAR_雙重2A_HER2 iCAR MV4-11，中高
6 SB06019 FLT3/CD33二價環4 aCAR_HER2 iCAR MV4-11，高
7 SB05413 針對二價環6之轉導滴定 MV4-11，高
組分序列：
所評估構築體之組分序列示於 實例 1中之 表 C中。 二價 FLT3 或 CD33 NK CAR 相對於單特異性 NK CAR 之評估
在MV4-11鼠類腫瘤模型中評估二價FLT3或CD33 CAR-NK細胞及單特異性CAR-NK細胞。存活示於 圖 20中。代表性腫瘤成像示於 圖 21中。結果顯示，具有環4連接體之CAR表現出比具有環4連接體之CAR更佳之功效。功效之順序(自最佳開始)確定為：(1)二價環4 CAR，(2) CD33單CAR，(3)二價環4 CAR，(4) FLT3單CAR。亦注意到NV NK組具有比先前實驗中所觀察到者更高之基礎殺傷(資料未顯示)。結果證實，二價環4 CAR NK在所有組中具有最佳抗腫瘤功效及存活率，且與單CAR方法相比具有相似/更佳之功效。 實例 3 - FLT3 或 CD33 非 EMCN CAR-NK 細胞進一步最佳化
進一步評估用於FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR-NK細胞療法之各種組分、組織及方法。如上，在多順反子系統中之構築體中編碼所有組分。
評估編碼EMCN iCAR及FLT3/CD33二價aCAR之順序、各種抑制性細胞內抑制性結構域、標籤存在、各種鉸鏈、抗體結合結構域之間之各種連接體及不同的基於逆轉錄病毒之載體。具體評估部分變化之構築體，無論CAR是包括親和標籤還是為「無標籤」形式，以及在二價aCAR之可變結構域之間使用之連接體「環4」。 圖 22圖解說明所評估之各種帶標籤及無標籤之組合。所評估之額外候選物示於 表 E中。亦評估如 表 F中所示來自 實例 1之最佳候選物。對照與 實例1中之彼等相同。 方法 用於構築體篩選之轉導：使用以下轉導程序(天數係指轉導後之天數)： •   添加1e6個NK細胞/孔 •   效價：3e10基因體效價/1e6個細胞或2e10基因體效價/1e6個細胞 •   無血清轉導 •   僅具有IL-2之NK MACS •   旋轉接種2小時 •   使細胞靜息2+小時，接著添加NK MACS+人類Ab血清+ IL-2 • 第 2 天：轉移至24孔G-Rex • 第 8 天：檢查表面上之FLT3/CD33及EMCN表現+IL-15表現，且在 第 9-10 天以1:2 E:T比率或1:4 E:T比率實施細胞毒性分析(靶細胞=在IMDM培養基中孵育18-20小時之MV4-11 +/- EMCN) •   藉由流式細胞術評估表現及靶標殺傷 表 E
SB 編號 構築體 載體 標籤
SB07401 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Sinvec SV40 無標籤+CD8
SB07403 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 無標籤+CD8
SB07405 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Sinvec SV40 無標籤+來自ICD之天然鉸鏈
SB07404 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Sinvec SV40 僅iCAR標籤 + CD8
SB07408 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 僅iCAR標籤 + CD8
SB07409 crIL-15_aCAR_iCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 無標籤+來自ICD之天然鉸鏈
SB07410 crIL15_iCAR_aCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Sinvec SV40 僅iCAR標籤 + CD8
SB07412 crIL15_iCAR_aCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Sinvec SV40 無標籤+來自ICD之天然鉸鏈
SB07416 crIL15_iCAR_aCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 僅iCAR標籤 + CD8
SB07417 crIL15_iCAR_aCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 無標籤+CD8
SB07418 crIL15_iCAR_aCAR定向：aCAR scfv -環4人類化EMCN LIR1 iCAR標籤/鉸鏈 Retrovec 無標籤+來自ICD之天然鉸鏈
表 F
SB 編號 構築體 載體 標籤
SB06511 crIL-15-iCAR-aCAR，環6，KIR3DL1 Retrovec 標籤+來自ICD之天然鉸鏈
SB06512 crIL-15-aCAR-iCAR，環6，KIR3DL1 Retrovec 僅iCAR標籤 + CD8
SB06557 crIL-15-iCAR-aCAR環6，SIGLEC2 Retrovec 僅iCAR標籤 + CD8
SB06541 crIL-15-iCAR-aCAR環6，LIR1 Retrovec 標籤+來自ICD之天然鉸鏈
SB06467 crIL-15-aCAR-iCAR，環6，LIR1 Retrovec 標籤+來自ICD之天然鉸鏈
組分序列：所評估構築體之組分序列示於 實例 1中之 表 C中。主要候選物及其結構域組織係： -   SB06342; SINvec SV40 (完整載體序列係SEQ ID NO: 425) o   IgGE SS -- Il15 -- LR1分割N末端連接體+ Tace10 -- B7-1 TM -- E2A/T2A -- GM-CSFRa SS -- FLT3 VH –GGGGS -- CD33 VH -- 6環(GSTSGSGKPGSGEGSTKG) -- CD33 VL –GGGGS -- FLT3 VL -- CD8鉸鏈-- CD8 TM -- CD28 -- CD3z -- E2A/T2A -- CD8 SS -- EMCN VH -- (GGGGS)3連接體-- EMCN VL -- CD8鉸鏈--LIR1 TM -- LIR1 ICD -   SB06463; SINvec SV40 (完整載體序列係SEQ ID NO: 426) o   IgGE SS -- Il15 -- LR1分割N末端連接體+ Tace10 -- B7-1 TM -- E2A/T2A -- GM-CSFRa SS -- FLT3 VH –GGGGS -- CD33 VH -- 6環(GSTSGSGKPGSGEGSTKG) -- CD33 VL --GGGGS -- FLT3 VL -- CD8鉸鏈-- CD8 TM -- CD28 -- CD3z -- E2A/T2A -- CD8 SS -- EMCN VH -- (GGGGS)3連接體-- EMCN VL – LIR1鉸鏈--LIR1 TM -- LIR1 ICD -   SB07401; SINvec SV40 (完整載體序列係SEQ ID NO: 427) o   IgGE SS -- Il15 -- LR1分割N末端連接體+ Tace10 -- B7-1 TM -- E2A/T2A -- GM-CSFRa SS -- FLT3 VH – (GGGGS)2連接體-- CD33 VH -- (GGGGS)2連接體-- CD33 VL -- (GGGGS)2連接體-- FLT3 VL -- CD8鉸鏈-- CD8 TM -- CD28 -- CD3z -- E2A/T2A -- CD8 SS -- EMCN VH -- (GGGGS)3連接體-- EMCN VL – CD8鉸鏈-- LIR1 TM -- LIR1 ICD -   SB07405; SINvec SV40 (完整載體序列係SEQ ID NO: 428) o   IgGE SS -- Il15 -- LR1分割N末端連接體+ Tace10 -- B7-1 TM -- E2A/T2A -- GM-CSFRa SS -- FLT3 VH – (GGGGS)2連接體-- CD33 VH -- (GGGGS)2連接體-- CD33 VL -- (GGGGS)2連接體-- FLT3 VL -- CD8鉸鏈-- CD8 TM -- CD28 -- CD3z -- E2A/T2A -- CD8 SS -- EMCN VH -- (GGGGS)3連接體-- EMCN VL – LIR1鉸鏈-- LIR1 TM -- LIR1 ICD -   SB07412; SINvec SV40 (完整載體序列係SEQ ID NO: 429) o   IgGE SS -- Il15 -- LR1分割N末端連接體+ Tace10 -- B7-1 TM -- E2A/T2A -- CD8 SS -- EMCN VH -- (GGGGS)3連接體-- EMCN VL – LIR1鉸鏈-- LIR1 TM -- LIR1 ICD -- E2A/T2A -- GM-CSFRa SS -- FLT3 VH – (GGGGS)2連接體-- CD33 VH -- (GGGGS)2連接體-- CD33 VL -- (GGGGS)2連接體-- FLT3 VL -- CD8鉸鏈-- CD8 TM -- CD28 -- CD3z 無標籤構築體之流式細胞術：
將針對CD33、FLT3及EMCN CAR之螢光團/生物素偶聯抗原添加至CAR NK細胞中。CD33及EMCN在同一小組中運行，且FLT3在單獨小組中運行。 帶標籤及無標籤表現之評估
藉由流式細胞術針對各種構築體評估EMCN iCAR及FLT3/CD33二價aCAR之無標籤形式之表現。「無病毒」對照之染色示於 圖 23中。無標籤構築體SB07401及SB07405之染色示於 圖 24中。僅帶iCAR標籤之構築體SB06467之染色示於 圖 25中。結果證實，「無標籤」CAR可使用FLT3、CD33及EMCN螢光團偶聯抗原來偵測，表現類似於帶標籤之CAR形式。 環 4 及環 6 表現之評估
藉由流式細胞術針對各種構築體評估包括環4或環6連接體之構築體之表現。CD33/EMCN雙陽性細胞之概述示於 圖 26中，結果證實CD33+及EMCN+CAR NK細胞之雙陽性群體在40-60%範圍。具有環4連接體之構築體的CD33、FLT3及EMCN CAR中之每一者之表現概述示於 圖 27中，證實CD33及FLT3群體之表現水準幾乎相同，且EMCN表現通常可偵測到。具有環6連接體之構築體的CD33、FLT3及EMCN CAR中之每一者之表現概述示於 圖 28中，亦證實CD33及FLT3群體之表現水準幾乎相同，且EMCN表現通常可偵測到。 環 4/ 環 6 及無標籤細胞毒性評估
針對各種構築體評估包括環4或環6連接體以及EMCN iCAR及FLT3/CD33二價aCAR之無標籤形式之構築體的細胞毒性。效應物:靶標比率為1:2之殺傷活性之概述示於 圖 29中，且在 圖 30中相對於無病毒(NV)正規化。效應物:靶標比率為1:4之殺傷活性之概述示於 圖 31中。結果證實MV4-11靶細胞之顯著CAR特異性殺傷及顯著EMCN依賴性保護。儘管對於1:4 E:T比率存在更低之總殺傷，但仍存在顯著之殺傷活性及EMCN iCAR介導之保護。 實例 4 - SEM 靶細胞之活體外表徵
使用SEM細胞實施細胞毒性分析以評估表現aCAR/iCAR之NK細胞中aCAR/iCAR系統之邏輯閘控。在 圖 32中，將用SB07401、SB07403、SB07412及SB07418轉導之NK細胞與表現EMCN (「EMCN+」)或不表現EMCN (「EMCN-」)之SEM細胞共培養20小時。 圖 32顯示在轉導(1:2效應物與靶標比率)後第13天對特異性細胞毒性及iCAR保護之評估。藉助減去未轉導之NK細胞之背景細胞毒性實施正規化來計算特異性細胞毒性。研究證實，SB07403、SB07412及SB07418提供aCAR介導的對EMCN-SEM細胞之特異性細胞毒性，以及藉助iCAR對EMCN+ SEM細胞之保護。
實施進一步細胞毒性分析以實施連續殺傷分析，其中實施與表現EMCN (SEM CD33+ EMCN+)或不表現EMCN (SEM CD33+)之CD33+ SEM細胞之多輪共培養。在24小時、48小時及96小時實施連續殺傷。 圖 33A- 圖 33C顯示2次激發後之特異性殺傷及保護。SB07412及SB07418在兩次再激發後顯示出顯著之CAR特異性殺傷及iCAR保護。 實例 5 – 活體內 SEM 活體內研究
在活體內小鼠模型中測試aCAR/iCAR構築體。在第0天用腫瘤細胞及NK細胞(1:1比率)之混合物感染JAX IL15 NSG小鼠。將IL-2每週注射兩次。 表 G顯示用於本研究之構築體。 圖 34A顯示實驗之一般示意圖。 圖 34B顯示包含表現EMCN之SEM細胞(CD33+/EMCN+)及不表現EMCN之SEM細胞(CD33+/EMCN-)之1:1混合物之SEM群體的表現。
在活體內小鼠模型中測試aCAR/iCAR構築體。在第0天用腫瘤細胞及NK細胞(1:1比率)之混合物注射JAX IL15 NSG小鼠。將IL-2每週注射兩次。 表 G顯示用於本研究之構築體。 圖 34A顯示實驗之一般示意圖。 圖 34B顯示包含表現EMCN之SEM細胞(CD33+/EMCN+)及不表現EMCN之SEM細胞(CD33+/EMCN-)之1:1混合物之SEM群體的表現。
在注射SEM細胞群體後，在第11天及第19天(SEM注射後天數)藉由生物發光成像(BLI)顯現動物。除了BLI之外，亦自小鼠收集血液且定量SEM細胞。 圖 35顯示用PBS或用經無病毒(NV)、SB07401、SB07779、SB07403或SB07569轉導之NK細胞處理之小鼠。在SEM細胞注射後之指定時間點實施BLI量測。在第19天，與用未轉導之NK細胞(NV)注射之小鼠相比，用經SB07779及SB07569轉導之NK細胞注射之小鼠展現出降低之BLI。 圖 36顯示來自時間點第11天及第19天之所關注區域之BLI定量。 表 H概述如 表 G中所示之研究觀察結果。與NV組相比，SB07779、SB07569及SB07403組在第19天表現出較低之BLI定量。
為了評估表現安全抗原(EMCN)之細胞之保護作用，自動物抽取周邊血且定量。安全抗原之表現用作用於健康細胞之模型，因此應保護EMCN+ SEM細胞在表現aCAR及EMCN特異性iCAR之NK細胞存在下免於細胞殺傷。 圖 37A顯示注射用各別構築體轉導之NK細胞後周邊血中SEM細胞比例之定量。向小鼠注射1:1比率之EMCN(+)與EMCN(-) SEM細胞，因此當與由表現單獨aCAR (僅或閘對照)之NK細胞組成之處理組相比時，EMCN+細胞百分比之增加將指示iCAR表現。在第13天，抽取周邊血，且使用流式細胞術定量EMCN+細胞之比例。周邊血分析發現，與用或閘對照SB06569轉導之NK細胞相比，用SB07403 (aCAR/iCAR)轉導之NK細胞顯著保護EMCN+ SEM細胞。 圖 37B顯示在第21天小鼠中SEM之周邊血定量結果。在該時間點，與用7779僅或閘對照轉導之NK細胞相比，用7401及7412轉導之NK細胞顯示出對EMCN+細胞之增加保護，導致EMCN+細胞成為與EMCN-SEM細胞相比更佔優勢之群體。當與其各別僅或閘對照7569相比時，iCAR之顯著保護作用(如第13天所觀察)對於Retrovec候選物而言持續存在。在第27天，再次分析周邊血以確定iCAR介導之保護是否在更長之時間點持續。發現EMCN陽性細胞之比例在第27天保持為高，且7401、7412及7403與其各別或閘對照構築體相比顯示出顯著保護( 圖 37C)。 表 G ：用於 SEM 活體內研究中之實驗組
組 載體
PBS N/A
NV N/A
SB07401 二價aCAR + EMCN iCAR (sinvec)
SB07412 二價aCAR + EMCN iCAR (sinvec)
SB07779 二價aCAR Her2 KLRG1 iCAR (sinvec)
SB07403 二價aCAR + EMCN iCAR (retrovec)
SB07418 二價aCAR+ EMCN iCAR (retrovec)
SB07569 二價aCAR+ Her2 KLRG1 iCAR (retrovec)
表 H ：研究之結構及簡要概述
組 腫瘤細胞 處理 NK 細胞 小鼠數 觀察結果 ( 處理後2-6 hr) 概述
1 Nalm6-FLT3 (0.25e6) + Nalm6-EMCN-FLT3 (0.25e6) 1:1混合物 PBS 4      
2    NK NV 4      
3    NK SB07401 4      
4    NK SB07412 4      
5    NK SB07779 4 低體溫，較少活動 恢復
6    NK SB07403 4 低體溫，較少活動 恢復
7    NK SB07418 4 低體溫，較少活動 4隻中有2隻死亡
8    NK SB07569 4 低體溫，較少活動 4隻中有3隻死亡
9 SEM-CD33 (1.5e6) + SEM-EMCN-CD33 (1.5e6) 1:1混合物 PBS 6      
10    NK NV 5      
11    NK SB07401 5      
12    NK SB07412 6 低體溫，較少活動 恢復
13    NK SB07779 6 低體溫，較少活動 恢復
14    NK SB07403 6      
15    NK SB07418 6 低體溫，較少活動 6隻中有5隻死亡。1隻安樂死
16    NK SB07569 6 低體溫，較少活動 6隻中有1隻死亡
MV4-11 活體內研究
藉由在小鼠模型中使用MV4-11靶細胞進行活體內研究以評估表現aCAR/iCAR之NK細胞之功能性。 表 I概述用於本研究中之實驗組，且 表 J概述研究結果。在第0天將50 μL MV4-11細胞及150 μL NK細胞注射至JAX IL15 NSG小鼠中。亦每週兩次向動物投與IL2。在第21天，結束IL2投與。在第7、21、28及34天實施BLI量測。 圖 38A- 圖 38B分別顯示在指示時間點之BLI量測之代表性影像及定量。與PBS或未轉導之NK細胞對照相比，注射用構築體SB7401、SB7412、SB07403及SB07418轉導之NK細胞顯示減少之腫瘤生長，如藉助BLI所定量。當研究持續至約55天時，該觀察結果對於SB07412及SB04128持續( 圖 39A)。 圖 39B顯示第55天用PBS、未轉導之NK細胞以及經SB07412及SB07418轉導之NK細胞注射的動物之代表性BLI影像。影像顯示接受經構築體SB07412及SB07418轉導之NK細胞之小鼠在第55天展現出降低之信號，表明與PBS及經轉導之NK細胞對照相比，對所注射之MV4-11細胞之殺傷。在 圖 39C中，接受PBS或未轉導之NK細胞之小鼠的中值存活期分別計算為49天及55天，而接受經轉導NK細胞(SB07412及SB07418)之小鼠具有未定之中值存活期。當與用PBS或未轉導之NK細胞處理之小鼠相比時，發現用SB07412或SB07418轉導之NK細胞處理之小鼠的中值存活期的差異顯著，顯示由SB07412或SB07418編碼之構築體增加MV4-11腫瘤模型中之存活。在 圖 39D中，實施與 圖 39C相同之研究直至第120天，其中發現用PBS (49天)、未經工程改造之NK細胞(NV) (55天)、用SB07412 Sinvec (81.5天)或SB07418 RetroVec (108天)轉導的經工程改造之NK細胞注射之小鼠的中值存活期(天)。 表 I
組 載體
PBS N/A
NV N/A
SB07401 二價aCAR + EMCN iCAR (Sinvec)
SB07412 二價aCAR + EMCN iCAR (Sinvec)
SB07403 二價aCAR + EMCN iCAR (Retrovec)
SB07418 二價aCAR + EMCN iCAR (Retrovec)
表 J顯示用具有特定構築體之各別病毒轉導後NK細胞之定量。 表 J
SB 編號 表現CD33+ % 表現EMCN+ % 拷貝數
SB07401(SinVec) 79.3 58.8 38.1
SB07412(SinVec) 86.3 65.8 47.7
SB07403 (RetroVec) 59.70 71.90 27.6
SB07418 (RetroVec) 80.1 58.4 25.7
實例 6 ：其他 iCAR 架構之驗證
在本研究中，測試額外ICD在EMCN ICAR中之使用。 表 9提供所評估之全長抗EMCN iCAR之序列，其包括所指示之各種ICD，其中所有iCAR皆包括相同的抗EMCN結合物序列：在如先前在本揭示案中所述之細胞毒性分析中測試具有各種ICD之iCAR。
細胞經工程改造以表現具有不同ICD之aCAR及iCAR，以確定各種iCAR架構對aCAR活性之抑制作用。在使用僅表現FLT3之靶細胞或表現FLT3及EMCN二者之靶細胞之活體外細胞毒性保護分析篩選中使用表現具有不同ICD之iCAR之FLT3非EMCN CAR-NK細胞(經工程改造以共表現相同FLT3 aCAR與不同EMCN iCAR之原代NK細胞) ( 圖 40)。若所測試之iCAR係功能性的且能夠抑制aCAR活性，則應保護表現FLT3及EMCN之靶細胞群體免受aCAR介導之殺傷。鑑別出多種功能性iCAR架構，其能夠在EMCN表現缺失下達成穩健的靶細胞殺傷，且在EMCN存在下提供顯著的抗原依賴性靶細胞保護。 表 9 ：具有不同細胞內傳訊結構域之例示性 EMCN iCAR 之列表
ICD SEQ ID NO: EMCN iCAR + ICD AA 序列
LIR1 489 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH
LIR2 490 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVVLLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQPEDGVEMDTRAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH
LIR3 491 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVLIGVSVAFVLLLFLLLFLLLRRQRHSKHRTSDQRKTDFQRPAGAAETEPKDRGLLRRSSPAADVQEENLYAAVKDTQSEDRVELDSQSPHDEDPQAVTYAPVKHSSPRREMASPPSSLSGEFLDTKDRQVEEDRQMDTEAAASEASQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEGEPPAEPSIYATLAIH
LIR5 492 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVLIGVLVVSILLLSLLLFLLLQHWRQGKHRTLAQRQADFQRPPGAAEPEPKDGGLQRRSSPAADVQGENFCAAVKNTQPEDGVEMDTRQSPHDEDPQAVTYAKVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSFTLRQKATEPPPSQEGASPAEPSVYATLAIH
KIR2DL1 493 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP
KIR3DL1 494 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP
LIR1- KIR3DL1 495 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIHHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP
KIR3DL1- KIR3DL1 496 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP
LIR1- LIR1 497 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH
BTLA 498 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS
SIGLEC 2 499 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH
SIGLEC 10 500 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDGAFLGIGITALLFLCLALIIMKILPKRRTQTETPRPRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQKATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQYQLPSFPEPKSSTQAPESQESQEELHYATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEVKFQ
KLRG1 501 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAIALGLLTAVLLSVLLYQWIMTDSVIYSMLELPTATQAQNDYGPQQKSSSSRPSCSCLGSG
LAIR1 502 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH
NKG2A 503 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLSRYDMHWVRQPPGQGLEWMGVIWGNGNTHYHSALKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAIYFCTLRIKDWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPPSLSVALGQSVSISCKSSQSLVASDENTYLNWLLQSPGRSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSEKDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQGIHLPWTFGGGTKLELKGKPIPNPLLGLDSTNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGILVAVILLLLLLLLLFLIMDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK
實例 7 ：源自不同供體的表現 FLT3/CD33 非 EMCN 之 NK 細胞之表徵
在該研究中，表徵自不同供體獲得之NK細胞以評估供體與供體之變異性。該等細胞未經工程改造或經FLT3/CD33非EMCN迴路(SB07412)工程改造。表徵源自不同供體之NK細胞表現SB07412內不同組分(FLT3/CD33二價aCAR、EMCN iCAR及crIL15)之能力。 圖 45A- 圖 45D顯示crIL15陽性NK細胞( 圖 45A)、經分泌crIL15 ( 圖 45B)、CD33/FLT3二價aCAR ( 圖 45C)及EMCN iCAR ( 圖 45D)之表現。 NK 細胞之細胞毒性
在 圖 41A- 圖 41F中，測試未經工程改造或經工程改造之NK細胞針對AML細胞株MOLM-13或MV4-11及SEM (FLT3+/CD33+ /EMCN-)的細胞介導之細胞毒性。在該等分析中使用自11個不同NK供體產生之總共16批NK細胞。當在所有測試批次之NK細胞之間比較細胞毒性資料時，在所有細胞株中，由經轉導細胞誘導之平均細胞毒性顯著高於自未經工程改造之NK細胞所觀察到者( 圖 41A- 圖 41C)。對於經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞二者，所觀察到的細胞毒性之量取決於用於實驗中之E:T比率( 圖 41D及 圖 41E)，指示細胞毒性作用與E:T比率相關。在針對SEM (CD33+/FLT3+/EMCN-)靶細胞的細胞介導之細胞毒性之情況下，進一步觀察到所觀察到的細胞毒性與經工程改造之NK細胞上之活化性CAR表現相關( 圖 41F)。
針對MOLM-13、MV4-11及SEM-CD33細胞株測試來自16個不同批次的經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞之細胞毒性。在2:1之E:T比率( 圖 41A- 圖 41C)下，多個NK批次(每條線表示不同的NK批次)中針對MOLM-13 ( 圖 41A)、MV4-11 ( 圖 41B)及SEM-CD33 ( 圖 41C)細胞之NK細胞毒性。每一點表示來自一式三份實施的一個實驗之平均細胞毒性值，且每條線連接來自相同批次的測試細胞之一組成對資料點(未經工程改造及經工程改造之NK細胞)。使用配對t檢驗實施統計；**P＜0.01，****P＜0.0001。 圖 41D- 圖 41E證實在多種E:T比率下針對MOLM-13 ( 圖 41D)及MV4-11 ( 圖 41E)細胞之NK細胞毒性。顯示來自單一NK細胞供體之資料。誤差杠表示樣品標準偏差。 圖 41F顯示針對CD33 CAR表現標繪的來自多個實驗的經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞之細胞毒性。誤差杠表示一式三份樣品之標準偏差，且使用線性回歸擬合資料。 經工程改造之 NK 細胞之細胞介素譜
在 圖 42中，在MOLM-13或MV4-11之第一輪連續殺傷後，自未經工程改造或經工程改造之NK細胞之細胞上清液獲得細胞介素譜。在 圖 42中，藉由分析所指定之細胞介素譜生成熱圖，比較與NK細胞共培養的各別細胞株之經工程改造及未經工程改造之NK細胞之間的細胞介素水準。使用下式生成之值計算倍數表現：倍數表現= log 2(( 經工程改造之 NK 細胞之細胞介素水準)/( 未經工程改造之 NK 細胞之細胞介素水準))。
與來自相同供體的未經工程改造之NK細胞相比，在經工程改造之NK細胞中量測到上清液中更高水準之細胞介素( 圖 42)。藉由確定經工程改造之NK細胞樣品中量測到之細胞介素與來自相同批次的未經工程改造NK樣品相比之倍數變化來計算值。與經工程改造之NK細胞共培養而產生增加之細胞介素係IFNγ、GM-CSF、IL10、TNFα及穿孔蛋白，其皆介導NK細胞中之炎性或細胞毒性功能。當不將NK細胞添加至AML細胞株培養物中時，細胞介素係不可偵測的，表明細胞介素產生歸因於NK細胞之存在，而並非由靶細胞株固有表現。
在與MOLM-13及MV4-11 AML靶細胞以2:1之E:T比率共培養後，自來自5個不同批次的經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞之上清液分析細胞介素。 經工程改造之 NK 細胞針對原發性 AML 樣品之細胞毒性
來自不同亞型之原發性AML患者樣品購自Discovery Life Sciences。將冷凍保存之樣品解凍且培養隔夜以供分析。次日，將解凍及靜息之NK細胞(經工程改造之NK細胞及供體匹配的未經工程改造之NK細胞對照)與原發性AML細胞以2:1 E:T比共培養隔夜。使用活力染料(Sytox Red)經由流式細胞術確定AML靶細胞之活力。為了區分AML母細胞與LSC，使用CD34及CD38進一步剖析CD45低靶細胞。AML母細胞= CD56-CD45低SSC低；LSC = CD56-CD45低CD34高CD38低。
進一步測試經工程改造之細胞針對原發性腫瘤來源之AML樣品之細胞毒性。將來自M0、M1、M4及M5亞型之AML患者樣品與經工程改造之NK細胞或供體匹配的未經工程改造之NK細胞共培養。在37℃/5% CO2孵育箱中隔夜共培養後，經由對AML母細胞及白血病幹細胞(LSC)之流式細胞術閘控來確定細胞毒性。
在兩批所測試的經工程改造之NK細胞中，經工程改造之NK細胞表現出對原發性腫瘤來源之AML樣品之高靶細胞殺傷。表現出針對所測試之每一原發性AML樣品(包括針對AML母細胞及LSC細胞類型二者)之細胞毒性( 圖 43A- 圖 43B)。值得注意的是，在所有測試之樣品中，經工程改造之NK細胞表現出比未經工程改造之NK細胞顯著更大的針對原發性AML母細胞及LSC之細胞毒性。 iCAR 介導之對人類幹細胞之保護
使用經工程改造之NK細胞(SB07412)，先前所揭示之實例闡述表現保護性抗原EMCN以及靶抗原CD33及/或FLT3之細胞之保護。選擇EMCN作為用於健康造血幹細胞(HSC)及其他前驅細胞之保護性抗原，此乃因其在該等健康細胞子集中特異性表現(關於HSC、多潛能前驅細胞(MPP)、淋巴-髓樣經引發前驅細胞(LMPP)及造血前驅細胞(HPC)中之代表性EMCN表現，參見 圖 47)。在該研究中，亦研究了人類造血幹細胞(HSC) (定義為譜系-CD34+ CD38- CD90+ CD45RA，如 圖 48中之流式細胞術閘控策略中所示)之保護。在活體外細胞毒性分析中測試經工程改造以僅表現FLT3/CD33二價aCAR之NK細胞及經工程改造以表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR二者之NK細胞(SB07412)殺傷白血病細胞、同時不傷害原代健康HSC (在富集CD34之健康骨髓中)之能力。為了殺傷表現FLT3/CD33之白血病細胞，將CAR NK細胞與白血病細胞以1:2之效應物:靶標比率共培養大約18小時，接著收集細胞，染色且藉由流式細胞術分析，揭示與無EMCN iCAR之CAR NK細胞相比，EMCN iCAR不顯著抑制對腫瘤靶細胞之殺傷( 圖 46B)。然而，當將相同的CAR NK細胞與原代健康HSC (在富集CD34之健康骨髓混合物內)以3:1之效應物:靶標比率共培養大約18小時，接著收集、染色且藉由流式細胞術分析時，表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR之NK細胞表現出針對EMCN+HSC顯著降低之細胞毒性( 圖 46A)。
重要地，單獨或閘(FLT3/CD33二價aCAR)對照CAR NK細胞及表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR二者之CAR-NK細胞(SB07412)同等地殺傷腫瘤細胞，表明當不接合時，iCAR不強烈地抑制細胞毒性。總之，表現aCAR及保護性iCAR二者之彼等CAR NK細胞對健康EMCN+HSC而非白血病細胞之殺傷顯著降低。
在 圖 46C中，實施集落形成細胞分析以進一步證實在用SB07412轉導的經工程改造之NK細胞存在下維持造血幹細胞及前驅細胞(HSPC)群體，該等經工程改造之NK細胞表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR二者。首先，將原代健康HSPC (富集CD34之骨髓)與(或不與，作為對照)經轉導以表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR之CAR-NK細胞(SB07412)以1:2之效應物:靶標比率共培養大約18小時(一式三份)，接著收集來自每一孔之細胞，且將1/10之細胞重新平鋪於針對造血幹細胞及前驅細胞集落之生長及計數最佳化之甲基纖維素，其中每一集落皆係針對單一親代幹細胞/前驅細胞之功能讀數。藉由對來自甲基纖維素分析之集落實施計數及評分，與單獨HSPC對照相比，HSPC與具有EMCN iCAR之CAR NK細胞之共培養並未顯著減少幹細胞/前驅細胞(具有集落形成潛力)之數目。
作為 圖 46A- 圖 46B中詳述之HSC實驗之一部分，亦評估EMCN iCAR亦減少前驅細胞、特定而言多潛能前驅(MPP)細胞之殺傷之能力(定義為譜系-CD34+ CD38- CD90- CD45RA-，如 圖 48中之流式細胞術閘控策略中所示)。在活體外細胞毒性分析中測試經工程改造以僅表現FLT3/CD33二價aCAR之NK細胞及經工程改造以表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR二者之NK細胞(SB07412)不傷害原代健康MPP (在富集CD34之健康骨髓中)之能力。將CAR NK細胞與原代健康MPP (在富集CD34之健康骨髓混合物內)以3:1之效應物:靶標比率共培養大約18小時，接著收集，染色，且藉由流式細胞術分析，揭示表現FLT3/CD33二價aCAR及EMCN iCAR之NK細胞表現出針對整個健康MPP群體( 圖 46D)及健康EMCN+MPP ( 圖 46E)二者顯著降低之細胞毒性。 NK 細胞表型分析
分析來自單獨供體之三個不同批次的經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞的與NK細胞活化、增殖及功能有關的表型標記物之表現。倍數變化分析指示，與未經工程改造之NK細胞相比，若干標記物在經工程改造之NK細胞中具有升高之表現。( 圖 44)。將經工程改造之NK細胞中上調的前7個標記物鑑別為細胞毒性標記物TRAIL、NKG2D、NKp30、NKp44、CD69、Ki-67及Tim-3。使用下式計算倍數表現： log2(gMFI 經工程改造之 NK 細胞 /gMFI 未經工程改造之 NK 細胞)。
與MV4-11靶細胞共培養後NK表型之分析。藉由流式細胞術分析之NK活化標記物表現之熱圖分析( 圖 44)。每列表示不同的表型標記物。基於所有樣品之平均倍數變化值對標記物進行等級排序。 其他序列 HIV-1 蛋白酶 (SEQ ID NO: 144) ：PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF 血管收縮素轉化酶 (ACE) (SEQ ID NO: 156) ：MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALALDPGLQPGNFSADEAGAQLFAQSYNSSAEQVLFQSVAASWAHDTNITAENARRQEEAALLSQEFAEAWGQKAKELYEPIWQNFTDPQLRRIIGAVRTLGSANLPLAKRQQYNALLSNMSRIYSTAKVCLPNKTATCWSLDPDLTNILASSRSYAMLLFAWEGWHNAAGIPLKPLYEDFTALSNEAYKQDGFTDTGAYWRSWYNSPTFEDDLEHLYQQLEPLYLNLHAFVRRALHRRYGDRYINLRGPIPAHLLGDMWAQSWENIYDMVVPFPDKPNLDVTSTMLQQGWNATHMFRVAEEFFTSLELSPMPPEFWEGSMLEKPADGREVVCHASAWDFYNRKDFRIKQCTRVTMDQLSTVHHEMGHIQYYLQYKDLPVSLRRGANPGFHEAIGDVLALSVSTPEHLHKIGLLDRVTNDTESDINYLLKMALEKIAFLPFGYLVDQWRWGVFSGRTPPSRYNFDWWYLRTKYQGICPPVTRNETHFDAGAKFHVPNVTPYIRYFVSFVLQFQFHEALCKEAGYEGPLHQCDIYRSTKAGAKLRKVLQAGSSRPWQEVLKDMVGLDALDAQPLLKYFQPVTQWLQEQNQQNGEVLGWPEYQWHPPLPDNYPEGIDLVTDEAEASKFVEEYDRTSQVVWNEYAEANWNYNTNITTETSKILLQKNMQIANHTLKYGTQARKFDVNQLQNTTIKRIIKKVQDLERAALPAQELEEYNKILLDMETTYSVATVCHPNGSCLQLEPDLTNVMATSRKYEDLLWAWEGWRDKAGRAILQFYPKYVELINQAARLNGYVDAGDSWRSMYETPSLEQDLERLFQELQPLYLNLHAYVRRALHRHYGAQHINLEGPIPAHLLGNMWAQTWSNIYDLVVPFPSAPSMDTTEAMLKQGWTPRRMFKEADDFFTSLGLLPVPPEFWNKSMLEKPTDGREVVCHASAWDFYNGKDFRIKQCTTVNLEDLVVAHHEMGHIQYFMQYKDLPVALREGANPGFHEAIGDVLALSVSTPKHLHSLNLLSSEGGSDEHDINFLMKMALDKIAFIPFSYLVDQWRWRVFDGSITKENYNQEWWSLRLKYQGLCPPVPRTQGDFDPGAKFHIPSSVPYIRYFVSFIIQFQFHEALCQAAGHTGPLHKCDIYQSKEAGQRLATAMKLGFSRPWPEAMQLITGQPNMSASAMLSYFKPLLDWLRTENELHGEKLGWPQYNWTPNSARSEGPLPDSGRVSFLGLDLDAQQARVGQWLLLFLGIALLVATLGLSQRLFSIRHRSLHRHSHGPQFGSEVELRHS DENV NS3pro (NS2B/NS3) ＞sp|P33478|1475-2093 (SEQ ID NO: 157) ：SGVLWDTPSPPEVERAVLDDGIYRIMQRGLLGRSQVGVGVFQDGVFHTMWHVTRGAVLMYQGKRLEPSWASVKKDLISYGGGWRFQGSWNTGEEVQVIAVEPGKNPKNVQTAPGTFKTPEGEVGAIALDFKPGTSGSPIVNREGKIVGLYGNGVVTTSGTYVSAIAQAKASQEGPLPEIEDEVFRKRNLTIMDLHPGSGKTRRYLPAIVREAIRRNVRTLILAPTRVVASEMAEALKGMPIRYQTTAVKSEHTGKEIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNMIIMDEAHFTDPASIARRGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGSVEAFPQSNAVIQDEERDIPERSWNSGYEWITDFPGKTVWFVPSIKSGNDIANCLRKNGKRVIQLSRKTFDTEYQKTKNNDWDYVVTTDISEMGANFRADRVIDPRRCLKPVILKDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRIGRNQNKEGDQYVYMGQPLNNDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLRGEARKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASEGFQYSDRRWCFDGERNNQVLEENMDVEMWTKEGERKKLRPRWLDARTYSDPLALREFKEFAAGRR DENV NS3pro (NS2B/NS3) ＞sp|P14340|1476-2093 (SEQ ID NO: 158) ：AGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKQKGILGYSQIGAGVYKEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLISYGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALEPGKNPRAVQTKPGLFKTNAGTIGAVSLDFSPGTSGSPIIDKKGKVVGLYGNGVVTRSGAYVSAIAQTEKSIEDNPEIEDDIFRKRKLTIMDLHPGAGKTKRYLPAIVREAIKRGLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAIRAEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVEMGEAAGIFMTATPPGSRDPFPQSNAPIMDEEREIPERSWSSGHEWVTDFKGKTVWFVPSIKAGNDIAACLRKNGKKVIQLSRKTFDSEYVKTRTNDWDFVVTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMKPVILTDGEERVILAGPMPVTHSSAAQRRGRIGRNPKNENDQYIYMGEPLENDEDCAHWKEAKMLLDNINTPEGIIPSMFEPEREKVDAIDGEYRLRGEARKTFVDLMRRGDLPVWLAYRVAAEGINYADRRWCFDGIKNNQILEENVEVEIWTKEGERKKLKPRWLDAKIYSDPLALKEFKEFAAGRK DENV NS3pro (NS2B/NS3) ＞sp|Q99D35|1474-2092 (SEQ ID NO: 159) ：SGVLWDVPSPPETQKAELEEGVYRIKQQGIFGKTQVGVGVQKEGVFHTMWHVTRGAVLTHNGKRLEPNWASVKKDLISYGGGWRLSAQWQKGEEVQVIAVEPGKNPKNFQTMPGIFQTTTGEIGAIALDFKPGTSGSPIINREGKVVGLYGNGVVTKNGGYVSGIAQTNAEPDGPTPELEEEMFKKRNLTIMDLHPGSGKTRKYLPAIVREAIKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALKGLPIRYQTTATKSEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGTADAFPQSNAPIQDEERDIPERSWNSGNEWITDFVGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKNGKKVIQLSRKTFDTEYQKTKLNDWDFVVTTDISEMGANFKADRVIDPRRCLKPVILTDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRVGRNPQKENDQYIFMGQPLNKDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLKGESRKTFVELMRRGDLPVWLAHKVASEGIKYTDRKWCFDGERNNQILEENMDVEIWTKEGEKKKLRPRWLDARTYSDPLALKEFKDFAAGRK DENV NS3pro (NS2B/NS3) ＞sp|Q5UCB8|1475-2092 (SEQ ID NO: 160) ：SGALWDVPSPAATQKAALSEGVYRIMQRGLFGKTQVGVGIHIEGVFHTMWHVTRGSVICHETGRLEPSWADVRNDMISYGGGWRLGDKWDKEEDVQVLAIEPGKNPKHVQTKPGLFKTLTGEIGAVTLDFKPGTSGSPIINRKGKVIGLYGNGVVTKSGDYVSAITQAERIGEPDYEVDEDIFRKKRLTIMDLHPGAGKTKRILPSIVREALKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAVKSEHTGREIVDLMCHATFTTRLLSSTRVPNYNLIVMDEAHFTDPSSVAARGYISTRVEMGEAAAIFMTATPPGTTDPFPQSNSPIEDIEREIPERSWNTGFDWITDYQGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKSGKKVIQLSRKTFDTEYPKTKLTDWDFVVTTDISEMGANFRAGRVIDPRRCLKPVILPDGPERVILAGPIPVTPASAAQRRGRIGRNPAQEDDQYVFSGDPLKNDEDHAHWTEAKMLLDNIYTPEGIIPTLFGPEREKTQAIDGEFRLRGEQRKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASAGISYKDREWCFTGERNNQILEENMEVEIWTREGEKKKLRPKWLDARVYADPMALKDFKEFASGRK PEST ( 人類 IκBα 之殘基 277-307 之兩個拷貝； SEQ ID NO: 161) ：LQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDGSLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDD GRR ( 人類 p105 之殘基 352-408 ； SEQ ID NO: 162) ：EIKDKEEVQRKRQKLMPNFSDSFGGGSGAGAGGGGMFGSGGGGGGTGSTGPGYSFPH DRR ( 酵母 Cdc34 之殘基 210-295 ； SEQ ID NO: 163) ：IDDENGSVILQDDDYDDGNNHIPFEDDDVYNYNDNDDDDERIEFEDDDDDDDDSIDNDSVMDRKQPHKAEDESEDVEDVERVSKKD SNS (SP2 及 NB 之銜接重複 (A 型流感或 B 型流感之 SP2-NB-SP2 ；例如， SEQ ID NO: 164) ：PESMREEYRKEGSKRIKCPDCEPFCNKRGSPESMREEYRKE RPB ( 酵母 RPB 之殘基 1688-1702 之四個拷貝； SEQ ID NO: 165) ：RSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSGGSRSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSG SPmix (SP1 及 SP2 之銜接重複 (A 型流感病毒 M2 蛋白之 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2 ； SEQ ID NO: 166) ：PESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKE NS2 (A 型流感病毒 NS 蛋白之殘基 79-93 之三個拷貝； SEQ ID NO: 167) ：LIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGS ODC ( 鳥胺酸去羧酶之殘基 106-142 ； SEQ ID NO: 168) ：FPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV 小鼠 ODC ( 殘基 422-461 ； SEQ ID NO: 169) ：SHGFPPEVEEQAAGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV SB03513 (SEQ ID NO: 210)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSDEPHYSQRRLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03514 (SEQ ID NO: 211)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSVTPEPIFSLILLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03515 (SEQ ID NO: 212)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSDEPHYSQRRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03516 (SEQ ID NO: 213)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSVTPEPIFSLISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03517 (SEQ ID NO: 214)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGDEPHYSQRRGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03518 (SEQ ID NO: 215)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03519 (SEQ ID NO: 216)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQDEPHYSQRRLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SB03520 (SEQ ID NO: 217)AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQVTPEPIFSLILLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV 5X NFAT minADEp 啟動子 (SEQ ID NO: 218)GGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTCCTGCAGGagctGGCGCGCCAGACGCTAGCGGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGTTCGTCCTCACTCT SB06342; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 425)aagcttgaattcgagcttgcatgcctgcaggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgagatcgggagacccctgcccagggaccaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttaggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaaaatatgggccccccctcgagCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCTCGAggccgccaccATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTGGGTAGCGGCCAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCTATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCTGAAGTTCAGCTGGTTCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCTCTTGGGTTCGACAGGCACCTGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCTATCTTCGGCACCGCCAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGAAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCTGTGTATTACTGCGCCACATTCGCCCTGTTCGGCTTCAGAGAGCAGGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTTTCATCTGGCGGCGGTGGCTCTCAGGTTCAGCTTGTGCAATCTGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAATATGCATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGCCAGGGACTTGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACAATCACAGCCGACGAGTCCACCAATACTGCTTATATGGAACTGTCTAGCCTTCGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGAGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGCGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCCTCAAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACATTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGGTGGCGGCGGATCCGATATTCAGATGACTCAGTCCCCAAGCAGCCTGTCAGCCTCCGTGGGCGATAGAGTCACCATTACATGCAGAGCCAGCCAGTCCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCCGGAAAGGCTCCAAAGCTCCTCATCTACGCCGCTTCTAGCCTGCAGTCTGGCGTGCCATCTAGATTCTCTGGCTCCGGAAGCGGGACCGACTTCACACTGACCATATCTTCTCTGCAGCCCGAAGATCTGGCCACGTACTATTGTCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGACCCGGAACAAAGGTGGACATTAAGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTTCTGGCCAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCTATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCAACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCACtaaTgAggatccggattagtccaatttgttaaagacaggatgggctgcaggaattccgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggagaattcgatatcagtggtccaggctctagttttgactcaacaatatcaccagctgaagcctatagagtacgagccatagataaaataaaagattttatttagtctccagaaaaaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcaataaaagagcccacaacccctcactcggggcgccagtcctccgattgactgagtcgcccggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatcgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcacacatgcagcatgtatcaaaattaatttggttttttttcttaagctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagatcccgcggtacctcgcgaatgcatctagatccaatggcctttttggcccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttgcggccgcttagccctcccacacataaccagagggcagcaattcacgaatcccaactgccgtcggctgtccatcactgtccttcactatggctttgatcccaggatgcagatcgagaagcacctgtcggcaccgtccgcaggggctcaagatgcccctgttctcatttccgatcgcgacgatacaagtcaggttgccagctgccgcagcagcagcagtgcccagcaccacgagttctgcacaaggtcccccagtaaaatgatatacattgacaccagtgaagatgcggccgtcgctagagagagctgcgctggcgacgctgtagtcttcagagatggggatgctgttgattgtagccgttgctctttcaatgagggtggattcttcttgagacaaaggcttggccatgcggccgccgctcggtgttcgaggccacacgcgtcaccttaatatgcgaagtggacctcggaccgcgccgccccgactgcatctgcgtgttcgaattcgccaatgacaagacgctgggcggggtttgtgtcatcatagaactaaagacatgcaaatatatttcttccggggggtaccggcctttttggccATTGGatcggatctggccaaaaaggcccttaagtatttacattaaatggccatagtacttaaagttacattggcttccttgaaataaacatggagtattcagaatgtgtcataaatatttctaattttaagatagtatctccattggctttctactttttcttttatttttttttgtcctctgtcttccatttgttgttgttgttgtttgtttgtttgtttgttggttggttggttaatttttttttaaagatcctacactatagttcaagctagactattagctactctgtaacccagggtgaccttgaagtcatgggtagcctgctgttttagccttcccacatctaagattacaggtatgagctatcatttttggtatattgattgattgattgattgatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttgtgtgtgtgaTtgtgTaTatgtgtgtatggTtgtgtgtgaTtgtgtgtatgtatgTTtgtgtgtgaTtgTgtgtgtgtgaTtgtgcatgtgtgtgtgtgtgaTtgtgtTtatgtgtatgaTtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgtgTaTaTatatttatggtagtgagagGcaacgctccggctcaggtgtcaggttggtttttgagacagagtctttcacttagcttggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttt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SB06463; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 426)aagcttgaattcgagcttgcatgcctgcaggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgagatcgggagacccctgcccagggaccaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttaggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaaaatatgggccccccctcgagCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCTCGAggccgccaccATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTGGGTAGCGGCCAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCTATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCTGAAGTTCAGCTGGTTCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCTCTTGGGTTCGACAGGCACCTGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCTATCTTCGGCACCGCCAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGAAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCTGTGTATTACTGCGCCACATTCGCCCTGTTCGGCTTCAGAGAGCAGGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTTTCATCTGGCGGCGGTGGCTCTCAGGTTCAGCTTGTGCAATCTGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAATATGCATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGCCAGGGACTTGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACAATCACAGCCGACGAGTCCACCAATACTGCTTATATGGAACTGTCTAGCCTTCGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGAGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAGCGGCGAGGGATCTACCAAGGGCGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCCTCAAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACATTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGGTGGCGGCGGATCCGATATTCAGATGACTCAGTCCCCAAGCAGCCTGTCAGCCTCCGTGGGCGATAGAGTCACCATTACATGCAGAGCCAGCCAGTCCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCCGGAAAGGCTCCAAAGCTCCTCATCTACGCCGCTTCTAGCCTGCAGTCTGGCGTGCCATCTAGATTCTCTGGCTCCGGAAGCGGGACCGACTTCACACTGACCATATCTTCTCTGCAGCCCGAAGATCTGGCCACGTACTATTGTCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGACCCGGAACAAAGGTGGACATTAAGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGTTCTGGCCAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCTATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGC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SB07401; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 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SB07405; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 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SB07412; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 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SB08288; SINvec SV40 (SEQ ID NO: 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SB ID 骨架 序列類型 SS IL15 切割位點 TM 結構域 E2A SS aCAR 二價結合物 鉸鏈 TM 結構域 共刺激 ICD CD3z ICD E2A SS iCAR EMCN 結合物 鉸鏈 TM 結構域 LIR1 ICD
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SB ID 骨架 序列類型 SS IL15 切割位點 TM 結構域 E2A SS aCAR 二價結合物 鉸鏈 TM 結構域 共刺激 ICD CD3z ICD E2A SS iCAR EMCN 結合物 鉸鏈 TM 結構域 LIR1 ICD
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SB ID 骨架 序列類型 SS IL15 切割位點 TM 結構域 E2A SS iCAR EMCN 結合物 鉸鏈 TM 結構域 LIR1 ICD E2A SS aCAR 二價結合物 鉸鏈 TM 結構域 共刺激 ICD CD3z ICD
SB07418       IgGE Il15 LR1分割N末端連接體+ Tace10 B7-1 E2A/T2A CD8 EMCN VH (GGGGS)3連接體 EMCN VL LIR1 LIR1 LIR1 E2A/T2A GM-CSFRa FLT3 VH (GGGGS)2連接體 CD33 VH (GGGGS)2連接體 CD33 VL (GGGGS)2連接體 FLT3 VL CD8 CD8 CD28 CD3z
Retrovec DNA ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCA GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCT GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT GAAGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCTCTTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATGGGAGGCATCATCCCCATCTTCGGCACCGCCAATTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACATTTGCCCTGTTCGGCTTCAGAGAGCAGGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTTTCTAGC GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT CAGGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTGAAAAAGCCAGGCTCCTCCGTGAAAGTCTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAACATGCACTGGGTCCGACAAGCTCCAGGCCAGGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACAATCACAGCCGACGAGTCCACCAACACAGCTTATATGGAACTGTCTAGCCTGCGCTCCGAGGATACAGCTGTGTACTATTGTGCCAGGGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAA GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT GATATCCAAATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGAGCGCCAGCGTTGGCGATAGAGTCACAATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCTCCTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAAGCTCCCAAACTCCTGATCTATGCTGCCTCCAGCCTGCAGAGTGGCGTGCCATCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTTACACTGACAATATCTTCCCTGCAGCCAGAGGACCTGGCCACATATTATTGCCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGACCCGGAACAAAGGTGGACATTAAG GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
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Sinvec DNA ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCA TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCA GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCT GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT GTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT GAAGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCTCTTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATGGGAGGCATCATCCCCATCTTCGGCACCGCCAATTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACATTTGCCCTGTTCGGCTTCAGAGAGCAGGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTTTCTAGC GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT CAGGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTGAAAAAGCCAGGCTCCTCCGTGAAAGTCTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAACATGCACTGGGTCCGACAAGCTCCAGGCCAGGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACAATCACAGCCGACGAGTCCACCAACACAGCTTATATGGAACTGTCTAGCCTGCGCTCCGAGGATACAGCTGTGTACTATTGTGCCAGGGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT GGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGCTCT GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCAAGGCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAA GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT GATATCCAAATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGAGCGCCAGCGTTGGCGATAGAGTCACAATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCTCCTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAAGCTCCCAAACTCCTGATCTATGCTGCCTCCAGCCTGCAGAGTGGCGTGCCATCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTTACACTGACAATATCTTCCCTGCAGCCAGAGGACCTGGCCACATATTATTGCCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGACCCGGAACAAAGGTGGACATTAAG GCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
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解釋
本文所揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案皆關於其每一者所列舉之標的物以引用方式併入，其在一些情形中可涵蓋整個文件。
除非明確指示相反之情形，否則如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用之不定冠詞「一(a及an)」應理解為意指「至少一」。
亦應理解，除非明確指示相反之情形，否則在本文所主張之包括超過一個步驟或動作之任何方法中，該方法之步驟或動作之順序不必受限於列舉該方法之步驟或動作之順序。
在申請專利範圍中以及在上文說明書中，所有過渡片語(諸如「包含」、「包括」、「攜載」、「具有」、「含有」、「涉及」、「固持」、「由...構成」及諸如此類)皆應理解為係開放式的，亦即，意指包括但不限於。僅過渡片語「由……組成」及「基本上由……組成」應分別係封閉式或半封閉式過渡片語，如美國專利局專利審查程序手冊(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)第2111.03節中所陳述。
圖 1提供圖解說明總體FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR-NK細胞系統之組分及組織的示意圖。 圖 2提供圖解說明在FLT3或CD33非EMCN邏輯閘控之CAR-NK細胞系統之最佳化中評估的組分之示意圖。 圖 3顯示用於藉由流式細胞術評估iCAR及aCAR表現之閘控策略。 圖 4顯示所指示系列之RetroVec構築體於第15天之aCAR及iCAR表現。 圖 5顯示所指示系列之自失活(SIN) γ逆轉錄病毒SINvec構築體於第15天之aCAR及iCAR表現。 圖 6顯示所指示系列之RetroVec構築體於第15天之膜結合IL-15表現之代表性流式細胞術圖。 圖 7顯示所指示系列之SINvec構築體於第15天之膜結合IL-15表現之代表性流式細胞術圖。 圖 8顯示所指示系列之RetroVec及SINvec構築體之aCAR、iCAR表現及膜結合IL-15之第一系列比較。 圖 9顯示所指示系列之RetroVec及SINvec構築體之aCAR、iCAR表現及膜結合IL-15之第二系列比較。 圖 10顯示所指示系列之RetroVec及SINvec構築體之aCAR、iCAR表現及膜結合IL-15之第三系列比較。 圖 11顯示如藉由MFI評估的所指示系列之RetroVec及SINvec構築體於第15天之aCAR及iCAR表現之概述。 圖 12顯示所評估的各種組分及組織之表現考量因素之一般概述。 圖 13顯示使用LIR1 ICD之構築體針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的總細胞毒性，兩種靶細胞株皆係針對以aCAR至iCAR組織(頂部圖)及iCAR至aCAR組織(底部圖)排序之構築體而言。 圖 14顯示使用LIR1 ICD之構築體針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的正規化細胞毒性。 圖 15顯示對於以aCAR至iCAR組織排序之構築體而言，使用LIR1 ICD之構築體在所指示之效應物:靶標比率下在第17天針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的總細胞毒性。 圖 16顯示使用LIR1 ICD之構築體在所指示之效應物:靶標比率下在第10天針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的正規化細胞毒性，兩種靶細胞株皆係針對以aCAR至iCAR組織(頂部圖)及iCAR至aCAR組織(底部圖)排序之構築體而言。 圖 17圖解說明本文所述膜可切割系統之示意圖，其中期望之酬載表現為嵌合蛋白，其中蛋白酶切割位點插入酬載與膜系鏈結構域之間。左圖圖解說明使用跨膜架構(例如，嵌合蛋白含有跨膜結構域)之膜可切割系統之示意圖。右圖圖解說明使用膜締合架構(例如，嵌合蛋白含有容許與細胞膜締合之轉譯後修飾標籤)之膜可切割系統之示意圖。 圖 18圖解說明用於IL-15之受調控分泌之代表性膜可切割系統，其中IL-15表現為具有切割位點之嵌合蛋白，該切割位點能夠被插入IL-15酬載與膜系鏈結構域之間之TACE切割。左圖藉助使用I型跨膜結構域(諸如PDGFR-β及CD8)圖解說明I型跨膜架構(例如，S - C - MT)。右圖藉助使用II型跨膜結構域(諸如NKG2D及TNFR2)圖解說明II型跨膜架構(例如，MT - C - S)。 圖 19顯示編碼二價FLT3或CD33 aCAR或單特異性aCAR之所指示構築體之組分及其順序。 圖 20顯示二價FLT3或CD33 CAR-NK細胞及單特異性CAR-NK細胞於MV4-11鼠類腫瘤模型中之存活曲線。 圖 21顯示二價FLT3或CD33 CAR-NK細胞及單特異性CAR-NK細胞於MV4-11鼠類腫瘤模型中之代表性腫瘤成像。 圖 22圖解說明aCAR及iCAR之各種帶標籤及無標籤之組合。 圖 23顯示用於評估帶標籤及無標籤CAR之「無病毒」對照之代表性流式細胞術圖。 圖 24顯示無標籤構築體SB07401及SB07405於第8天之代表性流式細胞術圖。 圖 25顯示僅帶iCAR標籤之構築體SB06467於第8天之代表性流式細胞術圖。 圖 26顯示具有環6 (上圖)或環4 (下圖)連接體之所指示構築體的CD33/EMCN雙陽性細胞百分比之概述。 圖 27顯示具有環4連接體之指定構築體之CD33、FLT3及EMCN CAR中之每一者之表現的概述。 圖 28顯示具有環6連接體之指定構築體之CD33、FLT3及EMCN CAR中之每一者之表現的概述。 圖 29顯示使用LIR1 ICD之構築體在1:2效應物:靶標比率下針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的總細胞毒性。 圖 30顯示使用LIR1 ICD之構築體在1:2效應物:靶標比率下針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的正規化細胞毒性(相對於無病毒對照正規化)。 圖 31顯示使用LIR1 ICD之構築體在1:4效應物:靶標比率下針對表現FLT3/CD33之靶細胞株(AML細胞株MV4-11)及工程改造為亦表現非閘靶抗原EMCN之靶細胞株(MV4-11+EMCN)的正規化細胞毒性(相對於無病毒對照正規化)。 圖 32顯示在1:2效應物:靶標比率下表現CD33之靶細胞株(SEM)及亦表現非閘靶抗原之靶細胞株(SEM+EMCN)之特異性細胞毒性。該圖分別在左柱狀圖中提供SEM EMCN-，且在右柱狀圖中提供EMCN+。 圖 33A顯示在24小時連續殺傷分析中在1:2效應物:靶標比率下表現CD33之靶細胞株及亦表現非閘靶抗原之靶細胞株(SEM+EMCN)之特異性細胞毒性。 圖 33B顯示在48小時連續殺傷分析中在1:2效應物:靶標比率下表現CD33之靶細胞株及亦表現非閘靶抗原之靶細胞株(SEM+EMCN)之特異性細胞毒性。 圖 33C顯示在96小時連續殺傷分析中在1:2效應物:靶標比率下表現CD33之靶細胞株及亦表現非閘靶抗原之靶細胞株(SEM+EMCN)之特異性細胞毒性。分別為EMCN+右柱狀圖。 圖 34A顯示評估非邏輯閘控CAR-NK細胞之體內實驗之一般示意圖。 圖 34B顯示 圖 34A中所示之SEM CD33+及SEM CD33+/EMCN+細胞之50:50混合物之表徵。 圖 35顯示活體內實驗之結果，其中將SEM+/-EMCN之1:1混合物注射至小鼠中且用經各別載體轉導之NK細胞處理。頂列顯示第11天之BLI影像，而下圖顯示腫瘤注射後19天之BLI影像。 圖 36顯示 圖 35之結果，其中在第11天及第19天定量所關注區域(ROI)。 圖 37A顯示在活體內研究第14天小鼠中健康細胞之比例，其中向小鼠注射SEM+/-EMCN之1:1混合物且用經各別構築體轉導之NK細胞處理。圓圈部分比較或/非閘控及或閘控之CAR-NK細胞處理之間EMCN+SEM細胞之百分比，顯示用或/非閘控之CAR-NK細胞處理的動物中EMCN+SEM細胞之顯著更高之百分比，證實對EMCN+細胞之非閘保護。 圖 37B顯示在 圖 37A中所示研究之第21天EMCN+ SEM細胞之比例。 圖 37C顯示在 圖 37A中所示研究之第27天EMCN+SEM細胞之比例。 圖 38A顯示在活體內研究之各別天數小鼠之平均BLI量測結果，其中向小鼠注射MV4-11細胞且用經各別構築體轉導之NK細胞處理。 圖 38B顯示在 圖 38A中所示之活體內研究過程中 圖 38A中所示之小鼠之定量BLI信號。 圖 39A顯示在活體內研究之各別天數小鼠之BLI量測結果，其中向小鼠注射MV4-11細胞且用經各別構築體轉導之NK細胞處理。 圖 39B顯示用PBS、未轉導之NK細胞或用經SB07412或SB07418轉導之NK細胞處理之小鼠在腫瘤移植後第55天之代表性影像。 圖 39C顯示測試處理組之存活曲線及中值存活期(天)。 圖 39D顯示 圖 39C中所示研究之繼續，其中已收集資料直至第120天。 圖 40顯示細胞毒性分析中對表現aCAR及不同iCAR細胞內結構域之NK細胞之測試。 圖 41A顯示使用未經工程改造或經工程改造之NK細胞的針對MOLM-13之細胞介導之細胞毒性的比較。 圖 41B顯示使用未經工程改造或經工程改造之NK細胞的針對MV4-11之細胞介導之細胞毒性的比較。 圖 41C顯示使用未經工程改造或經工程改造之NK細胞的針對SEM-CD33之細胞介導之細胞毒性的比較。 圖 41D顯示多種E:T比率下之MOLM-13細胞之NK細胞毒性。 圖 41E顯示多種E:T比率下之MV4-11之NK細胞毒性。 圖 41F顯示針對CD33 CAR表現標繪的來自多個實驗的經工程改造之NK細胞及未經工程改造之NK細胞之NK細胞毒性。 圖 42顯示熱圖，以直觀表示與MV4-11或MOLM-13共培養後NK細胞之細胞介素產生之倍數表現分析。 圖 43A顯示與原發性AML樣品共培養的源自供體A之經工程改造及未經工程改造之NK細胞之NK細胞的細胞毒性。 圖 43B顯示與原發性AML樣品共培養的源自供體B之經工程改造及未經工程改造之NK細胞之NK細胞的細胞毒性。 圖 44顯示如藉由流式細胞術所分析的NK活化標記物之熱圖分析。 圖 45A顯示源自不同供體之經轉導NK細胞中表面相關IL15之表現。 圖 45B顯示源自不同供體之經轉導NK細胞中經分泌IL15之表現。 圖 45C顯示源自不同供體之經轉導NK細胞中CD33/FLT3二價aCAR之表現。 圖 45D顯示EMCN iCAR在源自不同供體的經工程改造之NK細胞中之表現。 圖 46A顯示來自與表現EMCN之人類幹細胞一起孵育之經工程改造之NK細胞的細胞毒性分析之結果。 圖 46B顯示來自與AML (白血病細胞)一起孵育之經工程改造之NK細胞的細胞毒性分析之結果。 圖 46C顯示來自與人類幹前驅細胞一起孵育之經工程改造之NK細胞的細胞毒性分析之結果。 圖 46D顯示來自與原代健康MPP一起孵育之經工程改造之NK細胞的細胞毒性分析之結果。顯示整個健康MPP群體之結果。 圖 46E顯示來自與原代健康MPP一起孵育之經工程改造之NK細胞的細胞毒性分析之結果。顯示健康EMCN+MPP群體之結果。 圖 47顯示兩個代表性供體中富集CD34之原代人類骨髓細胞中各種造血幹細胞及前驅細胞(HSPC)亞群上之EMCN表現，該等細胞亞群包括造血前驅細胞(HPC)、淋巴-髓樣經引發前驅細胞(lympho-myeloid primed progenitor cell，LMPP)、多潛能前驅細胞(MPP)，以及HSC。 圖 48顯示在殺傷分析後對活的剩餘EMCN+HSC之數目進行計數之流式細胞術閘控策略。自左至右及自上至下，基於(1)細胞大小參數、(2)單細胞、(3) CD56陰性細胞(即，非NK細胞)、(4)活CD34+未分化細胞、(5) CD45RA-CD38-細胞(亦即，HSC及MPP)、(6) CD90+細胞(亦即，HSC)及(7) EMCN+HSC之漸進閘。使用FMO對照設置用於CD90及EMCN之閘。

Claims (20)

  1. 一種多順反子表現系統，其包含經工程改造之核酸，該經工程改造之核酸包含：  (A)   編碼膜可切割嵌合蛋白之外源性多核苷酸，該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有下式： S - C - MT或 MT - C - S其中 S包含可分泌效應分子，其中該可分泌效應分子包含IL-15， C包含蛋白酶切割位點，且 MT包含細胞膜系鏈結構域， 其中 S - C - MT或 MT - C - S經構形以表現為單一多肽； (B)   編碼抑制性嵌合抗原受體(iCAR)之外源性多核苷酸，該iCAR包含： (i)     對內皮黏蛋白(EMCN)特異之抗原結合結構域； (ii)    一或多個抑制免疫反應之細胞內抑制性結構域；及 (iii)   一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合；及 (C)   編碼二價活化性嵌合抗原受體(aCAR)之外源性多核苷酸，該aCAR包含： (i)     對FLT3特異之抗原結合結構域； (ii)    對CD33特異之抗原結合結構域； (iii)   一或多個刺激免疫反應之細胞內傳訊結構域；及 (iv)   一或多種選自由以下組成之群之多肽：信號肽、跨膜結構域、鉸鏈結構域、間隔區、一或多種肽連接體及其組合。
  2. 如請求項1之多順反子表現系統，其中該等編碼該膜可切割嵌合蛋白、該iCAR及該二價aCAR中之每一者之外源性多核苷酸係由編碼2A核糖體跳躍元件之多核苷酸連接體連接在一起，視情況其中該2A核糖體跳躍元件係選自由以下組成之群：T2A核糖體跳躍元件、E2A核糖體跳躍元件、P2A核糖體跳躍元件、F2A核糖體跳躍元件、其核糖體跳躍元件融合物及其組合，視情況其中該核糖體跳躍元件融合物包含E2A/T2A核糖體跳躍元件，視情況其中該E2A/T2A核糖體跳躍元件包含胺基酸序列QCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 221)，視情況其中該E2A/T2A核糖體跳躍元件係由包含序列CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 222)或序列CAGTGCACAAATTATGCACTGCTGAAGCTCGCCGGGGATGTCGAGAGTAACCCAGGACCTGGAAGCGGAGAAGGTCGTGGTAGTCTACTAACGTGTGGTGATGTAGAAGAAAATCCTGGACCT (SEQ ID NO: 223)之多核苷酸序列編碼。
  3. 如請求項1或2之多順反子表現系統，其中該膜可切割嵌合蛋白、該iCAR及該二價aCAR係以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii)二價aCAR；及(iii) iCAR；或以5’至3’之如下順序編碼：(i)膜可切割嵌合蛋白；(ii) iCAR；及(iii)二價aCAR。
  4. 如請求項1至3中任一項之多順反子表現系統，其中該可分泌效應分子包含信號肽或信號錨序列，視情況其中該信號肽包含該可分泌效應分子天然之天然信號肽，視情況其中該信號肽包含非天然信號肽，或該信號錨序列包含該可分泌效應分子非天然之非天然信號錨序列，視情況其中該非天然信號肽或該非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶(Gaussia luciferase)、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa，視情況其中該非天然信號肽包含IgE信號肽，視情況其中該IgE信號肽包含胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 228)，視情況其中該IgE信號肽係由包含序列ATGGACTGGACTTGGA TACTCTTTCTGGTCGCTGCCGCCACACGGGTGCACTCT (SEQ ID NO: 229)之多核苷酸序列編碼。
  5. 如請求項1至4中任一項之多順反子表現系統，其中該蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之N末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSG GS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS GGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGS GEGSTKG；及EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK，視情況其中該蛋白酶切割位點進一步包含N末端肽連接體SGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 230)，視情況其中該蛋白酶切割位點進一步包含視情況選自由以下組成之群之C末端肽連接體：SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSG GGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；及EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK，視情況其中該蛋白酶切割位點進一步包含C末端連接體GGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 231)，視情況其中該蛋白酶切割位點包含腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)特異性切割位點，視情況其中該TACE特異性切割位點包含胺基酸序列VTPEPIFSLI (SEQ ID NO: 191)，視情況，其中該TACE特異性切割位點包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO: 250)，視情況其中該TACE特異性切割位點係由包含序列TCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAA (SEQ ID NO: 251)之多核苷酸序列編碼。
  6. 如請求項1至5中任一項之多順反子表現系統，其中該細胞膜系鏈結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、LIR1、B7-1及BTLA，視情況其中該細胞膜系鏈結構域包含B7-1跨膜結構域，視情況其中該B7-1跨膜結構域包含胺基酸序列LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 204)，視情況其中該B7-1跨膜結構域係由包含序列TTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 252)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該膜可切割嵌合蛋白自N末端至C末端定向，具有式 S - C - MT，視情況其中該膜可切割嵌合蛋白包含胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 226)，視情況其中該膜可切割嵌合蛋白係由包含序列ATGGACTGGACTTGGATACTCTTTCTGGTCGCTGC CGCCACACGGGTGCACTCTAATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAAAATCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGTCCAGCAACGGCAATGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGTGACCCCTGAGCCTATCTTCAGCCTGATCGGCGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAATTGCTGCCTAGCTGGGCCATCACACTGATCTCCGTGAACGGCATCTTCGTGATCTGCTGCCTGACCTACTGCTTCGCCCCTAGATGCAGAGAGCGGAGAAGAAACGAGCGGCTGAGAAGAGAAAGCGTGCGGCCTGTG (SEQ ID NO: 227)之多核苷酸序列編碼。
  7. 如請求項1至6中任一項之多順反子表現系統，其中該對EMCN特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： 該EMCN-VH包含： 具有RYDMH (SEQ ID NO: 291)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 具有VIWGNGNTHYHSALKS (SEQ ID NO: 296)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 具有RIKD (SEQ ID NO: 298)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 該EMCN-VL包含： 具有KSSQSLVASDENTYLN (SEQ ID NO: 299)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 具有QVSKLDS (SEQ ID NO: 300)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 具有LQGIHLPWT (SEQ ID NO: 301)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義；視情況其中該EMCN-VH及該EMCN-VL係由肽連接體隔開，視情況其中該對EMCN特異之抗原結合結構域包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中L係該肽連接體，視情況其中該肽連接體包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSG；GGGSGGGGSGGGSLQ；GGS；GGSGGS；GGSGGSGGS；GGSGGSGGS GGS；GGSGGSGGSGGSGGS；GGGS；GGGSGGGS；GGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGS；GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；GGGGS；GGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；GSTSGSGKPGSGEGSTKG；或EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK，視情況其中該肽連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 244)，視情況其中該肽連接體係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 253)之多核苷酸序列編碼。
  8. 如請求項1至7中任一項之多順反子表現系統，其中該細胞內抑制性結構域包含LIR1細胞內抑制性結構域，視情況其中該LIR1細胞內抑制性結構域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 285)，視情況其中該LIR1細胞內抑制性結構域係由包含序列CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 286)之多核苷酸序列編碼。
  9. 如請求項1至8中任一項之多順反子表現系統，其中(A)該信號肽存在於該iCAR中，視情況其中該iCAR之該信號肽包含天然信號肽或非天然信號肽，視情況其中該非天然信號肽或該非天然信號錨序列係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2及GMCSF，視情況其中該iCAR之該信號肽包含CD8信號肽，視情況其中該CD8信號肽包含胺基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 137)，視情況其中該CD8信號肽係由包含序列ATGGCTCTGCCC GTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCA (SEQ ID NO: 416)之多核苷酸序列編碼；及/或其中(B)該鉸鏈結構域存在於該iCAR中，視情況其中該iCAR之該鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合，視情況其中該iCAR之該鉸鏈結構域包含LIR1鉸鏈，視情況其中該LIR1鉸鏈包含胺基酸序列HPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (SEQ ID NO: 417)，視情況其中該LIR1鉸鏈係由包含序列CACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTT (SEQ ID NO: 418)之多核苷酸序列編碼；視情況其中該iCAR之該鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈，視情況其中該CD8鉸鏈包含胺基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACD (SEQ ID NO: 271)，視情況其中該CD8鉸鏈係由包含序列ACAACAACACCCGCACCTCGGCCTCCAACTCCAGCTCCAACAATTGCACTGCAACCCCTGAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCTGTTCACACTAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC (SEQ ID NO: 283)之多核苷酸序列編碼；及/或其中(C)存在該iCAR之該跨膜結構域，視情況其中該iCAR之該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之跨膜結構域：PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ鏈、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1、LIR1及BTLA，視情況其中該iCAR之該跨膜結構域包含LIR1跨膜結構域，視情況其中該LIR1跨膜結構域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 259)，視情況其中該LIR1跨膜結構域係由包含序列GTGATCGGCA TTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 260)之多核苷酸序列編碼。
  10. 如請求項1至9中任一項之多順反子表現系統，其中該iCAR包含胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYDMHWVRQAPGKGLEWVSVIWGNGNTHYHSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTLRIKDWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVASDENTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGIHLPWTFGQGTKLEIKngaaHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 419)，視情況其中該iCAR係由包含序列ATGGCTCTGCCCGTGACAGCTTTGCTGCTGCCTTTGGCACTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCAGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGATACGATATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGTGATCTGGGGCAACGGCAACACACACTACCACAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCTGAGAATCAAGGATTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGGTGGCCAGCGACGAGAACACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGACAGTCTCCTAGACGGCTGATCTACCAGGTGTCCAAGCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTCTGCAAGGCATCCATCTGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGAATGGCGCTGCACACCCATCCGATCCTCTCGAGCTGGTGGTTTCTGGACCTTCTGGCGGCCCTAGCAGCCCTACAACAGGACCTACAAGCACAAGCGGCCCTGAGGACCAACCTCTGACACCAACAGGCAGCGATCCTCAGTCTGGACTGGGGAGACATCTGGGCGTTGTGATCGGCATTCTGGTCGCCGTGATCCTGCTCCTGTTGCTCCTGCTGCTTCTGTTCCTGATCCTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCATCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCCCAAGAGGAAAATCTTTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAGCCTGAGGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCAGAAGTGAAGCACTCCAGACCTCGGAGAGAGATGGCAAGCCCTCCATCTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAAGACAGACAGGCCGAAGAGGACAGACAGATGGATACCGAAGCCGCCGCTTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAAGGCCCATCTCCTGCCGTGCCTTCCATCTATGCCACTCTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 420)之多核苷酸序列編碼。
  11. 如請求項1至10中任一項之多順反子表現系統，其中該對FLT3特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： 該FLT3-VH包含： 具有GGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 360)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 具有GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 361)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 具有FALFGFREQAFDI (SEQ ID NO: 362)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 該FLT3-VL包含： 具有RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 363)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 具有AASSLQS (SEQ ID NO: 364)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 具有QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 365)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義；視情況其中： 該FLT3-VH包含胺基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315)；且 該FLT3-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)，視情況其中該FLT3-VH及該FLT3-VL係由肽連接體隔開。
  12. 如請求項1至11中任一項之多順反子表現系統，其中該對CD33特異之抗原結合結構域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： 該CD33-VH包含： 具有DYNMH (SEQ ID NO: 402)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR-H1)、 具有YIYPYNGGTGYNQKFKSKA (SEQ ID NO: 403)之胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDR-H2)及 具有GRPAMDYWGQ (SEQ ID NO: 404)之胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDR-H3)，且 該CD33-VL包含： 具有RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 405)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR-L1)、 具有AASNQGS (SEQ ID NO: 406)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDR-L2)及 具有QQSKEVPWT (SEQ ID NO: 407)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDR-L3)，且 其中參考抗體之該CDR-H1、該CDR-H2、該CDR-H3、該CDR-L1、該CDR-L2及該CDR-L3之該等胺基酸序列係基於Kabat編號方案來定義；視情況其中： 該CD33-VH包含胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329)；且 該CD33-VL包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 330)，視情況其中該CD33-VH及該CD33-VL係由肽連接體隔開。
  13. 如請求項1至12中任一項之多順反子表現系統，其中該aCAR抗原結合結構域包含結構(FLT3-VH) - L1 - (CD33-VH) - L2 - (CD33-VL) - L3 - (FLT3-VL)，其中L1、L2及L3分別係第一肽連接體、第二肽連接體及第三肽連接體；視情況其中該等L1、L2及/或L3各自獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID No: 230-248，視情況其中該L1肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)，視情況其中該L1肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 254)之多核苷酸序列編碼，或該L1肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGG ATCT (SEQ ID NO: 256)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該L2肽連接體係胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 247)，視情況其中該L2肽連接體係由包含序列GGCTCTACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGAAG CGGCGAGGGATCTACCAAGGGC (SEQ ID NO: 249)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該L2肽連接體係胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)，視情況其中該L2肽連接體係由包含序列GGTGGCGGAGGAAGTGGC GGCGGAGGCTCT (SEQ ID NO: 257)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該L3肽連接體係胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 242)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)，視情況其中該L3肽連接體GGGGS (SEQ ID NO: 242)係由包含序列GGTGGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 255)之多核苷酸序列編碼，或該L3肽連接體GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 243)係由包含序列GGCGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 258)之多核苷酸序列編碼。
  14. 如請求項1至13中任一項之多順反子表現系統，其中該等刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域係選自由以下組成之群：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、CD97、CD2、ICOS、CD27、CD154、CD8、OX40、4-1BB、CD28、ZAP40、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、MyD88、2B4、CD40、PD-1、LFA-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、SLAM蛋白、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、CDS、ICAM-1、(CD11a/CD18)、BAFFR、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及其組合，視情況其中該等刺激免疫反應之aCAR細胞內傳訊結構域包含CD28共刺激結構域及CD3ζ傳訊結構域，視情況其中該CD28共刺激結構域包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 287)，視情況其中該CD28共刺激結構域係由包含序列AGAAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 288)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該CD3ζ傳訊結構域包含胺基酸序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 289)，視情況其中該CD3ζ傳訊結構域係由包含序列AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCC GCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 290)之多核苷酸序列編碼，視情況其中 (A) 存在該aCAR之該鉸鏈結構域，視情況其中該aCAR之該鉸鏈結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合，視情況其中該aCAR之該鉸鏈結構域包含CD8鉸鏈，視情況其中該CD8鉸鏈包含胺基酸序列ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPT TTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 272)，視情況其中該CD8鉸鏈係由包含序列GCCCTGAGCAACAGCA TCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCACCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTTGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 284)之多核苷酸序列編碼，及/或其中 (B) 存在該aCAR之該跨膜結構域，視情況其中該aCAR之該跨膜結構域係選自由以下組成之群：人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈、IgG4鉸鏈、IgG2鉸鏈、CD8a鉸鏈或IgD鉸鏈、KIR2DS2鉸鏈、LNGFR鉸鏈、LIR1鉸鏈、PDGFR-β細胞外連接體及其組合，視情況其中該aCAR之該跨膜結構域包含CD8鉸鏈，視情況其中該CD8跨膜包含胺基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLL SLVITLYCNHR (SEQ ID NO: 206)，視情況其中該CD8跨膜係由包含序列ATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGCGGAGTTCTGCTGCTCAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACAGA (SEQ ID NO: 261)之多核苷酸序列編碼；及/或其中 (C) 存在該aCAR之該aCAR信號肽，視情況其中該aCAR之該信號肽係選自由以下組成之群：IgE、IL-12、IL-2、經最佳化之IL-2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、泌乳素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、NKG2D、TNFR2、GMCSF及GM-CSFRa，視情況其中該aCAR之該信號肽包含GM-CSFRa信號肽，視情況其中該GM-CSFRa信號肽包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 423)，視情況其中該GM-CSFRa信號肽係由包含序列ATGCTGCTGCTGGTTACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCATCCTGCCTTTCTGCTTATTCCT (SEQ ID NO: 424)之多核苷酸序列編碼，視情況其中該aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 414)，視情況其中該aCAR包含胺基酸序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 415)。
  15. 一種表現載體，其包含如請求項1至14中任一項之多順反子表現系統，視情況其中該表現載體包含SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 429、SEQ ID NO: 433或SEQ ID NO: 432之多核苷酸。
  16. 一種經分離細胞，其包含如請求項1至14中任一項之多順反子表現系統或如請求項15之表現載體，視情況其中該細胞包含免疫細胞，視情況其中該細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調控性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、骨髓細胞、巨噬細胞、人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC源細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞(iPSC)以及iPSC源細胞，視情況，其中該細胞係NK細胞。
  17. 一種多核苷酸，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 429、SEQ ID NO: 433、SEQ ID NO: 432及SEQ ID NO: 433。
  18. 一種治療有需要之個體之方法，該方法包括投與治療有效劑量之如請求項16之經分離細胞中之任一者或如請求項17之多核苷酸，視情況其中該個體患有癌症，視情況其中該經分離細胞源自該個體，或就該個體而言係同種異體的。
  19. 一種在個體中刺激細胞介導的對腫瘤細胞之免疫反應之方法，該方法包括向患有腫瘤之個體投與治療有效劑量之請求項16之經分離細胞中之任一者或如請求項17之多核苷酸，視情況其中該經分離細胞源自該個體，或就該個體而言係同種異體的。
  20. 一種製備經工程改造之細胞之方法，其包括用如請求項1至14中任一項之多順反子表現系統、如請求項15之表現載體或如請求項17之多核苷酸轉導經分離細胞。
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