CN114765990A - 双重病毒和双重溶瘤病毒以及治疗方法 - Google Patents

双重病毒和双重溶瘤病毒以及治疗方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了能够产生初级病毒和次级病毒的双重病毒以及能够产生初级溶瘤病毒和次级溶瘤病毒的双重溶瘤病毒。

Description

双重病毒和双重溶瘤病毒以及治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月10日提交的美国临时申请第62/913,514号的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本形式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。序列表的计算机可读格式副本，文件名：ONCR-013_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年10月9日，文件大小：约271千字节。
技术领域
背景技术
溶瘤病毒旨在优先感染和破坏癌细胞(MacLean等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》72:630-639(1991)；Robertson等人,《普通病毒学杂志)》73:967-970(1992)；Brown等人,《普通病毒学杂志)》75:3767-3686(1994)；Chou等人,《科学(Science)》250:1262-1265(1990))并且已经在用于癌症治疗的多项临床前和临床研究使用。直接的肿瘤细胞裂解不仅导致细胞死亡，而且还产生针对由局部抗原呈递细胞摄取和呈递的肿瘤抗原的适应性免疫应答。然而，强大的抗肿瘤免疫应答受到病毒株的低效力以及免疫应答可能重定向以靶向病毒本身的限制。
发明内容
本公开提供了重组初级溶瘤病毒，其包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是没有复制能力的。在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒的所述多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
本公开提供了重组初级病毒，其包括编码次级病毒的多核苷酸。在一些实施例中，所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，所述初级病毒和/或所述次级病毒是没有复制能力的。在一些实施例中，所述编码所述次级病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。在一些实施例中，所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。在一些实施例中，所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒。在一些实施例中，所述dsDNA病毒是痘病毒科病毒。在一些实施例中，所述dsDNA病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是RNA病毒。在一些实施例中，所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。在一些实施例中，所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。在一些实施例中，所述负义ssRNA病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的病毒。在一些实施例中，所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒。在一些实施例中，所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹病毒。在一些实施例中，所述正粘病毒科病毒是流感病毒。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是肠道病毒。在一些实施例中，所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)或艾柯病毒(echovirus)。在一些实施例中，所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)。在一些实施例中，所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是门戈病毒(Mengovirus)。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒。在一些实施例中，所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒。在一些实施例中，所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、罗斯河病毒(Ross River Virus)或马雅罗病毒(Mayaro virus)。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒是假型化病毒，并且其中所述初级溶瘤病毒包括所述次级溶瘤病毒的在所述次级溶瘤病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒是甲病毒。在一些实施例中，所述次级病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。在一些实施例中，所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。在一些实施例中，所述次级病毒是假型化病毒，并且其中所述初级病毒包括所述次级病毒的在所述次级病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。在一些实施例中，所述次级病毒是甲病毒。在一些实施例中，所述次级病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，所述可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素诱导型启动子。在一些实施例中，所述可调节启动子包括侧接有重组酶识别位点的组成型启动子。
在一些实施例中，本公开的初级溶瘤病毒进一步包括编码能够与所述可调节启动子结合的肽的第二多核苷酸。在一些实施例中，本公开的初级病毒进一步包括编码能够与所述可调节启动子结合的肽的第二多核苷酸。在一些实施例中，所述第二多核苷酸与组成型启动子或诱导型启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
在一些实施例中，所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。在一些实施例中，所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒进一步包括编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸。在一些实施例中，所述编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒的复制。在一些实施例中，所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
在一些实施例中，所述初级病毒进一步包括编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸。在一些实施例中，所述编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述一个或多个RNAi分子与所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级病毒的复制。在一些实施例中，所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
在一些实施例中，所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。在一些实施例中，所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
在一些实施例中，所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性切除盒(RREC)。在一些实施例中，所述RREC包括转录/翻译终止(STOP)元件。在一些实施例中，所述转录/翻译终止(STOP)元件包括与SEQ ID NO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性反转盒(RRIC)。在一些实施例中，所述RRIC包括在中心元件的每一侧上的两个或更多个正交重组酶识别位点。在一些实施例中，所述RRIC包括启动子或所述启动子的一部分。在一些实施例中，所述RRIC包括编码区或所述编码区的一部分，其中所述编码区编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的病毒基因组。在一些实施例中，所述RRIC包括一个或多个控制元件。在一些实施例中，所述控制元件是转录/翻译终止(STOP)元件。在一些实施例中，所述控制元件具有与SEQ IDNO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述重组酶应答性反转盒(RRIC)进一步包括内含子的一部分。在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的多核苷酸在通过mRNA剪接去除所述内含子之后产生所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的不具有所述重组酶识别位点的成熟病毒基因组转录物。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒进一步包括编码所述重组酶的多核苷酸。在一些实施例中，所述初级病毒进一步包括编码所述重组酶的多核苷酸。在一些实施例中，所述重组酶是翻转酶(Flp)或Cre重组酶(Cre)。在一些实施例中，所述重组酶的编码区包括内含子。在一些实施例中，所述重组酶重组酶的表达盒包括一个或多个mRNA去稳定化元件。在一些实施例中，所述重组酶是包括另外的多肽的融合蛋白的一部分，并且其中所述另外的多肽调节所述重组酶的活性和/或细胞定位。在一些实施例中，所述重组酶的活性和/或细胞定位通过配体和/或小分子的存在进行调节。在一些实施例中，所述另外的多肽包括雌激素受体蛋白的配体结合结构域。
在一些实施例中，所述一个或多个重组酶识别位点是翻转酶识别靶(FRT)位点。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
在一些实施例中，所述初级病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
本公开提供了重组初级溶瘤病毒，其包括编码次级溶瘤病毒的第一多核苷酸和编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，所述第一多核苷酸与第一可调节启动子可操作地连接，并且其中所述第二多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。在一些实施例中，所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒或痘病毒科病毒，任选地其中所述痘病毒科病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒是RNA病毒。在一些实施例中，所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。在一些实施例中，所述负义ssRNA病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的病毒，任选地其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒；任选地其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹；或者任选地其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是肠道病毒，任选地其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(SVV)、柯萨奇病毒或艾柯病毒，任选地其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)，任选地其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或门戈病毒。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒，任选地其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒，并且任选地其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒或马雅罗病毒。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。
本公开提供了重组初级病毒，其包括编码次级病毒的第一多核苷酸和编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。在一些实施例中，所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，所述第一多核苷酸与第一可调节启动子可操作地连接，并且其中所述第二多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
在一些实施例中，所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。在一些实施例中，所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒或痘病毒科病毒，任选地其中所述痘病毒科病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。在一些实施例中，所述初级病毒是RNA病毒。在一些实施例中，所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。在一些实施例中，所述负义ssRNA病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的病毒，任选地其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒；任选地其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹；或者任选地其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是肠道病毒，任选地其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(SVV)、柯萨奇病毒或艾柯病毒，任选地其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)，任选地其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或门戈病毒。在一些实施例中，所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒，任选地其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒，并且任选地其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒或马雅罗病毒。
在一些实施例中，所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。在一些实施例中，所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。
在一些实施例中，所述第一可调节启动子和所述第二可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素依赖性启动子。
在一些实施例中，本公开的初级溶瘤病毒或初级病毒进一步包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码能够与所述第一可调节启动子结合的第一肽和能够与所述第二可调节启动子结合的第二肽。在一些实施例中，所述第三多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
在一些实施例中，所述第一可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第一肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。在一些实施例中，所述第二可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第二肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。在一些实施例中，所述第一可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第一肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。在一些实施例中，所述第二可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第二肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
在一些实施例中，所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒的复制。在一些实施例中，所述一个或多个RNAi分子与所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级病毒的复制。在一些实施例中，所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。在一些实施例中，所述第一核酶编码序列和所述第二核酶编码序列编码锤头状核酶或丁型肝炎病毒核酶。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒的复制。
在一些实施例中，所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。在一些实施例中，所述第一核酶编码序列和所述第二核酶编码序列编码锤头状核酶或丁型肝炎病毒核酶。
在一些实施例中，所述初级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，所述次级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，所述初级病毒和所述次级病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级病毒和/或所述次级病毒的复制。
在一些实施例中，本公开的初级溶瘤病毒进一步包括编码至少一种外源性有效负载蛋白的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述外源性有效负载蛋白是荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子或抗原结合分子。
在一些实施例中，所述次级溶瘤病毒的表达由外源性药剂调节。在一些实施例中，所述外源性药剂是肽、激素或小分子。
在一些实施例中，本公开的初级病毒进一步包括编码至少一种外源性有效负载蛋白的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述外源性有效负载蛋白是荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子或抗原结合分子。
在一些实施例中，所述次级病毒的表达由外源性药剂调节。在一些实施例中，所述外源性药剂是肽、激素或小分子。
本公开提供了包括本公开的初级溶瘤病毒的组合物。本公开提供了包括本公开的初级病毒的组合物。
本公开提供了杀死肿瘤细胞群体的方法，所述方法包括将本公开的所述初级溶瘤病毒或其组合物施用于所述肿瘤细胞群体。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级溶瘤病毒感染并杀死。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级溶瘤病毒感染并杀死。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的亚群被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒两者感染并杀死。在一些实施例中，与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。在一些实施例中，在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
本公开提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的初级溶瘤病毒或其组合物。在一些实施例中，与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级溶瘤病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级溶瘤病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级溶瘤病毒。在一些实施例中，与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级溶瘤病毒。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。在一些实施例中，所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。在一些实施例中，在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
本公开提供了杀死肿瘤细胞群体的方法，所述方法包括将本公开的所述初级病毒或其组合物施用于所述肿瘤细胞群体。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级病毒感染并杀死。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级病毒感染并杀死。在一些实施例中，所述肿瘤细胞的亚群被所述初级病毒和所述次级病毒两者感染并杀死。在一些实施例中，与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。在一些实施例中，在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
本公开提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的初级病毒或其组合物。在一些实施例中，与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级病毒。在一些实施例中，与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级病毒。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。在一些实施例中，与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。在一些实施例中，所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。在一些实施例中，在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
本公开提供了编码本公开的初级溶瘤病毒的多核苷酸。本公开提供了编码本公开的初级病毒的多核苷酸。本公开提供了包括本公开的多核苷酸的载体。本公开提供了包括本公开的载体的药物组合物。
附图说明
图1A-图1B示出了嵌套溶瘤病毒和免疫应答随时间变化的示意图。图1A展示了嵌套溶瘤病毒，其中初级溶瘤病毒的基因组(oV1基因组，灰色条)包括编码次级溶瘤病毒的基因组的多核苷酸(oV2多核苷酸，白色条)，使得两种不同的病毒(oV1和oV2)由相同的构建体产生。图1B展示了oV1和oV2随时间的相对水平，其中oV2的产生是由诱导刺激触发的。随着时间推移，肿瘤特异性CD8+T细胞的对应扩增由灰色虚线指示。这些程序可以用不是溶瘤病毒的病毒来执行。
图2示出了嵌套溶瘤病毒构建体，其中初级病毒是重组HSV，并且次级病毒是正义单链RNA病毒(左下)或负义单链RNA病毒(右下)。次级病毒基因组的表达由四环素应答性Pol II启动子(黑色箭头)和RNA聚合酶I启动子(灰色箭头)调节。重组HSV包括在其糖蛋白B(gB:N/T)中的D285N和A549T突变、在ICP27中的T128、T219a和T122 miR-靶序列、关节区的缺失、US12突变、ICP4中的T124、T1和T143 miR靶序列以及ICP34.5中的T128、T204和T219miR靶序列。
图3是描绘了用于调节病毒激活T7 RNA聚合酶或重组酶的表达和/或功能的控制元件的示意图。转录控制可以通过肿瘤特异性启动子或配体诱导型启动子来实现。转录后控制元件包含调节mRNA或mRNA编码的蛋白质半衰期、miRNA靶位点、Tet-ON miR-T元件、Tet-OFF核酶/适体酶和其以配体依赖性或组成型方式控制转录物丰度的任何组合。可以将另外的控制元件工程化成编码的多肽(例如，重组酶)以控制其半衰期、亚细胞定位和/或活性。
图4A-图4B示出了用于控制次级溶瘤病毒的表达的定点重组系统的用途。图4A示出了用于在编码次级溶瘤病毒的多核苷酸中插入可以由FLP或另一种重组酶切除的移码/终止密码子的方案。图4B示出了可以被赋予活性反转到正确朝向的无活性的反向启动子。这些程序可以用不是溶瘤病毒的病毒来执行。
图5展示了可以插入到初级溶瘤病毒基因组中以产生示例性嵌套溶瘤病毒构建体的组分的示例性示意图。rtTA肽的表达处于组成型活性启动子的控制下，并且次级病毒基因组的表达处于四环素应答性(TetOn)Pol II启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒转录物的表达进一步由内部TetOff-核酶(TetOff-R)调节，使得转录物在不存在Tet的情况下被降解。进一步，次级病毒转录物被5'和3'TetOn-核酶(TetOn-R)激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'和3'端进行加工。这些程序可以用不是溶瘤病毒的病毒来执行。
图6展示了可以插入到初级溶瘤病毒基因组中以产生示例性嵌套溶瘤病毒构建体的组分的示例性示意图。rtTA和四环素反式激活因子(tTA)肽的表达处于组成型活性启动子的控制下。次级病毒基因组的表达处于TetOn Pol II启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒转录物的表达进一步由对次级病毒的mRNA转录物中的靶序列具有特异性的shRNA的调节。shRNA的表达处于TetOff启动子的控制下，使得shRNA的转录在不存在Tet和存在tTA肽的情况下发生。进一步，次级病毒转录物被5'和3'TetOn-R激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'和3'端进行加工。这些程序可以用不是溶瘤病毒的病毒来执行。
图7展示了插入到初级溶瘤病毒基因组中以产生示例性嵌套病毒构建体的组分的示意图。rtTA和tTA肽的表达处于组成型活性启动子的控制下。次级病毒基因组的表达处于TetOn Pol II启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒转录物的表达进一步由对次级病毒的mRNA转录物中的靶序列具有特异性的shRNA的调节。shRNA的表达处于TetOff启动子的控制下，使得shRNA的转录在不存在Tet和存在tTA肽的情况下发生。进一步，次级病毒转录物通过AmiRNA靶位点和3'TetOn-R在5'端上的切割而被激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'端上被加工。这些程序可以用不是溶瘤病毒的病毒来执行。
图8是展示了重组酶系统的多水平控制的表格。Flp在此用作非限制性示例性重组酶。
图9是描绘了包括STOP元件的示例性重组酶应答性切除盒(RREC)的示意图。
图10A-10B是描绘了包括STOP元件的示例性重组酶应答性反转盒(RRIC)的示意图。图10A描绘了启动子反转设计，其中启动子区和STOP元件在初始构建体中处于反转朝向，如通过反转文本所示。图10B描绘了有效负载反转设计，其中编码有效负载分子的cDNA在初始构建体中处于反转朝向，如通过反转文本所示。
图11是描绘了具有内含子的重组酶应答性反转盒(RRIC)的示例性设计的示意图，所述示例性设计被称为分裂内含子反转设计。经反转的元件由反转文本描绘。
图12是示出了用MND-TetR构建体和与Tet依赖性启动子可操作地连接的mCherry-NLuc报告基因构建体转染的HEK293T细胞中的报告基因水平的条形图。
图13是示出了用各种构建体转染的HEK293T细胞中的报告基因水平的条形图。
图14是示出了用如所指示的3种不同构建体的组合转染的HEK293T细胞中的报告基因水平的条形图。
图15A是示出了用具有任选内含子区的Flp-ERT2融合蛋白构建体和具有任选STOP盒的mCherry-NLuc报告构建体转染的HEK293T细胞中的报告基因水平的条形图。图15B是示出了用具有内含子区和任选的mRNA去稳定化元件的Flp-ERT2融合蛋白构建体以及如所指示的其它构建体转染的HEK293T细胞中的报告基因水平的条形图。
图16是示出了用所指示的表达构建体转染的HEK293T细胞中的基线报告基因水平的条形图。经反转的元件由反转文本描绘。
图17是示出了用所指示的表达构建体转染的HEK293T细胞中的响应于多西环素和/或4OHT的报告基因水平的条形图。
图18是描绘了用于使用多个控制元件调节报告基因表达的基于pDEST14的表达构建体的设计的示意图。插入包括，从左到右：attB1、SV40 pA、MND-TetR(在反向朝向上)、HBP1-TO-FEXPi2、ACTB polyA、attB5、GAPDH polyA、CMV-NLucP(在反向朝向上)、HBP2-TO-STOP3-mCherry-Fluc、bGH polyA、attB2。
图19是描绘了基于ONCR222b载体的双重溶瘤病毒载体的设计的示意图。14.1kb插入包括，从左到右：attB1、SV40 pA、MND-TetR(在反向朝向上)、HBP1-TO-FEXPi2、ACTBpolyA、attB5、GAPDH polyA、CMV(在反向朝向上)、HBP2-TO-STOP3-SVV-mCherry、bGHpolyA、attB2。重组HSV包括在其糖蛋白B(gB:N/T)中的D285N和A549T突变、在ICP27中的T128、T219a和T122 miR-靶序列、关节区的缺失、US12突变、ICP4中的T124、T1和T143 miR靶序列以及ICP34.5中的T128、T204和T219 miR靶序列。
图20A是示出了在用所指示的双溶瘤病毒载体感染NCI-H1299细胞之后HSV的病毒滴度随时间变化的图。图20B是示出了在用所指示的双溶瘤病毒载体感染NCI-H1299细胞之后SVV的病毒滴度随时间变化的图。
图21是描绘了具有插入到HSV-1病毒基因组中的SVV病毒基因组的双重溶瘤病毒载体的设计的示意图。重组HSV包括在其糖蛋白B(gB:N/T)中的D285N和A549T突变、UL37突变、关节区的缺失、US12突变以及ICP4中的T124、T1和T143 miR靶序列。
图22是示出了在Vero或H1299细胞中用ONCR-189或ONCR-190病毒进行病毒感染的10倍系列稀释液的一系列成像图。
图23是示出了在H1299细胞中用ONCR-189和ONCR-190病毒进行病毒感染的10倍系列稀释液的一系列成像图。
图24A是示出了H446细胞的ONCR-189和ONCR-190病毒感染的IC50滴度测定的一系列图。图24B是示出了根据图24A所示实验的所计算的IC50值的表格。
图25是示出了测量经转染或感染的H1299细胞中的SVV RNA拷贝数量的qPCR测定的条形图。
图26A是示出了用溶瘤病毒处理的NCI-H1299异种移植小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。图26B是示出了同一实验的体重变化的图。
图27是示出了阵列扫描细胞术测定的条形图，所述阵列扫描细胞术测定评估mCherry在HEK293细胞中在对照TetOff适体酶下的表达水平。
图28是描绘了双重病毒的各种组分的设计的示意图。在一些实施例中，双重病毒是双重溶瘤病毒。所有斜体字母和/或虚线指示任选组分。例如，如图所指示的，任选的RNAi靶序列可以插入到多核苷酸的编码和/或非编码区，以通过RNAi来控制对应的RNA转录物的表达水平和/或稳定性，并且如图所指示的，任选的重组酶应答性盒可以插入到多核苷酸中，以允许响应于重组酶的存在控制靶RNA表达。
具体实施方式
在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。在本文中所引用的所有文件或文件的部分，包含但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著，都特此出于任何目的以全文引用的方式清楚地并入本文。如果所并入文档或文档部分中的一个或多个定义的术语与本申请中所述术语的定义相矛盾，则以本申请中出现的定义为准。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式暗示。
定义
如本申请中使用的，术语“约”和“大约”用作等同物。本申请中使用的有或无约/大约的任何数值意指涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指在陈述的参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围，除非另外陈述或另外从上下文明显可见(除了这种数字将会超过可能值的100％的情况)。
“施用”在本文中是指将药剂或组合物引入到受试者中。
“互补”是指通过碱基堆叠和特定氢键在包括天然或非天然碱基或其类似物的两个序列之间配对的能力。例如，如果核酸的一个位置处的碱基能够与靶标的对应位置处的碱基形成氢键，则认为在所述位置的碱基相互互补。核酸可以包括对氢键没有正或负贡献的通用碱基或惰性无碱基间隔子。碱基配对可以包含规范的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)和非沃森-克里克碱基配对(例如，摆动碱基配对和胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing))。应当理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可以与任何A、C、U或T杂合并被认为与其是互补的。Nichols等人,《自然(Nature)》,1994；369:492-493和Loakes等人,《(Nucleic Acids Res.)核酸研究》,1994；22:4039-4043。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。参见Watkins和SantaLucia,《核酸研究》,2005；33(19):6258-6267。
术语“有效量”是指产生特定生理效应的药剂或组合物的量(例如，可以增加、激活和/或增强特定生理效应的量)。特定药剂的有效量可以基于药剂的性质以多种方式表示，如质量/体积、细胞数/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者质量)、细胞数/(受试者质量)或粒子/(受试者质量)。特定药剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC50)，其是指使特定生理应答的幅度介于参考水平与最大应答水平之间的药剂的浓度。
术语“溶瘤病毒”是指经过修饰或天然优先感染癌细胞的病毒。
术语“药学上可接受的”是指当向受试者施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
术语“具有复制能力的病毒”是指能够在宿主细胞中复制并产生感染性病毒颗粒的病毒。
术语“序列同一性”是指在两个多核苷酸或多肽序列之间相同且相对位置相同的碱基或氨基酸的百分比。因此，一个多核苷酸或多肽序列与另一多核苷酸或多肽序列相比具有一定百分比的序列同一性。为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。
术语“受试者”包含动物，例如包含灵长类动物和人的哺乳动物。所述术语包含家畜，如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家养动物，如狗和猫；研究动物，如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，如近交系猪等。
如本文所用，“治疗”是指将药剂或组合物递送到受试者以影响生理结果。
术语“载体”在本文中用于是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。
分子和细胞生物化学的通用方法可以在这种标准教科书中找到，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版(Sambrook等人,港实验室出版社(HaRBor Laboratory Press)2001)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocolsin Molecular Biology)》,第4版(Ausubel等人编,约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)1999)；《蛋白质方法(Protein Methods)》(Bollag等人,约翰威利父子出版公司,1996)；《基因治疗非病毒载体(Nonviral Vectors for Gene Therapy)》(Wagner等人编,学术出版社(Academic Press)1999)；《病毒载体(Viral Vectors)》(Kaplift和Loewy编,学术出版社1995)；《免疫学方法手册(Immunology Methods Manual)》(I.Lefkovits编,学术出版社1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术实验室步骤(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology)》(Doyle和Griffiths,约翰威利父子公司1998)，所述标准教科书的公开内容通过引用的方式并入本文中。
术语“可操作地连接”是指第一多核苷酸分子，如启动子，与第二可转录的多核苷酸分子，如所关注基因或病毒基因组的编码序列连接，其中所述多核苷酸分子被布置成使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。两个多核苷酸分子可以是单个连续多核苷酸分子的一部分并且可以是相邻的。然而，多核苷酸分子不需要是连续的以可操作地连接。在一些实施例中，术语“可操作地连接”还指在重组之后(例如，由重组酶介导)可操作地连接但不在初始布置中的两个多核苷酸分子。
双重病毒
在整个本公开中，包含所有小标题和所有部分，为溶瘤病毒(例如，双重溶瘤病毒)提供的公开内容和实施例可以应用于除溶瘤病毒之外的病毒。在一些实施例中，不是溶瘤病毒的病毒可以是非溶瘤病毒。
在本公开的一些实施例中，初级病毒包括编码次级病毒的多核苷酸。此类实施例在本文中被称为“双重病毒”或“双重病毒构建体”，因为病毒构建体在被引入到宿主细胞中时能够从相同构建体产生两种不同的溶瘤病毒。
在恶性肿瘤病毒治疗的上下文中，总体目标是通过肿瘤细胞裂解促进肿瘤特异性免疫应答。有效的病毒疗法需要一种病毒，所述病毒具有足够的免疫原性以刺激宿主的抗肿瘤免疫应答，并且具有足够的毒性以介导肿瘤细胞裂解。同时，病毒的免疫原性和毒力可以将宿主免疫应答重定向到病毒本身，从而限制抗肿瘤免疫应答和肿瘤细胞裂解的发展，反而使病毒清除。因此，本领域公认需要能够促进抗肿瘤免疫和抑制抗病毒免疫的病毒。在一些实施例中，本公开提供了用于治疗恶性肿瘤的双重病毒。
类似的免疫原性和/或毒力问题可能存在于其它应用中的病毒，如疫苗或基因疗法。在一些实施例中，本公开提供了包括本公开的双重病毒的疫苗组合物。在一些实施例中，本公开提供了本公开的双重病毒作为基因疗法载体。
在本公开的一些实施例中，初级病毒包括编码次级病毒的多核苷酸(即，双重病毒)。本文所描述的双重病毒能够从一种病毒载体产生两种不同的病毒：初级病毒和次级病毒。在一些实施例中，初级和/或次级病毒的表达是可诱导的，允许对初级和/或次级病毒的表达进行时间控制。在一些实施例中，本文所描述的双重病毒促进病毒在宿主中的存留，从而能够增加肿瘤细胞的病毒裂解和增强肿瘤抗原特异性T细胞群体的发育。
双重溶瘤病毒
在一些实施例中，本公开提供了包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸的初级溶瘤病毒。此类实施例在本文中被称为“双重溶瘤病毒”或“双重溶瘤病毒构建体”，因为病毒构建体在被引入到宿主细胞中时能够从相同构建体产生两种不同的溶瘤病毒。
在恶性肿瘤病毒治疗的上下文中，总体目标是通过肿瘤细胞裂解促进肿瘤特异性免疫应答。有效的溶瘤病毒疗法需要一种病毒，所述病毒具有足够的免疫原性以刺激宿主的抗肿瘤免疫应答，并且具有足够的毒性以介导肿瘤细胞裂解。同时，病毒的免疫原性和毒力可以将宿主免疫应答重定向到病毒本身，从而限制抗肿瘤免疫应答和肿瘤细胞裂解的发展，反而使病毒清除(Ikeda等人,《自然医学(Nature Medicine)》(1999)5:8；881-887)。因此，本领域公认需要能够促进抗肿瘤免疫和抑制抗病毒免疫的溶瘤病毒(参见例如，《肿瘤靶标与治疗(Onco Targets Ther)》(2016)9；2627-2637)。
在一些实施例中，本公开提供了包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸的初级溶瘤病毒(即，双重溶瘤病毒)。本文所描述的双重溶瘤病毒能够从一种病毒载体产生两种不同的溶瘤病毒：初级溶瘤病毒和次级溶瘤病毒。在一些实施例中，初级和/或次级病毒的表达是可诱导的，允许对初级和/或次级病毒的表达进行时间控制。图1示出了此过程的示例性图示。简言之，图1A所示的双重溶瘤病毒的施用产生初级溶瘤病毒(oV1)的初始表达和肿瘤细胞的病毒裂解(图1B，黑线)。由oV1介导的肿瘤细胞裂解产生肿瘤新抗原的释放和肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的发展，从而使免疫细胞介导的肿瘤细胞进一步裂解(图1B，灰色虚线)。从插入到oV1的基因组中的多核苷酸转录次级溶瘤病毒(oV2)(图1A)产生oV2的表达，并且由oV2介导的肿瘤细胞裂解产生肿瘤抗原的第二次释放，从而为现有的抗肿瘤CD8+T细胞群体提供抗原增强。oV2的转录和表达可以任选地通过施用诱导剂或去除抑制剂来诱导。因为，oV1和oV2是不同的病毒，针对一种病毒产生的抗病毒免疫应答对另一种病毒无效，由此减轻免疫应答对病毒抗原的重定向。因此，本文所描述的双重溶瘤病毒促进病毒在宿主中的存留，从而能够增加肿瘤细胞的病毒裂解和增强肿瘤抗原特异性T细胞群体的发育。
施用
在一些实施例中，双重溶瘤病毒或双重病毒的施用促进针对肿瘤细胞或肿瘤抗原的特异性免疫应答。在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使更特异性地杀死受试者中的肿瘤细胞。在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒和次级溶瘤病毒或次级病毒对肿瘤的感染使免疫应答集中于因感染而释放的常见肿瘤抗原。在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒和次级溶瘤病毒或次级病毒的感染产生针对肿瘤细胞或肿瘤抗原的优先或特异性宿主免疫。
在一些实施例中，与通过仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒杀死的肿瘤细胞的数量相比，通过施用双重溶瘤病毒或双重病毒杀死更多数量的肿瘤细胞。在一些实施例中，与通过仅施用相同量/剂量的初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，通过施用双重溶瘤病毒或双重病毒杀死的肿瘤细胞多至少10％、多至少20％、多至少30％、多至少50％、多至少100％、多至少200％或多至少500％。在一些实施例中，与仅施用任一病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使肿瘤大小更大地减小(或者在两种病毒单独都不能减小肿瘤大小的情况下减小肿瘤大小)。在一些实施例中，与仅施用任一病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使肿瘤大小另外减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使针对受试者中的一种或多种肿瘤抗原的免疫应答更强。在一些实施例中，通过对一种或多种肿瘤相关抗原具有特异性的免疫细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的数量来测量免疫应答。在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使对一种或多种肿瘤相关抗原具有特异性的免疫细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)多至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。在一些实施例中，所述免疫细胞是CD4+T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是CD8+T细胞。
在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使针对受试者中的初级溶瘤病毒或初级病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，通过对初级溶瘤病毒或初级病毒的一种或多种抗原具有特异性的免疫细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的数量来测量免疫应答。在一些实施例中，通过对初级溶瘤病毒或初级病毒的一种或多种抗原具有特异性的抗体的水平来测量免疫应答。在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒相比，免疫应答减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
在一些实施例中，与仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使针对受试者中的次级溶瘤病毒或次级病毒的免疫应答降低。在一些实施例中，通过对次级溶瘤病毒或次级病毒的一种或多种抗原具有特异性的免疫细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的数量来测量免疫应答。在一些实施例中，通过对次级溶瘤病毒或次级病毒的一种或多种抗原具有特异性的抗体的水平来测量免疫应答。在一些实施例中，与仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，免疫应答减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒不会诱导针对受试者中的次级溶瘤病毒或次级病毒的免疫应答。
在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使初级溶瘤病毒或初级病毒在受试者中更持久地产生。在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒的持续产生通过血液循环或肿瘤位点中的初级溶瘤病毒或初级病毒的水平来测量。在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使初级溶瘤病毒或初级病毒的可检测水平在血液循环或肿瘤位点中持续更长时间，例如长至少10％、长至少20％、长至少30％、长至少50％、长至少100％、长至少200％或长至少500％。
在一些实施例中，与仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使次级溶瘤病毒或次级病毒在受试者中更持久地产生。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的持续产生通过血液循环或肿瘤位点中的次级溶瘤病毒或次级病毒的水平来测量。在一些实施例中，与仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使次级溶瘤病毒或次级病毒的可检测水平在血液循环或肿瘤位点中持续更长时间，例如长至少10％、长至少20％、长至少30％、长至少50％、长至少100％、长至少200％或长至少500％。
在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，在受试者中施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒使受试者中的肿瘤抑制期延长。在一些实施例中，肿瘤抑制期为无进展期。在一些实施例中，肿瘤抑制期为无肿瘤期。在一些实施例中，肿瘤抑制期是介于开始施用病毒与癌症缓解之间的时间。在一些实施例中，肿瘤抑制期为无转移期。在一些实施例中，肿瘤抑制期是在施用溶瘤病毒或病毒之前肿瘤生长到其初始大小之前(在由于溶瘤病毒治疗或病毒治疗导致的肿瘤缩小期之后)的时间。在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，施用双重溶瘤病毒或双重病毒使肿瘤抑制期长至少10％、长至少20％、长至少30％、长至少50％、长至少100％、长至少200％、长至少500％或长至少1000％。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的产生由外源性药剂调节。在一些实施例中，外源性药剂的调节提供了对次级溶瘤病毒或次级病毒的产生的空间和/或时间控制。在一些实施例中，所述外源性药剂是肽、激素或小分子。在一些实施例中，所述外源性药剂是配体。在一些实施例中，所述外源性药剂通过调节启动子、核酶或RNAi的活性来调节次级溶瘤病毒或次级病毒的产生。例如，四环素/强力霉素是用于Tet-On或Tet-OFF启动子和/或核酶的示例性外源性药剂。在一些实施例中，所述外源性药剂通过调节重组酶的活性来调节次级溶瘤病毒或次级病毒的产生。例如，4-羟基三苯氧胺是一种示例性的外源物质，其可以通过与重组酶融合的雌激素受体(ER)的经修饰的配体结合结构域来调节重组酶的活性/亚细胞定位。
在一些实施例中，所述外源性药剂是全身施用的。在一些实施例中，所述外源性药剂局部施用，例如肿瘤内施用。在一些实施例中，本公开提供了一种施用外源性药剂以调节次级溶瘤病毒或次级病毒的产生的方法。在一些实施例中，外源性药剂的存在抑制了次级溶瘤病毒或次级病毒的产生。在一些实施例中，外源性药剂的存在诱导次级溶瘤病毒或次级病毒的产生。在一些实施例中，在施用外源性药剂之前，在受试者中没有检测到次级溶瘤病毒或次级病毒。在一些实施例中，在施用双重溶瘤病毒或双重病毒的大约同时或之前施用外源性药剂。在一些实施例中，在施用双重溶瘤病毒或双重病毒之后施用外源性药剂。在一些实施例中，在施用双重溶瘤病毒或双重病毒之后至少1小时、至少3小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时施用外源性药剂。在一些实施例中，在施用双重溶瘤病毒或双重病毒之后至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月施用外源性药剂。在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒与次级病毒的感染在时间上是分开的。在一些实施例中，初级溶瘤病毒和次级溶瘤病毒或初级病毒和次级病毒的时间上分离的感染使免疫应答集中在肿瘤细胞和/或肿瘤抗原上。
在一些实施例中，与仅施用初级溶瘤病毒或初级病毒或仅施用次级溶瘤病毒或次级病毒相比，施用本公开的双重溶瘤病毒或双重病毒能够使病毒感染更多细胞类型。在一些实施例中，被双重溶瘤病毒或双重病毒感染的至少一种细胞类型对仅初级溶瘤病毒或初级病毒或仅次级溶瘤病毒或次级病毒具有抗性。在一些实施例中，被双重溶瘤病毒或双重病毒感染的至少一种细胞类型对仅初级溶瘤病毒或初级病毒具有抗性。在一些实施例中，对仅初级溶瘤病毒或初级病毒或仅次级溶瘤病毒或次级病毒具有抗性的细胞类型是骨髓细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。在一些实施例中，对仅初级溶瘤病毒或初级病毒或仅次级溶瘤病毒或次级病毒具有抗性的细胞类型有助于免疫抑制。在一些实施例中，对仅初级溶瘤病毒或初级病毒或仅次级溶瘤病毒或次级病毒具有抗性的细胞类型有助于肿瘤抑制。
在一些实施例中，本公开的“仅初级溶瘤病毒”是指不包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒(即，不是双重溶瘤病毒)。在一些实施例中，本公开的“仅初级病毒”是指不包括编码次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒(即，不是双重病毒)。
经修饰的双重病毒和经修饰的双重溶瘤病毒
在一些实施例中，本公开提供了假型化或以其它方式工程化的病毒(例如，初级病毒和/或次级病毒)。在一些实施例中，病毒是假型化或以其它方式工程化的初级溶瘤病毒和/或次级溶瘤病毒。
在本公开的一些实施例中，“假型化病毒”是指其中病毒外壳蛋白(例如，包膜蛋白)中的一种或多种病毒外壳蛋白已被替代或修饰的病毒。在一些实施例中，假型化病毒能够感染对应的非假型化病毒不能感染的细胞或组织类型。在一些实施例中，与非假型化病毒相比，假型化病毒能够优先感染细胞或组织类型。在一些实施例中，假型化病毒的病毒颗粒的一部分(例如，包膜或衣壳)包括异源蛋白，如衍生自异源病毒的病毒蛋白或非病毒蛋白。非病毒蛋白可以包含抗体和其抗原结合片段。在一些实施例中，假型化病毒能够i)相对于非假型化病毒改变嗜性，和/或ii)减少或消除无益作用。在一些实施例中，与非假型化病毒相比，假型化病毒表现出减少的毒性或减少非肿瘤细胞或非肿瘤组织的感染。
通常，病毒具有最有效感染的天然宿主细胞群体。例如，逆转录病毒的天然宿主细胞范围有限，而腺病毒和腺相关病毒能够有效地感染范围相对更广的宿主细胞，尽管一些细胞类型对这些病毒的感染是顽固的。病毒的表面上的蛋白质(例如，包膜蛋白或衣壳蛋白)介导附着并进入易感宿主细胞，并且由此确定病毒的嗜性，即特定病毒感染特定细胞或组织类型的能力。在一些实施例中，本公开的病毒包括病毒的表面上的单一蛋白质类型。例如，逆转录病毒和腺相关病毒具有涂覆其膜的单一蛋白。在一些实施例中，本公开的病毒包括病毒的表面上的超过一种类型的蛋白质。例如，腺病毒被包膜蛋白和从病毒的表面延伸出来的纤维所涂覆。
在一些实施例中，病毒的表面上的蛋白质可以与细胞表面分子如硫酸肝素聚结合，由此将病毒定位到潜在宿主细胞的表面。病毒的表面上的蛋白质还可以介导病毒与宿主细胞上表达的诱导病毒蛋白的结构变化的特定蛋白质受体之间的相互作用以介导病毒进入。在一些实施例中，病毒表面上的蛋白质与细胞受体之间的相互作用可以促进病毒内化到内体中，其中内体腔的酸化诱导病毒外壳的重新折叠。在一些实施例中，病毒进入潜在宿主细胞需要病毒的表面上的至少一种分子与细胞的表面上的至少一种分子之间的有利相互作用。
在一些实施例中，本公开的病毒包括病毒外壳(例如，病毒包膜或病毒衣壳)，其中存在于病毒外壳的表面上的蛋白质(例如，病毒包膜蛋白或病毒衣壳蛋白)调节对用于病毒进入的潜在靶细胞的识别。在一些实施例中，确定病毒进入的潜在靶细胞的此过程被称为宿主嗜性。在一些实施例中，宿主嗜性是细胞嗜性，其中对受体的病毒识别发生在细胞水平，或组织嗜性，其中对细胞受体的病毒识别发生在组织水平。在一些实施例中，病毒的病毒外壳识别存在于单一类型细胞上的受体。在一些实施例中，病毒的病毒外壳识别存在于多种细胞类型(例如，2、3、4、5、6或更多不同的细胞类型)上的受体。在一些实施例中，病毒的病毒外壳识别存在于单一类型的组织上的细胞受体。在一些实施例中，病毒的病毒外壳识别存在于多种组织类型(例如，2、3、4、5、6或更多不同的组织类型)上的细胞受体。
在一些实施例中，本公开的假型化病毒包括病毒外壳，所述外壳已被修饰以并入来自不同病毒的表面蛋白，以促进病毒进入特定细胞或组织类型。在一些实施例中，假型化病毒包括病毒外壳，其中第一病毒的病毒外壳与第二病毒外壳交换，其中次级病毒的病毒外壳允许假型化病毒感染特定细胞或组织类型。在一些实施例中，病毒外壳包括病毒包膜。在一些实施例中，病毒包膜包括磷脂双分子层和蛋白质，如从宿主膜中获得的蛋白质。在一些实施例中，病毒包膜进一步包括用于识别和附着于宿主细胞表达的受体的糖蛋白。在一些实施例中，病毒外壳包括衣壳。在一些情况下，衣壳由被称为原体的寡聚蛋白质亚基组装而成。在一些实施例中，衣壳由一种类型的原体或蛋白质组装而成，或者由两种、三种、四种或更多种类型的原体或蛋白质组装而成。
在一些实施例中，出于疗法(例如，癌症疗法)的目的，限制或扩大对本公开的病毒转导敏感的细胞范围是有利的。为此，已经开发了许多病毒，其中内源性病毒外壳蛋白(例如，病毒包膜或衣壳蛋白)蛋白已被来自其它病毒的病毒外壳蛋白或嵌合蛋白替代。在一些实施例中，嵌合蛋白包含并入到病毒体中所必需的病毒蛋白的部分，以及被设计成与特定宿主细胞蛋白如靶向部分相互作用的蛋白质或核酸。
在一些实施例中，本公开的假型化病毒被假型化以限制或控制病毒嗜性(即，减少假型化病毒能够感染的细胞或组织类型的数量)。大多数用于限制嗜性的策略都使用了嵌合病毒外壳蛋白(例如，包膜蛋白)连接的抗体片段。这些病毒对开发疗法(例如，癌症疗法)示出了巨大的希望。在一些实施例中，本公开的假型化病毒被假型化以扩增病毒嗜性(即，增加假型化病毒能够感染的细胞或组织类型的数量)。用于扩增病毒(例如，包膜病毒)细胞嗜性的一种机制是通过形成表型混合颗粒或假型进行的，这一过程通常发生在用两种或更多种病毒感染的细胞中的病毒组装期间。例如，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)。HIV1用适当的共受体感染表达CCR4的细胞。然而，HIV1通过表型混合并入异源糖蛋白(GP)形成假型，使得病毒可以感染不表达CD4受体和/或适当的共受体的细胞，由此扩增病毒的嗜性。若干项研究证明，在用异嗜性小鼠白血病病毒(MLV)、双嗜性MLV或单纯疱疹病毒感染的细胞中产生的野生型HIV-1会产生具有扩大宿主范围的表型混合病毒体，从而表明已经产生了假型化病毒体。病毒GP的表型混合也示出了在HIV-1与VSV之间在共感染的细胞培养物中发生。这些早期观察结果是随后设计带有异源GP的基于HIV-1的慢病毒载体的关键。
用于使慢病毒假型化的替代性GP列表越来越多，每种都有特定的优点和缺点。VSVG蛋白(VSV-G)对假型慢病毒的广泛使用使此GP实际上成为比较其它病毒GP形成假型的有效性的标准。慢病毒假型的另外的非限制性实例包含带有狂犬病病毒衍生的GP的假型、带有淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒GP的假型化慢病毒、带有甲病毒GP的慢病毒假型(例如，用RRV和SFV GP假型化的慢病毒载体、用辛德毕斯病毒GP假型化的慢病毒载体)、带有丝状病毒GP的假型和含有杆状病毒GP64的慢病毒载体假型。
在一些实施例中，工程化的(例如，假型化的)病毒能够与肿瘤和/或肿瘤细胞结合，通常是通过与肿瘤细胞上表达的蛋白质、脂质或碳水化合物结合。在此类实施例中，本文所描述的工程化的病毒可以包括将病毒引导到特定宿主细胞中的靶向部分。在一些情况下，本领域已知或尚待鉴定的在特定细胞或组织类型(例如，肿瘤或肿瘤细胞，或肿瘤相关基质或基质细胞)上差异表达或以其它方式存在的任何细胞表面生物材料可以用作本公开的病毒的潜在靶标。在一些实施例中，细胞表面材料是蛋白质。在一些实施例中，靶向部分结合指示以下的细胞表面抗原：疾病，如癌症(例如，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤等)；自身免疫性疾病(例如重症肌无力、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病等)；传染性疾病，包含HIV、HCV、HBV、CMV和HPV感染；以及遗传性疾病，包含镰状细胞性贫血、囊性纤维化、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs)、J3-地中海贫血、神经纤维瘤病、多囊肾病、血友病等。在某些实施例中，靶向部分靶向对特定细胞或组织类型具有特异性的细胞表面抗原，例如存在于神经、肺、肾、肌肉、血管、甲状腺、眼、乳腺、卵巢、睾丸或前列腺组织中的细胞表面抗原。
在一些实施例中，本公开的病毒(初级病毒和/或次级病毒)是嵌合病毒(例如，编码包括一个部分的病毒，如衣壳蛋白或IRES，源自第一病毒和另一部分，如非结构基因，如蛋白酶或聚合酶，源自第二病毒)。在一些实施例中，所述病毒是初级溶瘤病毒和/或次级溶瘤病毒。
双重溶瘤病毒、双重病毒和控制元件的设计
本公开提供了一种初级溶瘤病毒，其包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸、任选地编码重组酶的多核苷酸和任选地编码调节性多肽的多核苷酸，如图28所示。在一些实施例中，调节性多肽能够与可调节启动子结合。在一些实施例中，调节性多肽调节图28中所示的一种或多种可调节启动子的功能。在一些实施例中，所述调节性多肽是rtTA蛋白。在一些实施例中，所述调节性多肽是tTA蛋白。
本公开提供了一种初级病毒，其包括编码次级病毒的多核苷酸、任选地编码重组酶的多核苷酸和任选地编码调节性多肽的多核苷酸，如图28所示。在一些实施例中，调节性多肽能够与可调节启动子结合。在一些实施例中，调节性多肽调节图28中所示的一种或多种可调节启动子的功能。在一些实施例中，所述调节性多肽是rtTA蛋白。在一些实施例中，所述调节性多肽是tTA蛋白。
在一些实施例中，本公开提供了一种初级溶瘤病毒，其包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒的表达由可调节启动子控制。在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子、激素应答性启动子(例如，松甾酮A诱导型启动子)和四环素(Tet)调节的启动子。在一些实施例中，所述可调节启动子是重组酶识别位点(RRS)侧接的启动子。
在一些实施例中，本公开提供了一种初级病毒，其包括编码次级病毒的多核苷酸，其中所述次级病毒的表达由可调节启动子控制。在一些实施例中，所述编码所述次级病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子、激素应答性启动子(例如，松甾酮A诱导型启动子)和四环素(Tet)调节的启动子。在一些实施例中，所述可调节启动子是重组酶识别位点(RRS)侧接的启动子。
在一些实施例中，所述可调节启动子是Tet调节的启动子。Tet调节的启动子是通过在最小启动子的上游放置Tet应答元件(TRE)来开发的。TRE是19个核苷酸的四环素操纵子(tetO)序列的7个重复序列，并且被四环素阻遏物(tetR)识别。在内源性细菌系统中，如果存在四环素或类似强力霉素的类似物，则tetR将与四环素结合而不与TRE结合，由此允许转录。为了使用Tet作为基因表达的调节剂，通过将tetR与病毒体蛋白16(VP16)的转录激活结构域融合产生四环素控制的反式激活因子(tTA)(Gossen和Bujard,PNAS(1992)15:89(12):5547-5551)。在不存在四环素的情况下，tTA的tetR部分将结合TRE中的tetO序列，并且VP16激活结构域将促进下游基因的转录。在存在四环素的情况下，四环素与tTA的tetR结构域结合，从而排除了tTA与tetO序列的结合和VP16介导的下游基因表达的激活。因此，在一些实施例中，可调节启动子是Tet调节的启动子，其中编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录在存在tTA蛋白和不存在Tet(或其强力霉素衍生物)的情况下是有活性的。此类启动子在本文中被称为Tet-OFF启动子，因为它们在不存在四环素的情况下是有活性的。在一些实施例中，tTA多肽包括以下或由以下组成：与由SEQ ID NO:853编码的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，可调节启动子是Tet调节的启动子，其中编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录在存在Tet(或其强力霉素衍生物)和反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)的情况下是有活性的。rtTA是包括VP16转录激活结构域和tetR结构域的融合蛋白，所述tetR结构域已经突变使得tetR结构域依赖于Tet的存在与启动子中的tetO序列结合。因此，下游基因的转录不是四环素的活性缺失。然而，在存在四环素的情况下，rtTA蛋白的突变tetR部分将与tetO序列结合，从而允许VP16介导的转录激活和下游基因的表达。此类启动子在本文中被称为Tet-ON启动子，因为它们在存在四环素的情况下是有活性的。在一些实施例中，rtTa蛋白包括以下或由以下组成：与由SEQ ID NO:852编码的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括与可调节启动子可操作地连接的编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，以及编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的第二多核苷酸。在一些实施例中，可调节启动子是Tet-ON启动子并且能够与可调节启动子结合的蛋白是rtTA蛋白。在一些实施例中，可调节启动子是Tet-OFF启动子并且能够与可调节启动子结合的蛋白是tTA蛋白。在一些实施例中，编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。组成型启动子是本领域已知的并且包含但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
在一些实施例中，所述可调节启动子是重组酶识别位点(RRS)侧接的启动子。通过将组成型启动子与重组酶识别位点侧接而产生RRS侧接的启动子。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括与RRS侧接的启动子可操作地连接的编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，以及编码能够介导重组酶识别位点之间重组的重组酶蛋白的第二多核苷酸。在一些实施例中，重组酶蛋白的表达允许编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录。例如，在一些实施例中，RRS侧接的启动子包括反向启动子序列(参见例如，图4B)。在不存在重组酶表达的情况下，启动子序列保持反向并且编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录不会发生。当重组酶被表达时，反向启动子序列被翻转，允许编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录。
在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸序列和编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的多核苷酸序列包括在同一多核苷酸中。例如，在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸序列和编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的多核苷酸序列在双向启动子的控制下。在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸序列和编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的多核苷酸序列包括在插入初级病毒的基因组中的不同位置处的不同多核苷酸中。
在一些实施例中，本公开提供了一种初级溶瘤病毒或初级病毒，其包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的表达由一个或多个转录后控制元件调节。在本文中，“转录后控制元件”是指除启动子之外的能够调节次级溶瘤病毒或次级病毒mRNA转录物的丰度的任何元件。转录后控制元件通过多种转录后机制控制mRNA转录本丰度，并且可以是组成型元件或诱导型元件。转录后控制元件的实例包含核酶、适体酶、RNAi分子的靶位点(例如，shRNA靶位点、微RNA靶位点、人工微RNA(AmiRNA)靶位点)和RSS侧接的移码或终止密码子插入。
在一些实施例中，转录后控制元件是介导mRNA转录物的自我切割的核酶编码序列。示例性核酶包含锤头状核酶、Varkud卫星(VS)核酶、发夹核酶、GIR1分支核酶、glmS核酶、绞扭核酶(twister ribozyme)、绞扭姐妹核酶、手枪核酶、斧头核酶和丁型肝炎病毒核酶。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的基因组包括一个或多个内部核酶序列，使得病毒转录物在内部被切割并且由此阻止次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。
在一些实施例中，转录后控制元件是适体酶编码序列。“适体酶”是含有对配体具有特异性的整合适体结构域以产生配体诱导型自切割核酶的核酶序列。与适体结构域结合的配体触发核酶的酶活性的激活，从而产生RNA转录物的切割。示例性适体酶包含茶碱依赖性适体酶(例如，与茶碱依赖性适体连接的锤头状核酶，描述于Auslander等人,《分子生物系统(Mol BioSyst.)》(2010)6,807-814中)、四环素依赖性适体酶(例如，与Tet依赖性适体连接的锤头状核酶，通过以下描述：Zhong等人,《e生命(eLife)》2016；5:e18858 DOI:10.7554/eLife.18858；Win和Smolke,PNAS(2007)104；14283-14288；Whittmann和Suess,《分子生物系统》(2011)7；2419-2427；Xiao等人,《化学与生物学(Chem&Biol)》(2008)15；125-1137；以及Beilstein等人,《ACS合成生物学(ACS Syn Biol)》(2015)4；526-534)、鸟嘌呤依赖性适体酶(例如，与鸟嘌呤依赖性适体连接的锤头状核酶，通过以下描述：Nomura等人,《化学通讯(Chem Commun.)》,(2012)48(57)；7215-7217)。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的基因组包括一个或多个内部适体酶序列，使得病毒转录物在内部被切割并且由此阻止次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。在一些实施例中，本公开的核酶/适体酶是TetOff核酶/适体酶。在一些实施例中，TetOff适体酶包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:913具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TetOff适体酶包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:914具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，核酶/适体酶定位于3'UTR区域中。
在一些实施例中，转录后控制元件是RNAi靶序列。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒包括一个或多个RNAi靶位点。如本文所用，“RNA干扰分子”或“RNAi分子”是指通过内源性基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))介导靶mRNA序列降解的RNA多核苷酸。示例性RNA干扰药剂包含微RNA(miRNA)、人工微RNA(AmiRNA)、短发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)。
在一些实施例中，转录后控制元件是miRNA靶序列。miRNA是指长度为约18-25个核苷酸的至少部分地与靶mRNA序列互补的天然存在的小非编码RNA分子。在动物中，miRNA的基因被转录为初级miRNA(pri-miRNA)，其是双链的并且形成茎环结构。然后Pri-miRNA在细胞核中被包括2类RNase III、Drosha和微处理器亚基DCGR8的微处理器复合物切割，形成70-100个核苷酸的前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA形成发夹结构并且被转运到细胞质，在所述细胞质中被RNase III酶Dicer加工成约18-25个核苷酸的miRNA双链体。尽管双链体的任一链都可能充当功能性miRNA，但通常miRNA的一条链被降解，并且只有一条链被加载到Argonaute(AGO)核酸酶上以产生效应RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其中miRNA与其mRNA靶标相互作用(Wahid等人,1803:11,2010,1231-1243)。
在一些实施例中，转录后控制元件是siRNA靶序列。siRNA是指通常长度为约21-23个核苷酸的双链RNA分子。双链siRNA分子在细胞质中被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物加工，在此期间“乘客”有义链从双链中酶促切割。激活的RISC中含有的反义“引导”链随后凭借序列互补性将RISC引导至对应的mRNA，并且AGO核酸酶切割靶mRNA，从而产生特异性基因沉默。在一些实施例中，siRNA分子源自shRNA分子。shRNA是长度为约50-70个核苷酸的形成茎环结构的单链人工RNA分子。在一些实施例中，shRNA模拟pre-miRNA，并且可以绕过Drosha加工并直接输出以供Dicer加工。在一些实施例中，shRNA是基于miRNA的shRNA。基于miRNA的shRNA在细胞中的表达是通过质粒或病毒载体引入编码基于miRNA的shRNA的DNA多核苷酸来实现的。然后，基于miRNA的shRNA被转录成模拟pri-miRNA的茎环结构的产物，并且在细胞核中由Drosha进行类似的加工，以形成具有发夹环结构的单链RNA。在发夹RNA输出到细胞质之后，发夹由Dicer加工以形成双链siRNA分子，其然后由RISC进一步加工以介导靶基因沉默。
在一些实施例中，转录后控制元件是人工微RNA(AmiRNA)。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒包括一个或多个RNAi靶位点；以及编码与RNAi靶位点结合的一个或多个RNAi分子的第二多核苷酸。在此类实施例中，一个或多个RNAi分子与次级溶瘤病毒或次级病毒的基因组中的靶序列结合，使得一个或多个RNAi分子的表达使次级溶瘤病毒或次级病毒的mRNA转录物降解，由此防止次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。在一些实施例中，编码一个或多个RNAi分子的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在此类实施例中，一个或多个RNAi分子的经调节的表达可以用于防止次级溶瘤病毒或次级病毒的异常表达。
例如，在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸与第一可调节启动子可操作地连接，并且编码一个或多个RNAi分子的第二多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-ON启动子(例如，SEQ IDNO:844)并且第二可调节启动子是Tet-OFF启动子(例如，SEQ ID NO:845)。在此类实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的表达在存在Tet的情况下被激活，使得次级溶瘤病毒或次级病毒的表达能够在期望的时间处被触发。在施用Tet之前(即，在不存在Tet的情况下)，表达RNAi分子。因此，次级溶瘤病毒或次级病毒的在不存在Tet的情况下产生的任何RNA转录物将被RNAi分子靶向，从而防止次级溶瘤病毒或次级病毒的异常表达。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-OFF启动子，并且第二可调节启动子是Tet-ON启动子。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒可以与Tet组合施用，使得在Tet已经通过降解被去除之后触发次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。当Tet仍然存在时，RNAi分子被表达并靶向次级溶瘤病毒或次级病毒的在存在Tet的情况下产生的RNA转录物以进行降解，从而防止次级溶瘤病毒或次级病毒的异常表达。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括与第一可调节启动子可操作地连接的编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸；与第二可调节启动子可操作地连接的编码一个或多个RNAi分子的第二多核苷酸；以及编码能够与第一可调节启动子结合的第一蛋白和/或能够与第二可调节启动子结合的第二蛋白的第三多核苷酸。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-On启动子，并且第一蛋白是rtTA。在一些实施例中，第二可调节启动子是Tet-On启动子，并且第二蛋白是rtTA。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-OFF启动子，并且第一蛋白是tTA。在一些实施例中，第二可调节启动子是Tet-OFF启动子，并且第二蛋白是tTA。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-On启动子并且第一蛋白是rtTA，并且第二可调节启动子是Tet-OFF启动子并且第二蛋白是tTA。在一些实施例中，第一可调节启动子是Tet-OFF启动子并且第一蛋白是tTA，并且第二可调节启动子是Tet-ON启动子并且第二蛋白是rtTA。
双重溶瘤病毒构建体的非限制性实例如图2所展示。这里，初级病毒是重组HSV，并且次级病毒是正义单链RNA病毒或负义单链RNA病毒。在一些实施例中，次级病毒是选自SVV和CVA21的正义单链RNA病毒。在一些实施例中，次级病毒是VSV(负义RNA病毒)。将次级病毒的病毒基因组插入到编码初级HSV病毒的多核苷酸中。在一些实施例中，插入位点是介于HSV的UL37与UL38之间的基因间区域。在一些实施例中，次级病毒基因组的表达由四环素应答性Pol II启动子(黑色箭头)和RNA聚合酶I启动子(灰色箭头)调节。
图5-7提供了使用转录控制元件(如可调节启动子)和转录后控制元件(如核酶和/或RNAi机制)的组合来控制次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组的表达、激活和降解的非限制性实例。在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒基因组或次级病毒基因组的mRNA的转录与可调节启动子(例如，TetOn启动子)可操作地连接。在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒基因组或次级病毒基因组的多核苷酸侧接有TetOn-核酶(TetOn-R)和/或可以从病毒基因组转录物中去除非病毒RNA的RNAi靶序列(例如，AmiRNA)。在一些实施例中，病毒基因组转录物的降解受其它调节性机制(例如，内部TetOff核酶、RNAi分子)控制，所述机制也处于调节性控制之下，任选地通过控制可调节启动子的相同调节性机制。
图5展示了可以插入到初级溶瘤病毒基因组或初级病毒基因组中以产生示例性嵌套溶瘤病毒构建体或嵌套病毒构建体的组分的示例性示意图。在此非限制性实例中，rtTA肽的表达处于组成型活性启动子的控制下，并且次级病毒基因组的表达处于四环素应答性(TetOn)Pol II启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒或次级病毒转录物的表达进一步由内部TetOff-核酶(TetOff-R)调节，使得转录物在不存在Tet的情况下被降解。进一步，次级病毒转录物被5'和3'TetOn-核酶(TetOn-R)激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'和3'端进行加工，从而产生病毒基因组的RNA转录物，而没有侧接另外的核苷酸。因此，在此实例中，Tet的存在开启了次级溶瘤病毒基因组或次级病毒基因组的转录和激活，并且同时防止了其降解。
图6展示了可以插入到初级溶瘤病毒基因组或初级病毒基因组中以产生示例性嵌套溶瘤病毒构建体或嵌套病毒构建体的组分的示例性示意图。rtTA和四环素反式激活因子(tTA)肽的表达处于组成型活性启动子的控制下。次级病毒基因组的表达处于TetOn PolII启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒或次级病毒转录物的表达进一步由对次级病毒的mRNA转录物中的靶序列具有特异性的shRNA的调节。shRNA的表达处于TetOff启动子的控制下，使得shRNA的转录在不存在Tet和存在tTA肽的情况下发生。进一步，次级病毒转录物被5'和3'TetOn-R激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'和3'端进行加工，从而产生病毒基因组的RNA转录物，而没有侧接另外的核苷酸。因此，在此实例中，Tet的存在开启了次级溶瘤病毒基因组或次级病毒基因组的转录和激活，并且同时防止了其降解。
图7展示了可以插入到初级溶瘤病毒基因组或初级病毒基因组中以产生示例性嵌套溶瘤病毒构建体的组分的示例性示意图。rtTA和tTA肽的表达处于组成型活性启动子的控制下。次级病毒基因组的表达处于TetOn Pol II启动子的控制下，使得病毒基因组的转录在存在Tet和rtTA肽的情况下发生。次级溶瘤病毒或次级病毒转录物的表达进一步由对次级病毒的mRNA转录物中的靶序列具有特异性的shRNA的调节。shRNA的表达处于TetOff启动子的控制下，使得shRNA的转录在不存在Tet和存在tTA肽的情况下发生。进一步，次级病毒转录物通过AmiRNA靶位点和3'TetOn-R在5'端上的切割而被激活，使得mRNA转录物在存在Tet的情况下在5'端上被加工。
在一些实施例中，采用定点重组系统来控制次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码包括重组酶识别位点的次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸和编对相应重组酶蛋白的第二多核苷酸。编码重组酶蛋白的第二多核苷酸可以处于诱导型或以其它方式可调节启动子的控制下，使得可以暂时控制重组酶蛋白的表达。适用于本公开的定点重组系统是本领域已知的，包含包括被翻转酶(FLP)重组酶识别的翻转酶识别靶(FRT)位点的FRT/FLP系统和包括被Cre重组酶识别的loxP位点的Cre/Lox系统。
在一些实施例中，重组酶是Flp重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT位点(例如，FRT-1位点、FRT-14位点)。在一些实施例中，FRT-1位点包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:850或其补体具有至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT-14位点。在一些实施例中，FRT-14位点包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:851或其补体具有至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施例中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施例中，重组酶是Dre重组酶。在一些实施例中，重组酶是ΦC31(phiC31)重组酶。在一些实施例中，重组酶是λ整合酶。在一些实施例中，重组酶选自下表1：
表1.重组酶和示例性靶位点/序列的列表
Figure BDA0003640693020000361
Figure BDA0003640693020000371
在一些实施例中，重组酶的表达产生功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒的表达。例如，在一些实施例中，编码次级病毒的多核苷酸包括一个或多个移码或终止密码子插入，其侧接有重组酶识别位点(参见例如，图4A)。在不存在重组酶表达的情况下，转录的次级溶瘤病毒或次级病毒包括移码或终止密码子插入，其防止功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒的表达。当重组酶蛋白的表达被激活或诱导时，移码或终止密码子插入从第二多核苷酸中切除，从而允许表达功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒(参见例如，图4A)。在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒或其一部分的多核苷酸被反转并且侧接有重组酶识别位点。在不存在重组酶表达的情况下，转录的次级溶瘤病毒或次级病毒包括经反转的部分，其防止功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒的表达。当重组酶蛋白的表达被激活或诱导时，经反转的部分被翻转到正确的朝向，从而允许表达功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒(参见例如，图4B)。
在一些实施例中，重组酶的表达防止功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒的表达。例如，在一些实施例中，编码次级病毒的多核苷酸侧接有重组酶识别位点。在不存在重组酶表达的情况下，多核苷酸被转录并产生功能性次级溶瘤病毒或功能性次级病毒。当重组酶蛋白的表达被激活或诱导时，重组酶识别位点之间的重组可以使多核苷酸反转，从而防止次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。在一些实施例中，控制编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录的启动子侧接有重组酶识别位点。在不存在重组酶表达的情况下，启动子保持功能并允许次级溶瘤病毒或次级病毒的转录。当重组酶蛋白的表达被激活或诱导时，重组酶识别位点之间的重组可以使启动子反转，从而防止次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。
如图8中的非限制性实例所展示的，可以将至少三个控制水平工程化成重组酶系统，这可以提供对次级溶瘤病毒(OV2)或次级病毒的表达的严格时间调节。
第一水平是重组酶的转录控制。在一些实施例中，可调节启动子与重组酶的编码区可操作地连接。在一些实施例中，所述可调节启动子是TetOn启动子。在一些实施例中，可调节启动子允许细菌TetR阻遏物进行转录抑制。在一些实施例中，通过添加强力霉素，启动子活性被解除抑制，从而产生重组酶的表达。在一些实施例中，重组酶是Flp重组酶或其融合蛋白。在一些实施例中，重组酶是Cre重组酶或其融合蛋白。
图3展示了可以用于调节编码重组酶的mRNA的转录的示例性控制元件。此非限制性实例描绘了用于调节病毒激活T7 RNA聚合酶或重组酶的表达和/或功能的控制元件。在一些实施例中，转录控制可以通过肿瘤特异性启动子或可调节启动子来实现。在一些实施例中，编码重组酶的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。在一些实施例中，编码重组酶的多核苷酸包括一种或多种转录后控制元件。转录后控制元件包含调节mRNA或mRNA编码的蛋白质半衰期、miRNA靶位点、Tet-ON miR-T元件、Tet-OFF核酶/适体酶和其以配体依赖性肿瘤细胞特异性或组成型方式控制转录物丰度的任何组合。在一些实施例中，可以将另外的控制元件工程化成编码的多肽(例如，重组酶)以控制其半衰期、亚细胞定位和/或活性。示例性Tet-On miR-T元件描述于Mou等人,《分子治疗(Mol Ther.)》2018年5月2日；26(5):1277-1286中。示例性Tet-On核酶/适体酶描述于Zhong等人,《e生命》2016年11月2日；5:e18858中。
在一些实施例中，将一种或多种mRNA去稳定化元件插入到重组酶表达盒中。在一些实施例中，一种或多种mRNA去稳定化元件可以使编码重组酶的mRNA转录物去稳定化和/或增加mRNA周转。在一些实施例中，一种或多种mRNA去稳定化元件的存在可以减少或最小化未诱导状态下重组酶mRNA的泄漏表达，使得当系统被诱导时(例如，通过外源性药剂)，仅有足够的重组酶可用于介导预期的重组反应。在一些实施例中，mRNA去稳定化元件包括c-fos编码元件。在一些实施例中，c-fos编码元件包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:894具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，mRNA去稳定化元件包括来自c-fos基因3'UTR的富含AU的元件。在一些实施例中，来自c-fos基因3'UTR的富含AU的元件包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:895具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，mRNA去稳定化元件包括FCE和ARE两者的组合，任选地呈串联。在一些实施例中，FCE和ARE两者的组合包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:896具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，将一个或多个内含子插入到重组酶编码区中。在一些实施例中，一个或多个内含子的存在可以防止或最小化重组酶在原核表达系统中的不期望的泄漏表达(例如，当使用原核细胞产生编码重组酶的载体时)。
第二水平是对重组酶活性的翻译后控制。在一些实施例中，重组酶的活性和/或细胞定位是可调节的。在一些实施例中，重组酶的活性和/或细胞定位由外源性药剂(例如，配体或小分子)调节。在一些实施例中，重组酶与一个或多个活性控制结构域融合。在一些实施例中，外源性药剂(例如，配体或小分子)通过一个或多个活性控制结构域调节重组酶的细胞活性和/或定位。在一些实施例中，活性控制结构域是雌激素受体(ER)的经修饰的配体结合结构域。在不存在配体的情况下，融合蛋白(重组酶-ER)保留在不能催化重组的细胞质中，但添加对应的小分子(例如，4-羟基三苯氧胺)允许融合蛋白易位至细胞核以进行重组。在一些实施例中，活性控制结构域是孕酮受体(PR)或其一部分。在一些实施例中，对应的融合蛋白(重组酶-PR)的活性用孕酮类似物RU-486诱导。在一些实施例中，活性控制结构域是经修饰的大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)蛋白。在一些实施例中，对应的融合蛋白(重组酶-DHFR)不稳定，并且在不存在诱导物的情况下会在蛋白酶体中迅速降解。在一些实施例中，对应的诱导物是抗生素甲氧苄啶(TMP)，并且融合蛋白在存在TMP的情况下稳定，易位至细胞核并进行重组。
在一些实施例中，重组酶是Flp并且活性控制结构域是雌激素受体(ER)的经修饰的配体结合结构域。在一些实施例中，Flp-ER融合蛋白包括与由SEQ ID NO:846编码的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，Flp-ER融合蛋白包括与由SEQ ID NO:847编码的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包括RGS连接子。在一些实施例中，融合蛋白包括XTEN连接子。在一些实施例中，融合蛋白包括NLS和/或PEST序列，任选地在融合蛋白的N末端。在一些实施例中，NLS序列包括与SEQ ID NO:848具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，PEST序列包括与SEQ ID NO:849具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，FLP-RGS-ER融合多肽包括与SEQ ID NO:846具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，FLP-XTEN-ERT2多肽包括与SEQ ID NO:847具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
第三水平是OV2表达的转录控制，其中重组酶介导包括OV2的启动子和编码区的多核苷酸的一部分的切除和/或反转，产生OV2病毒基因组转录表达的激活或失活。在一些实施例中，重组酶介导多核苷酸的一部分的切除(例如，去除转录终止信号)。在一些实施例中，重组酶介导多核苷酸的一部分的反转(例如，将OV2的编码区置于启动子的控制之下)。在一些实施例中，重组酶介导切除和反转。在一些实施例中，一个或多个内含子区被引入到多核苷酸中。在一些实施例中，内含子区从成熟的OV2病毒基因组转录物中去除重组酶识别位点。
图4A-图4B展示了用于控制次级溶瘤病毒或次级病毒的表达的定点重组系统的示例性用途。图4A示出了用于在编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸中插入可以由FLP或另一种重组酶切除的移码/终止密码子的方案。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组通过插入产生编码区移码的终止密码子或多核苷酸变得惰性，所述编码区侧接有重组位点(例如，FRT位点)。在存在对应的重组酶(FLP蛋白)的情况下，可以去除产生编码区移码的终止密码子或多核苷酸，从而产生功能性病毒基因组。类似地，图4B示出了侧接有重组位点的无活性反向启动子，一旦在存在对应重组酶的情况下所述启动子被反转到正确的朝向，它就可以被赋予活性。
图9-11展示了可以用于控制靶多核苷酸的表达的示例性重组酶应答性盒。
重组酶应答性切除盒(RREC)可以用于控制靶多核苷酸(例如，cDNA)的表达。在一些实施例中，RREC包括中间的控制元件和控制元件的每侧上的侧接重组酶识别位点。
在一些实施例中，重组酶应答性切除盒(RREC)采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A1–控制元件–重组酶识别位点A2–3'，
其中重组酶识别位点在存在对应重组酶时介导控制元件的切除。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2呈相同朝向。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2具有相同的核苷酸序列。在一些实施例中，重组酶是Flp重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT位点。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT-1位点。在一些实施例中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是Lox位点。
在一些实施例中，所述控制元件包括转录/翻译终止元件(STOP)或由其组成。在一些实施例中，转录/翻译终止元件(STOP)包括一个或多个翻译终止密码子或由其组成，任选地在每个阅读框中。在一些实施例中，转录/翻译终止元件(STOP)包括一个或多个转录终止信号或由其组成。在一些实施例中，转录/翻译终止元件(STOP)包括以下或由以下组成：编码每个阅读框中的多个翻译终止密码子的DNA序列，随后的转录终止信号(例如，多腺苷酸化信号)。在一些实施例中，控制元件包括移码元件或由其组成，所述移码元件由引起下游开放阅读框的移码的DNA序列组成。在一些实施例中，在控制元件与任一或两侧上的重组酶识别位点中的一个或多个重组酶识别位点之间存在另外的核苷酸。在一些实施例中，RREC被放置于启动子于编码区(例如，开放阅读框)之间。在一些实施例中，RREC被放置于转录物的5'-UTR中。在一些实施例中，RREC被放置于启动子区中。在一些实施例中，RREC被放置于编码区(例如，开放阅读框)中。在一些实施例中，STOP元件包括以下或由以下组成：与SEQID NO:854具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，STOP元件包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:855具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，STOP元件包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:856具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
RREC的非限制性实例——STOP盒——如图9中所展示，其中重组酶是Flp，两个重组酶识别位点均是相同朝向的FRT-1位点，并且控制元件是转录/翻译终止元件(STOP)。在一些实施例中，STOP盒可以包括侧接有最小FRT元件的串联直接重复序列的(STOP)元件或由其组成。在一些实施例中，转录/翻译终止元件包括以下或由以下组成：编码每个阅读框中的多个翻译终止密码子的DNA序列，随后的多腺苷酸化信号。在一些实施例中，STOP盒插入在启动子与被调节的所关注cDNA之间，使得其定位于对应的转录物的5'-UTR中。在不存在Flp重组酶的情况下，STOP盒保持稳定整合并且用于终止转录，并且因此防止所关注cDNA的表达。当Flp重组酶存在时，它将介导串联FRT元件之间的重组并且不可逆地切除STOP元件，从而激活所关注cDNA的表达。在一些实施例中，STOP元件含有单个合成多腺苷酸化信号(例如，如在STOP 1中，SEQ ID NO:854)。在一些实施例中，STOP元件包括多个多腺苷酸化信号，如在STOP2(SEQ ID NO:855)和STOP3(SEQ ID NO:856)中。在一些实施例中，具有多个多腺苷酸化信号增加了转录终止的效率。在一些实施例中，STOP盒包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:857具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，STOP盒包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:858具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，STOP盒包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:859具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
可以通过重组酶应答性反转盒(RRIC)实现另外的表达控制层。在一些实施例中，RRIC包括中间的中心元件和控制元件的每侧上的侧接重组酶识别位点。
在一些实施例中，重组酶应答性反转盒(RRIC)采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A1–中心元件–重组酶识别位点A2–3'，
其中所述重组酶识别位点A1和A2在存在对应重组酶时介导中心元件朝向的反转。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2呈相反朝向。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2具有相同的核苷酸序列。在一些实施例中，重组酶是Flp重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT位点。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT-1位点。在一些实施例中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是Lox位点。
在一些实施例中，RRIC的中心元件包括启动子或启动子的一部分或由其组成，并且此类RRIC可以任选地被放置于编码区的上游。在一些实施例中，RRIC的中心元件包括编码区(例如，开放阅读框)或编码区的一部分或由其组成，并且此类RRIC可以任选地被放置于启动子区的下游。在一些实施例中，编码区编码次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组。在一些实施例中，在中心元件与任一或两侧上的一个或多个重组酶识别位点之间存在另外的核苷酸。
在一些实施例中，所述RRIC包括在中心元件的每一侧上的两个或更多个重组酶识别位点。在一些实施例中，RRIC采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A1–重组酶识别位点B1–中心元件–重组酶识别位点A2–重组酶识别位点B2–3'，
其中重组酶识别位点A1和A2对和/或重组酶识别位点B1和B2对，可以在存在对应重组酶时介导中心元件朝向的反转。在一些实施例中，这两对相互正交(即，没有由重组酶识别位点A之一和重组酶识别位点B之一介导的反转)。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2呈相反朝向。在一些实施例中，重组酶识别位点A1和A2具有相同的核苷酸序列。在一些实施例中，重组酶识别位点B1和B2呈相反朝向。在一些实施例中，重组酶识别位点B1和B2具有相同的核苷酸序列。在一些实施例中，重组酶是Flp重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是FRT位点。在一些实施例中，一对重组酶识别位点(A对或B对)包括FRT-1位点，并且另一对包括FRT-14位点。在一些实施例中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施例中，重组酶识别位点是Lox位点。在上述配置中的这些元件之间可以存在另外的多核苷酸。
在一些实施例中，由一对重组酶识别位点(A对或B对)介导的反转使另一对进入相同的朝向，使得另一对重组酶识别位点现在可以介导RRIC的一部分的切除，从而产生以下新的多核苷酸配置：
5'–重组酶识别位点A–中心元件(反向)–重组酶识别位点B–3'。
在一些实施例中，一旦切除发生，反应是不可逆的。因此，在此类配置中具有两对重组酶识别位点的益处之一是中心元件的反转一旦由重组酶进行，可以是不可逆的。
另外的元件可以并入到RRIC中。作为非限制性实例，一个或多个控制元件可以并入到RRIC中。在一些实施例中，一个或多个控制元件可以并入到重组酶识别位点之间的一个或多个区域中。在一些实施例中，控制元件可以是本公开的STOP元件或其它转录/翻译终止信号。在一些实施例中，由于隐蔽的启动子区和/或编码区附近的转录起始信号，转录/翻译终止信号的引入防止了功能性有效负载蛋白或病毒基因组的意外或泄漏表达。
因此，在一些实施例中，RRIC采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A1–控制元件1(任选的)–重组酶识别位点B1–中心元件–重组酶识别位点A2–控制元件2(任选的)–重组酶识别位点B2–3'，
其中一个或两个控制元件可以存在于RRIC中。在一些实施例中，控制元件是相同的。在一些实施例中，控制元件是不同的。在一些实施例中，一个或多个控制元件是STOP元件。
上文所描述的RRIC的非限制性实例展示于图10A中，其中所述重组酶是Flp，重组酶识别位点是FRT-1和FRT-14，控制元件是STOP3元件，并且中心元件是启动子。启动子被朝向成使得其在反转发生之前相对于所关注cDNA被反转，并且因此在不存在Flp重组酶的情况下不能驱动cDNA表达。在不存在Flp重组酶的情况下，STOP盒也保持稳定整合并且用于终止转录，并且因此保持反向启动子元件的朝向。如果存在Flp重组酶，它将介导一对经反转的FRT元件(FRT-1或FRT-14)之间的重组，并且将定位于它们之间的所有元件反转。在图10A中，FRT-1元件示出了此反转事件，但FRT-14元件可能会发生类似的反应。应注意，反转事件使启动子朝向成使得所述启动子可以潜在地驱动cDNA表达，并且还将另一个FRT对中的相反FRT元件从反转重复转换为直接重复朝向。如果仍然有足够的FLP可用，那么它可以介导第二重组反应，或者反转第一反应并重新产生原始配置，或者重组直接重复FRT元件组，如图10A中的FRT-14所示。第二反应将不可逆地切除STOP元件并激活所关注cDNA的表达。图10A中的设计在本公开中有时被称为“启动子反转设计”。示例性启动子反转设计在本文中被提供为SEQ ID NO:860。类似地，图10B展示了RRIC的非限制性实例，其中有效负载编码区作为中心元件，在存在Flp重组酶时将被反转，尽管过程类似于启动子反转元件但涉及cDNA有效负载而不是启动子的反转。图10B中的设计在本公开中有时被称为“有效负载反转设计”。示例性有效负载反转涉及在本文中被提供为SEQ ID NO:861。
在一些实施例中，一个或多个内含子和/或剪接元件被插入到本公开的盒中。在一些实施例中，一个或多个内含子被插入到RRIC中和/或邻近RRIC插入。在一些实施例中，表达盒采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A1–控制元件1(任选的)–重组酶识别位点B1–具有内含子C1的中心元件–重组酶识别位点A2–控制元件2(任选的)–重组酶识别位点B2–内含子C2–3'编码区–3'，
其中具有内含子C1的中心元件包括以下配置：
5'–启动子–5'编码区–内含子C1–3'(盒中的反转朝向)。
在一些实施例中，盒中的5'编码区的初始朝向与3'编码区的朝向相反。在一些实施例中，另外的核苷酸存在于任何或所有这些元件之间。与RRIC的情况一样，重组酶可以通过重组酶识别位点介导反转/切除事件，并且最终的不可逆重组产物采用以下配置：
5'–重组酶识别位点A–启动子–5'编码区–内含子C1–重组酶识别位点B–内含子C2–3'编码区–3'，
其中在mRNA转录之后去除内含子到内含子'区域(由内含子C1和内含子C2元件介导)会产生完整的编码区，而编码区内没有另外的核苷酸。在一些实施例中，由于隐蔽的启动子区和/或编码区附近的转录起始信号的存在，如本文所描述的引入一个或多个内含子区域防止了功能性有效负载蛋白或病毒基因组的意外或泄漏表达。
图11中展示了非限制性实例(其在本公开中有时被称为“分裂内含子反转设计”)。示例性分裂内含子反转设计在本文中被提供为SEQ ID NO:862。分裂内含子反转设计的功能类似于启动子反转设计。然而，关键的区别是cDNA已被工程化为含有一对基于ACTB基因(SEQ ID NO:863)的内含子3的分裂内含子，这会破坏编码区。内含子被分裂成5'-剪接供体和3'-剪接受体片段，其中BamHI和EcoRV限制位点描绘了分裂的定位。这里的中心元件包括相对于3'cDNA元件呈相反朝向的启动子、5'cDNA元件、内含子之一和5'-剪接供体位点。中心元件侧接有STOP3元件和FRT位点，类似于启动子反转设计。在不存在Flp重组酶的情况下，cDNA的两个部分被分裂并且朝向相反，并且因此不能驱动完整cDNA的表达，并且STOP元件保持稳定整合并用于终止转录，并且因此保持反向启动子和5'cDNA元件的朝向。如果存在Flp重组酶，它将介导一组反向串联FRT位点之间的重组，并且反转定位于它们之间的所有元件。在图11中，FRT-1位点示出了此反转事件，但FRT-14位点可能会发生类似的反应。应注意，反转事件使启动子和部分cDNA元件朝向成使得其可以潜在地驱动cDNA表达，并且还将另一对FRT位点从反向重复转换为直接重复朝向。如果仍然有足够的FLP可用，那么它可以介导第二重组反应，或者反转第一反应并重新产生原始配置，或者重组直接重复FRT元件组，如图11中的FRT-14所示。在第二种情况下，所得表达盒包括编码具有内部内含子的全cDNA的多核苷酸，一旦所述多核苷酸被转录，将在RNA剪接之后形成没有内含子或FRT位点的完整cDNA。因此，此第二反应可能会不可逆地激活所关注cDNA的表达。
有效负载分子
在一些实施例中，初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸和编码有效负载分子的多核苷酸。“有效负载分子”是指能够进一步增强初级和/或次级溶瘤病毒或初级和/或次级病毒的治疗功效的任何分子，包含细胞因子、趋化因子、酶、抗体或其抗原结合片段、可溶性受体、细胞表面受体的配体、二分肽、三分肽和细胞毒性肽。
在一些实施例中，所述有效负载分子是细胞毒性肽。“细胞毒性肽”是指当在宿主细胞中表达时能够诱导细胞死亡和/或当由宿主细胞分泌时能够诱导相邻细胞的细胞死亡的蛋白质。在一些实施例中，细胞毒性肽是胱天蛋白酶、p53、白喉毒素(DT)、假单胞菌外毒素A(PEA)、I型核糖体失活蛋白(RIP)(例如，皂草素和白树毒素)、II型RIP(例如，蓖麻毒素)、志贺样毒素1(Slt1)、光敏活性氧类(例如杀手红)。在一些实施例中，细胞毒性肽由自杀基因编码，通过凋亡导致细胞死亡，如胱天蛋白酶基因。
在一些实施例中，有效负载分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段与细胞表面受体，如免疫检查点受体(例如，PD1、PDL1和CTLA4)或涉及细胞生长和活化的其它细胞表面受体(例如，OX40、CD200R、SIRPα、CSF1R、4-1BB、CD40和NKG2D)特异性结合。在一些实施例中，有效负载分子是细胞表面受体的配体。适合用作有效负载的示例性配体包含但不限于NKG2D配体、神经纤毛蛋白配体、Flt3配体、4-1BBL、CD40L、GITRL、LIGHT和CD47。在一些实施例中，有效负载分子是可溶性受体。适合用作有效负载的示例性可溶性受体包含但不限于可溶性受体，如IL-13R、TGFβR1、TGFβR2、SIRPα、PD-1、IL-35R、IL-15R、IL-2R、IL-12R和干扰素受体。
在一些实施例中，有效负载分子是细胞因子。适合用作有效负载的示例性细胞因子包含但不限于IL-1、IL-12、IL-15、IL-18、IL-36、TNFα、IFNα、IFNβ和IFNγ。在一些实施例中，有效负载分子是趋化因子。适合用作有效负载的示例性趋化因子包含但不限于CXCL10、CXCL9、CCL21、CCL4和CCL5。
在一些实施例中，有效负载分子是酶。适合用作有效负载的示例性酶包含但不限于腺苷脱氨酶、15-羟基前列腺素脱氢酶、基质金属蛋白酶(例如，MMP9)、胶原酶、透明质酸酶、明胶酶和弹性蛋白酶。在一些实施例中，所述酶是基因定向酶前药疗法(GDEPT)系统的一部分，如单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶或细胞色素P450。在一些实施例中，所述酶能够在靶细胞(例如，胱天蛋白酶)中诱导或激活细胞死亡途径。
在一些实施例中，有效负载分子是包括能够结合在非癌性效应细胞上表达的细胞表面抗原的第一结构域和能够结合由靶细胞(例如，癌性细胞、肿瘤细胞或不同类型的效应细胞)表达的细胞表面抗原的第二结构域的二分肽。在一些实施例中，二分多肽的单独多肽结构域可以包括抗体或其结合片段(例如，单链可变片段(scFv)或F(ab))、蝎子多肽、双功能抗体、柔性体、DOCK-AND-LOCKTM抗体或单克隆抗独特型抗体(mAb2)。在一些实施例中，二分多肽的结构可以是双可变结构域抗体(DVD-IGTM)、
Figure BDA0003640693020000471
双特异性T细胞接合剂(BITETM)、
Figure BDA0003640693020000472
或双亲和力重新靶向(DART)多肽。在一些实施例中，在肿瘤细胞上表达的细胞表面抗原是肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原选自CD19、EpCAM、CEA、PSMA、CD33、EGFR、Her2、EphA2、MCSP、ADAM17、PSCA、17-A1、NKGD2配体、CSF1R、FAP、GD2、DLL3或神经纤毛蛋白。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸和编码有效负载分子的多核苷酸，其中RNAi分子的靶序列插入在编码有效负载分子的多核苷酸中的一个或多个定位处。
在一些实施例中，编码有效负载分子的多核苷酸进一步包括一个或多个内部RNAi靶序列以防止有效负载分子在细胞或受试者中表达。在一些实施例中，内部RNAi靶序列是siRNA分子、AmiRNA分子或miRNA分子的靶序列。在一些实施例中，在将病毒构建体引入到细胞中或施用于受试者之后，内部RNAi序列能够对有效负载分子的表达进行进一步的时间控制。在此类实施例中，内部RNAi靶序列是由细胞内源性表达的miRNA的miRNA靶序列。例如，在一些实施例中，编码有效负载分子的多核苷酸包括由非癌性细胞内源性表达的miRNA的一个或多个内部靶序列，使得有效负载分子不在所述细胞中表达。
在一些实施例中，内部RNAi序列能够在双重病毒载体的产生期间控制有效负载分子的表达。在一些实施例中，内部RNAi靶序列是不是由产生细胞系或样品或受试者中的细胞内源性表达的siRNA分子、AmiRNA分子或人工miRNA分子的靶序列。
启动子
在一些实施例中，所述启动子是四环素(Tet)依赖性启动子。在一些实施例中，Tet依赖性启动子包括启动子元件下游的Tet-On元件。在一些实施例中，所述启动子是CMV启动子(SEQ ID NO:897)、HSV gB启动子(SEQ ID NO:900)、HSV gC启动子(SEQ ID NO:901)、HSVICP8启动子(SEQ ID NO:899)、HSV TK启动子(SEQ ID NO:898)、HBP1启动子(HSV-ICP8和-TK启动子的杂合体)或HBP2启动子(HSV-TK和-ICP8启动子的杂合体)。在一些实施例中，所述启动子是CMV启动子。示例性HBP1-TetOn启动子被提供为SEQ ID NO:865。示例性HBP2-TetOn启动子被提供为SEQ ID NO:866。在一些实施例中，所述启动子包括与根据SEQ IDNO:865-866和897-901的序列中的任何一个序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
初级病毒
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。示例性dsDNA病毒包含肌病毒科、短尾病毒科、长尾病毒科、异疱疹病毒科、疱疹病毒科(例如，HSV-1、HSV-1、马疱疹病毒)、痘病毒科(例如，传染性软疣病毒、牛痘病毒、粘液瘤病毒)和腺病毒科(例如，腺病毒)的成员。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是HSV-1或HSV-2。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是RNA病毒。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是副粘病毒或弹状病毒。
在一些实施例中，与野生型病毒相比，初级溶瘤病毒或初级病毒不包括任何修饰，除了插入编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸。在一些实施例中，所述初级病毒是HSV。HSV病毒载体和其构建方法描述于例如美国专利第7,078,029号、第6,261,552号、第5,998,174号、第5,879,934号、第5,849,572号、第5,849,571号、第5,837,532号、第5,804,413号和第5,658,724号；以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583中，所述美国专利和国际专利申请通过引用整体并入本文。公布HSV的序列(NCBI登录号NC_001806；还参见McGoech等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)》,69(PT 7),1531-1574(1988))并且其可以用于设计另外的HSV病毒载体。
在一些实施例中，所述初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸以及与野生型病毒相比的一种或多种另外的修饰。在一些实施例中，所述初级病毒是野生型HSV的变体。变体HSV载体和其构建方法描述于美国专利第9,593,347号；美国专利申请公开：第2016-0250267号、第2017-0036819号、第2017-0274025号、第2017-0189514号和第2017-0107537号；以及国际PCT公开号：WO 2011/0130749和WO 2015/066042中，所述文献通过引用整体并入本文。在一些实施例中，初级病毒是变体HSV，并且包括内部重复(联合)区的缺失，所述区域包括二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT和ICP4中的每个二倍体基因的一个拷贝以及ICP47基因的启动子(参见例如，美国专利第10,210,575号；第10,172,893号；和第10,188,686号)。
在一些实施例中，所述初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸和增强初级病毒进入细胞中的一种或多种修饰。在一些实施例中，初级病毒包括一种或多种表面糖蛋白的突变，所述一种或多种表面糖蛋白促进病毒通过非经典受体进入细胞和/或增强通常抵抗病毒横向扩散的细胞中的横向扩散。在一些实施例中，初级病毒包括病毒的表面上的与靶细胞上的表面受体结合的非天然配体，如scFv或其它抗原结合分子。在一些实施例中，靶细胞上的表面受体是EGF-R。
在一些实施例中，初级病毒是变体HSV，并且表现出增强的进入细胞的能力。在一些实施例中，初级HSV可以通过与HSV感染的典型介质以外的细胞蛋白(例如，除了粘连蛋白-1、HVEM或硫酸乙酰肝素/硫酸软骨素蛋白聚糖)相互作用来直接感染细胞。在一些实施例中，初级病毒是变体HSV并且包括促进病毒通过非典型受体进入的gB或gH基因的突变。在一些实施例中，初级病毒是变体HSV并且包括突变的gH糖蛋白，所述糖蛋白在通常抵抗HSV横向扩散的细胞(如缺乏gD受体的细胞)中表现出横向扩散。
在一些实施例中，如美国专利第9,593,347号中所描述的，初级病毒是变体HSV并且包括突变的gB或gH蛋白中的一种或多种蛋白，所述美国专利通过引用整体并入本文。HSVgB或gH糖蛋白的非限制性突变包含以下残基中的一个或多个残基处的突变：gB:D285、gB:A549、gB:S668、gH:N753和gH:A778。在一些实施例中，初级HSV包括以下处的突变：gB:D285和gB:A549两者、gH:N753和gH:A778两者和/或gB:S668、gH:N753和gH:A778中的每一个。在一些实施例中，初级HSV包括以下处的突变：gB:285、gB:549、gH:753和gH:778。在一些实施例中，初级HSV包括以下突变中的一种或多种突变：gB:D285N、gB:A549T、gB:S668N、gH:N753K或gH:A778V。在一些实施例中，初级HSV包括gB:D285N/gB:A549T双重突变、gH:N753K/gH:A778V双重突变或gB:S668N/gH:N753K/gH:A778V三重突变。在一些实施例中，初级HSV包括gB:D285N/gB:A549T/gH:N753K/gH:A778V。突变在本文中指的是相对于HSV-1株KOS衍生物K26GFP的gD、gB和gH基因的密码子(氨基酸)编号。
在一些实施例中，初级病毒是变体HSV并且包括UL37基因中的减少神经元细胞的HSV感染的一种或多种突变，如描述于国际PCT公开号WO 2016/141320和Richard等人,《公共科学图书馆·病原学(Plos Pathogens)》,2017,13(12),e1006741中的那些突变。
次级病毒
在一些实施例中，本公开提供了一种包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的初级溶瘤病毒或初级病毒。在一些实施例中，经编码的次级溶瘤病毒或次级病毒具有复制能力，并且能够感染和杀死宿主细胞。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒两者是具有复制能力的。在一些实施例中，所述初级病毒和所述次级病毒两者是具有复制能力的。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒是没有复制能力的。在一些实施例中，具有复制能力的初级溶瘤病毒是HSV。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是没有复制能力的。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒由于包膜蛋白编码区的缺失或突变而是没有复制能力的。在一些实施例中，编码没有复制能力的次级病毒的初级溶瘤病毒或初级病毒包括次级溶瘤病毒或次级病毒的包膜蛋白的编码区，任选地位于次级溶瘤病毒或次级病毒的编码区之外。在一些实施例中，具有复制能力的次级溶瘤病毒或次级病毒是甲病毒。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是RNA病毒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是单链RNA(ssRNA)病毒。在一些实施例中，ssRNA病毒是正义ssRNA(+有义ssRNA)病毒或负义ssRNA(-有义ssRNA)病毒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是DNA病毒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是双链RNA(dsRNA)病毒或单链DNA(ssDNA)病毒。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是+有义ssRNA病毒。示例性+义ssRNA病毒包含小核糖核酸病毒科(例如柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和塞内加谷病毒(SVV)，包含SVV-A)、冠状病毒科(例如，甲冠状病毒如HCoV-229E和HCoV-NL63、乙冠状病毒如HCoV-HKU1、HCoV-OC3和MERS-CoV)、逆转录病毒科(例如，小鼠白血病病毒)和披膜病毒科(例如，辛德毕斯病毒)的成员。正义ssRNA病毒的其它示例性属和种在下表A中示出。
表A：示例性正义ssRNA病毒
Figure BDA0003640693020000511
Figure BDA0003640693020000521
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是塞内加谷病毒(SVV)。在一些实施例中，SVV的病毒基因组与SEQ ID NO:842具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的序列同一性。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒包括与根据SEQ ID NO:842的核苷酸3505到7310具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的SVV病毒基因组的一部分。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是柯萨奇病毒。在一些实施例中，柯萨奇病毒选自CVB3、CVA21和CVA9。示例性柯萨奇病毒的核酸序列由GenBank参考号M33854.1(CVB3)、GenBank参考号KT161266.1(CVA21)和GenBank参考号D00627.1(CVA9)提供。在一些实施例中，柯萨奇病毒的病毒基因组与SEQ ID NO:843具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒包括与根据SEQ ID NO:843的核苷酸3797到7435具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的柯萨奇病毒基因组的一部分。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是嵌合病毒(例如，编码包括一个部分的病毒，如衣壳蛋白或IRES，源自第一病毒和另一部分，如非结构基因，如蛋白酶或聚合酶，源自第二病毒)。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是嵌合小核糖核酸病毒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是嵌合SVV。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是嵌合柯萨奇病毒。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组包括微RNA(miRNA)靶序列(miR-TS)盒，其中所述miR-TS盒包括一种或多种miRNA靶序列，并且其中细胞中的一种或多种对应miRNA的表达抑制细胞中的编码的溶瘤病毒或编码的病毒的复制。在一些实施例中，所述一种或多种miRNA选自miR-124、miR-1、miR-143、miR-128、miR-219、miR-219a、miR-122、miR-204、miR-217、miR-137和miR-126。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括miR-124靶序列的一个或多个拷贝、miR-1靶序列的一个或多个拷贝和miR-143靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-219a靶序列的一个或多个拷贝和miR-122靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-204靶序列的一个或多个拷贝和miR-219靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括miR-217靶序列的一个或多个拷贝、miR-137靶序列的一个或多个拷贝和miR-126靶序列的一个或多个拷贝。
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组包括并入到一个或多个必需病毒基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中的一个或多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组包括并入到一个或多个非必需病毒基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中的一个或多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒的病毒基因组包括并入到一个或多个必需病毒基因的5'或3'中的一个或多个miR-TS盒。
+有义ssRNA病毒的基因组包括在5'→3'朝向上的ssRNA分子，所述分子可以直接从插入到初级溶瘤病毒基因组或初级病毒基因组中的多核苷酸转录，并由宿主细胞直接翻译以产生病毒蛋白。因此，包括编码+有义ssRNA病毒的多核苷酸的初级溶瘤病毒或初级病毒能够直接从插入的多核苷酸产生次级溶瘤病毒或次级病毒的基因组，并且不需要存在另外的病毒复制蛋白来产生次级溶瘤病毒或次级病毒。
在一些实施例中，所述多核苷酸编码负义单链RNA(-有义ssRNA)病毒基因组。示例性–有义ssRNA病毒包含副粘病毒科(例如，麻疹病毒和新城疫病毒)、弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒(VSV)和马巴病毒)、沙粒病毒科(例如，拉沙病毒)以及正粘病毒科(例如，流感病毒，如甲型流感、乙型流感、丙型流感和丁型流感)的成员。正义ssRNA病毒的其它示例性属和种在下表B中示出。
表B：示例性负义ssRNA病毒
Figure BDA0003640693020000541
Figure BDA0003640693020000551
Figure BDA0003640693020000561
–有义ssRNA病毒的基因组包括在3'→5'朝向上的ssRNA分子，所述分子不可以直接从插入到初级溶瘤病毒基因组或初级病毒基因组中的多核苷酸转录。相反，编码–有义ssRNA次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸首先被转录成+有义mRNA，其然后被一种或多种病毒RNA聚合酶复制以产生–有义ssRNA基因组。因此，在一些实施例中，插入到初级溶瘤病毒或初级病毒中的编码–有义ssRNA病毒的多核苷酸包括编码复制所需病毒蛋白的第一核酸序列和包括–有义ssRNA病毒基因组的反基因组序列的第二核酸序列。在此类实施例中，第一核酸序列编码5'→3'mRNA转录物，所述转录物可以被宿主细胞直接翻译成–有义ssRNA基因组复制所需的病毒蛋白，并且第二核酸序列编码–有义ssRNA基因组的反基因组序列的5'→3'mRNA转录物。然后，5'→3'反基因组转录物被第一核酸序列编码的病毒蛋白复制，以产生–有义ssRNA基因组。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列与能够在真核细胞中表达的启动子，例如哺乳动物启动子可操作地连接。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列与双向启动子，如双向Pol II启动子可操作地连接。
在一些实施例中，次级+有义和/或–有义ssRNA溶瘤病毒的基因组需要病毒原生的离散5'和3'端。在一些实施例中，次级+有义和/或–有义ssRNA病毒的基因组需要病毒原生的离散5'和3'端。哺乳动物RNA Pol II产生的mRNA转录物含有哺乳动物的5'和3'UTR，并且因此不含有产生感染性ssRNA病毒所需的离散天然端。因此，在一些实施例中，产生+有义和/或–有义ssRNA病毒需要另外的5'和3'序列，所述序列能够在病毒ssRNA和哺乳动物mRNA序列的连接处切割Pol II编码的病毒基因组转录物，使得从转录物中去除非病毒RNA，以保持病毒基因组的内源性5'和3'离散端。此类序列在本文中被称为连接切割序列。例如，在一些实施例中，编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸包括以下结构：
(a)5'–Pol II–连接切割–病毒基因组–连接切割–3'；
(b)5'–Pol II–连接切割–病毒反基因组–连接切割–3'。
连接切割序列可以通过多种方法完成从病毒基因组转录物中去除非病毒RNA。例如，在一些实施例中，连接切割序列是RNAi分子的靶标。示例性RNA干扰药剂包含miRNA、AmiRNA、shRNA和siRNA。进一步，任何用于在特定位点切割RNA转录物的系统目前已知或将被定义为未来可以用于产生次级溶瘤病毒或次级病毒天然的离散端。
在一些实施例中，RNAi分子是miRNA，并且5'和/或3'连接切割序列是miRNA靶序列。在一些实施例中，RNAi分子是siRNA分子，并且5'和/或3'连接切割序列是siRNA靶序列。在一些实施例中，RNAi分子是AmiRNA，并且5'和/或3'连接切割序列是AmiRNA靶序列。
在一些实施例中，连接切割序列是引导RNA(gRNA)靶序列。在此类实施例中，gRNA可以设计和引入具有RNase活性的Cas核酸内切酶(例如，Cas13)，以在精确的连接位点介导病毒基因组转录物的切割。在一些实施例中，5'和/或3'连接切割序列是gRNA靶序列。在一些实施例中，连接切割序列是pri-miRNA编码序列。在编码次级病毒基因组的多核苷酸转录之后，这些序列形成pri-miRNA茎环结构，所述茎环结构然后由Drosha在细胞核中切割，以在精确的连接位点处切割转录物。在一些实施例中，5'和/或3'连接切割序列是pri-mRNA靶序列。
在一些实施例中，连接切割序列是核酶编码序列，并且介导病毒转录物的自我切割以产生次级溶瘤病毒或次级病毒的天然离散端。在一些实施例中，5'和/或3'连接切割序列是核酶编码序列。在一些实施例中，连接切割序列是序列适体酶编码序列。在一些实施例中，5'和/或3'连接切割序列是适体酶编码序列。
在一些实施例中，连接切割序列是siRNA分子、miRNA分子、AmiRNA分子或gRNA分子的靶序列。在此类实施例中，靶RNA分子与RNAi或gRNA分子的引导序列至少部分地互补。用于比较和确定序列同一性百分比和互补性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如分别通过以下进行：Needleman和Wunsch的同源性比对算法,(1970)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》48:443；通过Pearson和Lipman(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》85:2444的相似性搜索法；这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；手动比对和视觉检查(参见例如，Brent等人,(2003)《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》；通过使用本领域已知的算法，包含BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于以下中：Altschul等人,(1977)《核酸研究》25:3389-3402；以及Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志》215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
在一些实施例中，5'连接切割序列和3'连接切割序列来自同一组(例如，都是RNAi靶序列，都是核酶编码序列等)。例如，在一些实施例中，连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)，并且并入到编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的5'和3'端中。在一些实施例中，5'和3'RNAi靶序列可以相同(即，相同siRNA、AmiRNA或miRNA的靶标)或不同(即，5'序列是一种siRNA、AmiRNA或miRNA的靶标，并且3'序列是另一种siRNA、AmiRNA或miRNA的靶标)。在一些实施例中，连接切割序列是引导RNA靶序列，并且并入到编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的5'和3'端中。在此类实施例中，5'和3'gRNA靶序列可以相同(即，相同gRNA的靶标)或不同(即，5'序列是一种gRNA的靶标，并且3'序列是另一种gRNA的靶标)。在一些实施例中，连接切割序列是pri-mRNA编码序列，并且并入到编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的5'和3'端中。在一些实施例中，连接切割序列是核酶编码序列，并且紧接着编码病毒基因组的多核苷酸序列的5'和3'并入到编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸中。
在一些实施例中，5'连接切割序列和3'连接切割序列来自同一组但是不同的变体或类型。例如，在一些实施例中，5'连接切割序列和3'连接切割序列可以是RNAi分子的靶序列，其中所述5'连接切割序列是siRNA靶序列并且所述3'连接切割序列是miRNA靶序列(或反之亦然)。在一些实施例中，5'连接切割序列和3'连接切割序列可以是核酶编码序列，其中所述5'连接切割序列是锤头状核酶编码序列，并且所述3'连接切割序列是丁型肝炎病毒核酶编码序列。
在一些实施例中，5'连接切割序列和3'连接切割序列是不同类型的。例如，在一些实施例中，5'连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)，并且3'连接切割序列是核酶序列、适体酶序列、pri-miRNA序列或gRNA靶序列。在一些实施例中，5'连接切割序列是核酶序列，并且3'连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)、适体酶序列、pri-miRNA编码序列或gRNA靶序列。在一些实施例中，5'连接切割序列是适体酶序列，并且3'连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、pri-miRNA序列或gRNA靶序列。在一些实施例中，5'连接切割序列是pri-miRNA序列，并且3'连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、适体酶序列或gRNA靶序列。在一些实施例中，5'连接切割序列是gRNA靶序列，并且3'连接切割序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、AmiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、pri-miRNA序列或适体酶序列。
连接切割序列相对于编码ssRNA次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的示例性布置在下表C1和C2中示出。
表C1：对称连接切割序列(JSC)布置
Figure BDA0003640693020000591
表C2：不对称JCS布置
Figure BDA0003640693020000592
Figure BDA0003640693020000601
在一些实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒进一步包括一个或多个内部RNAi靶序列以防止次级病毒基因组在细胞或受试者中表达。在一些实施例中，内部RNAi靶序列是siRNA分子、AmiRNA分子或miRNA分子的靶序列。在一些实施例中，在将病毒构建体引入到细胞中或施用于受试者之后，内部RNAi序列能够对次级溶瘤病毒或次级病毒的表达进行进一步的时间控制。在此类实施例中，内部RNAi靶序列是由细胞内源性表达的miRNA的miRNA靶序列。在此类实施例中，次级溶瘤病毒或次级病毒是miRNA减毒的。
在一些实施例中，内部RNAi序列能够在双重病毒载体的产生期间控制次级溶瘤病毒或次级病毒的表达。在一些实施例中，内部RNAi靶序列是不是由产生细胞系或样品或受试者中的细胞内源性表达的siRNA分子、AmiRNA分子或人工miRNA分子的靶序列。
miRNA减毒
在一些实施例中，初级和/或次级病毒包括插入到一个或多个必需病毒基因的基因座中的miRNA靶序列的拷贝中的一个或多个拷贝。在一些实施例中，初级和/或次级溶瘤病毒包括插入到一个或多个必需病毒基因的基因座中的miRNA靶序列的拷贝中的一个或多个拷贝。miR在多种疾病状态(包含多种类型的癌症)中差异表达。重要的是，与正常组织相比，miRNA在癌组织中差异性地表达，使其能够作为多种癌症的靶向机制。与致癌、恶性转化或转移相关(正或负)的miRNA被称为“oncomiR”。oncomiR的实例和其与不同癌症的关系是本领域已知的(参见例如，国际PCT公开号WO 2017/132552，其通过引用并入本文)。
在一些实施例中，初级和/或次级病毒或初级和/或次级溶瘤病毒可以包括插入到至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个必需病毒基因的基因座中的miRNA靶序列。在正常(非癌性)细胞中表达的miRNA可以与此类靶序列结合并且抑制含有miRNA靶序列的病毒基因的表达。通过将miRNA靶序列并入到病毒复制所需的关键基因中，病毒复制可以在表达miRNA的正常二倍体细胞中被有条件地抑制，并且可以在不表达miRNA的细胞中正常进行。在此类实施例中，重组病毒载体保护健康的非癌性细胞免于正常细胞感染的裂解作用。此类重组病毒或溶瘤病毒在本文中被称为“miR减毒的”，因为与不表达或miRNA的表达降低的细胞相比，它们在表达一种或多种能够与并入的miRNA靶序列结合的miRNA的细胞中表现出减少或减毒的病毒复制。
在一些方面，特定oncomiR的表达水平与特定癌症的发展或维持呈正相关。此类miR在本文中被称为“致癌miR”。在一些实施例中，与在非癌性对照细胞(即，正常或健康对照)中观察到的表达水平相比，致癌miR在癌性细胞或组织中的表达增加，或者与在源自不同癌症类型的癌性细胞中观察到的表达水平相比增加。
在一些实施例中，特定oncomiR的表达与特定癌症和/或转移的发展或维持负正相关。此类oncomiR在本文中被称为“肿瘤抑制miR”或“肿瘤抑制性miR”，因为其表达防止或抑制癌症的发展。在一些实施例中，与在非癌性对照细胞(即，正常或健康对照)中观察到的表达水平相比，肿瘤抑制miRNA在癌性细胞或组织中的表达降低，或者与在源自不同癌症类型的癌性细胞中观察到的肿瘤抑制miRNA的表达水平相比降低。
在一些实施例中，初级和/或次级病毒或初级和/或次级溶瘤病毒包括与选自SEQID NO:1-803的序列的反向补体至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，初级和/或次级病毒或初级和/或次级溶瘤病毒包括一个或多个miRNA靶序列，所述一个或多个miRNA靶序列包括选自SEQ ID NO:1-803的序列的反向补体或由其组成。
在一些实施例中，miRNA靶序列以“miR靶序列盒”或“miR-TS盒”的形式插入到一种或多种必需病毒基因的基因座中。miR-TS盒是指包括一个或多个miRNA靶序列并且能够插入到病毒基因的特定基因座中的多核苷酸序列。在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括至少一种miRNA靶序列。在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括多个miRNA靶序列。例如，在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个miRNA靶序列。
在一些实施例中，所述miR-TS盒包括多个miRNA靶序列，其中所述多个靶序列中的每个miRNA靶序列是相同miRNA的靶序列。例如，miR-TS盒可以包括相同miRNA靶序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。在一些实施例中，miR-TS盒包括相同miRNA靶序列的介于2到6个之间的拷贝。在一些实施例中，miR-TS盒包括相同miRNA靶序列的3个拷贝。在一些实施例中，miR-TS盒包括相同miRNA靶序列的4个拷贝。
在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括多个miRNA靶序列，其中所述多个靶序列包括对至少两种不同miRNA具有特异性的靶序列。例如，在一些实施例中，miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的一个或多个拷贝和第二miRNA靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的一个或多个拷贝、第二miRNA靶序列的一个或多个拷贝和第三miRNA靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝、第二miRNA靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝和第三miRNA靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的3或4个拷贝、第二miRNA靶序列的3或4个拷贝和第三miRNA靶序列的3或4个拷贝。在一些实施例中，多个miRNA靶序列包括至少4个不同的miRNA靶序列。例如，在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的一个或多个拷贝、第二miRNA靶序列的一个或多个拷贝、第三miRNA靶序列的一个或多个拷贝和第四miRNA靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miRNA靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝、第二miR靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝、第三miR靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝和第四miR靶序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。在一些实施例中，所述miR-TS盒包括第一miR靶序列的3或4个拷贝、第二miR靶序列的3或4个拷贝、第三miR靶序列的3或4个拷贝和第四miR靶序列的3或4个拷贝。
在一些实施例中，miR-TS盒中的多个miRNA靶序列是交错的，而不是彼此串联的。在一些实施例中，miR-TS盒中的多个miRNA靶序列由短(.例如，长度为4-15nt)的间隔子分开，从而形成更紧凑的盒。在一些实施例中，miR-TS盒不含(或具有减少的)抑制多个miRNA靶序列活性的RNA二级结构。在一些实施例中，miR-TS盒不含(或具有减少的)与致癌、恶性转化或转移相关的miRNA的种子序列。在一些实施例中，miR-TS盒不含(或具有减少的)多腺苷酸化位点。
在一些实施例中，miR-TS盒包括一个或多个另外的多核苷酸序列，所述一个或多个另外的多核苷酸序列使所述盒能够插入到初级和/或次级病毒基因组的基因座中。例如，miR-TS盒可以进一步包括在5'和3'端上的短多核苷酸序列，其与病毒基因组中的期望定位处的核酸序列互补。此类序列在本文中被称为“同源臂”并且促进将miR-TS盒插入到初级和/或次级病毒基因组中的特定定位中。
在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括两个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括三个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括四个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括5、6、7、8、9、10或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，次级病毒基因组包括两个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级病毒基因组包括三个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级病毒基因组包括四个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，次级病毒基因组包括5、6、7、8、9、10或更多个miR-TS盒。
在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括两个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括三个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括四个或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括5、6、7、8、9、10或更多个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括两个或更多个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括三个或更多个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括四个或更多个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括5、6、7、8、9、10或更多个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少一个miR-TS盒。
在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少两个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少两个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少三个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少两个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括至少四个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少两个miR-TS盒。在一些实施例中，初级病毒基因组包括5、6、7、8、9、10或更多个miR-TS盒，并且次级病毒基因组包括至少两个miR-TS盒。
下表D提供了可以与初级和/或次级病毒或初级和/或次级溶瘤病毒中的miRNA靶序列结合的示例性miRNA的序列。另外的miRNA序列提供于SEQ ID NO:33-803中。在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括与选自SEQ ID NO:1-803的序列的反向补体至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的一个或多个miRNA靶序列。在一些实施例中，本文所描述的miR-TS盒包括一个或多个miRNA靶序列，所述一个或多个miRNA靶序列包括选自SEQ ID NO:1-803的序列的反向补体或由其组成。
表D：示例性miRNA和靶序列
Figure BDA0003640693020000641
Figure BDA0003640693020000651
在一些实施例中，所述miR-TS盒包括多个miRNA靶序列，其中所述多个靶序列包括对至少两种不同miRNA具有特异性的靶序列并且被选择以保护不同细胞类型或器官免于病毒介导的细胞死亡。例如，在一些实施例中，将在各种类型的正常非癌性细胞中高表达而在癌性细胞中不表达或低表达的miRNA的靶序列并入到miR-TS盒中(并且并入到初级和/或次级病毒基因组中)以防止病毒在正常细胞中复制，同时允许病毒在癌性细胞中复制。
在一些实施例中，初级和/或次级病毒包括第一和第二miR-TS盒，所述盒各自包括多个miRNA靶序列。在一些实施例中，第一miR-TS盒包括miR-124-3p、miR-1-3p和/或miR-143-3p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-1-3p、miR-145-5p、miR-199-5p和/或miR-559的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-219a-5p、miR-122-5p和/或miR-128-3p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-122-5p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-137-3p、miR-208b-3p和/或miR-126-3p的靶序列的一个或多个拷贝。
在一些实施例中，初级和/或次级病毒包括第一、第二和第三miR-TS盒，所述盒各自包括多个miRNA靶序列。在一些实施例中，第一miR-TS盒包括miR-124-3p、miR-1-3p和/或miR-143-3p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-122-3p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第二miR-TS盒包括miR-219a-5p、miR-122-5p和/或miR-128-3p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第三miR-TS盒包括miR-125-5p的靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施例中，第三miR-TS盒包括miR-137-3p、miR-208b-3p和/或miR-126-3p的靶序列的一个或多个拷贝。
示例性miR-TS盒在下表E中提供。*N或N1-20表示长度可以在一个核苷酸与二十个核苷酸之间变化的连接子序列，其中“N”可以是任何核酸。在一些实施例中，连接子序列介于1与20个核酸之间。在一些实施例中，连接子序列介于1与8个核酸之间。在一些实施例中，连接子序列为1、2、3、4、5、6、7或8个核酸。在一些实施例中，连接子序列为4个核酸。miR-TS盒可以包括与表E所示的一个或多个序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或介于之间的任何百分比的同一性的miRNA TS序列。miR-TS盒可以包含与表E所示的一个或多个序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或介于之间的任何百分比的同一性的miRNA TS序列，其中种子区内的同一性百分比为100％。在一些实施例中，种子区可以包括在miRNA TS序列或其互补体或反向补体的位置1-8处的核苷酸。
表E：示例性miRNA TS设计
Figure BDA0003640693020000661
Figure BDA0003640693020000671
Figure BDA0003640693020000681
Figure BDA0003640693020000691
Figure BDA0003640693020000701
Figure BDA0003640693020000711
下表F中提供了示例性miRNA和相关序列。
表F：示例性miRNA相关序列
Figure BDA0003640693020000712
Figure BDA0003640693020000721
Figure BDA0003640693020000731
Figure BDA0003640693020000741
Figure BDA0003640693020000751
Figure BDA0003640693020000761
Figure BDA0003640693020000771
示例性双重溶瘤病毒构建体或双重病毒构建体
在一些实施例中，本公开提供了一种包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的初级溶瘤病毒或初级病毒。在一些实施例中，所述初级病毒和所述次级病毒或所述初级溶瘤病毒或所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。在一些实施例中，本公开提供了一种初级溶瘤病毒或初级病毒，其包括(i)与可调节启动子可操作地连接的编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸，以及(ii)编码能够与可调节启动子结合的蛋白质的并且与组成型启动子可操作地连接的第二多核苷酸。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒包括(i)与Tet-OFF启动子可操作地连接并编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸和(ii)与组成型启动子可操作地连接并编码能够与Tet-OFF启动子结合并调节编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸转录的tTA蛋白的第二多核苷酸。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒在存在或不存在四环素的情况下在细胞中表达，而次级病毒仅在不存在四环素的情况下表达。在此类实施例中，侧接编码次级病毒的多核苷酸的5'和3'连接切割序列可以是以下中的任一种：核酶、非四环素激活的适体酶、pre-miRNA序列、miRNA靶序列、gRNA靶序列或AmiRNA靶序列。如上文所描述的，初级病毒和次级病毒可以进一步被miR减毒。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒包括(i)与Tet-OFF启动子可操作地连接并编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸；(ii)与Tet-ON启动子可操作地连接并编码靶向次级病毒基因组中的序列的RNAi分子的第二多核苷酸；以及(ii)第三多核苷酸，所述第三多核苷酸与组成型启动子可操作地连接并编码能够与Tet-OFF启动子结合并调节编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录的tTA蛋白和能够与Tet-ON启动子结合并调节编码RNAi分子的多核苷酸的转录的rtTA蛋白。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒在存在或不存在四环素的情况下在细胞中表达，而次级病毒仅在不存在四环素的情况下表达。在存在四环素的情况下通过安全RNAi分子的表达来防止次级溶瘤病毒或次级病毒在存在四环素的情况下的异常表达，所述分子识别次级病毒基因组中的靶序列并介导次级病毒转录物的降解。在此类实施例中，侧接编码次级病毒的多核苷酸的5'和3'连接切割序列可以是以下中的任一种：核酶、非四环素激活的适体酶、pre-miRNA序列、miRNA靶序列、gRNA靶序列或AmiRNA靶序列。如上文所描述的，初级病毒和次级病毒可以进一步被miR减毒。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒包括(i)与Tet-ON启动子可操作地连接并编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸和(ii)与组成型启动子可操作地连接并编码能够与Tet-ON启动子结合并调节编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸转录的rtTA蛋白的第二多核苷酸。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒在存在或不存在四环素的情况下在细胞中表达，而次级病毒仅在存在四环素的情况下表达。在此类实施例中，侧接编码次级病毒的多核苷酸的5'和3'连接切割序列可以是以下中的任一种：核酶、适体酶(包含四环素激活的适体酶)、pre-miRNA序列、miRNA靶序列、gRNA靶序列或AmiRNA靶序列。如上文所描述的，初级病毒和次级病毒可以进一步被miR减毒。
在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒包括(i)与Tet-ON启动子可操作地连接并编码次级溶瘤病毒或次级病毒的第一多核苷酸；(ii)与Tet-OFF启动子可操作地连接并编码靶向次级病毒基因组中的序列的RNAi分子的第二多核苷酸；以及(ii)第三多核苷酸，所述第三多核苷酸与组成型启动子可操作地连接并编码能够与Tet-ON启动子结合并调节编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸的转录的rtTA蛋白和能够与Tet-OFF启动子结合并调节编码RNAi分子的多核苷酸的转录的tTA蛋白。在此类实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒在存在或不存在四环素的情况下在细胞中表达，而次级病毒仅在存在四环素的情况下表达。在不存在四环素的情况下通过安全RNAi分子的表达来防止次级溶瘤病毒或次级病毒在不存在四环素的情况下的异常表达，所述分子识别次级病毒基因组中的靶序列并介导次级病毒转录物的降解。在此类实施例中，侧接编码次级病毒的多核苷酸的5'和3'连接切割序列可以是以下中的任一种：核酶、适体酶(包含四环素激活的适体酶)、pre-miRNA序列、miRNA靶序列、gRNA靶序列或AmiRNA靶序列。如上文所描述的，初级病毒和次级病毒可以进一步被miR减毒。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒或初级病毒包括编码次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸。在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。在一些实施例中，所述编码所述次级溶瘤病毒或次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒。示例性重组酶应答性盒包含本公开的RREC和RRIC(任选地包括内含子的一部分)。在一些实施例中，所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒包括编码重组酶的多核苷酸。在一些实施例中，编码重组酶的多核苷酸包括内含子(或其一部分)。在一些实施例中，编码重组酶的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。
在一些实施例中，初级溶瘤病毒包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸，其中所述初级溶瘤病毒是HSV，并且所述次级溶瘤病毒是小核糖核酸病毒。在一些实施例中，双重溶瘤病毒包括初级溶瘤病毒，所述初级溶瘤病毒包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸，其中所述初级溶瘤病毒是HSV，并且所述次级溶瘤病毒是SVV。在一些实施例中，双重溶瘤病毒包括初级溶瘤病毒，所述初级溶瘤病毒包括编码次级溶瘤病毒的多核苷酸，其中所述初级溶瘤病毒是HSV，并且所述次级溶瘤病毒是CVA。在一些实施例中，初级病毒包括编码次级病毒的多核苷酸，其中所述初级病毒是HSV，并且所述次级病毒是小核糖核酸病毒。在一些实施例中，双重病毒包括初级病毒，所述初级病毒包括编码次级病毒的多核苷酸，其中所述初级病毒是HSV，并且所述次级病毒是SVV。在一些实施例中，双重病毒包括初级病毒，所述初级病毒包括编码次级病毒的多核苷酸，其中所述初级病毒是HSV，并且所述次级病毒是CVA。
双重溶瘤病毒构建体或双重病毒构建体的产生
在一些实施例中，本公开提供了产生本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒的方法。
在一些实施例中，本公开提供了本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒的病毒原液。在一些实施例中，病毒原液是同源性原液。病毒原液的制备和分析在本领域是众所周知的。例如，可以在滚瓶中制造病毒原液，所述滚瓶含有用病毒载体转导的细胞。然后可以在连续的nycodenze梯度上纯化病毒原液，并且等分并储存直到需要。病毒原液的滴度差异很大，主要取决于病毒基因型和用于制备所述病毒原液的方案和细胞系。在一些实施例中，本文考虑的病毒原液的滴度为至少约105个噬斑形成单位(pfu)，如至少约106pfu或至少约107pfu。在某些实施例中，滴度可以为至少约108、或至少约109pfu、至少约1010pfu或至少约1011pfu。
治疗组合物
在一些实施例中，本公开提供了包括本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒的组合物。在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“组合物”是指本文所描述的一种或多种双重溶瘤病毒或双重病毒的能够被施用或递送到受试者和/或细胞的调配物。通常，调配物包含所有生理学可接受的组合物，包含其衍生物和/或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋体或互变异构体以及任何生理学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。“治疗组合物”是一种或多种药剂的能够被施用或递送到患者和/或受试者和/或细胞以用于治疗特定疾病或病症的组合物。
如本文所用，“载体”包含生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等，包含已被美国食品和药物管理局批准用于人和/或家畜的药学上可接受的细胞培养基和/或乳化剂。将此类培养基和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则设想了将其用于治疗性组合物中。补充物
在一个实施例中，包括载剂的组合物适于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。药学上可接受的载剂包含无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂对药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或药剂与病毒载体或核酸分子不相容的情况之外，设想了其在本公开的药物组合物中的用途。
本公开的组合物可以包括一种或多种多肽、多核苷酸、包括其的载体、感染的细胞等，如本文所描述的，调配在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中以单独施用于细胞或动物，或与一种或多种其它治疗模式组合。还应理解，如果需要，本公开的组合物也可以与其它药剂组合施用，如例如细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种具有药学活性的药剂。对组合物中还可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
在本公开的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的调配物是本领域的技术人员众所周知的，同样是用于在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的给药和治疗方案的开发。在调配之后，以与剂量配制品相容的方式并且以如治疗有效一样的量的方式施用溶液以使症状得以改善或补救。调配物可以通过如可摄取溶液、药物释放胶囊等各种剂型容易地施用。剂量的某种变化可以根据正在治疗的受试者的病症而发生。在任何情况下，负责施用的人可以确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂满足如FDA生物制剂评估和研究标准中心(FDA Center for Biologics Evaluationand Research standards)要求的无菌性、总体安全性和纯度标准。施用途径将会随着正在治疗的疾病的位置和性质自然地变化并且可以包含例如皮内、透皮、真皮下、肠胃外、鼻腔、静脉内、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用。
在某些情况下，如例如在美国专利第5,543,158号；美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363中所描述的(所述美国专利中的每一个具体地通过引用整体并入本文)，期望在肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文所公开的组合物、重组病毒载体和核酸分子。可以在适当地混合有如羟基丙基纤维素等表面活性剂的水中制备以游离碱或药学上可接受的盐的形式存在的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适于注射使用的药物形式包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，所述美国专利具体地通过引用以其整体并入本文)。在所有情况下，所述形式应为无菌的，并且应为流体，以达到能够易于注射的程度。其应在制造和存储的条件下稳定并且应被保存以免遭微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。合适的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒度并且通过使用表面活性剂来维持。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)可以促进防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。对可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来提供。含有作为活性成分的蛋白质的水性组合物的制备是本领域所理解的。通常，将此类组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射之前溶于或悬浮于液体的固体形式。所述制剂也可以被乳化。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，所述溶液应当被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的生理盐水或葡萄糖进行等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此而言，鉴于本公开，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，并且添加到1000ml的皮下输液流体或在打算输注的部位进行注射(参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版马里兰巴尔的摩:利平科特·威廉姆斯和威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins),2000年)。剂量的一些变化必然会根据正在治疗的受试者的病状而发生。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体受试者的适当的剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、产热原性以及一般的安全性和纯度标准。
可以通过将活性化合物以所需的量根据需要与以上枚举的各种其它成分一起并入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
在某些实施例中，组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送载剂来递送。用于通过鼻气溶胶喷雾将多核苷酸和肽组合物直接递送到肺的方法已经描述于例如美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号中(所述美国专利各自具体通过引用整体并入本文)。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871号，具体地通过引用以其整体并入本文)递送药物在制药领域也是公知的。同样地，采用聚四氟乙烯载体基质形式的经粘膜药物递送描述于美国专利第5,780,045号中(所述美国专利具体通过引用整体并入本文)。
使用方法
在一些实施例中，本公开提供了杀死癌性细胞的方法，所述方法包括使所述癌性细胞暴露于本文所描述的双重溶瘤病毒或组合物。在一些实施例中，双重溶瘤病毒在癌性细胞内复制并产生次级溶瘤病毒。在一些实施例中，次级溶瘤病毒感染另一个癌性细胞并在另一个癌性细胞内复制。因此，在一些实施例中，本公开的双重溶瘤病毒能够杀死多个癌性细胞。在此类实施例中，多个癌细胞的第一子集可以被第一溶瘤病毒杀死，并且多个癌细胞的第二子集可以被次级溶瘤病毒杀死。在一些实施例中，癌性细胞在体内。在某些实施例中，癌性细胞在肿瘤内。
在一些实施例中，本公开提供了杀死癌性细胞的方法，所述方法包括使所述癌性细胞暴露于本文所描述的双重病毒或组合物。在一些实施例中，双重病毒在癌性细胞内复制并产生次级病毒。在一些实施例中，次级病毒感染另一个癌性细胞并在另一个癌性细胞内复制。因此，在一些实施例中，本公开的双重病毒能够杀死多个癌性细胞。在此类实施例中，多个癌细胞的第一子集可以被第一病毒杀死，并且多个癌细胞的第二子集可以被次级病毒杀死。在一些实施例中，癌性细胞在体内。在某些实施例中，癌性细胞在肿瘤内。
从双重溶瘤病毒载体产生初级和次级溶瘤病毒，或从双重病毒载体产生初级和次级病毒，可以通过本领域已知的方法(包含病毒RNA和/或DNA序列的RT-PCR)测量。例如，图25示出了产生次级溶瘤SVV的aPCR测定。H1299细胞用体外转录的SVV-neg或SVV-野生型(WT)正链RNA转染，或用包括编码具有复制能力的SVV(ONCR-189)或没有复制能力(ONCR-190)的SVV病毒基因组的多核苷酸的溶瘤HSV-1病毒感染。提取RNA并对正义和负义SVV RNA链两者进行qRT-PCR。如所示出的，在ONCR-189和用SVV野生型RNA(SVV WT)的对照转染中检测到相当水平的正义和负义RNA，其中SVV RNA水平在ONCR-190对照中低得多，表明SVV病毒复制从包括编码具有复制能力的SVV的多核苷酸的HSV-1的感染开始。两条链的高水平表明由溶瘤HSV诱导或表达的活性SVV感染，并且这例示了从oHSV感染开始感染正义RNA病毒。
在一些实施例中，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物。如本文所用，“受试者”包含表现出可以用本文所公开的重组病毒载体、组合物和方法治疗的疾病、病症或病状的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物(如马或牛)和家养动物或宠物(如猫或狗)。包含非人灵长类动物和优选地人患者。
“施用”在本文中是指将本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物引入到受试者，或使本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物与细胞和/或组织接触。施用可以通过注射、冲洗、吸入、消耗、电渗、血液透析、离子电渗疗法和本领域已知的其它方法进行。施用途径天然会随着所治疗疾病的定位和性质而变化，并且可以包含例如耳部施用、口腔施用、结膜施用、皮肤施用、牙科施用、宫颈管施用、鼻窦内施用、气管内施用、肠内施用、硬膜外施用、间质施用、关节内施用、动脉内施用、腹内施用、耳内施用、胆道内施用、支气管内施用、滑囊内施用、海绵体内施用、脑内施用、脑池内施用、角膜内施用、冠状动脉内施用、冠状动脉内施用、颅内施用、皮内施用、椎间盘内施用、导管内施用、十二指肠内施用、十二指肠内施用、硬膜内施用、心外膜内施用、表皮内施用、食管内施用、胃内施用、牙龈内施用、肝内施用、回肠内施用、病灶内施用、舌内施用、腔内施用、淋巴管内施用、乳房内施用、髓内施用、脑膜内施用、肌肉内施用、鼻内施用、结内施用、眼内施用、网膜内施用、卵巢内施用、腹膜内施用、心包内施用、胸膜内施用、前列腺内施用、肺内施用、瘤胃内施用、窦内施用、脊柱内施用、滑膜内施用、腱内施用、睾丸内施用、气管内施用、鞘内施用、胸内施用、管内施用、肿瘤内施用、鼓室内施用、宫内施用、腹膜内施用、血管内施用、心室内施用、膀胱内施用、前庭内施用、静脉内施用、玻璃体内施用、喉施用、鼻施用、鼻胃施用、口腔施用、眼施用、口咽施用、肠外施用、经皮施用、关节周围施用、硬膜外施用、神经周围施用、牙周施用、呼吸施用、管后施用、直肠施用、脊髓施用、蛛网膜下腔施用、结膜下施用、皮下施用、皮下施用、牙龈下施用、舌下施用、粘膜下施用、视网膜下施用、局部施用、透皮施用、经心内膜施用、经粘膜施用、经胎盘施用、气管施用、经鼓室施用、输尿管施用、尿道施用和/或阴道灌注施用、灌洗施用、直接注射施用和口服施用。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指向受试者施用治疗有效量的本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物，使得受试者的疾病或病状或疾病或病状的症状改善。改善是疾病或病症或者疾病或病症的症状的任何改善或补救。改善是可观察到的或可测量的改善或者可以是受试者的总体健康感受的改善。因此，本领域技术人员应认识到，治疗可以改善疾病病症，但可能不会完全治愈疾病。“预防有效量”是指有效达到期望的预防结果的本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物的量。如本文所用，“预防”可以意指完全预防疾病症状、延迟疾病症状的发作或减轻随后发展的疾病症状的严重性。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
本文中的“癌症”指代或描述哺乳动物中通常通过未经调节的细胞生长进行表征的生理学病症。癌症的实例包含但不限于肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包含脂肪肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、平滑肌肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、软骨肉瘤)、神经内分泌瘤、间皮瘤、滑膜瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包含：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌(lung cancer)，包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌；小细胞肺肿瘤；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌，包含胃肠癌；胰腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌(bladder cancer)；肝癌(hepatoma)；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾腺癌；肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛门癌；阴茎癌；睾丸癌；食道癌；胆道肿瘤；尤文氏肉瘤；基底细胞癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；囊腺癌；髓样癌；支气管癌、肾细胞癌、肝癌(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、睾丸肿瘤、肺癌(lung carcinoma)、膀胱癌(bladder carcinoma)、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、骨髓增生异常病、重链病、神经内分泌瘤、神经鞘瘤和其它癌瘤以及头颈癌。
在某些实施例中，本文所描述的双重溶瘤病毒或双重病毒或其组合物用于治疗选自以下的癌症：肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌(.例如，肝细胞癌(HCC))、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。
实例
实例1：对多西环素应答性启动子的表征
测试了各种四环素(Tet)依赖性启动子诱导报告基因表达的能力。包括启动子下游的Tet-On元件的每个Tet依赖性启动子与报告构建体中的mCherry-NLuc报告基因可操作地连接(图12，右图)。根据标准方法，使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))用MND-TetR构建体和报告构建体之一转染HEK293T细胞。在过夜生长后，通过向一组复制孔中添加200nM的强力霉素来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用纳米荧光素酶活性的同源测定(NanoGlo，普洛麦格公司(Promega))确定相对报告基因活性(图12条形图；每个条形上方的数值示出了添加强力霉素之后RLU的变化倍数)。结果表明，添加强力霉素显著增加了报告基因的表达。在测试的Tet依赖性启动子中，CMV启动子在添加强力霉素时示出了最大的变化倍数。
实例2：对Flp应答性STOP盒的表征
HEK293T细胞用以下共转染：
a)MND-TetR构建体(NLS-TetR-NLS多肽由SEQ ID NO:864编码)；
b)任选地，CMV-TetOn(TO)-Flp重组酶构建体(+Flp)；阴性对照被指示为(-Flp)；以及
c)不具有STOP盒的CMV-TO-mCherry-NLuc(NLuc)或具有Flp应答性STOP盒的CMV-TO-mCherry-NLuc构建体(FSF-NLuc)，
根据标准方法使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)。在过夜生长后，通过向一组复制孔中添加200nM的强力霉素来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用纳米荧光素酶活性的同源测定(NanoGlo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。
结果(图13)表明，Flp应答性STOP盒的并入(FSF-NLuc)产生对多西环素对报告基因表达的更大控制。在不存在强力霉素的情况下，报告基因的基线表达在FSF-NLuc组中降低(图13条形图右侧)。与不具有Flp重组酶的FSF-NLuc组相比，添加也受Tet-On元件控制的Flp重组酶表达构建体增加了FSF-NLuc构建体的整体报告基因表达。相反，对于不具有Flp应答性STOP盒的报告基因构建体(NLuc；图13条形图左侧)，在不存在强力霉素的情况下，报告基因的基线表达较高，并且表达水平不受Flp重组酶表达构建体存在或不存在的影响。
实例3：用于Flp活性的翻译后控制的Flp-ERT2融合蛋白的设计
使用他莫昔芬测试了许多Flp-ERT2融合蛋白控制Flp活性的能力(图14)。
每个Flp-ERT2融合蛋白都包括通过连接子区与突变的雌激素受体(ERT2)融合的Flp。ERT2仅在结合活性三苯氧胺代谢物4-羟基三苯氧胺(4OHT)时才被激活并转移到细胞核中。因此，细胞核中的融合蛋白的Flp活性可以通过4OHT来控制。
构建了许多Flp-ERT2融合蛋白。含有RGS连接子区的融合蛋白被表示为“FER”，而含有XTEN连接子区的融合蛋白被表示为“FEX”。FER和FEX构建体的N、P和NP变体是指其中所指示的NLS(N)和PEST(P)结构域被工程化到每个重组蛋白的N末端中的变体。Flp-ERT2融合蛋白的每个表达构建体都包括与Flp-ERT2融合蛋白的编码区可操作地连接的“HBP1启动子-TetOn”区。
如图14所示的示例性FLP-RGS-ERT2多肽具有由SEQ ID NO:846编码的氨基酸序列。如图14所示的示例性FLP-XTEN-ERT2多肽具有由SEQ ID NO:847编码的氨基酸序列。示例性NLS序列具有由SEQ ID NO:848编码的氨基酸序列。示例性PEST序列具有由SEQ ID NO:849编码的氨基酸序列。
测试了每种融合蛋白构建体控制基因表达的能力。HEK293T细胞用以下共转染：
a)MND-TetR构建体；
b)CMV-TO-mCherry-NLuc或CMV-TO-FSF-mCherry-NLuc构建体；以及
c)HBP1-TO-FER或HBP1-TO-FEX表达构建体，
根据标准方法使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)。在过夜生长后，通过向多组复制孔中添加200nM强力霉素和/或1uM4-羟基三苯氧胺来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用纳米荧光素酶活性的同源测定(NanoGlo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。
根据结果(图14)，若干种Flp-ERT2融合蛋白构建体示出了4OHT依赖性Flp活性，包含FERP、FERNPA、FEXP和FEXNP。
实例4：STOP盒、Flp编码区中的内含子和mRNA去稳定化元件对表达控制的影响
为了进一步控制Flp活性，测试了插入内含子元件的Flp表达构建体的另外的设计(图15A)。
使用先前实例中的FEXP构建体(SEQ ID NO:867)作为模板，并且将内含子区(ACTB基因的内含子2，具有必要的剪接供体/接受体元件)插入到Flp编码区中。所得构建体被表示为“FEXPi2”(SEQ ID NO:868)。因此，FEXP和FEXPi2构建体的不同之处在于将ACTB基因的内含子2插入到FLP编码区中。
HEK293T细胞用以下转染：
a)MND-TetR构建体；
b)HBP2-TO-mCherry-NLuc或HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc构建体；以及
c)HBP1-TO-FEXP或HBP1-TO-FEXPi2(SEQ ID NO:869)构建体，
根据标准方法使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)。使用了三个版本的HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc，所述三个版本各自分别含有Flp应答性STOP盒的STOP1(SEQID NO:854)、STOP2(SEQ ID NO:855)或STOP3(SEQ ID NO:856)变体。STOP1、STOP2和STOP3变体的不同之处在于盒中的串联多腺苷酸化信号的数量。在过夜生长后，通过向多组复制孔中添加200nM强力霉素和/或1uM 4-羟基三苯氧胺来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用纳米荧光素酶活性的同源测定(NanoGlo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。
根据结果(图15A)，在Flp应答性STOP盒中，具有较长串联多腺苷酸化信号的STOP3盒在抑制基线表达方面更有效，而Flp编码区中内含子的存在有助于维持Flp在存在多西环素和4OHT两者的情况下的最大活性，以及报告基因与包括STOP3盒的表达构建体组合时的表达水平。
还测试了插入mRNA去稳定化元件的Flp表达构建体的另外的设计(图15B)。不同的mRNA去稳定化元件被插入到FEXPi2构建体中。所使用的mRNA去稳定化元件是c-fos编码元件(FCE,SEQ ID NO:894)、来自c-fos基因的3'UTR的富含AU的元件(ARE,SEQ ID NO:895)，以及FCE和ARE两者串联的组合(SEQ ID NO:896)。插入了FCE的FEXPi2构建体被表示为FEXPi2-F，插入了ARE的FEXPi2构建体被表示为FEXPi2-A，并且插入了FCE和ARE两者的FEXPi2构建体被表示为FEXPi2-FA。
根据标准方法使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)用MND-TetR和HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc构建体和HBP1-TO-FEXPi2表达构建体的变体转染HEK293T细胞。在过夜生长后，通过向多组复制孔中添加200nM强力霉素和/或1uM 4-羟基三苯氧胺来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用纳米荧光素酶活性的同源测定(NanoGlo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。结果(图15B)示出了mRNA去稳定化元件的并入可能影响Flp重组酶的表达。
实例5：用各种表达构建体设计控制靶基因表达
测试了各种表达构建体设计对控制基因表达的影响。
如图16所示，所述设计包含：
1)STOP盒：包括插入在启动子-TetOn区与报告基因编码区之间的STOP盒的构建体；
2)有效负载反转：包括两个STOP盒的构建体；并且报告基因编码区被反转并放置于正交Flp识别位点的控制下(SEQ ID NO:861)；
3)启动子反转：包括两个STOP盒的构建体；并且启动子区被反转并放置于正交Flp识别位点的控制下(SEQ ID NO:860)；
4)分裂内含子反转：包括两个STOP盒的构建体；并且启动子区和报告基因编码区的一部分被反转并放置于正交Flp识别位点的控制下；并且内含子区与报告基因编码区可操作地连接(SEQ ID NO:862)。
根据标准方法，使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)用所指示的表达建体转染HEK293T细胞。将细胞培养持续两天，并且使用萤火虫荧光素酶活性的同源测定(ONE-Glo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。结果(图16)表明，这些设计使报告基因的基线表达降低，其中分裂内含子反转设计实现了最低的基线(泄漏)表达。
还测试了所有这些设计对多西环素和4OHT的应答性。根据标准方法，使用LipofectAMINE 2000(赛默飞世尔科技公司)用所指示的表达建体转染HEK293T细胞。在过夜生长后，通过向多组复制孔中添加200nM强力霉素和/或1uM 4-羟基三苯氧胺来诱导基因表达。将细胞培养过夜，并且使用萤火虫荧光素酶活性的同源测定(ONE-Glo，普洛麦格公司)确定相对报告基因活性。结果(图17)表明，所有这些设计都示出了对多西环素和4OH的应答性，并且需要这两种药物才能最大化表达。
实例6：对单个构建体中的转录控制、翻译控制和有效负载组分的工程化
为了构建整合了转录控制、翻译控制和有效负载组分的载体，网关attL位点被工程化到各种构建体中，以促进LR Clonase介导的使用多位点网关系统(MultiSite Gatewaysystem)(赛默飞世尔科技公司)将每个组分组装到pDEST14载体中。图18中所示的构建体利用了如先前实例中所示的STOP3盒(HBP2-TO-STOP3-mCherry-fLuc，SEQ ID NO:870)。还产生了利用根据先前实例的有效负载反转设计、启动子反转设计和分裂内含子反转设计的另外的构建体。
实例7：将转录控制、翻译控制和OV2有效负载组分工程化到HSV载体中
构建了各种双重溶瘤病毒载体，将转录控制、翻译控制和次级溶瘤病毒基因组组分整合在单个基于HSV的溶瘤病毒载体中。网关attL位点被工程化到各种构建体中，以促进LR Clonase介导的使用多位点网关系统(赛默飞世尔科技公司)将每个组分组装到ONCR222b载体中。一个示例性构建体如图19所示，其整合了用于Flp重组酶表达的HBP1_启动子-TetOn-FEXPi2盒(SEQ ID NO:869)和HBP2_启动子-TetOn-STOP3-SVV-mCherry(SEQID NO:871)盒，一旦STOP3元件被Flp重组酶切除，就能够转录和翻译SVV病毒基因组以及mCherry报告基因。全14.1kb插入序列提供在SEQ ID NO:872中。虽然重组酶应答性STOP3盒用于控制图19中的次级溶瘤病毒，但还构建了类似的双重溶瘤病毒载体，分别使用有效负载反转设计、启动子反转设计和分裂内含子反转设计来控制次级溶瘤病毒。每个基于HSV的双重溶瘤病毒载体通过使用Fugene HD(普洛麦格公司)转染到Vero-SF细胞中进行重组，并且根据标准方法扩增和滴定病毒原液。
NCI-H1299细胞用所指示的基于ONCR-222的双重溶瘤病毒载体以0.1pfu/细胞的感染复数感染，并且通过将200nM强力霉素和1uM4-羟基三苯氧胺添加到复制孔来诱导SVV-mCherry复制。使用自动反转荧光显微镜(IncuCyte S3)每2小时测定一次病毒复制，持续3天，以筛选来自HSV的GFP表达和来自SVV的mCherry表达。将数据绘制为GFP和mCherry细胞总数/显微镜场，作为对HSV(图20A)或SVV(图20B)的病毒滴度的指示。结果表明，对于所有测试的双重溶瘤病毒载体，HSV的病毒滴度不受强力霉素和4-羟基三苯氧胺的存在的显著影响(图20A)。另一方面，对于具有STOP3切除盒设计或启动子反转设计的双重溶瘤载体，SVV的病毒滴度在存在多西环素和4-羟基三苯氧胺的情况下显著增加(图20B)。特别是，对于在SVV次级溶瘤病毒(SVV)表达盒中使用启动子反转设计的双重溶瘤病毒载体，在不存在强力霉素和4-羟基三苯氧胺的情况下，SVV的基础产量最低，但在用这些小分子诱导之后，SVV的产量很高。
实例8：双重溶瘤病毒在体内显示出更有效的抗肿瘤作用
通过将SVV病毒基因组插入到溶瘤HSV骨架载体ONCR-142中构建了双重溶瘤病毒载体(图21)。SVV+ssRNA的表达由网关盒内的CMV启动子控制。在ONCR-189(SEQ ID NO:873)中，在编码SVV病毒基因组的RNA转录之后，侧接SVV病毒基因组的自切割核酶充当连接切割序列以从转录物中去除非病毒RNA，其进而释放SVV RNA以允许产生感染性SVV病毒。在对照载体ONCR-190(SEQ ID NO：874)中，没有此类核酶，并且因此不产生感染性SVV病毒RNA。因此，ONCR-189是具有SVV复制能力的，而ONCR-190是没有SVV复制能力的。
产生来自ONCR-189和ONCR-190的病毒原液并在Vero细胞中滴定。通过感染Vero或H1299细胞测试了ONCR-189或ONCR-190病毒原液的裂解活性(图22)。每种病毒原液的10倍系列稀释液用于感染Vero或H1299细胞，并且用结晶紫染色细胞以可视化裂解细胞死亡和单层清除。ONCR-189和ONCR-190在对HSV敏感但对SVV感染具有抗性的Vero细胞中展示出等效的细胞杀伤。另一方面，H1299细胞对HSV和SVV感染两者都敏感，并且ONCR-189在比ONCR-190更高的稀释度下清除H1299细胞的单层。进一步，人血清中和HSV而不是SVV，并且当病毒感染在存在2％人血清的情况下进行时，细胞裂解在ONCR-190对照中被抑制，而不是ONCR-189感染。这些实验证明，ONCR-189可以有效地产生功能性SVV次级溶瘤病毒。
然后测试了1％Triton是否会影响ONCR-189或ONCR-190病毒原液感染H1299细胞的能力(图23)。每种病毒原液的10倍系列稀释液用于感染H1299细胞，并且用结晶紫染色细胞以可视化裂解细胞死亡和单层清除。H1299细胞对HSV和SVV诱导的细胞裂解均敏感。与ONCR-190相比，当用相同的HSV-1MOI感染时(由于原液中存在HSV和SVV病毒体)，ONCR-189以更高的稀释度清除单层细胞。1％Triton会破坏HSV的包膜并且使感染性HSV病毒体灭活，但不影响无包膜的SVV。因此，在存在1％Triton的情况下，对于ONCR-190，细胞裂解被抑制，但不是对于ONCR-189原液(仅HSV感染被灭活，但由于ONCR-189病毒原液含有HSV和SVV病毒体，并且SVV未被1％Triton灭活，SVV病毒体裂解H1299细胞)。
对H446细胞的ONCR-189和ONCR-190病毒感染进行IC50滴度测定(图24A)。H446细胞对HSV和SVV感染两者均敏感。结果表明，如与ONCR-190相比，ONCR-189的IC50滴度更低。也就是说，ONCR-189更有效地杀死H446细胞。在存在1％Triton的情况下的感染会破坏HSV的包膜并使感染性HSV病毒体灭活，但不会影响SVV，因此当添加1％Triton时，ONCR-190中的细胞裂解被抑制，而ONCR-189感染则没有被抑制。图24B中汇总了IC50值。
在另一组实验中，H1299细胞用体外转录的SVV-neg或SVV-wt正链RNA转染或用ONCR-189和ONCR-190oHSV感染。提取来自每个测试组的RNA样品并进行RT qPCR测定(图25)。结果表明，SVV-WT正链RNA的转染产生正链RNA和负链RNA两者的高拷贝，表明了病毒复制。ONCR-189感染的细胞中的SVV正链和负链RNA的水平与SVV-WT转染的细胞类似，并且远高于ONCR-190感染的细胞中的SVV RNA水平，表明了SVV病毒复制在ONCR-189oHSV感染的细胞中的成功。
实例9：双重溶瘤病毒在体内示出了抗肿瘤作用
在携带皮下异种移植肿瘤(NCI-H1299)的裸鼠中进行对双重溶瘤病毒的体内功效的评估。每种oHSV均以1×107PFU的IV剂量静脉内(IV)施用，并且SVV以1×104PFU的IV剂量施用。当肿瘤达到150mm3(每组n＝7)并在第1天、第4天和第7天静脉内给药时，将携带NCI-H1299的小鼠分组。每周两次测量肿瘤生长(图26A)和体重(图26B)。
如图26A所示，oHSV骨架载体(ONCR-142)和编码不具有核酶的SVV的oHSV(ONCR-190)在此肿瘤模型中没有抗肿瘤作用。另一方面，用SVV病毒体或ONCR-190与SVV病毒体组合治疗的小鼠示出了显著的肿瘤生长抑制。观察到用ONCR-189进行IV给药的小鼠的类似的肿瘤生长抑制，这表明ONCR-189一旦在体内递送，就可以有效地产生功能性SVV病毒体，从而能够抑制肿瘤生长。对于此研究中测试的任何治疗，均未观察到对动物体重的不利影响(图26B)。对于组统计比较，使用双向ANOVA(邦费罗尼的多重比较测试(Bonferroni'smultiple comparisons test))。P值与PBS对照有关，其中*指示P<0.05。
实例10：使用TetOFF核酶控制基因表达
用mCherry报告载体质粒瞬时转染HEK293细胞，所述质粒在3'UTR中表达含有K4适体酶(SEQ ID NO:913)或K7适体酶(SEQ ID NO:914)的转录物。在添加所指示的浓度的四环素时，转染后48小时，通过阵列扫描细胞术在Spectramax Minimax上评估mCherry的表达水平。结果(图27)表明，四环素抑制转录物的适体酶切割以诱导基因表达。
实例11：双重溶瘤病毒在体内示出了持续的抗肿瘤作用
将在携带对初级溶瘤病毒部分地敏感的皮下异种移植肿瘤的裸鼠中进行对双重溶瘤病毒的体内功效的评估。病毒将在IV处静脉内(IV)施用。当肿瘤达到150mm3(每组n＝7-10)时，将携带肿瘤的小鼠分组并静脉内给药三次。每周两次测量肿瘤生长。
编码非复制能力的次级溶瘤病毒的初级溶瘤病毒将在此肿瘤模型中具有部分抗肿瘤作用，其中肿瘤将在一定时间量之后复发。另一方面，经编码可以有效产生功能性次级病毒体的具有复制能力的次级溶瘤病毒的初级溶瘤病毒处理的小鼠将在更大程度上抑制肿瘤生长，并且持续更延长的时间。
另外编号的实施例
在以下编号的实施例中提供了本公开的另外的实施例：
实施例1.一种重组初级溶瘤病毒，其包括：编码次级溶瘤病毒的多核苷酸。
实施例2.一种重组初级病毒，其包括：编码次级病毒的多核苷酸。
实施例3.根据实施例1所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。
实施例4.根据实施例2所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。
实施例5.根据实施例1所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是没有复制能力的。
实施例6.根据实施例2所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是没有复制能力的。
实施例7.根据实施例1、3和5中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。
实施例8.根据实施例2、4和6中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。
实施例9.根据实施例1、3、5和7中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
实施例10.根据实施例2、4、6和8中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
实施例11.根据实施例1、3、5、7和9中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
实施例12.根据实施例2、4、6、8和10中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
实施例13.根据实施例11或12所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒。
实施例14.根据实施例11或12所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是痘病毒科病毒。
实施例15.根据实施例14所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。
实施例16.根据实施例1、3、5、7和9中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是RNA病毒。
实施例17.根据实施例2、4、6、8和10中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是RNA病毒。
实施例18.根据实施例16或17所述的病毒，其中所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
实施例19.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16和18中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
实施例20.根据实施例2、4、6、8、10、12到15和17到18中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
实施例21.根据实施例19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的负义ssRNA病毒。
实施例22.根据实施例21所述的病毒，其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒。
实施例23.根据实施例21所述的病毒，其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹病毒。
实施例24.根据实施例21所述的病毒，其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。
实施例25.根据实施例19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是肠道病毒。
实施例26.根据实施例25所述的病毒，其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(SVV)、柯萨奇病毒或艾柯病毒。
实施例27.根据实施例26所述的病毒，其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)。
实施例28.根据实施例27所述的病毒，其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。
实施例29.根据实施例19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)。
实施例30.根据实施例19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是门戈病毒。
实施例31.根据实施例19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒。
实施例32.根据实施例31所述的病毒，其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒。
实施例33.根据实施例32所述的病毒，其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒或马雅罗病毒。
实施例34.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19和21到33中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。
实施例35.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18和20到33中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。
实施例36.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19和21到34中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。
实施例37.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33和35中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。
实施例38.根据实施例36所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是假型化病毒，并且其中所述初级溶瘤病毒包括所述次级溶瘤病毒的在所述次级溶瘤病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。
实施例39.根据实施例38所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是甲病毒、副粘病毒或弹状病毒。
实施例40.根据实施例37所述的病毒，其中所述次级病毒是假型化病毒，并且其中所述初级病毒包括所述次级病毒的在所述次级病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。
实施例41.根据实施例40所述的病毒，其中所述次级病毒是甲病毒、副粘病毒或弹状病毒。
实施例42.根据实施例7到41中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素诱导型启动子。
实施例43.根据实施例7到41中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子包括侧接有重组酶识别位点的组成型启动子。
实施例44.根据实施例1到43中任一项所述的病毒，其进一步包括编码能够与所述可调节启动子结合的肽的第二多核苷酸。
实施例45.根据实施例44所述的病毒，其中所述第二多核苷酸与组成型启动子或诱导型启动子可操作地连接。
实施例46.根据实施例45所述的病毒，其中所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
实施例47.根据实施例44到46中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
实施例48.根据实施例44到46中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
实施例49.根据实施例1到48中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒进一步包括编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸。
实施例50.根据实施例49所述的病毒，其中所述编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。
实施例51.根据实施例49或50所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的复制。
实施例52.根据实施例49到51中任一项所述的病毒，其中所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
实施例53.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39和42到52中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。
实施例54.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37和40到52中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。
实施例55.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39和42到53中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
实施例56.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52和到54中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
实施例57.根据实施例55或56所述的病毒，其中所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性切除盒(RREC)。
实施例58.根据实施例57所述的病毒，其中所述RREC包括转录/翻译终止(STOP)元件。
实施例59.根据实施例58所述的病毒，其中所述转录/翻译终止(STOP)元件包括与SEQ ID NO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。
实施例60.根据实施例55到59中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性反转盒(RRIC)。
实施例61.根据实施例60所述的病毒，其中所述RRIC包括在中心元件的每一侧上的两个或更多个正交重组酶识别位点。
实施例62.根据实施例60或61所述的病毒，其中所述RRIC包括启动子或所述启动子的一部分。
实施例63.根据实施例60或61所述的病毒，其中所述RRIC包括编码区或所述编码区的一部分，其中所述编码区编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的病毒基因组。
实施例64.根据实施例60到63中任一项所述的病毒，其中所述RRIC包括一个或多个控制元件。
实施例65.根据实施例64所述的病毒，其中所述控制元件是转录/翻译终止(STOP)元件。
实施例66.根据实施例65所述的病毒，其中所述控制元件具有与SEQ ID NO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。
实施例67.根据实施例60到66中任一项所述的病毒，其中所述重组酶应答性反转盒(RRIC)进一步包括内含子的一部分。
实施例68.根据实施例67所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的多核苷酸在通过mRNA剪接去除所述内含子之后产生所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的不具有所述重组酶识别位点的成熟病毒基因组转录物。
实施例69.根据实施例1到68中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒进一步包括编码所述重组酶的多核苷酸。
实施例70.根据实施例69所述的病毒，其中所述重组酶是翻转酶(Flp)或Cre重组酶(Cre)。
实施例71.根据实施例69或70所述的病毒，其中所述重组酶的编码区包括内含子。
实施例72.根据实施例69到71中任一项所述的病毒，其中所述重组酶重组酶的表达盒包括一个或多个mRNA去稳定化元件。
实施例73.根据实施例69到72中任一项所述的病毒，其中所述重组酶是包括另外的多肽的融合蛋白的一部分，并且其中所述另外的多肽调节所述重组酶的活性和/或细胞定位。
实施例74.根据实施例73所述的病毒，其中所述重组酶的活性和/或细胞定位通过配体和/或小分子的存在进行调节。
实施例75.根据实施例73或74所述的病毒，其中所述另外的多肽包括雌激素受体蛋白的配体结合结构域。
实施例76.根据实施例53到75中任一项所述的病毒实施例，其中所述一个或多个重组酶识别位点是翻转酶识别靶(FRT)位点。
实施例77.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55和57到76中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
实施例78.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54和56到76中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
实施例79.一种重组初级溶瘤病毒，其包括：
编码次级溶瘤病毒的第一多核苷酸；以及
编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。
实施例80.一种重组初级病毒，其包括：
编码次级病毒的第一多核苷酸；以及
编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。
实施例81.根据实施例79所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。
实施例82.根据实施例80所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。
实施例83.根据实施例79到82中任一项所述的病毒，其中所述第一多核苷酸与第一可调节启动子可操作地连接，并且其中所述第二多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。
实施例84.根据实施例79、81和83中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
实施例85.根据实施例80、82和83中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
实施例86.根据实施例79、81、83和84中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
实施例87.根据实施例80、82、83和85中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
实施例88.根据实施例86或87所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒或痘病毒科病毒，任选地其中所述痘病毒科病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。
实施例89.根据实施例79、81、83和84中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是RNA病毒。
实施例90.根据实施例80、82、83和85中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是RNA病毒。
实施例91.根据实施例89或90所述的病毒，其中所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
实施例92.根据实施例79、81、83、84、86、88、89和91中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
实施例93.根据实施例80、82、83、85、87、88和90到91中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
实施例94.根据实施例92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述负义ssRNA病毒，并且其中所述负义ssRNA病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的病毒，任选地：
其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒；
其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹；或者
其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。
实施例95根据实施例92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是肠道病毒，任选地其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(SVV)、柯萨奇病毒或艾柯病毒，任选地其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)，任选地其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。
实施例96.根据实施例92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或门戈病毒。
实施例97.根据实施例92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒，任选地其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒，并且任选地其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒或马雅罗病毒。
实施例98.根据实施例79、81、83、84、86、88、89、91到92和94到97中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。
实施例99.根据实施例80、82、83、85、87、88、90到91和93到97中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。
实施例100.根据实施例79、81、83、84、86、88、89、91到92和94到98中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。
实施例101.根据实施例80、82、83、85、87、88、90到91、93到97和99中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。
实施例102.根据实施例79到101中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子和所述第二可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素依赖性启动子。
实施例103.根据实施例79到102中任一项所述的病毒，其进一步包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码能够与所述第一可调节启动子结合的第一肽和能够与所述第二可调节启动子结合的第二肽。
实施例104.根据实施例103所述的病毒，其中所述第三多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
实施例105.根据实施例104所述的病毒，其中所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
实施例106.根据实施例103到105中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第一肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
实施例107.根据实施例103到106中任一项所述的病毒，其中所述第二可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第二肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
实施例108.根据实施例103到106中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第一肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
实施例109.根据实施例103到108中任一项所述的病毒，其中所述第二可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第二肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
实施例110.根据实施例79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100和102到109中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒的复制。
实施例111.根据实施例80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99和101到109中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级病毒的复制。
实施例112.根据实施例110或111所述的病毒，其中所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
实施例113.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110和112中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。
实施例114.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109和111到112中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。
实施例115.根据实施例113或114所述的病毒，其中所述第一核酶编码序列和所述第二核酶编码序列编码锤头状核酶或丁型肝炎病毒核酶。
实施例116.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113和115中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例117.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114和115中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例118.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113和115到116中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例119.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115和117中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例120.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113、115到116和118中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例121.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115、117和119中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
实施例122.根据实施例116、118和120中任一项所述的病毒，其中细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒的复制。
实施例123.根据实施例117、119和121中任一项所述的病毒，其中细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级病毒和/或所述次级病毒的复制。
实施例124.根据实施例1到123中任一项所述的病毒，其进一步包括编码至少一种外源性有效负载蛋白的多核苷酸序列。
实施例125.根据实施例124所述的病毒，其中所述外源性有效负载蛋白是荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子或抗原结合分子。
实施例126.根据实施例1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113、115到116、118、120、122和124到125中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒的表达由外源性药剂调节。
实施例127.根据实施例2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115、117、119、121和123到125中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒的表达由外源性药剂调节。
实施例128.根据实施例126或127所述的病毒，其中所述外源性药剂是肽、激素或小分子。
实施例129.一种组合物，其包括根据实施例1到128中任一项所述的病毒。
实施例130.一种杀死肿瘤细胞群体的方法，所述方法包括将根据实施例1到128中任一项所述的病毒或根据实施例129所述的组合物施用于所述肿瘤细胞群体。
实施例131.根据实施例130所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级溶瘤病毒感染并杀死。
实施例132.根据实施例130或131所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级溶瘤病毒感染并杀死。
实施例133.根据实施例130到132中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞的亚群被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒两者感染并杀死。
实施例134.根据实施例130到133中任一项所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。
实施例135.根据实施例130到134中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例136.根据实施例135所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例137.根据实施例135所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例138.根据实施例137所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
实施例139.根据实施例135到138中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
实施例140.根据实施例130所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级病毒感染并杀死。
实施例141.根据实施例130或140所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级病毒感染并杀死。
实施例142.根据实施例130、140和141中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞的亚群被所述初级病毒和所述次级病毒两者感染并杀死。
实施例143.根据实施例130和140到142中任一项所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。
实施例144.根据实施例130和140到143中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。
实施例145.根据实施例144所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。
实施例146.根据实施例145所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。
实施例147.根据实施例146所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
实施例148.根据实施例144到147中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
实施例149.一种治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1到128中任一项所述的病毒或根据实施例129所述的组合物。
实施例150.根据实施例149所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。
实施例151.根据实施例149或150所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。
实施例152.根据实施例149到151中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。
实施例153.根据实施例149到152中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级溶瘤病毒的免疫应答降低。
实施例154.根据实施例149到153中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级溶瘤病毒的免疫应答降低。
实施例155.根据实施例149到154中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。
实施例156.根据实施例149到155中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级溶瘤病毒。
实施例157.根据实施例149到156中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级溶瘤病毒。
实施例158.根据实施例149到157中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。
实施例159.根据实施例149到158中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。
实施例160.根据实施例149到159中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例161.根据实施例160所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例162.根据实施例160所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。
实施例163.根据实施例162所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
实施例164.根据实施例160到163中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
实施例165.根据实施例149所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。
实施例166.根据实施例149或165所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。
实施例167.根据实施例149、165和166中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。
实施例168.根据实施例149和165到167中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级病毒的免疫应答降低。
实施例169.根据实施例149和165到168中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级病毒的免疫应答降低。
实施例170.根据实施例149和165到169中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。
实施例171.根据实施例149和165到170中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级病毒。
实施例172.根据实施例149和165到171中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级病毒。
实施例173.根据实施例149和165到172中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。
实施例174.根据实施例149、165到173中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。
实施例175.根据实施例149和165到174中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。
实施例176.根据实施例175所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。
实施例177.根据实施例175所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。
实施例178.根据实施例177所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
实施例179.根据实施例175到178中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
实施例180.一种多核苷酸，其编码根据实施例1到128所述的病毒。
实施例181.一种载体，其包括根据实施例180所述的多核苷酸。
实施例182.一种药物组合物，其包括根据实施例181所述的载体。
通过引用并入
出于所有目的，本文中引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过全文引用的方式并入本文。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。
序列表
<110> 昂克诺斯公司（Oncorus, Inc.）
爱德华·M·肯尼迪 (Kennedy, Edward M.)
洛伦娜·勒纳 (Lerner, Lorena)
克里斯托夫·奎瓦 (Queva, Cristophe)
克雷格·A·斯特拉斯迪 (Strathdee, Craig A.)
珍妮弗·S·李 (Lee, Jennifer S.)
<120> 双重病毒和双重溶瘤病毒以及治疗方法
<130> ONCR-013/01WO 324865-2233
<150> US 62/913,514
<151> 2019-10-10
<160> 914
<170> PatentIn 3.5版
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uggaguguga caaugguguu ug 22
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<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
uuuccggcuc gcgugggugu gu 22
<210> 51
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
cacuguaggu gauggugaga gugggca 27
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
auauacaggg ggagacucuu au 22
<210> 53
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
auauacaggg ggagacucuc au 22
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
agaggauacc cuuuguaugu u 21
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
gggaugguag accggugacg ugc 23
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
uaggacacau ggucuacuuc u 21
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
cuccugagcc auucugagcc uc 22
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
gugccagcug caguggggga g 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
cccggagcca ggaugcagcu c 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
ucguggccug gucuccauua u 21
<210> 61
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
ucugcagggu uugcuuugag 20
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
uguucaugua gauguuuaag c 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
ccccaccucc ucucuccuca g 21
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
gugaggacuc gggaggugg 19
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
ucaccagccc uguguucccu ag 22
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
ucacaccugc cucgcccccc 20
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
ugagcccugu ccucccgcag 20
<210> 68
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
ucggccugac cacccacccc ac 22
<210> 69
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
ccucuucccc uugucucucc ag 22
<210> 70
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
aaguaguugg uuuguaugag augguu 26
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
aagugaucua aaggccuaca u 21
<210> 72
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
ucagaugauc uaaaggccua ua 22
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
uaggccuuua gaucacuuaa a 21
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 74
aauggauuuu uggagcagg 19
<210> 75
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 75
acccgucccg uucguccccg ga 22
<210> 76
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 76
accuucuugu auaagcacug ugcuaaa 27
<210> 77
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 77
acgcccuucc cccccuucuu ca 22
<210> 78
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 78
aggagggagg agaugggcca aguu 24
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 79
acggugcugg auguggccuu u 21
<210> 80
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 80
agaaggaaau ugaauucauu ua 22
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 81
agagaagaag aucagccugc a 21
<210> 82
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 82
agccuggaag cuggagccug cagu 24
<210> 83
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 83
aggaugagca aagaaaguag auu 23
<210> 84
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 84
cggaugagca aagaaagugg uu 22
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 85
agugaaugau ggguucugac c 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 86
aguuaggauu aggucgugga a 21
<210> 87
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 87
acaggugagg uucuugggag cc 22
<210> 88
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 88
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 89
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 89
aucccaccuc ugccacca 18
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 90
aucccaccac ugccaccau 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 91
auggauaagg cuuuggcuu 19
<210> 92
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 92
augggugaau uuguagaagg au 22
<210> 93
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
caagucuuau uugagcaccu guu 23
<210> 94
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
ccucagggcu guagaacagg gcu 23
<210> 95
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 95
cgggcguggu gguggggg 18
<210> 96
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 96
cgggcguggu ggugggggug 20
<210> 97
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 97
cuggacugag ccgugcuacu gg 22
<210> 98
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
cuggacugag ccaugcuacu gg 22
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 99
cuggagauau ggaagagcug ugu 23
<210> 100
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 100
agugccugcu augugccagg ca 22
<210> 101
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
cuuggcaccu agcaagcacu ca 22
<210> 102
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 102
gaugaugaug gcagcaaauu cugaaa 26
<210> 103
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 103
ggcgacaaaa cgagacccug uc 22
<210> 104
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 104
gugggggaga ggcuguc 17
<210> 105
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 105
cugaagcuca gagggcucug au 22
<210> 106
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 106
uaaagagccc uguggagaca 20
<210> 107
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 107
uacguagaua uauauguauu uu 22
<210> 108
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 108
uaguacugug cauaucaucu au 22
<210> 109
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 109
ucauauugcu ucuuucu 17
<210> 110
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 110
ucgccuccuc cucuccc 17
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 111
cggggccgua gcacugucug aga 23
<210> 112
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 112
gggggccgau acacuguacg aga 23
<210> 113
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 113
ucuacaaagg aaagcgcuuu cu 22
<210> 114
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 114
ucugggcaac aaagugagac cu 22
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 115
gaucucacuu uguugcccag g 21
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 116
ugcaggacca agaugagccc u 21
<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 117
cucuagccac agaugcagug au 22
<210> 118
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 118
ugcuggauca gugguucgag uc 22
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 119
uggacugccc ugaucuggag a 21
<210> 120
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 120
uggaguccag gaaucugcau uuu 23
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 121
uggauuuuug gaucaggga 19
<210> 122
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 122
uggcccugac ugaagaccag cagu 24
<210> 123
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 123
aagcccuuac cccaaaaagc au 22
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 124
uggguggucu ggagauuugu gc 22
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 125
uuaggccgca gaucugggug a 21
<210> 126
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 126
gaguggggcu ucgacccuaa cc 22
<210> 127
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 127
uuagggcccu ggcuccaucu cc 22
<210> 128
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 128
uucaaguaau ucaggug 17
<210> 129
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 129
uucauucggc uguccagaug ua 22
<210> 130
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 130
uucuggaauu cugugugagg ga 22
<210> 131
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 131
uugcagcugc cugggaguga cuuc 24
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 132
uugggacaua cuuaugcuaa a 21
<210> 133
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 133
uuuagagacg gggucuugcu cu 22
<210> 134
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 134
ucucacugua gccucgaacc cc 22
<210> 135
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 135
uuugaggcua cagugagaug ug 22
<210> 136
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 136
uuuucaacuc uaaugggaga ga 22
<210> 137
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 137
acguuggcuc ugguggug 18
<210> 138
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 138
ccaccucccc ugcaaacguc ca 22
<210> 139
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 139
acucggcgug gcgucggucg ug 22
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 140
ucgaccggac cucgaccggc u 21
<210> 141
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 141
cagugcaaug uuaaaagggc au 22
<210> 142
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 142
cagugcaaug augaaagggc au 22
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 143
gaugaugcug cugaugcug 19
<210> 144
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 144
ucaaaacuga ggggcauuuu cu 22
<210> 145
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 145
uaacagucua cagccauggu cg 22
<210> 146
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 146
agcugguaaa auggaaccaa au 22
<210> 147
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 147
ugugacuggu ugaccagagg gg 22
<210> 148
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 148
uauggcuuuu uauuccuaug uga 23
<210> 149
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 149
uauggcuuuu cauuccuaug uga 23
<210> 150
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 150
acuccauuug uuuugaugau gga 23
<210> 151
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 151
agcugguguu gugaaucagg ccg 23
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 152
uggagacgcg gcccuguugg agu 23
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 153
ucuacagugc acgugucucc agu 23
<210> 154
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 154
uaccacaggg uagaaccacg g 21
<210> 155
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 155
cagugguuuu acccuauggu ag 22
<210> 156
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 156
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 157
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 157
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 158
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 159
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 159
uacaguauag augauguacu 20
<210> 160
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 160
cucggcgcgg ggcgcgggcu cc 22
<210> 161
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 161
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 162
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 162
ugcccugugg acucaguucu gg 22
<210> 163
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 163
ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 164
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 164
guguguggaa augcuucugc 20
<210> 165
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 165
gugugcggaa augcuucugc ua 22
<210> 166
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 166
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210> 167
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 167
ucagugcauc acagaacuuu gu 22
<210> 168
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 168
ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23
<210> 169
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 169
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 170
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 170
cuagacugaa gcuccuugag g 21
<210> 171
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 171
ucgaggagcu cacagucuag u 21
<210> 172
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 172
ucgaggagcu cacagucu 18
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 173
ucagugcaug acagaacuug g 21
<210> 174
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 174
agguucugug auacacuccg acu 23
<210> 175
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 175
uugcauaguc acaaaaguga uc 22
<210> 176
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 176
aaaaccgucu aguuacaguu gu 22
<210> 177
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 177
uagguuaucc guguugccuu cg 22
<210> 178
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 178
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 179
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 179
uagcagcaca uaaugguuug ug 22
<210> 180
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 180
uagcagcaca ucaugguuua ca 22
<210> 181
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 181
acauacuucu uuauaugccc au 22
<210> 182
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 182
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 183
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 183
accacugacc guugacugua cc 22
<210> 184
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 184
accaucgacc guugauugua cc 22
<210> 185
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 185
aacauucaac gcugucggug agu 23
<210> 186
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 186
cucacugauc aaugaaugca 20
<210> 187
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 187
aacauucauu gcugucggug ggu 23
<210> 188
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 188
aacauucaac cugucgguga gu 22
<210> 189
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 189
ccaccggggg augaauguca c 21
<210> 190
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 190
ugguucuaga cuugccaacu a 21
<210> 191
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 191
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 192
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 192
ugaggcagua gauugaau 18
<210> 193
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 193
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 194
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 194
uggagagaaa ggcaguuccu ga 22
<210> 195
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 195
caaagaauuc uccuuuuggg cu 22
<210> 196
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 196
ucgugucuug uguugcagcc gg 22
<210> 197
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 197
cucccacaug caggguuugc a 21
<210> 198
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 198
caucccuugc augguggagg g 21
<210> 199
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 199
uaaggugcau cuagugcaga uag 23
<210> 200
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 200
uaaggugcau cuagugcagu uag 23
<210> 201
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 201
ccggccgccg gcuccgcccc g 21
<210> 202
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 202
cggcggggac ggcgauuggu c 21
<210> 203
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 203
cgcaggggcc gggugcucac cg 22
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 204
cuauauauca aacauauucc u 21
<210> 205
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 205
ugauauguuu gauauauuag gu 22
<210> 206
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 206
ugauauguuu gauauugggu u 21
<210> 207
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 207
gaggcagaag caggaugaca 20
<210> 208
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 208
ccaguccugu gccugccgcc u 21
<210> 209
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 209
ccccagggcg acgcggcggg 20
<210> 210
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 210
caacggaauc ccaaaagcag cug 23
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 211
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 212
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 212
aacuggccua caaaguccca gu 22
<210> 213
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 213
ugggucuuug cgggcgagau ga 22
<210> 214
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 214
aacuggcccu caaagucccg cu 22
<210> 215
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 215
uguaacagca acuccaugug ga 22
<210> 216
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 216
uagcagcaca gaaauauugg c 21
<210> 217
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 217
cggcaacaag aaacugccug ag 22
<210> 218
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 218
uagguaguuu cauguuguug gg 22
<210> 219
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 219
uagguaguuu ccuguuguug gg 22
<210> 220
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 220
ucaggccagg cacaguggcu ca 22
<210> 221
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 221
accgugcaaa gguagcaua 19
<210> 222
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 222
uucaccaccu ucuccaccca gc 22
<210> 223
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 223
cggguagaga gggcaguggg agg 23
<210> 224
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 224
ccuccugccc uccuugcugu 20
<210> 225
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 225
gguccagagg ggagauaggu uc 22
<210> 226
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 226
cccaguguuu agacuaucug uuc 23
<210> 227
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 227
ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23
<210> 228
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 228
ugugcaaauc caugcaaaac uga 23
<210> 229
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 229
uaacacuguc ugguaacgau gu 22
<210> 230
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 230
uaauacugcc ugguaaugau ga 22
<210> 231
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 231
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 232
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 232
agagguauag ggcaugggaa 20
<210> 233
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 233
gugaaauguu uaggaccacu ag 22
<210> 234
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 234
agugguucuu aacaguucaa caguu 25
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 235
guguuaauua aaccucuauu uac 23
<210> 236
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 236
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 237
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 237
uggaauguaa ggaagugugu gg 22
<210> 238
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 238
auaagacgag caaaaagcuu gu 22
<210> 239
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 239
aagcuuuuug cucgaauuau gu 22
<210> 240
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 240
uaaagugcuu auagugcagg uag 23
<210> 241
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 241
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 242
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 242
agccccugcc caccgcacac ug 22
<210> 243
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 243
uuggggaaac ggccgcugag ug 22
<210> 244
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 244
auuugugcuu ggcucuguca c 21
<210> 245
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 245
gcagggacag caaaggggug c 21
<210> 246
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 246
uucccuuugu cauccuucgc cu 22
<210> 247
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 247
gguucuuagc auaggagguc u 21
<210> 248
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 248
uguucucuuu gccaaggaca g 21
<210> 249
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 249
uaacagucuc cagucacggc c 21
<210> 250
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 250
augaccuaug aauugacaga c 21
<210> 251
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 251
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 252
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 252
uaaucucagc uggcaacugu ga 22
<210> 253
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 253
aaaucucugc aggcaaaugu ga 22
<210> 254
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 254
uugugcuuga ucuaaccaug u 21
<210> 255
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 255
agaguugagu cuggacgucc cg 22
<210> 256
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 256
agaauugugg cuggacaucu gu 22
<210> 257
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 257
agaauugcgu uuggacaauc agu 23
<210> 258
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 258
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 259
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 259
accuggcaua caauguagau uu 22
<210> 260
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 260
agcuacaucu ggcuacuggg u 21
<210> 261
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 261
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 262
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 262
caagucacua gugguuccgu u 21
<210> 263
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 263
gagagcagug uguguugccu gg 22
<210> 264
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 264
aucacauugc cagggauuuc c 21
<210> 265
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 265
aucacauugc cagggauuac c 21
<210> 266
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 266
aucacauugc cagugauuac cc 22
<210> 267
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 267
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 268
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 268
cauugcacuu gucucggucu ga 22
<210> 269
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 269
aggcggagac uugggcaauu g 21
<210> 270
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 270
caggcaguga cuguucagac guc 23
<210> 271
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 271
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 272
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 272
uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 273
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 273
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 274
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 274
uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 275
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 275
cacuagauug ugagcuccug ga 22
<210> 276
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 276
aaggagcuca cagucuauug ag 22
<210> 277
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 277
gaggguuggg uggaggcucu cc 22
<210> 278
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 278
agggcccccc cucaauccug u 21
<210> 279
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 279
auguaugugu gcaugugcau g 21
<210> 280
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 280
agcagaagca gggagguucu ccca 24
<210> 281
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 281
uaugugggau gguaaaccgc uu 22
<210> 282
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 282
ugguuuaccg ucccacauac au 22
<210> 283
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 283
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 284
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 284
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 285
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 285
uagcaccauu ugaaaucggu ua 22
<210> 286
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 286
uauacaaggg cagacucucu cu 22
<210> 287
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 287
cagugcaaua guauugucaa agc 23
<210> 288
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 288
gcucugacuu uauugcacua cu 22
<210> 289
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 289
cagugcaaug auauugucaa agc 23
<210> 290
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 290
gcucugacga gguugcacua cu 22
<210> 291
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 291
uaagugcuuc cauguuuugg uga 23
<210> 292
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 292
acuuaaacgu ggauguacuu gcu 23
<210> 293
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 293
uaagugcuuc cauguuuuag uag 23
<210> 294
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 294
uaagugcuuc cauguuucag ugg 23
<210> 295
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 295
uaagugcuuc cauguuugag ugu 23
<210> 296
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 296
uaagugcuuc caugcuu 17
<210> 297
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 297
uaauugcuuc cauguuu 17
<210> 298
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 298
ucagcaccag gauauuguug gag 23
<210> 299
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 299
ucaacaaaau cacugaugcu gga 23
<210> 300
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 300
gauaucagcu caguaggcac cg 22
<210> 301
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 301
cuuucagucg gauguuugca gc 22
<210> 302
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 302
uguaaacauc cucgacugga ag 22
<210> 303
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 303
uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210> 304
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 304
uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 305
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 305
uguaaacauc cccgacugga ag 22
<210> 306
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 306
cuuucagucg gauguuuaca gc 22
<210> 307
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 307
uguaaacauc cuugacugga ag 22
<210> 308
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 308
aucagggcuu guggaauggg aag 23
<210> 309
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 309
gcugcaccgg agacugggua a 21
<210> 310
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 310
ucgaggacug guggaagggc cuu 23
<210> 311
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 311
cugacugaau agguaggguc auu 23
<210> 312
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 312
agcuuuuggg aauucaggua gu 22
<210> 313
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 313
accugaauua ccaaaagcuu u 21
<210> 314
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 314
auauaccugu ucggucucuu ua 22
<210> 315
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 315
aggggaccaa agagauauau ag 22
<210> 316
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 316
gguugggcag ugaggagggu guga 24
<210> 317
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 317
ugaggagauc gucgagguug g 21
<210> 318
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 318
gguggggcaa ugggaucagg u 21
<210> 319
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 319
aagggcuucc ucucugcagg ac 22
<210> 320
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 320
aggcaagaug cuggcauagc u 21
<210> 321
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 321
cugauaagaa cagaggccca gau 23
<210> 322
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 322
ugugacuuua agggaaaugg cg 22
<210> 323
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 323
gaguucuaca gucagac 17
<210> 324
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 324
agaaggggug aaauuuaaac gu 22
<210> 325
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 325
uggggcggag cuuccggag 19
<210> 326
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 326
uggggcggag cuuccggagg cc 22
<210> 327
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 327
cuuccagacg cuccgcccca cgucg 25
<210> 328
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 328
gcuucuguag uguaguc 17
<210> 329
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 329
agaagaaggc ggucggucug cgg 23
<210> 330
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 330
uguggaaggu agacggccag aga 23
<210> 331
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 331
ucugggaggu uguagcagug gaa 23
<210> 332
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 332
cgcgccgggc ccggguu 17
<210> 333
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 333
cggggcggca ggggccuc 18
<210> 334
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 334
uggaagggag aagagcuuua au 22
<210> 335
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 335
aaaagcuggg uugagagggc ga 22
<210> 336
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 336
aaaagcuggg uugagagggc aa 22
<210> 337
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 337
aaaagcuggg uugagagggu 20
<210> 338
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 338
aaaagcuggg uugagagga 19
<210> 339
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 339
aaagcugggu ugagaagg 18
<210> 340
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 340
cacauuacac ggucgaccuc u 21
<210> 341
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 341
aggugguccg uggcgcguuc gc 22
<210> 342
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 342
cccaauacac ggucgaccuc uu 22
<210> 343
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 343
agguuguccg uggugaguuc gca 23
<210> 344
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 344
acugccccag gugcugcugg 20
<210> 345
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 345
cgcauccccu agggcauugg ugu 23
<210> 346
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 346
ccuaguaggu guccaguaag ugu 23
<210> 347
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 347
uauugcacau uacuaaguug ca 22
<210> 348
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 348
ccucugggcc cuuccuccag 20
<210> 349
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 349
cuggcccucu cugcccuucc gu 22
<210> 350
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 350
gggggggcag gaggggcuca ggg 23
<210> 351
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 351
aacacaccug guuaaccucu uu 22
<210> 352
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 352
gagguuuucu ggguuucugu uuc 23
<210> 353
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 353
gcaaagcaca cggccugcag aga 23
<210> 354
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 354
ucucugggcc ugugucuuag gc 22
<210> 355
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 355
gccccugggc cuauccuaga a 21
<210> 356
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 356
cuagguaugg ucccagggau cc 22
<210> 357
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 357
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23
<210> 358
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 358
cuccuauaug augccuuucu uc 22
<210> 359
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 359
gaacggcuuc auacaggagu u 21
<210> 360
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 360
aacaauaucc uggugcugag ug 22
<210> 361
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 361
ugagcgccuc gacgacagag ccg 23
<210> 362
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 362
ucccuguccu ccaggagcuc acg 23
<210> 363
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 363
gugcauugua guugcauugc a 21
<210> 364
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 364
gugcauugcu guugcauugc 20
<210> 365
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 365
uuauaaagca augagacuga uu 22
<210> 366
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 366
ucucacacag aaaucgcacc cgu 23
<210> 367
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 367
aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 368
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 368
gcccugaacg aggggucugg ag 22
<210> 369
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 369
gcugacuccu aguccagggc uc 22
<210> 370
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 370
ugucugcccg caugccugcc ucu 23
<210> 371
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 371
caaucacuaa cuccacugcc au 22
<210> 372
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 372
aaucacuaac cacacggcca gg 22
<210> 373
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 373
aggcagugua guuagcugau ugc 23
<210> 374
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 374
ccuccguguu accuguccuc uag 23
<210> 375
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 375
ugaggaugga uagcaaggaa gcc 23
<210> 376
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 376
acaaaaaaaa aagcccaacc cuuc 24
<210> 377
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 377
uguuguacuu uuuuuuuugu uc 22
<210> 378
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 378
ucccccaggu gugauucuga uuu 23
<210> 379
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 379
uagccuucag aucuuggugu uuu 23
<210> 380
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 380
ccacuuggau cugaaggcug ccc 23
<210> 381
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 381
ucucucggcu ccucgcggcu c 21
<210> 382
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 382
uuaucagaau cuccaggggu ac 22
<210> 383
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 383
aacacaccua uucaaggauu ca 22
<210> 384
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 384
aauccuugga accuaggugu gagu 24
<210> 385
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 385
aauugcacgg uauccaucug ua 22
<210> 386
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 386
cggguggauc acgaugcaau uu 22
<210> 387
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 387
uaaugccccu aaaaauccuu au 22
<210> 388
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 388
agggacuuuc aggggcagcu gu 22
<210> 389
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 389
aauugcacuu uagcaauggu ga 22
<210> 390
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 390
accuggaccc agcguagaca aag 23
<210> 391
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 391
aauaauacau gguugaucuu u 21
<210> 392
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 392
agaucgaccg uguuauauuc gc 22
<210> 393
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 393
gccugcuggg guggaaccug gu 22
<210> 394
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 394
caggucacgu cucugcaguu ac 22
<210> 395
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 395
acucaaacug ugggggcacu 20
<210> 396
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 396
acucaaaaga uggcggcacu uu 22
<210> 397
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 397
aaagugcugc gacauuugag cgu 23
<210> 398
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 398
gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23
<210> 399
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 399
cuuaucagau uguauuguaa uu 22
<210> 400
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 400
uuauaauaca accugauaag ug 22
<210> 401
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 401
auauaauaca accugcuaag ug 22
<210> 402
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 402
auaauacaac cugcuaagug cu 22
<210> 403
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 403
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 404
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 404
gguagauuuu ccuucuaugg u 21
<210> 405
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 405
aucauagagg aaaauccacg u 21
<210> 406
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 406
aucauagagg aaaauccaug uu 22
<210> 407
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 407
aacauagagg aaauuccacg u 21
<210> 408
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 408
gguggauauu ccuucuaugu u 21
<210> 409
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 409
aucacacaaa ggcaacuuuu gu 22
<210> 410
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 410
acuggacuug gaggcagaa 19
<210> 411
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 411
acuggacuug gagucagaag agugg 25
<210> 412
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 412
acuggacuug gagucagaaa 20
<210> 413
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 413
acuggacuug gagucagga 19
<210> 414
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 414
acuggacuug gagccagaag 20
<210> 415
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 415
acugggcuug gagucagaag 20
<210> 416
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 416
acuggacuug gugucagaug g 21
<210> 417
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 417
acuggacuag gagucagaag g 21
<210> 418
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 418
ugguagacua uggaacguag g 21
<210> 419
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 419
uauguaauau gguccacauc uu 22
<210> 420
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 420
uauacaaggg caagcucucu gu 22
<210> 421
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 421
agcgagguug cccuuuguau au 22
<210> 422
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 422
aaucauucac ggacaacacu u 21
<210> 423
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 423
gaaguuguuc gugguggauu cg 22
<210> 424
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 424
agaucagaag gugauugugg cu 22
<210> 425
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 425
auuccuagaa auuguucaua 20
<210> 426
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 426
aagaggaaga aauggcuggu ucucag 26
<210> 427
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 427
acagggccgc agauggagac u 21
<210> 428
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 428
ggaggaaccu uggagcuucg gc 22
<210> 429
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 429
ucaggugugg aaacugaggc ag 22
<210> 430
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 430
gaauguugcu cggugaaccc cu 22
<210> 431
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 431
agguuacccg agcaacuuug cau 23
<210> 432
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 432
aauauaacac agauggccug u 21
<210> 433
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 433
uaguagaccg uauagcguac g 21
<210> 434
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 434
acuucaccug guccacuagc cgu 23
<210> 435
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 435
aucaacagac auuaauuggg cgc 23
<210> 436
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 436
acuggacuua gggucagaag gc 22
<210> 437
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 437
agcucggucu gaggccccuc agu 23
<210> 438
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 438
ugaggggcag agagcgagac uuu 23
<210> 439
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 439
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
<210> 440
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 440
aaugacacga ucacucccgu uga 23
<210> 441
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 441
gggcucacau caccccau 18
<210> 442
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 442
accccacucc ugguacc 17
<210> 443
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 443
uaauacuguc ugguaaaacc gu 22
<210> 444
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 444
ugucuugcag gccgucaugc a 21
<210> 445
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 445
ucuuggagua ggucauuggg ugg 23
<210> 446
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 446
aucaugaugg gcuccucggu gu 22
<210> 447
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 447
uacggugagc cugucauuau uc 22
<210> 448
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 448
accugucugu ggaaaggagc ua 22
<210> 449
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 449
uguugggauu cagcaggacc au 22
<210> 450
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 450
gcgacucuga aaacuagaag gu 22
<210> 451
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 451
auggccagag cucacacaga gg 22
<210> 452
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 452
uuggaggcgu ggguuuu 17
<210> 453
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 453
ggcuccuugg ucuaggggua 20
<210> 454
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 454
ugguagagcu gaggaca 17
<210> 455
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 455
ggauccgagu cacggcacca 20
<210> 456
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 456
agggugugug uguuuuu 17
<210> 457
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 457
agagguaggu guggaagaa 19
<210> 458
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 458
gauugagacu aguagggcua ggc 23
<210> 459
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 459
uugcauaugu aggauguccc au 22
<210> 460
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 460
uaacggccgc gguacccuaa 20
<210> 461
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 461
agggggcggg cuccggcg 18
<210> 462
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 462
uggcagugua uuguuagcug gu 22
<210> 463
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 463
aggcagugua uuguuagcug gc 22
<210> 464
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 464
uaggcagugu auugcuagcg gcugu 25
<210> 465
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 465
auugggaaca uuuugcaugu au 22
<210> 466
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 466
auuggggaca uuuugcauuc au 22
<210> 467
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 467
uuuugcgaug uguuccuaau au 22
<210> 468
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 468
uugggaucau uuugcaucca ua 22
<210> 469
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 469
uuuugcaaua uguuccugaa ua 22
<210> 470
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 470
gggagaaggg ucggggc 17
<210> 471
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 471
gcuaaggaag uccugugcuc ag 22
<210> 472
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 472
auagcagcau gaaccugucu ca 22
<210> 473
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 473
aacuguuugc agaggaaacu ga 22
<210> 474
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 474
auggagaagg cuucuga 17
<210> 475
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 475
ccccggggag cccggcg 17
<210> 476
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 476
ucgugcauau aucuaccaca u 21
<210> 477
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 477
ugugguagau auaugcacga u 21
<210> 478
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 478
uagugcaaua uugcuuauag ggu 23
<210> 479
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 479
gcaguccaug ggcauauaca c 21
<210> 480
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 480
uaugugccuu uggacuacau cg 22
<210> 481
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 481
gaagauggug cugugcugag gaa 23
<210> 482
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 482
agcccgcccc agccgagguu cu 22
<210> 483
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 483
gccccggcgc gggcggguuc ugg 23
<210> 484
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 484
cgggcugucc ggaggggucg gcu 23
<210> 485
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 485
uuucccuuca gagccuggcu uu 22
<210> 486
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 486
gaugcgccgc ccacugcccc gcgc 24
<210> 487
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 487
gcgggggugg cggcggcauc cc 22
<210> 488
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 488
cggugagcgc ucgcuggc 18
<210> 489
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 489
ucacuccucu ccucccgucu u 21
<210> 490
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 490
aagacgggag gaaagaaggg ag 22
<210> 491
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 491
ucaggcucag uccccucccg au 22
<210> 492
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 492
gucauacacg gcucuccucu cu 22
<210> 493
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 493
agaggcuggc cgugaugaau uc 22
<210> 494
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 494
cggggcagcu caguacagga u 21
<210> 495
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 495
aaucauacag ggacauccag uu 22
<210> 496
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 496
aaucguacag ggucauccac uu 22
<210> 497
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 497
gugguuaucc cuguccuguu cg 22
<210> 498
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 498
uugaaaggcu auuucuuggu c 21
<210> 499
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 499
gugacaucac auauacggca gc 22
<210> 500
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 500
caaccuggag gacuccaugc ug 22
<210> 501
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 501
ccauggaucu ccaggugggu 20
<210> 502
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 502
cuuaugcaag auucccuucu ac 22
<210> 503
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 503
aguggggaac ccuuccauga gg 22
<210> 504
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 504
aggaccugcg ggacaagauu cuu 23
<210> 505
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 505
ugaaggucua cugugugcca gg 22
<210> 506
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 506
ugaaacauac acgggaaacc uc 22
<210> 507
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 507
agguuguccg uguugucuuc ucu 23
<210> 508
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 508
aaacaaacau ggugcacuuc uu 22
<210> 509
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 509
gaaguugccc auguuauuuu cg 22
<210> 510
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 510
ugaguauuac auggccaauc uc 22
<210> 511
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 511
cagcagcaca cugugguuug u 21
<210> 512
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 512
uuucaagcca gggggcguuu uuc 23
<210> 513
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 513
aacaucacag caagucugug cu 22
<210> 514
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 514
uuaagacuug cagugauguu u 21
<210> 515
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 515
aacaucacug caagucuuaa ca 22
<210> 516
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 516
acagacuugc ugugauguuc a 21
<210> 517
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 517
uucugccucu guccaggucc uu 22
<210> 518
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 518
agggcuggac ucagcggcgg agcu 24
<210> 519
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 519
uaauccuugc uaccugggug aga 23
<210> 520
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 520
uuuugugucu cccauucccc ag 22
<210> 521
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 521
agggggaugg cagagcaaaa uu 22
<210> 522
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 522
aaugcacccg ggcaaggauu cu 22
<210> 523
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 523
aaugcaccug ggcaaggauu ca 22
<210> 524
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 524
auccuugcua ucugggugcu a 21
<210> 525
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 525
gggguauugu uuccgcugcc agg 23
<210> 526
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 526
uagcagcggg aacaguucug cag 23
<210> 527
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 527
gggagugcag ggcaggguuu c 21
<210> 528
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 528
agacccuggu cugcacucua uc 22
<210> 529
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 529
cgucaacacu ugcugguuuc cu 22
<210> 530
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 530
uaaggcaccc uucugaguag a 21
<210> 531
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 531
uauucaggaa gguguuacuu aa 22
<210> 532
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 532
uuuugcaccu uuuggaguga a 21
<210> 533
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 533
ugauuguagc cuuuuggagu aga 23
<210> 534
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 534
uacuccagag ggcgucacuc aug 23
<210> 535
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 535
uacugcagac guggcaauca ug 22
<210> 536
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 536
ugauugguac gucugugggu ag 22
<210> 537
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 537
uacugcagac aguggcaauc a 21
<210> 538
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 538
auugaaaccu cuaagagugg a 21
<210> 539
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 539
uacucaggag aguggcaauc ac 22
<210> 540
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 540
gugucuuuug cucugcaguc a 21
<210> 541
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 541
aagugcuguc auagcugagg uc 22
<210> 542
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 542
cacucagccu ugagggcacu uuc 23
<210> 543
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 543
uaaauuucac cuuucugaga agg 23
<210> 544
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 544
uucacaggga ggugucau 18
<210> 545
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 545
uucacaagga ggugucauuu au 22
<210> 546
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 546
uaaauuucac cuuucugaga aga 23
<210> 547
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 547
uucucaagga ggugucguuu au 22
<210> 548
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 548
auugacacuu cugugaguag a 21
<210> 549
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 549
uacucuggag agugacaauc aug 23
<210> 550
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 550
auugacaccu cugugagugg a 21
<210> 551
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 551
uucucaagag ggaggcaauc au 22
<210> 552
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 552
gagugccuuc uuuuggagcg uu 22
<210> 553
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 553
uucuccaaaa gaaagcacuu ucug 24
<210> 554
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 554
ugcuuccuuu cagagggu 18
<210> 555
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 555
uucucgagga aagaagcacu uuc 23
<210> 556
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 556
aucuggaggu aagaagcacu uu 22
<210> 557
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 557
aucgugcauc ccuuuagagu gu 22
<210> 558
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 558
aucgugcauc ccuuuagagu gu 22
<210> 559
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 559
aucgugcauc cuuuuagagu gu 22
<210> 560
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 560
caaagcgcuc cccuuuagag gu 22
<210> 561
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 561
caaagcgcuu cucuuuagag ugu 23
<210> 562
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 562
caaagcgcuu cccuuuggag c 21
<210> 563
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 563
aaagcgcuuc ccuucagagu g 21
<210> 564
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 564
gaaagcgcuu cucuuuagag g 21
<210> 565
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 565
ucauccucgu cucccuccca g 21
<210> 566
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 566
agggaagggg acgaggguug gg 22
<210> 567
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 567
aaagugcauc cuuuuagagg uu 22
<210> 568
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 568
cucuagaggg aagcgcuuuc ug 22
<210> 569
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 569
aaagugcauc uuuuuagagg au 22
<210> 570
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 570
caaagugccu cccuuuagag ug 22
<210> 571
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 571
aagugccucc uuuuagagug uu 22
<210> 572
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 572
aaagugcuuc ccuuuggacu gu 22
<210> 573
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 573
cuccagaggg aaguacuuuc u 21
<210> 574
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 574
aaagugcuuc cuuuuagagg g 21
<210> 575
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 575
aaagugcuuc cuuuuagagg gu 22
<210> 576
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 576
aaagugcuuc ucuuuggugg gu 22
<210> 577
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 577
cuacaaaggg aagcccuuuc 20
<210> 578
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 578
aaagugcuuc cuuuuugagg g 21
<210> 579
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 579
aagugcuucc uuuuagaggg uu 22
<210> 580
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 580
acaaagugcu ucccuuuaga gugu 24
<210> 581
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 581
acaaagugcu ucccuuuaga gu 22
<210> 582
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 582
aacgcacuuc ccuuuagagu gu 22
<210> 583
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 583
aaaaugguuc ccuuuagagu gu 22
<210> 584
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 584
gaacgcgcuu cccuauagag ggu 23
<210> 585
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 585
gaaggcgcuu cccuuuggag u 21
<210> 586
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 586
gaaggcgcuu cccuuuagag cg 22
<210> 587
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 587
cuccagaggg augcacuuuc u 21
<210> 588
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 588
cucuagaggg aagcacuuuc ug 22
<210> 589
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 589
cucuugaggg aagcacuuuc ugu 23
<210> 590
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 590
ccucccacac ccaaggcuug ca 22
<210> 591
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 591
caugccuuga guguaggacc gu 22
<210> 592
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 592
aucauacaag gacaauuucu uu 22
<210> 593
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 593
ggagaaauua uccuuggugu gu 22
<210> 594
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 594
uggugggcac agaaucugga cu 22
<210> 595
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 595
ugugacagau ugauaacuga aa 22
<210> 596
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 596
ucggggauca ucaugucacg aga 23
<210> 597
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 597
aaacauucgc ggugcacuuc uu 22
<210> 598
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 598
auucugcauu uuuagcaagu uc 22
<210> 599
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 599
ucagcaaaca uuuauugugu gc 22
<210> 600
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 600
caaaacuggc aauuacuuuu gc 22
<210> 601
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 601
aaaaguaauu gcgaguuuua cc 22
<210> 602
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 602
aaaaaccaca auuacuuuug cacca 25
<210> 603
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 603
gaaaacgaca augacuuuug ca 22
<210> 604
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 604
aaaagugauu gcaguguuug 20
<210> 605
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 605
aaagguaauu gcaguuuuuc cc 22
<210> 606
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 606
aaaaguaacu gcgguuuuug a 21
<210> 607
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 607
aacggcaaug acuuuuguac ca 22
<210> 608
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 608
uaaaacugca guuauuuuug c 21
<210> 609
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 609
aaaaguaauu gcaguuuuug c 21
<210> 610
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 610
caagaaccuc aguugcuuuu gu 22
<210> 611
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 611
aaaaguaauu gcgguuuuug cc 22
<210> 612
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 612
caaaaaccac aguuucuuuu gc 22
<210> 613
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 613
aaaaguaauu gugguuuuug cc 22
<210> 614
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 614
aaaaacugag acuacuuuug ca 22
<210> 615
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 615
caaaagcaau cgcgguuuuu gc 22
<210> 616
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 616
aaaacuguaa uuacuuuugu ac 22
<210> 617
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 617
aaaaguaauc gcgguuuuug uc 22
<210> 618
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 618
aaaaguaauu gcggauuuug cc 22
<210> 619
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 619
caaaaacugc auuacuuuug c 21
<210> 620
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 620
aaaaguaauu gcggucuuug gu 22
<210> 621
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 621
aaaaguacuu gcggauuuug cu 22
<210> 622
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 622
aaaaguauuu gcggguuuug uc 22
<210> 623
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 623
caaagguauu ugugguuuuu g 21
<210> 624
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 624
caaaaguaau uguggauuuu gu 22
<210> 625
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 625
ccaaaacugc aguuacuuuu gc 22
<210> 626
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 626
gcuggugcaa aaguaauggc gg 22
<210> 627
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 627
agcuacaguu acuuuugcac ca 22
<210> 628
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 628
aaaaguaauc acuguuuuug cc 22
<210> 629
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 629
caaaaaccgc aauuacuuuu gca 23
<210> 630
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 630
ugacaacuau ggaugagcuc u 21
<210> 631
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 631
agugccugag ggaguaagag ccc 23
<210> 632
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 632
gcgacccacu cuugguuucc a 21
<210> 633
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 633
gcgacccaua cuugguuuca g 21
<210> 634
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 634
aacaggugac ugguuagaca a 21
<210> 635
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 635
aaaacgguga gauuuuguuu u 21
<210> 636
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 636
gcuaguccug acucagccag u 21
<210> 637
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 637
aggguaagcu gaaccucuga u 21
<210> 638
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 638
auauuaccau uagcucaucu uu 22
<210> 639
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 639
gaugagcuca uuguaauaug ag 22
<210> 640
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 640
caaaguuuaa gauccuugaa gu 22
<210> 641
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 641
aucaaggauc uuaaacuuug cc 22
<210> 642
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 642
aaaguagcug uaccauuugc 20
<210> 643
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 643
agguugacau acguuuccc 19
<210> 644
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 644
aggcacggug ucagcaggc 19
<210> 645
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 645
gggcgccugu gaucccaac 19
<210> 646
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 646
aguauguucu uccaggacag aac 23
<210> 647
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 647
auguauaaau guauacacac 20
<210> 648
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 648
cgaaaacagc aauuaccuuu gc 22
<210> 649
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 649
ugaguuggcc aucugaguga g 21
<210> 650
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 650
guccgcucgg cgguggccca 20
<210> 651
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 651
cugaagugau guguaacuga ucag 24
<210> 652
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 652
cacgcucaug cacacaccca ca 22
<210> 653
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 653
ugagugugug ugugugagug ugu 23
<210> 654
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 654
gagccaguug gacaggagc 19
<210> 655
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 655
aagaugugga aaaauuggaa uc 22
<210> 656
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 656
auucuaauuu cuccacgucu uu 22
<210> 657
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 657
uagauaaaau auugguaccu g 21
<210> 658
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 658
cuucuugugc ucuaggauug u 21
<210> 659
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 659
uucauuuggu auaaaccgcg auu 23
<210> 660
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 660
ucgcgguuug ugccagauga cg 22
<210> 661
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 661
uugagaauga ugaaucauua gg 22
<210> 662
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 662
uaacugguug aacaacugaa cc 22
<210> 663
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 663
uuacaguugu ucaaccaguu acu 23
<210> 664
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 664
ucaguuccag gccaaccagg cu 22
<210> 665
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 665
uuaugguuug ccugggacug ag 22
<210> 666
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 666
ugggcguauc uguaugcua 19
<210> 667
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 667
uuuccauagg ugaugaguca c 21
<210> 668
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 668
ugagaaccac gucugcucug ag 22
<210> 669
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 669
uaauuuuaug uauaagcuag u 21
<210> 670
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 670
gagcuuauuc auaaaagugc ag 22
<210> 671
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 671
agaccauggg uucucauugu 20
<210> 672
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 672
uugugucaau augcgaugau gu 22
<210> 673
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 673
ugucucugcu gggguuucu 19
<210> 674
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 674
gaagugugcc gugguguguc u 21
<210> 675
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 675
aagccugccc ggcuccucgg g 21
<210> 676
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 676
ugugucacuc gaugaccacu gu 22
<210> 677
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 677
uacgucaucg uugucaucgu ca 22
<210> 678
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 678
guugugucag uuuaucaaac 20
<210> 679
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 679
acuuacagac aagagccuug cuc 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 680
uggucuagga uuguuggagg ag 22
<210> 681
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 681
cacacacugc aauuacuuuu gc 22
<210> 682
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 682
aggcugcgga auucaggac 19
<210> 683
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 683
uaaaucccau ggugccuucu ccu 23
<210> 684
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 684
aaacuacuga aaaucaaaga u 21
<210> 685
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 685
guucaaaucc agaucuauaa c 21
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<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 686
agggguggug uugggacagc uccgu 25
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 687
ugagcuaaau gugugcuggg a 21
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<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 688
gcugggcagg gcuucugagc uccuu 25
<210> 689
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 689
aggaauguuc cuucuuugcc 20
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 690
gaacgccugu ucuugccagg ugg 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 691
uccgagccug ggucucccuc uu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 692
gggggucccc ggugcucgga uc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 693
agucauugga ggguuugagc ag 22
<210> 694
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 694
agacuuccca uuugaaggug gc 22
<210> 695
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 695
gaccuggaca uguuugugcc cagu 24
<210> 696
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 696
auggagauag auauagaaau 20
<210> 697
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 697
cacaagguau ugguauuacc u 21
<210> 698
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 698
agggggaaag uucuauaguc c 21
<210> 699
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 699
agcugucuga aaaugucuu 19
<210> 700
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 700
ucuuuucuuu gagacucacu 20
<210> 701
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 701
gugagucucu aagaaaagag ga 22
<210> 702
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 702
ucuaguaaga guggcagucg a 21
<210> 703
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 703
augcugacau auuuacuaga gg 22
<210> 704
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 704
uggguuuacg uugggagaac u 21
<210> 705
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 705
aguauucugu accagggaag gu 22
<210> 706
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 706
agaccuggcc cagaccucag c 21
<210> 707
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 707
acugggggcu uucgggcucu gcgu 24
<210> 708
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 708
agggaucgcg ggcggguggc ggccu 25
<210> 709
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 709
aucgcugcgg uugcgagcgc ugu 23
<210> 710
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 710
augauccagg aaccugccuc u 21
<210> 711
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 711
aaagacauag gauagaguca ccuc 24
<210> 712
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 712
agacacauuu ggagagggaa cc 22
<210> 713
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 713
gucccucucc aaaugugucu ug 22
<210> 714
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 714
acuuguaugc uagcucaggu ag 22
<210> 715
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 715
aguguggcuu ucuuagagc 19
<210> 716
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 716
aagugugcag ggcacuggu 19
<210> 717
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 717
aaaccugugu uguucaagag uc 22
<210> 718
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 718
aggaggcagc gcucucagga c 21
<210> 719
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 719
gggacuagga ugcagaccuc c 21
<210> 720
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 720
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<210> 721
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 721
ccucaccauc ccuucugccu gc 22
<210> 722
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 722
caggcagaag uggggcugac agg 23
<210> 723
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 723
aaaggaaagu guauccuaaa ag 22
<210> 724
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 724
uuuaggauaa gcuugacuuu ug 22
<210> 725
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 725
aauggcgcca cuaggguugu g 21
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 726
caacccuagg agagggugcc auuca 25
<210> 727
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 727
uaugucugcu gaccaucacc uu 22
<210> 728
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 728
uggugggccg cagaacaugu gc 22
<210> 729
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 729
auaauacaug guuaaccucu uu 22
<210> 730
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 730
aauauuauac agucaaccuc u 21
<210> 731
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 731
accuccugug ugcauggauu a 21
<210> 732
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 732
uacccauugc auaucggagu ug 22
<210> 733
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 733
ugccuggguc ucuggccugc gcgu 24
<210> 734
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 734
aggcggggcg ccgcgggacc gc 22
<210> 735
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 735
uauucauuua uccccagccu aca 23
<210> 736
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 736
uucauuugcc ucccagccua ca 22
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<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 737
ugggcuaagg gagaugauug ggua 24
<210> 738
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 738
accaggaggc ugaggccccu 20
<210> 739
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 739
uccgguucuc agggcuccac c 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 740
aggaagcccu ggaggggcug gag 23
<210> 741
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 741
cgcgccugca ggaacuggua ga 22
<210> 742
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 742
ugggcagggg cuuauuguag gag 23
<210> 743
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 743
cugggcccgc ggcgggcgug ggg 23
<210> 744
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 744
uggugcggag agggcccaca gug 23
<210> 745
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 745
aaggagcuua caaucuagcu ggg 23
<210> 746
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 746
ugcggggcua gggcuaacag ca 22
<210> 747
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 747
uuugugaccu gguccacuaa cc 22
<210> 748
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 748
gaugguugac cagagagcac ac 22
<210> 749
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 749
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 750
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 750
cggcucuggg ucugugggga 20
<210> 751
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 751
gcagcagggu gaaacugaca ca 22
<210> 752
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 752
gcaggugcuc acuuguccuc cu 22
<210> 753
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 753
uggaggagaa ggaaggugau g 21
<210> 754
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 754
acuccagccc cacagccuca gc 22
<210> 755
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 755
aggaggaauu ggugcugguc uu 22
<210> 756
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 756
ucugcucaua ccccaugguu ucu 23
<210> 757
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 757
ugcaccaugg uugucugagc aug 23
<210> 758
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 758
cugggaucuc cggggucuug guu 23
<210> 759
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 759
ugagaccucu ggguucugag cu 22
<210> 760
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 760
uccaguacca cgugucaggg cca 23
<210> 761
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 761
caguaacaaa gauucauccu ugu 23
<210> 762
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 762
ggagacugau gaguucccgg ga 22
<210> 763
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 763
gcaggaacuu gugagucucc u 21
<210> 764
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 764
cugcccuggc ccgagggacc ga 22
<210> 765
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 765
cggccccacg caccagggua aga 23
<210> 766
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 766
ccuggaaaca cugagguugu g 21
<210> 767
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 767
uggugguuua caaaguaauu ca 22
<210> 768
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 768
uggauuucuu ugugaaucac ca 22
<210> 769
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 769
guagaggaga uggcgcaggg 20
<210> 770
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 770
aggcagcggg guguagugga ua 22
<210> 771
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 771
uccauuacac uacccugccu cu 22
<210> 772
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 772
gugaacgggc gccaucccga gg 22
<210> 773
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 773
cuugggagcc cuguuagacu c 21
<210> 774
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 774
uacucaaaaa gcugucaguc a 21
<210> 775
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 775
uuaauaucgg acaaccauug u 21
<210> 776
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 776
uacuuggaaa ggcaucaguu g 21
<210> 777
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 777
ugcaacgaac cugagccacu ga 22
<210> 778
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 778
ugcaacuuac cugagucauu ga 22
<210> 779
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 779
cacugugucc uuucugcgua g 21
<210> 780
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 780
cacuggcucc uuucugggua ga 22
<210> 781
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 781
gcagcagaga auaggacuac guc 23
<210> 782
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 782
agagucuugu gaugucuugc 20
<210> 783
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 783
agguugggau cgguugcaau gcu 23
<210> 784
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 784
uauugcacuu gucccggccu gu 22
<210> 785
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 785
uauugcacuc gucccggccu cc 22
<210> 786
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 786
ugugcgcagg gagaccucuc cc 22
<210> 787
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 787
ugucuacuac uggagacacu gg 22
<210> 788
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 788
ccaguuaccg cuuccgcuac cgc 23
<210> 789
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 789
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 790
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 790
acaguagagg gaggaaucgc ag 22
<210> 791
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 791
auccgcgcuc ugacucucug cc 22
<210> 792
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 792
uggggagcug aggcucuggg ggug 24
<210> 793
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 793
aaggcagggc ccccgcuccc c 21
<210> 794
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 794
cacccggcug ugugcacaug ugc 23
<210> 795
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 795
cacauggccg aaacagagaa gu 22
<210> 796
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 796
ucuucucugu uuuggccaug ug 22
<210> 797
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 797
aaauuauugu acaucggaug ag 22
<210> 798
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 798
uucaacgggu auuuauugag ca 22
<210> 799
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 799
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 800
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 800
cuauacaacu uacuacuuuc cc 22
<210> 801
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 801
ugagguagua aguuguauug uu 22
<210> 802
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 802
aacccguaga uccgaucuug ug 22
<210> 803
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 803
cacccguaga accgaccuug cg 22
<210> 804
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 804
caaacaccat tgtcacactc ca 22
<210> 805
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 805
ggcattcacc gcgtgcctta 20
<210> 806
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 806
tcacaggtta aagggtctca ggga 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 807
cgcattatta ctcacggtac ga 22
<210> 808
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 808
cacattatta ctcacggtac ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 809
agccaagctc agacggatcc ga 22
<210> 810
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 810
aaagagaccg gttcactgtg a 21
<210> 811
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 811
aaagagaccg gttcactgtg g 21
<210> 812
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 812
atactttttg gggtaagggc tt 22
<210> 813
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 813
gcaagcccag accgcaaaaa g 21
<210> 814
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 814
atgccctttc atcattgcac tg 22
<210> 815
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 815
gtagtgcaac agggaaagag t 21
<210> 816
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 816
cagctggttg aaggggacca aa 22
<210> 817
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 817
tagctggttg aaggggacca aa 22
<210> 818
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 818
ttggtgacta ggtggcccac agg 23
<210> 819
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 819
ctacgcgtat tcttaagcaa taa 23
<210> 820
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 820
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 821
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 821
gagctacagt gcttcatctc a 21
<210> 822
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 822
agaacagtat ttccaggaat cc 22
<210> 823
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 823
agggattcct gggaaaactg gac 23
<210> 824
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 824
acccttatca gttctccgtc ca 22
<210> 825
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 825
taaccaatgt gcagactact gt 22
<210> 826
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 826
gaacaggtag tctgaacact ggg 23
<210> 827
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 827
aggcatagga tgacaaaggg aa 22
<210> 828
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 828
acaaaccttt tgttcgtctt at 22
<210> 829
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 829
actgcctgtc tgtgcctgct gt 22
<210> 830
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 830
tccaatcagt tcctgatgca gta 23
<210> 831
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 831
agaattgcgt ttggacaatc a 21
<210> 832
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 832
tggggtattt gacaaactga ca 22
<210> 833
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 833
acaaccagct aagacactgc ca 22
<210> 834
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 834
aactcagtaa tggtaacggt tt 22
<210> 835
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 835
ttttggtgca tatttacttt a 21
<210> 836
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 836
aactatacaa cctactacct ca 22
<210> 837
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 837
tcatacagct agataaccaa aga 23
<210> 838
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRT-1-143_1736
<400> 838
ccatatacat acttctttac attccatcct gagctacagt gcttcatctc attgcataca 60
tacttcttta cattccaacg tgagctacag tgcttcatct catccgatac atacttcttt 120
acattccacg gcgagctaca gtgcttcatc tcaccttata catacttctt tacattccaa 180
aaagagctac agtgcttcat ctcaccat 208
<210> 839
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRT-128m-122-219_6793
<400> 839
cacgagaatt gcgtttggac aatcagacac aaacaccatt gtcacactcc atcttaaaga 60
gaccggttca ctgtggatgt caaacaccat tgtcacactc caacttagaa ttgcgtttgg 120
acaatcaagg gaaagagacc ggttcactgt ggccagcaaa caccattgtc acactccaaa 180
acaaagagac cggttcactg tggtacgaga attgcgtttg gacaatcaga aaaaagagac 240
cggttcactg tggaatacaa acaccattgt cacactccaa caaagaattg cgtttggaca 300
atcaggtt 308
<210> 840
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRT-128m-204-219_9304
<400> 840
aagtaaagag accggttcac tgtggaataa gaattgcgtt tggacaatca aggtaggcat 60
aggatgacaa agggaacagc aaagagaccg gttcactgtg gggctagaat tgcgtttgga 120
caatcacgta aggcatagga tgacaaaggg aacgagaaag agaccggttc actgtggggg 180
aagaattgcg tttggacaat catactaggc ataggatgac aaagggaatt agaaagagac 240
cggttcactg tggatttaga attgcgtttg gacaatcata gaaggcatag gatgacaaag 300
ggaattgt 308
<210> 841
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRT-217-137-126m_3163
<400> 841
tatgctacgc gtattcttaa gcaataagac ttccaatcag ttcctgatgc agtacgacca 60
cattattact cacggtacga aagcctacgc gtattcttaa gcaataaccg ccacattatt 120
actcacggta cgataaatcc aatcagttcc tgatgcagta attactacgc gtattcttaa 180
gcaataacta ttccaatcag ttcctgatgc agtaccccca cattattact cacggtacga 240
gaattccaat cagttcctga tgcagtacag tcacattatt actcacggta cgatcaacta 300
cgcgtattct taagcaataa ccaa 324
<210> 842
<211> 7310
<212> RNA
<213> 塞内卡病毒属塞内卡病毒A（Senecavirus Senecavirus A）
<400> 842
uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60
ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120
ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180
uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240
ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300
aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360
aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420
gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480
acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540
gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600
gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660
acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720
accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780
ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840
aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900
caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960
augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020
ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080
uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140
aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200
ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260
agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320
aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380
uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440
uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500
ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560
gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620
accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680
ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740
gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800
uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860
aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920
uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980
acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040
gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100
uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160
gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220
aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280
aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340
augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400
acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460
uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520
aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580
ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640
acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700
gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760
ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820
aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880
cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940
gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000
cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060
acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120
gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180
cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240
ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300
cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360
gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420
gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480
ggcgauaucg agaccaaucc cgggccugcu ucugacaacc caauuuugga guuucuugaa 3540
gcagaaaaug aucuagucac ucuggccucu cucuggaaga uggugcacuc uguucaacag 3600
accuggagaa aguaugugaa gaacgaugau uuuuggccca auuuacucag cgagcuagug 3660
ggggaaggcu cugucgccuu ggccgccacg cuauccaacc aagcuucagu aaaggcucuu 3720
uugggccugc acuuucucuc ucgggggcuc aauuacacug acuuuuacuc uuuacugaua 3780
gagaaaugcu cuaguuucuu uaccguagaa ccaccuccuc caccagcuga aaaccugaug 3840
accaagcccu cagugaaguc gaaauuccga aaacuguuua agaugcaagg acccauggac 3900
aaagucaaag acuggaacca aauagcugcc ggcuugaaga auuuucaauu uguucgugac 3960
cuagucaaag agguggucga uuggcugcag gccuggauca acaaagagaa agccagcccu 4020
guccuccagu accaguugga gaugaagaag cucgggccug uggccuuggc ucaugacgcu 4080
uucauggcug guuccgggcc cccucuuagc gacgaccaga uugaauaccu ccagaaccuc 4140
aaaucucuug cccuaacacu ggggaagacu aauuuggccc aaagucucac cacuaugauc 4200
aaugccaaac aaaguucagc ccaacgaguu gaacccguug uggugguccu uagaggcaag 4260
ccgggaugcg gcaagagcuu ggccucuacg uugauugccc aggcuguguc caagcgccuc 4320
uauggcuccc aaaguguaua uucucuuccc ccagauccag auuucuucga uggauacaaa 4380
ggacaguucg ugaccuugau ggaugauuug ggacaaaacc cggauggaca agauuucucc 4440
accuuuuguc agaugguguc gaccgcccaa uuucucccca acauggcgga ccuugcagag 4500
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ccugucacca uugcugaucc uucugcaguc ucucgccgua ucaacuacga ucugacucua 4620
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cuugccaagc uaggucuugc ccuagcugcg gucaccccug gucugauaau cuuggcagug 5040
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ucagucggaa cagaaaaggg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7310
<210> 843
<211> 7435
<212> DNA
<213> 肠道病毒属肠道病毒A（Enterovirus Enterovirus A）
<400> 843
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120
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ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240
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caaccgctca caacccagtg agtaggttgt cgtaatgcgt aagtctgtgg cggaaccgac 540
tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600
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ccaccattaa ttacactact atcaactatt acaaagacag tgcgagtaat tccgctacta 840
gacaagacct ctcccaagat ccatcaaaat tcacagaacc ggttaaggac ttaatgttga 900
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cacgccgaat taacaaaatg gagagcacaa taaacaatta tatacagttc aagagcaaac 4440
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atactaagga gatgcagaga cttttagata cctatggaat caatctacca ttagtcacgt 6420
acgtgaaaga tgaactcagg tcaaagacta aagtggaaca aggaaagtca agattgattg 6480
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gatttggcag tagagtagac tatatagact acctgaacca ctctcaccac ctttacaaaa 6780
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cagataaatc agtaaccttt gaaacagtca catgggagaa tgtaacattt ctgaaaagat 7080
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ggctcgactc attttagtaa ccctacctca gtcggattgg attgggttat actgttgtag 7380
gggtaaattt ttctttaatt cggagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 7435
<210> 844
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TetON调节元件
<400> 844
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<210> 845
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TetOff调节元件
<400> 845
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct 120
atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg 180
agtttatccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag 240
aacgtatgtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcc 315
<210> 846
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FLP-RGS-ERT2
<400> 846
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gagttcacca tcatccctta caacggccag aagcaccaga gcgacatcac cgacatcgtg 360
tccagcctgc agctgcagtt cgagagcagc gaggaggccg acaagggcaa cagccacagc 420
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ctgttcctgg ccacattcat caactgcggc aggttcagcg acatcaagaa cgtggacccc 600
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accacctaca cccaccagat caccgccatc cccgaccact acttcgccct ggtgtccagg 1080
tactacgcct acgaccccat cagcaaggag atgatcgccc tgaaggacga gaccaacccc 1140
atcgaggagt ggcagcacat cgagcagctg aagggcagcg ccgagggcag catcagatac 1200
cccgcctgga acggcatcat cagccaggag gtgctggact acctgagcag ctacatcaac 1260
aggcggatct gcgtacgcgg atccgctgga gacatgagag ctgccaacct ttggccaagc 1320
ccgctcatga tcaaacgctc taagaagaac agcctggcct tgtccctgac ggccgaccag 1380
atggtcagtg ccttgttgga tgctgagccc cccatactct attccgagta tgatcctacc 1440
agacccttca gtgaagcttc gatgatgggc ttactgacca acctggcaga cagggagctg 1500
gttcacatga tcaactgggc gaagagggtg ccaggctttg tggatttgac cctccatgat 1560
caggtccacc ttctagaatg tgcctggcta gagatcctga tgattggtct cgtctggcgc 1620
tccatggagc acccagtgaa gctactgttt gctcctaact tgctcttgga caggaaccag 1680
ggaaaatgtg tagagggcat ggtggagatc ttcgacatgc tgctggctac atcatctcgg 1740
ttccgcatga tgaatctgca gggagaggag tttgtgtgcc tcaaatctat tattttgctt 1800
aattctggag tgtacacatt tctgtccagc accctgaagt ctctggaaga gaaggaccat 1860
atccaccgag tcctggacaa gatcacagac actttgatcc acctgatggc caaggcaggc 1920
ctgaccctgc agcagcagca ccagcggctg gcccagctcc tcctcatcct ctcccacatc 1980
aggcacatga gtaacaaagg catggagcat ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtggtg 2040
cccctctatg acctgctgct ggaggcggcg gacgcccacc gcctacatgc gcccactagc 2100
cgtggagggg catccgtgga ggagacggac caaagccact tggccactgc gggctctact 2160
tcatcgcatt ccttgcaaaa gtattacatc acgggggagg cagagggttt ccctgccaca 2220
<210> 847
<211> 2253
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FLP-XTEN-ERT2
<400> 847
atgagccagt tcgacatcct gtgcaagacc ccccccaagg tgctggtgcg gcagttcgtg 60
gagagattcg agaggcccag cggcgagaag atcgccagct gtgccgccga gctgacctac 120
ctgtgctgga tgatcaccca caacggcacc gccatcaaga gggccacctt catgagctac 180
aacaccatca tcagcaacag cctgagcttc gacatcgtga acaagagcct gcagttcaag 240
tacaagaccc agaaggccac catcctggag gccagcctga agaagctgat ccccgcctgg 300
gagttcacca tcatccctta caacggccag aagcaccaga gcgacatcac cgacatcgtg 360
tccagcctgc agctgcagtt cgagagcagc gaggaggccg acaagggcaa cagccacagc 420
aagaagatgc tgaaggccct gctgtccgag ggcgagagca tctgggagat caccgagaag 480
atcctgaaca gcttcgagta caccagcagg ttcaccaaga ccaagaccct gtaccagttc 540
ctgttcctgg ccacattcat caactgcggc aggttcagcg acatcaagaa cgtggacccc 600
aagagcttca agctggtgca gaacaagtac ctgggcgtga tcattcagtg cctggtgacc 660
gagaccaaga caagcgtgtc caggcacatc tactttttca gcgccagagg caggatcgac 720
cccctggtgt acctggacga gttcctgagg aacagcgagc ccgtgctgaa gagagtgaac 780
aggaccggca acagcagcag caacaagcag gagtaccagc tgctgaagga caacctggtg 840
cgcagctaca acaaggccct gaagaagaac gccccctacc ccatcttcgc tatcaagaac 900
ggccctaaga gccacatcgg caggcacctg atgaccagct ttctgagcat gaagggcctg 960
accgagctga caaacgtggt gggcaactgg agcgacaaga gggcctccgc cgtggccagg 1020
accacctaca cccaccagat caccgccatc cccgaccact acttcgccct ggtgtccagg 1080
tactacgcct acgaccccat cagcaaggag atgatcgccc tgaaggacga gaccaacccc 1140
atcgaggagt ggcagcacat cgagcagctg aagggcagcg ccgagggcag catcagatac 1200
cccgcctgga acggcatcat cagccaggag gtgctggact acctgagcag ctacatcaac 1260
aggcggatca gcggcagcga gacccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcgct 1320
ggagacatga gagctgccaa cctttggcca agcccgctca tgatcaaacg ctctaagaag 1380
aacagcctgg ccttgtccct gacggccgac cagatggtca gtgccttgtt ggatgctgag 1440
ccccccatac tctattccga gtatgatcct accagaccct tcagtgaagc ttcgatgatg 1500
ggcttactga ccaacctggc agacagggag ctggttcaca tgatcaactg ggcgaagagg 1560
gtgccaggct ttgtggattt gaccctccat gatcaggtcc accttctaga atgtgcctgg 1620
ctagagatcc tgatgattgg tctcgtctgg cgctccatgg agcacccagt gaagctactg 1680
tttgctccta acttgctctt ggacaggaac cagggaaaat gtgtagaggg catggtggag 1740
atcttcgaca tgctgctggc tacatcatct cggttccgca tgatgaatct gcagggagag 1800
gagtttgtgt gcctcaaatc tattattttg cttaattctg gagtgtacac atttctgtcc 1860
agcaccctga agtctctgga agagaaggac catatccacc gagtcctgga caagatcaca 1920
gacactttga tccacctgat ggccaaggca ggcctgaccc tgcagcagca gcaccagcgg 1980
ctggcccagc tcctcctcat cctctcccac atcaggcaca tgagtaacaa aggcatggag 2040
catctgtaca gcatgaagtg caagaacgtg gtgcccctct atgacctgct gctggaggcg 2100
gcggacgccc accgcctaca tgcgcccact agccgtggag gggcatccgt ggaggagacg 2160
gaccaaagcc acttggccac tgcgggctct acttcatcgc attccttgca aaagtattac 2220
atcacggggg aggcagaggg tttccctgcc aca 2253
<210> 848
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SV40 NLS
<400> 848
atgcctaaga agaagaggaa ggtg 24
<210> 849
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LYL1 PEST
<400> 849
atgtgcccac ctcaggcaca ggcagaggtg ggccctacca tgactgagaa ggcagagatg 60
gtgtgtgccc ctagcccagc gcctgcccca ccccctaagc ctgcctcgcc tgggcccccg 120
caggtggagg ag 132
<210> 850
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FRT-1位点
<400> 850
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34
<210> 851
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FRT-14位点
<400> 851
gaagttccta ttctatcaga agtataggaa cttc 34
<210> 852
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> rtTA
<400> 852
atgtctaggc tggacaagag caaagtcata aacggagctc tggaattact caatggtgtc 60
ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120
ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180
gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240
aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300
ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360
tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420
acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480
cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540
ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600
ctaaagtgcg aaagcggcgg gccgaccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660
ccagccgatg cccttgacga ttttgacctt gacatgctcc ccggg 705
<210> 853
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> tTA
<400> 853
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc cgcgtacagc cgcgcgcgta cgaaaaacaa ttacgggtct 660
accatcgagg gcctgctcga tctcccggac gacgacgccc ccgaagaggc ggggctggcg 720
gctccgcgcc tgtcctttct ccccgcggga cacacgcgca gactgtcgac ggcccccccg 780
accgatgtca gcctggggga cgagctccac ttagacggcg aggacgtggc gatggcgcat 840
gccgacgcgc tagacgattt cgatctggac atgttggggg acggggattc cccgggtccg 900
ggatttaccc cccacgactc cgccccctac ggcgctctgg atatggccga cttcgagttt 960
gagcagatgt ttaccgatgc ccttggaatt gacgagtacg gtgggtag 1008
<210> 854
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Stop1
<400> 854
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49
<210> 855
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Stop2
<400> 855
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtgg aataaaatgc 60
atttgtataa aaaatgcttt aaatgatgga tatgttactt tagcaagaac ttttaggtca 120
ggtttctcct ttgtttt 137
<210> 856
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Stop3
<400> 856
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtgg aataaaatgc 60
atttgtataa aaaatgcttt aaatgatgga tatgttactt tagcaagaac ttttaggtca 120
ggtttctcct ttgttttgaa taaatgggaa ttgaaaaaag ctgcgagatg tgtgcttatt 180
tagggaaaca cggctggctg atggaggcat gggg 214
<210> 857
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FRT-1-Stop1-FRT-1
<400> 857
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttctaataa taaataataa taattagtag 60
taggaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgggggaag 120
ttcctattct ctagaaagta taggaacttc 150
<210> 858
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FRT-1-Stop2-FRT-1
<400> 858
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttctaataa taaataataa taattagtag 60
taggaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtggaataaa 120
atgcatttgt ataaaaaatg ctttaaatga tggatatgtt actttagcaa gaacttttag 180
gtcaggtttc tcctttgttt tgaagttcct attctctaga aagtatagga acttc 235
<210> 859
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FRT-1-Stop3-FRT-1
<400> 859
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttctaataa taaataataa taattagtag 60
taggaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtggaataaa 120
atgcatttgt ataaaaaatg ctttaaatga tggatatgtt actttagcaa gaacttttag 180
gtcaggtttc tcctttgttt tgaataaatg ggaattgaaa aaagctgcga gatgtgtgct 240
tatttaggga aacacggctg gctgatggag gcatggggtg aagttcctat tctctagaaa 300
gtataggaac ttc 313
<210> 860
<211> 3579
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 启动子反转与STOP
<400> 860
gaagttccta tacttctgat agaataggaa cttcacccca tgcctccatc agccagccgt 60
gtttccctaa ataagcacac atctcgcagc ttttttcaat tcccatttat tcaaaacaaa 120
ggagaaacct gacctaaaag ttcttgctaa agtaacatat ccatcattta aagcattttt 180
tatacaaatg cattttattc cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga 240
tattttattc ctactactaa ttattattat ttattattag aagttcctat actttctaga 300
gaataggaac ttcggtaccg atctctatca ctgataggga gatctctatc actgataggg 360
agagctctgc ttggtatatg tacactttac ctgggggcgt gccggaccgc cccgactgca 420
tctgcgtgtt cgaattcgcc aatgacaaga cgctgggcgg ggacgcgtga agttcctatt 480
ctatcagaag tataggaact tctaataata aataataata attagtagta ggaataaatg 540
cagtttataa aagtgttaga ttgttgttat accttgtaag agtcatgtga tcatactgtt 600
ttctacaaag ttgtatttta gatataatgc ctgaaaccat tttggtgttt gcttcagtca 660
gtatttcatt gtatgctgga ataaagtcca aagtctgatc tggtctagtt tacctagaag 720
tatttttgtc tcttagaaat acttgtgatt tttataatac aaaagggtct tgactctaaa 780
tgcagtttta agaattgttt ttgaatttaa ataaagttac ttgaatttca aagatcacag 840
ggcagtgtct tcatttgacc aggactgttg aaagaataaa aaagctcttt taatattgat 900
atactgtcct ttttaacgct ttaaaaacag attttgaggg gagaaaagta ttgtttcagt 960
tttgcttttg ataaaaatat aatttgactt ctttgaactg gatttttctt taaggctttg 1020
ccagttgtgg aagataagct attttggggg tctttcagta tttaattgtg aagttcctat 1080
tctctagaaa gtataggaac ttcgcggccg cgagctcgga tccactagtc cagtgtggtg 1140
gaattcgcca ccatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat caaggagttc 1200
atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc 1260
gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggt 1320
ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg ctccaaggcc 1380
tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc 1440
aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc 1500
tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc 1560
gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga gcggatgtac 1620
cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc 1680
cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc 1740
gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg 1800
gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga gctgtacaag 1860
aggaggaaga gagaaggcag ggggagcctt ctcacttgcg gcgatgtcga ggaaaatccg 1920
gggcctatgg aagatgccaa aaacattaag aagggcccag cgccattcta cccactcgaa 1980
gacgggaccg ccggcgagca gctgcacaaa gccatgaagc gctacgccct ggtgcccggc 2040
accatcgcct ttaccgacgc acatatcgag gtggacatta cctacgccga gtacttcgag 2100
atgagcgttc ggctggcaga agctatgaag cgctatgggc tgaatacaaa ccatcggatc 2160
gtggtgtgca gcgagaatag cttgcagttc ttcatgcccg tgttgggtgc cctgttcatc 2220
ggtgtggctg tggccccagc taacgacatc tacaacgagc gcgagctgct gaacagcatg 2280
ggcatcagcc agcccaccgt cgtattcgtg agcaagaaag ggctgcaaaa gatcctcaac 2340
gtgcaaaaga agctaccgat catacaaaag atcatcatca tggatagcaa gaccgactac 2400
cagggcttcc aaagcatgta caccttcgtg acttcccatt tgccacccgg cttcaacgag 2460
tacgacttcg tgcccgagag cttcgaccgg gacaaaacca tcgccctgat catgaacagt 2520
agtggcagta ccggattgcc caagggcgta gccctaccgc accgcaccgc ttgtgtccga 2580
ttcagtcatg cccgcgaccc catcttcggc aaccagatca tccccgacac cgctatcctc 2640
agcgtggtgc catttcacca cggcttcggc atgttcacca cgctgggcta cttgatctgc 2700
ggctttcggg tcgtgctcat gtaccgcttc gaggaggagc tattcttgcg cagcttgcaa 2760
gactataaga ttcaatctgc cctgctggtg cccacactat ttagcttctt cgctaagagc 2820
actctcatcg acaagtacga cctaagcaac ttgcacgaga tcgccagcgg cggggcgccg 2880
ctcagcaagg aggtaggtga ggccgtggcc aaacgcttcc acctaccagg catccgccag 2940
ggctacggcc tgacagaaac aaccagcgcc attctgatca cccccgaagg ggacgacaag 3000
cctggcgcag taggcaaggt ggtgcccttc ttcgaggcta aggtggtgga cttggacacc 3060
ggtaagacac tgggtgtgaa ccagcgcggc gagctgtgcg tccgtggccc catgatcatg 3120
agcggctacg ttaacaaccc cgaggctaca aacgctctca tcgacaagga cggctggctg 3180
cacagcggcg acatcgccta ctgggacgag gacgagcact tcttcatcgt ggaccggctg 3240
aagagcctga tcaaatacaa gggctaccag gtagccccag ccgaactgga gagcatcctg 3300
ctgcaacacc ccaacatctt cgacgccggg gtcgccggcc tgcccgacga cgatgccggc 3360
gagctgcccg ccgcagtcgt cgtgctggaa cacggtaaaa ccatgaccga gaaggagatc 3420
gtggactatg tggccagcca ggttacaacc gccaagaagc tgcgcggtgg tgttgtgttc 3480
gtggacgagg tgcctaaagg actgaccggc aagttggacg cccgcaagat ccgcgagatt 3540
ctcattaagg ccaagaaggg cggcaagatc gccgtgtaa 3579
<210> 861
<211> 3591
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 有效负载反转与STOP
<400> 861
ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggtccg 60
gcacgccccc aggtaaagtg tacatatacc aagcagagct ctccctatca gtgatagaga 120
tctccctatc agtgatagag atcggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 180
ttctaataat aaataataat aattagtagt aggaataaaa tatctttatt ttcattacat 240
ctgtgtgttg gttttttgtg tggaataaaa tgcatttgta taaaaaatgc tttaaatgat 300
ggatatgtta ctttagcaag aacttttagg tcaggtttct cctttgtttt gaataaatgg 360
gaattgaaaa aagctgcgag atgtgtgctt atttagggaa acacggctgg ctgatggagg 420
catggggtga agttcctatt ctatcagaag tataggaact tcgcggccgc tgcagaattc 480
ttacacggcg atcttgccgc ccttcttggc cttaatgaga atctcgcgga tcttgcgggc 540
gtccaacttg ccggtcagtc ctttaggcac ctcgtccacg aacacaacac caccgcgcag 600
cttcttggcg gttgtaacct ggctggccac atagtccacg atctccttct cggtcatggt 660
tttaccgtgt tccagcacga cgactgcggc gggcagctcg ccggcatcgt cgtcgggcag 720
gccggcgacc ccggcgtcga agatgttggg gtgttgcagc aggatgctct ccagttcggc 780
tggggctacc tggtagccct tgtatttgat caggctcttc agccggtcca cgatgaagaa 840
gtgctcgtcc tcgtcccagt aggcgatgtc gccgctgtgc agccagccgt ccttgtcgat 900
gagagcgttt gtagcctcgg ggttgttaac gtagccgctc atgatcatgg ggccacggac 960
gcacagctcg ccgcgctggt tcacacccag tgtcttaccg gtgtccaagt ccaccacctt 1020
agcctcgaag aagggcacca ccttgcctac tgcgccaggc ttgtcgtccc cttcgggggt 1080
gatcagaatg gcgctggttg tttctgtcag gccgtagccc tggcggatgc ctggtaggtg 1140
gaagcgtttg gccacggcct cacctacctc cttgctgagc ggcgccccgc cgctggcgat 1200
ctcgtgcaag ttgcttaggt cgtacttgtc gatgagagtg ctcttagcga agaagctaaa 1260
tagtgtgggc accagcaggg cagattgaat cttatagtct tgcaagctgc gcaagaatag 1320
ctcctcctcg aagcggtaca tgagcacgac ccgaaagccg cagatcaagt agcccagcgt 1380
ggtgaacatg ccgaagccgt ggtgaaatgg caccacgctg aggatagcgg tgtcggggat 1440
gatctggttg ccgaagatgg ggtcgcgggc atgactgaat cggacacaag cggtgcggtg 1500
cggtagggct acgcccttgg gcaatccggt actgccacta ctgttcatga tcagggcgat 1560
ggttttgtcc cggtcgaagc tctcgggcac gaagtcgtac tcgttgaagc cgggtggcaa 1620
atgggaagtc acgaaggtgt acatgctttg gaagccctgg tagtcggtct tgctatccat 1680
gatgatgatc ttttgtatga tcggtagctt cttttgcacg ttgaggatct tttgcagccc 1740
tttcttgctc acgaatacga cggtgggctg gctgatgccc atgctgttca gcagctcgcg 1800
ctcgttgtag atgtcgttag ctggggccac agccacaccg atgaacaggg cacccaacac 1860
gggcatgaag aactgcaagc tattctcgct gcacaccacg atccgatggt ttgtattcag 1920
cccatagcgc ttcatagctt ctgccagccg aacgctcatc tcgaagtact cggcgtaggt 1980
aatgtccacc tcgatatgtg cgtcggtaaa ggcgatggtg ccgggcacca gggcgtagcg 2040
cttcatggct ttgtgcagct gctcgccggc ggtcccgtct tcgagtgggt agaatggcgc 2100
tgggcccttc ttaatgtttt tggcatcttc cataggcccc ggattttcct cgacatcgcc 2160
gcaagtgaga aggctccccc tgccttctct cttcctcctc ttgtacagct cgtccatgcc 2220
gccggtggag tggcggccct cggcgcgttc gtactgttcc acgatggtgt agtcctcgtt 2280
gtgggaggtg atgtccaact tgatgttgac gttgtaggcg ccgggcagct gcacgggctt 2340
cttggccttg taggtggtct tgacctcagc gtcgtagtgg ccgccgtcct tcagcttcag 2400
cctctgcttg atctcgccct tcagggcgcc gtcctcgggg tacatccgct cggaggaggc 2460
ctcccagccc atggtcttct tctgcattac ggggccgtcg gaggggaagt tggtgccgcg 2520
cagcttcacc ttgtagatga actcgccgtc ctgcagggag gagtcctggg tcacggtcac 2580
cacgccgccg tcctcgaagt tcatcacgcg ctcccacttg aagccctcgg ggaaggacag 2640
cttcaagtag tcggggatgt cggcggggtg cttcacgtag gccttggagc cgtacatgaa 2700
ctgaggggac aggatgtccc aggcgaaggg cagggggcca cccttggtca ccttcagctt 2760
ggcggtctgg gtgccctcgt aggggcggcc ctcgccctcg ccctcgatct cgaactcgtg 2820
gccgttcacg gagccctcca tgtgcacctt gaagcgcatg aactccttga tgatggccat 2880
gttatcctcc tcgcccttgc tcaccatggt ggcgaattcc accacactgg actagtggat 2940
ccgagctcgc ggccgcgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc acaattaaat 3000
actgaaagac ccccaaaata gcttatcttc cacaactggc aaagccttaa agaaaaatcc 3060
agttcaaaga agtcaaatta tatttttatc aaaagcaaaa ctgaaacaat acttttctcc 3120
cctcaaaatc tgtttttaaa gcgttaaaaa ggacagtata tcaatattaa aagagctttt 3180
ttattctttc aacagtcctg gtcaaatgaa gacactgccc tgtgatcttt gaaattcaag 3240
taactttatt taaattcaaa aacaattctt aaaactgcat ttagagtcaa gacccttttg 3300
tattataaaa atcacaagta tttctaagag acaaaaatac ttctaggtaa actagaccag 3360
atcagacttt ggactttatt ccagcataca atgaaatact gactgaagca aacaccaaaa 3420
tggtttcagg cattatatct aaaatacaac tttgtagaaa acagtatgat cacatgactc 3480
ttacaaggta taacaacaat ctaacacttt tataaactgc atttattcct actactaatt 3540
attattattt attattagaa gttcctatac ttctgataga ataggaactt c 3591
<210> 862
<211> 4017
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 启动子与分裂内含子反转和STOP
<400> 862
gaagttccta tacttctgat agaataggaa cttcacccca tgcctccatc agccagccgt 60
gtttccctaa ataagcacac atctcgcagc ttttttcaat tcccatttat tcaaaacaaa 120
ggagaaacct gacctaaaag ttcttgctaa agtaacatat ccatcattta aagcattttt 180
tatacaaatg cattttattc cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga 240
tattttattc ctatcactag tcatcactag ctatcactag aagttcctat actttctaga 300
gaataggaac ttcggatcca ggaaggaggg aggcggccac cagaagaggt agcgggccac 360
tcacctgcag ggaggagtcc tgggtcacgg tcaccacgcc gccgtcctcg aagttcatca 420
cgcgctccca cttgaagccc tcggggaagg acagcttcaa gtagtcgggg atgtcggcgg 480
ggtgcttcac gtaggccttg gagccgtaca tgaactgagg ggacaggatg tcccaggcga 540
agggcagggg gccacccttg gtcaccttca gcttggcggt ctgggtgccc tcgtaggggc 600
ggccctcgcc ctcgccctcg atctcgaact cgtggccgtt cacggagccc tccatgtgca 660
ccttgaagcg catgaactcc ttgatgatgg ccatgttatc ctcctcgccc ttgctcacca 720
tggtggctgg ccaccacact ggactagtga gctcggtacc gatctctatc actgataggg 780
agatctctat cactgatagg gagagctctg cttggtatat gtacacttta cctgggggcg 840
tgccggaccg ccccgactgc atctgcgtgt tcgaattcgc caatgacaag acgctgggcg 900
gggaacgcgt gaagttccta ttctatcaga agtataggaa cttctaataa taaataataa 960
taattagtag taggaataaa tgcagtttat aaaagtgtta gattgttgtt ataccttgta 1020
agagtcatgt gatcatactg ttttctacaa agttgtattt tagatataat gcctgaaacc 1080
attttggtgt ttgcttcagt cagtatttca ttgtatgctg gaataaagtc caaagtctga 1140
tctggtctag tttacctaga agtatttttg tctcttagaa atacttgtga tttttataat 1200
acaaaagggt cttgactcta aatgcagttt taagaattgt ttttgaattt aaataaagtt 1260
acttgaattt caaagatcac agggcagtgt cttcatttga ccaggactgt tgaaagaata 1320
aaaaagctct tttaatattg atatactgtc ctttttaacg ctttaaaaac agattttgag 1380
gggagaaaag tattgtttca gttttgcttt tgataaaaat ataatttgac ttctttgaac 1440
tggatttttc tttaaggctt tgccagttgt ggaagataag ctattttggg ggtctttcag 1500
tatttaattg tgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcgatat cggcctcccg 1560
gagctgcgcc ctttctcact ggttctctct tctgccgttt tccgtaggac tctcttctct 1620
gacctgagtc tcctttggaa ctctgcaggt tctatttgct ttttcccaga tgagctcttt 1680
ttctggtgtt tgtctctctg actaggtgtc taagacagtg ttgtgggtgt aggtactaac 1740
actggctcgt gtgacaaggc catgaggctg gtgtaaagcg gccttggagt gtgtattaag 1800
taggtgcaca gtaggtctga acagactccc catcccaaga ccccagcaca cttagccgtg 1860
ttctttgcac tttctgcatg tcccccgtct ggcctggctg tccccagtgg cttccccagt 1920
gtgacatggt gtatctctgc cttacaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 1980
ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 2040
tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg 2100
aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag 2160
cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac 2220
gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc 2280
atggacgagc tgtacaagag gaggaagaga gaaggcaggg ggagccttct cacttgcggc 2340
gatgtcgagg aaaatccggg gcctatggaa gatgccaaaa acattaagaa gggcccagcg 2400
ccattctacc cactcgaaga cgggaccgcc ggcgagcagc tgcacaaagc catgaagcgc 2460
tacgccctgg tgcccggcac catcgccttt accgacgcac atatcgaggt ggacattacc 2520
tacgccgagt acttcgagat gagcgttcgg ctggcagaag ctatgaagcg ctatgggctg 2580
aatacaaacc atcggatcgt ggtgtgcagc gagaatagct tgcagttctt catgcccgtg 2640
ttgggtgccc tgttcatcgg tgtggctgtg gccccagcta acgacatcta caacgagcgc 2700
gagctgctga acagcatggg catcagccag cccaccgtcg tattcgtgag caagaaaggg 2760
ctgcaaaaga tcctcaacgt gcaaaagaag ctaccgatca tacaaaagat catcatcatg 2820
gatagcaaga ccgactacca gggcttccaa agcatgtaca ccttcgtgac ttcccatttg 2880
ccacccggct tcaacgagta cgacttcgtg cccgagagct tcgaccggga caaaaccatc 2940
gccctgatca tgaacagtag tggcagtacc ggattgccca agggcgtagc cctaccgcac 3000
cgcaccgctt gtgtccgatt cagtcatgcc cgcgacccca tcttcggcaa ccagatcatc 3060
cccgacaccg ctatcctcag cgtggtgcca tttcaccacg gcttcggcat gttcaccacg 3120
ctgggctact tgatctgcgg ctttcgggtc gtgctcatgt accgcttcga ggaggagcta 3180
ttcttgcgca gcttgcaaga ctataagatt caatctgccc tgctggtgcc cacactattt 3240
agcttcttcg ctaagagcac tctcatcgac aagtacgacc taagcaactt gcacgagatc 3300
gccagcggcg gggcgccgct cagcaaggag gtaggtgagg ccgtggccaa acgcttccac 3360
ctaccaggca tccgccaggg ctacggcctg acagaaacaa ccagcgccat tctgatcacc 3420
cccgaagggg acgacaagcc tggcgcagta ggcaaggtgg tgcccttctt cgaggctaag 3480
gtggtggact tggacaccgg taagacactg ggtgtgaacc agcgcggcga gctgtgcgtc 3540
cgtggcccca tgatcatgag cggctacgtt aacaaccccg aggctacaaa cgctctcatc 3600
gacaaggacg gctggctgca cagcggcgac atcgcctact gggacgagga cgagcacttc 3660
ttcatcgtgg accggctgaa gagcctgatc aaatacaagg gctaccaggt agccccagcc 3720
gaactggaga gcatcctgct gcaacacccc aacatcttcg acgccggggt cgccggcctg 3780
cccgacgacg atgccggcga gctgcccgcc gcagtcgtcg tgctggaaca cggtaaaacc 3840
atgaccgaga aggagatcgt ggactatgtg gccagccagg ttacaaccgc caagaagctg 3900
cgcggtggtg ttgtgttcgt ggacgaggtg cctaaaggac tgaccggcaa gttggacgcc 3960
cgcaagatcc gcgagattct cattaaggcc aagaagggcg gcaagatcgc cgtgtaa 4017
<210> 863
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ACTB的内含子3
<400> 863
gtgagtggcc cgctacctct tctggtggcc gcctccctcc ttcctggatc cgatatcggc 60
ctcccggagc tgcgcccttt ctcactggtt ctctcttctg ccgttttccg taggactctc 120
ttctctgacc tgagtctcct ttggaactct gcaggttcta tttgcttttt cccagatgag 180
ctctttttct ggtgtttgtc tctctgacta ggtgtctaag acagtgttgt gggtgtaggt 240
actaacactg gctcgtgtga caaggccatg aggctggtgt aaagcggcct tggagtgtgt 300
attaagtagg tgcacagtag gtctgaacag actccccatc ccaagacccc agcacactta 360
gccgtgttct ttgcactttc tgcatgtccc ccgtctggcc tggctgtccc cagtggcttc 420
cccagtgtga catggtgtat ctctgcctta cagctcccgg agctgcgccc tttctcactg 480
gttctctctt ctgccgtttt ccgtaggact ctcttctctg acctgagtct cctttggaac 540
tctgcaggtt ctatttgctt tttcccagat gagctctttt tctggtgttt gtctctctga 600
ctaggtgtct aagacagtgt tgtgggtgta ggtactaaca ctggctcgtg tgacaaggcc 660
atgaggctgg tgtaaagcgg ccttggagtg tgtattaagt aggtgcacag taggtctgaa 720
cagactcccc atcccaagac cccagcacac ttagccgtgt tctttgcact ttctgcatgt 780
cccccgtctg gcctggctgt ccccagtggc ttccccagtg tgacatggtg tatctctgcc 840
ttacag 846
<210> 864
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NLS-TetR-NLS
<400> 864
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcatg tctagactgg acaagtccaa ggtcatcaat 60
tctgccctgg aactcttgaa cgaagtgggc attgagggcc tgaccacaag gaagttggct 120
caaaaattgg gcgtggaaca acccaccctc tactggcacg tgaagaacaa aagagccctc 180
ttggatgctc tggctatcga aatgctggac cgccatcaca cccatttctg tcccctggag 240
ggcgagtctt ggcaggactt cctgaggaac aatgccaagt ccttccggtg cgccctgttg 300
tcccacaggg acggcgccaa ggtgcacctg ggcaccagac ccaccgagaa gcaatacgag 360
actttggaga accagctggc tttcctgtgt cagcagggct tcagcttgga aaacgccctg 420
tacgccttgt ctgccgtcgg ccacttcacc ctgggctgtg tgctggagga ccaggaacac 480
caggtggcca aggaggagcg agagaccccc accaccgact ccatgccccc actgctgagg 540
caggccattg agctgttcga ccatcagggc gccgaacccg cttttctgtt tgggttggag 600
ctcattatct gtggcctgga gaagcagttg aagtgcgagt ccggcagtgc ctattctggc 660
agtagagagt ttcccaagaa gaagaggaag gtgtaa 696
<210> 865
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HBP1-TO
<400> 865
ccacgcccac cggctgatga cgcgcggggt gtgggagggg ctggggcggc gcggtcccag 60
gtccacttcg catattaagc agagctctcc ctatcagtga tagagatctc cctatcagtg 120
atagaga 127
<210> 866
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HBP2-TO
<400> 866
ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggtccg 60
gcacgccccc aggtaaagtg tacatatacc aagcagagct ctccctatca gtgatagaga 120
tctccctatc agtgatagag a 141
<210> 867
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FEXP核苷酸序列
<400> 867
atgtgcccac ctcaggcaca ggcagaggtg ggccctacca tgactgagaa ggcagagatg 60
gtgtgtgccc ctagcccagc gcctgcccca ccccctaagc ctgcctcgcc tgggcccccg 120
caggtggagg agatgagcca gttcgacatc ctgtgcaaga ccccccccaa ggtgctggtg 180
cggcagttcg tggagagatt cgagaggccc agcggcgaga agatcgccag ctgtgccgcc 240
gagctgacct acctgtgctg gatgatcacc cacaacggca ccgccatcaa gagggccacc 300
ttcatgagct acaacaccat catcagcaac agcctgagct tcgacatcgt gaacaagagc 360
ctgcagttca agtacaagac ccagaaggcc accatcctgg aggccagcct gaagaagctg 420
atccccgcct gggagttcac catcatccct tacaacggcc agaagcacca gagcgacatc 480
accgacatcg tgtccagcct gcagctgcag ttcgagagca gcgaggaggc cgacaagggc 540
aacagccaca gcaagaagat gctgaaggcc ctgctgtccg agggcgagag catctgggag 600
atcaccgaga agatcctgaa cagcttcgag tacaccagca ggttcaccaa gaccaagacc 660
ctgtaccagt tcctgttcct ggccacattc atcaactgcg gcaggttcag cgacatcaag 720
aacgtggacc ccaagagctt caagctggtg cagaacaagt acctgggcgt gatcattcag 780
tgcctggtga ccgagaccaa gacaagcgtg tccaggcaca tctacttttt cagcgccaga 840
ggcaggatcg accccctggt gtacctggac gagttcctga ggaacagcga gcccgtgctg 900
aagagagtga acaggaccgg caacagcagc agcaacaagc aggagtacca gctgctgaag 960
gacaacctgg tgcgcagcta caacaaggcc ctgaagaaga acgcccccta ccccatcttc 1020
gctatcaaga acggccctaa gagccacatc ggcaggcacc tgatgaccag ctttctgagc 1080
atgaagggcc tgaccgagct gacaaacgtg gtgggcaact ggagcgacaa gagggcctcc 1140
gccgtggcca ggaccaccta cacccaccag atcaccgcca tccccgacca ctacttcgcc 1200
ctggtgtcca ggtactacgc ctacgacccc atcagcaagg agatgatcgc cctgaaggac 1260
gagaccaacc ccatcgagga gtggcagcac atcgagcagc tgaagggcag cgccgagggc 1320
agcatcagat accccgcctg gaacggcatc atcagccagg aggtgctgga ctacctgagc 1380
agctacatca acaggcggat cagcggcagc gagacccccg gcaccagcga gagcgccacc 1440
cccgagagcg ctggagacat gagagctgcc aacctttggc caagcccgct catgatcaaa 1500
cgctctaaga agaacagcct ggccttgtcc ctgacggccg accagatggt cagtgccttg 1560
ttggatgctg agccccccat actctattcc gagtatgatc ctaccagacc cttcagtgaa 1620
gcttcgatga tgggcttact gaccaacctg gcagacaggg agctggttca catgatcaac 1680
tgggcgaaga gggtgccagg ctttgtggat ttgaccctcc atgatcaggt ccaccttcta 1740
gaatgtgcct ggctagagat cctgatgatt ggtctcgtct ggcgctccat ggagcaccca 1800
gtgaagctac tgtttgctcc taacttgctc ttggacagga accagggaaa atgtgtagag 1860
ggcatggtgg agatcttcga catgctgctg gctacatcat ctcggttccg catgatgaat 1920
ctgcagggag aggagtttgt gtgcctcaaa tctattattt tgcttaattc tggagtgtac 1980
acatttctgt ccagcaccct gaagtctctg gaagagaagg accatatcca ccgagtcctg 2040
gacaagatca cagacacttt gatccacctg atggccaagg caggcctgac cctgcagcag 2100
cagcaccagc ggctggccca gctcctcctc atcctctccc acatcaggca catgagtaac 2160
aaaggcatgg agcatctgta cagcatgaag tgcaagaacg tggtgcccct ctatgacctg 2220
ctgctggagg cggcggacgc ccaccgccta catgcgccca ctagccgtgg aggggcatcc 2280
gtggaggaga cggaccaaag ccacttggcc actgcgggct ctacttcatc gcattccttg 2340
caaaagtatt acatcacggg ggaggcagag ggtttccctg ccaca 2385
<210> 868
<211> 2519
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FEXPi2核苷酸序列
<400> 868
atgtgcccac ctcaggcaca ggcagaggtg ggccctacca tgactgagaa ggcagagatg 60
gtgtgtgccc ctagcccagc gcctgcccca ccccctaagc ctgcctcgcc tgggcccccg 120
caggtggagg agatgagcca gttcgacatc ctgtgcaaga ccccccccaa ggtgctggtg 180
cggcagttcg tggagagatt cgagaggccc agcggcgaga agatcgccag ctgtgccgcc 240
gagctgacct acctgtgctg gatgatcacc cacaacggca ccgccatcaa gagggccacc 300
ttcatgagct acaacaccat catcagcaac agcctgagct tcgacatcgt gaacaagagc 360
ctgcagttca agtacaagac ccagaaggcc accatcctgg aggccagcct gaagaagctg 420
atccccgcct gggagttcac catcatccct tacaacggcc agaagcacca gagcgacatc 480
accgacatcg tgtccagcct gcagctgcag ttcgagagca gcgaggaggc cgacaagggc 540
aacagccaca gcaagaagat gctgaaggcc ctgctgtccg agggcgagag catctgggag 600
atcaccgaga agatcctgaa cagcttcgag tacaccagca ggttcaccaa gaccaagacc 660
ctgtaccagt tcctgttcct ggccacattc atcaactgcg gcaggtaggg gagctggctg 720
ggtggggcag ccccgggagc gggcgggagg caagggcgct ttctctgcac aggagcctcc 780
cggtttccgg ggtgggggct gcgcccgtgc tcagggcttc ttgtcctttc cttcccaggt 840
tcagcgacat caagaacgtg gaccccaaga gcttcaagct ggtgcagaac aagtacctgg 900
gcgtgatcat tcagtgcctg gtgaccgaga ccaagacaag cgtgtccagg cacatctact 960
ttttcagcgc cagaggcagg atcgaccccc tggtgtacct ggacgagttc ctgaggaaca 1020
gcgagcccgt gctgaagaga gtgaacagga ccggcaacag cagcagcaac aagcaggagt 1080
accagctgct gaaggacaac ctggtgcgca gctacaacaa ggccctgaag aagaacgccc 1140
cctaccccat cttcgctatc aagaacggcc ctaagagcca catcggcagg cacctgatga 1200
ccagctttct gagcatgaag ggcctgaccg agctgacaaa cgtggtgggc aactggagcg 1260
acaagagggc ctccgccgtg gccaggacca cctacaccca ccagatcacc gccatccccg 1320
accactactt cgccctggtg tccaggtact acgcctacga ccccatcagc aaggagatga 1380
tcgccctgaa ggacgagacc aaccccatcg aggagtggca gcacatcgag cagctgaagg 1440
gcagcgccga gggcagcatc agataccccg cctggaacgg catcatcagc caggaggtgc 1500
tggactacct gagcagctac atcaacaggc ggatcagcgg cagcgagacc cccggcacca 1560
gcgagagcgc cacccccgag agcgctggag acatgagagc tgccaacctt tggccaagcc 1620
cgctcatgat caaacgctct aagaagaaca gcctggcctt gtccctgacg gccgaccaga 1680
tggtcagtgc cttgttggat gctgagcccc ccatactcta ttccgagtat gatcctacca 1740
gacccttcag tgaagcttcg atgatgggct tactgaccaa cctggcagac agggagctgg 1800
ttcacatgat caactgggcg aagagggtgc caggctttgt ggatttgacc ctccatgatc 1860
aggtccacct tctagaatgt gcctggctag agatcctgat gattggtctc gtctggcgct 1920
ccatggagca cccagtgaag ctactgtttg ctcctaactt gctcttggac aggaaccagg 1980
gaaaatgtgt agagggcatg gtggagatct tcgacatgct gctggctaca tcatctcggt 2040
tccgcatgat gaatctgcag ggagaggagt ttgtgtgcct caaatctatt attttgctta 2100
attctggagt gtacacattt ctgtccagca ccctgaagtc tctggaagag aaggaccata 2160
tccaccgagt cctggacaag atcacagaca ctttgatcca cctgatggcc aaggcaggcc 2220
tgaccctgca gcagcagcac cagcggctgg cccagctcct cctcatcctc tcccacatca 2280
ggcacatgag taacaaaggc atggagcatc tgtacagcat gaagtgcaag aacgtggtgc 2340
ccctctatga cctgctgctg gaggcggcgg acgcccaccg cctacatgcg cccactagcc 2400
gtggaggggc atccgtggag gagacggacc aaagccactt ggccactgcg ggctctactt 2460
catcgcattc cttgcaaaag tattacatca cgggggaggc agagggtttc cctgccaca 2519
<210> 869
<211> 2695
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HBP1-TO-FEXPi2
<400> 869
ccacgcccac cggctgatga cgcgcggggt gtgggagggg ctggggcggc gcggtcccag 60
gtccacttcg catattaagc agagctctcc ctatcagtga tagagatctc cctatcagtg 120
atagagatcg gtaccgagct cggatccact agtccagtgt ggtggaattc gccaccatgt 180
gcccacctca ggcacaggca gaggtgggcc ctaccatgac tgagaaggca gagatggtgt 240
gtgcccctag cccagcgcct gccccacccc ctaagcctgc ctcgcctggg cccccgcagg 300
tggaggagat gagccagttc gacatcctgt gcaagacccc ccccaaggtg ctggtgcggc 360
agttcgtgga gagattcgag aggcccagcg gcgagaagat cgccagctgt gccgccgagc 420
tgacctacct gtgctggatg atcacccaca acggcaccgc catcaagagg gccaccttca 480
tgagctacaa caccatcatc agcaacagcc tgagcttcga catcgtgaac aagagcctgc 540
agttcaagta caagacccag aaggccacca tcctggaggc cagcctgaag aagctgatcc 600
ccgcctggga gttcaccatc atcccttaca acggccagaa gcaccagagc gacatcaccg 660
acatcgtgtc cagcctgcag ctgcagttcg agagcagcga ggaggccgac aagggcaaca 720
gccacagcaa gaagatgctg aaggccctgc tgtccgaggg cgagagcatc tgggagatca 780
ccgagaagat cctgaacagc ttcgagtaca ccagcaggtt caccaagacc aagaccctgt 840
accagttcct gttcctggcc acattcatca actgcggcag gtaggggagc tggctgggtg 900
gggcagcccc gggagcgggc gggaggcaag ggcgctttct ctgcacagga gcctcccggt 960
ttccggggtg ggggctgcgc ccgtgctcag ggcttcttgt cctttccttc ccaggttcag 1020
cgacatcaag aacgtggacc ccaagagctt caagctggtg cagaacaagt acctgggcgt 1080
gatcattcag tgcctggtga ccgagaccaa gacaagcgtg tccaggcaca tctacttttt 1140
cagcgccaga ggcaggatcg accccctggt gtacctggac gagttcctga ggaacagcga 1200
gcccgtgctg aagagagtga acaggaccgg caacagcagc agcaacaagc aggagtacca 1260
gctgctgaag gacaacctgg tgcgcagcta caacaaggcc ctgaagaaga acgcccccta 1320
ccccatcttc gctatcaaga acggccctaa gagccacatc ggcaggcacc tgatgaccag 1380
ctttctgagc atgaagggcc tgaccgagct gacaaacgtg gtgggcaact ggagcgacaa 1440
gagggcctcc gccgtggcca ggaccaccta cacccaccag atcaccgcca tccccgacca 1500
ctacttcgcc ctggtgtcca ggtactacgc ctacgacccc atcagcaagg agatgatcgc 1560
cctgaaggac gagaccaacc ccatcgagga gtggcagcac atcgagcagc tgaagggcag 1620
cgccgagggc agcatcagat accccgcctg gaacggcatc atcagccagg aggtgctgga 1680
ctacctgagc agctacatca acaggcggat cagcggcagc gagacccccg gcaccagcga 1740
gagcgccacc cccgagagcg ctggagacat gagagctgcc aacctttggc caagcccgct 1800
catgatcaaa cgctctaaga agaacagcct ggccttgtcc ctgacggccg accagatggt 1860
cagtgccttg ttggatgctg agccccccat actctattcc gagtatgatc ctaccagacc 1920
cttcagtgaa gcttcgatga tgggcttact gaccaacctg gcagacaggg agctggttca 1980
catgatcaac tgggcgaaga gggtgccagg ctttgtggat ttgaccctcc atgatcaggt 2040
ccaccttcta gaatgtgcct ggctagagat cctgatgatt ggtctcgtct ggcgctccat 2100
ggagcaccca gtgaagctac tgtttgctcc taacttgctc ttggacagga accagggaaa 2160
atgtgtagag ggcatggtgg agatcttcga catgctgctg gctacatcat ctcggttccg 2220
catgatgaat ctgcagggag aggagtttgt gtgcctcaaa tctattattt tgcttaattc 2280
tggagtgtac acatttctgt ccagcaccct gaagtctctg gaagagaagg accatatcca 2340
ccgagtcctg gacaagatca cagacacttt gatccacctg atggccaagg caggcctgac 2400
cctgcagcag cagcaccagc ggctggccca gctcctcctc atcctctccc acatcaggca 2460
catgagtaac aaaggcatgg agcatctgta cagcatgaag tgcaagaacg tggtgcccct 2520
ctatgacctg ctgctggagg cggcggacgc ccaccgccta catgcgccca ctagccgtgg 2580
aggggcatcc gtggaggaga cggaccaaag ccacttggcc actgcgggct ctacttcatc 2640
gcattccttg caaaagtatt acatcacggg ggaggcagag ggtttccctg ccaca 2695
<210> 870
<211> 2932
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HBP2-TO-STOP3-mCherry-fLuc
<400> 870
ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggtccg 60
gcacgccccc aggtaaagtg tacatatacc aagcagagct ctccctatca gtgatagaga 120
tctccctatc agtgatagag atcggtaccg agctcggatc cactagtcca gtgtggtgga 180
attcgccacc atgtggaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttct aataataaat 240
aataataatt agtagtagga ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt 300
tttgtgtgga ataaaatgca tttgtataaa aaatgcttta aatgatggat atgttacttt 360
agcaagaact tttaggtcag gtttctcctt tgttttgaat aaatgggaat tgaaaaaagc 420
tgcgagatgt gtgcttattt agggaaacac ggctggctga tggaggcatg gggtgaagtt 480
cctattctct agaaagtata ggaacttcgt gagcaagggc gaggaggata acatggccat 540
catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt 600
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<210> 871
<211> 8648
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HBP2-TO-STOP3-SVV-mCherry
<400> 871
ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggtccg 60
gcacgccccc aggtaaagtg tacatatacc aagcagagct ctccctatca gtgatagaga 120
tctccctatc agtgatagag atcggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 180
ttctaataat aaataataat aattagtagt aggaataaaa tatctttatt ttcattacat 240
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ctgtaaccac atgctgttag tccctttatg gctgcaagat ggctacccac ctcggatcac 900
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acctacaggg tgaaattgaa attttaaggt ctttcaatga ataccaaatt cgcgccgcca 1380
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ttgaagaccc gaccaaatct gatcctccgt ccagcagcac agatcaaccc accaccactt 1800
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cggccgggac ggacgaagaa caggggccca ttcctacggc acccagagaa aattcgctta 2520
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ttgccgttcc cacccagttc gatgacaggc ctctcatctc cttcccgatc accctttcag 2760
atcccgtcta tcagaacacc ctggttggcg ccatcagttc aaatttcgcc aattaccgtg 2820
ggtgtatcca aatcactctg acattttgtg gacccatgat ggcgagaggg aaattcctgc 2880
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acgtggccgt gtacattcgg tacaagaacg cacgtgcctg gtgccccagc atgcttccct 3960
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cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg 4260
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atggatacaa aggacagttc gtgaccttga tggatgattt gggacaaaac ccggatggac 5700
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aagcaattct gggcatcccc ggactagacc ccatggatcc ccacacagct ccgggtctgc 7440
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ctgtctcggt gcacgcttac ggcgagcgtc gcatcaagat taccggtggc ctcccctccg 7980
gttgtgccgc gaccagcctg ctgaacacag tgctcaacaa tgtgatcatc aggactgctc 8040
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tcgagaagct gcaatctgtt tctatgttgg ctcaacattc tggaaaagaa gaatatgata 8400
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gatggagggc cttgttcgac tgacccagat agcccaaggc gcttcggtgc tgccggcgat 8520
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gaatggga 8648
<210> 872
<211> 14108
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全14.1 kbp插入序列
<400> 872
gctttgacat tgattattga ctagtaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60
cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240
tgtctgtttc tcgagtttac tagtgaccgg tttacacctt cctcttcttc ttgggaaact 300
ctctactgcc agaataggca ctgccggact cgcacttcaa ctgcttctcc aggccacaga 360
taatgagctc caacccaaac agaaaagcgg gttcggcgcc ctgatggtcg aacagctcaa 420
tggcctgcct cagcagtggg ggcatggagt cggtggtggg ggtctctcgc tcctccttgg 480
ccacctggtg ttcctggtcc tccagcacac agcccagggt gaagtggccg acggcagaca 540
aggcgtacag ggcgttttcc aagctgaagc cctgctgaca caggaaagcc agctggttct 600
ccaaagtctc gtattgcttc tcggtgggtc tggtgcccag gtgcaccttg gcgccgtccc 660
tgtgggacaa cagggcgcac cggaaggact tggcattgtt cctcaggaag tcctgccaag 720
actcgccctc caggggacag aaatgggtgt gatggcggtc cagcatttcg atagccagag 780
catccaagag ggctcttttg ttcttcacgt gccagtagag ggtgggttgt tccacgccca 840
atttttgagc caacttcctt gtggtcaggc cctcaatgcc cacttcgttc aagagttcca 900
gggcagaatt gatgaccttg gacttgtcca gtctagacat gaccttccgc ttcttctttg 960
gggccatggt ggcaccggtg gatcctctag agtcggtgtc ttctatggag gtcaaaacag 1020
cgtggatggc gtctccaggc gatctgacgg ttcactaaac gagctctgct tatatagagc 1080
tcggggagca gaagcgcgcg aacagaagcg agaagcgaac tgattggtta gttcaaataa 1140
ggcacagggt catttcaggt ccttggggca ccctggaaac atctgatggt tctctagaaa 1200
ctgctgaggg cgggaccgca tctggggacc atctgttctt ggccctgagc cggggcagga 1260
actgcttacc acagatatcc tgtttggccc atattctgct gttccaactg ttcttggccc 1320
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tctgttctta ttaatagtaa tcaattacgg ggcatgatca aagcttccac gcccaccggc 1440
tgatgacgcg cggggtgtgg gaggggctgg ggcggcgcgg tcccaggtcc acttcgcata 1500
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cgagctcgga tccactagtc cagtgtggtg gaattcgcca ccatgtgccc acctcaggca 1620
caggcagagg tgggccctac catgactgag aaggcagaga tggtgtgtgc ccctagccca 1680
gcgcctgccc caccccctaa gcctgcctcg cctgggcccc cgcaggtgga ggagatgagc 1740
cagttcgaca tcctgtgcaa gacccccccc aaggtgctgg tgcggcagtt cgtggagaga 1800
ttcgagaggc ccagcggcga gaagatcgcc agctgtgccg ccgagctgac ctacctgtgc 1860
tggatgatca cccacaacgg caccgccatc aagagggcca ccttcatgag ctacaacacc 1920
atcatcagca acagcctgag cttcgacatc gtgaacaaga gcctgcagtt caagtacaag 1980
acccagaagg ccaccatcct ggaggccagc ctgaagaagc tgatccccgc ctgggagttc 2040
accatcatcc cttacaacgg ccagaagcac cagagcgaca tcaccgacat cgtgtccagc 2100
ctgcagctgc agttcgagag cagcgaggag gccgacaagg gcaacagcca cagcaagaag 2160
atgctgaagg ccctgctgtc cgagggcgag agcatctggg agatcaccga gaagatcctg 2220
aacagcttcg agtacaccag caggttcacc aagaccaaga ccctgtacca gttcctgttc 2280
ctggccacat tcatcaactg cggcaggtag gggagctggc tgggtggggc agccccggga 2340
gcgggcggga ggcaagggcg ctttctctgc acaggagcct cccggtttcc ggggtggggg 2400
ctgcgcccgt gctcagggct tcttgtcctt tccttcccag gttcagcgac atcaagaacg 2460
tggaccccaa gagcttcaag ctggtgcaga acaagtacct gggcgtgatc attcagtgcc 2520
tggtgaccga gaccaagaca agcgtgtcca ggcacatcta ctttttcagc gccagaggca 2580
ggatcgaccc cctggtgtac ctggacgagt tcctgaggaa cagcgagccc gtgctgaaga 2640
gagtgaacag gaccggcaac agcagcagca acaagcagga gtaccagctg ctgaaggaca 2700
acctggtgcg cagctacaac aaggccctga agaagaacgc cccctacccc atcttcgcta 2760
tcaagaacgg ccctaagagc cacatcggca ggcacctgat gaccagcttt ctgagcatga 2820
agggcctgac cgagctgaca aacgtggtgg gcaactggag cgacaagagg gcctccgccg 2880
tggccaggac cacctacacc caccagatca ccgccatccc cgaccactac ttcgccctgg 2940
tgtccaggta ctacgcctac gaccccatca gcaaggagat gatcgccctg aaggacgaga 3000
ccaaccccat cgaggagtgg cagcacatcg agcagctgaa gggcagcgcc gagggcagca 3060
tcagataccc cgcctggaac ggcatcatca gccaggaggt gctggactac ctgagcagct 3120
acatcaacag gcggatcagc ggcagcgaga cccccggcac cagcgagagc gccacccccg 3180
agagcgctgg agacatgaga gctgccaacc tttggccaag cccgctcatg atcaaacgct 3240
ctaagaagaa cagcctggcc ttgtccctga cggccgacca gatggtcagt gccttgttgg 3300
atgctgagcc ccccatactc tattccgagt atgatcctac cagacccttc agtgaagctt 3360
cgatgatggg cttactgacc aacctggcag acagggagct ggttcacatg atcaactggg 3420
cgaagagggt gccaggcttt gtggatttga ccctccatga tcaggtccac cttctagaat 3480
gtgcctggct agagatcctg atgattggtc tcgtctggcg ctccatggag cacccagtga 3540
agctactgtt tgctcctaac ttgctcttgg acaggaacca gggaaaatgt gtagagggca 3600
tggtggagat cttcgacatg ctgctggcta catcatctcg gttccgcatg atgaatctgc 3660
agggagagga gtttgtgtgc ctcaaatcta ttattttgct taattctgga gtgtacacat 3720
ttctgtccag caccctgaag tctctggaag agaaggacca tatccaccga gtcctggaca 3780
agatcacaga cactttgatc cacctgatgg ccaaggcagg cctgaccctg cagcagcagc 3840
accagcggct ggcccagctc ctcctcatcc tctcccacat caggcacatg agtaacaaag 3900
gcatggagca tctgtacagc atgaagtgca agaacgtggt gcccctctat gacctgctgc 3960
tggaggcggc ggacgcccac cgcctacatg cgcccactag ccgtggaggg gcatccgtgg 4020
aggagacgga ccaaagccac ttggccactg cgggctctac ttcatcgcat tccttgcaaa 4080
agtattacat cacgggggag gcagagggtt tccctgccac atgagaattc tgcagatatc 4140
cagcacagtg gcggccgctc gagtctagag ggcccgttta acccgctgat cagcctaata 4200
aaagtgcaca ccttaaaatg aggccaagtg tgactttgtg gtgtggctgg gttgggggca 4260
gcagagggtg aaccctgcag gagggtgaac cctgcaaaag ggtggggcag tgggggggcc 4320
taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttaa tctagaccca actttgtata 4380
caaaagttgg ctttgaccgc ggattgatta ttgactagcc ccagacccta gaataagaca 4440
ggacaagtaa ctggttgagc acagggtact ttatttttct cgagtttact agtgaccggt 4500
tcatgatcag ccagtaagca gtgggttctc tagttagcca gagagctctg cttatataga 4560
cctcccaccg tacacgccta ccgcccattt gcgtcaatgg ggcggagttg ttacgacatt 4620
ttggaaagtc ccgttgattt tggtgccaaa acaaactccc attgacgtca atggggtgga 4680
gacttggaaa tccccgtgag tcaaaccgct atccacgccc attgatgtac tgccaaaacc 4740
gcatcaccat ggtaatagcg atgactaata cgtagatgta ctgccaagta ggaaagtccc 4800
ataaggtcat gtactgggca taatgccagg cgggccattt accgtcattg acgtcaatag 4860
ggggcgtact tggcatatga tacacttgat gtactgccaa gtgggcagtt taccgtaaat 4920
actccaccca ttgacgtcaa tggaaagtcc ctattggcgt tactatggga acatacgtca 4980
ttattgacgt caatgggcgg gggtcgttgg gcggtcagcc aggcgggcca tttaccgtaa 5040
gttatgtaac gcggaactcc atatatgggc tatgaactaa tgaccccgta attgattact 5100
attaataact agtcaataat caatgtaagc ttaccccgcc cagcgtcttg tcattggcga 5160
attcgaacac gcagatgcag tcggggcggt ccggcacgcc cccaggtaaa gtgtacatat 5220
accaagcaga gctctcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata gagatcggta 5280
ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttctaat aataaataat aataattagt 5340
agtaggaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtggaata 5400
aaatgcattt gtataaaaaa tgctttaaat gatggatatg ttactttagc aagaactttt 5460
aggtcaggtt tctcctttgt tttgaataaa tgggaattga aaaaagctgc gagatgtgtg 5520
cttatttagg gaaacacggc tggctgatgg aggcatgggg tgaagttcct attctctaga 5580
aagtatagga acttcgcggc cgcttatcaa actgatgagt ccgtgaggac gaaacgagta 5640
agctcgtctt tgaaatgggg ggctgggccc tgatgcccag tccttccttt ccccttccgg 5700
ggggttaacc ggctgtgttt gctagaggca cagaggggca acatccaacc tgcttttgcg 5760
gggaacggtg cggctccgat tcctgcgtcg ccaaaggtgt tagcgcaccc aaacggcgca 5820
cctaccaatg ttattggtgt ggtctgcgag ttctagccta ctcgtttctc ccccgaccat 5880
tcactcaccc acgaaaagtg tgttgtaacc ataagattta acccccgcac gggatgtgcg 5940
ataaccgtaa gactggctca agcgcggaaa gcgctgtaac cacatgctgt tagtcccttt 6000
atggctgcaa gatggctacc cacctcggat cactgaactg gagctcgacc ctccttagta 6060
agggaaccga gaggccttcg tgcaacaagc tccgacacag agtccacgtg actgctacca 6120
ccatgagtac atggttctcc cctctcgacc caggacttct ttttgaatat ccacggctcg 6180
atccagaggg tggggcatga cccctagcat agcgagctac agcgggaact gtagctaggc 6240
cttagcgtgc cttggatact gcctgatagg gcgacggcct agtcgtgtcg gttctatagg 6300
tagcacatac aaatatgcag aactctcatt tttctttcga tacagcctct ggcacctttg 6360
aagatgtaac cggaacaaaa gtcaagatcg ttgaataccc cagatcggtg aacaatggtg 6420
tttacgattc gtctactcat ttggagatac tgaacctaca gggtgaaatt gaaattttaa 6480
ggtctttcaa tgaataccaa attcgcgccg ccaaacaaca actcggactg gacatcgtgt 6540
acgaactaca gggtaatgtt cagacaacgt caaagaatga ttttgattcc cgtggcaata 6600
atggtaacat gaccttcaat tactacgcaa acacttatca gaattcagta gacttctcga 6660
cctcctcgtc ggcgtcaggc gccggacctg ggaactctcg gggcggatta gcgggtctcc 6720
tcacaaattt cagtggaatc ttgaaccctc ttggctacct caaagatcac aacaccgaag 6780
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ccggtgcctt tctgtctagg cagggaggcc tcaacggagg ggccttcaca gctaccctac 7080
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acggtaaggc aaagagctta caggagctga atgaagaaca gtgggtggaa atgtctgacg 7260
attaccggac cgggaaaaac atgccttttc agtctcttgg cacatactat cggcccccta 7320
actggacttg gggtcccaat ttcatcaacc cctatcaagt aacggttttc ccacaccaaa 7380
ttctgaacgc gagaacctct acctcggtag acataaacgt cccatacatc ggggagaccc 7440
ccacgcaatc ctcagagaca cagaactcct ggaccctcct cgttatggtg ctcgttcccc 7500
tagactataa ggaaggagcc acaactgacc cagaaattac attttctgta aggcctacaa 7560
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ccattcctac ggcacccaga gaaaattcgc ttatgtttct ctcaaccctc cctgacgaca 7680
ctgtccctgc ttacgggaat gtgcgtaccc ctcctgtcaa ttacctccct ggtgaaataa 7740
ccgacctttt gcaactggcc cgcataccca ctctcatggc atttgagcgg gtgcctgaac 7800
ccgtgcctgc ctcagacaca tatgtgccct acgttgccgt tcccacccag ttcgatgaca 7860
ggcctctcat ctccttcccg atcacccttt cagatcccgt ctatcagaac accctggttg 7920
gcgccatcag ttcaaatttc gccaattacc gtgggtgtat ccaaatcact ctgacatttt 7980
gtggacccat gatggcgaga gggaaattcc tgctctcgta ttctccccca aatggaacgc 8040
aaccacagac tctttccgaa gctatgcagt gcacatactc tatttgggac ataggcttga 8100
actctagttg gaccttcgtc gtcccctaca tctcgcccag tgactaccgt gaaactcgag 8160
ccattaccaa ctcggtttac tccgctgatg gttggtttag cctgcacaag ttgaccaaaa 8220
ttactctacc acctgactgt ccgcaaagtc cctgcattct ctttttcgct tctgctggtg 8280
aggattacac tctccgtctc cccgttgatt gtaatccttc ctatgtgttc cactccaccg 8340
acaacgccga gaccggggtt attgaggcgg gtaacactga caccgatttc tctggtgaac 8400
tggcggctcc tggctctaac cacactaatg tcaagttcct gtttgatcga tctcgattat 8460
tgaatgtaat caaggtactg gagaaggacg ccgttttccc ccgccctttc cctacacaag 8520
aaggtgcgca gcaggatgat ggttactttt gtcttctgac cccccgccca acagtcgctt 8580
cccgacccgc cactcgtttc ggcctgtacg ccaatccgtc cggcagtggt gttcttgcta 8640
acacttcact ggacttcaat ttttatagct tggcctgttt cacttacttt agatcggacc 8700
ttgaggttac ggtggtctca ctagagccgg atctggaatt tgctgtaggg tggtttcctt 8760
ctggcagtga ataccaggct tccagctttg tctacgacca gctgcatgtg cccttccact 8820
ttactgggcg cactccccgc gctttcgcta gcaagggtgg gaaggtatct ttcgtgctcc 8880
cttggaactc tgtctcgtct gtgctccccg tgcgctgggg gggggcttcc aagctctctt 8940
ctgctacgcg gggtctaccg gcgcatgctg attgggggac tatttacgcc tttgtccccc 9000
gtcctaatga gaagaaaagc accgctgtaa aacacgtggc cgtgtacatt cggtacaaga 9060
acgcacgtgc ctggtgcccc agcatgcttc cctttcgcag ctacaagcag aagatgctga 9120
tgcaatctgg cgatatcgag accaatcccg ggccgagcaa gggcgaggag gataacatgg 9180
ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg 9240
agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc 9300
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tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt 9420
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cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga 9660
agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc 9720
ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg 9780
aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca 9840
tggacgagct gtacaaggag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga 9900
atcccgggcc tgcttctgac aacccaattt tggagtttct tgaagcagaa aatgatctag 9960
tcactctggc ctctctctgg aagatggtgc actctgttca acagacctgg agaaagtatg 10020
tgaagaacga tgatttttgg cccaatttac tcagcgagct agtgggggaa ggctctgtcg 10080
ccttggccgc cacgctatcc aaccaagctt cagtaaaggc tcttttgggc ctgcactttc 10140
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tcgattggct gcaggcctgg atcaacaaag agaaagccag ccctgtcctc cagtaccagt 10440
tggagatgaa gaagctcggg cctgtggcct tggctcatga cgctttcatg gctggttccg 10500
ggccccctct tagcgacgac cagattgaat acctccagaa cctcaaatct cttgccctaa 10560
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cagcccaacg agttgaaccc gttgtggtgg tccttagagg caagccggga tgcggcaaga 10680
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cctccaatct catcattgca actacaaatc tcccccactt cagtcctgtc accattgctg 10980
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acaagaaaca cacacggctg aattttgact tggctttcag gcgcacagac gcccccccca 11100
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cccccgtcga cgaggcgttg ggtagagttc tctcccccgc tgcggtcgat gaggcgcttg 11340
tcgacctcac tccagaggcc gacccggttg gccgtttggc tattcttgcc aagctaggtc 11400
ttgccctagc tgcggtcacc cctggtctga taatcttggc agtgggactc tacaggtact 11460
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ttctggtgac cggccggacc ttcctaatca atgaacatac atggtccaat ccctcctgga 11760
ccagcttcac aatccgcggt gaggtacaca ctcgtgatga gcccttccaa acggttcatt 11820
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tccctaacaa tctagacaag tttggacttg accagatgcc ggcacgcaac tcccgtgtgg 11940
ttggcgtttc gtccagttac ggaaacttct tcttctctgg aaatttcctc ggatttgttg 12000
attccatcac ctctgaacaa ggaacttacg caagactctt taggtacagg gtgacgacct 12060
acaaaggatg gtgcggctcg gccctggtct gtgaggccgg tggcgtccga cgcatcattg 12120
gcctgcattc tgctggcgcc gccggtatcg gcgccgggac ctatatctca aaattaggac 12180
taatcaaagc cctgaaacac ctcggtgaac ctttggccac aatgcaagga ctgatgactg 12240
aattagagcc tggaatcacc gtacatgtac cccggaaatc caaattgaga aagacgaccg 12300
cacacgcggt gtacaaaccg gagtttgagc ctgctgtgtt gtcaaaattt gatcccagac 12360
tgaacaagga tgttgacttg gatgaagtaa tttggtctaa acacactgcc aatgtccctt 12420
accaacctcc tttgttctac acatacatgt cagagtacgc tcatcgagtc ttctccttct 12480
tggggaaaga caatgacatt ctgaccgtca aagaagcaat tctgggcatc cccggactag 12540
accccatgga tccccacaca gctccgggtc tgccttacgc catcaacggc cttcgacgta 12600
ctgatctcgt cgattttgtg aacggtacag tagatgcggc gctggctgta caaatccaga 12660
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attgcattgt gggcagaatg ttgcttgggc gctttgctgc caagtttcaa tcccatcctg 12840
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ctcaactcga ggggagaaag aacacgtatg acgtggacta cagtgccttt gactcttcac 12960
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gccctgcgct gggaccgtat ctcagatccc tggctgtctc ggtgcacgct tacggcgagc 13080
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tggcgccggc tgggcaacat gcttcggcat ggcgaatggg acgcggccgc tcgagtctag 13800
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gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 13920
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 13980
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 14040
gcggtgggct ctatggggcc taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttaa 14100
tctagacc 14108
<210> 873
<211> 8480
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ONCR-189的SVV表达盒
<400> 873
gctttgacat tgattattga ctagacattg attattgact agtacattga ttattgacta 60
gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 120
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 180
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 240
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 300
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 360
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 420
tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 480
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 540
actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 600
ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc 660
ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 720
gcttggtacc ttatcaaact gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctttga 780
aatggggggc tgggccctga tgcccagtcc ttcctttccc cttccggggg gttaaccggc 840
tgtgtttgct agaggcacag aggggcaaca tccaacctgc ttttgcgggg aacggtgcgg 900
ctccgattcc tgcgtcgcca aaggtgttag cgcacccaaa cggcgcacct accaatgtta 960
ttggtgtggt ctgcgagttc tagcctactc gtttctcccc cgaccattca ctcacccacg 1020
aaaagtgtgt tgtaaccata agatttaacc cccgcacggg atgtgcgata accgtaagac 1080
tggctcaagc gcggaaagcg ctgtaaccac atgctgttag tccctttatg gctgcaagat 1140
ggctacccac ctcggatcac tgaactggag ctcgaccctc cttagtaagg gaaccgagag 1200
gccttcgtgc aacaagctcc gacacagagt ccacgtgact gctaccacca tgagtacatg 1260
gttctcccct ctcgacccag gacttctttt tgaatatcca cggctcgatc cagagggtgg 1320
ggcatgaccc ctagcatagc gagctacagc gggaactgta gctaggcctt agcgtgcctt 1380
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tatgcagaac tctcattttt ctttcgatac agcctctggc acctttgaag atgtaaccgg 1500
aacaaaagtc aagatcgttg aataccccag atcggtgaac aatggtgttt acgattcgtc 1560
tactcatttg gagatactga acctacaggg tgaaattgaa attttaaggt ctttcaatga 1620
ataccaaatt cgcgccgcca aacaacaact cggactggac atcgtgtacg aactacaggg 1680
taatgttcag acaacgtcaa agaatgattt tgattcccgt ggcaataatg gtaacatgac 1740
cttcaattac tacgcaaaca cttatcagaa ttcagtagac ttctcgacct cctcgtcggc 1800
gtcaggcgcc ggacctggga actctcgggg cggattagcg ggtctcctca caaatttcag 1860
tggaatcttg aaccctcttg gctacctcaa agatcacaac accgaagaaa tggaaaactc 1920
tgctgatcga gtcacaacgc aaacggcggg caacactgcc ataaacacgc aatcatcatt 1980
gggtgtgttg tgtgcctacg ttgaagaccc gaccaaatct gatcctccgt ccagcagcac 2040
agatcaaccc accaccactt tcactgccat cgacaggtgg tacactggac gtctcaattc 2100
ttggacaaaa gctgtaaaaa ccttctcttt tcaggccgtc ccgcttcccg gtgcctttct 2160
gtctaggcag ggaggcctca acggaggggc cttcacagct accctacata gacacttttt 2220
gatgaagtgc gggtggcagg tgcaggtcca atgtaatttg acacaattcc accaaggcgc 2280
tcttcttgtt gccatggttc ctgaaaccac ccttgatgtc aagcccgacg gtaaggcaaa 2340
gagcttacag gagctgaatg aagaacagtg ggtggaaatg tctgacgatt accggaccgg 2400
gaaaaacatg ccttttcagt ctcttggcac atactatcgg ccccctaact ggacttgggg 2460
tcccaatttc atcaacccct atcaagtaac ggttttccca caccaaattc tgaacgcgag 2520
aacctctacc tcggtagaca taaacgtccc atacatcggg gagaccccca cgcaatcctc 2580
agagacacag aactcctgga ccctcctcgt tatggtgctc gttcccctag actataagga 2640
aggagccaca actgacccag aaattacatt ttctgtaagg cctacaagtc cctacttcaa 2700
tgggcttcgc aaccgctaca cggccgggac ggacgaagaa caggggccca ttcctacggc 2760
acccagagaa aattcgctta tgtttctctc aaccctccct gacgacactg tccctgctta 2820
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agacacatat gtgccctacg ttgccgttcc cacccagttc gatgacaggc ctctcatctc 3000
cttcccgatc accctttcag atcccgtcta tcagaacacc ctggttggcg ccatcagttc 3060
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ggtttactcc gctgatggtt ggtttagcct gcacaagttg accaaaatta ctctaccacc 3360
tgactgtccg caaagtccct gcattctctt tttcgcttct gctggtgagg attacactct 3420
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ctcgtctgtg ctccccgtgc gctggggggg ggcttccaag ctctcttctg ctacgcgggg 4080
tctaccggcg catgctgatt gggggactat ttacgccttt gtcccccgtc ctaatgagaa 4140
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gagaaagtat gtgaagaacg atgatttttg gcccaattta ctcagcgagc tagtggggga 4440
aggctctgtc gccttggccg ccacgctatc caaccaagct tcagtaaagg ctcttttggg 4500
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caaagactgg aaccaaatag ctgccggctt gaagaatttt caatttgttc gtgacctagt 4740
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cgcccccccc atttatcctt ttgctgccca tgtgcccttt gtggacgtag ctgtgcgctt 5520
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cgctaagaaa gtggtcgtcc ccattacctt catggttccc aacagacctt ctgggcttac 6060
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tccctcctgg accagcttca caatccgcgg tgaggtacac actcgtgatg agcccttcca 6180
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ctcccgtgtg gttggcgttt cgtccagtta cggaaacttc ttcttctctg gaaatttcct 6360
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aaaattagga ctaatcaaag ccctgaaaca cctcggtgaa cctttggcca caatgcaagg 6600
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caatgtccct taccaacctc ctttgttcta cacatacatg tcagagtacg ctcatcgagt 6840
cttctccttc ttggggaaag acaatgacat tctgaccgtc aaagaagcaa ttctgggcat 6900
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agatgagatc agaccctcag agaaagtccg agcgggaaaa acccgcattg ttgatgtgcc 7140
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gaatttggaa gccatgctct cctacttcaa accaggaaca ctactcgaga agctgcaatc 7860
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catgctgggg atgcggtggg ctctatgggg cctaggcttt tgcaaaaagc taacttgttt 8460
attgcagctt aatctagacc 8480
<210> 874
<211> 9100
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ONCR-190的SVV表达盒
<400> 874
gctttgacat tgattattga ctagacattg attattgact agtacattga ttattgacta 60
gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 120
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 180
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 240
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 300
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 360
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tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 480
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actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 600
ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc 660
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gcttggtacc ttaattaatt tgaaatgggg ggctgggccc tgatgcccag tccttccttt 780
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tgcttttgcg gggaacggtg cggctccgat tcctgcgtcg ccaaaggtgt tagcgcaccc 900
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gtcaagcccg acggtaaggc aaagagctta caggagctga atgaagaaca gtgggtggaa 2340
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cggcccccta actggacttg gggtcccaat ttcatcaacc cctatcaagt aacggttttc 2460
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tctgctggtg aggattacac tctccgtctc cccgttgatt gtaatccttc ctatgtgttc 3420
cactccaccg acaacgccga gaccggggtt attgaggcgg gtaacactga caccgatttc 3480
tctggtgaac tggcggctcc tggctctaac cacactaatg tcaagttcct gtttgatcga 3540
tctcgattat tgaatgtaat caaggtactg gagaaggacg ccgttttccc ccgccctttc 3600
cctacacaag aaggtgcgca gcaggatgat ggttactttt gtcttctgac cccccgccca 3660
acagtcgctt cccgacccgc cactcgtttc ggcctgtacg ccaatccgtc cggcagtggt 3720
gttcttgcta acacttcact ggacttcaat ttttatagct tggcctgttt cacttacttt 3780
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aatgtccctt accaacctcc tttgttctac acatacatgt cagagtacgc tcatcgagtc 7560
ttctccttct tggggaaaga caatgacatt ctgaccgtca aagaagcaat tctgggcatc 7620
cccggactag accccatgga tccccacaca gctccgggtc tgccttacgc catcaacggc 7680
cttcgacgta ctgatctcgt cgattttgtg aacggtacag tagatgcggc gctggctgta 7740
caaatccaga aattcttaga cggtgactac tctgaccatg tcttccaaac ttttctgaaa 7800
gatgagatca gaccctcaga gaaagtccga gcgggaaaaa cccgcattgt tgatgtgccc 7860
tccctggcgc attgcattgt gggcagaatg ttgcttgggc gctttgctgc caagtttcaa 7920
tcccatcctg gctttctcct cggctctgct atcgggtctg accctgatgt tttctggacc 7980
gtcatagggg ctcaactcga ggggagaaag aacacgtatg acgtggacta cagtgccttt 8040
gactcttcac acggcactgg ctccttcgag gctctcatct ctcacttttt caccgtggac 8100
aatggtttta gccctgcgct gggaccgtat ctcagatccc tggctgtctc ggtgcacgct 8160
tacggcgagc gtcgcatcaa gattaccggt ggcctcccct ccggttgtgc cgcgaccagc 8220
ctgctgaaca cagtgctcaa caatgtgatc atcaggactg ctctggcatt gacttacaag 8280
gaatttgaat atgacatggt tgatatcatc gcctacggtg acgaccttct ggttggcacg 8340
gattacgatc tggacttcaa tgaggtggca cgacgcgctg ccaagttggg gtataagatg 8400
actcctgcca acaagggttc tgtcttccct ccgacttcct ctctttccga tgctgttttt 8460
ctaaagcgca aattcgtcca aaacaacgac ggcttataca aaccagttat ggatttaaag 8520
aatttggaag ccatgctctc ctacttcaaa ccaggaacac tactcgagaa gctgcaatct 8580
gtttctatgt tggctcaaca ttctggaaaa gaagaatatg atagattgat gcaccccttc 8640
gctgactacg gtgccgtacc gagtcacgag tacctgcagg caagatggag ggccttgttc 8700
gactgaccca gatagcccaa ggcgcttcgg tgctgccggc gattctggga gaactcagtc 8760
ggaacagact agtgcggccg ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct 8820
cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 8880
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 8940
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 9000
attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgggg cctaggcttt 9060
tgcaaaaagc taacttgttt attgcagctt aatctagacc 9100
<210> 875
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> KD_KDRT
<400> 875
aaacgatatc agacatttgt ctgataatgc ttcattatca gacaaatgtc tgatatcgtt 60
t 61
<210> 876
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B2_B2RT
<400> 876
gagtttcatt aaggaataac taattcccta atgaaactc 39
<210> 877
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B3_B3RT
<400> 877
ggttgcttaa gaataagtaa ttcttaagca acc 33
<210> 878
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> R_RSRT
<400> 878
ttgatgaaag aataacgtat tctttcatca a 31
<210> 879
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Cre_loxP
<400> 879
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 880
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VCre_VloxP
<400> 880
tcaatttctg agaactgtca ttctcggaaa ttga 34
<210> 881
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SCre_SloxP
<400> 881
ctcgtgtccg ataactgtaa ttatcggaca tgat 34
<210> 882
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Vika_vox
<400> 882
aataggtctg agaacgccca ttctcagacg tatt 34
<210> 883
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Dre_rox
<400> 883
taactttaaa taatgccaat tatttaaagt ta 32
<210> 884
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> λ-Int_attP
<400> 884
cagctttttt atactaagtt g 21
<210> 885
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> λ-Int_attB
<400> 885
ctgctttttt atactaactt g 21
<210> 886
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HK022_attP
<400> 886
atcctttagg tgaataagtt g 21
<210> 887
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HK022_attB
<400> 887
gcactttagg tgaaaaaggt t 21
<210> 888
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> phiC31_attP
<400> 888
ccccaactgg ggtaaccttt gagttctctc agttgggg 38
<210> 889
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> phiC31_attB
<400> 889
gtgccagggc gtgcccttgg gctccccggg cgcg 34
<210> 890
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Bxb1_attP
<400> 890
ggtttgtctg gtcaaccacc gcggtctcag tggtgtacgg tacaaacc 48
<210> 891
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Bxb1_attB
<400> 891
ggcttgtcga cgacggcggt ctccgtcgtc aggatcat 38
<210> 892
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Gin_gix
<400> 892
ttatccaaaa cctcggttta caggaa 26
<210> 893
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Tn3_res位点I
<400> 893
cgttcgaaat attataaatt atcagaca 28
<210> 894
<211> 316
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 894
atctccagaa gaagaagaga aaaggagaat ccgaagggaa aggaataaga tggctgcagc 60
caaatgccgc aaccggagga gggagctgac tgatacactc caagcggaga cagaccaact 120
agaagatgag aagtctgctt tgcagaccga gattgccaac ctgctgaagg agaaggaaaa 180
actagagttc atcctggcag ctcaccgacc tgcctgcaag atccctgatg acctgggctt 240
cccagaagag atgtctgtgg cttcccttga tctgactggg ggcctgccag aggttgccac 300
cccggagtct gaggag 316
<210> 895
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 895
ttttattgtg tttttaattt atttattaag atggattctc agatatttat atttttattt 60
tattttttt 69
<210> 896
<211> 385
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 896
atctccagaa gaagaagaga aaaggagaat ccgaagggaa aggaataaga tggctgcagc 60
caaatgccgc aaccggagga gggagctgac tgatacactc caagcggaga cagaccaact 120
agaagatgag aagtctgctt tgcagaccga gattgccaac ctgctgaagg agaaggaaaa 180
actagagttc atcctggcag ctcaccgacc tgcctgcaag atccctgatg acctgggctt 240
cccagaagag atgtctgtgg cttcccttga tctgactggg ggcctgccag aggttgccac 300
cccggagtct gaggagtttt attgtgtttt taatttattt attaagatgg attctcagat 360
atttatattt ttattttatt ttttt 385
<210> 897
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CMV-TO
<400> 897
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300
cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 360
ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 420
aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 480
taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc cctatcagtg atagagatct 540
ccctatcagt gatagaga 558
<210> 898
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TK-TO
<400> 898
cccgttgctc gcgtttgctg gcggtgtccc cggaagaaat atatttgcat gtctttagtt 60
ctatgatgac acaaaccccg cccagcgtct tgtcattggc gaattcgaac acgcagatgc 120
agtcggggcg gcgcggtccc aggtccactt cgcatattaa gcagagctct ccctatcagt 180
gatagagatc tccctatcag tgatagaga 209
<210> 899
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICP8-TO
<400> 899
tttttttata atagggccac gcccaccggc tgatgacgcg cggggtgtgg gaggggctgg 60
ggcggtccgg cacgccccca ggtaaagtgt acatatacca accgcatatc agacgcgcag 120
agctctccct atcagtgata gagatctccc tatcagtgat agaga 165
<210> 900
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gB-TO
<400> 900
tcgcttcttc gagctcgtca acgggcccct ctttgatcac tccacccaca gcttcgccca 60
gccccccaac accgcgctgt attacagcgt cgagaacgtg gggctcctgc cgcacctgaa 120
ggaggagctc gcccggttca tcatgggggc ggggggctcg ggtgctgatt gggccgtcag 180
cgaatttcag aggttttact gttttgacgg catttccgga ataacgccca ctcagcgcgc 240
cgcctggcga tatattcgca gagctctccc tatcagtgat agagatctcc ctatcagtga 300
tagaga 306
<210> 901
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gC-TO
<400> 901
gtgatgattt cgccataaca cccaaacccc ggatggggcc cgggtataaa gcagagctct 60
ccctatcagt gatagagatc tccctatcag tgatagaga 99
<210> 902
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(40)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(80)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(120)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 902
ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
ggcattcacc gcgtgcctta 140
<210> 903
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(42)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(83)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(125)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (147)..(166)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (189)..(208)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (230)..(249)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (272)..(291)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 903
atacatactt ctttacattc cannnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctaca gtgcttcatc 60
tcannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatacata cttctttaca ttccannnnn nnnnnnnnnn 120
nnnnngagct acagtgcttc atctcannnn nnnnnnnnnn nnnnnnatac atacttcttt 180
acattccann nnnnnnnnnn nnnnnnnnga gctacagtgc ttcatctcan nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnna tacatacttc tttacattcc annnnnnnnn nnnnnnnnnn ngagctacag 300
tgcttcatct ca 312
<210> 904
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(40)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(80)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(120)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (141)..(160)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (183)..(202)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (224)..(243)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (266)..(285)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (307)..(326)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (349)..(368)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (390)..(409)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (432)..(451)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 904
ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn atacatactt ctttacattc 180
cannnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctaca gtgcttcatc tcannnnnnn nnnnnnnnnn 240
nnnatacata cttctttaca ttccannnnn nnnnnnnnnn nnnnngagct acagtgcttc 300
atctcannnn nnnnnnnnnn nnnnnnatac atacttcttt acattccann nnnnnnnnnn 360
nnnnnnnnga gctacagtgc ttcatctcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnna tacatacttc 420
tttacattcc annnnnnnnn nnnnnnnnnn ngagctacag tgcttcatct ca 472
<210> 905
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(41)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(83)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(124)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (147)..(166)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (188)..(207)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (229)..(248)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(290)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (312)..(331)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (353)..(372)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (394)..(413)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (436)..(455)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 905
agaattgcgt ttggacaatc annnnnnnnn nnnnnnnnnn ncaaacacca ttgtcacact 60
ccannnnnnn nnnnnnnnnn nnnaaagaga ccggttcact gtgrnnnnnn nnnnnnnnnn 120
nnnncaaaca ccattgtcac actccannnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa ttgcgtttgg 180
acaatcannn nnnnnnnnnn nnnnnnnaaa gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnca aacaccattg tcacactcca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aaagagaccg 300
gttcactgtg rnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nagaattgcg tttggacaat cannnnnnnn 360
nnnnnnnnnn nnaaagagac cggttcactg tgrnnnnnnn nnnnnnnnnn nnncaaacac 420
cattgtcaca ctccannnnn nnnnnnnnnn nnnnnagaat tgcgtttgga caatca 476
<210> 906
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(41)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(82)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(124)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (146)..(165)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (187)..(206)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (229)..(248)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (270)..(289)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (311)..(330)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (353)..(372)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (394)..(413)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (435)..(454)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 906
aaagagaccg gttcactgtg rnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nagaattgcg tttggacaat 60
cannnnnnnn nnnnnnnnnn nnaggcatag gatgacaaag ggaannnnnn nnnnnnnnnn 120
nnnnaaagag accggttcac tgtgrnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnagaat tgcgtttgga 180
caatcannnn nnnnnnnnnn nnnnnnaggc ataggatgac aaagggaann nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnaa agagaccggt tcactgtgrn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gaattgcgtt 300
tggacaatca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aggcatagga tgacaaaggg aannnnnnnn 360
nnnnnnnnnn nnaaagagac cggttcactg tgrnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnagaattg 420
cgtttggaca atcannnnnn nnnnnnnnnn nnnnaggcat aggatgacaa agggaa 476
<210> 907
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> miRNA-TS
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<222> (405)..(424)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
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<222> (447)..(466)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<400> 907
acaaaccttt tgttcgtctt atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncrcattat tactcacggt 60
acgannnnnn nnnnnnnnnn nnnnctacgc gtattcttaa gcaataannn nnnnnnnnnn 120
nnnnnnnaca aaccttttgt tcgtcttatn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 180
cttaagcaat aannnnnnnn nnnnnnnnnn nncrcattat tactcacggt acgannnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnnacaaac cttttgttcg tcttatnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnctac 300
gcgtattctt aagcaataan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc rcattattac tcacggtacg 360
annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca ataannnnnn nnnnnnnnnn 420
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnncrcatta ttactcacgg 60
tacgannnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120
nnnnnnnncr cattattact cacggtacga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccaatcagt 180
tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnctacgcg tattcttaag caataannnn 240
nnnnnnnnnn nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 300
rcattattac tcacggtacg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca 360
ataannnnnn nnnnnnnnnn nnnncrcatt attactcacg gtacgannnn nnnnnnnnnn 420
nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 480
cttaagcaat aa 492
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ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnagccaag ctcagacgga 60
tccgannnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120
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tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnctacgcg tattcttaag caataannnn 240
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gccaagctca gacggatccg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca 360
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<222> (65)..(84)
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<220>
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ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnaaagaga ccggttcact 60
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nnnnnnnaaa gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntc caatcagttc 180
ctgatgcagt annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca ataannnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnntccaat cagttcctga tgcagtannn nnnnnnnnnn nnnnnnnaaa 300
gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnct acgcgtattc ttaagcaata 360
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nntccaatca gttcctgatg cagtannnnn nnnnnnnnnn nnnnnctacg cgtattctta 480
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA-TS
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(43)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(85)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(128)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (151)..(170)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (194)..(213)
<223> n是任何天然存在的核苷酸，并且其中至多19个可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (237)..(256)
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ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatacttt ttggggtaag 60
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nnnnnnnnnn nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnna 300
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<220>
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<222> (24)..(43)
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<220>
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<222> (449)..(468)
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<400> 912
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cactgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120
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tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgccct ttcatcattg cactgnnnnn 240
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ttaagcaata a 491
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K4适体酶
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ggcgcgtcct ggattcgtac aaaacatacc agatttcgat ctggagaggt gaagaatacg 60
accacctgta catccagctg atgagtccca aataggacga aacgcgct 108
<210> 914
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K7适体酶
<400> 914
ggcgcgtcct ggattcgtgc aaaacatacc agatttcgat ctggagaggt gaagaatacg 60
accacctgta catccagctg atgagtccca aataggacga aacgcgct 108

Claims (182)

1.一种重组初级溶瘤病毒，其包括：
编码次级溶瘤病毒的多核苷酸。
2.一种重组初级病毒，其包括：
编码次级病毒的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。
4.根据权利要求2所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。
5.根据权利要求1所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是没有复制能力的。
6.根据权利要求2所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是没有复制能力的。
7.根据权利要求1、3和5中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。
8.根据权利要求2、4和6中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸与可调节启动子可操作地连接。
9.根据权利要求1、3、5和7中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
10.根据权利要求2、4、6和8中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
11.根据权利要求1、3、5、7和9中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
12.根据权利要求2、4、6、8和10中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
13.根据权利要求11或12所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒。
14.根据权利要求11或12所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是痘病毒科病毒。
15.根据权利要求14所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。
16.根据权利要求1、3、5、7和9中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是RNA病毒。
17.根据权利要求2、4、6、8和10中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是RNA病毒。
18.根据权利要求16或17所述的病毒，其中所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
19.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16和18中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
20.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15和17到18中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
21.根据权利要求19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的负义ssRNA病毒。
22.根据权利要求21所述的病毒，其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒。
23.根据权利要求21所述的病毒，其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹病毒。
24.根据权利要求21所述的病毒，其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。
25.根据权利要求19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是肠道病毒。
26.根据权利要求25所述的病毒，其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)或艾柯病毒(echovirus)。
27.根据权利要求26所述的病毒，其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)。
28.根据权利要求27所述的病毒，其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。
29.根据权利要求19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)。
30.根据权利要求19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是门戈病毒(Mengovirus)。
31.根据权利要求19或20所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒。
32.根据权利要求31所述的病毒，其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒。
33.根据权利要求32所述的病毒，其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、罗斯河病毒(Ross River Virus)或马雅罗病毒(Mayaro virus)。
34.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19和21到33中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。
35.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18和20到33中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。
36.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19和21到34中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。
37.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33和35中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。
38.根据权利要求36所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是假型化病毒，并且其中所述初级溶瘤病毒包括所述次级溶瘤病毒的在所述次级溶瘤病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。
39.根据权利要求38所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是甲病毒、副粘病毒或弹状病毒。
40.根据权利要求37所述的病毒，其中所述次级病毒是假型化病毒，并且其中所述初级病毒包括所述次级病毒的在所述次级病毒的编码区之外的衣壳蛋白或包膜蛋白的编码区。
41.根据权利要求40所述的病毒，其中所述次级病毒是甲病毒、副粘病毒或弹状病毒。
42.根据权利要求7到41中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素诱导型启动子。
43.根据权利要求7到41中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子包括侧接有重组酶识别位点的组成型启动子。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的病毒，其进一步包括编码能够与所述可调节启动子结合的肽的第二多核苷酸。
45.根据权利要求44所述的病毒，其中所述第二多核苷酸与组成型启动子或诱导型启动子可操作地连接。
46.根据权利要求45所述的病毒，其中所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
47.根据权利要求44到46中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
48.根据权利要求44到46中任一项所述的病毒，其中所述可调节启动子是四环素(Tet)依赖性启动子，并且其中所述肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
49.根据权利要求1到48中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒进一步包括编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸。
50.根据权利要求49所述的病毒，其中所述编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。
51.根据权利要求49或50所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的复制。
52.根据权利要求49到51中任一项所述的病毒，其中所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
53.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39和42到52中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。
54.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37和40到52中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶识别位点。
55.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39和42到53中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
56.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52和54中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括一个或多个重组酶应答性盒，其中所述重组酶应答性盒包括所述一个或多个重组酶识别位点。
57.根据权利要求55或56所述的病毒，其中所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性切除盒(RREC)。
58.根据权利要求57所述的病毒，其中所述RREC包括转录/翻译终止(STOP)元件。
59.根据权利要求58所述的病毒，其中所述转录/翻译终止(STOP)元件包括与SEQ IDNO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。
60.根据权利要求55到59中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个重组酶应答性盒包括重组酶应答性反转盒(RRIC)。
61.根据权利要求60所述的病毒，其中所述RRIC包括在中心元件的每一侧上的两个或更多个正交重组酶识别位点。
62.根据权利要求60或61所述的病毒，其中所述RRIC包括启动子或所述启动子的一部分。
63.根据权利要求60或61所述的病毒，其中所述RRIC包括编码区或所述编码区的一部分，其中所述编码区编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的病毒基因组。
64.根据权利要求60到63中任一项所述的病毒，其中所述RRIC包括一个或多个控制元件。
65.根据权利要求64所述的病毒，其中所述控制元件是转录/翻译终止(STOP)元件。
66.根据权利要求65所述的病毒，其中所述控制元件具有与SEQ ID NO:854-856中的任一个具有80％同一性的序列。
67.根据权利要求60到66中任一项所述的病毒，其中所述重组酶应答性反转盒(RRIC)进一步包括内含子的一部分。
68.根据权利要求67所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的多核苷酸在通过mRNA剪接去除所述内含子之后产生所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒的不具有所述重组酶识别位点的成熟病毒基因组转录物。
69.根据权利要求1到68中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒或所述初级病毒进一步包括编码所述重组酶的多核苷酸。
70.根据权利要求69所述的病毒，其中所述重组酶是翻转酶(Flp)或Cre重组酶(Cre)。
71.根据权利要求69或70所述的病毒，其中所述重组酶的编码区包括内含子。
72.根据权利要求69到71中任一项所述的病毒，其中所述重组酶重组酶的表达盒包括一个或多个mRNA去稳定化元件。
73.根据权利要求69到72中任一项所述的病毒，其中所述重组酶是包括另外的多肽的融合蛋白的一部分，并且其中所述另外的多肽调节所述重组酶的活性和/或细胞定位。
74.根据权利要求73所述的病毒，其中所述重组酶的活性和/或细胞定位通过配体和/或小分子的存在进行调节。
75.根据权利要求73或74所述的病毒，其中所述另外的多肽包括雌激素受体蛋白的配体结合结构域。
76.根据权利要求53到75中任一项所述的病毒权利要求，其中所述一个或多个重组酶识别位点是翻转酶识别靶(FRT)位点。
77.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55和57到76中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
78.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54和56到76中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒进一步包括编码调节性多肽的多核苷酸，并且其中所述调节性多肽调节一个或多个启动子的活性。
79.一种重组初级溶瘤病毒，其包括：
编码次级溶瘤病毒的第一多核苷酸；以及
编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。
80.一种重组初级病毒，其包括：
编码次级病毒的第一多核苷酸；以及
编码一个或多个RNA干扰(RNAi)分子的第二多核苷酸。
81.根据权利要求79所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒是具有复制能力的。
82.根据权利要求80所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒是具有复制能力的。
83.根据权利要求79到82中任一项所述的病毒，其中所述第一多核苷酸与第一可调节启动子可操作地连接，并且其中所述第二多核苷酸与第二可调节启动子可操作地连接。
84.根据权利要求79、81和83中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒产生不介导针对所述次级溶瘤病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
85.根据权利要求80、82和83中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒产生不介导针对所述次级病毒的抗原特异性免疫的抗原特异性免疫应答。
86.根据权利要求79、81、83和84中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
87.根据权利要求80、82、83和85中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是双链DNA(dsDNA)病毒。
88.根据权利要求86或87所述的病毒，其中所述dsDNA病毒是单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒或痘病毒科病毒，任选地其中所述痘病毒科病毒是传染性软疣病毒、粘液瘤病毒、牛痘病毒、猴痘病毒或塔痘病毒。
89.根据权利要求79、81、83和84中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒是RNA病毒。
90.根据权利要求80、82、83和85中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒是RNA病毒。
91.根据权利要求89或90所述的病毒，其中所述RNA病毒是副粘病毒或弹状病毒。
92.根据权利要求79、81、83、84、86、88、89和91中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
93.根据权利要求80、82、83、85、87、88和90到91中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒是正义单链RNA(ssRNA)病毒、负义ssRNA病毒或双义ssRNA病毒。
94.根据权利要求92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述负义ssRNA病毒，并且其中所述负义ssRNA病毒是弹状病毒科、副粘病毒科或正粘病毒科的病毒，任选地：
其中所述弹状病毒科病毒是水疱性口炎病毒(VSV)或马拉巴病毒；
其中所述副粘病毒科病毒是新城疫病毒、仙台病毒或麻疹；或者
其中所述正粘病毒科病毒是流感病毒。
95.根据权利要求92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是肠道病毒，任选地其中所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒(SVV)、柯萨奇病毒或艾柯病毒，任选地其中所述柯萨奇病毒是柯萨奇病毒A(CVA)或柯萨奇病毒B(CVB)，任选地其中所述柯萨奇病毒是CVA9、CVA21或CVB3。
96.根据权利要求92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或门戈病毒。
97.根据权利要求92或93所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒或所述次级病毒是所述正义ssRNA病毒，并且其中所述正义ssRNA病毒是披膜病毒科病毒，任选地其中所述披膜病毒科病毒是新世界甲病毒或旧世界甲病毒，并且任选地其中所述新世界甲病毒或所述旧世界甲病毒是VEEV、WEEV、EEV、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒或马雅罗病毒。
98.根据权利要求79、81、83、84、86、88、89、91到92和94到97中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是嵌合病毒。
99.根据权利要求80、82、83、85、87、88、90到91和93到97中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是嵌合病毒。
100.根据权利要求79、81、83、84、86、88、89、91到92和94到98中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒是假型化病毒。
101.根据权利要求80、82、83、85、87、88、90到91、93到97和99中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和/或所述次级病毒是假型化病毒。
102.根据权利要求79到101中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子和所述第二可调节启动子选自类固醇诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、MX-1启动子、GENESWITCHTM杂合启动子、cumate应答性启动子和四环素依赖性启动子。
103.根据权利要求79到102中任一项所述的病毒，其进一步包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码能够与所述第一可调节启动子结合的第一肽和能够与所述第二可调节启动子结合的第二肽。
104.根据权利要求103所述的病毒，其中所述第三多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
105.根据权利要求104所述的病毒，其中所述组成型启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、泛素C启动子(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
106.根据权利要求103到105中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第一肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
107.根据权利要求103到106中任一项所述的病毒，其中所述第二可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第二肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
108.根据权利要求103到106中任一项所述的病毒，其中所述第一可调节启动子是四环素(Tet)阻抑型启动子，并且其中所述第一肽是四环素控制的反式激活因子(tTA)肽。
109.根据权利要求103到108中任一项所述的病毒，其中所述第二可调节启动子是四环素(Tet)诱导型启动子，并且其中所述第二肽是反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)肽。
110.根据权利要求79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100和102到109中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级溶瘤病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级溶瘤病毒的复制。
111.根据权利要求80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99和101到109中任一项所述的病毒，其中所述一个或多个RNAi分子与所述次级病毒的基因组中的靶序列结合，并且抑制所述次级病毒的复制。
112.根据权利要求110或111所述的病毒，其中所述RNAi分子是siRNA、miRNA、shRNA或AmiRNA。
113.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110和112中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。
114.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109和111到112中任一项所述的病毒，其中所述编码所述次级病毒的多核苷酸包括第一3'核酶编码序列和第二5'核酶编码序列。
115.根据权利要求113或114所述的病毒，其中所述第一核酶编码序列和所述第二核酶编码序列编码锤头状核酶或丁型肝炎病毒核酶。
116.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113和115中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
117.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
118.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113和115到116中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
119.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115到117中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒的所述基因组包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
120.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113、115到116和118中任一项所述的病毒，其中所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
121.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115、117到119中任一项所述的病毒，其中所述初级病毒和所述次级病毒各自包括miRNA靶序列(miR-TS)盒，所述miR-TS盒包括插入到复制所需的一个或多个病毒基因中或插入到所述病毒基因组的3'或5'UTR中的一个或多个miRNA靶序列。
122.根据权利要求116、118和120中任一项所述的病毒，其中细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级溶瘤病毒和/或所述次级溶瘤病毒的复制。
123.根据权利要求117、119和121中任一项所述的病毒，其中细胞中的一个或多个miRNA的表达抑制所述初级病毒和/或所述次级病毒的复制。
124.根据权利要求1到123中任一项所述的病毒，其进一步包括编码至少一种外源性有效负载蛋白的多核苷酸序列。
125.根据权利要求124所述的病毒，其中所述外源性有效负载蛋白是荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子或抗原结合分子。
126.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13到16、18到19、21到34、36、38到39、42到53、55、57到77、79、81、83、84、86、88、89、91到92、94到98、100、102到109、110、112到113、115到116、118、120、122和124到125中任一项所述的病毒，其中所述次级溶瘤病毒的表达由外源性药剂调节。
127.根据权利要求2、4、6、8、10、12到15、17到18、20到33、35、37、40到52、54、56到76、78、80、82、83、85、87、88、90到91、93到97、99、101到109、111到112、114到115、117、119、121和123到125中任一项所述的病毒，其中所述次级病毒的表达由外源性药剂调节。
128.根据权利要求126或127所述的病毒，其中所述外源性药剂是肽、激素或小分子。
129.一种组合物，其包括根据权利要求1到128中任一项所述的病毒。
130.一种杀死肿瘤细胞群体的方法，所述方法包括将根据权利要求1到128中任一项所述的病毒或根据权利要求129所述的组合物施用于所述肿瘤细胞群体。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级溶瘤病毒感染并杀死。
132.根据权利要求130或131所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级溶瘤病毒感染并杀死。
133.根据权利要求130到132中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞的亚群被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒两者感染并杀死。
134.根据权利要求130到133中任一项所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。
135.根据权利要求130到134中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。
137.根据权利要求135所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
139.根据权利要求135到138中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
140.根据权利要求130所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第一亚群被所述初级病毒感染并杀死。
141.根据权利要求130或140所述的方法，其中所述肿瘤细胞的第二亚群被所述次级病毒感染并杀死。
142.根据权利要求130、140和141中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞的亚群被所述初级病毒和所述次级病毒两者感染并杀死。
143.根据权利要求130和140到142中任一项所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。
144.根据权利要求130和140到143中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
148.根据权利要求144到147中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
149.一种治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到128中任一项所述的病毒或根据权利要求129所述的组合物。
150.根据权利要求149所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级溶瘤病毒和所述次级溶瘤病毒杀死。
151.根据权利要求149或150所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。
152.根据权利要求149到151中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。
153.根据权利要求149到152中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级溶瘤病毒的免疫应答降低。
154.根据权利要求149到153中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级溶瘤病毒的免疫应答降低。
155.根据权利要求149到154中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。
156.根据权利要求149到155中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级溶瘤病毒。
157.根据权利要求149到156中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级溶瘤病毒。
158.根据权利要求149到157中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。
159.根据权利要求149到158中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级溶瘤病毒的多核苷酸的参考初级溶瘤病毒或仅所述次级溶瘤病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。
160.根据权利要求149到159中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级溶瘤病毒的产生。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级溶瘤病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级溶瘤病毒的产生。
162.根据权利要求160所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级溶瘤病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级溶瘤病毒的产生。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级溶瘤病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
164.根据权利要求160到163中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级溶瘤病毒。
165.根据权利要求149所述的方法，其中与被不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒杀死的肿瘤细胞数量相比，所述群体中的更多数量的肿瘤细胞被所述初级病毒和所述次级病毒杀死。
166.根据权利要求149或165所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤大小更大程度地减小。
167.根据权利要求149、165和166中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法诱导针对所述受试者的一个或多个肿瘤抗原的更强免疫应答。
168.根据权利要求149和165到167中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述初级病毒的免疫应答降低。
169.根据权利要求149和165到168中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者对所述次级病毒的免疫应答降低。
170.根据权利要求149和165到169中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得优先/更特异性地杀死所述受试者的肿瘤细胞。
171.根据权利要求149和165到170中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述初级病毒。
172.根据权利要求149和165到171中任一项所述的方法，其中与仅施用所述次级病毒相比，所述方法使得在所述受试者中更持久地产生所述次级病毒。
173.根据权利要求149和165到172中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法使所述受试者的肿瘤抑制期延长。
174.根据权利要求149和165到173中任一项所述的方法，其中与施用不具有所述编码所述次级病毒的多核苷酸的参考初级病毒或仅所述次级病毒相比，所述方法实现更多细胞类型的病毒感染。
175.根据权利要求149和165到174中任一项所述的方法，其进一步包括向所述肿瘤细胞群体施用一种或多种外源性药剂，其中所述一种或多种外源性药剂调节所述次级病毒的产生。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂与所述初级病毒同时施用，并且其中所述外源性药剂的存在抑制所述次级病毒的产生。
177.根据权利要求175所述的方法，其中所述一种或多种外源性药剂在所述初级病毒之后施用，并且其中所述外源性药剂的存在诱导所述次级病毒的产生。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述外源性药剂在施用所述初级病毒之后至少1天、至少1周或至少1个月施用。
179.根据权利要求175到178中任一项所述的方法，其中在所述施用所述外源性药剂之前未能检测到次级病毒。
180.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1到128所述的病毒。
181.一种载体，其包括根据权利要求180所述的多核苷酸。
182.一种药物组合物，其包括根据权利要求181所述的载体。
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