KR101700913B1 - ＭｙｏＤ 단백질을 포함하는 근육 분화 유도용 조성물 - Google Patents

ＭｙｏＤ 단백질을 포함하는 근육 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MyoD 단백질을 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 조성물 관한 것으로, 더욱 자세하게는 근분화 유도능을 가지는 MyoD의 세포 투과 및 내포낭 탈출 능력을 향상시킨 융합단백질을 제작하고, 이를 첨가하여 줄기세포에서 근육세포로의 분화능을 현저히 높이고, 근육 손상 및 근육 관련 질환을 치료할 수 있는 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 MyoD 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도 효과가 탁월하므로, hASCs 및 줄기세포를 이용한 근육 손상 및 근육 관련 질환 치료용 세포치료제로 사용에 유용하다.

Description

ＭｙｏＤ 단백질을 포함하는 근육 분화 유도용 조성물{Composition for inducing myogenic differentiation comprising MyoD protein}
본 발명은 MyoD 단백질을 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 조성물 관한 것으로, 더욱 자세하게는 근분화 유도능을 가지는 MyoD의 세포 투과 및 내포낭 탈출 능력을 향상시킨 융합단백질을 제작하고, 이를 첨가하여 줄기세포로부터 근원성 세포로의 분화능을 현저히 높이고, 근육 손상 및 근육 관련 질환을 치료할 수 있는 치료제에 관한 것이다.
근육형성세포는 분열, 증식하여 근아세포(myoblast)로 분화하고, 다시 근관세포(myotube)로 변한 후, 근원섬유(myofibers)로 분화한다. 근아세포의 일부는 줄기 위성세포(satellite cell)로서 정지 상태로 있다가, 근육조직이 외상 또는 근육위축병(muscular dystrophy)과 같은 질병에 노출되면, 위성세포로 알려진 근육 줄기세포들은 손상된 부위의 근육을 치유하고 재생시킨다. 근육위축병과 같은 질환에 있어서, 이들 세포들은 근육의 안정성과 치유에 있어 특히 중요하다.
중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)는 골수, 혈액, 제대혈 그리고 지방조직 등 다양한 인체 조직으로부터 분리해낼 수 있는 장점이 있다. MSC의 한 종류인 hASC (human adipose-derived stem cells, 인간 지방유래 줄기세포)는 근분화(myogenesis) 촉진 배양조건이나 근원성(myogenic) 전사인자인 MyoD를 발현시키면 근원성(myogenic) 세포로 분화한다고 보고된 바 있다(Y.W. Eom et al ., BBRC . 408:167-173,2011: S. Wakitani et al ., Muscle Nerve . 18:1417-1426.1995: S. Goudenege et al ., Mol Ther . 17 :1064-1072,2009). 근분화 촉진 배양조건에 사용되는 5-azacytidine는 DNA메틸화 저해제로서, 독성과 돌연변이 발생 가능성의 이유로 세포치료 사용에 제한적이며, 또한 MyoD 유전자를 발현시킬 때 사용되는 바이러스 벡터는 게놈 변화의 위험성이 있다. 따라서, 임상적용에 안전한 근분화(myogenesis) 기술 개발은 매우 중요하다.
단백질 형질도입(transduction)법으로 전사인자를 세포내로 전달하는 방법은 게놈의 변화 없이 세포내에서 도입된 단백질의 분해가 일어나므로 안전한 방법으로 주목을 받고 있다. 근육 분화의 핵심 전사인자인 MyoD 단백질을 근아세포에 처리하여 근육 분화를 유도한 사례들이 보고된 바 있다(T. Noda et al ., BBRC . 382:473-477,2009: S. Hidema et al ., J Biosci Bioeng . 113:5-11,2005). 보통 HIV의 Tat 펩티드 같은 PTD (protein transduction domain, 단백질 형질도입 영역)를 표적 전사인자에 융합시켜서 세포막을 투과하도록 하는 방법이 사용되나, MyoD는 PTD 없이도 세포 투과를 할 수 있으며 근아세포주인 C2C12의 근원성 분화를 유도할 수 있다고 보고 되었다(T. Noda et al ., BBRC . 382:473-477,2009). 이는 MyoD 단백질 안에 존재하는 염기성 helix-loop-helix motif가 PTD의 역할을 하기 때문이라고 생각되어 졌다. 반면에 다른 그룹은 MyoD 단백질에 PTD를 융합시켜 주어야 근육 분화 효율이 높아진다고 보고하였다(S. Hidema et al ., J Biosci Bioeng. 113:5-11, 2005). 이렇게 MyoD 단백질 또는 PTD를 융합한 MyoD 단백질의 근육 분화 능력에 관한 보고들이 있었으나, 이들은 모두 C2C12 또는 근아세포의 근분화를 근관세포 분화 배양조건에서 실험한 것들로서, MyoD 단백질의 형질도입을 이용한 줄기세포의 근분화는 아직 보고된 예가 없다. 그 이유는 MyoD 단백질과 PTD를 융합한 MyoD 단백질만으로는 근분화의 효율이 낮기 때문이며, 이는 세포안으로 들어간 MyoD가 내포낭(endosome)에 의한 트래핑(trapping)되며 이후 용해소체(lysosome)로 옮겨져서 가수분해되기 때문이라고 생각된다(T. Noda et al ., BBRC . 382:473-477, 2009). 따라서, MyoD 단배질을 세포 내 핵으로 효과적으로 보내기 위해서는 내포낭의 탈출이 필요하다(I. Nakase et al ., Biopolymers . 94 :763-770,2010).
이에, 본 발명자들은 임상적으로 안전하면서, 줄기세포로부터 근육세포로의 분화 유도능을 가지는 근육 손상 질환 치료용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, MyoD 단백질에 PTD와 내포낭의 탈출을 위한 INF7 펩타이들을 융합시킨 단백질을 제작하였고, 이를 줄기세포에 첨가 시 효율적으로 근육세포로 분화할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 MyoD 단백질을 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 근분화 유도 기능을 가지는 MyoD 단백질과 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근육 손상 질환 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 근분화 유도 기능을 가지는 MyoD 단백질을 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 단백질 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 근분화 유도 기능을 가지는 MyoD 단백질과 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근육 손상 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 근아세포와 공동배양된 줄기세포 및 MyoD 단백질을 유효성분으로 함유하는 근육 손상 및 근육 관련 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에 따르면, MyoD와 같은 근분화 유도능을 가지는 단백질의 첨가를 통해 줄기세포로부터 근육세포로의 분화 유도능을 현저히 향상시킴으로써, 근육 손상 및 근육 관련 질환 치료용 세포 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 MyoD 단백질 발현 벡터를 제조한 것이다( MyoD-IT: INF7과 Tat PTD펩티드를 포함하는 MyoD 단백질). (A) His-tag의 MyoD와 MyoD-IT를 발현하는 pET21a-MyoD와 pET21a-MyoD-IT 벡터, (B) Halo-tag의 MyoD와 MyoD-IT를 발현하는 pFN18A-MyoD와 MyoD-IT 벡터.
도 2의 A는 본 발명에 따른 His-와 Halo-tagged MyoD 단백질의 발현을 확인한 것이다(a,b: Western blot분석, c,d: SDS-PAGE, B: before induction, A: after induction, S: soluble fraction, I: insoluble fraction). B는 MyoD 단백질 정제 후 순도를 확인한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 MyoD와 MyoD-IT의 핵으로의 이동 능력을 비교한 것이다. (A) NHS-Rhodamine (red)으로 표지된 MyoD와 MyoD-IT를 hASC에 처리하였다. 이후 PKH67 (green)로 세포막을 염색하고 DAPI (blue)로 핵을 염색하여 각각의 위치를 형광 이미지를 얻어서 관찰하였다. (B) MyoD와 MyoD-IT 단백질의 핵 분포 비율.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 MyoD 단백질을 처리하여 hASCs의 근분화를 확인한 것이다. (A) MyoD와 MyoD-IT 단백질을 14일 동안 hASCs에 처리하였다. 그리고 분화된 세포들을 근육 분화 마커인 항-MHC (myosin heavy chain) 항체와 형광 표지된 이차항체(red)로 염색하고, PKH67 (green)과 DAPI (blue)로 세포막과 핵을 염색한 후에 형광 이미지를 관찰하였다. (B) MyoD 단백질을 농도별로 처리하여 hASCs 분화 정도를 상기의 항-MHC 항체를 이용한 방법으로 분석 하였다.
도 5는 본 발명에 따른 재조합 MyoD 단백질을 처리하여 hBM-MSCs(human bone marrow-derived MSCs)의 근분화를 확인한 것이다. 형광 이미지는 도 4와 동일한 방법으로 얻었다.
도 6은 본 발명에 따른 C2C12 세포와 hASCs의 공동배양에 따른 세포융합으로 근관세포 형성을 분석하는 계획도이다(GM: 10% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 DMEM (DulbeccoModified Eagle Medium) 배지, DM: 2% HS (horse serum)가 포함된 DMEM 배지).
도 7은 본 발명에 따라 hASCs를 근세포로 분화시키고 이를 C2C12 세포와 공동배양시켜서 근관세포로 분화하는 것을 분석한 것이다. (A) MyoD-IT를 7일 또는 14일 동안 처리 하여 근분화를 유도한 hASC를 C2C12 세포와 공동배양한 후 형광 이미지로 분석하였다. C2C12 세포와 공동배양을 하기 전에 hASCs를 PKH26 (red)으로 염색하여 이후에 구분을 할 수 있도록 하였다. 그리고 공동 배양을 한 후에 근육 분화 마커인 anti-MHC 항체(green)와 DAPI(blue)로 염색한 후 형광 현미경으로 이미지를 얻었다. (B) hASCs가 근관세포 분화에 기여한 정도를 알기 위해서 전체 항-MHC 항체에 의해서 염색된 세포의 핵의 수에 대한 PKH26으로 염색된 다핵세포 수의 비율을 구하여 나타내었다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, MyoD 단백질을 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 조성물 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도능을 향상시키는 효과를 가지는 상기 재조합 MyoD 융합단백질은 Tat PTD(protein transduction domain) 및 INF7 내포낭 막 파괴 펩티드가 융합된 재조합 단백질을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 재조합 MyoD 융합단백질의 N-말단에는 단백질 정제를 위한 tag이 융합될 수 있으며, His-tag 또는 Halo-tag이 융합될 수 있다. His-tag일 경우, MyoD 단백질의 용해도가 낮아 분리와 정제가 용이하지 않을 수 있어, Halo-tag가 융합되는 것이 바람직하다. C-말단에는 PTD와 INF7 펩티드를 포함하여 제조할 경우, 효율적으로 줄기세포내의 세포막 투과와 내포낭 탈출을 용이하게 하여 근분화 유도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포에서 근육세포로의 분화 유도용 조성물은 2 g/ml 농도의 MyoD 단백질을 함유하는 것이 바람직하며, 10 g/ml 농도 이상으로 함유 될 경우, 세포자살을 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서, 근육세포로의 분화는 근원세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)로의 분화일 수 있다. 상기 근관세포로의 분화 유도는 C2C12 근아세포주와 같은 다른 근육 세포와의 공동 배양을 필요로 할 수도 있다. 상기의 공동 배양은 줄기세포를 손상된 근육에 직접 주입하는 경우에 주변 근육과의 상호작용을 모사하며, 이러한 환경에서 MyoD 단백질에 의해서 근분화가 유도된 줄기세포는 효과적으로 근원섬유로 최종 분화를 할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 다양한 조직 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal setm cell, MSC)를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 인간 지방세포 유래 줄기세포(human adipose derived stem cell, hASCs) 및 인간 골수유래 중간엽줄기세포를 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 근분화 유도 기능을 가지는 MyoD 단백질과 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근육 손상 질환 치료용 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 근아세포와 공동배양된 줄기세포 및 MyoD 단백질을 유효성분으로 함유하는 근육 손상 및 근육 관련 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
요약하면, 본 발명의 재조합 MyoD 융합단백질은 hASCs에서 근육세포로의 분화를 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 이는 줄기세포의 세포치료제로서의 응용 가능성을 시사한다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: 재조합 MyoD 발현 벡터 제작
인간 MyoD 유전자는 OriGene(Rockvill, USA)에서 구입한 cDNA로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였고, 다음의 특정 프라이머를 사용하였다.
1-1: His - tagged MyoD 발현 벡터를 제작
His-tagged MyoD는 다음의 서열번호 1과 서열번호 2를 사용하여 증폭하였다. His-tagged MyoD-IT의 증폭은 서열번호 1과 3, 서열번호 1과 4 그리고 서열번호 1과 5를 사용하여 순차적으로 3번의 PCR을 수행하여 MyoD-IT를 발현하는 최종 DNA 산물을 얻었다. 증폭되어진 His-tagged MyoD와 His-tagged MyoD-IT DNA는 NdeI와 EcoRI 제한효소로 절단하고 pET21a( Life Technologies, USA) 벡터에 삽입하여, pET21a-MyoD와 pET21a-MyoD-IT를 제작하였다.
His-MyoD_F
5'-GGAATTCCATATGCACCACCACCACCACCACATGGAGCTACTGTCGCCAC-3'(서열번호 1)
His-MyoD_R
5'-GGAATTCTTAGAGCACCTGGTATATCGGG-3' (서열번호 2)
His-Cterm-IT_R1:
5'- CCGATATACCAGGTGCTCGGCCTGTTTGAAGCGATTGAAGGCTTTATTGAAAA
CGGCTGGGAAGGC-3'(서열번호 3)
His-Cterm-IT_R2:
5'-GCCATACCAGCCATCAATCATGCCTTCCCAGCCGTTTTC-3' (서열번호 4)
His-Cterm-IT_R3:
5'-GGAATTCTTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTTTTACGACCGTAGCCATACCAGCC
ATACCAGCCATCAATC-3' (서열번호 5)
1-2: Halo - tagged MyoD 발현 벡터를 제작
Halo-tagged MyoD 는 다음의 서열번호 6과 서열번호 7을 사용하였고, Halo-tagged MyoD-IT 는 MyoD cDNA 대신 실시예 1-1에서 제작한 pET21a-MyoD-IT를 서열번호 6과 서열번호 8로 증폭하였다. 증폭되어진 DNA는 NcoI와 PmeI 제한효소로 절단한 후 pFN18A(Promega, USA) 벡터에 삽입하여, pFN18A-MyoD와 pFN18A-MyoD-IT를 제작하였다.
Halo-MyoD_F: 5'-CATGCCCATGGAGCTACTGTCGCC-3' (서열번호 6),
Halo-MyoD_R: 5'-AGCTTTGTTTAAACTTAGAGCACCTGGTATATC-3' (서열번호 7),
Halo-MyoD-IT-R: 5'-AGCTTTGTTTAAACTTAACGGCGACGCTGGCA-3' (서열번호 8).
그 결과, MyoD 및 MyoD-IT의 N-말단에 단백질 정제를 위한 His-tag과 Halo-tag이 결합된 두 가지 종류의 발현 벡터를 제작하였다. MyoD-IT의 C-말단에는 내포낭(endosome) 탈출을 위한 INF7 펩티드(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)와 세포막 투과를 용이하게 하는 Tat PTD(YGRKKRRQRRR)를 포함하는 벡터를 제작하였다. INF7 펩티드는 HA2 펩티드의 개량된 버전으로 이의 융합을 통해서 내포낭 탈출을 유도할 수 있다(N.M. Moore et al ., J Gene Med 10: 1134-1149,2008: C. Plank et al ., JBC 269:12918-12924,1994).
실시예 2: MyoD 의 발현과 단백질의 정제
본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 벡터를 이용하여, MyoD 단백질들을 발현시키고 정제하였다.
pET21a-MyoD와 pET21a-MyoD-IT를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 하여 His-tagged MyoD 단백질을 발현시켰다. 형질전환체는 암피실린이 포함된 LB 배지로 37에서 배양 후, 흡광도가 600 nm(OD600)에서 0.5에 도달하면 0.2 mM IPTG를 첨가하고 16에서 하룻밤 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. Halo-tag 벡터인 pFN18A-MyoD와 pFN18A-MyoD-IT는 KRX 균주(Promega)에 형질전환 후, OD600에서 0.5에 도달하면 0.1% rhamnose를 첨가하고 16에서 하룻밤 배양하여 단백질 발현을 유도하였다.
상기 배양된 세포에서 소니케이션 방법으로 세포를 lysis하여 단백질을 추출한 후, His-tagged MyoD 단백질은 Ni-NTA 컬럼(Qiagen, USA)을 사용하여 정제하였다 (J.Y. Mun et al ., Appl Microbiol Biotechnol . 93:251-260,2012). Halo-tagged MyoD 단백질은 HaloLink 레진(Promega)에 공유결합으로 부착시킨 후, 강한 세척을 통하여 다른 단백질들을 제가하고 TEV 단백질 분해효소로 Halo-tag으로부터 MyoD 단백질을 분리하여 컬럼으로부터 용출하였다. 용출한 용액에 남아있는 TEV 단백질 분해효소는 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 제거하고 순수한 MyoD 단백질만 정제하였다. 발현과 순도는 10% SDS-PAGE와 항-MyoD 항체(Abcam, USA)를 이용한 Western blot 방법으로 분석하였다.
그 결과, His-tagged MyoD 단백질은 불용성 부분에서 많은 양이 존재하며(도 2A), 정제 순도 역시 낮음을 확인하였다(도 2B). 이에 반해서 His-tag 대신 Halo-tag을 융합한 Halo-tagged MyoD 단백질은 대장균에서 재조합 발현 시 수용성 부분에서 더 많이 존재할 뿐만 아니라 Halo-resion으로 정제 시 정제 효율과 순도가 높은 것을 확인하였다(도 2A, 2B).
실시예 3: 세포 배양과 분화 조건
hASCs는 Life Technologies에서 구입하였고, 근육세포로 분화유도 전 안정화를 위하여 GM(10% FBS가 포함된 DMEM) 배지에서 1일간 배양하였다. MyoD와 MyoD-IT 단백질을 0.2~10 g/ml 농도로 첨가하여 1일 이상 배양한 후, DM(2% HS가 포함된 DMEM) 배지로 교체하고 같은 농도의 MyoD와 MyoD-IT 단백질을 첨가하여 12일간 배양하였다.
실시예 4: MyoD 단백질의 세포내 전달 비교
본 실시예에서는 MyoD 단백질의 세포투과 능력과 핵 위치 특성을 분석하였다.
이를 위하여 실시예 2에서 정제된 MyoD와 MyoD-IT 단백질을 NHS-Rhodamine(Thermo Scientific, USA)으로 표지하였다. 표지된 단백질을 0.5 g/ml의 농도로 실시예 3에서 안정화된 hASCs에 첨가하고, 15시간 배양하였다. 그 후에, hASCs는 4% paraformaldehyde로 1시간 고정하고, 세포막은 PKH67 (Sigma-Aldrich, USA), 핵은 DAPI(Life Technologies)로 염색하여 Zeiss LSM510 공초점현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 분석하였다.
그 결과, MyoD-IT 단백질은 MyoD보다 훨씬 선명하게 핵에 위치하는 것을 확인하였다(도 3A). 반면에, MyoD 단백질은 주로 세포질에서 여러 개의 점들로 관찰되어 이 전의 보고와 같이 내포낭에 의한 트래핑(trapping)되었다고 사료된다(T. Noda et al ., BBRC . 382:473-477, 2009). 다음으로, MyoD와 MyoD-IT 단백질의 핵 표적화 능력을 비교하였다. 푸른색으로 염색된 핵과 붉은색으로 염색된 MyoD 단백질이 겹치는 비율을 분석하였고, MyoD-IT 단백질이 MyoD 단백질보다 12배 높은 것을 확인하였다(도 3B).
이러한 결과들은, MyoD-IT 단백질의 Tat PTD와 INF7 펩티드 융합에 의해 효율적으로 세포막 투과와 내포낭 탈출이 이루어져서 세포질로 이동할 수 있으며, 이후 MyoD가 본래 가지고 있는 핵 위치 신호(nuclear localization signal)에 의해서 핵으로 이동 했음을 나타내는 것이다.
실시예 5: MyoD 단백질에 의한 hASCs 의 근육세포로의 분화능 비교
본 실시예에서는 MyoD 단백질이 hASCs의 근원성 세포로의 분화에 미치는 효과를 면역형광 염색법으로 분석하였다.
실시예 3에서 분화된 hASCs는 4% paraformaldehyde로 1시간 고정하여 PKH67로 염색한 후, 5분간 permeabilization (0.2% Triton X-100)과 1시간동안 blocking (1% BSA)을 수행하였다. 염색한 hASCs는 근세포 분화 말기 마커인 항-MHC(myosin heavy chain) 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 4에서 하룻밤 동안 면역염색 하였다. 다음 날 Texas Red (Vector Labs, USA)가 결합된 2차 항체를 처리하고, 핵은 DAPI로 염색 후 형광이미지를 분석하였다. 다음으로, 분화 유도능에 대한 정량분석은 전체 핵의 개수 대비 MHC 양성 세포에서의 핵의 비율로 측정하였다.
그 결과, MyoD-IT를 처리한 hASCs는 MyoD를 처리한 세포들에 비해서 길쭉한 스핀들 모양으로 변하였을 뿐만 아니라 MHC 면역염색으로 훨씬 선명하게 관찰되는 것을 확인하였다(도 4A). 근세포로의 분화 정도는 전체 핵의 수 대비 MHC 양성인 세포의 핵의 수로 계산하였으며, MyoD와 MyoD-IT를 0.2~10 g/ml 농도로 처리하여 분석한 결과, 모든 농도에서 MyoD-IT의 근세포 분화 유도능이 현저하게 높은 것을 확인하였다(도 4B). MyoD와 MyoD-IT 모두 2 g/ml 농도에서 최고의 근세포 분화능력을 보였으며, 10 g/ml 농도에서는 세포 자살 현상이 관찰되었다. MyoD에 의한 세포 자살 현상은 이전에도 보고된바 있다(H. Hirai et al., J. Cell Biol . 191:347-365, 2010).
실시예 6: 근세포 분화가 유도된 hASCs 와 C2C12 근아세포의 공동배양에 의한 근관세포 형성 확인
본 실시예에서는 MyoD-IT 단백질에 의해서 근세포 분화가 유도된 hASCs가 C2C12 세포와의 융합으로 근관세포를 형성하는 지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이는 hASCs는 근세포로의 분화가 유도된 경우, 근육세포 분화 말기 단계에서 C2C12 세포와의 융합으로 근관세포를 형성한다는 이전의 연구 결과를 이용한 것이다(Y.W. Eom et al ., BBRC 408: 167-173,2011).
도 6는 공동배양 계획도를 나타낸 것으로, hASCs는 GM에서 1일간 배양 후 2 g/ml 농도의 MyoD-IT를 처리하여 다시 1일간 배양하고, 배양조건을 같은 농도의 MyoD-IT가 포함된 DM으로 변경하여 5일 또는 12일간 배양한다. 이후 hASCs의 구분을 위해서 PKH26(Sigma-Aldrich)으로 염색하고, GM에서 3일간 배양된 C2C12와 DM에서 3일간 공동배양 한다. 분석은 세포고정 후 항-MHC 항체와 Alexa-488 (Life Technologies)이 결합된 이차항체를 이용하여 면역염색하였으며, 핵은 DAPI로 염색 하였다. 다음으로, hASCs와의 근관세포로 세포융합된 비율은 전체 MHC 양성 핵에서 PKH26으로 염색 된 다핵세포 비율로서 측정하였다.
그 결과, MyoD-IT가 처리된 hASCs가 현저하게 많은 비율의 다핵 근관세포로 분화한 것을 확인하였다(도 7A). MyoD-IT를 7일간 처리한 hASCs 보다 14일간 처리한 hASCs를 C2C12와 공동배양 하였을 때 근관세포로의 세포융합 비율이 현저하게 높음을 알 수 있었다(도 7B).
이로부터 본 발명에 따른 재조합 MyoD-IT 융합단백질이, hASCs의 근육세포로의 분화능을 효과적으로 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 줄기세포의 근육 손상 및 근육 관련 질환의 세포치료제로서의 응용 가능성을 시사한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition for inducing myogenic differentiation comprising MyoD protein <130> P13-B195 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-MyoD_F <400> 1 ggaattccat atgcaccacc accaccacca catggagcta ctgtcgccac 50 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-MyoD_R <400> 2 ggaattctta gagcacctgg tatatcggg 29 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Cterm-IT_R1 <400> 3 ccgatatacc aggtgctcgg cctgtttgaa gcgattgaag gctttattga aaacggctgg 60 gaaggc 66 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Cterm-IT_R2 <400> 4 gccataccag ccatcaatca tgccttccca gccgttttc 39 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Cterm-IT_R3 <400> 5 ggaattctta acggcgacgc tggcgacgtt ttttacgacc gtagccatac cagccatacc 60 agccatcaat c 71 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Halo-MyoD_F <400> 6 catgcccatg gagctactgt cgcc 24 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Halo-MyoD_R <400> 7 agctttgttt aaacttagag cacctggtat atc 33 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Halo-MyoD-IT-R <400> 8 agctttgttt aaacttaacg gcgacgctgg ca 32

Claims (11)

  1. PTD(protein transduction domain) 및 INF7 내포낭 막 파괴 펩티드가 융합된 MyoD 단백질을 첨가하여 줄기세포를 배양하는 단계; 및
    상기 줄기세포를 근아세포주와 공배양하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 근육세포로의 분화를 유도하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 근육세포는 근원세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포에서 근육세포로의 분화를 유도하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal setm cell, MSC) 또는 인간지방세포 유래 줄기세포(human adipose derived stem cell, hASCs) 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포에서 근육세포로의 분화를 유도하는 방법.
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