WO2018236131A1 - 안지오포이에틴-1 또는 vegf를 분비하는 줄기세포 및 이를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

안지오포이에틴-1 또는 vegf를 분비하는 줄기세포 및 이를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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stem cells
vegf
ang
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이봉희
바이예르사이칸대기
이재석
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Definitions

  • a stem cell which secretes angiopoietin-1 or VEGF and a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cardiovascular diseases containing the same
  • Angiopoietin (Ang-1) or VEGF secreting stem cells that promote angiogenesis and methods for the prevention or treatment of cardiovascular diseases.
  • Cell therapy is an active area of research.
  • One of the typical cell therapy agents is myocardial stem cells.
  • the mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells, progenitor cells, myoblasts, adipocytes, and stem cells have been highlighted. These differentiated myocardial stem cells have become increasingly useful as cell therapy agents for the treatment of cardiovascular diseases, and their development technology has been actively under way.
  • the stem cells produced by the current simple separation culture method have low therapeutic efficacy, and it is necessary to develop a high-efficiency, next-generation stem cell that has a body-strengthened therapeutic function.
  • One example provides Ang-1 secreting Ang-1 secreting stem cells.
  • Another example provides VEGF secreting stem cells that secrete VEGF.
  • Another example provides Ang-1 and VEGF secreting stem cells comprising Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells.
  • the stem cells may be human-derived stem cells.
  • the Ang-1 and / or VEGF-secreting stem cells may be one in which the Ang-1 gene and / or the VEGF gene are inserted into a stem cell dielectric, for example, a safe harbor site such as MVS1 in the stem cell's genome .
  • the stem cell may be a mesenchymal stem cell, for example, a mesenchymal stem cell derived from a cord or the like.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for angiogenesis or angiogenesis promotion comprising at least one selected from the group consisting of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof.
  • Another example is an angiogenesis method comprising administering a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof to a subject in need of promoting angiogenesis Or promoting angiogenesis.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for inhibiting ischemic cell death comprising at least one selected from the group consisting of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof.
  • Another example is an ischemic cell death inhibition method comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of Ang-1 secretory stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof to a subject in need of inhibition of ischemic cell death ≪ / RTI >
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular diseases, which comprises as an active ingredient at least one member selected from the group consisting of Ang-1 secretory stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof.
  • Another example includes a step of administering a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of Ang-1 secretion-enjoying cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof to a subject in need of prevention or treatment of cardiovascular diseases , A method for the prevention or treatment of cardiovascular diseases.
  • the cardiovascular disease is a cardiovascular disorder which can be selected from among all ischemic cardiovascular diseases and can be one or more selected from the group consisting of stroke, myocardial infarction, angina pectoris, lower limb ischemia, hypertension, arrhythmia, It is not.
  • Another example provides a method of producing stem cells that secrete Ang-1, VEGF, or both, comprising introducing an An g -1 gene, a VEGF gene, or both into the genome of a pleiocyte.
  • the genome of the stem cells was transformed with Ang-
  • VEGF 1 gene and / or the VEGF gene may be performed by an endonuclease (or a nucleic acid molecule encoding the same) and a guide RNA (or a nucleic acid molecule encoding the same).
  • the endonuclease is RNA Guided
  • the endonuclease and the guide RNA may be,
  • Another example provides Ang-1 and VEGF secreting stem cells prepared by the above-described method.
  • Another example is a complex of endonuclease (or a nucleic acid molecule encoding it) and guide RNA (or a nucleic acid molecule encoding the same) for use in producing Ang-1 and VEGF secreting stem cells, for example, CRISPR / Cas9 RNP to provide.
  • endonuclease or a nucleic acid molecule encoding it
  • guide RNA or a nucleic acid molecule encoding the same
  • the present inventors have conducted extensive studies in order to clarify the method of assisting the vascular regeneration in ischemic diseases. As a result, it has been found that the angiopoietin-1 (Ang-1) and Vasculaar endothelial growth factor VEGF), and it has been confirmed that it can prevent or treat ischemic cardiovascular diseases.
  • Ang-1 angiopoietin-1
  • VEGF Vasculaar endothelial growth factor
  • One example provides Ang-1 secreted Ang-1 secreted pleiotropic cells.
  • Another example provides VEGF secreting stem cells that secrete VEGF
  • Another example provides Ang-1 and VEGF secreting stem cells comprising Ang-1 ' secretory stem cells and VEGF secreting stem cells.
  • the stem cells may be human-derived stem cells.
  • the Ang-1 and / or VEGF-secreting stem cells may be one in which the Ang-1 gene and / or the VEGF gene are inserted into a stem cell dielectric, for example, a safe harbor site such as MVS1 in the stem cell's genome .
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells, for example, mesenchymal stem cells derived from umbilical cord.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for angiogenesis or angiogenesis promotion comprising at least one selected from the group consisting of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof.
  • angiogenesis method comprising administering to a subject in need of angiogenesis a pharmaceutically effective amount of a monocyte selected from the group consisting of Ang-1 secretory cell and VEGF secreting stem cell, or a culture thereof. Or promoting angiogenesis.
  • Another example consists of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells , Or a culture thereof.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting ischemic cell death.
  • Another example is an ischemic cell death inhibition method comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of Ang-1 secretory stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof to a subject in need of inhibition of ischemic cell death ≪ / RTI >
  • the ischemic cell line may be used for the treatment of myocardial or muscular cell death caused by an interruption or lack of blood supply through a blood vessel due to cardiovascular diseases such as stroke, myocardial infarction, angina pectoris, lower limb ischemia, hypertension, arrhythmia, ), And the Ang-1 and / or VEGF secreting stem cells provided in the present invention can effectively inhibit induction of such ischemic cell death, thereby preventing and / or treating ischemic cardiovascular diseases Is possible.
  • cardiovascular diseases such as stroke, myocardial infarction, angina pectoris, lower limb ischemia, hypertension, arrhythmia, ).
  • Ang-1 and / or VEGF secreting stem cells provided in the present invention can effectively inhibit induction of such ischemic cell death, thereby preventing and / or treating ischemic cardiovascular diseases Is possible.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular diseases, which comprises as an active ingredient at least one member selected from the group consisting of Ang-1 secretory stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof.
  • Another example includes a step of administering a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of Ang-1 secreting stem cells and VEGF secreting stem cells, or a culture thereof to a subject in need of prevention or treatment of cardiovascular diseases , A method for the prevention or treatment of cardiovascular diseases.
  • the cardiovascular disease is a cardiovascular disorder which can be selected from among all ischemic cardiovascular diseases and can be one or more selected from the group consisting of stroke, myocardial infarction, angina pectoris, lower limb ischemia, hypertension, arrhythmia, It is not.
  • Another example provides a method of producing stem cells secreting Ang-1, VEGF, or both, comprising introducing an Ang-1 gene, a VEGF gene, or both into the genome of a stem cell.
  • the step of introducing the Ang-1 gene and / or the VEGF gene into the genome of the stem cell may be performed by an endonuclease (or a nucleic acid molecule encoding the same) and a guide RNA (or a nucleic acid molecule encoding the same) have.
  • the endonuclease may be RNA Guided Endonuclease (RGEN).
  • the endonuclease and the guide RNA may be,
  • a recombinant vector comprising (a) an endonuclease protein or a nucleic acid molecule encoding the same or a nucleic acid molecule thereof; and (b) a nucleic acid molecule encoding the guide RNA or the guide RNA or a recombinant vector Mixture type of
  • Another example provides Ang-1 and VEGF secreting stem cells prepared by the above-described method.
  • Another example is a complex of endonuclease (or a nucleic acid molecule encoding it) and guide RNA (or a nucleic acid molecule encoding the same) for use in producing Ang-1 and VEGF secreting stem cells, for example, CRISPR / Cas9 RNP to provide.
  • 'Ang-1 secreting stem cells' refers to pleural cells which secrete Ang-1 by introducing Ang-1 gene
  • 'VEGF secreting stem cells' refers to stem cells which secrete VEGF by introducing VEGF gene
  • Ang-1 and VEGF secreting stem cells are obtained by mixing Ang-1 secretory stem cells and VEGF secretory stem cells or Ang-1 gene and VEGF gene to secrete Ang-1 and VEGF simultaneously It can mean stem cells.
  • 'Ang-1 and / or VEGF secreting stem cells',' VEGF secretory enjoying cells 1 and 'Ang-1, and VEGF secreting stem cells' have.
  • Ang-1 and VEGF < RTI ID 0.0 >
  • the cardiovascular diseases treatable by the Ang-1 and VEGF secreting stem cells may be all ischemic cardiovascular diseases, for example, one or more selected from the group consisting of myocardial infarction, angina pectoris ischemia, stroke, etc. However, no.
  • the subject may be a mammal including a rodent such as a human having ischemic cell death or cardiovascular disease, a primate of a primate, a rat, a mouse, or a cell (myocardial or cardiovascular) or tissue (cardiac tissue ) Or cultures thereof, and may be selected from, for example, a human being suffering from ischemic cell death or cardiovascular disease or myocardial or cardiovascular cells isolated therefrom, cardiac tissue, or a culture thereof.
  • a rodent such as a human having ischemic cell death or cardiovascular disease, a primate of a primate, a rat, a mouse, or a cell (myocardial or cardiovascular) or tissue (cardiac tissue ) Or cultures thereof, and may be selected from, for example, a human being suffering from ischemic cell death or cardiovascular disease or myocardial or cardiovascular cells isolated therefrom, cardiac tissue, or a culture thereof.
  • the active ingredients Ang-1 and / or VEGF-secreting stem cells provided herein or pharmaceutical compositions comprising them can be administered to the subject by various routes of administration, such as oral or parenteral administration, and the route of administration is subcutaneous intramuscular ly, intradermal iy, intratumoral ly, intranodal ly, intramedulary, intra-femoral, intravenous, and lymphatic ⁇ .
  • routes of administration such as oral or parenteral administration
  • the route of administration is subcutaneous intramuscular ly, intradermal iy, intratumoral ly, intranodal ly, intramedulary, intra-femoral, intravenous, and lymphatic ⁇ .
  • the active ingredient Ang-1 and / or VEGF secreting stem cells or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in any convenient manner such as injection, transfusion, implant ation or transplantation into the lesion site of the individual (e.g., heart (cardiac, cardiovascular, etc.) (Intravenous administration or arterial administration), and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • a convenient manner such as injection, transfusion, implant ation or transplantation into the lesion site of the individual (e.g., heart (cardiac, cardiovascular, etc.) (Intravenous administration or arterial administration), and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • compositions provided herein may be formulated into oral preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols or the like formulated in accordance with conventional methods, or suspensions, emulsions, freeze- , External preparations, suppositories, sterile injectable solutions, parenteral formulations such as transplant preparations, and the like.
  • the amount of the stem cell or pharmaceutical composition to be used according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the subject to be treated, and may vary depending on the condition of the subject to be treated, the specific category or type of cancer to be treated, , And susceptibility to the particular therapeutic agent, and can be appropriately prescribed in view of this.
  • the stem single dose of the cells (a pharmaceutically effective amount for obtaining the effect of a predetermined desired) is lxlO 3 ⁇ lxlO 9 per 1 kg body weight of administration of the target object, for example, lxlO 4 ⁇ lxlO 9 gae, lxlO 4 ⁇ 1 x 10 s , lxlO 5 ⁇ lxlO 7 , or lxlO 5 ⁇ lxlO 6 , but is not limited thereto.
  • Angiopoietin-1 is a protein that plays an important role in angiogenesis, and is a mammalian-derived protein composed of human Ang-1 (mRNA: GenBank Accession No. LY001146.4) Ang-1. ≪ / RTI > Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) is a protein that plays an important role in vasculogenesis and angiogenesis. It is a protein derived from mammals such as human VEGF (gene (mRNA): GenBank Accession No. 00001171623.1) One species selected from VEGF Or more.
  • the stem cell may be a mammal, for example, a stem cell derived from a human.
  • the stem cells may be used to encompass both embryonic stem cells, adult stem cells, and progenitor cells.
  • the stem cell may be a stem cell derived from the same species and / or a stem cell derived from an autosome.
  • Embryonic stem cells are stem cells derived from embryonic stem cells that have the ability to differentiate into cells of all tissues.
  • progenitor cells are capable of differentiating into specific types of cells, but they are more specific and targeted than stem cells, and unlike stem cells, the number of divisions is finite.
  • the pre-developmental cells may be pre-developmental cells derived from mesoderm, but are not limited thereto. Before generating cell herein it is included in stem cell category, unless otherwise noted. 1 stem cell "are to be interpreted as a concept containing also occur around the cell.
  • Adult stem cells are stem cells extracted from umbilical cord, umbilical cord blood (umbilical cord blood) or adult bone marrow, blood, nerve, etc., which means primitive cells just before being differentiated into cells of specific organs.
  • the adult stem cells may be at least one selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and the like.
  • the adult stem cells may be mammals, such as human adult stem cells.
  • Adult stem cells are difficult to proliferate and tend to differentiate easily. Instead of using various kinds of adult stem cells, they can be used for various long-term regeneration needed in actual medicine. In addition, they can differentiate according to the characteristics of each organ And can be advantageously applied to the treatment of incurable diseases / incurable diseases.
  • the stem cells may be mammalian mesenchymal stem cells (MSCs), such as human mesenchymal stem cells.
  • MSCs mammalian mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stromal cells (MSC) are called osteoblasts, chondrocytes, myocytes, and adipocytes.
  • the mesenchymal stem cells are called mesenchymal stromal cells (MSCs) (Tiotropic stromal cell) that can differentiate into various types of cells, such as the tongue.
  • the mesenchymal stem cells may be mammalian, for example, a human mesenchymal stem cell.
  • the introduction of the gene may mean that the Ang-1 and / or VEGF gene is inserted into the genome of the stem cell, for example, insertion into the safe harbor gene region such as AAVS1 in the genome of the stem cell .
  • Safe Harbor gene means a safe gene region that does not cause cell damage even when the DNA of this part is damaged (cleavage, and / or nucleotide deletion, substitution, insertion or the like).
  • Adeno- associated virus integration site such as MVS1 located on human chromosome 19 (19cil3), etc.), but the present invention is not limited thereto.
  • the insertion (introduction) of the Ang-1 and / or VEGF gene into the stem cell genome can be carried out through all genetic engineering techniques commonly used for gene transfer into the genome of animal cells.
  • the genetic engineering technique may be using endonuclease.
  • the endonuclease may be used in conjunction with the guide R A to exhibit a target specific endonuclease activity and target the safe harbor gene region as described above.
  • the endonuclease acts to cleave a specific gene of a stem cell genome and insert a foreign gene (Ang-1 and VEGF gene) therein.
  • the endonuclease is also referred to as a programmable nuclease, and is capable of recognizing a specific position on a desired genomic DNA and terminating all forms of endo-cleavage (single strand cleavage or double strand cleavage) Nuclease.
  • the endonuclease may be isolated from microorganisms or non-natural ly occurring recombinantly or synthetically.
  • the endonuclease is But are not limited to, those that are commonly used for nuclear transfer of eukaryotic cells (e.g., nuclear localization signal (NLS), etc.).
  • the endonuclease may be used in the form of a purified protein, in the form of DNA encoding it, or in the form of a recombinant vector comprising the DNA.
  • the endonuclease is a group consisting of meganuclease, Zinc finger (Fokl protein) nuclease, CRISPR / Cas9 (Cas9 protein), CRISP-Cpfl (Cpfl protein) and TALE-nuclease ≪ / RTI > In one embodiment, the endonuclease is a Cas9 protein or a Cpfl protein.
  • the target specific endonuclease is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • a transcription activator-like effector nuclease fused with a transcription activator-like effector domain and a cleavage domain derived from a plant pathogenic gene that is a domain that recognizes a specific target sequence on the genome;
  • Zink-fingers Zinc-finger nuclease
  • RNA-guided engineered nuclease e.g., Cas protein (e.g., Cas9, etc.), Cpfl, etc.) derived from the microbial immune system CRISPR;
  • Cas protein e.g., Cas9, etc.
  • Cpfl microbial immune system
  • Ago homo 1 og (DNA-guided endonuclease)
  • the target-specific endonuclease may recognize a specific nucleotide sequence in the genome of an animal, including a prokaryotic cell and / or a human cell, such as eukaryotic cells, resulting in a double strand break (DSB) .
  • the double helix cleavage can cut the double helix of DNA to produce a blunt end or a cohesive end.
  • DSBs can be efficiently repaired by homologous recombination or non-homologous end-joining (NHEJ) mechanisms within the cell, where desired mutations can be introduced into the target site.
  • NHEJ non-homologous end-joining
  • Such meganuclease may be, but is not limited to, a naturally-occurring meganuclease, which has 15 to 40 base pair cleavage sites , Which are usually categorized into four families: the LAGLIDADG family, the GIY- YIG family, the His-Cyst box family, and the HNH family.
  • Exemplary meganuclease agents include but are not limited to I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-Csml, I-Panl, I-SceII, I- , I-Tevl, I-TevII, and I-TevIII.
  • the ZFN comprises a selected gene and a zinc-finger protein engineered to bind to a target region of a cleavage domain or a cleavage half-domain.
  • the ZFN may be an artificial restriction enzyme comprising a zinc-finger DNA binding domain and a DNA cleavage domain.
  • the zinc-finger DNA binding domain may be engineered to bind to the selected sequence.
  • Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313- 340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin.
  • zinc finger domains and / or multi-finger zinc finger proteins may be linked to a linker comprising any suitable linker sequence, for example, a linker of 5 or more amino acids in length Can be connected together. Examples of linker sequences of 6 or more amino acids in length are disclosed in U. S. Patent Nos. 6,479, 626; 6, 903, 185; 7, 153, 949.
  • the proteins described herein may include any combination of appropriate linkers between each zinc finger of the protein.
  • nuclease such as ZFN contains a nuclease active portion (cleavage domain, cleavage half-domain).
  • the cleavage domain may be heterologous to the DNA binding domain, such as, for example, a cleavage domain from a nuclease that is different from a zinc finger DNA binding domain.
  • the heterologous cleavage domain can be obtained from any endonuclease or from an aconuclease.
  • Exemplary endonuclease agents from which the cleavage domain may be derived include, but are not limited to, restriction endonucleases and meganuclease agents.
  • a truncated half-domain can be derived from any nuclease, or a portion thereof, that requires dimerization for cleavage activity, as indicated above.
  • the fusion protein comprises a cleavage half-domain, generally two fusion proteins are required for cleavage.
  • a single protein comprising two truncated half-domains may be used.
  • the two cleavage half-domains may be from the same endonuclease (or functional fragments thereof), or each cleavage half-domain may be derived from a different endonuclease (or functional fragments thereof) have.
  • the target site of the two fusion proteins is located such that the cleavage-half domains are positioned spatially oriented relative to each other by the binding of the two fusion proteins and their respective target sites, so that the cleavage half- It is preferable that they are arranged so as to be able to form a functional cleavage domain by embedding.
  • the neighboring edges of the target site are separated by 3 to 8 nucleotides or 14 to 18 nucleotides.
  • any integer number of nucleotides or nucleotide pairs can be interposed between the two target sites (e.g., 2 to 50 nucleotide pairs or more).
  • the cleavage site lies between the target sites.
  • Restriction endonucleases are present in many species and can sequence-specifically bind to DNA (at the target site) and directly cut DNA at or near the junction.
  • Some restriction enzymes eg, Type I IS
  • Fokl catalyzes the cleavage of stranded DNA strands at nine nucleotides from a recognition site on one strand and thirteen nucleotides from a recognition site on the other strand.
  • the fusion protein comprises a cleavage domain (or cleavage half-domain) from at least one Type I IS restriction enzyme and one or more zinc-finger binding domains (which may or may not be engineered) .
  • TALEN refers to a nuclease capable of recognizing and cleaving a target region of DNA.
  • TALEN refers to a fusion protein comprising a TALE domain and a nucleotide truncation domain.
  • the terms " TAL effector nuclease " and " TALEN " are interchangeable.
  • the TAL effect is known as the protein secreted by their type m secretion system when Xanthomonas bacteria are infected with various plant species.
  • the protein may be associated with a promoter sequence in a host plant to activate expression of a plant gene that aids in bacterial infection.
  • TALE trimeronuclease
  • the protein recognizes plant DNA sequences through a repetitive domain consisting of fewer than 34 and a variable number of amino acid repeats.
  • TALE is expected to be a new platform for tools in genome engineering.
  • a few key parameters that have not been known to date should be defined as follows. i) the minimum DNA-binding domain of TALE, ii) the length of the spacer between the two half-digits constituting one target region, and iii) the linker or fusion junction connecting the Fokl nucleases domain to dTALE ion).
  • the TALE domain of the present invention refers to a protein domain that binds to nucleotides in a sequence-specific manner through one or more TALE repeat motifs.
  • the TALE domain includes, but is not limited to, at least one TALE-repeat motif, more specifically 1 to 30 TALE repeat motifs.
  • the terms " TAL effector domain " and " TALE domain " are interchangeable.
  • the TALE domain may include half of the TALE-repeat models. The above TALEN and The entire contents of the disclosure of WO / 2012/093833 or US-A-2013-0217131 are incorporated herein by reference.
  • the insertion (introduction) of the Ang-1 and / or VEGF-encoding gene into a stem cell genome can be performed using endonuclease (RGEN derived from CRISPR).
  • RGEN derived from CRISPR
  • the endonuclease may be,
  • RNA-guided nuclease or a coding DNA thereof, or a recombinant vector comprising the coding DNA
  • the target region of the target gene e.g., a safe harbor site such as MVSl
  • a safe harbor gene e.g., in a safe harbor gene such as MVSl
  • the endonuclease may be one or more selected from all nuclease agents capable of recognizing a specific sequence of the target gene and having a nucleotide cleavage activity and causing induction and / or deletion (Indel) in the target gene .
  • the endonuclease is a Cas protein (eg, a Cas9 protein (CRISPR) (Clustered regular interspecific short palindromic repeats) associated protein 9), a Cpf 1 protein (CRISPR from Prevotel la and Franci sel la 1), and the like, and nuclease (e.g., endonuclease) associated with type ⁇ and / or type V CRISPR system.
  • the endonuclease further comprises a target DNA specific guide RNA for directing to a target site of the genomic DNA.
  • the guide RNA may be transcribed in vitro, and may be, for example, transcribed from an oligonucleotide double stranded or plasmid template.
  • the endonuclease is capable of acting in the form of a ribonucleic acid protein (RNP) by forming a ribonucleic acid-protein complex bound to a guide RNA (RNA-Guided Engineered Nuclease) outside the living body (cell) .
  • RNP ribonucleic acid protein
  • RNA-Guided Engineered Nuclease RNA-Guided Engineered Nuclease
  • Cas protein is a major protein component of the CRISPR / Cas system and is capable of forming an activated endonuclease or ni ckase.
  • Strap tokocus sp. (. Sirepiococ zs sp "), for example, Streptococcus blood yoge Ness (Streptococcus pyogenes) derived from Cas proteins, for example, Cas9 protein (e.g., SwissProt Accession number Q99ZW2 (NP_269215.1));
  • Cas proteins derived from Campylobacter such as Campylobacter jejuni, for example Cas9 protein
  • Cas proteins derived from Streptococcus such as Streptococcus thernopi les or Streptocuccus aureus such as Cas9 protein;
  • Cas proteins derived from Neisseria meningitidis such as Cas9 protein
  • Pasteurella multocida such as Cas9 protein
  • Cas proteins derived from the genus Francis sella such as Francisella novicida, such as the Cas9 protein
  • the gene deletion is adjacent to the 5 'end of the Cas9 protein-specific PAM (proto-spacer-adjacent motif) sequence according to the nucleotide sequence-derived microorganism of each gene For example, single stranded or double stranded truncation of the 3 bp frontal PAM sequence at the consecutive 17 bp to 30 bp nucleotide sequence positions located by
  • the PAM sequence is 5'-NGG-3 '(N is A, T, G, or C)
  • the base sequence region (target region) to be cleaved is a consecutive 17 bp to 30 bp or 17 bp to 23 bp, for example 20 bp, located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'- NGG- Base sequence region.
  • the PAM sequence is 5'-NNNNRYAC_3 '(where N is Wherein the base sequence region (target region) to be cleaved is a 5'-NNNNRYAC-3 'sequence in the target gene. May be consecutive 17 bp to 23 bp, e. G. , 21 bp to 23 bp nucleotide sequences located adjacent to the 5 'and / or 3' ends.
  • the Cas9 protein is a Streptococcus thermophilus
  • the sequence region may be a consecutive 17 bp to 23 bp, for example 21 bp to 23 bp, sequence located adjacent to the 5 'or 3' end of the 5'-NNAGMW-3 'sequence in the target gene.
  • the PAM sequence is 5'-NNNNGATT-3 '(wherein each N is independently A, T, C, or G) .
  • the base sequence region (target region) to be cleaved is consecutive 17 bp to 23 bp, for example 21 bp to 23 bp, located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNNNGATT- Base sequence region.
  • the PAM sequence is 5'-NNGRR (T) -3 'wherein N is each independently A, T, C or G (R) is A or G, and (T) means a sequence that can optionally be included), and the base sequence region to be cleaved is a 5'-NNGRR (T) -3 1 sequence in the target gene May be a consecutive base sequence region of 17 bp to 23 bp, e.g., 21 bp to 23 bp, located adjacent to the ' terminal or 3 '
  • the Cpfl protein is an endonuclease of the new CRISPR system distinct from the CRISPR / Cas system, which is relatively small in size and does not require tracRNA, and can act by a single guide RNA. In addition, it recognizes thymine-rich protospacer-adjacent motif (PAM) sequences and cuts double strands of DNA to produce a cohesive end (cohesive double-strand break).
  • PAM thymine-rich protospacer-adjacent motif
  • the Cpfl protein may be selected from the group consisting of Cand datus, Lachnospira, Butyrivibrio, Peregrinibacteria,
  • BV3L6 Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotel la disiens, Moraxella bovoculi (237), Sniihella sp.
  • SC-K08D17 Lactobacillus sp.
  • Leptospira inadai Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisel la novicida (U112), Candidatus Methanoplasma terwituw, Candidatus Paceibacter, and Eubacteriuw eligens.
  • the PAM sequence is ⁇ '- ⁇ - ⁇ is A, T, C or G, and the cleaved base sequence region (target site) For example, 21 bp to 23 bp contiguous to the 5 'or 3' end of the ⁇ -3 'sequence.
  • the endonuclease may be isolated from microorganisms or artificially or naturally occurring, such as recombinant or synthetic methods.
  • the endonuclease may be used in the form of a pre-transcribed niRNA in vitro or a pre-produced protein form, or a form contained in a recombinant vector for expression in a target cell or in vivo.
  • the endonuclease (for example, Cas9, Cpfl, and the like) is a recombinant DNACRecombinant DNA; rDNA).
  • Recombinant DAN refers to a DNA molecule artificially created by genetic recombination methods, such as molecular cloning, to include heterologous or homologous genetic material obtained from various organisms.
  • the target-specific nuclease may be a mutated form of a mutated target-specific nuclease.
  • Such a variation of the target specific nuclease may be that occurring at least in the catalytic domain of the nuclease (e.g., the RuvC catalytic domain in the case of Cas9).
  • the mutation is an aspartic acid residue with catalytic activity (eg, aspartate acid (D10) at position 10 in SEQ ID NO: 4), glutamic acid (E762) at position 762 in SEQ ID NO: 4, histidine Asparagine (N854) at position 863, asparagine (N863) at position 863, aspartic acid at position 986 (D986), and the like.
  • catalytic activity eg, aspartate acid (D10) at position 10 in SEQ ID NO: 4
  • glutamic acid (E762) at position 762 in SEQ ID NO: 4
  • any other amino acid to be substituted may be alanine, but is not limited thereto.
  • the mutated target specific nuclease may be mutated to recognize a p-human sequence that differs from the wild-type Cas9 protein.
  • the mutation target-specific nuclease may include at least one of an aspartic acid (D1135) at position 1135, arginine at position 1335 (R1335), and threonine at position 1337 (T1337) of Cas9 protein derived from Streptococcus pyoensis , For example all three are mutated to recognize another NGA (N is any base selected from A, T, G, and C) that is different from the PAM sequence (NGG) of wild-type Cas9 .
  • NGA is any base selected from A, T, G, and C
  • the mutation target-specific nuclease is selected from the group consisting of the amino acid sequence of the Cas9 protein from Streptococcus fyijens (SEQ ID NO: 4)
  • the 'other amino acid' includes alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, purine, tryptophan, valine, Among all known variants of asparagine, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine and the above amino acids, amino acids selected from amino acids other than the amino acid .
  • the 'other amino acid' may be alanine, valine, glutamine, or arginine.
  • guide RNA refers to an RNA comprising a targeting sequence capable of being expressed in a specific base sequence (target sequence) in a target region in a target gene, And binds to a nuclease such as Cas protein, Cpf1, etc. in a living body (or cell) and directs it to a target gene (or a target site).
  • the guide RNA may be appropriately selected depending on the kind of nuclease to be complexed and / or the microorganism derived therefrom.
  • RNA crRNA
  • tracrRNA Fra / js-act ivat ing crRNA (tracrRNA), which contains sites that interact with nuclease such as Cas protein, Cpf1 and the like;
  • a single guide RNA in the form of fusion of the major part of the crRNA and the tracrRNA (for example, a crRNA site including a targeting sequence and a site of a tracrRNA interacting with a nuclease)
  • RNA may be a dual RNA comprising CRISPR RNA (crRNA) and ira / js-act ivat ing crRNA (tracrRNA), or a single guide RNA (sgRNA) comprising the major regions of crRNA and tracrRNA.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA ira / js-act ivat ing crRNA
  • sgRNA single guide RNA
  • the sgRNA is a part having a sequence (a targeting sequence) complementary to a target sequence in a target gene (also referred to as a Spacer region, a target DNA recognition sequence, a base pairing region, etc.)
  • a target sequence in a target gene also referred to as a Spacer region, a target DNA recognition sequence, a base pairing region, etc.
  • the structures described above may be sequentially present in the order of 5 'to 3', but are not limited thereto.
  • the guide RNA is selected from the group consisting of crRNA and Any type of guide RNA may be used in the present invention if it contains a major portion of the tracrRNA and a complementary portion of the target DNA.
  • the Cas9 protein contains two guide RNAs for target gene correction: CRISPR RNA (crRNA) having a nucleotide sequence that can be reacted with the target region of the target gene, and irans-act ivat ing crRNA (Which interact with Cas9 protein), these crRNAs and racrRNAs are linked via a double-stranded, double-stranded, crRNA: tRNA-rRNA complex or through a linker to form a single guide RNA (sgRNA) Can be used.
  • CRISPR RNA CRISPR RNA
  • irans-act ivat ing crRNA Which interact with Cas9 protein
  • the sgRNA comprises at least a portion of all or a portion of the crRNA comprising the nucleotide sequence capable of stabilizing the crRNA, and a region containing at least a site that interacts with the Cas9 protein of the Cas9's tracrRNA It may be that some or all of the racrRNAs form a hair-pin structure (stem-loop structure) through the nucleotide linker, where the nucleotide linker may correspond to the loop structure.
  • the guide RNA specifically a crRNA or an sgRNA, comprises a sequence complementary to a target sequence in a target gene (targeting sequence), and includes at least one upstream region of a crRNA or sgRNA, specifically at the 5 'end of a sRNA or dualRNA crRNA, , 1-10, 1-5, or 1-3 additional nucleotides.
  • the additional nucleotide may be, but is not limited to, guanine (G).
  • the guide NA may comprise crRNA, and may be appropriately selected according to the Cpf1 protein type and / or the microorganism from which the complex is to be formed.
  • the specific sequence of the guide RNA can be appropriately selected according to the kind of nuclease (Cas9 or Cpfl) (that is, the derived microorganism), and it can be easily determined by those skilled in the art Isai
  • the crRNA when the Cas9 protein from Streptococcus pyogenes is used as the target specific nuclease, the crRNA may be represented by the following general formula 1:
  • N cas9 is a targeting sequence, that is, a site determined based on the sequence of the target site of the target gene (capable of being hybridized with the target sequence of the target site), 1 is the number of nucleotides contained in the targeting sequence 15 to 3 () 17 to 23, or an integer of 18 to 22, for example 20,
  • the site containing the consecutive 12 nucleotides (GUUUUAGAGCUA) (SEQ ID NO: 1) located in the 3 'direction of the targeting sequence is an essential part of the crRNA,
  • X cas9 is a site containing m nucleotides located at the 3 'terminal side of the crRNA (i.e., located adjacent to the 3' direction of the essential part of the crRNA), and m is an integer of 8 to 12, And the m nucleotides may be the same or different from each other, and may be independently selected from the group consisting of A, U, C and G.
  • X cas9 may include, but is not limited to, UGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 2).
  • tracrRNA can be represented by the following general formula 2:
  • SEQ ID NO: 3 is an essential part of tracRNA
  • Y cas9 is a site containing p nucleotides located adjacent to the 5 1 end of the essential part of the tracrRNA, p may be an integer of 6 to 20, such as an integer of 8 to 19, and the p nucleotides may be the same And may be independently selected from the group consisting of A, U, C and G,
  • sgRNA form a hairpin structure (stem-loop structure) oligonucleotide is tracrRNA elements throughout the oligonucleotide linker containing crRNA part, and an integral part of the tracrRNA (60 nucleotides) containing the targeting sequence and the essential portion of the crRNA (At this time, the oligonucleotide linker corresponds to the loop structure). More specifically, the sgRNA is a double-stranded RNA molecule in which a portion of a trcRNA comprising an essential portion of a crRNA and a trcRNA portion containing an essential portion of a tracrRNA are bound to each other. In the double-stranded RNA molecule, the 3 'end of the crRNA region and the 5' And may have a hairpin structure connected through a nucleotide linker.
  • the sgRNA can be represented by the following general formula 3:
  • the oligonucleotide linker contained in the sgRNA may contain 3 to 5 nucleotides, for example, 4 nucleotides.
  • the nucleotides may be the same or different from each other and are each independently selected from the group consisting of A, U, C and G .
  • the crRNA or sgRNA may further comprise 1 to 3 guanines (G) at the 5 'terminus (i.e., at the 5' terminus of the targeting sequence region of the crRNA).
  • the tracrRNA or sgRNA may further comprise a termination site comprising 5 to 7 uracil (U) at the 3 'end of an essential part (60 nt) of the tracrRNA.
  • the target sequence of the guide RNA is located at the 5 'end of PAM (Protospacer Adjacent Motif sequence 5'-NGG-3' (N is A, T, G, or C in the case of S. pyoge / es Cas9) From about 17 to about 23, or from about 18 to about 22, such as 20, contiguous nucleic acid sequences located contiguously.
  • PAM Protospacer Adjacent Motif sequence 5'-NGG-3' (N is A, T, G, or C in the case of S. pyoge / es Cas9)
  • N is A, T, G, or C in the case of S. pyoge / es Cas9
  • the target sequence of the guide RNA and the targeting sequence of the guide RNA that can be stabilized can be determined by the DNA strand (i.e., PAM sequence (5'-NGG-3 1 where N is A, T, G, or C)
  • the guide RNA may be represented by the following general formula: 5'-nl-n2-AU-n3-UCUACU-n4-n5-n6-n7-GUAGAU- (Ncp f1) q-3 '(general formula 4).
  • n1 is absent or U is A or G
  • n2 is A or G
  • n3 is U
  • n4 is absent or G
  • C or A and n5 is A, C, G, or none
  • n6 is U
  • n7 is U or G
  • Ncpfl is determined according to the target sequence of the target gene as a targeting sequence including a gene target site and a floatable nucleotide sequence, and q represents the number of nucleotides contained, and may be an integer of 15 to 30.
  • the target sequence of the target gene (a sequence which is to be modified with a crRNA) is P nucleotide sequence (5'-TATN-3 'or 5'-TATTN- (For example, contiguous) of the target region of the target gene in the 3 'direction of the target gene (for example, a nucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the crRNA of the Cpfl protein may further contain 1 to 3 guanines (G) at the 5 'terminus.
  • the 5 'terminal region sequence (excluding the targeting sequence region) of the crRNA sequence of the Cpf1 protein usable according to the Cpfl-derived microorganism is exemplified in Table 1:
  • Porphyromonas crev i or i can is (PcCpf 1) UAAUUUCUACU-AUUGUAGAU
  • Leptospira inadai (LiCpf 1) GAAUUUCUACU-UUUGUAGAU .
  • Candidatus methano lasma termi tum (CMtCpf 1) GAAUCUCUACUCUUUGUAGAU.
  • Eubacterium eligens (EeCpf 1) UAAUUUCUAGU- UUGUAGAU
  • the nucleotide sequence that can be reacted with the gene target site is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 99% , Or 10 nucleotide sequences complementary to each other (hereinafter, used in the same sense unless otherwise specified, and the sequence homology can be confirmed using conventional sequence comparison means (for example, BLAST) .
  • transduction of the guide RNA and an RNA-guided endonuclease (e.g., Cas9 protein) into cells is carried out by a conventional method (for example, electroporation, etc.) (Or more than 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 80%, at least 80% A gene having 97% or more, 98% or more, or 99% or more of the nucleotide sequence homology) is introduced into a cell in a state contained in a vector or a separate vector (e.g., plasmid, virus vector, etc.) You can do it through.
  • a conventional method for example, electroporation, etc.
  • a separate vector e.g., plasmid, virus vector, etc.
  • the vector may be a virus vector.
  • the virus vector may be a negative strand RNA viruses such as influenza viruses such as retroviruses, adenovirus parvoviruses (e.g., adenoassociated viruses (AAV)), coronaviruses, orthomyxoviruses, Rhabdoviruses such as rabies and follicular stomatitis virus), paramyxoviruses (e.g., dengue and Sendai, alphavirus and pi cornavius) And herpes viruses such as herpes simplex virus types 1 and 2, 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus), double-stranded DNA viruses including adenovirus, poxvirus (e.g., vaccinia, fowlpox ) And canarypox), and the like.
  • influenza viruses such as retroviruses, adenovirus parvoviruses (e.g., adenoassociated viruses (AAV)), coronaviruses
  • the Cas9 protein-encoding nucleic acid molecule, the guide RNA-encoding nucleic acid molecule, or a vector comprising at least one of these may be used for electroporation, liposome, virus vector, nanoparticles, PTD (protein translocation domain)
  • the Cas9 protein and / or the guide RNA may be delivered to the cell using a variety of methods known in the art, such as fusion protein methods, and for the intracellular delivery of the cells, the Cas9 protein and / .
  • cleavage " of a target site refers to the breakage of the covalent backbone of the polynucleotide. Cleavage can include, but is not limited to, enzymatic or chemical hydrolysis of phosphodiester linkages, and can be accomplished by a variety of other methods. Both single-strand breaks and double-strand breaks are possible, and double-strand breaks can occur as a result of two distinct single-strand breaks. Cleavage of double strands can produce blunt ends or staggered ends.
  • the generation and regeneration of blood vessels are indispensable, but the development of a method for promoting them is urgent. Therefore, the Ang-1 and VEGF secreting stem cells of the present invention can be usefully used for preventing and treating vascular regrowth in cardiovascular diseases such as myocardial infarction and lower limb ischemia.
  • FIG. 1 shows the vector structure for producing Ang-1 secreted umbilical mesenchymal stem cells and the secretion of Ang-1 from these cells after western blotting and ELISA.
  • FIG. 2 shows a vector structure for preparing VEGF secreting umbilical mesenchymal stem cells, and VEGP secretion from these cells after western blotting and ELISA.
  • FIGS. 3A and 3B show CRISPR / Cas9 RNPs for delivery of Ang-1 or VEGF secretory cell producing vectors to confirm the increase of the transfer rate in Jurkat cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the result of observing the degree of under-injury of ANG-1 secreted umbilical cord mesenchymal stem cells or VEGF secretory umbilical cord mesenchymal stem cells treated with lower limb ischemia model.
  • 5a to 5c show the survival rates (5a), the degree of angiogenesis (5b), and the expression levels of major factors in the myocardial cell survival (5a) upon administration of Ang-1 and VEGF secreting umbilical cord mesenchymal stem cells 5c).
  • FIG. 6 is a graph showing the degree of fibrosis in the heart of a rat treated with Ang-1 and VEGF secreting umbilical cord mesenchymal stem cells, Scar Area (LV), Infacted Wal thi ckness (mm), and LV expans ion index.
  • FIG. 7A is a photograph showing heart rate of a rat treated with Ang-1-MSC and VEGF-MSC in myocardial infarction model and myocardial infarction model in a living body by CINE-f-MRI technique, Fig.
  • Fig. 8 is a graph showing the angiogenesis of the heart of rats treated with Ang-1 and VEGF secreting umbilical artery embryonic stem cells, respectively, in a myocardial infarction model.
  • Example 1 Preparation of Ang-1 and VEGF secreting cells using CRISPR / Cas9 RNP 1.1. Production of Ang-1 secretory cells
  • Ang-1 gene GenBank Accession No. LY001146.4
  • pZDonor vector Sigma Aldrich
  • a CRISPR / Cas9 RNP 0 strain targeting MVS1 was prepared (Cas9: Cas9 protein from Streptococcus pyogenes; Target sequence of sgRNA to target AAVS1: gucaccaauccugucccuag; The entire sequence is represented by the general formula 3 described above).
  • the prepared MVS1-targeting CRISPR / Cas9 RNP and pZDonor containing the Ang-1 gene were transfected together with human umbilical cord mesenchymal stem cells.
  • the umbilical cord was treated with collagenase, centrifuged to remove the solution, placed in a T25 flask and incubated at 37 ° C with 5% CO 2 Lt; / RTI > After 7 days, the cells adhered to the flask were examined for chromosomes.
  • the culture was incubated with 20% fetal bovine serum (FBS) and 4 ng / mL basic fibroblast growth After replacing the medium with the modified minimum essential medium supplemented with factor, start the culture by transferring to the T25 flask. After 5 to 7 days, check whether the cells adhere well to the bottom and proliferate. If the cells start to proliferate stably, The culture was then changed twice a week until 80% confluent.
  • FBS fetal bovine serum
  • 4 ng / mL basic fibroblast growth After replacing the medium with the modified minimum essential medium supplemented with factor, start the culture by transferring to the T25 flask. After 5 to 7 days, check whether the cells adhere well to the bottom and proliferate. If the cells start to proliferate stably, The culture was then changed twice a week until 80% confluent.
  • CRISPR / Cas9 RNP cleaves the MVS site of the cell gene, thereby inserting the desired gene (i.e. Ang-1 gene) between the cleavage sites, thereby producing Ang-1-secreting mesenchymal stem cell (Ang-1-MSC) And.
  • the Ang-1 secretion of the prepared Ang-1-MSC was tested by Western blotting, ELISA, PCR, and fluorescent immunostaining (Flag). The results are shown in FIG.
  • VEGF gene (GenBank Accession No. 00001171623.1) was inserted into pZDonor vector (Sigma-Aldrich) to prepare a recombinant vector for VEGF expression (Fig. 2).
  • pZDonor vector Sigma-Aldrich
  • sgRNA Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes
  • sgRNA serving as an AAVS1 target
  • targeting sequence gucaccaauccugucccuag, which is a target of MVS1.
  • the entire sequence is represented by the general formula 3 ).
  • PZDonor containing the CRISPR / Cas9 RNP and VEGF genes targeting the prepared MVS1 was transfected together with human umbilical cord mesenchymal stem cells (see Example 1.1).
  • CRISPR / Cas9 RNP inserts the desired gene (i.e., the VEGF gene) between the cleavage sites by cleaving the AAVS site in the cell gene, whereby VEGF (VEGF-MSC) were produced.
  • VEGF-MSC VEGF secretion of the prepared VEGF-MSC was tested by Western blotting, ELISA, PCR, and fluorescent immunostaining (Flag). The results are shown in FIG.
  • cDNA was synthesized using olig-dT primer and reverse transcriptase.
  • the cDNA synthesis was carried out at 42 ° C for 1 hour and at 95 ° C for 10 minutes to stop the enzyme activity.
  • the immobilized cells were reacted with the primary antibody at 4 ° C for 12 hours, washed, and incubated with fluorescein-conjugated goat anti-i-rabbit IgG for 1 hour at room temperature.
  • the stained cells were placed on a glass slide and observed with a Zeiss con focal microscope.
  • the inducible (insertion and / or deletion) efficiency of the single-primed CRISPR / Cas9 RNP (template) was tested in Jurkat cells (ATCC) and the results are shown in FIGS. 3b.
  • sgRNA targeting sgRNA # 1: 5'-GTCACCMTCCTGTCCCTAG (TGG) -3 '(hAAVSl # 1; parenthesized is the PAM sequence);
  • sgRNA # 2 5'-ACCCCACAGTGG ⁇ CCACTA (GGG) - 3 'G in parentheses is the PAM sequence); Sp. cas9 only: proceed to process only Cas9 protein (SEQ ID NO: 4) ";
  • aRGENl processed by processing sgRNA # l and Cas9 protein targeting hAAVSl # 1;
  • aRGEN2 processed by processing sgRNA # 2 and Cas9 protein targeting hAAVSl # 2;
  • dRGENl proceeded by treating plasmids encoding sgRNA # l and Cas9 protein targeting AVS1 # 1;
  • dRGEN2 sgRNA # 2 targeting hAAVSl # 2 and a plasmid encoding Cas9 protein).
  • Example 2 Myocardial cell protection effect
  • Human heart muscle cells (ATCC: https: //www.wccc.org/) were mixed with 5% (v / v) FBS, 5 (v / v) HS (horse serum), 20 / The cells were suspended in DMEM (culture medium) supplemented with 2.5 / g / n of amphotericin B and plated in a 10 cm culture dish with lxlO 6 cel ls / iii (10 m) Maintained at 37 [ deg.] C in the incubator: 2 to 3 weeks after in vitro incubation, treated with AGE-albumin (Sigma-Aldrich) and used for apoptosis-related properties.
  • DMEM culture medium
  • lxlO 6 cel ls / iii 10 m
  • the human myocardial cells prepared in Example 2.1 were inoculated into a 96-well culture plate with 2x10 3 cells per well. After reaching an 80% confluence, primary human myocardial cells were treated with 50 nM AGE-albumin (Sigma-Aldrich) for 24 hours. Cells were then washed with PBS after treatment with Ang-1-MSC (Ang-1 secreted cordage mesenchymal stem cells) or VEGF-MSC (VEGF secreting mesenchymal stem cells) (see Example 1 above) The cell viability was then measured by MTT [3- (4,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl) -1,5-di pheny 1 tetrazolium bromide] assay.
  • MTT [3- (4,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl) -1,5-di pheny 1 tetrazolium bromide
  • the yellow ⁇ compound is converted by living cells into a blue formazen dissolved in dimethylsulfoxide (Me 2 SO). 0.5 mg / ml MTT was added to each well and incubated for 2 hours and DMSO (Sigma-Aldrich) was added. The blue staining intensity (absorbance) in the culture medium was measured at 540 nm using a 96-well plate reader (VERSA Max, Molecular Devices) and expressed as a proportional amount of viable cells.
  • MSC, VEGF: VEGF-MSC, ANG1: ANG1-MSC, VEGF + MSC, and angiogenesis were shown in FIG. 5A (proliferation assay result; cell survival rate)
  • ANG1 a mixture of VEGF-MSC and ANG1-MSC
  • rhVEGF recombinant human VEGF (RND system).
  • VEGF-MSC had an excellent angiogenic effect as compared with rhVEGF, a re-aggregate protein, which means that VEGF-MSC is caused by sustained release of VEGF.
  • ANG-1 or VEGF secreting mesenchymal stem cells have a protective effect (myocardial cell death inhibitory effect) on myocardial cell death, and this effect is more pronounced when ANG-1 or VEGF is used as monoclonal form Show excellent.
  • Example 2.2 each of the stem cell-treated myocardial cells was pulverized through liquid nitrogen, lysed with RIPA buffer (Abcam), centrifuged to take a supernatant, and the protein solution from the stem cell- Respectively. (Total protein amount: 30 ug) was subjected to electrophoresis using 10% SDS-PAGE gel, and then the PVDF membrane Lt; / RTI > The cells were washed with primary antibody (Sigma Aldrich) at 4 ° C for 12 hours. After completion of the reaction, the primary antibody was washed and reacted with HRP-conjugated secondary antibody (Vector laboratories) for 1 hour at room temperature.
  • RIPA buffer Abcam
  • Sprague Dawley rats weighing 250-300 g were anesthetized with ketamine (50 mg / kg) and xylazine (4 mg / kg).
  • a 16-gauge catheter was inserted into the trachea of an experimental animal, and it was connected to a ventilator. The animal was laid flat on a flat plate and fixed with a tape by a bare leg and a tail. The skin was cut longitudinally 1 to 1.5 cm from the left side of the bones, (pectoral is major musc le) and the small chest muscles were opened to confirm the space between the fifth ribs. After placing the retractor between the fifth and sixth ribs, the retractor was pushed up and down.
  • the thymus covered the upper part of the heart to cover the field of view.
  • the LAD Left Anter Ior Descending artery
  • the LAD located beneath ⁇ was tied to 6-0 si lk.
  • the skin was sutured using a MAX0N 4-0 fi lament, and the lute removed from the intubation was removed and the mucus on the pharynx was removed. After surgery, analgesic ((Buprenorphine 0.025 mg / kg) was injected into the skin every 12 hours.
  • analgesic ((Buprenorphine 0.025 mg / kg) was injected into the skin every 12 hours.
  • Ang-1-MSC Ang-1-MSC
  • VEGF-MSC VEGF-secreting mesenchymal stem cells
  • FIG. 6 The above observation result is shown in Fig. 6,
  • the upper graph shows the staining of the heart tissue
  • the left graph shows the results of the Scar Area (% of LV (left ventricular) area), which quantifies the infarct area.
  • the middle graph shows the infarcted wall thickness ( ⁇ ). The higher the value, the more the restoration of myocardial infarction.
  • the right graph shows the graph showing the LV expansion index , The lower the value, the more myocardial infarction is restored.
  • FIG. 6 when the Ang-1 and / or VEGF secretory cord mesenchymal stem cells were administered in rat heart cells before or after myocardial infarction, it was confirmed that the area of fibrosis (blue) Respectively.
  • the effect of treating myocardial infarction increased in the order of MSC ⁇ ANG1-MSC ⁇ VEGF-MSC ⁇ ANG1-MSC + VEGF-MSC (A + V MSC).
  • FIG. 7A is a photograph showing the heart beat of a rat treated with Ang-1-MSC and VEGF-MSC in the myocardial infarction model by observation using a CINE-f-MRI technique in vivo, and FIG. The infarct size was plotted as a graph. As shown in Figs. 7a-7b, the ejection fraction of the heart was also significantly increased compared to the normal MSC.
  • Example 4 Protective Effect of Ang-1-MSC or VEGF-MSC on Muscle Cell Death in Lower Extra-Atrial Model (/ ij VIVO Experiment)
  • Ang- 1-MSC 10 6 cells were injected. After 1 week and 2 weeks, the hind legs of the mouse were observed and shown in FIG.
  • Fig. 4 is a photograph showing the hind limb of a bare limb ischemic model mouse administered with Ang-1-MSC, MSC (positive control), and PBS (negative control). As shown in Fig. 4, it can be confirmed that lowering of muscle muscle activity in the lower limb of mice treated with Ang-1-MSC is alleviated as compared with MSC and PBS administration group.
  • IHC Immunohistochemistry
  • Immunohistochemistry was performed in the heart tissue of normal or myocardial infarcted rats (Example 3.1).
  • the heart tissues of normal or myocardial infarcted rats were fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M neutral phosphate buffer solution, cryopreserved overnight in 30% sucrose solution, and then lysed with cryostat (Leica CM 1900) at 10 m
  • the sections were prepared. Paraffin-embedded tissues were cut into 10-well sections, deparaffinized in xylene, and rehydrated with a series of graded ethanol. Normal goat serum (1OT) was used to block non-specific protein binding.
  • Tissue sections were incubated overnight at 4 ° C with one of the following antibodies: rabbit anti-alpha- SMA antibody (Abeam), mouse anti-human albumin antibody (1: 200, R & D System), goat anti- (1: 500, Abeam).
  • the cultured tissue sections were washed three times with PBS and incubated with Alexa flour 633 anti-mouse IgG (1: 500, Invitrogen) at room temperature for 1 hour. After washing the secondary antibody three times with PBS, cover slips were mounted on glass slides using Vectashield mounting medium (Vector Laboratories) and observed with a laser confocal fluorescence microscope (LSM-710, Carl Zeiss).

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Abstract

혈관 생성을 촉진하는 Angiopoietin-1(Ang-1) 또는 VEGF 분비 줄기세포, 이의 제조 방법 및 심혈관 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
안지오포이에틴 -1 또는 VEGF를 분비하는 줄기세포 및 이를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
[기술분야】
혈관 생성을 촉진하는 Angi opoi et i n— l (Ang— 1) 또는 VEGF 분비 줄기세포 이의 제조 방법 및 심혈관 질환 예방 또는- 치료 용도에 관한 것이디- .
【배경기술]
세포 치료제는 활발히 연구되고 있는 분야이다. 대표적인 세포 치료제 중 하나가 심근줄기세포이다. 심근즐기세포로 분화되는 줄기세포로 mesenchma l stem ce l l , 조혈모세포， 니 j피전구세포， 근육모세포, adipocyt e— der ived stem ce l l 등이 부각되고 있디—. 이와 같이 분화된 심근줄기세포는 심혈관 질환 치료를 위한 세포 치료제로시- 유용성이 증가되고 있고， 그 개발 기술에 대한 연구기- 활발히 진행중이다.
그러나, 현재의 단순 분리 배양법에 의하여 생산된 줄기세포들은 그 치료 효능이 낮아， 치료 기능이 보디- 강화된 고효율의 차세대줄기세포 개발이 필요하다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
일 예는 Ang-1를 분비하는 Ang-1 분비 줄기세포를 제공한다.
다른 예는 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포를 포함하는 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.
상기 줄기세포는 인간 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 Ang-1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포는 Ang-1 유전자 및 /또는 VEGF 유전자가 줄기세포 유전체 내에 삽입된， 예컨대， 줄기세포의 유전체 중의 MVS1 등과 같은 세이프 하버 ( safe harbor ) 부위에 삽입된 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 증간엽 줄기세포일 수 있고， 예컨대， 제대 등에서 유래하는 중간엽줄기세포일 수 있다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 포함하는， 혈관생성용 또는 혈관생성 촉진용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 혈관 생성 촉진을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관생성 방법 또는 혈관생성 촉진 방법을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 포함하는， 허혈성 세포사 저해용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 허혈성 세포사 저해를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 세포사 저해 방법을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 유효성분으로 포함하는， 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 즐기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는， 심혈관 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 심혈관질환은 심혈관 이상으로 생기는 병으로， 모든 허혈성 심혈관 질환 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 뇌졸중， 심근경색， 협심증， 하지허혈， 고혈압， 부정맥 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 즐기세포의 게놈에 Ang-1 유전자， VEGF 유전자， 또는 이들 모두를 도입시키는 단계를 포함하는， Ang-1 , VEGF , 또는 이들 모두를 분비하는 줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 줄기세포의 게놈에 Ang-
1 유전자 및 /또는 VEGF 유전자를 도입시키는 단계는 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 RNA Guided
Endonuc lease (RGEN)일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제와가이드 RNA는，
( 1) 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 R A가 복합체를 형성하는 리보핵산단백질 (Ribonucleoprotein) 형태， 또는
(2) (a) 엔도뉴클레아제 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터와 (b) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터의 흔합물 형태
로 사용 (예컨대， 투여)될 수 있다.
다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.
다른 예는 상기 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포 제작에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)의 복합체， 예컨대, CRISPR/Cas9 RNP를 제공한다. 【기술적 해결방법】
본 발명자들은 허혈성 질환에서 혈관 재생의 돕는 방법을 규명하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 심근경색 또는 하지허혈모델의 혈관의 생성에 Angiopoiet in-1 (Ang-1) 과 Vascul ar Endothel i al Growth Factor (VEGF)를 분비하는 줄기세포를 제작하고， 이를 이용하여 허혈성 심혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
일 예는 Ang-1를 분비하는 Ang-1 분비 즐기세포를 제공한다.
다른 예는 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다
다른 예는 Ang-1' 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포를 포함하는 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.
상기 줄기세포는 인간 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 Ang-1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포는 Ang-1 유전자 및 /또는 VEGF 유전자가 줄기세포 유전체 내에 삽입된, 예컨대， 줄기세포의 유전체 중의 MVS1 등과 같은 세이프 하버 (safe harbor ) 부위에 삽입된 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포알 수 있고， 예컨대， 제대 등에서 유래하는 중간엽줄기세포일 수 있다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 포함하는， 혈관생성용 또는 혈관생성 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 즐기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 아상， 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 혈관 생성 촉진을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관생성 방법 또는 혈관생성 촉진 방법을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 포함하는， 허혈성 세포사 저해용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 허혈성 세포사 저해를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 세포사 저해 방법을 제공한다.
상기 허혈성 세포사는 뇌졸증， 심근경색， 협심증， 하지허혈, 고혈압， 부정맥 등과 같이 심혈관질환으로 인한 혈관을 통한 혈액 공급의 중단 또는 부족， 또는 면역학적인 원인에 기인하는 심근 또는 근육세포의 세포사 (cel l death)를 의미하는 것일 수 있으며， 본 발명에서 제공되는 Ang— 1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포에 의하여， 이와 같은 허혈성 세포사의 유도를 효과적으로 저해할 수 있으며， 이를 통하여 허혈성 심혈관 질환의 예방 및 /또는 치료가 가능하다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 심혈관질환은 심혈관 이상으로 생기는 병으로, 모든 허혈성 심혈관 질환 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대, 뇌졸중， 심근경색， 협심증， 하지허혈， 고혈압， 부정맥 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 줄기세포의 게놈에 Ang-1 유전자， VEGF 유전자， 또는 이들 모두를 도입시키는 단계를 포함하는， Ang-1 , VEGF, 또는 이들 모두를 분비하는 줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 줄기세포의 게놈에 Ang- 1 유전자 및 /또는 VEGF 유전자를 도입시키는 단계는 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이¾ 암호화하는 핵산 분자)에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 RNA Guided Endonuc lease (RGEN)일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA는,
(1) 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA가 복합체를 형성하는 리보핵산단백질 (Ri bonuc leoprotein) 형태， 또는
(2) (a) 엔도뉴클레아제 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터와 (b) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터의 흔합물 형태
로 사용 (예컨대， 투여)될 수 있다.
다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.
다른 예는 상기 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포 제작에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)의 복합체， 예컨대， CRISPR/Cas9 RNP를 제공한다.
본 명세서에서， ' Ang— 1 분비 줄기세포'는 Ang-1 유전자가 도입되어 Ang— 1를 분비하는 즐기세포를 의미하고， ' VEGF 분비 줄기세포'는 VEGF 유전자가 도입되어 VEGF를 분비하는 줄기세포를 의미하고， ' Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포'는 상기 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포의 흔합물 또는 Ang-1 유전자 및 VEGF 유전자가 도입되어 Ang-1 및 VEGF를 동시에 분비하는 줄기세포를 의미할 수 있다. 본 명세서에서， 상기 ' Ang-1 분비 줄기세포，' ' VEGF 분비 즐기세포1 및 ' Ang— 1 、및 VEGF 분비 줄기세포'를 총칭하여 ' Ang-1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포'로 칭할 수 있다. 본 명세서에 Ang— 1 및 VEGF 툰비 줄기세포는 혈관 생성 촉진
(혈관생성률 증가 및 /또는 혈관생성 인자 생산 증가 등) 및 /또는 허혈성 세포사 저해 효과를 가지며, 심혈관 질환 질환의 예방， 증상 완화 또는 개선， 치료 등의 효과를 갖는다. 상기 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포에 의하여 치료 가능한 심혈관 질환은 모든 허혈성 심혈관 질환일 수 있으며， 예컨대， 심근경색， 협심증 하지허혈， 뇌졸증 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 허혈성 세포사 증상또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간, 원승이 둥의 영장류, 랫트， 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유동물 또는 상기 포유동물로부터 분리된 세포 (심근 또는 심혈관 세포) 또는 조직 (심장조직) 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대， 허혈성 세포사 증상 또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간 또는 이로부터 분리된 심근 또는 심혈관 세포， 심장 조직， 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 유효성분인 Ang— 1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 다양한 투여 경로로 투여 대상에게 투여될 수 있으며， 투여 경로는 피하 (subcutaneous ly) , 피내 (intradermal iy)， 종양내 ( intratumoral ly) , 절내 (intranodal ly)， 골수내 ( intramedul lary)， 근육내 ( intra腿 scular ly)， 정맥내 (intravenous)， 림프액내 ^.]!^^，)]!^^)， 복막내 (intraperitoneal ly), 또는 병변 조직 내 등에서 적절하게 선택될 수 있다ᅳ 예컨대， 상기 유효성분인 Ang-1 및 /또는 VEGF 분비 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 개체의 병변 부위 (예컨대， 심장 (심근， 심혈관 등) 등)에 주사 (injection), 수혈 (transfusion)， 삽입 ( implant at ion) 또는 이식 (transplantation)과 같은， 임의의 편리한 방식으로 투여되거나， 혈관투여 (정맥투여 또는 동맥투여)， 등의 투여 경로로 투여될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은， 통상의 방법에 따라 제형화 된， 산제, 과립제， 정제， 캡술제， 현탁액， 에멀견， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형， 또는 현탁제， 유제， 동결건조 제제， 외용제， 좌제, 멸균 주사 용액， 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 줄기세포 또는 약학 조성물 사용량은 치료 대상의 나이， 성별， 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무앗보다도， 치료대상 개체의 상태， 치료 대상 암의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로， 사용되는 치료제의 속성， 및 상기 특정한 치료제에 대한 감수성 등에 의존적일 수 있으며， 이를 고려하여 적절히 처방될 수 있다. 예컨대， 상기 줄기세포의 1회 투여량 (소정의 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량)은 투여대상 개체의 체중 1 kg당 lxlO3 ~ lxlO9개， 예컨대， lxlO4 ~ lxlO9개， lxlO4 ~ 1x10s개， lxlO5 ~ lxlO7개 또는 lxlO5 ~ lxlO6개의 양으로 투여될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
앤지오포이에틴 -l(Angiopoietin-l; Ang-1)은 혈관생성에 중요한 역할을 하는 단백질로， 인간 Ang— 1 (유전자 (mRNA): GenBank Accession No. 丽 _001146.4) 등으로 이루어진 포유류 유래 Ang-1 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)는 혈관생성 (vasculogenesis and angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 단백질로， 인간 VEGF (유전자 (mRNA): GenBank Accession No. 匪 _001171623.1) 등으로 이루어진 포유류 유래 VEGF 증에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서， 줄기세포는 포유류, 예컨대， 인간 유래의 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며， 예컨대, 배아줄기세포， 성체 줄기세포， 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된
1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및 /또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다.
배아줄기세포 (embryonic stem eel Is)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서， 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.
전발생세포 (progenitor eel Is)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만， 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며， 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중배엽 유래의 전발생세포일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며， 특별한 언급이 없는 한 1줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.
성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대， 제대혈 (탯줄혈액) 또는 성인의 골수， 혈액, 신경 등에서 추출해낸 줄기세포로， 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell), 신경줄기세포 (neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 포유류， 예컨대 사람의 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병 /불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.
일 예에서， 상기 줄기세포는 포유류 유래 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC), 예컨대 사람의 중간엽줄기세포일 수 있다. 증간엽줄기세포는 중배엽기질세포 (mesenchymal stromal cell； MSC)이라고도 불리며， 골모세포 (osteoblasts), 연골모세포 (chondrocytes), 근세포 (myocytes), 자방세포 (adipocytes) 둥과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포 (腿 ltipotent stromal cell)를 의미한다. 중배엽줄기세포는 태반 (placenta), 제대혈 (umbilical cord blood) , 제대 (umbilical cord) , 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육 (adult muscle), 각막 기질 (corneal stroma), 젖니의 치아 속질 (dental pulp) 등과 같은 비골수 조직 (non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 중간엽줄기세포는 포유류 유래, 예컨대， 사람의 제대 중간엽줄기세포일 수 있다.
상기 유전자 도입은 Ang-1 및 /또는 VEGF 유전자가 줄기세포의 유전체 내에 삽입되는 것을 의미할 수 있으며， 예컨대， 줄기세포의 유전체 중의 AAVS1 등과 같은 세이프 하버 (safe harbor) 유전자 부위에 삽입되는 것을 의미할 수 있다. 세이프 하버 유전자는 이 부분의 DNA가 손상 (절단， 및 /또는 뉴클레오타이드의 결실， 치환, 또는 삽입 등)되어도 세포 손상을 유발하지 않는 안전한 유전자 부위를 의미하는 것으로， 예컨대, MVS1 (Adeno— associated virus integration site; 예컨대 인간 염색체 19(19cil3)에 위치하는 MVS1 등) 등일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Ang-1 및 /또는 VEGF 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입 (도입)은 동물 세포의 유전체 내로의 유전자 도입에 통상적으로 사용되는 모든 유전자 조작 기술을 통하여 수행될 수 있다. 일 예에서， 상기 유전자 조작 기술은 엔도뉴클레아제를 사용하는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 가이드 R A와 함께 사용되어 표적 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있으며， 앞서 설명한 바와 같은 safe harbor 유전자 부위를 표적으로 하는 것일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 줄기세포 게놈의 특정 유전자와 특정 위치를 절단하여， 여기에 외래 유전자 (Ang-1 및 VEGF 유전자)가 삽입되도록 하는 역할을 한다.
본 명세서에 사용된 바로서, 상기 엔도뉴클레아제는 유전자 가위 (programmable nuclease)라고도 불리며， 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단 (단일가닥 절단 또는 이중가닥 절단)할 수 있는 모든 형태의 엔도뉴클레아제를 통칭한다. 상기 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것 (non-natural ly occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대， 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 엔도뉴클레아제는 정제된 단백질 형태로 사용되거나， 이를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 백터의 형태로 사용될 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제 (meganuclease), 징크핑거 (Zinc finger; Fokl 단백질) 뉴클레아제， CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질)， CRISP -Cpfl (Cpfl 단백질) 및 TALE—뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpfl 단백질일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는
유전체 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)；
징크-핑거. 뉴클레아제 (zinc— finger nuclease)；
메가뉴클레아제 (meganuc lease)；
미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대， Cas 단백질 (예컨대， Cas9 등), Cpfl, 등);
아고 호몰로그 (Ago homo 1 og , DNA-guided endonuc lease)
등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는 원핵 세포， 및 /또는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포 (예컨대, 진핵 세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라， 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end- joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데， 이 과정에 소망하는 변이를 표적 위치에 도입할 수 있다.
ᅵ상기 메가뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나， 자연 -발생 메가뉴클레아제일 수 있고 이들은 15 - 40 개 염기쌍 절단 부위를 인식하는데， 이는 통상 4 개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리， GIY- YIG 패밀리， His-Cyst 박스 패밀리， 및 HNH 패밀리. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-Scel , I-Ceul , PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-Csml , I- Panl, I-SceII, I-Ppol, I-SceIII, I-Crel, I-Tevl , I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다.
자연 -발생 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터 유래하는 DNA 결합 도메인을 이용하여 식물, 효모， 초파리 (Drosophila), 포유동물 세포 및 마우스에서 위치-특이적 게놈 변형이 촉진되었으나， 이런 접근법은 메가뉴클레아제 표적 서열이 보존된 상동성 유전자의 변형 (Monet et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88-93)으로， 표적 서열이 도입되는 사전-조작된 게놈의 변형에는 한계가 있었다. 따라서， 의학적으로나 생명공학적으로 관련된 부위에서 신규한 결합 특이성을 나타내도록 메가뉴클레아제를 조작하려는 시도가 있었다. 또한， 메가뉴클레아제로부터 유래하는 자연—발생된 또는 조작된 DNA 결합 도메인이 이종성 뉴클레아제 (예， Fokl)로부터 유래하는 절단 도메인에 작동 가능하게 연결되었다.
상기 ZFN은 선택된 유전자, 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크 -핑거 단백질을 포함한다. 상기 ZFN은 징크 -핑거 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 인공적인 제한효소일 수 있다. 여기서， 징크 -핑거 DNA 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작된 것일 수 있다. 예를 들면， Beerli et al . (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141; Pabo et al . (2001) Ann. Rev. Biochem. 70： 313- 340； Isalan et al , (2001) Nature Biotechnol . 19： 656-660； Segal et al . (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al . (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416이 본 명세서 참고자료로서 포함될 수 있다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여， 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는， 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며， 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사증 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상와서열과 연합된다.
표적 서열의 선택， 융합 단백질 (및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성은 당업자에 공지되어 있으며， 참고자료로 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987의 전문에 상세하게 설명되며， 상기 공개특허의 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다. 또한， 아러한 참고문헌 및 당업계의 다른 문헌에 개시된 대로， 징크 핑거 도메인 및 /또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열， 예를 들면 5 개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다 . 6 개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국등록특허 6 , 479 , 626 ; 6 , 903 , 185； 7 , 153 , 949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 .핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또한， ZFN과 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 부분 (절단 도메인， 절단 하프—도메인)을 포함한다. 주지된 대로， 예를 들면 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인과 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제나 액소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
유사하게， 절단 하프 -도메인은， 상기 제시된 바와 같이 , 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우， 일반적으로 2 개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안으로， 2 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수도 있다. 2 개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한， 2 개의 융합 단백질의 표적 부위는， 2 개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단—하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써， 절단 하프 -도메인이， 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다. 따라서， 일 구현예에서, 3 - 8 개 뉴클레오티드 또는 14 - 18 개 뉴클레오티드에 의해 표적 부위의 이웃 가장자리가 분리된다. 그러나， 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2 개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예， 2 내지 50 개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상) . 일반적으로， 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며， DNA에 서열 -특이적으로 결합하여 (표적 부위에서)， 바로 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소 (예, Type I IS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며， 분리 가능한 결합과 절단, 가능한 도메인을 가진다. 예를 들면, Type I IS 효소 Fokl은 한 가닥 상의 인식 부위로부터 9 개 뉴클레오티드에서 그리고 나머지 한 가닥 상의 인식 부위로부터 13 개 뉴클레오티드에서 DNA의 이증가닥 절단을 촉매한다. 따라서， 한 구현예에서， 융합 단백질은 최소 1 개의 Type I IS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)과 하나 이상의 아연- 핑거 결합 도메인 (조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는)을 포함한다.
"TALEN"은 DNA의 타켓 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 가리킨다. TALEN은 TALE 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 가리킨다. 본 발명에서， "TAL 이펙터 뉴클레아제" 및 "TALEN"이라는 용어는 호환이 가능하다. TAL 이팩터는 크산토모나스 (Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 m 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하와 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 증심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다. 따라서， TALE은 게놈 엔지니어링의 도구를 위한 신규 플랫폼이 될 수 있을 것으로 여겨진다. 다만 게놈 -교정 활성을 갖는 기능 TALEN을 제작하기 위해서 다음과 같이 현재까지 알려지지 않았던 소수의 주요 매개변수가 정의되어야 한다. i ) TALE의 최소 DNA-결합 도메인， i i ) 하나의 타켓 영역을 구성하는 2 개의 절반 -자리 사이의 스페이서의 길이， 및 i i i ) Fokl 뉴클레아제 도메인을 dTALE에 연결하는 링커 또는 융합 접합 ( fusion junct ion) .
본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE 반복 모들을 통해 서열- 특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모들， 보다 구체적으로는 1 내지 30 개의 TALE-반복 모들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서， "TAL 이펙터 도메인 " 및 "TALE 도메인"이라는 용어는 호환가능하다. 상기 TALE 도메인은 TALE-반복 모들의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALEN과 관련하여 국제공개특허 WO/2012/093833호 또는 미국공개특허 2013- 0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
일 예에서， 상기 Ang-1 및 /또는 VEGF 암호화 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입 (도입)은 엔도뉴클레아제 (CRISPR에서 유래한 RGEN)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는,
( 1) RNA-가이드 뉴클레아제 (또는 이의 코딩 DNA, 또는 상기 코딩 DNA를 포함하는 재조합 백터)， 및
(2) 표적 유전자 (예컨대， MVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor ) 위치)의 표적 부위 (예컨대， MVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor ) 유전자 내의 연속하는 15 내지 30， 17 내지 23 , 또는 18 내지 22 개의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 부위)와 흔성화 가능한 (또는 상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA (또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 백터)
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델 ( insert ion and/or delet ion, Indel )을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서， 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질 (CRISPR (Clustered regular ly interspaced short pal indromi c repeats) associ ated protein 9) )， Cpf 1 단백질 (CRISPR from Prevotel la and Franci sel l a 1) 등과 같은 타입 Π 및 /또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우， 상기 엔도뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 ( in vi tro)에서 전사된 (transcr ibed) 것일 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 이증가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 상기 엔도뉴클레아제는， 생체 (세포) 외에서 또는 생체 (세포) 내 잔달 후， 가이드 RNA에 결합된 리보핵산-단백질 복합체를 형성 (RNA-Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 작용할 수 있다.
Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로， 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 ni ckase를 형성할 수 있는 단백질이다. Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Informat ion)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대， 상기 Cas 단백질은，
스트랩토코커스 sp. (Sirepiococ zs sp."), 예컨대， 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas 단백질， 예컨대， Cas9 단백질 (예컨대， SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1))；
캄필로박터 속， 예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas 단백질， 예컨대， Cas9 단백질;
스트렙토코커스 속， 예컨대， 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thernop i les) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas 단백질, 예컨대， Cas9 단백질;
네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;
파스테우렐라 (Pasteure!Ia 속， 예컨대， 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질;
프란시셀라 (Franc i sell a) 속, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Franc i sella novicida) 유래의 Cas 단백질， 예컨대 Cas9 단백질
둥으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 특정 위치의 절단이 Cas9 단백질에 의하여 유도되는 경우， 상기 유전자 절단은 각 유전자의 염기서열 증 유래 미생물에 따른 Cas9 단백질 고유의 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 30bp의 염기서열 부위에서의 PAM 서열 3bp 앞쪽의 뉴클레오타이드의 절단, 예컨대 , 단일가닥 또는 이중가닥 절단일 수 있다.
일 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우， 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고， 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'— NGG-3' 서열의 5' 말단 및 /또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 30bp 또는 17bp 내지 23bp, 예컨대， 20bp의 염기서열 부위일 수 있다.
다른 예에서， 상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우， 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC_3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고， R은 A또는 G이고， Y는 C 또는 T임)이고， 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위 )는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNRYAC- 3' 서열의 5' 말단 및 /또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대ᅵ, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.
다른 예에서， 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스
(Streptococcus thermophi les) 유래의 것인 경우， 상기 PAM 서열은 5'- NNAGAAW-31 (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고， W는 A 또는 T임 )이고， 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위 )는 타겟 유전자 내의 5'-NNAGMW-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대， 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.
다른 예에서， 상기 Cas9 단백질이 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 것인 경우， 상기 PAM 서열은 5'— NNNNGATT-3 ' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임 )이고, 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNGATT-3' 서열의 5' 말단 및 /또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대， 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.
다른 예에서， 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 것인 경우， 상기 PAM 서열은 5'-NNGRR(T)- 3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고， R은 A또는 G이고， (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNGRR(T)— 31 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대， 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.
Cpfl 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서， Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracr NA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한， 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.
예컨대, 상기 Cpfl 단백질은 캔디다투스 (Canc datus) 속， 라치노스피라 (Lachnospira) 속， 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속， 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스
(Acidominococcus 속， 포르파이로모나스 (Porphyromo s) 속， 프레보텔라 (Prevotella) 속， 프란시셀라 (PrauciseUa) 속， 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplaswa) , 또는 유박테리움 (Eubacteriuw) 속 유래의 것일 수 있고， 예컨대， Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17) , Lachnospiraceae bacterium (MC2017)， Butyrivibrio proteoclasi icus, Peregr inibact er i a bacterium (GW2011_GWA_33_10) , Aci awi ococcus sp. (BV3L6) , Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006) , Porphyromonas crevioricanis, Prevotel la disiens, Moraxella bovoculi (237) , Sniihella sp. (SC— K08D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020) , Francisel la novicida (U112) , Candidatus Methanoplasma terwituw, Candidatus Paceibacter, Eubacteriuw eligens등의 미생물 유래의 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 . 엔도뉴클레아제로 Cpfl 단백질이 사용되는 경우， 상기 PAM 서열은 δ'-ΤΤΝ-ΚΝ은 A, Τ, C 또는 G임 )이고， 상기 절단되는 염기서열 부위 (타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-Ί Ν-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것 (non- natural ly occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 in vitro에서 미리 전사된 niRNA 또는 미리 생산된 단백질 형태， 또는 표적 세포 또는 생체 내에서 발현하기 위하여 재조합 백터에 포함된 형태로 사용될 수 있다. ¾ 예에서， 상기 엔도뉴클레아제 (예컨대， Cas9, Cpfl, 둥)는 재조합 DNACRecombinant DNA; rDNA)에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대， 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 엔도뉴클레아제를 생산 in vivo 또는 hi v/tro)하는 경우， 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 코딩 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 상기 표적특이적 뉴클레아제는 변이된 형태의 변이 표적특이적 뉴클레아제일 수 있다. 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며， 예컨대， 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같은 표적특이적 뉴클레아제의 변이 (예컨대， 아미노산 치환 등)는 적어도 뉴클레아제의 촉매 활성 도메인 (예컨대， Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 표적특이적 뉴클레아제가 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질 (Swi ssProt Access i on number Q99ZW2(NP_269215. 1)； 서열번호 4)인 경우, 상기 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalyt i c aspartate res i due ; 예컨대， 서열번호 4의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등)， 서열번호 4의 762번째 위치의 글루탐산 (E762) , 840번째 위치의 히스티던 (H840) , 854번째 위치의 아스파라긴 (N854) , 863번째 위치의 아스파라긴 (N863) , 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때， 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (al anine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질과 상이한 p眉 서열을 인식하도록 변이된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135) , 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335) , 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상， 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어， 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G， 및 C 증에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것알수 있다.
일 예에서， 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 4) 증，
( 1) D10 , H840 , 또는 D10 + H840 ;
(2) D1135 , R1335 , T1337 , 또는 D1135 + 1335 + T1337 ; 또는
(3) ( 1)과 (2) 잔기 모두
에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서， 상기 '다른 아미노산'은， 알라닌， 이소류신， 류신， 메티오닌, 페닐알라닌， 프를린， 트립토판, 발린， 아스파라긴산， 시스테인， 글루타민， 글리신， 세린， 트레오닌， 티로신， 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘， 라이신， 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서， 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다 . 일 예에서， 상기 '다른 아미노산'은 알라닌 , 발린， 글루타민， 또는 아르기닌일 수 있다.
본 발명에서， 용어 "가이드 RNA (guide RNA) "는 표적 유전자 내의 표적 부위 내의 특이적인 염기 서열 (표적서열)에 흔성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며， 생체 외 ( in vi tro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas 단백질， Cpf l 등과 같은 뉴클레아제와 결합하여 이를 표적 유전자 (또는 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다.
상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 뉴클레아제의 종류 및 /또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
예컨대 , 상기 가이드 RNA는，
표적 서열과 흔성화 가능한 부위 (표적화 서열)을 포함하는 CRISPR
RNA (crRNA) ;
Cas 단백질， Cpf l 등과 같은 뉴클레아제와 상호작용하는 부위를 포함하는 fra/js-act ivat ing crRNA (tracrRNA) ; 및
상기 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위 (예컨대, 표적화 서열을 포함하는 crRNA 부위 및 뉴클레아제와 상호작용하는 tracrRNA의 부위)가 융합된 형태의 단일 가이드 RNA (singl e guide RNA ; sgRNA)
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며，
구체적으로 CRISPR RNA (crRNA) 및 ira/js-act ivat ing crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이증 RNA (dual RNA) , 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위를 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
상기 sgRNA는 표적 유전자 (표적 부위) 내의 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 가지는 부분 (이를 Spacer region , Target DNA recogni t ion sequence , base pai r ing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hai rpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로， 표적 유전자 내의 표적서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 포함하는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hai rpin 구조, 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5 '에서 3 ' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분 및 표적 DNA의 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.
예컨대， Cas9 단백질은 표적 유전자 교정을 위하여 두 개의 가이드 RNA , 즉， 표적 유전자의 표적 부위와 흔성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 Cas9 단백질와 상호작용하는 irans-act ivat ing crRNA (t racrRNA ; Cas9 단백질과 상호작용함)를 필요로 하몌， 이들 crRNA와 t racrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA : t racrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가이드 RNA ( s ingl e gui de RNA ; sgRNA) 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서， Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우， sgRNA는 적어도 상기 crRNA의 흔성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA 일부 또는 전부와 상기 Cas9의 tracrRNA의 Cas9 단백질와 상호작용하는 부위를 적어도 포함하는 t racrRNA 일부 또는 전부가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-l oop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때 뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당할 수 있음) .
상기 가이드 RNA , 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA는 표적 유전자 내 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 포함하며， crRNA 또는 sgRNA의 업스트림 부위， 구체적으로 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5 ' 말단에 하나 이상， 예컨대， 1-10개， 1-5개, 또는 1-3개의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine , G)일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 뉴클레아제가 Cpf l인 경우， 상기 가이드 NA는 crRNA을 포함하는 것일 수 있으며， 복합체를 형성할 Cpf l 단백질 종류 및 /또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 뉴클레아제 (Cas9 또는 Cpfl)의 종류 (즉， 유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며， 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다ᅳ
일 예에서， 표적특이적 뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우， crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:
5 ' -(Ncas9)厂 (GUUUUAGAGCUA)— (Xcas9)ra-3 ' (일반식 1)
상기 일반식 1에서， Ncas9는 표적화 서열， 즉 표적 유전자 (target gene)의 표적 부위 (target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (표적 부위의 표적 서열과 흔성화 가능)이며， 1은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 15 내지 3()ᅳ 17 내지 23, 또는 18 내지 22의 정수， 예컨대 20일 수 있고，
상기 표적화 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드 (GUUUUAGAGCUA) (서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,
Xcas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉， 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며， 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며， 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 예에서 , 상기 Xcas9는 UGCUGUUUUG (서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한， 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:
5 — (Ycas9)p一
(UAGCMGUUAAMUM(XX:UAGUCCGUUAUCMCUUGAAAMGU(¾CACCGAGUC(^UGC)-3 '
(일반식 2)
상기 일반식 2에서，
60개의 뉴클레오타이드
( UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC )
(서열번호 3)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고，
Ycas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 51 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로， p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며， 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
또한， sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분'과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서， crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
일 예에서， sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:
5 '— (Ncas9 )i-( GUUUUAGAGCUA )- (올리고뉴클레오타이드 링커) -
( UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC )-3'
(일반식 3)
상기 일반식 3에서， (^ 이는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.
상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며， 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉， crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌 (G)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분 (60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif 서열 S. pyoge/es Cas9의 경우， 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17개 내지 약 23개 또는 약 18개 내지 약 22개， 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열과 흔성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열 (5'— NGG-31 (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥) 또는 이의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50¾> 이상， 601이상， 70% 이상， 80% 이상， 90% 이상 95% 이상， 99% 이상， 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로， 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.
다른 예에서, 엔도뉴클레아제가 Cpfl 시스템인 경우， 가이드 RNA (crRNA)는 다음의 일반식 4로 표현될 수 있다: 5 ' -nl-n2-A-U-n3-U-C-U-A-C-U-n4-n5-n6-n7-G-U-A-G-A-U- ( Ncp f 1 ) q-3 ' (일반식 4) .
상기 일반식 4에서，
nl은 존재하지 않거나， U, A, 또는 G이고， n2는 A 또는 G이고， n3은 U, A, 또는 C이고, n4는 존재하지 않거나 G, C, 또는 A이고， n5는 A, U, C, G, 또는 존재하지 않고， n6은 U, G 또는 C이고， n7은 U또는 G이며，
Ncpfl는 유전자 표적 부위와 흔성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열로서 표적 유전자의 표적 서열에 따라서 결정되며, q는 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로, 15 내지 30의 정수일 수 있다. 상기 표적 유전자의 표적 서열 (crRNA와 흔성화 하는 서열)은 P雇 서열 (5 ' -ΤΤΝ-3 ' 또는 5 ' -ΤΤΤΝ-3 ' ; Ν은 임의의 뉴클레오타이드로서， A, Τ, G, 또는 C의 염기를 갖는 뉴클레오타이드임)의 3 ' 방향으로 인접하여 위치하는 (예컨대， 연속하는) 15 내지 30개의 표적 유전자의 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.
상기 일반식 4에서 5 ' 말단에서 카운팅하여 6번째부터 10번째까지의
5개의 뉴클레오타이드 (5 ' 말단 스템 부위)와 15번째 (η4가 존재하는 경우 16번째)부터 19번째 (η4가 존재하는 경우 20번째)까지의 5개 뉴클레오타이드 (31 말단 스템 부위)은 서로 역평행 (ant iparal lel )하게 상보적 뉴클레오타이드로 이루어져 이중 가닥 구조 (스템 구조)를 형성하고 상기 5 ' 말단 스템 부위와 3 ' 말단 스템 부위 사이의 3 내지 5개 뉴클레오타이드가 루프 구조를 형성할 수 있다.
상기 Cpfl 단백질의 crRNA (예컨대， 일반식 4로 표현됨)는 5 ' 말단에 1 내지 3개의 구아닌 (G)을 추가로 포함할 수 있다.
Cpfl 유래 미생물에 따라 사용 가능한 Cpf l 단백질의 crRNA 서열의 5 ' 말단 부위 서열 (타겟팅 서열 부위 제외한 부분)을 표 1에 예시적으로 기재하였다:
[표 1]
Figure imgf000023_0001
Lachnospi raceae bacter ium ND2006 (LbCpi 1) GAAUUUCUACU-AUUGUAGAU
Porphyromonas crev i or i can is (PcCpf 1 ) UAAUUUCUACU-AUUGUAGAU
Prevotel la disiens (PdCpf 1) UAAUUUCUACU-UCGGUAGAU
Moraxel la bovocul i 237 (MbCpf l) AMUUUCUACUGUUUGUAGAU
Leptospira inadai (LiCpf 1) GAAUUUCUACU-UUUGUAGAU .
Lachnospiraceae bacter ium MA2020 (Lb2Cpf 1) GAAUUUCUACU-AUUGUAGAU
Franci sel la novicida U112 (FnCpf 1) UAAUUUCUACU-GUUGUAGAU
Candidatus Methano lasma termi tum (CMtCpf 1) GAAUCUCUACUCUUUGUAGAU .
Eubacterium el igens (EeCpf 1) UAAUUUCUAGU— UUGUAGAU
(- : 뉴클레오타이드가 존재하지 않음을 의미)
본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 흔성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열 (표적 서열)과 50% 이상， 60% 이상， 70% 이상， 80% 이상， 90% 이상， 95% 이상， 99% 이상， 또는 10 의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하， 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용되며， 상기 서열 상동성은 통상적인 서열 비교 수단 (예컨대 BLAST)를 사용하여 확인될 수 있다) .
상기 방법에서, 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9 단백질)의 세포 내로의 형질도입은 상기 가이드 RNA와 RNA- 가이드 엔도뉴클레아제를 통상적인 방법 (예컨대， 전기천공 등)으로 직접 세포에 도입하거나， 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자 (또는 이와 80% 이상， 85% 이상， 90% 이상， 95% 이상， 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상 또는 99% 이상의 염기서열 상동성을 갖는 유전자)를 하나의 백터 또는 각각 별개의 백터 (예컨대， 플라스미드， 바이러스 백터 등)에 포함된 상태로 세포에 도입하거나， mRNA del i very를 통하여 수행할 수 있다.
일 예에서， 상기 백터는 바이러스 백터일 수 있다. 상기 바이러스 백터는 레트로바이러스， 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련 (adenoassoci ated) 바이러스 (AAV) ) , 코로나바이러스， 오르소믹소바이러스 (orthomyxovi rus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스)， 랩도바이러스 (rhabdovi rus) 예컨대， 광견병 및 소포성 구내염 바이러스) , 파라믹소바이러스 (paramyxovi rus) (예컨대， 흥역 및 센다이 (Sendai ) , 알파바이러스 (alphavi rus ) 및 피코르나바이러스 (pi cornavi rus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들， 및 헤르페스바이러스 (예컨대, 단순포진 (Herpes Simpl ex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인 (Epstein)-바 (Barr) 바이러스， 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들， 폭스바이러스 (poxvirus) (예컨대， 우두 (vaccinia), 계두 (fowlpox) 및 카나리아두창 (canarypox)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 Cas9 단백질 암호화 핵산 분자， 가이드 RNA 암호화 핵산 분자， 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 백터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포좀， 바이러스백터, 나노파티클 (nanopart icles) 뿐만 아니라 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들을 사용하여 세포 내로 전달될 수 았으며， 세포의 핵내 전달을 위하여， 상기 Cas9 단백질 및 /또는 가이드 RNA는 적절한 핵 위치호 신호 (nuclear localization signal)를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 타겟 부위의 "절단 (cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 covalent backbone의 파손 (breakage)을 의미한다. 절단은 포스포다이에스터 (phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나， 이에 제한되지 않으며， 이외의 다양한 여러 가지 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 단일-가닥의 절단 및 이중-가닥의 절단 모두 가능하며， 이중-가닥의 절단은 두 개의 구별되는 (distinct) 단일- 가닥의 절단의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 절단은 blunt ends 또는 staggered end를 생성할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 심근경색 또는 하지허혈 모델에서 혈관의 생성과 재생은 필수적이나 이를 촉진할 수 있는 방법의 개발이 시급하였디-. 따라서， 본 발명의 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포는， 심근경색， 하지허혈 등의 심혈관 질환에서 혈관의 재생을 도와의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
[도면의 간단한 설명】
도 1은 Ang— 1 분비 제대 중간엽줄기세포를 만들기 위한 백터 구성도 및 제작 후 이 세포들로부터 Ang-1의 분비를 western blotting 및 ELISA 로 확인한 결과이다.
도 2는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 만들기 위한 백터 구성도 및 제작 후 이 세포들로부터 VEGP^ 분비를 western blotting 및 ELISA 로 확인한 결과이다. 도 3a 및 3b은 Ang-1 또는 VEGF 분비세포 제작용 백터를 전달하기 위한 CRISPR/Cas9 RNP를 제작하여 Jurkat 세포에서 이입율의 증가 등을 확인한 도이다.
도 4는 하지허혈모델에 ANG-1 분비 제대 중간엽줄기세포 또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 처리한 경우의 하지손상 정도를 확인한 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 내지 5c는 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포의 투여시의 심근세포의 생존률 (prol i ferat i on assay) (5a) , 혈관 생성 정도 (5b) , 및 주요 인자들의 발현 수준 (5c)을 보여주는 결과이다.
도 6는 심근경색모델에 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 각 각 또는 함께 처리한 랫트의 심장의 섬유화 정도， Scar Area ( of LV ( left ventr i cular ) area) , Inf arcted wal l thi ckness (mm) , 및 LV expans ion index를 보여주는 결과이다.
도 7a는 심근경색모델과 심근경색모델에 Ang- 1-MSC와 VEGF—MSC를 함께 처리한 랫트의 심장의 박동량 산출을 CINE-f-MRI 기법으로 생체에서 관찰한 모습을 보여주는 사진이고， 7b는 경색 부위 크기를 나타낸 그래프이다.
도 8은 심근경색모델에 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 증간엽줄기세포를 각 각 또는 함께 처리한 랫트의 심장의 혈관 생성 정도를 관찰한 사형광진이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다. 실시예 1: CRISPR/Cas9 RNP을 이용한 Ang-1및 VEGF분비세포제작 1.1. Ang-1분비 세포제작
pZDonor vector (Sigma Aldr i ch)에 Ang-1 유전자 (GenBank Access i on No . 丽 _001146.4)를 삽입하여， Ang-1 발현을 위한 재조합 백터를 제작하였다 (도 1 참조) . 또한， MVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP 0주)를젠)을 준비하였다 (Cas9 : Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질; AAVS1 타겟으로 하는 sgRNA의 타겟팅 서열: gucaccaauccugucccuag; 전체 서열은 앞서 기재된 일반식 3 참조).
상기 준비된 MVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP와 Ang-1의 유전자를 포함한 pZDonor를 사람의 제대 중간엽줄기세포에 함께 trans feet ion 하였다. 상기 제대 중간엽줄기세포는 다음의 과정으로 준비하였다: 사람의 제대 (umbilical cord)를 collagenase로 처리한 후， 원심분리하여 용액을 제거하고， T25 플라스크에 넣어 5% C02가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 7일 후， 플라스크에 부착한 세포에 대해서는 염색체 검사를 진행하고, 부착하지 않은 세포 (non-adhering umbilical cord eel Is)에 대해서는 배양액을 20% fetal bovine serum (FBS)와 4 ng/mL basic fibroblast growth factor가 첨가된 modified minimum essential medium으로 교체해서 T25 플라스크에 옮겨 배양을 시작하며 5~7일 후 세포가 바닥에 잘 부착， 증식하고 있는지를 확인한 후， 세포가 안정적으로 증식하기 시작하면 배양액을 교체하고 이후 80% confluent 할 때까지 일주일에 두 번씩 배양액을 교체하여 배양하였다.
CRISPR/Cas9 RNP는 세포 유전자중 MVS site를 절단함으로써 원하는 유전자 (즉 Ang-1 유전자)를 절단 부위 사이에 삽입하게 되고， 이로써 Ang- 1 를 분비하는 제대 중간엽줄기세포 (Ang-1-MSC) 및 가 만들어졌다. 상기 제작된 Ang-1-MSC의 Ang-1 분비 여부를 웨스턴블라팅, ELISA, PCR, 및 형광면역염색 (Flag)으로 시험하였으며， 그 결과를 도 1에 나타내었다.
1.2. VEGF분비 세포제작
pZDonor vector (Sigma— Aldrich)에 VEGF 유전자 (GenBank Accession No. 匪 _001171623.1)를 삽입하여 VEGF 발현을 위한 재조합 백터를 제작하였다 제작하였다 (도 2). 또한， MVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP ((주 )를젠)을 준비하였다 (Cas9: Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질; AAVS1 타겟으로 하는 sgRNA와 타겟팅 서열: gucaccaauccugucccuag; 전체 서열은 앞서 기재된 일반식 3 참조). ―
상기 준비된 MVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP와 VEGF의 유전자를 포함한 pZDonor를 사람의 제대 중간엽줄기세포 (실시예 1.1 참조)에 함께 transfection 하였다.
CRISPR/Cas9 RNP는 세포 유전자중 AAVS site를 절단함으로써 원하는 유전자 (즉, VEGF 유전자)를 절단 부위 사이에 삽입하게 되고， 이로써 VEGF 를 분비하는 제대 중간엽줄기세포 (VEGF— MSC)가 만들어졌다. 상기 제작된 VEGF-MSC의 VEGF 분비 여부를 웨스턴블라팅, ELISA, PCR, 및 형광면역염색 (Flag)으로 시험하였으며， 그 결과를 도 2에 나타내었다.
싱ᅵ기 시험은 다음과 같이 진행하였다:
- RT-PCR분석
Trizol 용액을 이용하여 RNA를 추출한 후， olig-dT primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 42°C에서 1시간 동안 진행하고, 95°C에서 10분간 반응하여 효소활성을 정지시켰다. 확인하고자 하는 유전자의 primer를 제작한 후 PCR을 수행하였다 (프라이머: Fwd: 5'-cggaactctgccctctaacg-3'； Rev: 5 'ᅳ tgaggaagagttcttgcagctᅳ 3 ') .
- Western blot
분리된 단백질 용액의 단백질 농도를 BCA법으로 확인한 후 일정량의 단백질 용액을 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동한 후 PVDF membrane으로 transfer하였다. 1차 항체 (Sigma Aldrich)와 함께 4°C에서 12시간 반응시키고 반웅이 끝나면 1차 항체를 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 ECL(Amersham)로 단백질 발현 여부를 분석하였다.
— 면역세포화학-형광염색
고정된 세포를 4°C에서 12시간동안 1차 항체와 반응시킨 후 세척하고 상 -온:에-서 1시간동 ¾: fluoresce in一 conjugated goat ant i -rabbit IgG와 반웅시켰다. 이렇게 염색된 세포는 glass slide에 올려놓은 후 Zeiss con focal microscope로 관찰하였다 . 또한, 싱-기 준비된 CRISPR/Cas9 RNP (틀젠)의 유전지ᅳ 교정 (Indel: 삽입 및 /또는 결실) 효율을 Jurkat 세포 (ATCC)에서 시험하여， 그 결과를 도 3a 및. 3b에 나타내었다.
(도 3a 및 3b에서， .
none.: 아무것도 없이 transfect ion 진행;
sgRNA#l: 5 ' -GTCACCMTCCTGTCCCTAG(TGG)-3 ' (hAAVSl #1; 괄호 안은 PAM서열임)을 타겟으로 하는 가이드 RNA (sgRNA)만 처리하여 진행;
sgRNA#2: 5'-ACCCCACAGTGG^CCACTA(GGG)— 3' G 괄호 안은 PAM서열임)을 타겟으로 하는 sgRNA만 처리하여 진행; Sp . cas9 only: Cas9 단백질 (서열번호 4)만 처리하여'진행 ;
aRGENl： hAAVSl #1을 타겟으로 하는 sgRNA#l와 Cas9 단백질을 처리하여 진행;
aRGEN2 : hAAVSl #2를 타겟으로 하는 sgRNA#2와 Cas9 단백질을 처리하여 진행;
dRGENl： AVS1 #1을 타겟으로 하는 sgRNA#l와 Cas9 단백질을 코딩하는 플라스미드를 처리하여 진행;
dRGEN2 : hAAVSl #2을 타겟으로 하는 sgRNA#2와 Cas9 단백질을 코딩하는 플라스미드를 처라하여 진행) .
도 3a 및 3b에서 확인되는 바와 같이 RNP 형태기ᅳ 플라스미드 형태보다 세포 내 전달 효율 및 유전자 교정 효율이 우수함을 확인할 수 있다. 실시예 2: 심근세포보호 효과
2. 1. 인간심근세포 배양
인간 심근 세포 (ATCC; https : //丽 w. atcc . org/)를 5%(v/v) FBS, 5 (v/v) HS (horse serum) , 20/ /πι·β의 겐타마이신 및 2.5/ g/n^의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM (배양배지)에 현탁시키고, 10cm 배양접시에 lxlO6 cel l s/iii (10m£)로 플레이트한 다음， 5% C02/95% 대기 하의 배양기에서 37°C로 유지하였다: in vi tro 배양 2~3주 후, AGE- 알부만 (Sigma-Aldrich)으로 처리한 후 아폼토시스—관련 특성을 위해 사용하였다.
2.2. 세포생존율 (MTT assay) 측정
상기 실시예 2.1에서 준비된 인간 심근세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2xl03 세포로 접종하였다. 80% 융합 (conf luence)에 도달한 후， 일차 인간 심근세포에 AGE—알부민 (Sigma-Aldri ch) 50nM을 24시간 동안 처리하였다. 그 후 Ang-l-MSC (Ang-1 분비 제대 중간엽줄기세포) 또는 VEGF-MSC (VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포) (상기 실시예 1 참조)를 처리하고 24시간 후， 세포를 PBS로 세척한 다음， 세포생존율을 MTT[3-(4, 5- d i me t hy 11 h i azo 1 -2-y 1 ) -2 , 5-d i pheny 1 tetrazol ium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. 황색 ΜΊΤ 화합물은 살아있는 세포에 의해 디메틸술폭사이드 (Me2S0)에 용해되는 청색 formazen으로 변환된다. 0.5 mg/ml MTT를 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양하고 DMSO (Sigma- Aldrich)를 첨가하였다. 배양 배지에서의 청색 염색 강도 (흡광도)는 96-웰 플레이트 리더 (VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 540nm에서 측정하였고， 생존 세포의 비례량 (proportional amount)으로 나타내었다. 결과는 도 5a (proliferation assay 결과; 세포생존률) 및 5b (입체 광학현미경으로 관찰한 결과; 혈관생성를)에 나타내었다 (GFP: GFP-MSC, VEGF: VEGF-MSC, ANG1: ANG1-MSC, VEGF+ANG1： VEGF— MSC와 ANG1-MSC의 흔합물, 및 rhVEGF: recombinant human VEGF (RND system)).
도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이， 인간 심근세포에 AGE-알부민을 처리한 경우 세포생존율이 감소하여 세포사가 유도됨을 확인하였다. 반면， 일차 인간 심근세포에 ANG-1 및 /또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 을 처리한 경우 세포생존율 및 혈관생성율이 증가됨을 확인하였다. 또한， 재초합 단백질인 rhVEGF와 비교하여， VEGF-MSC의 혈관생성 효과가 현저히 우수함을 확인하였으며， 이는 VEGF-MSC에서의 지속적인 VEGF 분비에 기인하는 것을 의미하는 것이라고 할 수 있다.
이러한 결과는， ANG-1 또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 가 심근세포사에 대해 보호 효과 (심근세포사 저해 효과)를 가짐과， 이러한 효과는 ANG-1 또는 VEGF이 단^질 형태로 사용되는 경우보다 우수함을 보여준다.
2.3. 혈관생성 인자측정 (Western blotting)
상기 실시예 2.2에서 각 줄기세포 처리된 심근세포를 액체질소를 통해 분말화한 후， RIPA buffer(Abcam)로 lysis 진행한 후， 원심분리하여 supernatant를 취하여， 줄기세포 처리된 심근세포로부터 단백질 용액을 분리하였다. BCA Life technologies)를 사용하여 제조사 사용설명에 따라 상기 단백질 용액의 단백질 농도를 확인한 후, 일정량의 단백질 용액 (Total protein 양: 30ug)을 10% SDS—PAGE gel을 이용하여 전기영동한 후， PVDF membrane으로 transfer하였다. 1차 항체 (Sigma Aldrich)와 함께 4°C에서 12시간 반웅시키고， 반웅이 끝나면 1차 항체를 세척한 후， HRP가 결합된 2차 항체 (Vector laboratories)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반옹이 끝나면 ECL(Amersham)로 단백질 발현 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 도 5c에 나타난 바와 같이， ANG-1 및 /또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 처리시， 혈관의 생성에 필수적인 Akt 와 p-ERKl/2 의 증가가 가장 두드려 졌다. 실시예 3 : 심근경색모델 심근세포사에 대한 Ang-1— MSC 또는 VEGF-MSC 의 보호효과 (Jn vivo실험)
3. 1. 심근경색 동물모델 제작
무게가 250—300 g의 흰쥐 (Sprague Dawley)를 준비하여 Ketamine (50 mg/kg) , xylazine (4 mg/kg)의 흔합하여 마취하였다. 실험동물의 기관에 16 gauge의 catheter를 삽입하고 인공호흡기와 연결하고， 평평한 판에 눕혀서 테이프로 괄다리와 꼬리를 고정한 후에 복장뼈의 왼쪽에서 1~1.5 cm정도 피부를 세로로 절개하고 큰가슴근육 (pectoral i s major musc le)과 작은가슴근육 사이를 벌려 다섯 번째 갈비사이공간을 확인하고 조심스럽게 갈비사이근육을 가로로 1cm 정도 절개하였다. 다섯 번째， 여섯 번째 갈비뼈 사이에 retractor를 넣고 위아래로 벌린 후， 보통 흰쥐에서 가슴샘 (thymus)가 심장 윗부분을 덮아 시야를 가리므로 angle hook 등을 이용해서 머리 쪽으로 가슴샘을 당겼다. 왼심장동맥 ( left coronary artery)의 형태를 관찰하여 어느 범위의 혈관가지를 묶을지 결정한 후에 폐동맥원뿔 (pulmonary comis)과 왼심방귀 ( l eft atr i al appendage)의 뾰족한 부분이 교차하는 선의 2~3 匪 아래에 위치하는 LAD (Left Anter ior Descending artery)를 6-0 s i lk로 묶었다. 벌려진 다섯 번째， 여섯 번째 갈비뼈를 다시 모으고 절개했던 갈비사이근육을 MAX0N 4-0 f i lament로 묶어준 다음 흉강에 남아있는 '공기를 23 Gauge needl e 주사기로 빼주어 폐가 완전히 펴질 수 있도록 하였다. 피부를 MAX0N 4-0 f i lament를 이용하여 봉합하고， 기관삽관 하였던 류브를 빼내고 인두에 묻어있는 점액들을 제거하였다. 수술 후에 진통제 ( (Buprenorphine 0.025 mg/kg)를 12시간마다 피부 주사 하였다.
3.2. Ang-1-MSC또는 VEGF-MSC의'보호효과
상기 준비된 심근경색 동물모델에 하기의 실시예 3의 Ang-1 분비 제대 중간엽즐기세포 (Ang-1-MSC) 및 /또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포, (VEGF-MSC)를 주입한 후 (주입량: 각각 30ul , lxlO6개의 세포 포함) , 심근세포의 수를 크레실 바이올렛 (cresyl violet )으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
상기 관찰 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 도면 방향 기준으로 상부 사진은 심장 조직의 염색 사진을 보여주는 것이고， 왼쪽 그래프는 경색 부위를 정량화한 Scar Area (% of LV (left ventricular) area) 결과를 보여주는 결과로서， 그 수치가 낮을수록 심장의 섬유화 정도가 감소함을 보여주고， 가운데 그래프는 경색부의 두께 (Infarcted wall thickness; 匪)를 나타내는 결과로서， 그 수치가 높을수록 심근경색이 회복됨을 보여주고， 오른쪽 그래프는 심실의 확장 정도 (LV expansion index)를 보여주는 그래프로서， 그 수치가 낮을수록 심근경색이 회복됨을 보여준다. 도 6에 나타난 바와 같이, 심근경색 전 또는 후의 랫트의 심장세포에서， 상기 Ang-1 및 /또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 투여한 경우 섬유화 지역 (청색)과 심근경색 영역이 감소함을 확인하였다. 또한, 심근경색 치료효과가 MSC < ANG1-MSC < VEGF-MSC < ANG1-MSC+VEGF-MSC (A+V MSC) 순서로 증가함을 확인하였다.
또한， 상기 심근경색모델에 Ang— 1-MSC 및 VEGF-MSC를 함께 처리한 랫트의 심장의 박동량을 CINE-f-MRI 기법으로 생체에서 관찰한 모습을 보여주는 사진을 도 7a에 나타내고， 도 7b에 경색 부위 크기를 그래프로 나타내었다. 도 7a— 7b에 나타난 바와 같이， 심장의 박출량 (ejection fraction) 또한 일반 MSC에 비하여 현저히 증가 하였다. 실시예 4: 하지허혈모델 근육세포사에 대한 Ang-1-MSC 또는 VEGF- MSC의 보호효과 (/ij VIVO실험)
4.1. 하지허혈 동물모델 제작 (Rat lower limb ischemia model) 동물은 male Balb/c-nu 마우스를 사용하였다. 동물모델 제작시 모든 환경은 깨끗하고 멸균된 장소에서 시행하였으며， Ν20:02=1:1(ν:ν), 포란 마취제 흡입에 의하여 마취시켜 진행하였다.
마취 후 약 2츠 가량 피부를 절개 후， 3-0 surgical si lk로 정확한 부위에 결찰 (iliac arteries 흑은 superficial femoral arteries와 inguinal ligament에서 5-6 mm 아래)한 후 Skin clip을 이용 피부를 닫아주었다. 4.2. 하지근육세포사에 대한보호효과
하지허혈모델에서 하지근육세포사에 대한 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC 의 보호 효과를 확인하기 위하여， 상기 준비된 하지허혈모델의 조직에 Ang- 1-MSC 106 세포를 주입한 후， 1주일 및 2주일 경과 후 마우스의 뒷다리 모습을 관찰하여 도 4에 나타내었다.
도 4는 Ang-l-MSC, MSC (양성대조군)， 및 PBS (음성대조군)를 투여받은 하지허혈모델 마우스의 뒷다리 모습을 보여주는 사진이다 (Sham: 하지허혈이 유도되지 않은 정상 마우스). 도 4에 나타난 바와 같이， MSC 및 PBS 투여군과 비교하여， Ang— 1-MSC를 투여한 마우스의 하지근육세포사가 완화됨을 확인할 수 있다. 실시예 5. 면역조직화학 (immunohistochemistry, IHC)
정상 또는 심근경색 랫트 (실시예 3.1)의 심장조직에서 면역조직화학을 수행하였다. 정상 또는 심근경색 랫트의 심장조직을 0.1M 중성 인산염완층용액 내 4% 파라포름알데히드로 고정시키고， 30% 수크로오스 용액에서 밤새도록 냉동보관한 다음， 저온유지장치 (cryostat, Leica CM 1900)로 10 m 절편을 준비하였다. 파라핀 -포매 조직을 10 두께의 절편으로 절단하고， 자일렌에서 탈파라핀시킨 후， 일련의 등급 에탄올로 재수화하였다. 정상 염소 혈청 (1OT)을 사용하여 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 조직 절편을 하기 항체들 중 하나와 함께 4°C에서 밤새도록 배양하였다: 토끼 항 -alpha— SMA 항체 (Abeam), 마우스 항 -인간 알부민 항체 (1:200， R&D System), 염소 항 -Ibal 항체 (1:500， Abeam) . 상기 배양된 조직 절편을 PBS로 3번 세척하고， Alexa flour 633 ant i -mouse IgG( 1：500, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하몄다. 이차 항체를 PBS로 3번 세척한 후, 커버슬립을 Vectashield mounting medium( Vector Laboratories)를 사용하여 글라스 슬라이드 위에 설치하고， 레이저 공초점 형광현미경 (LSM-710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
상기 관찰 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이 랫트의 심장조직에 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC를 각각 또는 함께 처리한 경우 혈관생성을 나타내는 alpha-SMA인자의 염색이 가장 강하게 나타났다.

Claims

【청구범위】
【청구항 1】
VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 증간엽줄기세포 및 Ang— 1 유전자가 삽입되어 Ang-1 를 분비하는 Ang-1 증간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포， 또는 상기 중간엽줄기세포의 배양물을 포함하는， 혈관생성용 약학 조성물.
【청구항 2】
VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 중간엽줄기세포 및 Ang-1 유전자가 삽입되어 Ang— 1 를 분비하는 Ang-1 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포， 또는 상기 중간엽줄기세포의 배양물을 포함하는， 허혈성 세포사 저해용 약학 조성물.
【청구항 3】
VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 중간엽줄기세포 및 Ang-1 유전자가 삽입되어 Ang-1 를 분비하는 Ang-1 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포， 또는 상기 증간엽줄기세포의 배양물을 포함하는， 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 4】
제 3항에 있어서, 상기 심혈괄 질환은 뇌졸중， 심근경색, 협심증， 하지허혈， 고혈압， 또는 부정맥인, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 5】
거 U항 내지 계 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증간엽줄기세포는 제대 유래 중간엽줄기세포인， 약학 조성물.
【청구항 6】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 VEGF 유전자 및 Ang-1 유전자는 중간엽줄기세포의 유전체 중의 세이프하버 부위에 삽입된 것인, 약학 조성물.
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