KR20200010379A

KR20200010379A - 안지오포이에틴-1 또는 vegf를 분비하는 줄기세포 및 이를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20200010379A
Application number: KR1020197037467A
Authority: KR
Inventors: 이봉희; 바이예르사이칸대기; 이재석
Original assignee: 주식회사 툴젠; 주식회사 엔세이지
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2020-01-30
Also published as: JP6959369B2; WO2018236131A1; US20200368284A1; JP2020524165A

Abstract

혈관 생성을 촉진하는 Angiopoietin-1(Ang-1) 또는 VEGF 분비 줄기세포, 이의 제조 방법 및 심혈관 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

안지오포이에틴-1 또는 VEGF를 분비하는 줄기세포 및 이를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

세포 치료제는 활발히 연구되고 있는 분야이다. 대표적인 세포 치료제 중 하나가 심근줄기세포이다. 심근줄기세포로 분화되는 줄기세포로 mesenchmal stem cell, 조혈모세포, 내피전구세포, 근육모세포, adipocyte-derived stem cell 등이 부각되고 있다. 이와 같이 분화된 심근줄기세포는 심혈관 질환 치료를 위한 세포 치료제로사 유용성이 증가되고 있고, 그 개발 기술에 대한 연구가 활발히 진행중이다.

그러나, 현재의 단순 분리 배양법에 의하여 생산된 줄기세포들은 그 치료 효능이 낮아, 치료 기능이 보다 강화된 고효율의 차세대줄기세포 개발이 필요하다.

일 예는 Ang-1를 분비하는 Ang-1 분비 줄기세포를 제공한다.

다른 예는 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포를 포함하는 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.

상기 줄기세포는 인간 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 Ang-1 및/또는 VEGF 분비 줄기세포는 Ang-1 유전자 및/또는 VEGF 유전자가 줄기세포 유전체 내에 삽입된, 예컨대, 줄기세포의 유전체 중의 AAVS1 등과 같은 세이프 하버(safe harbor) 부위에 삽입된 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있고, 예컨대, 제대 등에서 유래하는 중간엽줄기세포일 수 있다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물을 포함하는, 혈관생성용 또는 혈관생성 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 혈관 생성 촉진을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관생성 방법 또는 혈관생성 촉진 방법을 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물을 포함하는, 허혈성 세포사 저해용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 허혈성 세포사 저해를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 세포사 저해 방법을 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 이들의 배양물의 약학적 유효량을 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 심혈관질환은 심혈관 이상으로 생기는 병으로, 모든 허혈성 심혈관 질환 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 고혈압, 부정맥 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 줄기세포의 게놈에 Ang-1 유전자, VEGF 유전자, 또는 이들 모두를 도입시키는 단계를 포함하는, Ang-1, VEGF, 또는 이들 모두를 분비하는 줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 줄기세포의 게놈에 Ang-1 유전자 및/또는 VEGF 유전자를 도입시키는 단계는 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산분자)에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 RNA Guided Endonuclease (RGEN)일 수 있다.

상기 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA는,

(1) 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA가 복합체를 형성하는 리보핵산단백질 (Ribonucleoprotein) 형태, 또는

(2) (a) 엔도뉴클레아제 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터와 (b) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터의 혼합물 형태

로 사용 (예컨대, 투여)될 수 있다.

다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.

다른 예는 상기 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포 제작에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)의 복합체, 예컨대, CRISPR/Cas9 RNP를 제공한다.

본 발명자들은 허혈성 질환에서 혈관 재생의 돕는 방법을 규명하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 심근경색 또는 하지허혈모델의 혈관의 생성에 Angiopoietin-1 (Ang-1) 과 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)를 분비하는 줄기세포를 제작하고, 이를 이용하여 허혈성 심혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

일 예는 Ang-1를 분비하는 Ang-1 분비 줄기세포를 제공한다.

다른 예는 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 줄기세포를 제공한다.

상기 허혈성 세포사는 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 고혈압, 부정맥 등과 같이 심혈관질환으로 인한 혈관을 통한 혈액 공급의 중단 또는 부족, 또는 면역학적인 원인에 기인하는 심근 또는 근육세포의 세포사(cell death)를 의미하는 것일 수 있으며, 본 발명에서 제공되는 Ang-1 및/또는 VEGF 분비 줄기세포에 의하여, 이와 같은 허혈성 세포사의 유도를 효과적으로 저해할 수 있으며, 이를 통하여 허혈성 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료가 가능하다.

상기 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA는,

로 사용 (예컨대, 투여)될 수 있다.

본 명세서에서, 'Ang-1 분비 줄기세포'는 Ang-1 유전자가 도입되어 Ang-1를 분비하는 줄기세포를 의미하고, 'VEGF 분비 줄기세포'는 VEGF 유전자가 도입되어 VEGF를 분비하는 줄기세포를 의미하고, 'Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포'는 상기 Ang-1 분비 줄기세포 및 VEGF 분비 줄기세포의 혼합물 또는 Ang-1 유전자 및 VEGF 유전자가 도입되어 Ang-1 및 VEGF를 동시에 분비하는 줄기세포를 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 'Ang-1 분비 줄기세포,' 'VEGF 분비 줄기세포' 및 'Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포'를 총칭하여 'Ang-1 및/또는 VEGF 분비 줄기세포'로 칭할 수 있다.

본 명세서에 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포는 혈관 생성 촉진(혈관생성률 증가 및/또는 혈관생성 인자 생산 증가 등) 및/또는 허혈성 세포사 저해 효과를 가지며, 심혈관 질환 질환의 예방, 증상 완화 또는 개선, 치료 등의 효과를 갖는다. 상기 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포에 의하여 치료 가능한 심혈관 질환은 모든 허혈성 심혈관 질환일 수 있으며, 예컨대, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 뇌졸중 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 개체는 허혈성 세포사 증상 또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간, 원숭이 등의 영장류, 랫트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유동물 또는 상기 포유동물로부터 분리된 세포 (심근 또는 심혈관 세포) 또는 조직 (심장조직) 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 허혈성 세포사 증상 또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간 또는 이로부터 분리된 심근 또는 심혈관 세포, 심장 조직, 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 유효성분인 Ang-1 및/또는 VEGF 분비 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 다양한 투여 경로로 투여 대상에게 투여될 수 있으며, 투여 경로는 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막내(intraperitoneally), 또는 병변 조직 내 등에서 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분인 Ang-1 및/또는 VEGF 분비 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 개체의 병변 부위(예컨대, 심장 (심근, 심혈관 등) 등)에 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 투여되거나, 혈관투여 (정맥투여 또는 동맥투여), 등의 투여 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 줄기세포 또는 약학 조성물 사용량은 치료 대상의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 암의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성, 및 상기 특정한 치료제에 대한 감수성 등에 의존적일 수 있으며, 이를 고려하여 적절히 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 줄기세포의 1회 투여량(소정의 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량)은 투여대상 개체의 체중 1 kg당 1x10³ ~ 1x10⁹개, 예컨대, 1x10⁴ ~ 1x10⁹개, 1x10⁴ ~ 1x10⁸개, 1x10⁵ ~ 1x10⁷개 또는 1x10⁵ ~ 1x10⁶개의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

앤지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang-1)은 혈관생성에 중요한 역할을 하는 단백질로, 인간 Ang-1 (유전자(mRNA): GenBank Accession No. NM_001146.4) 등으로 이루어진 포유류 유래 Ang-1 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)는 혈관생성 (vasculogenesis and angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 단백질로, 인간 VEGF (유전자 (mRNA): GenBank Accession No. NM_001171623.1) 등으로 이루어진 포유류 유래 VEGF 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 있어서, 줄기세포는 포유류, 예컨대, 인간 유래의 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및/또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다.

배아줄기세포 (embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.

전발생세포 (progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중배엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.

성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대, 제대혈(탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 포유류, 예컨대 사람의 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.

일 예에서, 상기 줄기세포는 포유류 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC), 예컨대 사람의 중간엽줄기세포일 수 있다. 중간엽줄기세포는 중배엽기질세포(mesenchymal stromal cell; MSC)이라고도 불리며, 골모세포 (osteoblasts), 연골모세포 (chondrocytes), 근세포 (myocytes), 지방세포 (adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중배엽줄기세포는 태반 (placenta), 제대혈 (umbilical cord blood), 제대 (umbilical cord), 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육 (adult muscle), 각막 기질 (corneal stroma), 젖니의 치아 속질 (dental pulp) 등과 같은 비골수 조직 (non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 중간엽줄기세포는 포유류 유래, 예컨대, 사람의 제대 중간엽줄기세포일 수 있다.

상기 유전자 도입은 Ang-1 및/또는 VEGF 유전자가 줄기세포의 유전체 내에 삽입되는 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 줄기세포의 유전체 중의 AAVS1 등과 같은 세이프 하버(safe harbor) 유전자 부위에 삽입되는 것을 의미할 수 있다. 세이프 하버 유전자는 이 부분의 DNA가 손상 (절단, 및/또는 뉴클레오타이드의 결실, 치환, 또는 삽입 등)되어도 세포 손상을 유발하지 않는 안전한 유전자 부위를 의미하는 것으로, 예컨대, AAVS1(Adeno-associated virus integration site; 예컨대 인간 염색체 19(19q13)에 위치하는 AAVS1 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Ang-1 및/또는 VEGF 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입(도입)은 동물 세포의 유전체 내로의 유전자 도입에 통상적으로 사용되는 모든 유전자 조작 기술을 통하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 유전자 조작 기술은 엔도뉴클레아제를 사용하는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있으며, 앞서 설명한 바와 같은 safe harbor 유전자 부위를 표적으로 하는 것일 수 있다.

상기 엔도뉴클레아제는 줄기세포 게놈의 특정 유전자의 특정 위치를 절단하여, 여기에 외래 유전자 (Ang-1 및 VEGF 유전자)가 삽입되도록 하는 역할을 한다.

본 명세서에 사용된 바로서, 상기 엔도뉴클레아제는 유전자 가위(programmable nuclease)라고도 불리며, 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단 (단일가닥 절단 또는 이중가닥 절단)할 수 있는 모든 형태의 엔도뉴클레아제를 통칭한다. 상기 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 엔도뉴클레아제는 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.

상기 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거(Zinc finger; FokI 단백질) 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1 (Cpf1 단백질) 및 TALE-뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는

유전체 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease);

징크-핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease);

메가뉴클레아제 (meganuclease);

미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대, Cas 단백질 (예컨대, Cas9 등), Cpf1, 등);

아고 호몰로그 (Ago homolog, DNA-guided endonuclease)

등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는 원핵 세포, 및/또는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포 (예컨대, 진핵 세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라, 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데, 이 과정에 소망하는 변이를 표적 위치에 도입할 수 있다.

상기 메가뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 자연-발생 메가뉴클레아제일 수 있고 이들은 15 - 40 개 염기쌍 절단 부위를 인식하는데, 이는 통상 4 개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리, 및 HNH 패밀리. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, 1-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다.

자연-발생 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터 유래하는 DNA 결합 도메인을 이용하여 식물, 효모, 초파리 (Drosophila), 포유동물 세포 및 마우스에서 위치-특이적 게놈 변형이 촉진되었으나, 이런 접근법은 메가뉴클레아제 표적 서열이 보존된 상동성 유전자의 변형 (Monet et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88-93)으로, 표적 서열이 도입되는 사전-조작된 게놈의 변형에는 한계가 있었다. 따라서, 의학적으로나 생명공학적으로 관련된 부위에서 신규한 결합 특이성을 나타내도록 메가뉴클레아제를 조작하려는 시도가 있었다. 또한, 메가뉴클레아제로부터 유래하는 자연-발생된 또는 조작된 DNA 결합 도메인이 이종성 뉴클레아제 (예, FokI)로부터 유래하는 절단 도메인에 작동 가능하게 연결되었다.

상기 ZFN은 선택된 유전자, 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 상기 ZFN은 징크-핑거 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 인공적인 제한효소일 수 있다. 여기서, 징크-핑거 DNA 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작된 것일 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416이 본 명세서 참고자료로서 포함될 수 있다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.

표적 서열의 선택, 융합 단백질 (및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성은 당업자에 공지되어 있으며, 참고자료로 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987의 전문에 상세하게 설명되며, 상기 공개특허의 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다. 또한, 이러한 참고문헌 및 당업계의 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5 개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 6 개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국등록특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

또한, ZFN과 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 부분 (절단 도메인, 절단 하프-도메인)을 포함한다. 주지된 대로, 예를 들면 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인과 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제나 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

유사하게, 절단 하프-도메인은, 상기 제시된 바와 같이, 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우, 일반적으로 2 개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안으로, 2 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수도 있다. 2 개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한, 2 개의 융합 단백질의 표적 부위는, 2 개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단-하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써, 절단 하프-도메인이, 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 일 구현예에서, 3 - 8 개 뉴클레오티드 또는 14 - 18 개 뉴클레오티드에 의해 표적 부위의 이웃 가장자리가 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2 개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예, 2 내지 50 개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며, DNA에 서열-특이적으로 결합하여(표적 부위에서), 바로 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소 (예, Type IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리 가능한 결합과 절단 가능한 도메인을 가진다. 예를 들면, Type IIS 효소 FokI은 한 가닥 상의 인식 부위로부터 9 개 뉴클레오티드에서 그리고 나머지 한 가닥 상의 인식 부위로부터 13 개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 따라서, 한 구현예에서, 융합 단백질은 최소 1 개의 Type IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)과 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인 (조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는)을 포함한다.

"TALEN"은 DNA의 타켓 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 가리킨다. TALEN은 TALE 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 가리킨다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 뉴클레아제" 및 "TALEN"이라는 용어는 호환이 가능하다. TAL 이펙터는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 Ⅲ 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다. 따라서, TALE은 게놈 엔지니어링의 도구를 위한 신규 플랫폼이 될 수 있을 것으로 여겨진다. 다만 게놈-교정 활성을 갖는 기능 TALEN을 제작하기 위해서 다음과 같이 현재까지 알려지지 않았던 소수의 주요 매개변수가 정의되어야 한다. i) TALE의 최소 DNA-결합 도메인, ii) 하나의 타켓 영역을 구성하는 2 개의 절반-자리 사이의 스페이서의 길이, 및 iii) FokI 뉴클레아제 도메인을 dTALE에 연결하는 링커 또는 융합 접합 (fusion junction).

본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 보다 구체적으로는 1 내지 30 개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 도메인" 및 "TALE 도메인"이라는 용어는 호환가능하다. 상기 TALE 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALEN과 관련하여 국제공개특허 WO/2012/093833호 또는 미국공개특허 2013-0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.

일 예에서, 상기 Ang-1 및/또는 VEGF 암호화 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입 (도입)은 엔도뉴클레아제(CRISPR에서 유래한 RGEN)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는,

(1) RNA-가이드 뉴클레아제 (또는 이의 코딩 DNA, 또는 상기 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및

(2) 표적 유전자 (예컨대, AAVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor) 위치)의 표적 부위 (예컨대, AAVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor) 유전자 내의 연속하는 15 내지 30, 17 내지 23, 또는 18 내지 22 개의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 부위)와 혼성화 가능한 (또는 상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA (또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터)

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 엔도뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델 (insertion and/or deletion, Indel)을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질(CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) associated protein 9)), Cpf1 단백질 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 등과 같은 타입 Ⅱ 및/또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우, 상기 엔도뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro)에서 전사된(transcribed) 것일 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 엔도뉴클레아제는, 생체(세포) 외에서 또는 생체(세포) 내 전달 후, 가이드 RNA에 결합된 리보핵산-단백질 복합체를 형성(RNA-Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 작용할 수 있다.

Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있는 단백질이다.

Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas 단백질은,

스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질 (예컨대, SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1));

캄필로박터 속, 예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

스트렙토코커스 속, 예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 예컨대, 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질;

프란시셀라 (Francisella) 속, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질

등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 특정 위치의 절단이 Cas9 단백질에 의하여 유도되는 경우, 상기 유전자 절단은 각 유전자의 염기서열 중 유래 미생물에 따른 Cas9 단백질 고유의 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 30bp의 염기서열 부위에서의 PAM 서열 3bp 앞쪽의 뉴클레오타이드의 절단, 예컨대, 단일가닥 또는 이중가닥 절단일 수 있다.

일 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3'(N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 30bp 또는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 20bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C 또는 T임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNRYAC-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNAGAAW-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNGATT-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNGRR(T)-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

Cpf1 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracrRNA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한, 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.

예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisela) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Candidates Paceibacter, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .

엔도뉴클레아제로 Cpf1 단백질이 사용되는 경우, 상기 PAM 서열은 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-TTN-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

상기 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 in vitro에서 미리 전사된 mRNA 또는 미리 생산된 단백질 형태, 또는 표적 세포 또는 생체 내에서 발현하기 위하여 재조합 벡터에 포함된 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)는 재조합 DNA(Recombinant DNA; rDNA)에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 엔도뉴클레아제를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 코딩 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 상기 표적특이적 뉴클레아제는 변이된 형태의 변이 표적특이적 뉴클레아제일 수 있다. 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같은 표적특이적 뉴클레아제의 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 적어도 뉴클레아제의 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적특이적 뉴클레아제가 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질 (SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1); 서열번호 4)인 경우, 상기 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 예컨대, 서열번호 4의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 서열번호 4의 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

다른 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질과 상이한 PAM 서열을 인식하도록 변이된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 4) 중,

(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;

(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는

(3) (1)과 (2) 잔기 모두

에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자 내의 표적 부위 내의 특이적인 염기 서열 (표적서열)에 혼성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며, 생체 외 (in vitro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 결합하여 이를 표적 유전자 (또는 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다.

상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 뉴클레아제의 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.

예컨대, 상기 가이드 RNA는,

표적 서열과 혼성화 가능한 부위 (표적화 서열)을 포함하는 CRISPR RNA (crRNA);

Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 상호작용하는 부위를 포함하는 trans-activating crRNA (tracrRNA); 및

상기 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위 (예컨대, 표적화 서열을 포함하는 crRNA 부위 및 뉴클레아제와 상호작용하는 tracrRNA의 부위)가 융합된 형태의 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며,

구체적으로 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA (dual RNA), 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위를 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.

상기 sgRNA는 표적 유전자 (표적 부위) 내의 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 내의 표적서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조, 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5'에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분 및 표적 DNA의 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.

예컨대, Cas9 단백질은 표적 유전자 교정을 위하여 두 개의 가이드 RNA, 즉, 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 Cas9 단백질와 상호작용하는 trans-activating crRNA (tracrRNA; Cas9 단백질과 상호작용함)를 필요로 하며, 이들 crRNA와 tracrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA) 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, sgRNA는 적어도 상기 crRNA의 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA 일부 또는 전부와 상기 Cas9의 tracrRNA의 Cas9 단백질와 상호작용하는 부위를 적어도 포함하는 tracrRNA 일부 또는 전부가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때 뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당할 수 있음).

상기 가이드 RNA, 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA는 표적 유전자 내 표적 서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하며, crRNA 또는 sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5' 말단에 하나 이상, 예컨대, 1-10개, 1-5개, 또는 1-3개의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 상기 뉴클레아제가 Cpf1인 경우, 상기 가이드 RNA는 crRNA을 포함하는 것일 수 있으며, 복합체를 형성할 Cpf1 단백질 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.

상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 뉴클레아제 (Cas9 또는 Cpf1)의 종류 (즉, 유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.

일 예에서, 표적특이적 뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:

상기 일반식 1에서,

N_cas9는 표적화 서열, 즉 표적 유전자(target gene)의 표적 부위(target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (표적 부위의 표적 서열과 혼성화 가능)이며, l은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 15 내지 30, 17 내지 23, 또는 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고,

상기 표적화 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA) (서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,

X_cas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 예에서, 상기 X_cas9는 UGCUGUUUUG (서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:

상기 일반식 2에서,

60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC) (서열번호 3)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,

Y_cas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

또한, sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서, crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.

일 예에서, sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:

상기 일반식 3에서, (N_cas9)_l는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.

상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif 서열(S. pyogenes Cas9의 경우, 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17개 내지 약 23개 또는 약 18개 내지 약22개, 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.

상기 가이드 RNA의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열(5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥) 또는 이의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.

다른 예에서, 엔도뉴클레아제가 Cpf1 시스템인 경우, 가이드 RNA(crRNA)는 다음의 일반식 4로 표현될 수 있다:

상기 일반식 4에서,

n1은 존재하지 않거나, U, A, 또는 G이고, n2는 A 또는 G이고, n3은 U, A, 또는 C이고, n4는 존재하지 않거나 G, C, 또는 A이고, n5는 A, U, C, G, 또는 존재하지 않고, n6은 U, G 또는 C이고, n7은 U 또는 G이며,

Ncpf1는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열로서 표적 유전자의 표적 서열에 따라서 결정되며, q는 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로, 15 내지 30의 정수일 수 있다. 상기 표적 유전자의 표적 서열 (crRNA와 혼성화 하는 서열)은 PAM 서열 (5'-TTN-3' 또는 5'-TTTN-3'; N은 임의의 뉴클레오타이드로서, A, T, G, 또는 C의 염기를 갖는 뉴클레오타이드임)의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 (예컨대, 연속하는) 15 내지 30개의 표적 유전자의 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.

상기 일반식 4에서 5' 말단에서 카운팅하여 6번째부터 10번째까지의 5개의 뉴클레오타이드 (5' 말단 스템 부위)와 15번째 (n4가 존재하는 경우 16번째)부터 19번째 (n4가 존재하는 경우 20번째)까지의 5개 뉴클레오타이드(3' 말단 스템 부위)은 서로 역평행 (antiparallel)하게 상보적 뉴클레오타이드로 이루어져 이중 가닥 구조 (스템 구조)를 형성하고, 상기 5' 말단 스템 부위와 3' 말단 스템 부위 사이의 3 내지 5개 뉴클레오타이드가 루프 구조를 형성할 수 있다.

상기 Cpf1 단백질의 crRNA (예컨대, 일반식 4로 표현됨)는 5' 말단에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

Cpf1 유래 미생물에 따라 사용 가능한 Cpf1 단백질의 crRNA 서열의 5' 말단 부위 서열 (타겟팅 서열 부위 제외한 부분)을 표 1에 예시적으로 기재하였다:

(-: 뉴클레오타이드가 존재하지 않음을 의미)

본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열 (표적 서열)과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용되며, 상기 서열 상동성은 통상적인 서열 비교 수단 (예컨대 BLAST)를 사용하여 확인될 수 있다).

상기 방법에서, 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9 단백질)의 세포 내로의 형질도입은 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 통상적인 방법 (예컨대, 전기천공 등)으로 직접 세포에 도입하거나, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자(또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 염기서열 상동성을 갖는 유전자)를 하나의 벡터 또는 각각 별개의 벡터 (예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 등)에 포함된 상태로 세포에 도입하거나, mRNA delivery를 통하여 수행할 수 있다.

일 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련(adenoassociated) 바이러스 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이(Sendai), 알파바이러스(alphavirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 Cas9 단백질 암호화 핵산 분자, 가이드 RNA 암호화 핵산 분자, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 바이러스벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들을 사용하여 세포 내로 전달될 수 있으며, 세포의 핵내 전달을 위하여, 상기 Cas9 단백질 및/또는 가이드 RNA는 적절한 핵 위치호 신호 (nuclear localization signal)를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 타겟 부위의 "절단(cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 covalent backbone의 파손(breakage)을 의미한다. 절단은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이외의 다양한 여러 가지 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 단일-가닥의 절단 및 이중-가닥의 절단 모두 가능하며, 이중-가닥의 절단은 두 개의 구별되는(distinct) 단일-가닥의 절단의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 절단은 blunt ends 또는 staggered end를 생성할 수 있다.

본 발명의 심근경색 또는 하지허혈 모델에서 혈관의 생성과 재생은 필수적이나 이를 촉진할 수 있는 방법의 개발이 시급하였다. 따라서, 본 발명의 Ang-1 및 VEGF 분비 줄기세포는, 심근경색, 하지허혈 등의 심혈관 질환에서 혈관의 재생을 도와의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 Ang-1 분비 제대 중간엽줄기세포를 만들기 위한 벡터 구성도 및 제작 후 이 세포들로부터 Ang-1의 분비를 western blotting 및 ELISA 로 확인한 결과이다.
도 2는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 만들기 위한 벡터 구성도 및 제작 후 이 세포들로부터 VEGF의 분비를 western blotting 및 ELISA 로 확인한 결과이다.
도 3a 및 3b은 Ang-1 또는 VEGF 분비세포 제작용 벡터를 전달하기 위한 CRISPR/Cas9 RNP를 제작하여 Jurkat 세포에서 이입율의 증가 등을 확인한 도이다.
도 4는 하지허혈모델에 ANG-1 분비 제대 중간엽줄기세포 또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 처리한 경우의 하지손상 정도를 확인한 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 내지 5c는 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포의 투여시의 심근세포의 생존률 (proliferation assay)(5a), 혈관 생성 정도(5b), 및 주요 인자들의 발현 수준(5c)을 보여주는 결과이다.
도 6는 심근경색모델에 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 각 각 또는 함께 처리한 랫트의 심장의 섬유화 정도, Scar Area (% of LV (left ventricular) area), Infarcted wall thickness (mm), 및 LV expansion index를 보여주는 결과이다.
도 7a는 심근경색모델과 심근경색모델에 Ang-1-MSC와 VEGF-MSC를 함께 처리한 랫트의 심장의 박동량 산출을 CINE-f-MRI 기법으로 생체에서 관찰한 모습을 보여주는 사진이고, 7b는 경색 부위 크기를 나타낸 그래프이다.
도 8은 심근경색모델에 Ang-1 및 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 각 각 또는 함께 처리한 랫트의 심장의 혈관 생성 정도를 관찰한 사형광진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.

실시예 1: CRISPR/Cas9 RNP 을 이용한 Ang-1 및 VEGF 분비세포 제작

1.1. Ang-1 분비 세포 제작

pZDonor vector(Sigma Aldrich)에 Ang-1 유전자(GenBank Accession No. NM_001146.4)를 삽입하여, Ang-1 발현을 위한 재조합 벡터를 제작하였다 (도 1 참조). 또한, AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP ((주)툴젠)을 준비하였다 (Cas9: Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질; AAVS1 타겟으로 하는 sgRNA의 타겟팅 서열: gucaccaauccugucccuag; 전체 서열은 앞서 기재된 일반식 3 참조).

상기 준비된 AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP와 Ang-1의 유전자를 포함한 pZDonor를 사람의 제대 중간엽줄기세포에 함께 transfection 하였다. 상기 제대 중간엽줄기세포는 다음의 과정으로 준비하였다: 사람의 제대(umbilical cord)를 collagenase로 처리한 후, 원심분리하여 용액을 제거하고, T25 플라스크에 넣어 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 7일 후, 플라스크에 부착한 세포에 대해서는 염색체 검사를 진행하고, 부착하지 않은 세포 (non-adhering umbilical cord cells)에 대해서는 배양액을 20% fetal bovine serum (FBS)와 4 ng/mL basic fibroblast growth factor가 첨가된 modified minimum essential medium으로 교체해서 T25 플라스크에 옮겨 배양을 시작하며 5~7일 후 세포가 바닥에 잘 부착, 증식하고 있는지를 확인한 후, 세포가 안정적으로 증식하기 시작하면 배양액을 교체하고 이후 80% confluent 할 때까지 일주일에 두 번씩 배양액을 교체하여 배양하였다.

CRISPR/Cas9 RNP는 세포 유전자중 AAVS site를 절단함으로써 원하는 유전자 (즉 Ang-1 유전자)를 절단 부위 사이에 삽입하게 되고, 이로써 Ang-1 를 분비하는 제대 중간엽줄기세포 (Ang-1-MSC) 및 가 만들어졌다. 상기 제작된 Ang-1-MSC의 Ang-1 분비 여부를 웨스턴블라팅, ELISA, PCR, 및 형광면역염색 (Flag)으로 시험하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

1.2. VEGF 분비 세포 제작

pZDonor vector(Sigma-Aldrich)에 VEGF 유전자(GenBank Accession No. NM_001171623.1)를 삽입하여 VEGF 발현을 위한 재조합 벡터를 제작하였다 제작하였다 (도 2). 또한, AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP ((주)툴젠)을 준비하였다 (Cas9: Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질; AAVS1 타겟으로 하는 sgRNA의 타겟팅 서열: gucaccaauccugucccuag; 전체 서열은 앞서 기재된 일반식 3 참조).

상기 준비된 AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP와 VEGF의 유전자를 포함한 pZDonor를 사람의 제대 중간엽줄기세포(실시예 1.1 참조)에 함께 transfection 하였다.

CRISPR/Cas9 RNP는 세포 유전자중 AAVS site를 절단함으로써 원하는 유전자 (즉, VEGF 유전자)를 절단 부위 사이에 삽입하게 되고, 이로써 VEGF를 분비하는 제대 중간엽줄기세포(VEGF-MSC)가 만들어졌다. 상기 제작된 VEGF-MSC의 VEGF 분비 여부를 웨스턴블라팅, ELISA, PCR, 및 형광면역염색(Flag)으로 시험하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 시험은 다음과 같이 진행하였다:

- RT-PCR 분석

Trizol 용액을 이용하여 RNA를 추출한 후, olig-dT primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 42℃에서 1시간 동안 진행하고, 95℃에서 10분간 반응하여 효소활성을 정지시켰다. 확인하고자 하는 유전자의 primer를 제작한 후 PCR을 수행하였다(프라이머: Fwd: 5'-cggaactctgccctctaacg-3'; Rev: 5'-tgaggaagagttcttgcagct-3').

- Western blot

분리된 단백질 용액의 단백질 농도를 BCA법으로 확인한 후 일정량의 단백질 용액을 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동한 후 PVDF membrane으로 transfer하였다. 1차 항체(Sigma Aldrich)와 함께 4℃에서 12시간 반응시키고 반응이 끝나면 1차 항체를 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 ECL(Amersham)로 단백질 발현 여부를 분석하였다.

- 면역세포화학-형광염색

고정된 세포를 4℃에서 12시간동안 1차 항체와 반응시킨 후 세척하고 상온에서 1시간동안 fluorescein-conjugated goat anti-rabbit IgG와 반응시켰다. 이렇게 염색된 세포는 glass slide에 올려놓은 후 Zeiss confocal microscope로 관찰하였다.

또한, 상기 준비된 CRISPR/Cas9 RNP(툴젠)의 유전자 교정 (Indel: 삽입 및/또는 결실) 효율을 Jurkat 세포(ATCC)에서 시험하여, 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.

(도 3a 및 3b에서,

none: 아무것도 없이 transfection 진행;

sgRNA#1: 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG(TGG)-3' (hAAVS1 #1; 괄호 안은 PAM 서열임)을 타겟으로 하는 가이드 RNA (sgRNA)만 처리하여 진행;

sgRNA#2: 5'-ACCCCACAGTGGGGCCACTA(GGG)-3' (hAAVS1 #2; 괄호 안은 PAM 서열임)을 타겟으로 하는 sgRNA만 처리하여 진행;

Sp.cas9 only: Cas9 단백질(서열번호 4)만 처리하여 진행;

aRGEN1: hAAVS1 #1을 타겟으로 하는 sgRNA#1와 Cas9 단백질을 처리하여 진행;

aRGEN2: hAAVS1 #2를 타겟으로 하는 sgRNA#2와 Cas9 단백질을 처리하여 진행;

dRGEN1: hAAVS1 #1을 타겟으로 하는 sgRNA#1와 Cas9 단백질을 코딩하는 플라스미드를 처리하여 진행;

dRGEN2: hAAVS1 #2을 타겟으로 하는 sgRNA#2와 Cas9 단백질을 코딩하는 플라스미드를 처리하여 진행).

도 3a 및 3b에서 확인되는 바와 같이 RNP 형태가 플라스미드 형태보다 세포 내 전달 효율 및 유전자 교정 효율이 우수함을 확인할 수 있다.

실시예 2: 심근 세포 보호 효과

2.1. 인간 심근세포 배양

인간 심근 세포(ATCC; https://www.atcc.org/)를 5%(v/v) FBS, 5%(v/v) HS (horse serum), 20㎍/㎖의 겐타마이신 및 2.5㎍/㎖의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM (배양배지)에 현탁시키고, 10cm 배양접시에 1x10⁶ cells/㎖ (10㎖)로 플레이트한 다음, 5% CO₂/95% 대기 하의 배양기에서 37℃로 유지하였다. in vitro 배양 2~3주 후, AGE-알부민(Sigma-Aldrich)으로 처리한 후 아폽토시스-관련 특성을 위해 사용하였다.

2.2. 세포생존율(MTT assay) 측정

상기 실시예 2.1에서 준비된 인간 심근세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2x10³ 세포로 접종하였다. 80% 융합(confluence)에 도달한 후, 일차 인간 심근세포에 AGE-알부민(Sigma-Aldrich) 50nM 을 24시간 동안 처리하였다. 그 후 Ang-1-MSC (Ang-1 분비 제대 중간엽줄기세포) 또는 VEGF-MSC (VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포) (상기 실시예 1 참조)를 처리하고 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포생존율을 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. 황색 MTT 화합물은 살아있는 세포에 의해 디메틸술폭사이드 (Me₂SO) 용해되는 청색 formazen으로 변환된다. 0.5 mg/ml MTT를 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양하고 DMSO (Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 배양 배지에서의 청색 염색 강도(흡광도)는 96-웰 플레이트 리더(VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 540nm에서 측정하였고, 생존 세포의 비례량(proportional amount)으로 나타내었다.

결과는 도 5a (proliferation assay 결과; 세포생존률) 및 5b (입체 광학현미경으로 관찰한 결과; 혈관생성률)에 나타내었다 (GFP: GFP-MSC, VEGF: YEGF-MSC, ANG1: ANG1-MSC, VEGF+ANG1: VEGF-MSC와 ANG1-MSC의 혼합물, 및 rhVEGF: recombinant human VEGF (RND system)).

도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, 인간 심근세포에 AGE-알부민을 처리한 경우 세포생존율이 감소하여 세포사가 유도됨을 확인하였다. 반면, 일차 인간 심근세포에 ANG-1 및/또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 을 처리한 경우 세포생존율 및 혈관생성율이 증가됨을 확인하였다. 또한, 재조합 단백질인 rhVEGF와 비교하여, VEGF-MSC의 혈관생성 효과가 현저히 우수함을 확인하였으며, 이는 VEGF-MSC에서의 지속적인 VEGF 분비에 기인하는 것을 의미하는 것이라고 할 수 있다.

이러한 결과는, ANG-1 또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 가 심근세포사에 대해 보호 효과 (심근세포사 저해 효과)를 가짐과, 이러한 효과는 ANG-1 또는 VEGF이 단백질 형태로 사용되는 경우보다 우수함을 보여준다.

2.3. 혈관생성 인자 측정 (Western blotting)

상기 실시예 2.2에서 각 줄기세포 처리된 심근세포를 액체질소를 통해 분말화한 후, RIPA buffer(Abcam)로 lysis 진행한 후, 원심분리하여 supernatant를 취하여, 줄기세포 처리된 심근세포로부터 단백질 용액을 분리하였다. BCA(Life technologies)를 사용하여 제조사 사용설명에 따라 상기 단백질 용액의 단백질 농도를 확인한 후, 일정량의 단백질 용액 (Total protein 양: 30ug)을 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동한 후, PVDF membrane으로 transfer하였다. 1차 항체 (Sigma Aldrich)와 함께 4℃에서 12시간 반응시키고, 반응이 끝나면 1차 항체를 세척한 후, HRP가 결합된 2차 항체(Vector laboratories)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 ECL(Amersham)로 단백질 발현 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 도 5c에 나타난 바와 같이, ANG-1 및/또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포 처리시, 혈관의 생성에 필수적인 Akt 와 p-ERK1/2 의 증가가 가장 두드려 졌다.

실시예 3: 심근경색모델 심근세포사에 대한 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC 의 보호 효과 ( in vivo 실험)

3.1. 심근경색 동물모델 제작

무게가 250-300 g의 흰쥐(Sprague Dawley)를 준비하여 Ketamine (50 mg/kg), xylazine (4 mg/kg)의 혼합하여 마취하였다. 실험동물의 기관에 16 gauge의 catheter를 삽입하고 인공호흡기와 연결하고, 평평한 판에 눕혀서 테이프로 팔다리와 꼬리를 고정한 후에 복장뼈의 왼쪽에서 1~1.5 cm정도 피부를 세로로 절개하고 큰가슴근육(pectoralis major muscle)과 작은가슴근육 사이를 벌려 다섯 번째 갈비사이공간을 확인하고 조심스럽게 갈비사이근육을 가로로 1cm 정도 절개하였다. 다섯 번째, 여섯 번째 갈비뼈 사이에 retractor를 넣고 위아래로 벌린 후, 보통 흰쥐에서 가슴샘(thymus)가 심장 윗부분을 덮어 시야를 가리므로 angle hook 등을 이용해서 머리 쪽으로 가슴샘을 당겼다. 왼심장동맥(left coronary artery)의 형태를 관찰하여 어느 범위의 혈관가지를 묶을지 결정한 후에 폐동맥원뿔(pulmonary conus)과 왼심방귀(left atrial appendage)의 뾰족한 부분이 교차하는 선의 2~3 mm 아래에 위치하는 LAD (Left Anterior Descending artery)를 6-0 silk로 묶었다. 벌려진 다섯 번째, 여섯 번째 갈비뼈를 다시 모으고 절개했던 갈비사이근육을 MAXON 4-0 filament로 묶어준 다음 흉강에 남아있는 공기를 23 Gauge needle 주사기로 빼주어 폐가 완전히 펴질 수 있도록 하였다. 피부를 MAXON 4-0 filament를 이용하여 봉합하고, 기관삽관 하였던 튜브를 빼내고 인두에 묻어있는 점액들을 제거하였다. 수술 후에 진통제((Buprenorphine 0.025 mg/kg)를 12시간마다 피부 주사 하였다.

3.2. Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC 의 보호 효과

상기 준비된 심근경색 동물모델에 하기의 실시예 3의 Ang-1 분비 제대 중간엽줄기세포(Ang-1-MSC) 및/또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포, (VEGF-MSC)를 주입한 후 (주입량: 각각 30ul, 1x10⁶개의 세포 포함), 심근세포의 수를 크레실 바이올렛 (cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

상기 관찰 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 도면 방향 기준으로 상부 사진은 심장 조직의 염색 사진을 보여주는 것이고, 왼쪽 그래프는 경색 부위를 정량화한 Scar Area (% of LV (left ventricular) area) 결과를 보여주는 결과로서, 그 수치가 낮을수록 심장의 섬유화 정도가 감소함을 보여주고, 가운데 그래프는 경색부의 두께 (Infarcted wall thickness; mm)를 나타내는 결과로서, 그 수치가 높을수록 심근경색이 회복됨을 보여주고, 오른쪽 그래프는 심실의 확장 정도 (LV expansion index)를 보여주는 그래프로서, 그 수치가 낮을수록 심근경색이 회복됨을 보여준다. 도 6에 나타난 바와 같이, 심근경색 전 또는 후의 랫트의 심장세포에서, 상기 Ang-1 및/또는 VEGF 분비 제대 중간엽줄기세포를 투여한 경우 섬유화 지역(청색)과 심근경색 영역이 감소함을 확인하였다. 또한, 심근경색 치료효과가 MSC < ANG1-MSC < VEGF-MSC < ANG1-MSC+VEGF-MSC (A+V MSC) 순서로 증가함을 확인하였다.

또한, 상기 심근경색모델에 Ang-1-MSC 및 VEGF-MSC를 함께 처리한 랫트의 심장의 박동량을 CINE-f-MRI 기법으로 생체에서 관찰한 모습을 보여주는 사진을 도 7a에 나타내고, 도 7b에 경색 부위 크기를 그래프로 나타내었다. 도 7a-7b에 나타난 바와 같이, 심장의 박출량(ejection fraction) 또한 일반 MSC에 비하여 현저히 증가 하였다.

실시예 4: 하지허혈모델 근육세포사에 대한 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC의 보호 효과 ( in vivo 실험)

4.1. 하지허혈 동물모델 제작(Rat lower limb ischemia model)

동물은 male Balb/c-nu 마우스를 사용하였다. 동물모델 제작시 모든 환경은 깨끗하고 멸균된 장소에서 시행하였으며, N₂O:O₂=1:1(v:v), 포란 마취제 흡입에 의하여 마취시켜 진행하였다.

마취 후 약 2츠 가량 피부를 절개 후, 3-0 surgical silk로 정확한 부위에 결찰 (iliac arteries 혹은 superficial femoral arteries와 inguinal ligament에서 5-6 mm 아래)한 후 Skin clip을 이용 피부를 닫아주었다.

4.2. 하지근육세포사에 대한 보호효과

하지허혈모델에서 하지 근육세포사에 대한 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC의 보호 효과를 확인하기 위하여, 상기 준비된 하지허혈모델의 조직에 Ang-1-MSC 10⁶ 세포를 주입한 후, 1주일 및 2주일 경과 후 마우스의 뒷다리 모습을 관찰하여 도 4에 나타내었다.

도 4는 Ang-l-MSC, MSC (양성대조군), 및 PBS (음성대조군)를 투여받은 하지허혈모델 마우스의 뒷다리 모습을 보여주는 사진이다 (Sham: 하지허혈이 유도되지 않은 정상 마우스). 도 4에 나타난 바와 같이, MSC 및 PBS 투여군과 비교하여, Ang-1-MSC를 투여한 마우스의 하지근육세포사가 완화됨을 확인할 수 있다.

실시예 5. 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)

정상 또는 심근경색 랫트(실시예 3.1)의 심장조직에서 면역조직화학을 수행하였다. 정상 또는 심근경색 랫트의 심장조직을 0.1M 중성 인산염 완충용액 내 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 30% 수크로오스 용액에서 밤새도록 냉동보관한 다음, 저온유지장치(cryostat, Leica CM 1900)로 10㎛ 절편을 준비하였다. 파라핀-포매 조직을 10 ㎛ 두께의 절편으로 절단하고, 자일렌에서 탈파라핀시킨 후, 일련의 등급 에탄올로 재수화하였다. 정상 염소 혈청(10%)을 사용하여 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 조직 절편을 하기 항체들 중 하나와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다: 토끼 항-alpha-SMA 항체(Abcam), 마우스 항-인간 알부민 항체(1:200, R&D System), 염소 항-Iba1 항체(1:500, Abcam). 상기 배양된 조직 절편을 PBS로 3번 세척하고, Alexa flour 633 anti-mouse IgG(1:500, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이차 항체를 PBS로 3번 세척한 후, 커버슬립을 Vectashield mounting medium(Vector Laboratories)를 사용하여 글라스 슬라이드 위에 설치하고, 레이저 공초점 형광현미경(LSM-710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.

상기 관찰 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이, 랫트의 심장조직에 Ang-1-MSC 또는 VEGF-MSC를 각각 또는 함께 처리한 경우 혈관생성을 나타내는 alpha-SMA인자의 염색이 가장 강하게 나타났다.

<110> TOOLGEN INCORPORATED nSAGE corp. <120> Angiopoietin-1 or VEGF Secreting Stem Cell and Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Cardiovascular Disease Comprising the Same <130> OPP20180957KR <150> KR 10-2017-0078197 <151> 2017-06-20 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of crRNA <400> 1 guuuuagagc ua 12 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-terminal part of crRNA <400> 2 ugcuguuuug 10 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of tracrRNA <400> 3 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 60 <210> 4 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 from Streptococcus pyogenes <400> 4 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 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Claims

VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 중간엽줄기세포 및 Ang-1 유전자가 삽입되어 Ang-1 를 분비하는 Ang-1 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포, 또는 상기 중간엽줄기세포의 배양물을 포함하는, 혈관생성용 약학 조성물.
VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 중간엽줄기세포 및 Ang-1 유전자가 삽입되어 Ang-1 를 분비하는 Ang-1 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포, 또는 상기 중간엽줄기세포의 배양물을 포함하는, 허혈성 세포사 저해용 약학 조성물.
VEGF 유전자가 삽입되어 VEGF를 분비하는 VEGF 분비 중간엽줄기세포 및 Ang-1 유전자가 삽입되어 Ang-1 를 분비하는 Ang-1 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중간엽줄기세포, 또는 상기 중간엽줄기세포의 배양물을 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 심혈괄 질환은 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 고혈압, 또는 부정맥인, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대 유래 중간엽줄기세포인, 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 유전자 및 Ang-1 유전자는 중간엽줄기세포의 유전체 중의 세이프하버 부위에 삽입된 것인, 약학 조성물.