CN105555796A - 抑制肽对治疗炎性疾病的用途 - Google Patents
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Abstract
公开了一种经分离的肽,所述肽包含与SEQ?ID?NO:1(PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽包含核靶向活性,所述肽长度不超过20个氨基酸。
Description
发明领域和发明背景
本发明涉及可以用来防止蛋白质核转位的肽,作为转位至细胞核的方式,所述蛋白质天然地与Imp7缔合。所述肽可以用于治疗炎性疾病和免疫疾病。进一步的,所述肽可以用于促进蛋白质和其他化合物核转位至细胞核中(当其连接于其时)。
为确保精确的细胞功能,蛋白质的空间分布需要紧密调节与协调。这在许多信号蛋白质上特别明显,所述蛋白质受到细胞外刺激后显著地并迅速地改变他们的定位。为了维持这样的调节,细胞核通过双层膜包膜从细胞质中分离,其允许通过特异性核孔复合体(NPC)具有蛋白质的选择性入口。核定位的选择性主要由核内蛋白序列内含有的核定位信号(NLS)介导[G.Schlenstedt,FEBSLett389,75(Jun24,1996)]。
迄今鉴定的主要类型的NLS是由碱性氨基酸构成的,所述氨基酸是通过NPC进入的原理所需的。这些碱性序列有两种:(i)五至六个碱性氨基酸的单一延伸,例如猴肾病毒(SV)40大T抗原NLS;与(ii)二分的NLS,其由两个碱性氨基酸、10-12个氨基酸的间隔区和其中五个氨基酸中的三个必须是碱性的一个簇构成。该类型的代表是核质蛋白。为了使NLS-介导的核输入发生,NLS首先与细胞质输入-受体蛋白质输入蛋白α和β缔合,使其停靠(docking)在核膜孔的细胞质侧[E.J.Tran,S.R.Wente,Cell125,1041(Jun16,2006)]。通过核膜孔的移动是由小GTP酶Ran调节,所述GTP酶Ran在其GTP-结合状态促进输入的蛋白质从输入蛋白上的解离并使其回收返回细胞质[J.Moroianu,JCellBiochemSuppl32-33,76(1999)]。
然而,不是所有的细胞-核穿梭蛋白质都含有规范的NLS,因此使用其他的,不依赖NLS使他们的通过NPC的通道机制。一些表征的不依赖NLS的机制包括小蛋白质(<30-40kDa)的被动扩散、特殊核引导基序(distinctnuclear-directingmotif)[D.Christophe,C.Christophe-Hobertus,B.Pichon,CellSignal12,337(May,2000)]、与含NLS的蛋白质的相互作用,或可选地,与核膜孔蛋白质(NUP)的直接相互作用;[L.Xu,J.Massague,NatRevMolCellBiol5,209(Mar,2004)]。然而,通过这些机制的穿梭和核保留的动力学通常太慢以至于不能及时进行瞬时转录,且因此允许信号蛋白在刺激后迅速和可逆的不依赖NLS转位的分子机制仍然是不清楚的。
Chuderland等人,2008,MolCell31,850-861和Plotnikov等人,2011,MolCellBiol31,3515–3530教导了ERK1/2转位涉及CK2-介导的ERK1/2。核转运信号(NTS)中的两个丝氨酸残基的磷酸化作用。该磷酸化作用允许与Imp7相互作用,其进一步促进ERK1/2通过核膜孔穿梭。
调节生物学组分的细胞定位的能力对于许多功能如调节核酸表达、真核细胞转染,基因治疗、保护免受有毒化学品侵害以及运输抗癌剂是重要的。因此广泛意识到鉴定能调节核转运的新型序列是需要的,且是非常有利的。
另外的背景技术包括美国专利申请号20100099627。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了一种经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1(PERYQNLSPV)至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽包含核靶向活性,所述肽长度不超过20个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了一种经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1(PERYQNLSPV)至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽长度不超过20个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了在受试者中治疗炎症性或免疫病症的方法,所述方法包含对受试者施用治疗有效量的本文描述的经分离的肽,从而治疗炎性疾病或免疫疾病。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了一种物质组合物,其包含本文描述的经分离的肽以及通过接头与所述肽的氨基酸序列连接的异源物质。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了一种经分离的多核苷酸,其包含能够编码本文描述的肽的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了一种核酸构建体,其包含本文描述的经分离的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法,所述方法包括将物质导入宿主细胞中,所述物质连接于本文描述的肽上。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法,所述方法包括将本文描述的肽引入宿主细胞,所述肽连接至能够结合所述物质的亲和部分。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了包含本文描述核酸的分离的细胞。
根据本发明的一些实施方案的一方面,在此提供了药物组合物,包含作为活化剂的本文描述的肽和药物可接受载体。
根据本发明的一些实施方案,所述肽包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:8所示的序列。
根据本发明的一些实施方案,至少一个氨基酸是合成氨基酸。
根据本发明的一些实施方案,至少一个氨基酸是D立体异构体。
根据本发明的一些实施方案,至少一个氨基酸是L立体异构体。
根据本发明的一些实施方案,一种异源物质通过接头与氨基酸序列连接。
根据本发明的一些实施方案,经分离的肽包含选自SEQIDNO:2(PERYQNLSPVG)、SEQIDNO:3(PERYQNLSPVGS)、SEQIDNO:4(PERYQNLSPVGSG)、SEQIDNO:5(PERYQNLSPVGSGA)SEQIDNO:6(KPERYQNLSPVGSGA)和SEQIDNO:7(KPERYQNLSPVAAAA)的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案,经分离的肽包含与SEQIDNO:8(KPERYQNLSPV)所示的序列至少80%同一性的序列。
根据本发明的一些实施方案,经分离的肽是肉豆蔻酰化的(myristoylated)。
根据本发明的一些实施方案,免疫病症是自身免疫病症。
根据本发明的一些实施方案,炎性疾病是结肠炎。
根据本发明的一些实施方案,所述肽用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。
根据本发明的一些实施方案,异源物质选自多肽、核酸、小分子和碳水化合物。
根据本发明的一些实施方案,异源物质是多肽。
根据本发明的一些实施方案,异源物质是药剂。
根据本发明的一些实施方案,药剂是治疗剂,化妆剂或诊断剂。
根据本发明的一些实施方案,组合物通过接头与可检测部分连接。
根据本发明的一些实施方案,接头包含肽键。
根据本发明的一些实施方案,接头包含非肽键。
根据本发明的一些实施方案,物质组合物通过接头与亲和部分连接。
根据本发明的一些实施方案,亲和部分选自抗体,受体配体和碳水化合物。
根据本发明的一些实施方案,构建体进一步包含用于调节多核苷酸表达的顺式调节元件。
根据本发明的一些实施方案,经分离的多核苷酸转录地融合至编码目的异源多肽序列的核酸序列中。
根据本发明的一些实施方案,分离的细胞是真核细胞。
根据本发明的一些实施方案,真核细胞是酵母细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述物质是内源物质。
根据本发明的一些实施方案,所述物质是外源物质。
根据本发明的一些实施方案,所述方法进一步包括在引入之前、伴随引入或在引入之后对宿主细胞施用外源物质。
根据本发明的一些实施方案,宿主细胞是分裂细胞。
根据本发明的一些实施方案,宿主细胞是非分裂细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述物质选自多肽、核酸、小分子和碳水化合物。
根据本发明的一些实施方案,所述物质是核酸。
根据本发明的一些实施方案,通过选自下述的方法将核酸被引入至宿主细胞中:显微注射,电穿孔,磷酸钙共沉淀,DEAE葡聚糖引入,脂质体介导的引入,病毒介导的引入,裸DNA注射,和生物射弹轰击。
根据本发明的一些实施方案,靶向在体内有效。
根据本发明的一些实施方案,靶向在先体外后体内有效。
根据本发明的一些实施方案,靶向在体外有效。
根据本发明的一些实施方案,宿主细胞是真核细胞。
根据本发明的一些实施方案,真核细胞是酵母细胞。
除非另有限定,本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属的本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方案,但本文在下文描述了示例性的方法和/或材料。以防冲突,本专利说明书,包括定义,将进行控制。另外,材料、方法以及实施例仅用做示例性的,并且不意在必须是限制性的。
附图简述
仅以例子的方式,本文描述了本发明的一些实施方案。通过参考附图细节,强调了显示的这些细节仅是示例性的,用于说明本发明的实施方案。在这点上,附图说明对本领域技术人员如何实施本发明来说是显而易见的。
在附图中:
图1A-B阐明了在HeLa细胞中JNK1/2和p38α/β与Imp3、7和9相互作用。(A)Co-IP研究。HeLa细胞在血清饥饿(0.1%FBS,16小时)下生长至70%汇合,随后用茴香霉素(Anis;0.5μg/ml,15分钟)和TPA(250nM,15分钟)刺激,或者不进行处理(NT)。随后将细胞提取物与抗JNK1、JNK2、p38α、p38β抗体或兔IgG(作为阴性对照)进行Co-IP实验。使用具有指示的抗Imp抗体的蛋白免疫印迹检测相互作用的Imp。如指示的(底部小图),IpedMAPK的量通过抗JNK1、JNK2、p38α、p38β抗体进行检测,IgG作为对照。印迹使用NBT/BCIP或ECL显色。箭头指示了相互作用的Imp。(B)使用PLA研究。HeLa细胞在血清饥饿(0.1%FBS,16小时)下长至70%汇合,并随后用茴香霉素(Anis)刺激,或者不进行处理(NT)。将细胞固定,且根据生产厂商的说明书进行PLA测定,其如指示的使用了抗Imp抗体连同抗JNK(上部小图)或抗p38(下部小图)。使用DAPI检测细胞核,且使用荧光显微镜观察载玻片。信号强度定量使用ImageJ分析工具(显示的数据代表平均数+S.E.p<0.0001(经处理的相对于对照)执行。
图2A-C阐明了Imp3、7和9是JNK和p38转位和诱导转录所需的。(A)Imp3、7、9的SiRNA,而不是Imp5的SiRNA,抑制经刺激的JNK和p38的核转位。HeLa细胞在盖玻片上生长至30%聚集。根据生产商说明书使用Dharmafect将指示的Imp的siRNA和公司提供的si对照的(siScr,阴性对照)转染至细胞中。转染48小时后,细胞是血清饥饿的,随后如指示的用茴香霉素(0.5μg/ml,15分钟)刺激,或不处理(NT)。随后固定细胞,使用指示的(左侧)抗MAPK抗体染色,并用荧光显微镜观察。(B)在刺激之前和刺激后JNKs/p38s核定位的定量。显示的数据代表平均数+S.E。Imp3相对于Imp7/Imp9(*)的显著性为p<0.0003。刺激的Imp3/7/9相对于Scr的显著性为p<0.00001。(C)Imp3、7、9的SiRNA抑制JNKs/p38s的下游转录因子靶的活化。根据厂商说明手册使用Dharmafect方法使用指示的Imp的siRNA和生产厂商提供的si对照(siScr,阴性对照)转染HeLa细胞。转染48小时后,细胞是血清饥饿的,且随后以指示的时间用茴香霉素(0.5μg/ml,15分钟)刺激,或不处理(NT)。使用抗pJUN、pMEF2A、pATF2、指示的Imp和微管蛋白抗体对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
图3A-B阐明了JNK1/2和p38α/β与Imp7或Imp9,但不与Imp3直接相互作用。(A)JNK1/2和p38α/β与Imp3/7/9的体外相互作用。由IP以如下制备纯化的Imp3/7/9的:HeLa细胞生长至70%汇合,血清饥饿,且随后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml,15分钟)、TPA(250nM,15分钟)刺激,或不处理(NT)。随后从细胞提取物中获得Imp3/7/9,充分洗涤(使用RIPA缓冲液洗涤两次,使用0.5MLiCl洗涤一次)。根据材料和方法中所述的从细菌中制备指示的GST-MAPK。为了检测缔合作用,将500ng的各GST-MAPK与20μl在PBS中得指示的经IP的Imp温育(4℃下振荡2小时)。随后用含有150mMNaCl的洗涤缓冲液洗涤小珠,且使用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的MAPK。(B)Imp3不是Imp7/9与JNK1/2和p38α/β的相互作用所需的。根据厂商说明书,使用Imp3的SiRNA处理HeLa细胞。转染48小时后,细胞是血清饥饿的,随后使用茴香霉素(Anis0.5μg/ml)或TPA(TPA250ng)刺激,或不处理(NT)。随后细胞提取物与抗Imp7或Imp9进行Co-IP,使用指示的抗体以蛋白质印迹检测相互作用的MAPK。通过指示的抗体检测经IP的Imp的量。
图4A-B阐明了衍生自p38α的第21位-第33位氨基酸的肉豆蔻酰化肽抑制刺激-依赖的核转位和JNK1/2和p38α与Imp7的相互作用。(A)所述肽抑制JNK1/2和p38α/β的刺激-依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿(0.1%FBS,16小时),并随后与抑制肽(肽,10μM)或乱序肽(scrambledpeptide)(Scr肽,10μM)温育,细胞随后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml)处理或不处理(NT)。将细胞固定,并如指示的抗JNK1、JNK2、p38α或p38β抗体染色,且以DAPI检测细胞核。使用荧光显微镜观察载玻片。(B)所述肽抑制JNK1/2和p38α/β与Imp7的相互作用。HeLa细胞生长至70%汇合,血清饥饿(0.1%FBS,16小时),并随后与抑制肽(肽,10μM)、乱序肽(Scr肽,10μM)或DMSO温育,之后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml)处理或模拟对照(NT)。随后将细胞提取物与抗JNK1、JNK2、p38α、p38β抗体进行Co-IP。使用指示的抗Imp抗体通过蛋白质印迹检测相互作用的Imp7。经IP的MAPK的量如指示的通过抗JNK1、JNK2、p38α和p38β进行检测。
图5A-D阐明了Imp3以磷-依赖(phospho-dependent)的方式与Imp7/9-MAPK二聚体的相互作用。(A)使用PLA检测异源二聚化的Imp3/7/9。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml15分钟)刺激。其后,将细胞固定,并进行PLA,使用图上部标示的抗体。使用DAPI检测细胞核,并使用荧光显微镜观察载玻片。(B)使用ImageJ分析工具对信号强度进行定量。显示的数据代表了平均数+S.E。经刺激的相对于NT的显著性为p<0.0005。(C)通过CoIP检测Imp3/7/9相互作用。使用茴香霉素(Anis0.5μg/ml)或TPA(250nM)将血清-饥饿的HeLa细胞(0.1%FBS,16小时)处理15分钟。随后将细胞提取物与右侧指示的抗体进行Co-IP。左侧指示的抗体和NBT/BCIP或ECL使CoIPs和经IP的Imp(底部小图)的印迹显色。(D)Imp3对Imp7/9的相互作用依赖于Imp3的磷酸化作用。通过IP以如下制备纯化的Imp3:HeLa细胞生长至70%汇合,血清饥饿,并随后用TPA(250nM,15分钟)刺激或不进行处理(NT)。随后,Imp3从细胞提取物中经IP的,并充分洗涤(使用RIPA缓冲液洗涤两次,使用0.5MLiCl洗涤一次)。随后,纯化的蛋白质与小牛小肠磷酸酶温育(CIP,1小时,37℃)或不进行处理。将500ng指示的重组Imp与经IP的Imp3温育(2小时,4℃下振荡)。随后用含有150mMNaCl的洗涤缓冲液洗涤小珠,并使用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的Imp。
图6A-B阐明了在刺激后p38和JNK与Imp3/7或Imp3/9的二聚体形成复合体。(A)凝胶过滤研究显示在刺激后Imp3/7/9的MW移动。HeLa细胞是血清饥饿的,并随后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml,15分钟)和TPA(250nM,15分钟)刺激,或不处理(NT)。将细胞提取物(各处理20mg)加载于16/60superdex200大小的柱上(速率1ml/分钟),并收集1ml级分。随后使用具有左侧指示的抗Imp3/7/9抗体的蛋白质印迹分析级分。(B)CoIP证实了JNK和p38与Imp二聚体在约280kDa峰处而不是在约120kDa峰处的的缔合。来源于未处理的Anis或TPA刺激的柱的代表约280kDa和约120kDa峰(级分号9和22)的级分与指示的(右侧)抗体进行CoIP。使用具有指示的(左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的蛋白质。
图7A-B阐明了JNK1/2和p38α/β独立于他们的活化磷酸化作用而转位至细胞核中。(A)JNK1/2和p38α/β的核转位。HeLa细胞生长至70%汇合,血清饥饿(0.1%FBS,16小时),并随后在指示的时间点用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml)和TPA(250nM)刺激,或不处理(NT)。将细胞固定,用指示的抗JNK1、JNK2、p38α或p38β抗体染色,并使用DAPI检测细胞核。使用荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观察载玻片。(B)内源JNK1/2和p38α/β的核转位独立于他们的磷酸化作用。HeLa细胞生长至70%汇合,血清饥饿,并随后用茴香霉素(0.5μg/ml)或TPA(250nM)刺激指示的时间。产生细胞提取物,并与指示的抗体进行蛋白质印迹分析。使用NBT/BCIP或ECL将印迹显色。
图8A-B阐明了在MCF10A和HB2细胞中JNK1/2和p38α/β转位至细胞核中。(A,B)在MCF10A和HB2细胞中JNK1/2和p38α/β的核转位。(A)HB2和(B)MCF10A细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml)或TPA(250nM,只对HB2)刺激。将细胞固定,使用图中上部标示的抗JNK和p38抗体染色。使用DAPI检测细胞核,并使用荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观察载玻片。
图9阐明了JNK1/2和p38α/β使用不依赖NTS机制转位至细胞核中。在NTS-同源区内的突变不影响JNK1/2和p38α/β的核穿梭。HeLa细胞生长至70%汇合,使用JNK1-GFP(wt-JNK1)、JNK2-GFP(wt-JNK2)、p38α-GFP(wt-p38α)或p38β-GFP(wt-p38β)以及他们的突变体(APA或EPE)进行转染。转染16小时后,细胞是血清饥饿的、经固定的,使用荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观察。
图10A-B阐明了内源的和过表达的JNK1/2和p38α/β与Imp3、7和9的CoIP。(A)进行Co-IP筛选在MCF7细胞中以检测输入蛋白与JNK1/2和p38α/β相互作用。MCF7细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并随后用茴香霉素(Anis0.5μg/ml,15分钟)或TPA(250nM,15分钟)刺激,或不处理(NT)。细胞提取物随后与抗JNK1、JNK2、p38α或p38β抗体,和兔IgG(作为阴性对照)(对照)进行Co-IP。使用具有指示的Imp或MAPK抗体的蛋白质印迹检测相互作用的Imp或经IP的MAPK。(B)HeLa细胞中过表达的MAPK的相互作用。使用JNK2-GFP(wt-JNK2)、p38ββ-GFP(wt-p38β)或GFP单独转染HeLa细胞。细胞是血清饥饿的,并且随后使用茴香霉素(Anis0.5μg/ml,15分钟),TPA(250nM,15分钟)处理。随后将细胞提取物与抗GFP抗体进行CoIP。使用具有指示的(左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的Imp和负载的提取物。使用NBT/BCIP或ECL与所述印迹显色。箭头指示了相互作用的Imp。
图11阐明了敲除Imp3/9不影响ERK底物cMyc的磷酸化作用。Imp3、9的SiRNA不抑制ERK1/2的下游转录因子靶的活化。使用Dharmafect根据制造商说明书,使用指示的Imp的siRNA和厂商提供的si对照(siScr,阴性对照)转染HeLa细胞。转染48小时后,细胞是血清饥饿的,并随后在指示的时间点用茴香霉素(Anis0.5μg/ml)刺激或不刺激(NT)。使细胞提取物进行具有指示的抗体的蛋白质印迹分析,印迹与NBT/BCIP或ECL显色。
图12A-B阐明了应答刺激的Imp3/7/9的转位。HeLa(A)或HB2(B)细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并随后用茴香霉素(Anis0.5μg/ml15分钟)刺激或不处理(NT)。将细胞固定,并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测细胞核,并且使用荧光显微镜观测(OlympusBX51,x40放大率)载玻片。
图13阐明了Ran是JNK1/2和p38α/β核转位所需的。Ran的siRNA抑制刺激-依赖的JNK1/2和p38α/β的核转位。HeLa细胞在盖玻片上生长至30%汇合。随后使用Dharmafect根据制造商说明书,将siRNARan和公司提供的si对照(siScr,阴性对照)转染至细胞。转染48小时后,细胞是血清饥饿的,随后如指示的用茴香霉素(0.5μg/ml,15分钟)刺激,或不处理(NT)。随后固定细胞,使用指示的抗MAPK抗体染色,并使用荧光显微镜观察(OlympusBX51,x40放大率)。
图14A-C阐明了p38αα与输入蛋白7相互作用的位点的鉴定。(A)示意图代表p38α的截短突变。(B)p38α的N末端缺失突变抑制其核转位。构建p38α-GFPΔC(40a.a)或ΔN(20或30a.a)末端缺失突变,并转染至HeLa细胞。转染16小时后,细胞是血清饥饿的,使用茴香霉素(0.5μg/ml,15分钟)刺激,或不处理(NT)。固定细胞,用DAPI检测细胞核,使用荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观测载玻片。(C)p38α的N末端缺失突变抑制其与Imp7/9的相互作用。构建p38α-GFP的N末端连续缺失突变,转染16小时后,细胞是血清饥饿的,使用茴香霉素(0.5μg/ml,15分钟)刺激,或不处理(NT)。随后使细胞提取物与抗GFP抗体进行CoIP。相互作用的Imp7和负载的提取物用使用指示的抗体(左侧)的蛋白质印迹分析检测。印迹使用NBT/BCIP或ECL显色。箭头指示了相互作用的Imp。
图15A-B阐明了JNK(图15A)和p38(图15B)MAPK在刺激后形成复合体。HeLa细胞是血清饥饿的,之后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml,15分钟),TPA(250nM,15分钟)刺激或不处理(NT)。将细胞提取物负载于16/60superdex200大小柱(速率1ml/分钟),并收集1ml级分。随后分析各级分,如指示的使用具有抗JNK/p38抗体的蛋白质印迹进行分析。印迹与NBT/BCIP或ECL显色。
图16阐明了肉豆蔻酰化肽的胞内分布和稳定性。HeLa细胞在盖玻片上生长至70%汇合,血清饥饿(0.1%FBS,16小时),并在指示的时间用N-末端共轭肉豆寇酸、C-末端共轭生物素的肽处理。用3%PFA固定细胞,并使用抗生物素蛋白-FITC染色,并进行DAPI。使用荧光显微镜(x40放大率)观察肽。
图17A-C阐明了在结肠炎模型中抑制肽作为潜在治疗剂的用途。21只雄性C57BL小鼠用肽(15mg/Kilo),乱序肽(15mg/Kilo)或DMSO(2%)处理(每48小时静脉注射)。使用DSS(饮用水中1.25%)诱导结肠炎,并在诱导7天后处死小鼠。使用内窥镜成像评估结肠炎,并使用结肠中病灶的数目和小鼠体重进行评分。
图18A-B阐明了肉豆蔻酰化肽阻断p38与输入蛋白7的相互作用。(A)肉豆蔻酰化肽是经修饰的(将3个残基置换为丙氨酸)Myr-KPERYQNLSPVGSGA-SEQIDNO:9;Myr-KPERYQNLSPVAAAA-SEQIDNO:10。(B)HeLa细胞与经修饰的肽预孵育(2小时),随后用茴香霉素刺激(Anis,0.5μg/ml,15分钟),或不处理。随后将细胞提取物与抗p38α进行CoIP。通过具有指示的抗体的蛋白质印迹法检测相互作用的Imp7或经IP的p38。
图19A-C阐明了肉豆蔻酰化肽抑制p38的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并与新肽(NP)、肽或乱序肽预孵育,并随后用茴香霉素刺激(Anis0.5μg/ml15分钟),或不处理(NT)。固定细胞,并使用指示的抗体染色。用DAPI检测细胞核,并使用旋转盘共焦显微镜(spinningdiscconfocalmicroscope)(Zeiss,x100放大率)观察载玻片。
图20A-C阐明了肉豆蔻酰化肽抑制JNK的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并与新肽(NP)、肽或乱序肽预孵育,并随后用茴香霉素刺激(Anis0.5μg/ml15分钟),或不处理(NT)。固定细胞并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测细胞核,并使用旋转盘共焦显微镜(Zeiss,x100放大率)观察载玻片。
图21阐明了肉豆蔻酰化肽不影响MAPK的刺激依赖活化作用。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合,血清饥饿,并与新肽(NP)、肽或乱序肽预孵育,并随后用茴香霉素(Anis0.5μg/ml)、TPA(250nM)刺激,或不处理(NT)。产生细胞提取物,并使细胞提取物进行具有指示的抗体的蛋白免疫印迹分析。
本发明实施方案描述
本发明的一些实施方案涉及可以用于防止蛋白质核转位的肽,所述蛋白质天然地以与Imp7缔合的方式转位至细胞核中。所述肽可以用于治疗炎症和免疫相关疾病。进一步的,所述肽可以用于促进当连接细胞核时蛋白质和其他化合物转移至细胞核。
根据附图和附加的描述可以更好地理解根据本发明的核转移信号的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前,应当理解本发明不将其应用限于下文的描述或实施例给出的示例。本发明可以包含其他的实施方案,或以不同的方式进行或执行。并且,应当理解本文使用措辞和术语是用于描述性目的,并且不应当被认为是限制性的。
JNK和p38是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员。哺乳动物中,存在三种JNK同种型(JNK1-3)和四种p38同种型(p38α-δ),其调控多个细胞过程,其主要包括应激反应。
本发明人研究了JNK1/2和p38α/β的刺激核转位,并发现在应激和促有丝分裂刺激后全部四种均迅速转位至细胞核中。本发明人获得的实验结果表明JNK1/2和p38α/β各自通过不依赖活化的机制从其细胞质锚定上释放。其允许活化的或不活化的MAPK与Imp7或Imp9结合,然后结合到Imp3。随后Imp3/Imp7或Imp3/Imp9二聚体护送连接的MAPK至核膜,在核膜初保留了Imp3,而Imp7/9进一步穿过核孔。很可能MAPK/Imp复合体随后通过GTP-Ran解离,所述GTP-Ran在细胞核中使MAPK游离。
本发明人接着试图鉴定JNK和p38中介导与Imp7和Imp9相互作用的位点,并且显示了位于p38α的第20位-第30位残基中的重要序列(图14A-C)。
当减少执行本发明时,本发明人合成了基于p38α的第21位-第34位残基序列的14个氨基酸肉豆蔻酰化的肽,并且显示当其在刺激前应用于HeLa细胞时,其阻止了核转位(图4A),以及测试的MAPK的Imp7/9的相互作用(图4B)。
因为本发明的肽能够特异地抑制JNK1/2和P38α/β的核活性,而不调节其细胞质活动,这些肽可以用于在细胞中抑制JNK1/2和P38α/β的核活动(例如,细胞凋亡活性,炎症活性),而不损害其他的JNK1/2和P38α/β相关的细胞质活性。因此,本发明的该方面的肽可以用作炎症和细胞凋亡相关疾病的治疗剂,而没有其他JNK1/2和P38α/β的抑制剂的副作用。
因此,根据本发明的一个方面,在此提供了经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽包含核靶向活性,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:2所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:3所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:4所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:5所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:6所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:7所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:8所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其包含核靶向活性,且不多于20个氨基酸。
因此,根据本发明的一方面,在此提供了经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽能够防止经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:2所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:3所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:4所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:5所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:6所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:7所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
根据另一个实施方案,所述肽包含与SEQIDNO:8所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,其能够防止所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不多于20个氨基酸。
如提及的,根据本发明的该方面的肽优选地不多于20个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为19个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为18个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为17个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为16个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为15个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为14个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为13个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为12个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为11个氨基酸。
根据一个特别的实施方案,肽长度为10个氨基酸。
更优选地本发明的肽的氨基酸序列与SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7或8的同源性为81%、更优选地为82%、更优选地为83%、更优选地为84%、更优选地为85%、更优选地为86%、更优选地为87%、更优选地为88%、更优选地为89%、更优选地为90%、更优选地为91%、更优选地为92%、更优选地为93%、更优选地为94%、更优选地为95%、更优选地为96%、更优选地为97%、更优选地为98%、更优选地为99%、最优选地为100%。
根据一个实施方案,本发明的肽具有与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8所示序列同一的氨基酸序列。
根据还另一个实施方案,本发明的肽由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列组成。
样品多肽与参考多肽的同源性或同一性百分比,例如本发明的核靶向肽与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列的多肽的同源性或同一性的百分比,可以通过多种方法中任一的进行确定。优选地,多肽之间的同源性或同一性百分比使用NCBI的标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]软件来确定。
本发明人预期本文公开的肽的氨基酸序列可以被保守地或非保守地取代。
本文使用的术语“保守取代”,指的是将存在于肽中天然序列的氨基酸替换为天然的或非天然存在的氨基酸或具有相似空间特性的模拟肽。当将天然氨基酸的侧链替换为极性的或疏水的,保守取代应当使用天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或模拟肽部分(其也是极性或疏水的)(另外其具有如置换的氨基酸的侧链的相同的空间特性)。
天然存在的氨基酸通常根据他们的特性进行分组,由天然存在的氨基酸的保守取代可以容易地根据牢记的事实来确定,根据本发明的带电荷的氨基酸被空间相似的不带电荷的氨基酸取代被认为是保守取代。
对于产生非天然存在的氨基酸的保守取代,还可能使用本领域熟知的氨基酸类似物(合成氨基酸)。天然存在的氨基酸的模拟肽在技术人员已知的文献中详细记载。
当进行保守取代时,取代的氨基酸在侧链上应当具有与原氨基酸相同或相似的官能团。
本文使用的短语“非保守取代”指的是将亲本序列中存在的氨基酸取代为另一个天然或非天然存在的氨基酸,其具有不同的电化学和/或空间特性。因此,取代的氨基酸的侧链可以显著地比被取代的天然氨基酸的侧链更大(或更小)和/或可以具有与被取代的氨基酸显著不同电子特性的官能团。这类的非保守取代的例子包括将苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代为丙氨酸、将异亮氨酸取代为甘氨酸,或将–NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-取代为天冬氨酸。落入本发明范围内的那些非保守取代是那些仍构成具有抗细菌特性的肽的那些取代。
本文使用的短语“核靶向活性”指的是肽增加其核:细胞质定位比率,或其连接的剂至少10%、更优选地至少20%和甚至更优选地至少30%、50%、80%或更多的能力。
核靶向活性可以通过直接或间接方法检测:当使用荧光染料(标记试剂盒是商业上可以获得的,例如从Pierce或MolecularProbes)标记核靶向肽时,可以通过荧光或共聚焦激光扫描显微镜的直接观察。如果所述核靶向肽使用电子密度材料如胶体金标记,核靶向活性还可以通过电子显微镜来评价(Oliver,MethodsMol.Biol.115(1999),341-345)。
可以理解如果核靶向肽与异源剂(例如多核苷酸)连接,则可以通过观察异源剂的位置来检测活性。
如果连接的分子(例如核酸)在细胞核内发挥功能,可以以间接方式评价核靶向活性。该功能可以是,例如,由连接的核酸编码的基因的表达,其包括这样的基因表达的结果,其可以在其他细胞分子或过程中发挥。
本文使用的术语“肽”或“多肽”指的是天然或合成氨基酸的聚合物,其包括天然肽(降解产物,综合地合成多肽或者重组多肽)和模拟肽(通常地,综合地合成肽),以及类肽和半肽,其是多肽的类似物,其可以具有,例如,使所述肽在体内甚至更稳定或更能够穿透细胞的修饰。因此,本发明预期了例如对肽的肉豆蔻酰化。优选地肉豆蔻酰化发生在N末端残基。肉豆蔻酰化是不可逆的蛋白质脂化修饰,其中衍生自肉豆蔻酸的肉豆蔻酰基团通过酰胺键共价连接至N-末端残基的α-氨基上。通过本发明预期肉豆蔻酰化的肽的例子包括SEQIDNO:9-16。
这样的修饰包括,但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肽键修饰,其包括,但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH、主链修饰和残疾修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的,并且在例如QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplinPergamonPress(1992)中说明,其在此以充分引用并入本文。下文中提供该方面的进一步细节。
可以取代多肽中的多肽键(-CO-NH-),例如,通过N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮基亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-),其中R是任何烷基、例如,甲基胺基(-CH2-NH-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH=CH-)、酰胺键(retroamidebond)(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-),其中R是“正常”侧链,天然存在于C原子上。
这些修饰可以发生在多肽链的任何键上,并甚至同时在若干处(2-3)发生。
天然芳香族氨基酸,Trp,、Tyr和Phe可以被取代为合成的非天然氨基酸例如,苯基甘氨酸,TIC,萘基丙氨酸(Nol),Phe的环甲基化衍生物,Phe或O-甲基-Tyr的卤化衍生物。
除了上文所述,本发明的多肽还可以包括一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如,脂肪酸,复合碳水化合物等)。
本文说明书和下文权利要求部分使用的术语“氨基酸”应理解为包括20个天然存在的氨基酸;那些氨基酸在体内经常进行翻译后修饰,包括,例如,羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸;和其他的不常见的氨基酸,其包括但不限于,2-氨基已二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外,术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸(立体异构体)两者。
表1和表2在下文列出了本发明可以使用的天然存在的氨基酸(表1)和非保守的或经修饰的氨基酸(表2)。
表1
表2
本发明的肽可以包括在细胞中调节其分泌的前导序列。示例性的前导序列可以包括TAT前导序列。
本发明的肽的N和C末端可以通过官能团保护。合适的官能团在Green和Wuts的"ProtectingGroupsinOrganicSynthesis",JohnWiley和Sons,Chapters5和7,1991中描述,其教导在此通过引用并入本文。优选的保护基团是能够促进连接于其上的化合物运输至细胞中的那些,例如,通过减少化合物的亲水性和增加其亲油性。
这些部分可以在体内在细胞内通过水解或酶促裂开。羟基保护基团包括酯、碳酸盐和氨基甲酸酯保护基团。胺保护基包括烷氧基和芳氧基羰基,如上所述用于N末端保护基团。羧酸保护基包括脂肪族的、苄基的和芳基酯,如上所述用于C末端保护基团。在一个实施方案中,本发明的肽的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基侧链的羧酸基团是受保护的,其优选使用甲基,乙基,苄基或取代的苯甲基酯。
N末端保护基团的例子包括酰基(-CO-R1)和烷氧基羰基或芳氧基羰基,其中R1是脂肪族的、取代的脂肪族的、苄基、取代的苄基,芳香族的或取代的芳香族基团。酰基的特定例子包括乙酰基,(乙基)-CO-、正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、十二烷酰、十六烷酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、油酰基苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苄基-CO-和(取代的苄基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基的例子包括CH3-O-CO-、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO-、异丙基O-CO-、正丁基-O-CO-、仲丁基-O-CO-、叔丁基-O-CO-、苯基O-CO-、取代苯基O-CO-和苄基O-CO-、(取代苄基)-O-CO-。金刚烷、萘、tuluen、联苯、肉桂酰、硝基苯甲酰,甲苯酰、糠酰、苯甲酰基、环己烷降莰烷、Z-己酸。为了促进N酰化,在分子的N-末端可以存在1-4个甘氨酸残基。
化合物的C末端的羧基可以被保护,例如,通过酰胺(即C末端羟基替换为-NH2,-NHR2和-NR2R3)或酯(即C末端的羟基替换为-OR2)。R2和R3是独立的脂肪族、取代的脂肪族、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基。此外,与氮原子一起,与来自约0-2个另外的杂原子如氮,氧或硫一起R2和R3可以形成C4到C8的杂环。合适的杂环的例子包括哌啶基,吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基或哌嗪基。C末端保护基团的例子包括-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基2、-N(甲基)(乙基)、-NH(苄基)、-N(C1-C4烷基)(苄基)、-NH(苯基)、-N(C1-C4烷基)(苯基)、-OCH3、-O-(乙基)、-O-(正丙基)、-O-(正丁基)、-O-(异-丙基)、-O-(仲丁基)、-O-(叔丁基)、-O-苄基和-O-苯基。
本发明的肽还可以包含非氨基酸部分,例如,连接于肽上的疏水部分(各种线性的、枝化的、环状的、多环的或杂环碳氢化合物和碳氢化合物衍生物);各种保护基团,特别是线性的化合物,其连接于化合物的末端以减少降解。化合物中存在的化学(非氨基酸)基团可以为了改善各种生理特性;减少降解或清除;减少各种细胞泵的排斥、改善免疫原性活性、改善各种施用模式(如各种序列的连接,所述连接允许穿过各种屏障、内脏等);增加特异性、提高亲合性、减少毒性等而包括。
根据本发明的一个实施方案,本发明的肽连接于持续释放增强剂。示例性的持续释放增强剂包括,但不限于透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)、聚乙二醇(PEG)、甘醇二甲醚和聚异丙烯酰胺。
本发明的肽的氨基酸序列元件与其他非氨基酸试剂的连接可以通过共价连接、通过非共价进行,例如,通过复合至疏水聚合物,其可以降解或裂解,产生能够持续释放的化合物;通过在脂质体或胶粒上捕获肽的氨基酸部分来产生本发明的最终肽。连接可以通过在另一个元件(脂质体,胶粒)中捕获氨基酸序列或在聚合物中渗入氨基酸序列从而产生本发明的最终肽。
本发明的化合物可以是线性的或环状的(成环作用可以改善稳定性)。成环作用可以通过本领域已知的任何方法发生。当化合物主要由氨基酸构成时,成环作用可以通过N-至C-末端,、N末端至侧链和N末端至主链、C末端至侧链、C末端至主链、侧链至主链和侧链至侧链,以及主链至主链来成环。肽的成环作用也可以通过肽中包含的非氨基酸有机部分来发生。
本发明的肽可以是生物化学合成的,例如通过使用标准固相技术。这些方法包括专一固相合成、部分固相合成方法、片段冷凝、经典溶液合成。当肽相对短(即10kDa)和/或不能通过重组技术生产(即,不通过核酸序列编码)时优选使用这些方法,并因此涉及不同的化学作用。
固相多肽合成程序是本领域熟知的,并通过JohnMorrowStewart和JanisDillahaYoung,SolidPhasePolypeptideSyntheses(2ndEd.,PierceChemicalCompany,1984)进一步描述。
合成肽可以通过制备的高效液相层析[CreightonT.(1983)Proteins,structuresandmolecularprinciples.WHFreemanandCo.N.Y.]纯化,并且可通过氨基酸测序来证实其组合物。
重组体技术也可以用于生产本发明的肽和/或多肽。当肽连接于异源蛋白质(即融合蛋白质)时,这些技术可以是优选的,因为重组技术更适合用于生产相对长的多肽(例如,长于20个氨基酸)和对其大量生产。这样的重组技术在Bitter等人,(1987)MethodsinEnzymol.153:516-544,Studier等人(1990)MethodsinEnzymol.185:60-89,Brisson等(1984)Nature310:511-514,Takamatsu等人(1987)EMBOJ.6:307-311,Coruzzi等人(1984)EMBOJ.3:1671-1680和Brogli等人,(1984)Science224:838-843,Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,NY,SectionVIII,pp421-463中描述。在下文中提供异源蛋白质的例子。
为生产本发明的肽和/或多肽,其使用重组技术,将本发明的编码核靶向肽的多核苷酸连接至核酸表达载体,所述载体包含位于顺式调节序列(例如,启动子序列)转录控制下的多核苷酸序列,所述顺式调节序列适合在宿主细胞中指导本发明的多肽的组成的、组织特异性的或可诱导的转录。
短语“经分离的多核苷酸”指的是单链或双链核酸序列,其是经分离的,并且以RNA序列形式、互补多核苷酸序列(cDNA)形式、基因组多核苷酸序列形式和/或复合多核苷酸序列(例如,以上的组合)形式提供。
本文使用的短语“互补多核苷酸序列”指的是一种序列,其使用反转录酶或任何其他RNA依赖的DNA聚合酶由信使RNA反转录产生。这样的序列可以随后在体内或体外使用DNA依赖的DNA聚合酶扩增。
本文使用的短语“基因组多核苷酸序列”指的是衍生自(分离)染色体的序列,并因此其代表染色体的连续部分。
本文使用的短语“复合多核苷酸序列”指的是一种序列,其至少部分是互补的,并至少部分是基因组。复合序列可以包括一些编码本发明的多肽所需的外显子序列,以及掺入其间的内含子序列。内含子序列可以是任何来源,包括其他基因,通常包括保守的剪接信号序列。这样的内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调控元件。
如上文提及的,本发明的多核苷酸序列插入至表达载体中(即,核酸构建体)以能够表达重组肽。本发明的表达载体可以包括另外的序列,所述序列使得该载体适合在原核生物、真核生物或优选在两者中(例如,穿梭载体)复制和整合。通常的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如,启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如,多腺苷酸化信号)。可以理解表达载体还可以包含编码其他多肽的多核苷酸序列,所述多肽转录地连接至本发明的核靶向肽。这样的多肽在下文中进一步描述。
多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统以表达本发明的肽。这些包括,但不限于,微生物,使用例如具有含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌;使用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母;使用包含多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)感染或使用重组质粒表达载体,例如Ti质粒转化的植物细胞系统。
可以理解本发明的多核苷酸还可以在受试者中直接表达(即,体内基因治疗)或可以在体外在细胞系统中表达(自体的或非自体的),并随后施用于受试者。基因治疗技术在下文中进一步描述。
除了含有转录和翻译插入编码序列(编码所述多肽)所需的元件外,本发明的表达构建体还可以包括经工程改造的序列,以优化表达的肽的稳定性、生产、纯化、产量或活性。
可以使用多种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞系统。这些方法通常在Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork(1989,1992),Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.(1995),Vega等人,GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.(1995),Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques4(6):504-512,1986]中描述,并且包括,例如,稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外,正负选择法参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
在有效条件下培养转化的细胞,所述条件允许重组多肽大量表达。有效的条件包括,但不限于,允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指的是可以培养生产本发明的重组多肽的任何培养基。这样的培养基通常包括含有可吸收的碳源、氮源和磷酸源,和合适的盐类、矿物质、金属和其他营养物,如维生素的水溶液。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和陪替氏平皿中培养。培养可以在适于重组细胞的温度、pH和氧含量条件下进行。这样的培养条件在本领域技术人员的知识中。
依赖于生产所需的载体和宿主系统,本发明的生成肽和/或多肽可以保留在重组细胞中、分泌至发酵介质中、分泌至两个细胞膜的间隙中,例如大肠杆菌(E.coli)的周质间隙;或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
随培养预定的时间,对重组肽和/或多肽进行回收。
本文使用的短语“回收重组多肽”指的是收集含有多肽的全部发酵培养基,且不需要暗示另外的分离或纯化步骤。
因此,本发明的肽和/或多肽可以使用多种标准蛋白质纯化技术进行纯化,例如,但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解作用。
为了促进回收,表达的编码序列可以经工程改造以编码本发明的肽,并融合可切割部分。可以设计这样的融合蛋白质而使得多肽可以容易地通过亲和层析分离;例如,通过固定在对可切割部分特异的柱上。当切割位点在多肽和可切割部分之间进行工程改造时,多肽可以用能够特异性地在该位置切割融合蛋白质的合适的酶或剂处理后从层析柱释放(例如,参见Booth等人,Immunol.Lett.19:65-70(1988);和Gardella等人,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990))。
本发明的肽和/或多肽优选以“基本纯净的”形式回收。
本文使用的短语“基本纯净的”指的是允许在本文描述的应用中使蛋白质可以有效发挥作用的纯度。
除了在宿主细胞中合成,本发明的肽和/或多肽还可以使用体外表达系统合成。这些方法是本领域熟知的,并且系统的各组分是商业上可以获得的。
如上文提及的,还可以直接对受试者使用本发明的多核苷酸,其中所述多核苷酸在靶细胞翻译,即基因治疗。
本文使用的基因治疗指的是将目的遗传物质(例如DNA或RNA)转移至宿主以治疗或防止遗传性或后天性疾病或病症或表现型。目的遗传物质编码期望在体内产生的产物(例如蛋白质、多肽、肽、功能RNA、反义)。例如,目的遗传物质可以编码治疗价值的激素、受体、酶、多肽或肽。综述一般参见"GeneTherapy"(AdvancedinPharmacology40,AcademicPress,1997)的文本。
已经发展了基因治疗的两种基本方法:(1)先体外后体内的和(2)在体内的基因治疗。将先体外后体内的基因治疗细胞中从患者体内移除,并在体外培养治疗。通常,通过合适的基因送递载体/方法(转染、转导、同源重组等)和按需要的表达系统,将功能置换基因引入细胞中,并随后将经修饰的细胞在培养基中增殖,然后返回宿主/患者。这些遗传重植细胞在原位置已经显示了表达转染的遗传物质。细胞可以是受试者自体的或非自体的细胞。因为当施用给身体时,非自体细胞可以诱导免疫反应,已经开发了几种方法来降低对非自体细胞排斥的可能性。这些方法包括在移植前抑制接受者免疫系统或将非自体细胞封装入免疫隔离的半透膜内。
体内基因治疗中,靶细胞不是从受试者中取出,而是将遗传物质转移至接受者机体原位的细胞中(在接受者体内)。在一个可选的实施方案中,如果宿主基因是有缺陷的,则基因可以在原位修复(Culver,1998.(抗体stract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,February1998,Coronado,CA)。
这些遗传改变的细胞已经显示在原位表达转染的遗传物质。
为了给予特异性,优选地使用于表达本发明的肽和/或多肽的核酸构建体包含细胞特异性启动子序列元件,例如癌症特异性启动子(例如生存素启动子-Chen等人,CancerGeneTherapy,2004,Volume11,Number11,Pages740-747)。
对于基因治疗,核酸通常通过与病毒剂转染引入到细胞中。这是由于他们的感染特性可以获得更高的效率。此外,病毒是非常特异性的,并通常在特定细胞类型中感染和繁殖。因此,他们的天然特异性可以用于在体内或在组织内或细胞混合培养物内靶向载体至特定细胞类型。病毒载体还可以用特异性受体或配体修饰以通过受体介导的事件改变靶向特异性。
另外,重组病毒载体可用于体内表达期望的核酸,因为他们提供了例如横向感染和靶向特异性的优点。横向感染是例如反转录病毒等的生存周期中固有的,并且是一种单个受感染细胞生产许多出芽和感染相邻细胞的后代病毒颗粒的过程。结果是大区域迅速感染,其中大多数都不是由原始病毒粒子感染的。该情况与垂直型感染相反,垂直型感染中传染物的传播仅通过子代后代。还可以生产没有能力横向传播的病毒载体。如果所需的目的是将特异性基因仅引入局部数量的靶细胞,可以使用该特征。
本发明的核靶向肽可以用来在宿主细胞中调节内源性和外源性多肽的核转位,其包括分裂的(例如细胞系)和非分裂的细胞(例如初级细胞)和真核细胞例如哺乳动物细胞和酵母细胞中。
例如,本发明人已经显示本发明的核靶向肽自发地表现并与内源信号竞争,所述内源信号例如那些包含在c-JunN末端激酶(JNK1/2)和p38促分裂原活化蛋白激酶α/β(P38α/β)中。这导致了所述内源信号的核转位的下调。
因为本发明的肽能够特异地抑制JNK1/2和P38α/β的细胞核内活性而不调节他们的细胞质内活性,这些肽可以用于在细胞中抑制JNK1/2和P38α/β的核活性(例如,细胞凋亡活性,炎症活性),而不损害其他的JNK1/2和P38α/β相关的细胞质活性。因此,本发明的该方面的肽可以提供针对炎症和细胞凋亡相关疾病的治疗剂,而不具有其他JNK1/2和P38α/β抑制剂的副作用。
因此,根据本发明的另一个方面,在此提供了在受试者中治疗炎性病症或免疫病症症的方法,所述方法包括对受试者施用治疗有效量的经分离的肽,从而治疗炎性疾病或免疫疾病。
本文使用的,术语“受试者”指的是哺乳动物受试者,优选地是人。
许多涉及炎症应答的疾病和症状,可以通过上述的方法来治疗。这些疾病和症状在下文中进行总结。
炎性疾病-包括,但不限于,慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
超敏反应相关炎性疾病
超敏反应的例子包括,但不限于,I型超敏反应、II型超敏反应,III型超敏反应,IV型超敏反应、速发型超敏反应、抗体介导超敏反应、免疫复合体介导超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
I型或速发型超敏反应,例如哮喘。
II型超敏反应包括,但不限于,类风湿性疾病、类风湿自身免疫疾病、类风湿性关节炎(KrennV等人,HistolHistopathol2000Jul;15(3):791)、脊椎炎、强直脊椎炎(JanVoswinkel等人,ArthritisRes2001;3(3):189)、系统性疾病、系统性自身免疫疾病、系统性红斑狼疮(EriksonJ.等人,ImmunolRes1998;17(1-2):49)、硬化症、系统性硬化(RenaudineauY.等人,ClinDiagnLabImmunol.1999Mar;6(2):156);ChanOT.等人,ImmunolRev1999Jun;169:107)、腺疾病、腺自身免疫疾病、胰腺自身免疫疾病、糖尿病、I型糖尿病(ZimmetP.DiabetesResClinPract1996Oct;34Suppl:S125)、甲状腺病、自发性自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病(OrgiazziJ.EndocrinolMetabClinNorthAm2000Jun;29(2):339),甲状腺炎自发的自身免疫甲状腺炎(Braley-MullenH.andYuS,JImmunol2000Dec15;165(12):7262),桥本氏甲状腺炎(ToyodaN.等人,NipponRinsho1999Aug;57(8):1810)、粘液水肿、自发粘液性水肿(MitsumaT.NipponRinsho.1999Aug;57(8):1759)、自身免疫再生疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫(GarzaKM.等人,JReprodImmunol1998Feb;37(2):87)、自身免疫抗精液不育(DiekmanAB.等人,AmJReprodImmunol.2000Mar;43(3):134)、重复性流产(TincaniA.等人,Lupus1998;7Suppl2:S107-9)、神经变性的疾病、神经疾病、神经自身免疫疾病、多发性硬化(CrossAH.等人,JNeuroimmunol2001Jan1;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(OronL.等人,JNeuralTransmSuppl.1997;49:77)、重症肌无力(InfanteAJ.AndKraigE,IntRevImmunol1999;18(1-2):83)、原动神经病(KornbergAJ.JClinNeurosci.2000May;7(3):191)、急性感染性多发性神经炎,神经病和自身免疫神经病(KusunokiS.AmJMedSci.2000Apr;319(4):234)、重症肌无力疾病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征(TakamoriM.AmJMedSci.2000Apr;319(4):204)、附肿瘤性神经病疾病、小脑的萎缩、附肿瘤性小脑的萎缩、非附肿瘤性僵硬人综合症、小脑的萎缩、渐进小脑萎缩脑炎、Rasmussen's脑炎、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞蹈病、GillesdelaTourette综合症、多内分泌腺疾病、自身免疫多内分泌腺疾病(AntoineJC.andHonnoratJ.RevNeurol(Paris)2000Jan;156(1):23);神经病、免疫异常神经病(Nobile-OrazioE.等人,ElectroencephalogrClinNeurophysiolSuppl1999;50:419);神经性肌强直、获得性神经性肌强直、关节弯曲多重凹陷(VincentA.等人,AnnNYAcadSci.1998May13;841:482)、心血管疾病、心血管自身免疫疾病、动脉粥样硬化(MatsuuraE.等人,Lupus.1998;7Suppl2:S135)、心肌梗死(VaaralaO.Lupus.1998;7Suppl2:S132)、血栓(TincaniA.等人,Lupus1998;7Suppl2:S107-9)、肉芽肿病、眶坏死性肉芽肿病、动脉炎、Takayasu氏动脉炎和川崎综合症(PraprotnikS.等人,WienKlinWochenschr2000Aug25;112(15-16):660);抗凝血因子自身免疫病(Lacroix-DesmazesS.等人,SeminThrombHemost.2000;26(2):157);血管炎,引起坏死的小型血管炎、显微多血管炎、Churg和Strauss综合症、肾小球性肾炎、少免疫的焦点的坏死血管球性肾炎肾小球肾炎、新月形的血管球性肾炎(NoelLH.AnnMedInterne(Paris).2000May;151(3):178);抗磷脂综合症(FlamholzR.等人,JClinApheresis1999;14(4):171);心力衰竭、类兴奋剂β-肾上腺素能受体抗体心脏衰竭WallukatG.等人,AmJCardiol.1999Jun17;83(12A):75H)、血小板减少性紫癜(MocciaF.AnnItalMedInt.1999Apr-Jun;14(2):114);溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血(EfremovDG.等人,LeukLymphoma1998Jan;28(3-4):285)、胃肠疾病、胃肠道自身免疫疾病、肠疾病、慢性炎症肠道病(GarciaHerolaA.等人,GastroenterolHepatol.2000Jan;23(1):16)、脂泻病(LandauYE.andShoenfeldY.Harefuah2000Jan16;138(2):122)、肌肉系统自身免疫疾病、肌炎、自身免疫肌炎、Sjogren's综合症(FeistE.等人,IntArchAllergyImmunol2000Sep;123(1):92);平滑肌自身免疫病(ZauliD.等人,BiomedPharmacother1999Jun;53(5-6):234)、肝脏疾病、肝自身免疫疾病、自身免疫肝炎(MannsMP.JHepatol2000Aug;33(2):326)和夏科氏肝硬变(StrassburgCP.等人,EurJGastroenterolHepatol.1999Jun;11(6):595)。
IV型或T细胞介导的超敏反应,包括但不限于,类风湿性疾病、类风湿性关节炎(TischR,McDevittHO.ProcNatlAcadSciUSA1994Jan18;91(2):437)、系统性疾病、全身自身免疫疾病、系统性红斑狼疮(DattaSK.,Lupus1998;7(9):591),腺疾病、腺自身免疫疾病、胰腺疾病、胰腺自身免疫疾病、1型糖尿病(CastanoL.andEisenbarthGS.Ann.Rev.Immunol.8:647);甲状腺病、自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病(SakataS.等人,MolCellEndocrinol1993Mar;92(1):77);卵巢疾病(GarzaKM.等人,JReprodImmunol1998Feb;37(2):87),前列腺炎、自身免疫前列腺炎(AlexanderRB.等人,Urology1997Dec;50(6):893)、多腺综合症、自身免疫多腺综合症、I型自身免疫多腺综合症(HaraT.等人,Blood.1991Mar1;77(5):1127)、神经疾病、自身免疫神经疾病、多发性硬化、神经炎、视神经炎(SoderstromM.等人,JNeurolNeurosurgPsychiatry1994May;57(5):544)、重症肌无力(OshimaM.等人,EurJImmunol1990Dec;20(12):2563)、全身肌强直综合征(HiemstraHS.等人,ProcNatlAcadSciUSA2001Mar27;98(7):3988)、心血管疾病、Chagas'病的心脏自身免疫(Cunha-NetoE.等人,JClinInvest1996Oct15;98(8):1709)、自身免疫性血小板减少性紫癜(SempleJW.等人,Blood1996May15;87(10):4245)、抗辅助性T细胞自身免疫(CaporossiAP.等人,ViralImmunol1998;11(1):9)、溶血性贫血(SallahS.等人,AnnHematol1997Mar;74(3):139)、肝脏疾病、肝自身免疫疾病、肝炎、慢性活动型肝炎(FrancoA.等人,ClinImmunolImmunopathol1990Mar;54(3):382)、胆汁性肝硬变、夏科氏肝硬变(JonesDE.ClinSci(Colch)1996Nov;91(5):551)、肾病、肾自身免疫疾病、肾炎、间质性肾炎(KellyCJ.JAmSocNephrol1990Aug;1(2):140)、结缔组织疾病、耳病、自身免疫结缔组织疾病、自身免疫耳疾病(YooTJ.等人,CellImmunol1994Aug;157(1):249)、内耳疾病(GloddekB.等人,AnnNYAcadSci1997Dec29;830:266)、皮肤病、皮肤的疾病、真皮的疾病、大疱的皮肤病、寻常天疱疮、大疱的天疱疮样的和落叶状天疱疮。
迟发型超敏反应的例子包括,但不局限于,接触性皮炎和药疹。
T淋巴细胞介导的超敏反应的例子包括,但不局限于,辅助T细胞和细胞毒性T淋巴细胞。
辅助T细胞介导的超敏反应例子包括,但不局限于,Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。
自身免疫疾病
包括,但不限于心血管疾病、类风湿疾病、腺疾病、胃肠疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经疾病、肌肉疾病、肾疾病、生殖有关疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。
自身免疫心血管疾病例子包括,但不限于动脉粥样硬化(MatsuuraE.等人,Lupus.1998;7Suppl2:S135)、心肌梗死(VaaralaO.Lupus.1998;7Suppl2:S132),血栓(TincaniA.等人,Lupus1998;7Suppl2:S107-9)、眶坏死性肉芽肿病、Takayasu氏动脉炎、川崎综合症(PraprotnikS.等人,WienKlinWochenschr2000Aug25;112(15-16):660)、抗凝血因子自身免疫病(Lacroix-DesmazesS.等人,SeminThrombHemost.2000;26(2):157)、引起坏死小型脉管血管炎,微观的多脉管炎、Churg和Strauss综合症、少免疫的焦点的坏死和新月形肾小球肾炎(NoelLH.AnnMedInterne(Paris).2000May;151(3):178)、抗磷脂综合症(FlamholzR.等人,JClinApheresis1999;14(4):171)、抗体诱导心力衰竭(WallukatG.等人,AmJCardiol.1999Jun17;83(12A):75H)、血小板减少性紫癜(MocciaF.AnnItalMedInt.1999Apr-Jun;14(2):114;SempleJW.等人,Blood1996May15;87(10):4245),自身免疫性溶血性贫血(EfremovDG.等人,LeukLymphoma1998Jan;28(3-4):285;SallahS.等人,AnnHematol1997Mar;74(3):139)、Chagas氏疾病中的心脏自身免疫(Cunha-NetoE.等人,JClinInvest1996Oct15;98(8):1709)和抗辅助T细胞自身免疫(CaporossiAP.等人,ViralImmunol1998;11(1):9)。
自身免疫类风湿性的疾病例子包括,但不限于类风湿性关节炎(KrennV.等人,HistolHistopathol2000Jul;15(3):791;TischR,McDevittHO.ProcNatlAcadSciunitsSA1994Jan18;91(2):437)和强直性脊柱炎(JanVoswinkel等人,ArthritisRes2001;3(3):189)。
自身免疫腺疾病例子包括,但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、Graves'病甲状腺炎、自发的自身免疫甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自发粘液性水肿、卵巢的自身免疫、自身免疫抗精液不育,自身免疫前列腺炎和I型自身免疫多腺综合症疾病、但不限于胰腺的、1型糖尿病自身免疫疾病(CastanoL.andEisenbarthGS.Ann.Rev.Immunol.8:647;ZimmetP.DiabetesResClinPract1996Oct;34Suppl:S125)、自身免疫甲状腺病,Graves'病(OrgiazziJ.EndocrinolMetabClinNorthAm2000Jun;29(2):339;SakataS.等人,MolCellEndocrinol1993Mar;92(1):77)、自发的自身免疫甲状腺炎(Braley-MullenH.andYuS,JImmunol2000Dec15;165(12):7262)、桥本氏甲状腺炎(ToyodaN.等人,NipponRinsho1999Aug;57(8):1810)、自发粘液性水肿(MitsumaT.NipponRinsho.1999Aug;57(8):1759)、卵巢的自身免疫(GarzaKM.等人,JReprodImmunol1998Feb;37(2):87)、自身免疫抗精液不育(DiekmanAB.等人,AmJReprodImmunol.2000Mar;43(3):134)、自身免疫前列腺炎(AlexanderRB.等人,Urology1997Dec;50(6):893)和I型自身免疫多腺综合症(HaraT.等人,Blood.1991Mar1;77(5):1127)。
自身免疫胃肠疾病例子包括,但不限于,慢性的炎症性的肠疾病(GarciaHerolaA.等人,GastroenterolHepatol.2000Jan;23(1):16)、脂泻病(LandauYE.andShoenfeldY.Harefuah2000Jan16;138(2):122)、结肠炎回肠炎和克罗恩氏病。
根据本发明的一个特定实施方案,所述疾病为结肠炎。
自身免疫皮肤的疾病例子包括,但不限于,自身免疫大疱皮肤病,例如,但不限于,寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶状天疱疮。
自身免疫肝脏疾病例子包括,但不限于,肝炎、自身免疫慢性活动型肝炎(FrancoA.等人,ClinImmunolImmunopathol1990Mar;54(3):382)、夏科氏肝硬变(JonesDE.ClinSci(Colch)1996Nov;91(5):551;StrassburgCP.等人,EurJGastroenterolHepatol.1999Jun;11(6):595)和自身免疫肝炎(MannsMP.JHepatol2000Aug;33(2):326)。
自身免疫神经疾病例子包括,但不限于,多发性硬化(CrossAH.等人,JNeuroimmunol2001Jan1;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(OronL.等人,JNeuralTransmSuppl.1997;49:77)、,重症肌无力(InfanteAJ.AndKraigE,IntRevImmunol1999;18(1-2):83;OshimaM.等人,EurJImmunol1990Dec;20(12):2563)、神经病、原动力神经病(KornbergAJ.JClinNeurosci.2000May;7(3):191);急性感染性多发性神经炎和自身免疫神经病(KusunokiS.AmJMedSci.2000Apr;319(4):234)、肌无力、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征(TakamoriM.AmJMedSci.2000Apr;319(4):204);类瘤神经疾病、小脑的萎缩、类瘤小脑萎缩和全身肌强直综合征(HiemstraHS.等人,ProcNatlAcadSciunitsSA2001Mar27;98(7):3988);非类瘤全身肌强直综合征、渐进的小脑萎缩、脑炎、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞蹈病、GillesdelaTourette综合症和自身免疫多内分泌腺疾病(AntoineJC.andHonnoratJ.RevNeurol(Paris)2000Jan;156(1):23);免疫异常神经病(Nobile-OrazioE.等人,ElectroencephalogrClinNeurophysiolSuppl1999;50:419);获得性神经性肌强直,关节弯曲多重的congenita(VincentA.等人,AnnNYAcadSci.1998May13;841:482)、神经炎、视神经炎(SoderstromM.等人,JNeurolNeurosurgPsychiatry1994May;57(5):544)和神经变性疾病。
自身免疫肌肉疾病例子包括,但不限于,肌炎、自身免疫肌炎和主要的Sjogren氏综合症(FeistE.等人,IntArchAllergyImmunol2000Sep;123(1):92)和平滑肌自身免疫病(ZauliD.等人,BiomedPharmacother1999Jun;53(5-6):234)。
自身免疫肾疾病例子包括,但不限于,肾炎和自身免疫间质性肾炎(KellyCJ.JAmSocNephrol1990Aug;1(2):140)。
生殖相关自身免疫疾病例子包括,但不限于,重复性流产(TincaniA.等人,Lupus1998;7Suppl2:S107-9)。
自身免疫结缔组织疾病例子包括,但不限于,自身免疫耳病(YooTJ.等人,CellImmunol1994Aug;157(1):249)和内耳自身免疫疾病(GloddekB.等人,AnnNYAcadSci1997Dec29;830:266)。
自身免疫系统性疾病例子包括,但不限于,系统性红斑狼疮(EriksonJ.等人,ImmunolRes1998;17(1-2):49)和系统性硬化(RenaudineauY.等人,ClinDiagnLabImmunol.1999Mar;6(2):156);ChanOT.等人,ImmunolRev1999Jun;169:107)。
传染性疾病
传染性疾病的例子包括,但不限于,慢性的传染病、亚急性的传染病、急性的传染病、病毒性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫病、真菌病、支原体疾病和朊病毒疾病。
移植排斥疾病
移植排斥相关疾病的例子包括,但不限于,移植排斥、慢性移植排斥、亚急性移植排斥、过急性移植排斥、急性移植排斥和移植物抗宿主疾病。
过敏性疾病
过敏性疾病例子包括,但不限于,哮喘、蜂疹、荨麻疹、花粉过敏、灰尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、乳液过敏、化学品过敏、药物过敏、昆虫叮咬敏症、动物毛发皮屑过敏、带刺植物敏症、毒常春藤过敏和食物过敏。
癌症
癌症例子包括,但不限于,癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症疾病的特别的但不限制的例子:骨髓性白血病如慢性粒性白血病、伴随成熟的急性髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、伴随嗜碱性白细胞提高的急性非淋巴细胞白血病、急性单核细胞性白血病、伴随嗜曙红细胞增多白血病急性髓单核细胞白血病;恶性淋巴瘤,如Birkitt's非Hodgkin's;淋巴细胞白血病,如急性的成淋巴细胞白血病。慢性淋巴细胞性白血病;骨髓及外骨髓增殖的疾病、如实性肿瘤良性的脑膜瘤、涎腺混合瘤、结肠腺瘤;腺癌、如小细胞肺癌、肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠、肉瘤、脂肉瘤、粘液样的、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤(肺泡的)、外骨骼粘液样软骨肉瘤、尤因氏肉瘤;其他的包括双丸状的和卵巢的无性细胞瘤、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤、成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳房、皮肤、前列腺和卵巢。
本发明还预期阻止多肽的核转位,所述多肽内源性地包含本发明确定的信号肽,通过使用敲入策略等将本发明确定的序列进行突变。
另一种调整内源性多肽核转位的方法是通过蛋白质/蛋白质相互作用。因此,例如,核靶向肽与抗体连接,可以被引入细胞中。抗体识别并结合其靶多肽使得靶多肽间接地连接于核靶向肽。
可以理解,如调整内源多肽的转位功能,本发明的肽可以通过接头连接到异源物质上,从而作为载体运输异源物质至细胞核中。可以理解本发明的核靶向肽还可以在细胞中而不是在体外连接至异源物质。因此异源物质可以在核靶向肽施用之前,伴随施用或施用之后施用至细胞。
异源物质可以是靶向细胞核期望的任何材料,例如,药剂如治疗剂、诊断剂或化妆剂。因此,根据本发明的该方面,异源物质可以是多肽、多核苷酸、脂质、碳水化合物、激素、类固醇、小化学品,病毒和其任何组合等。
根据本发明该方面的一个实施方案,异源物质是多肽。多肽可以是,例如,永生化蛋白质(例如、SV40大T抗原和端粒酶)、抗细胞凋亡蛋白质(例如,突变p53和Bcl.sub.xL)、抗体、致癌基因(例如,ras、myc、HPVE6/E7和腺病毒E1a)、细胞周期调节蛋白(例如,细胞周期素和细胞周期素依赖蛋白激酶)、或酶(例如,绿色荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶)。
根据本发明的该方面的另一个实施方案,异源物质是核酸。该核酸可以是,例如,RNA、DNA或cDNA。核酸的序列可以是编码或非编码序列(例如,反义寡核苷酸)。
将核酸安全和有效转移进入细胞的能力是生物技术中的一项基本目标。当前的合成递送系统虽然安全,但是相对低效的。有效基因递送的一个主要障碍是将遗传物质靶向至细胞核。在目前的基因递送方法中,DNA通过扩散从细胞质向细胞核移动,这是较慢的过程,在此过程中遗传物质暴露于降解的细胞质环境中。已经实现了通过掺入核靶向肽上调核酸核转位的效率,参见,例如Zanta等人,PNAS,Vol.96,Issue1,91-96,January5,1999;Subramanian,A.等人,(1999)Nat.Biotechnol.17:873-877。
因此本发明人预想本发明的核靶向肽将增加各种转染方案的效率,其包括但不限于显微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE右旋糖酐引入、脂质体介导的引入、病毒介导引入、裸DNA注射和生物射弹轰击。
根据本发明的该方面的还另一个实施方案,异源物质是病毒。病毒可以是全病毒或含有病毒核酸的病毒核心(即,包装的病毒核酸,但没有病毒包膜)。可以被运输的病毒和病毒核心的例子包括,但不限于,乳头状瘤病毒、腺病毒、杆状病毒、反转录病毒核心、和Semliki病毒核心。
根据本发明的该方面的还另一个实施方案,异源物质是小分子。所述小分子可以是,例如,放射性核素、荧光标记物或染料。
根据本发明的该方面的另一个实施方案,异源物质是药物递送系统,、例如,磁性颗粒、二氧化硅珠、PLGA、纳米球或微球、壳聚糖等。
根据本发明的该方面的还另一个实施方案,异源物质是亲合部分,例如抗体、受体配位体或碳水化合物。当期望使用核靶向肽靶向具体细胞类型时,亲和部分与本发明的核靶向肽之间的连接是特别有益的。根据本发明的该方面可以使用的抗体的例子包括但不限于肿瘤抗体、抗CD20抗体和抗IL2Rα抗体。示例性的受体包括,但不限于叶酸受体和EGF受体。根据本发明的该方面可以使用的示例性的碳水化合物为凝集素。
根据本发明的该方面的还另一个实施方案,异源物质是可检测部分。
可检测部分可以是直接可检测的,通常通过发出其具体波长的辐射(例如荧光剂、磷光剂或化学发光剂)。可选地,可检测部分可以非直接可检测的。例如,可检测剂部分是酶促反应的底物,其能够产生可检测的产物。
可以理解本发明的核靶向肽可以直接和/或间接地与不止一个异源物质连接。
异源物质可以通过本领域已知的并适合用于特别的异源物质的任何方法与本发明的核靶向肽连接。因此例如,如果异源的物质是多肽,接头可以包含肽键或取代肽键,如上文所述的。如果该异源物质是小分子,接头可以包含非肽键。
连接方法的例子包括,但不限于,化学交联法、遗传融合和桥接。
化学交联法:同源双功能交联接头或异源双功能交联接头可以用于交联本发明的核靶向肽与异源物质。在核靶向肽运输该异源物质通过细胞膜后,同源双功能或异源双功能交联接头可以可切割的促进核靶向肽从异源的物质上分离。同源双功能交联接头有至少两个同一的反应基团。使用的同双功能交联剂可以导致自共轭,分子内的交联和/或聚合。同双功能交联接头主要是伯胺反应(例如,亚氨酸酯、N–琥珀酰酯、异硫氰酸酯、羧酸类和磺酰氯)或巯基反应(例如,2–二硫基吡啶、3-硝基-2–二硫基吡啶顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、芳基卤、二硝基氟苯、有机汞制剂、对氯汞苯甲酸、双马来酰亚胺正己烷、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、和1,4-二(3'-(2'-二硫代吡啶)-丙酰胺基)丁烷)。同双功能亚氨酸酯例子包括,但不限于二甲基己二亚酰胺、二甲基辛二亚酰胺和二硫代双丙亚胺。同双功能NHS酯的例子包括,但不限于,二琥珀酰亚胺戊二酸、双琥珀酰辛二酸、二(琥珀酰亚砜)辛二酸、二硫基二(琥珀酰丙酸盐)和双琥珀酰酒石酸。
异双功能交联接头拥有两个或更多个不同的反应基团,其允许与特定的基团连续共轭,因此将不期望的聚合或自共轭最小化。一些异双功能交联接头在一个末端进行胺反应,在另一末端进行巯基反应。这样的交联剂的例子包括,但不限于琥珀酰亚胺4-(N–马来酰亚胺基甲基)环己烷--羧酸酯、m–马来酰亚胺基苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯、双马来酰亚胺基己烷和N-(g-马来酰亚胺基丁酰氧)琥珀酰亚胺酯。
同双功能和异双功能交联反应可以在添加连接同双功能或异双功能交联剂至核靶向肽之后停止。可以通过本领域熟知的方法将核靶向肽与同双功能或异双功能交联剂纯化,且用作添加异源物质的原料。这样的连接同双功能或异双功能交联剂的纯化的核靶向肽可以以等分试样储存在,例如-20℃,并随后解冻。一旦解冻,可以通过完成交联反应添加异源物质。
基因融合:基因融合可以通过连接核靶向肽的框内编码序列与多肽异源物质的编码序列连接产生。本领域中存在很多将编码序列连接在一起的方法。示例性的方法包括,但不限于,聚合酶链式反应(PCR)、拼接PCR和限制性核酸内切酶消化和连接。优选地,核靶向肽的阅读框和异源物质在框架内并转录地融合。
核靶向肽和多肽异源物质之间可以包括蛋白酶切割位点。这样的蛋白酶切割位点的例子包括,但不限于Xa因子和烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶。
桥联分子:可以使用成对的桥联分子使核靶向肽和异源物质复合。这样的成对的例子包括,但不限于,(a)抗生蛋白链菌素和生物素、(b)谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶和(c)聚组氨酸和亲和层析剂(例如,四次氮基三乙酸(NTA)或亚氨基二乙酸(IDA)),其通过离子如Ni+2相互作用。核靶向肽可以连接到成对的任一成员上,且异源物质连接到另一个桥联分子。例如,如果核靶向肽连接在谷胱甘肽-S-转移酶上,随后负载物连接到谷胱甘肽。可选地,核靶向肽可以连接到抗生蛋白链菌素,且异源物质可以连接到生物素。核靶向肽与抗生蛋白链菌素可以通过本领域已知的用于连接肽和桥分子的任意方法进行连接。这样的方法例子包括,但不限于,化学交联或遗传融合。异源物质随后通过本领域已知的生物素化小分子、蛋白质或核酸的任意方法,例如化学交联与生物素连接。核靶向肽/异源物质复合物可以通过将核靶向肽-抗生蛋白链菌素与生物素化的异源的物质接触形成。
核靶向肽和异源物质可以在核靶向肽或异源物质的任意位置化学地或使用成对桥联分子复合,只要保证核靶向肽或异源物质的功能性不被破坏。例如,交联剂将与位于氨基末端或羧基末端(对于蛋白质)、位于5'端或3'端的(对于核酸)或位于整个分子的合适的官能团反应。
本领域技术人员将能够确定核靶向肽/异源的物质复合物的各部分是否保留了生物活性。如果核靶向肽能够将连接的异源物质转位至细胞核,则核靶向肽保留了其生物学活性。转运活性可以通过,例如,添加核靶向肽/异源物质复合物至细胞并测定细胞以确定异源物质是否被递送至细胞核中,其使用本领域已知的方法来测定,例如,免疫组织化学染色。异源物质可以分析其活性,使用适于此类型异源物质的方法(例如,对于酶进行酶活性测定,对于癌基因蛋白质进行转化分析,对于抗细胞凋亡蛋白质进行抗细胞凋亡测定,对于永生化蛋白质进行永生化测定)。这些测定都是本领域熟知的,并描述于Sambrook等人,1989andAusubel等人,1989中。
如果核靶向肽和多肽异源物质是基因操作连接的,该多肽负载部分可以复合至核靶向肽的氨基的末端或核靶向肽的羧基末端。优选地,多肽负载部分复合至核靶向肽的N末端。
本发明的核靶向肽可以直接施用于细胞本身或作为药物组合物的一部分,所述药物组合物与药物可接受载体混合。
本文使用的“药物组合物”指的是本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组分如生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。
本文的术语“活性成分”指的是本发明的核靶向肽,其单独地或与异源试剂连接;或是编码所述肽的多核苷酸,其用于产生生物学效应。
在下文中,短语”生理学可接受载体”和“药物可接受载体”可以互换使用,指的是不会对生物造成显著刺激的载体或稀释剂,也不会使施用的化合物生物活性和性能丧失。佐剂也包括在这些短语范围内。一种药物可接受载体中的成分例子可以是例如聚乙二醇(PEG),具有有机介质的和水介质两者的广范围的溶解度的生物相容的聚合物(Mutter等人(1979)。
本文的术语“赋形剂”指的是添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的例子,但不限于,包括碳酸钙、磷酸钙、各种的糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物配制和施用的技术可以在"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,PA,latestedition中找到,其在此通过引用并入本文。
合适的施用途径可以,例如,包括口服、直肠、引入粘液质、经鼻的、肠的或肠胃外的递送,包括肌肉、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、子宫内,或眼内注射。
可选地,可以在局部而不是全身施用该制剂,例如,通过直接在患者身体的特定区域注射制剂。
重组载体可以以多种方法施用。例如,如果使用的载体包含细胞特异性启动子,施用的方法可以利用其靶向特异性并因此不需要在疾病位置局部施用。
本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的制造方法来制备,例如,通过常规的混合、溶解、粒化、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干处理。
根据本发明使用的药物组合物可以使用传统的方法配制,其使用一种或多种生理学可接受载体,其包括可药物地使用的赋形剂和辅剂,其促进活性成分进入制剂的过程。合适的制剂取决于选择的施用途径。
对于注射,本发明的活性成分可以配制在水溶液中,优选地是生理学相容的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏液或生理盐水缓冲液。对于转化粘液质施用,在制剂中使用合适对屏障渗透的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服施用,该化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药物可接受载体组合配制。这些载体能够使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等,用于由患者口服摄取。用于口服的药物制剂可以使用固体赋形剂制备,如果需要,任选地研磨形成的混合物,并在添加合适的辅剂之后加工成颗粒混合物,以获得片剂或糖衣丸的核。具体地,合适的赋形剂是,填料例如糖,其包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇;纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠;和/或生理地可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望,可以添加崩解剂,例如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐类例如海藻酸钠。
糖衣丸具有合适的包衣。为了该目的,可以使用浓缩糖溶液,其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣丸包衣添加着色剂或色素,用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括明胶制的推合胶囊(push-fitcapsule)以及明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制备的软的,密封的胶囊。推合胶囊可以包含活性成分混合有填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地,稳定剂。软胶囊中,活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中,如脂肪油类、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外,可以添加稳定剂。口服施用的全部配方都应该是适合所选施用途径的剂量。
对于口腔施用,组合物可以是以传统方法配制的片剂或锭剂形式。
对于经鼻施用,根据本发明的活性成分方便地以来自压缩包的喷雾剂形式或使用合适推进器的气雾剂递送,例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烯或二氧化碳。在加压气溶胶的情况中,剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量确定。例如,在分配器中使用的明胶制成的胶囊和盒,可以配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文描述的制剂可以配制用于肠胃外施用,例如,通过快速浓注或连续输注。注射制剂可以是单位剂型存在,例如,以安瓿或在任选添加防腐剂的多剂量容器中。组合物可以是在油或水媒介中的悬浮液、溶液或乳剂,并可以含有配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
肠胃外施用的药物组合物包括以水溶形式的活性剂的水溶液。另外地,活性成分的悬浮液可以作为合适的油基或水基注射悬浮液配制。合适的亲脂性的溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、三酸甘油酯或脂质体。水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘性的物质,如羧甲基纤维素钠盐、山梨糖醇或葡聚糖。可选地,悬浮液也可以含有合适的稳定剂或提高活性成分可溶性的试剂,其允许高高浓度溶液的制备。
可选地,在使用前活性成分可以是粉末形式,用于与合适的媒介物,例如无菌的、无热原的水基溶液构建。
本发明的制剂还可以配制成直肠施用组合物,如栓剂或灌肠制剂,使用例如常规的栓剂基础例如可可脂或其他的甘油酯。
本发明背景下适合使用的药物组合物包括其中以实现意图目的有效量含有的活性成分的组合物。更具体地,治疗有效量意指对防止、减轻或改善病症或延长受治疗的受试者的生存的活性成分的量。
确定治疗有效剂量在本领域技术人员能力之内。
对于本发明的方法中使用的任何制剂,治疗有效量或剂量可以首先根据体外测定评估。例如,剂量可以在动物模型中配制,且这样的信息可以用于更准确地确定可用于人的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养物中或实验动物中进行标准药物程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制在人中使用的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和施用途径而变化。精确的配方,施用途径和剂量可以由医生根据患者状况选择。[参见,Fingl,等人,(1975)"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1p.1]。
取决于受治疗的状况的严重性和应答,可以以单剂量或多剂量施用,治疗过程持续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的降低。
施用的组合物的量,当然将取决于受治疗的对象、痛苦严重性、施用方式、处方医生的判断等。
可以理解本发明的多肽和多核苷酸可以与其他的活性剂一起提供给个体,以实现相比分别使用各自剂治疗改善的治疗效果。在这样的治疗中,量度(例如,补充剂的剂量和选择)可以与组合治疗相关的不良副作用。
还可以制备将包括本发明的制剂配制于适合的药物载体中的组合物,将其放置在合适的容器中,并标记用于治疗指示的状况。
如果期望,本发明的组合物,可以存在于包装或分配装置中,例如FDA批准的试剂盒,其可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可以例如,包含金属或塑料薄膜,如薄膜包装。包装或分配装置可以附有施用说明。包装或分配装置可以还包含一个连接于容器上的政府部门管理该药物的生产、使用或销售的注意事项,该注意事项反映了政府批准该组合物或人或兽医的施用形式。这样的注意事项,例如,可以通过U.S.FoodandDrugAdministration批准标记用于处方药或插入批准的产品。
本文使用的,术语“约”指的是±10%。
术语“包含”、“包括”“具有”以及他们的结合意思是“包括但不限于”。
术语“由……组成”指的是“包含并且限于……”。
术语“基本上由…组成”指的是组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分,但是仅当这些另外的组分、步骤和/或部分不实际改变要求保护的组合物、方法或结构的基本的或新型的特征时。
本文使用的,术语“方法”指的是完成给定目标的手段、方法、技术和步骤,其包括,但不限于,那些化学、药理、生物、生物化学和医学领域技术人员已知的方式,方法,技术和步骤,或很容易从已知的方式、方法、技术和步骤中发展出的那些方法。
本文使用的,术语“治疗”包括终止、基本抑制、减缓或逆转状况的进程,基本改善症状临床症状或表现症状,或基本上防止出现临床或表现症状。
可以理解本发明的特征,为了清楚地说明,在各个实施方案的范围中进行了描述,可以在单个实施方案联用中也进行了提供。反之,本发明的各种特征,为了简洁,在单个实施方案的范围内进行了描述,也可以分别地或任意再组合或以任何本发明其他的实施方案中所描述的内容中提供。各种实施方案的范围内特定特征的描述不应认为是那些实施方案的基本特征,除非在没有那些要素时该实施方案无法进行。
在前文进行描述,并在下文的权利要求部分进行了要求的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中发现了实验支持。
实施例
给出了针对以下的实施例的参考,其与上文描述一同以非限制性的方式阐明了本发明的一些实施方案。
通常地,本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中得到了详细解释。参见,例如,"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等人,(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel等人,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等人,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等人(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美国专利号4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057所示的方法;"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis,J.E.,ed.(1994);"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition;"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994);Stites等人(eds),"BasicandClinicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);MishellandShiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);可以得到的免疫学测定在专利和科学文献中进行了深入描述,参见,例如美国专利号3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984);“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,和HigginsS.J.,eds.(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.,和HigginsS.J.,eds.(1984);"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等人,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);所有的这些文献在此通过全文引入并入本文。其他的常规参考在本文档中也有提供。这些操作过程相信是本领域熟知的,并为读者便利而提供。本文包含的所有信息通过引用并入本文。
材料与方法
DNA构建体与突变:将GFP-JNK1/2、p38α/β克隆至pEGFP-C1(Clontech,MountainView,CA)。从HeLa细胞中扩增JNK1/2和p38α/β序列,JNK2和p38β侧翼为EcoRI/BamHI,且JNK1和p38α侧翼为XhoI/BamHI酶切位点。JNK1/2和p38α/β的点突变通过定点突变执行。将GST-JNK1/2、p38α/β克隆至pGEX-2T载体(GEhealthcare,Buckinghamshire,UK),侧翼为SpeI/NotI限制性位点。使用特异性引物执行GFP-p38α的N和C末端的缺失突变,以构建Δ7/Δ20/Δ30N末端缺失突变或Δ40的C末端缺失突变。将输入蛋白3、7和9克隆至pEGFP-C。使用特异性引物将输入蛋白7和9从HeLa细胞cDNA中扩增,输入蛋白7侧翼为BamHI/SalI限制位点,输入蛋白9侧翼为XhoI/SalI限制位点。输入蛋白3从Forchheimer库质粒集合中获得,并使用侧翼为XhoI/EcoRI限制位点的特异性引物扩增。
细胞培养和转染:HeLa和MCF7细胞在使用有2mML-谷氨酰胺,1%Pen/Strep和10%胎牛血清(FBS)补充的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中培养。HB2细胞在添加氢化可的松(0.5mg/ml)和胰岛素(10μg/ml)的相同培养基中培养。MCF10A细胞在添加5%马血清、EGF(200ng/ml)、氢化可的松(0.5mg/ml)、霍乱菌毒素(100ng/ml)、胰岛素(10μg/ml)、2mML-谷氨酰胺、1%pen/strep和10%FBS的DMEMF-12培养基中培养。所有细胞均在37℃、95%空气湿度和5%CO2环境中维持。HeLa细胞用聚乙烯亚胺(Sigma)进行转染。siRNA用Dharmafect(ThermoFisherScientific,CO,USA)进行转染。
免疫荧光显微术:将细胞在3%仲甲醛的PBS溶液中固定(20分钟,23oC),并在含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中温育(15分钟,23oC),随后用TritonX-100(PBS中浓度为0.1%,5分钟,23oC)透化。随后将固定的细胞与初级抗体温育(60分钟,23oC),用PBS洗涤三次,与罗丹明-共轭二级抗体和DAPI温育(60分钟,23oC)。通过荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观测载玻片。并使用Photoshop(Adobe,CA,USA)进行原始数据图像的背景校正、对比度调节。
免疫共沉淀反应:HeLa细胞生长至分汇合,血清-饥饿(0.1%FBS,16小时),并随后用其他药物刺激或处理。细胞抽提物按照如前所述的方法产生,并与预先连接有特异性抗体(1小时,23oC)的A/G-琼脂糖珠子(SantaCruzBiotechnology)共同温育2小时(4oC,震荡)。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤结合的A/G珠子三次。经IP的珠子随后使用1.5X样品缓冲液重悬并煮沸;使用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析分解蛋白质。
邻近连接测定(PLA):使用DuolinkPLA试剂盒(OlinkBioscience)根据生产商的方案分析蛋白质-蛋白质相互作用。简言之,使细胞如描述的生长、固定和透化处理。随后将样品与针对两种受检测的蛋白质的初级抗体进行温育(60分钟,23oC)、洗涤(0.01MTrisHClpH7.4,0.15MNaCl和0.05%吐温20),并随后使用特异性探针温育(60分钟,37oC),然后使用DAPI染色以观察细胞核,并使用缓冲液B:0.2MTrisHClpH7.5,0.1MNaCl洗涤。通过荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)可观测到作为区别的荧光点的信号。使用Photoshop(Adobe)和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和荧光信号的定量。
体外相互作用:HeLa细胞长至分汇合,血清-饥饿(0.1%FBS,16小时),并随后使用其他药物或刺激处理。将细胞提取物如描述的生产,并与预先与特异性抗体连接(1小时,23oC)的A/G-琼脂糖小珠温育2小时(4oC)。将结合的A/G小珠随后使用RIPA缓冲液洗涤一次,然后使用0.5MLiCl洗涤两次,并使用缓冲液A.洗涤两次。结合的A/G小珠随后在含有0.01%BSA的缓冲液A中重悬并等分。GST标记蛋白质与小珠温育2小时(4oC),随后在1.5X样品缓冲液中洗涤并重悬,并煮沸。
凝胶过滤:使HeLa细胞血清饥饿(如上文),随后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml,15分钟)和TPA(250nM,15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各个处理25mg)负载于16/60superdex200大小的柱(流速1ml/分钟),并收集1ml级分。使用具有合适抗体的蛋白质印迹分析级分。
统计学分析:数据用平均数+S.E表达。统计学评估使用泛函分析和Studentt检验(双尾)检测对照和实验结果之间的差异。p<0.05的值被认为是统计学显著的。
实施例1
JNK和p38使用不依赖NTS机制转位至细胞核中
在寻找不依赖NLS的穿梭蛋白质中,本发明人查找了JNK1/2和p38α/β的亚细胞定位。使用具有特异性抗体(Ab)的免疫染色发现,与ERK1/2相似,JNK1/2和p38α/β主要定位于静止细胞的细胞质中(图7A和图8A-B)。使用应激或促有丝分裂刺激物(分别地茴香霉素和TPA)处理细胞,在所有四种MAPK同种型中观察到了快速而强劲的核转位,在他们的转位动力学中仅有较小的差异。有趣地,该转位与JNK1/2和p38α/β活化磷酸化作用无关(图7B),指示这四种MAPK的转位机制与ERK1/2的不同。此外,JNK或p38蛋白质均不包含NTS,并且仅有两种,JNK2和p38β,在相同的激酶区域含有可磷酸化序列(T-P-S)。然而,JNK1/2和p38α/β与ERK1/2之间显著的序列和构型相似性可以表明前者在他们的激酶插入域仍使用NTS样序列用于转位。为了排除这种可能性,本发明人在所有的四个MAPK中将JNK1或p38α中的磷酸化的NTS比对残基突变为均突变为Ala或Glu残基。与ERK1/2不同,这些突变的过表达导致与WT蛋白质相似的分布(图9),指示JNK1/2和p38α/β不仅在从锚蛋白质上释放不同,而且他们的转位机制也不同。
实施例2
刺激后JNK1/2和p38α/β与Imp3、7和9的相互作用
缺乏ERK1/2样NTS,以及标准的或任何非典型的NLS,和JNK1/2和p38α/β不能与Impa或Impb直接或间接相互作用,促使寻找他们转位作用的实际机制。因为β-样Imp(下文表3)已经涉及信号蛋白质的刺激转位,假设这些Imp中的一种或多种涉及到所述过程。为了检验这一假设,使用免疫共沉淀反应(CoIP)筛选检测他们中的任一是否与JNK1/2和p38α/β相互作用。除了在这些测试细胞中Imp的表达,没有在静止HeLa细胞中检测到显著的Imp/MAPK相互作用(图1A)。然而,在受刺激HeLa细胞的提取物中,JNK1/2和p38α/β的IP展示了所有四个MAPK与Imps3、7和9的相互作用的多个程度。重要地,筛选和其他IP实验证明在组分间的缔合或相互作用的时间上仅有小的差异,表明他们之间的相似调节模式。
表3
Impβ-样蛋白质列表
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为了验证这些相互作用,在MCF7细胞中重复CoIP实验,并在HeLa细胞中检测表达的MAPK与Imp的相互作用。两个实验均证实Imp3/7/9的IP不仅对内源HeLa蛋白质是特异的(图10A-B)。另外,执行邻近连接测定(PLA),其是蛋白质-蛋白质相互作用研究的不依赖CoIP的工具。类似于CoIP的结果,在测试的Imp和MAPK之间没有检测到显著的基本相互作用(图1B)。然而,茴香霉素或TPA刺激引起JNK1/2或p38α/β与Imps3/7/9之间的相互作用的显著增加。如预计的Imps的穿梭作用,相互作用主要在细胞质和核周区域发现。这些结果表明Imp3/7/9与MAPK的刺激的相互作用首先发生在细胞质中,输入蛋白在穿梭时或在转位之后立即从MAPK脱离。
实施例3
Imp3、7和9是JNK1/2或p38α/β转位至细胞核所需的
为了进一步证实Imp3/7/9在JNK1/2或p38α/β的核转位中的作用,使用他们的Si-RNA执行敲除实验。将Imp5敲除。且将不相关的Si-RNA作为对照。四种测试Imp的Si-RNA的相应Imp量在48小时内减少超过85%(图2A-C)。这些敲除在静止细胞中没有影响内源JNK1/2或p38α/β的胞质定位。然而,敲除Imp3/7/9,而不是Imp5或Si-对照,显著调整了测试的MAPK的受刺激的核穿梭。敲除Imp3抑制了约80%细胞的转位作用,而Imp7和Imp9的Si-RNA仅抑制了~60%的转位作用。为了进一步研究敲除Imp3/7/9对JNK1/2或p38α/β转位作用的影响,本发明人检验了核JNK/p38底物c-Jun、ATF-2和MEF2A的磷酸化作用。重要地,全部三种Si-RNA显著抑制了这些转录因子的刺激-诱导的磷酸化作用,虽然Imp3的Si-RNA的效果比Imp7/9的效果略高(图2C)。在任何其他的蛋白质的检验中没有发现Si-RNAs对ERK靶C-Myc(图11)的效果或其他的非靶效果。因此,其显示三种Imp对JNK1/2和p38α/β的转位作用是重要的,虽然Imp3的作用可以更一般。
为了参与转位过程,可以不同于Impα/β,在刺激下Imps3/7/9改变他们的定位。的确,发现(图12A-B)对HeLa和HB2细胞的刺激引起Imp3/7/9从细胞质到核周区(Imp3),或进入细胞核(Imp7/9)。Impβ定位完全不受刺激影响。这些结果表明所有三个Imp对JNK1/2或p38α/β的核转位来说都是重要的,其可以通过交换,或可以通过转位复合物的形成来发挥作用。最后,如依赖b-类似Imp在Ran活性中预期的,使用Ran的Si-RNA,发现JNK和p38的转位确实是Ran-依赖的(图13)。这些观测暗示β-样Imp在应激-和促有丝分裂的-诱导过程中的作用,表明他们在细胞刺激下可以调节转录。
实施例4
通过特异性N-末端序列,JNK1/2和p38α/β与Imp7或Imp9相互作用
为了获得对MAPK-Imp相互作用的更好的了解,本发明人研究了GST-p38α/β和GST-JNK1/2与从不受刺激或受刺激的HeLa细胞的提取物中的Imp的体外相互作用。虽然预期MAPK与来自受刺激的细胞的Imp7/9相互作用,但是没有检测到与Imp3的体外相互作用(图3A)。此外,CoIP实验展示Imp3对于JNK和p38与Imp7/9的相互作用不是必须的(图3B相对于图1)。这些结果表明JNK和p38仅与Imp7或Imp9直接相互作用,并且该相互作用不需要Imp3。
本发明人接下来对JNK和p38上介导与Imp7和Imp9相互作用的位点进行确定。为了该目的,将靠近p38α激酶结构域的C和N末端区域的各区域缺失,并且检测这些缺失对其在亚细胞定位和激酶的输入蛋白相互作用中的影响(图14A-C)。N和C末端结构域两者的缺失都会导致p38α的胞质定位,然而,仅有N末端缺失(AA1-30)防止了刺激性转位和Imp7/9相互作用,指示了该区域对转位的重要性。为了定位转位所需的正合序列,发明人进一步细分了N-末端,通过缺失激酶首先的7个或20个残基。重要地,这两个另外的突变没有影响转位或与Imp7/9的结合,显著表明重要的序列位于p38α的第20位-第30位残基。
为了进一步研究MAPK的核转位中确定区域的作用,本发明人合成了一条基于p38α的21-34残基序列肽序列:Myr-PERYQNLSPVGSGA-SEQIDNO:16)的14个氨基酸的肉豆蔻酰化的肽。因为该区域在p38b以及JNK1和JNK2中相似,假设其应当与所有四个MAPK和Imp7/9的相互作用相竞争,并从而影响他们的核转位。的确,当该肽在刺激前应用于HeLa细胞时,其阻止了检验的MAPK的核转位(图4A)和Imp7/9相互作用(图4B)。因此,这些结果清楚地证实JNK/p38同种型中氨基末端调节核转位的重要性,并且表明该肽可以用于研究转位的作用和其临床参与。
实施例5
Imp7/9-JNK/p38复合物与磷酸化Imp3相互作用
MAPK与Imp3/7/9在细胞中的相互作用(图1A-B)提出了一个问题,即每个输入蛋白在核转位过程的作用是什么。事实是Imp3的SiRNA比Imp7/9的siRNA具有更高的效果(图2A-C),Imp3不与JNK1/2或p38α/β在体外直接相互作用(图3A),且Imp3不是MAPK与Imp7/9的相互作用所需的(图3B),导致产生这样一种假设,MAPKs结合至Imp7或Imp9,随后Imp3加入二聚体使其进行核转位。
为了验证该假设,并确立内源Imp3/7/9之间的复合物形成,本发明人通过PLA监控这些可能的相互作用。在静止HeLa细胞中没有检测到任何测试输入蛋白之间的相互作用(图5A,B)。然而,在刺激后会发生显著改变,其诱导了Imp3和Imp7或Imp9之间的相互作用,但Imp7和Imp9之间没有。这些结果随后通过受刺激的HeLa细胞提取物的CoIP实验进行了确认。有趣地,来自未受刺激或刺激细胞的重组Imp7和Imp9与Imp3的体外相互作用(图5D)证明在刺激后Imp3被修饰,使得其可以发生相互作用。使用碱性磷酸酶(CIP)处理细胞提取物减少了相互作用,显著指示Imp3与Imp7/9的相互作用需要Imp3的磷酸化。
实施例6
MAPK-Imp相互作用的凝胶过滤分析
为了进一步验证该机制,执行凝胶过滤以将未结合的蛋白质从更高MW的复合物分离。的确,来自静止细胞的Imp3/7/9显示了他们预期的单体MW(Imp3:约90kDa;Imp7/9:约120kDa;图5A)。Imp3也显示了约160kDa的峰,其可以代表蛋白质的同源或异源二聚体/三聚体。有趣的是,在另一个220-400kDa(指定为约280kDa)的峰发现了少量的所有三种未受刺激的Imp(图6A)。相对宽的约280峰可以对应于Imps的二聚体,或包含Imps的二聚体与其他的30-80kDa蛋白质(例如MAPKs)的异源三聚体,或Imps与任意高MW蛋白质(100-200kDa)的复合物。重要的是,来自刺激细胞提取物的各种峰的Imps的相对量都发生了显著的改变。因此,较低MW峰的Imps3/7/9的量显著减少,而较高的那些对相应升高。平行地,在刺激后JNK和p38从约40kDa的尖峰变成了很宽的峰(图15A-B)。
为了确定Imp和MAPK的较高MW峰是由(至少部分地)MAPK和Imp的二聚体之间的相互作用形成,执行了CoIP实验。正期望的,在约120kDa峰没有发现组分之间的结合(图6B);在Imp3的较高的MW峰(约160kDa)也是该情况。在另一方面,来自刺激的、280kDa峰的Imp3/7/9免疫共沉淀JNK和p38蛋白质。另外,Imp3于Imp7和Imp9两者CoIP,而在Imp7和Imp9之间没有发现相互作用。还在较高MW部分中观察到Imp7和Imp9之间缺少相互作用,清楚地指出在刺激后没有形成Imp3/7/9三聚体。在不同的刺激下没有观测到MAPK/Imp结合亲合性上可区分的刺激,指示了二聚体与MAPK的剩余活性。这些结果进一步支持了该观点:在刺激后Imp3与Imp7/MARK或Imp9/MAPK二聚体相互作用,并且异源三聚体是合适转位至核中所需的。
实施例7
肉豆蔻酰化肽治疗结肠炎的用途
材料和方法
细胞培养和转染:将HeLa细胞培养于补充有2mML-谷氨酰胺、1%Pen/Strep和10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中。
免疫荧光显微术:将细胞在3%仲甲醛的PBS溶液中固定(20分钟,23oC),并在含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中温育(15分钟,23oC),随后用TritonX-100(PBS中浓度为0.1%,5分钟,23oC)透化。将固定细胞与初级抗体(60分钟,23oC),用PBS洗涤三次,与罗丹明-共轭二级抗体和DAPI温育(60分钟,23oC)。之后用荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观察载玻片。使用Photoshop(Adobe,CA,USA)执行原始数据图像的背景校正和对比度调节。
DNA构建体和突变。将GFP-JNK1/2、p38α/β克隆至pEGFP-C1(Clontech,MountainView,CA)。从HeLa细胞cDNA中扩增JNK1/2和p38α/β序列,并对JNK2和p38β由EcoRI/BamHI作为侧翼,对JNK1和p38α由XhoI/BamHI作为侧翼。JNK1/2和p38α/β的点突变通过定位诱变执行。将GST-JNK1/2、p38α/β克隆至pGEX-2T载体中(GEhealthcare,Buckinghamshire,UK)并由翼SpeI/NotI限制位点作为侧翼。GFP-p38α的N或C末端缺失突变使用特异性引物来构建Δ7/Δ20/Δ30N-末端缺失突变或Δ40C-缺失突变。将输入蛋白3、7、9克隆至pEGFP-C。使用特异性引物从HeLa细胞cDNA中扩增输入蛋白7和9,其使用对输入蛋白7引由BamHI/SalI作为侧翼的特异性引物、对输入蛋白9由XhoI/SalI作为侧翼的特异性引物。从Forchheimer库质粒保存站获得输入蛋白3,使用由XhoI/EcoRI作为侧翼的特异性引物进行扩增。
肉豆蔻酰化肽:肉豆蔻酰化肽是特异性设计的(peptide2.0,VA,USA)。肽序列:KPERYQNLSPVGSGA–SEQIDNO:9(p38α的第21位-第34位残基)和KPERYQNLSPVAAAA(SEQIDNO:10)。
CoIP:产生细胞提取物并与预连接特异性抗体(1小时,23oC)的A/G-琼脂糖小珠温育2小时(4oC,震荡)。洗涤结合的A/G小珠、重悬(1.5X样品缓冲液)、煮沸,并进行蛋白免疫印迹。
邻近连接分析(PLA):根据生产商的方案使用DuolinkPLA试剂盒(OlinkBioscience)检测蛋白质-蛋白质相互作用。简言之,使细胞如前文描述的生长、固定和透化。随后将样品与针对两种受检验的蛋白质的初级抗体温育(60分钟,23oC)、洗涤(0.01MTrisHClpH7.4,0.15MNaCl和0.05%吐温20),并随后与特异性探针温育(60分钟,37oC),然后使用DAPI染色以使得细胞核显像,并进行洗涤(0.2MTrisHClpH7.5,0.15MNaCl)。信号通过荧光显微镜(OlympusBX51,x40放大率)观察到清楚的荧光点。使用Photoshop和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和荧光信号定量。
体外相互作用测定:细胞提取物如上文所述的方法生产,与预先与特异性抗体连接(1小时23oC)的A/G-琼脂糖小珠温育2小时(4oC)。结合的A/G小珠随后用RIPA缓冲液洗涤一次,然后用0.5MLiCl洗涤两次,用缓冲液A.洗涤两次。使用含有0.01%BSA的缓冲液A重悬结合的A/G小珠并等分。GST标记的蛋白质与小珠温育2小时(4oC,振荡),随后在1.5X样品缓冲液中洗涤并重悬,并煮沸。
体外磷酸化测定:HeLa细胞长至分汇合,血清饥饿(0.1%FBS,16小时),随后用刺激物或其他药物处理。如上文所述的方法生产细胞提取物,并与预先与特异性抗体连接(1小时23oC)的A/G-琼脂糖小珠温育2小时(4oC)。结合的A/G小珠随后用RIPA缓冲液洗涤一次,然后用0.5MLiCl洗涤两次,用缓冲液A.洗涤两次。源自刺激细胞的结合的A/G小珠样品随后与小牛小肠磷酸酶(37oC,1小时,NEB,MA,USA)温育,随后洗涤。随后样品在含有0.01%BSA的缓冲液A中重悬。等分-GST标记蛋白质与小珠温育2小时(4oC,2小时),随后洗涤并重悬于样品缓冲液中,煮沸。
亚细胞分级:{TC“细胞分级”\12}。亚细胞分级按照如下执行,将收获的细胞重悬于200μl含有0.1%NonidetP-40的缓冲液H中。将裂解产物如上文用力混合并立即离心,以产生含有细胞质级分的上层清液。通过下列步骤提取核蛋白质:在200μl提取缓冲液中重悬细胞核团块,在冰上放置5分钟,短暂超声处理(2x5秒,40W,4oC),用力混合并离心。使用Coomassie蛋白质测定试剂(Pierce)确定蛋白质浓度。对细胞质和核级分两者均进行蛋白质印迹。
凝胶过滤:使HeLa细胞血清饥饿(如上),并随后用茴香霉素(Anis,0.5μg/ml,15分钟)和TPA(250nM,15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各处理25mg)置于16/60superdex200大小的柱中(流速1ml/分钟),收集1ml级分。使用具有合适抗体的蛋白质印迹法对级分进行分析。
统计学分析:数据用平均数+S.E来表示。统计学评估用泛函分析和Student’st检验(双尾)来检测对照和实验结果之间的差异。p<0.05的值被认为是统计学显著的。
体内实验:将21只雄性C57BL小鼠称重,随后注射(I.V)肽(15mg/千克)、乱序肽(15mg/Kilo)或DMSO(2%)。注射24小时后将小鼠的饮用水换为含有DSS(1.25%)的水、肽、乱序肽或DMSO每48小时注射。在替换饮用水7天后将小鼠处死,并使用内窥镜和小鼠体重来评价结肠炎。
结果
本发明人检验了使用FITC-共轭的肉豆蔻酰化肽的肉豆蔻酰化肽的胞内分布和稳定性,并发现肽有效地穿透细胞,并甚至在24小时后还留在细胞质中(图16)。接着我们证明了肽在DSS-诱导结肠炎模式中的潜在治疗利用。使用肽治疗的小鼠证明相比于使用对照肽治疗的小鼠,减轻了DSS-诱导结肠炎(展示了平均体重损失和结肠中病灶的数目(图17A-C))。然而该肽与熟知的激酶结构域I(一种保守的蛋白质结构域)部分重合。为了克服该问题,发明人通过使用Ala残基取代该区域而对肽进行了修饰(图18A-B)。他们接着证明该新设计的肽抑制p38与Imp7的相互作用,并防止了JNK和p38MAPK的刺激-诱导的核转位,而不影响MAPK的刺激-依赖的激酶活性(图19-21)。
虽然发明已经连同其特定的实施方案进行了描述,对于本领域技术人员很多代替、修改和变化是显而易见的。因此,意在将所有这样的代替、修改和变化包含在在附带的权利要求的精神和范围内。
该说明书中的所有出版物、专利和专利申请都在以其整体通过引用并入说明书,以相同的程度好像各个出版物、专利或专利申请是具体地和分别地指示在此通过引用并入本文。另外,该申请中的任何参考的应用和鉴定不应当被解释为承认的,这样的参考可作为本发明的现有技术获得。在这一程度上,先前使用的部分不应当被解释为必要限制性的。
Claims (47)
1.一种经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1(PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽包含核靶向活性,所述肽不超过20个氨基酸。
2.一种经分离的肽,其包含与SEQIDNO:1(PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述经分离的肽能够防止P38α核转位,所述肽不超过20个氨基酸。
3.权利要求1或2的经分离的肽,其包含与SEQIDNO:8(KPERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的序列。
4.权利要求1或2的经分离的肽,其包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:8所示的序列。
5.权利要求1或2的经分离的肽,其中所述氨基酸中至少一个是合成氨基酸。
6.权利要求1或2的经分离的肽,其中所述氨基酸中至少一个是D型立体异构体。
7.权利要求1或2的经分离的肽,其中所述氨基酸中至少一个是L型立体异构体。
8.权利要求1或2的经分离的肽,其中异源物质通过接头连接至所述氨基酸序列上。
9.权利要求1或2的经分离的肽,其包含选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:2(PERYQNLSPVG)、SEQIDNO:3(PERYQNLSPVGS)、SEQIDNO:4(PERYQNLSPVGSG)和SEQIDNO:5(PERYQNLSPVGSGA)、SEQIDNO:6(KPERYQNLSPVGSGA)和SEQIDNO:7(KPERYQNLSPVAAAA)。
10.权利要求1-3中任一项的经分离的肽,其是肉豆蔻酰化的。
11.在受试者中治疗炎性病症或免疫病症的方法,所述方法包括对受试者施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的经分离的肽,从而治疗所述炎性疾病或免疫疾病。
12.权利要求11的方法,其中所述免疫病症是自身免疫病症。
13.权利要求11的方法,其中所述炎性疾病是结肠炎。
14.权利要求1-10中任一项的肽,其用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。
15.一种物质组合物,其包含权利要求1-10中任一项的经分离的肽和通过接头连接至所述氨基酸序列的异源物质。
16.权利要求15的物质组合物,其中所述异源物质选自多肽、核酸、小分子和碳水化合物。
17.权利要求15的物质组合物,其中所述异源物质是多肽。
18.权利要求15的物质组合物,其中所述异源物质是药剂。
19.权利要求18的物质组合物,其中所述药剂是治疗剂、化妆剂或诊断剂。
20.权利要求15的物质组合物,其通过接头连接至可检测部分。
21.权利要求15的物质组合物,其中所述接头包含肽键。
22.权利要求15的物质组合物,其中所述接头包含非肽键。
23.权利要求15的物质组合物,其通过接头连接至亲和部分。
24.权利要求23的物质组合物,其中所述亲和部分选自抗体、受体配体和碳水化合物。
25.一种经分离的多核苷酸,其包含编码权利要求1-9中任何的肽的核酸序列。
26.一种核酸构建体,其包含权利要求25的经分离的多核苷酸。
27.权利要求26的核酸构建体,其进一步包含用于调节多核苷酸表达的顺式调节元件。
28.权利要求26的核酸构建体,其中所述经分离的多核苷酸转录地融合至编码目的异源多肽序列的核酸序列中。
29.一种经分离的细胞,其包含权利要求26的核酸构建体。
30.权利要求29的经分离的细胞,其是真核的。
31.权利要求30的经分离的细胞,其中所述真核细胞是酵母细胞。
32.一种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法,所述方法包括将物质引入至宿主细胞中,所述物质连接于权利要求1-10的肽上。
33.一种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法,所述方法包括将权利要求1-10中任一项的肽引入至宿主细胞,将所述肽连接至能够结合所述物质的亲和部分。
34.权利要求33的方法,其中所述物质是内源物质。
35.权利要求33的方法,其中所述物质是外源物质。
36.权利要求35的方法,其进一步包括在所述引入之前、伴随所述引入或在所述引入之后对所述宿主细胞施用所述外源物质。
37.权利要求32或33的方法,其中所述宿主细胞是分裂细胞。
38.权利要求32或33的方法,其中所述宿主细胞是非分裂细胞。
39.权利要求32或33的方法,其中所述物质选自多肽、核酸、小分子或碳水化合物。
40.权利要求32或33的方法,其中所述物质是核酸。
41.权利要求40的方法,其中所述核酸通过选自下述的方法引入至所述宿主细胞中:显微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖引入、脂质体介导的引入、病毒介导的引入、裸DNA注射和生物射弹轰击。
42.权利要求32或33的方法,其中所述靶向在体内有效。
43.权利要求32或33的方法,其中所述靶向在先体外后体内有效。
44.权利要求32或33的方法,其中所述靶向在体外有效。
45.权利要求32的方法,其中所述宿主细胞是真核细胞。
46.权利要求45的方法,其中所述真核细胞是酵母细胞。
47.一种药物组合物,其包含权利要求1-9中任一项所述的肽,作为活性剂,和药物可接受载体。
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