CN103930439A - 基因工程生长因子变异体 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种重组制成的蛋白质构建体，其优先地形成多聚体。

Description

基因工程生长因子变异体
相关申请的引用
本申请要求于2011年5月9日提交的美国临时申请号US61/484,052的权益，其公开内容通过引用并入本文中。
技术领域
本申请涉及生长因子变异体领域以及用于控制此类生长因子的多聚化的方法。
背景技术
在生物系统中，蛋白质通常构成复杂的信号级联，该级联指导细胞以特别的方式活动。例如，细胞被导向至开始分裂过程的普通方式为蛋白质（配体）结合至跨膜蛋白受体的胞外域（胞外结构域），其中配体至胞外域的结合为受体赋予构象方面的变化。配体诱导的构象变化可以发生于胞外域、胞内域（胞内结构域）或该二者中并且导致变化，在该变化中蛋白质或分子能够与受体结合。这种由外至内的信号是用于发信号使细胞分裂、启动程序性细胞死亡和许多其他过程的常见机制。
调节生长因子受体活性的一种常用机制是配体诱导的受体的胞外域的二聚化，这反过来使胞内尾部并拢，从而为修饰性蛋白质（如激酶）制备了良好的停泊位点（docking site），该修饰性蛋白质引发向细胞核发出信号而引起细胞分裂的信号级联。
配体诱导的生长因子的胞外域的二聚化通常是通过配体二聚体的结合来完成的；即两个配体非共价彼此结合以形成同源二聚体或异源二聚体，然后该同源二聚体或异源二聚体结合至相同的（同源）或不同的（异源的）的两个受体。
配体诱导的受体二聚化的重要实例是NM23二聚体结合至MUCl*的胞外域并且使MUCl*的胞外域二聚化，MUC1*是肿瘤和干细胞特异的MUC1跨膜蛋白的截短型。不论配体是否为单体、二聚体或更高阶的多聚体，除了其他因素之外，其都与配体的浓度有关。对于许多生长因子受体，只有二聚体形式的配体能够活化生长因子受体。此外，在许多生物系统中，都存在反馈环路，其中更高阶的多聚体关闭由二聚体促进的功能。例如，NM23二聚体活化多能性增长但是NM23六聚体关闭多能性增长并且引发分化。类似地，λ噬菌体的CI蛋白当其以四聚体结合至DNA时开启一组基因的转录，但随着浓度的增加，当该CI蛋白变成八聚体时，其关闭那些基因的转录。在许多情况下，需要组成性激活生长因子受体或增加由特异的多聚化状态的蛋白质所介导的一些活性。问题是非常难于表达和分离出特异的多聚体，并且当将其加入到生物系统中或在生物系统中表达时，更加难以维持多聚化状态。因此，能够产生仅以特异的多聚化状态存在的或偏好该多聚化状态的配体（如二聚体或偏好二聚化的配体）将是有利的。
尽管已经报道了NM23突变体偏好二聚体形成，但是相对于非活性六聚体，作为活性二聚体而存在的部分差异很大，特别是当作为重组蛋白表达时，取决于表达它的细胞、浓度以及一些难于或不可能控制的蛋白质表达条件。因此，开发出能够产生出更高百分比或更稳定数目的二聚体形式的NM23或NM23突变体的方法（包括重组体方法）将是有益的。
发明内容
本发明克服了上述问题并且提供产生偏好特异的多聚化状态的蛋白质的蛋白质的遗传变异体、嵌合体和单链构建体。
在一方面，本发明涉及一种重组制备的蛋白质构建体，其优先地形成特异的多聚体。该多聚化状态可以为其生物学活性状态。该多聚化状态可以是二聚体。可替代地，该多聚化状态可以为其非活性状态。该多聚化状态可以为高阶多聚体。
蛋白质可以是生长因子或转录因子。二聚体形式可以为同源二聚体或异源二聚体。蛋白质可以为哺乳动物蛋白质，如人类蛋白质或小鼠蛋白质。
蛋白质构建体可以包含两种单体或单体的片段，其中它们可以通过接头肽连接在一起，从而形成单体-接头-单体构建体。
单体蛋白质可以为NM23，例如H1、H2或H7异构体。单体可以为NM23或其偏好形成二聚体并抑制形成高阶多聚体的突变体。突变体NM23可以为S120G或P96S或NM23和P96S。单体可以为NM23或其偏好形成二聚体的突变体，其中删除了一至十个C-末端氨基酸。可以删除一至六个C-末端氨基酸。
接头可以包括GS、GS2、GS3、IgG1铰链区、或IgG2a铰链区或它们的组合。
在一方面，蛋白质构建体可以包括：
NM23S120G GS2，
NM23P96S GS2，
NM23P96S/S120G GS2，
NM23P96SΔC1GS2，
NM23P96SΔC2GS2，
NM23P96SΔC6GS2，
NM23P96SΔC1/S120G GS2，
NM23P96SΔC2/S120G GS2，
NM23P96SΔC6/S120G GS2，
NM23S120G GS3，
NM23P96S GS3，
NM23P96S/S120G GS3，
NM23P96SΔC1GS3，
NM23P96SΔC2GS3，
NM23P96SΔC6GS3，
NM23P96SΔC1/S120G GS3，
NM23P96SΔC2/S120G GS3，
NM23P96SΔC6/S120G GS3，
NM23S120G IgG1h noC，
NM23P96S IgG1h noC，
NM23P96S/S120G IgG1h noC，
NM23P96SΔC1IgG1h noC，
NM23P96SΔC2IgG1h noC，
NM23P96SΔC6IgG1h noC，
NM23P96SΔC1/S120G IgG1h noC，
NM23P96SΔC2/S120G IgG1h noC，
NM23P96SΔC6/S120G IgG1h noC，
NM23S120G IgG2ah noC，
NM23P96S IgG2ah noC，
NM23P96S/S120G IgG2ah noC，
NM23P96SΔC1IgG2ah noC，
NM23P96SΔC2IgG2ah noC，
NM23P96SΔC6IgG2ah noC，
NM23P96SΔC1/S120G IgG2ah noC，
NM23P96SΔC2/S120G IgG2ah noC，
NM23P96SΔC6/S120G IgG2ah noC，
NM23S120G IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96S IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96S/S120G IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96SΔC1IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96SΔC2IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96SΔC6IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96SΔC1/S120G IgG1h/IgG2ah noC，
NM23P96SΔC2/S120G IgG2ah noC，或
NM23P96SΔC6/S120G IgG2ah noC。
在一个方面，可以通过将蛋白质单体重组地连接至第二组件（组分）而形成特异的多聚体。可以在第二组件之间形成特异的多聚体。第二组件可以为接头肽或蛋白质或蛋白质片段。
在一个方面，第二组件之间可以通过化学键形成多聚体。或者，第二组件之间可以通过共价键形成多聚体。共价键可以是二硫键。并且特别地，多聚体可以是二聚体。
在一个方面，第二组件可以为IgG1铰链或IgG2a铰链或它们的组合。蛋白质构建体可以是NM23-S120G-IgG1h、bNM23-S120G-IgG2ah或NM23S120G IgG1Fc。
在另一方面，在上述的蛋白质构建体中，第二组件之间可以通过非共价键形成多聚体。第二组件可以是具有高亲和力以与另一种蛋白质结合的蛋白质。第二组件可以是抗体Fos或Jun的Fc区的整体或一部分。Fc区可以是IgG1Fc。在一个方面，第二组件可以能够同源二聚化或异源二聚化。
在另一方面，可以将半胱氨酸插入到蛋白质中以通过二硫键促进多聚体形成。第二组件可以为IgM抗体的Fc结构域的片段。
在另一方面，在任何以上所讨论的蛋白质构建体中，可以包括促进进入细胞或进入细胞的细胞核的氨基酸序列。
在又另一方面，在任何以上所讨论的蛋白质构建体中，可以包括促进由其表达的宿主细胞分泌的蛋白质构建体的氨基酸序列。
本发明还涉及一种分离的核酸，其包括任何以上所讨论的蛋白质构建体。核酸可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列促进进入细胞或进入细胞的细胞核。核酸可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列促进蛋白质表达的宿主细胞分泌该蛋白质。核酸可以包括编码NM23或其偏好二聚体形成的NM23突变体的核酸。
在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其包括任何以上所讨论的核酸。该载体可以是质粒或病毒。
在另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含以上所讨论的载体。
在又另一方面，本发明涉及一种用于增殖细胞的方法，其包括用本文所讨论的载体转染或转导细胞。该细胞可以是干细胞或祖细胞。
在又另一方面，本发明涉及一种用于在体细胞中诱导多能性的方法，其包括用本文所描述的载体转染或转导细胞。
在另一方面，本发明涉及一种治疗患有通过给予未成熟细胞的治疗能够得到缓解的病症（condition）的患者的方法，包括：
（i）用本文所讨论的载体转染或转导宿主细胞以获得干细胞、祖细胞或iPS细胞；以及
（ii）将该获得的干细胞、祖细胞或iPS细胞给予到患者体内。
载体中一个或多个基因的核酸序列可以是原属于该细胞的并且可以是已经被修饰的。
在另一方面，本发明涉及一种用于改变靶基因的表达的方法，其包括下列步骤：
（i）制成编码转录因子变异体的核酸；以及
（ii）促使该核酸进入到靶细胞中。
上述方法可以进一步包括步骤（iii）设计该核酸以插入在靠近靶基因的启动子位点的位置。靶细胞可以是干细胞或祖细胞。该祖细胞可以是造血细胞。并且该祖细胞可以是B-细胞或B-细胞前体。
在另一方面，本发明涉及以上描述的方法，其进一步包含工程改造（engineering）转录因子的多聚化状态，从而如果需要表达目标基因时促进活性状态，且如果需要抑制目标基因时促进不处于活性状态。
在又另一方面，本发明涉及一种治愈或缓解疾病的方法，该疾病可以受益于干细胞或祖细胞的增加产生，该方法包括向患有或处于产生疾病、遗传缺陷或不健康病症风险的患者给予如上所描述的细胞。细胞可以是受精卵或未受精卵。细胞可以是干细胞或祖细胞。细胞可以获自待治疗的患者。或者细胞可以是iPS细胞。细胞可以是来自待治疗患者的iPS细胞。
在另一方面，本发明涉及一种用于识别偏好二聚化且抵抗形成更高阶多聚体的生长因子的方法，其包括测定生长因子对靶受体的结合亲和力，其中高阶多聚体不能以与二聚体相同的亲和力结合到靶受体。生长因子可以是NM23并且靶受体可以是MUC1*。靶受体可以是MUC1*胞外域肽，该MUC1*胞外域肽可以是具有序列GTINVHDVETQFNQYKTEA ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:l）的PSMGFR肽。
在另一方面，本发明涉及如上的蛋白质，其经基因工程改造以抵抗二聚体的形成。该蛋白质可以经基因工程改造以偏好形成高阶多聚体。该蛋白质可以经基因工程改造以偏好形成四聚体、五聚体或六聚体。高阶多聚体包含基因融合到IgM抗体的Fc部分的蛋白质。该蛋白质可以是生长因子。该蛋白质可以是NM23。该蛋白质可以是转录因子。该蛋白质可以是p53。
本发明涉及增加蛋白质的特异性多聚化状态的方法和组合物。该方法可以被应用到多聚体是活性形式的任何蛋白质上，特别是其中活性形式为二聚体。
一种用于制备多聚配体的方法是为已经连接的重组蛋白制备构建体。例如，其中将两个或多个单体直接连接或通过长度或序列可变的接头连接以获得所需的生物学活性的单链蛋白质。
另一种用于制备其为多聚的配体的方法是制备重组嵌合体，其中各个单体被连接至多聚的蛋白质的一部分。例如，蛋白质Fos和Jun相互作用以使这些蛋白质能够被基因地（遗传学地）连接至配体（配体可以是相同或不同的）以引起所得嵌合体的二聚化。类似地，抗体的Fc区二聚化。当制得配体-Fc区嵌合体时，它们二聚化并且能够模拟天然产生的二聚配体的活性。
又另一种用于制备配体多聚体的方法是通过两种或更多种单体配体的化学偶联。例如，可以使用双官能接头来化学偶联两种蛋白质配体以制备同源或异源二聚体。
又另一种用于制备多聚配体的方法是识别结合至靶受体的小分子，然后合成小分子的多聚体。
在优选的实施方式中，优选用于增强天然生物相互作用（例如活化生长因子受体）的多聚化状态是二聚体。在更优选的实施方式中，被制成二聚化或制成偏好二聚体形成的配体是NM23。优选的是NM23同种型H1（NME1）、H2（NME2）和H7（NME7），特别优选的是H1。在又一更优选的实施方式中，NM23是人源的。
因为结合至受体并且活化受体（且特别是生长因子受体）的许多配体通过使它们的同源受体二聚化而活化同源受体，一种用于抑制生长的途径是使用上述方法之一来制备配体的多聚体，其中多于两个配体被连接在一起或被促使形成高阶多聚体。还常见的是结合至特定核酸序列的配体只有当它们处于二聚化状态时才这样做。再次，可以使用上述的方法来制备这些蛋白质或小分子的变异体以便它们优先地形成二聚体，特别是当结合至核酸时。为了抑制核酸结合，可以产生偏好形成高阶多聚体的变异体。
在优选的实施方式中，被设计以形成高阶多聚体的配体能够与野生型蛋白质相互作用以抑制天然蛋白质形成二聚体的能力。例如，NM23-H1结合至MUC1*生长因子受体并且诱导二聚化，这引发生长、存活和多能性。取决于其序列和浓度，天然NM23以单体、二聚体、四聚体或六聚体存在。重组NM23可以被复性（重新折叠，refolded）或纯化，以使二聚体的群体能够被分离。已经从人类癌症中分离出偏好二聚体形成且抵抗四聚体和六聚体形成的NM23-H1突变。因此，一种用于抑制癌变生长的途径可以是识别偏好形成高阶多聚体的NM23突变体，其不会诱导生长和多能性。特别优选的是如下那些突变体，这些突变体能够募集野生型NM23进入它们的多聚体中以使它们不会形成与癌症相关的二聚体。
二聚化形式的NM23结合至干细胞和祖细胞上的MUC1*受体。结合至MUC1*有利于NM23二聚体的胞吞作用，其后它们被易位至细胞核，在那里NM23以二聚体结合至DNA以调节涉及干细胞和祖细胞的生长和多能性（pluripotency）以及多潜能性（multipotency）的基因转录。因此，本发明的一个重要应用是使用所描述的方法以制备偏好二聚体形成的NM23变异体，以在生长、维持和诱导多能性中使用。即，偏好二聚体形成的NM23变异体可以在体外、离体和体内中使用以促进干细胞和祖细胞的生长并且维持多能性或多潜能性。
此外，本发明还包括向患者给予这些NM23变异体以治疗病症，该病症能够受益于用未成熟细胞（包括干细胞和祖细胞）的治疗。可以向患者全身性或局部地给予NM23和NM23变异体。
本发明还包括在患者体外或体内、在受精卵或未受精卵中或在干细胞中使用本发明的方法，用于研究或拟用于治疗用途以及用于诱导多能性或诱导细胞至较不成熟的状态，本发明的方法引导（influence）蛋白质至特定的多聚化状态以实现单体或一些其他多聚体不能赋予的生物功能。在这种情况下，使用编码NM23变异体的核酸，例如作为表达载体的一部分。在一个实施方式中，NM23被设计成靠近靶基因定位。例如，NM23可以被设计成插入到目标基因中或靠近目标基因。在一个病例中，患者自身的细胞（其可以是iPS细胞或部分的iPS细胞）携带校正基因或插入基因；编码一种或多种偏好二聚化的NM23变异体的核酸被插入到相同的细胞中，以促进所述细胞在体外（in vitro）、离体（ex vivo）或体内（in vivo）的增殖。
在一个实施方式中，这些方法与通过有选择地增殖特定细胞群体而纠正基因缺陷或疾病病症的方法配合使用。例如，可以使表达胎儿形式的血红蛋白或用于治疗镰状细胞性贫血的纠正基因的细胞表达二聚化NM23。在另一个实施方式中，在基因治疗设置中使用这些方法以刺激细胞的生长。在另一个实施方式中，如对于自身免疫病的治疗，使用亦或生长促进多聚体亦或生长抑制多聚体以增加或减少特定细胞型的生产。
NM23及NM23变异体还促进其他哺乳动物的干细胞和祖细胞的生长。例如，在NM23二聚体（不论是野生型蛋白质还是蛋白质的变异体，或不论是人类来源的还是小鼠来源的）的存在下，小鼠干细胞和祖细胞激增。
从本发明的以下描述、所附的参照附图以及所附的权利要求中可以更全面地理解本发明的这些和其他的目的。
附图说明
从下文的详细描述以及附图中可更加全面地理解本发明，附图仅以示例的方式给出并因此不限制本发明，其中：
图1是测量的癌症细胞生长作为二价或单价抗体浓度的函数的曲线图，显示MUC1*受体的二聚化刺激生长。通过添加二价（Ab）抗-MUC1*刺激并且通过添加单价Fab抑制MUC1阳性的乳腺癌细胞ZR-75-30的生长。添加的二价抗体产生特征性的钟形生长曲线，表现出生长因子受体的二聚化。UMC1阴性HEK293细胞的生长未受到二价或单价Fab抗MUC1*的影响。当过量添加二价抗体时，每个受体上都结合有一个二价抗体，而不是一个二价抗体使每两个受体二聚化，从而抑制生长。
图2示出重叠的FPLC迹线，其表征野生型NM23（WT）或突变体NM23-S120G的三种不同群体的不同多聚化状态。野生型NM23示出对应于六聚体的分子量的单峰和对应于高阶多聚体的肩峰。未复性（未重新折叠）的NM23-S120G（标记为“混合的”）一种制剂具有对应于二聚体的主峰和对应于四聚体的小峰。未复性的NM23-S120G（“六聚体”）的另一种制剂具有六聚体的主峰和高阶多聚体的肩峰。NM23-S120G（“二聚体”）的复性制剂主要包含的是二聚体。
图3（a）示出NM23-WT、NM23-S120G-混合、NM23-S120G-六聚体和NM23-S120G-二聚体的非还原性凝胶的照片，其显示了野生型蛋白质以及S120G突变体的三种不同制剂的多聚化状态。（b）示出重叠的表面等离子体共振（SPR）测定，显示四种不同的NM23结合至MUC1*胞外域肽（PSMGFR）的能力，胞外域肽（PSMGFR）连接到SPR芯片表面。结果显示NM23结合至其同源受体MUC1*的量是有多少二聚体存在于样品中的函数。SPR测定芯片溶液界面上的蛋白质质量，所以如果六聚体结合至MUC1*肽表面，其将产生大于二聚体结合的3倍的SPR信号。（c）示出纳米粒子实验的照片，实验显示仅有NM23二聚体结合至同源受体MUC1*。将MUC1*胞外域肽固定到金纳米粒子上。向每等分的纳米粒子加入NM23-WT、NM23-S120G-二聚体或NM23-S120G-六聚体。如果NM23结合至纳米粒子固定的MUC1*肽，其将引起纳米粒子聚拢在一起，这将导致溶液从粉红色变成蓝色。该实验显示只有NM23-S120G-二聚体结合至MUC1*肽。加入抗-MUC1*Fab竞争性抑制溶液中NM23-S120G-二聚体对于纳米粒子上的MUC1*肽的结合。（d-g）示出测定不同NM23多聚体以检测它们支持多能干细胞生长的能力。在（d）NM23-S120G-二聚体、（e）NM23-S120G-六聚体、（f）NM23-WT、或（图3g）NM23-S120G-二聚体加MUC1*胞外域肽（PSMGFR）（用于竞争性地抑制NM23二聚体对于干细胞表面上的MUC1*受体结合）中培养人类ES（胚胎干）细胞。在（g）、（e）和（f）中以该顺序很容易地观察到诱导分化（集落增厚、变黑），表明NM23-二聚体-MUC1*相互作用的抑制诱导了分化，如同在不与MUC1*结合的NM23六聚体中培养细胞一样。只有二聚体制剂NM23-S120G（d）能够支持未分化的干细胞的生长。
图4示出天然非变性凝胶，其显示NM23-WT的多聚化状态与重组体NM23-S120G的三种不同制剂的对比。
图5示出A）NM23野生型（WT）和B）产生60%二聚体的NM23-S120G-“混合”的制剂的SPR测定。以五个不浓度注射蛋白质。结果显示，结合到MUC1*胞外域肽表面的NM23-S120G-混合的蛋白质比NM23-WT多8倍。由于野生型蛋白质为六聚体，所以RU数值必须除以3以与结合的二聚体的量比较。虽然野生型和S120G-二聚体者显示出浓度依赖性结合，结合的野生型六聚体的量如此小以至于其可能仍处于该系统的噪声范围内。
图6（a）示出在用于还原二硫键而添加的DTT（二硫苏糖醇）存在或不存在条件下装载有NM23单链变异体的非还原性凝胶的照片。用红色方块指示二聚体。在不存在DTT时，存在一些较高分子量的物质，这可能是因为以大概为用于培养细胞的浓度的1000倍将蛋白质装载至凝胶上。图6（b）示出还原性凝胶的照片，其显示NM23单链变异体以预期的二聚体的分子量迁移通过该凝胶。
图7示出单链变异体NM23S120G IgG1h和NM23S120G IgG2ah的纯化的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键。
图8示出融合嵌合体变异体NM23S120G IgGlFc的纯化的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键。
图9示出复性的（重新折叠的）融合嵌合体变异体NM23S120G IgGlFc的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键，其中变异体以二聚体的分子量运行，并且还使用还原性凝胶，这显示在不存在二硫键的结合时，融合变异体以单体的表观分子量运行。
图10示出融合嵌合体变异体NM23-S120G-IgG1Fc的FPLC（a）和非还原性SDS-PAGE（b）表征。
图11示出复性的NM23-S120G-GS2的FPLC（a）和非还原性SDS-PAGE（b），其示出二聚体的主要群体。（c-e）示出人类ES细胞BGO1v/hOG细胞系的照片，它们是在Matrigel（c和d）上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板（e）上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的NM23变异体NM23-S120G-GS2中培养的。这些数据显示NM23-S120G-GS2在使用前无需复性或纯化。
图12示出复性的NM23-S120G-IgG1h noC的FPLC（a）和非还原性SDS-PAGE（b），其显示出主要群体的二聚体。（c-e）示出人类ES细胞BGO1v/hOG系的照片，它们是在Matrigel（c和d）上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板（e）上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的NM23变异体NM23-S120G-IgG1h noC中培养的。这些数据显示这种变异体在使用前无需复性或纯化。
图13示出复性的NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC的FPLC（a）和非还原性SDS-PAGE（b），其显示出二聚体的主要群体。（c-e）示出人类ES细胞BGO1v/hOG细胞系的照片，它们是在Matrigel（c和d）上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板（e）上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的NM23变异体NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC中培养的。这些数据显示这种变异体在使用前无需复性或纯化。
图14（a）至14（h）示出使用非还原性凝胶和相应的FPLC迹线对NM23单链变异体NM23-P96SΔC1（a、b）、NM23-P96SΔC2（c、d）、NM23-P96SΔC6（e、f）和NM23-P96S（g、h）的SDS-PAGE表征，这些变异体都是未复性的或未纯化的。从这些FPLC迹线的比较可以看出，NM23-P96SΔC2和NM23-P96SΔC6在二聚体范围内具有它们的主峰，因此它们是优选的。这些数据显示这些变异体在使用前无需复性或纯化。
图15示出人类ES细胞BGO1v/hOG细胞系的照片，它们是在Matrigel（a、b、d、e）上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板（c、f）上的最低干细胞培养基中、在8nM的NM23变异体中培养的，（a-c）变异体是P96SΔC2；（d-f）变异体是P96SΔC6。这些变异体是未复性的或未纯化的，显示它们在使用前无需复性或纯化。
图16示出主要群体的NM23-S120G（复性的“RS”），如在FPLC迹线（a）中所示出并通过非还原性PAGE（b）所证实的其以二聚体存在。汇集通过FPLC纯化的只为二聚体的级分并且以8nM在最低干细胞培养基中使用以生长人类ES细胞BGOlv/hOG细胞系。（c-e）人类干细胞的照片显示，无论是在Matrigel（c、d）上还是在涂覆有抗-MUCl*抗体MN-C3的细胞培养板（e）上，在8nM的NM23变异体中培养都产生了多能干细胞。
图17示出人类ES细胞（H9细胞系）的照片，其培养于最低干细胞培养基加亦或复性的且纯化的NM23-S120G RS（a-d）亦或加单链构建体S120G-GS2中，单链构建体S120G-GS2被表达为二聚体并不需要复性和纯化。S120G-GS2是在存在（e-h）或不存在（i-1）添加的DTT下加入的。图像显示在单链变异体中培养的干细胞与它们在复性的且纯化的NM23-S120G-RS的二聚体级分中生长得一样良好。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
图18示出培养于最低干细胞培养基中的NM23-S120G-IgG1h noC中的人类ES细胞（H9细胞系）的照片。该NM23变异体以二聚体表达且不需要进一步加工或复性以确保其处于二聚体状态。在存在（a-d）或不存在（e-h）添加的DTT下加入S120G-IgG1hnoC。该图像显示培养在单链变异体中的干细胞与它们在复性的且纯化的S120G RS的二聚体级分中生长的一样良好（与图17a至17d相比）。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
图19示出人类ES细胞（H9细胞系）的照片，其培养在最低干细胞培养基加上亦或复性的且纯化的NM23-S120G RS（a-d）加上亦或单链构建体（NM23）S120G-IgG1h/IgG2ah noC中，单链构建体（NM23）S120G-IgG1h/IgG2ah noC被表达为二聚体且不需要复性和纯化。在存在（e-h）或不存在（i-1）添加的DTT下加入S120G-IgG1h/IgG2ah noC。该图像显示培养于单链变异体中的干细胞与它们在复性的且纯化的NM23-S120G RS的二聚体级分中生长的一样良好（与图17a至17d相比）。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
图20示出描绘人类干细胞的生长的图表，人类干细胞培养在亦或复性的且纯化的仅为二聚体级分的NM23-S120G中亦或培养于设计以自发地形成二聚体的NM23变异体或由两个NM23单体构成的单链构建体的NM23变异体中。在每种情况下，接种200,000细胞并且在4天后对细胞进行计数。该图表显示不需要二聚体群体的复性或进一步纯化的变异体引起干细胞的增殖，其与已经复性以形成大多数二聚体且经FPLC进一步纯化的NM23-S120G-RS一样好或者更好（与图17a至17d相比）。
图21示出描绘人类干细胞的生长的图表，人类干细胞培养于复性的且纯化的仅为二聚体级分的NM23-S120G-RS中或者培养于设计以自发地形成二聚体的NM23变异体或由两个NM23单体构成的单链构建体的NM23变异体中。该图表显示变异体引起了干细胞的增殖，其与NM23-S120G-RS一样好或者更好，并且效果持续经过几次传代。
图22示出与复性的且纯化的NM23-S120G-RS相比的NM23变异体的基因表达的RT-PCR测量结果的图表。基因表达分析显示在设计以自发地形成二聚体的NM23变异体中培养的细胞以与复性的且纯化的仅为二聚体群体的NM23相同或以比复性的且纯化的仅为二聚体群体的NM23更高的水平表达多能性基因。
图23示出NM23-S120G-RS的核定位的照片，NM23-S120G-RS为偏好二聚化但必须复性和纯化以获得主要为二聚体的群体的单点突变。（a）未添加外源性NM23-S120G-RS；（b）16nM的NM23-S120G RS；（c）128nM的NM23-S120G RS。（a-c）用荧光标记的抗-NM23抗体染色的细胞；（d-f）DAPI核染色和荧光标记的NM23的叠加。白色箭头指示在核中存在NM23。（g）为488荧光对照。（h）为显示条件a-c的核中NM23的定量的柱状图，并且表明向培养基中加入外源性NM23-S120G RS导致NM23的内在化和向细胞核的易位。需要注意的是，与以128nM添加相比，当以16nM添加时细胞核中存在更多的NM23，这与申请人的发现一致，即在过高的浓度下，NM23二聚体结合至每个MUC1*受体，而不是NM23二聚体结合至并使两个MUC1*受体二聚化。
图24示出NM23变异体NM23-S120G IgG1h/IgG2ah noC的核定位的照片。（a）未添加外源性NM23变异体；（b）16nM的NM23变异体；（c）128nM的NM23变异体。（a-c）用荧光标记的抗-NM23抗体染色的细胞；（d-f）DAPI核染色和荧光标记的NM23的叠加。白色箭头指示在核中存在NM23。（g）为488荧光对照。（h）为显示条件a-c的核中NM23的定量的柱状图，并且表明向培养基中加入外源性NM23S120GIgG1h/IgG2ah noC变异体导致NM23的内在化和向细胞核的易位。需要注意的是，与以128nM添加相比，当以16nM添加时细胞核中具有更多的NM23变异体，这与申请人的发现一致，即在过高的浓度下，NM23二聚体结合至每个MUC1*受体，而不是NM23二聚体结合至并使两个MUC1*受体二聚化。
图25示出小鼠胚胎干（ES）细胞的照片，该细胞已经在灭活的MEF饲养细胞层上在用亦或mLIF亦或NM23-S120G-RS补充的小鼠ES细胞最低培养基中培养了两天。该图像显示在仅使用NM23二聚体作为生长因子时小鼠ES细胞的生长与它们在具有作为基本生长因子的m LIF的标准小鼠干细胞培养基中的生长一样好。
图26示出与NM23-WT和NM23-S120G（非复性的）相比，已经复性的NM23变异体NM23-S120G-GS2、NM23-S120G-IgG1h noC和NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC的非还原性SDS-PAGE表征的照片。（a）显示在非还原性凝胶上，已经复性的或纯化的变异体NM23-S120G-GS2、NM23-S120G-IgG1h noC和NM23-S120G-IgG1h/IgG2ahnoC作为二聚体而存在，这与单体的表观分子量运行的野生型蛋白质相反。但是，回想起在非还原性凝胶上以单体的分子量运行的NM23六聚体，因为高价NM23多聚体不依赖于二硫键，但二聚体则依赖于二硫键。
图27示出重组产生NM23变异体的实例。应该注意的是亲和标记物，如(组氨酸)6、Strep Tagil等是可选的元件（要素）。
图28示出在已经被复性的NM23变异体中培养的人类干细胞的照片（如图标记中以“R”表示）。以8nM使用的NM23变异体为NM23-S120G-RS（a、e）、NM23-S120G-GS2（b、f）、NM23-S120G-IgG1h noC（c、g）和NM23-S120G-IgG1h/IgG2ahnoC（d、h）。细胞形态与多能干细胞一致，因为它们是圆的且在形状上不是成纤维细胞，并且它们是缺少指示细胞分化的增厚或变黑的单层。
具体实施方式
在本申请中，“一（a）”和“一个（an）”用于指代单个和多个对象。
本文所使用的，“多聚体”是指共价地连接在一起或非共价地彼此融合的多个单体。
本文所使用的，“高价多聚体”是指共价地连接在一起或非共价地彼此融合的多个单体，其大于二聚体。
序列表独立文本
关于使用的除了a、g、c、t之外的核苷酸符号，它们都遵照了WIPO标准ST.25附录2表1中规定的惯例，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t且y表示c或t。
人类NM23H1
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（SEQ ID NO:97）。
（氨基酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE-（SEQ ID NO:98）。
小鼠NM23H1
（DNA）
atggccaacagtgagcgcaccttcattgccatcaagcctgatggggtccagcgggggctggtgggcgagatcatcaagcggttcgagcagaaggggttccgccttgttggtctgaagtttctgcaggcttcagaggaccttctcaaggagcactacactgacctgaaggaccgccccttctttactggcctggtgaaatacatgcactcaggaccagtggttgctatggtctgggagggtctgaatgtggtgaagacaggccgcgtgatgcttggagagaccaaccccgcagactctaagcctgggaccatacgaggagacttctgcatccaagttggcaggaacatcattcatggcagcgattctgtaaagagcgcagagaaggagatcagcttgtggtttcagcctgaggagctggtggagtacaagagctgtgcgcagaactggatctatgagtga（SEQ ID NO:99）。
（氨基酸）
MANSERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFLQASEDLLKEHYTDLKDRPFFTGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFQPEELVEYKSCAQNWIYE-（SEQ ID NO:100）。
人类NM23H2
（DNA）
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa（SEQ ID NO:101）。
（氨基酸）
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE-（SEQ ID NO:102）。
小鼠NM23H2
（DNA）
atggccaacctcgagcgtaccttcattgccatcaagccagatggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaaacggttcgagcagaaggggttccgcctggtggccatgaagttccttcgggcctctgaagaacacctgaagcagcattacatcgacctgaaagaccgtcctttcttcccggggctggtgaagtacatgaactcggggcccgtggtggccatggtctgggaggggctcaatgtggtgaaaacgggccgagtgatgctgggggagaccaatccagctgattcaaaaccaggcaccatccgtggggatttctgcattcaagttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtggagagtgctgagaaagagatccatctgtggtttaagcccgaagaactgatcgactacaagtcttgtgcccatgactgggtgtacgagtag（SEQ ID NO:103）。
（氨基酸）
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIHLWFKPEELIDYKSCAHDWVYE-（SEQ ID NO:104）。
人类NM23-H7-1
（DNA）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag（SEQ ID NO:105）。
（氨基酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（SEQ ID NO:106）。
经优化用于大肠杆菌（E.coli）表达的人类NM23-H7-1序列
（DNA）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattag（SEQ ID NO:107）。
（氨基酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（SEQ ID NO:108）。
人类NM23-H7-2
（DNA）
atgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattga（SEQ ID NO:109）。
（氨基酸）
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（SEQ ID NO.110）。
小鼠NM23-H7-1
（DNA）
atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaaggaatgttgggaaagattttaatagctattcgggatgcatgctttggaatgtcagcgatacagatgttcaatttggatcgggctaatgttgaagaattctatgaagtctataaaggtgtagtgtctgagtataatgatatggtgacagagctgtgctccggcccttgcgtagcaatagagatccaacagagcaaccctacaaagacatttcgagaattctgcggacctgctgatcctgaaatcgcccggcatttacgacctgagaccctcagggcaatttttggtaaaactaaggttcaaaatgctgttcattgcacggatctgccggaggatgggctcctggaggtccagtatttcttcaagatcttggataattag（SEQ ID NO:111）。
（氨基酸）
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小鼠NM23-H7-2
（DNA）
atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaagatttatttattcattatatgtaa（SEQ ID NO:113）。
（氨基酸）
MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEDLFIHYM-（SEQ ID NO:114）。
在C-末端用组氨酸簇标记的NM23S120G（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
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（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23S120G（在Ndel和Agel之间克隆）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:63）。
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96S（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:65）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96S（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:115）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96S/S120G（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:67）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96S/S120G（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:117）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC1（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:69）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC1（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:119）。
（氨基酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYLEHHHHHH-（SEQ ID NO:120）。
在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC2（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:71）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC2（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:121）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC6（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:73）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC6（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:123）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC1/S120G（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:75）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC1/S120G（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:125）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC2/S120G（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga（SEQ IDNO:77）。
（氨基酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH-（SEQ ID NO:78）。
在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC2/S120G（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:127）。
（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC6/S120G（在Ndel和Agel之间克隆）
（DNA）
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（氨基酸）
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在C-末端用组氨酸簇标记的NM23P96SΔC6/S120G（在Ndel和Xhol之间克隆）
（DNA）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctctcgagcaccaccaccaccaccactga（SEQ ID NO:129）。
（氨基酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCALEHHHHHH-（SEQ ID NO:130）。
接头序列：
GS2接头
5’-ggcggtggcggatccggcggtggcggatcc-3’（SEQ ID NO:81）
GGGGSGGGGS（SEQ ID NO:82）
GS3接头
5’-ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc-3’（SEQ ID NO:83）
GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO:84）
IgG1h no C接头（抗体的Fc区的修饰的铰链部分）
5’-gataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggt-3’（SEQ ID NO:85）
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTG（SEQ ID NO:86）
IgG2ah no C接头（抗体的Fc区的修饰的铰链部分）
5’-actggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccg-3’（SEQ ID NO:87）
TGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP（SEQ ID NO:88）
IgG1h/IgG2ah no C接头（两种不同同种型的抗体的两个Fc区的结合铰链部分）
5’gataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccg-3’（SEQ ID NO:89）。
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP（SEQ ID NO:90）。
序列的其他实例如下：
（DNA）(ggtggttctggt)n（n=l至3）（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能）（SEQ ID NO:131）。
（相应的氨基酸序列）(GGSG)n（n=l至3）（SEQ ID NO:132）。
（DNA）gct(gaagctgctgctaaa)nGCT（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:133）。
（相应的氨基酸序列）A(EAAAK)nA（n=2-5）（SEQ ID NO:134）。
（DNA）ggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggt（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:135）。
（相应的氨基酸序列）GAGGAGGAGAGGAGAGAG（SEQ ID NO:136）。
（DNA）ggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggtgaacttggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggt（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:137）。
（相应的氨基酸序列）GAGGAGGAGAGGAGAGAGELGAGGAGGAGAGGAG AGAG（SEQID NO:138）。
（DNA）ggtggtgctggtgctggtgctggt（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:139）。
（相应的氨基酸序列）GGAGAGAG（SEQ ID NO:140）。
（DNA）ggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggt（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:141）。
（相应的氨基酸序列）GSGGGGSGGGGSG（SEQ ID NO:142）。
（DNA）cttgctgctgct（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ IDNO:143）。
（相应的氨基酸序列）LAAA（SEQ ID NO:144）。
（DNA）cttggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctgctgct（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:145）。
（相应的氨基酸序列）LGGGGSGGGGSGGGGSAAA（SEQ ID NO:146）。
（DNA）ctttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggtt ctgctgctgct（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:147）。
（相应的氨基酸序列）LSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA（SEQ ID NO:148）。
（DNA）cttgct(gaagctgctgctaaa)ngctgctgct（n=l至5）（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:149）。
（相应的氨基酸序列）LA(EAAAK)nAAA（n=l至5）（SEQ ID NO:150）。
（DNA）ctttttaataaagaacaacaaaatgctttttatgaaattcttcatcttcctaatcttaatgaagaacaacgtaatggttttattcaatctcttaaagatgatccttctcaatctgctaat（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）（SEQ ID NO:151）。
（相应的氨基酸序列）LFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAAA（SEQ ID NO:152）。
样品嵌合体序列：
NM23S120G IgG1Fc（NM23-X连接至抗体的Fc区）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaactcgagcaccacc accaccaccactga（SEQ ID NO:91）。
MANCERTnAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKLEHHHHHH-（SEQ ID NO:92）。
NM23S120G IgG1h（NM23-X仅连接到抗体的Fc区的修饰的铰链部分）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaccggtgccacgtgattctggttgtaaaccgtgtatttgtgttggtctcgagcaccaccaccaccacc actga（SEQ ID NO:93）。
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYEPVPRDSGCKPCI CVGLEHHHHHH（SEQ ID NO:94）。
NM23S120G IgG2ah（NM23-X仅连接到抗体Fc区的修饰的铰链部分）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaccgcgtggtccgaccattaaaccgtgtccaccgtgtaaatgtccaggtctcgagcaccaccacca ccaccactga（SEQ ID NO:95）。
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYEPRGPTIKPCPPCK CPGLEHHHHHH-（SEQ ID NO:96）。
本发明公开了用于制备蛋白质的方法，该蛋白质优先形成一种或多种特异性多聚体，其中该特异性多聚体具有所需的生物学功能，该生物学功能是蛋白质的单体或一些其他多聚体不具有的。例如，许多生长因子只有当它们处于二聚化形式时才发挥出它们的生长促进功能。这些可以是同源二聚体或异源二聚体。在这些情况下，本发明的方法通过增加生长因子的二聚体的量而增强生长。相反地，如果所需的生物学功能是抑制生长，例如抑制癌症的生长，那么该生长因子可以被工程改造或选择抵抗二聚体形成的突变体。
本发明的方法产生更有可能以所需的多聚体形式存在的蛋白质或天然蛋白质的变异体，由此产生所需的生物学功能，但该功能是单体或其他多聚体形式未赋予的，方法可以在体外、离体或体内使用。在体外，可以表达和可选地纯化偏好特异多聚化状态的变异体，然后用于细胞培养，特别是用于培养干细胞和祖细胞，包括造血干细胞和祖细胞以及其他未成熟的骨髓细胞或其他体外应用。
此外，表达的和可选纯化的多聚体特异的变异体可以通过乳膏、润滑剂（suave）、绷带等局部给予或者通过经口摄取、注射等作为全身性治疗给予而被用于治疗患者。在优选的实施方式中，亲代蛋白质是NM23且多聚体特异的变异体偏好二聚体形成，可选地抑制四聚体或六聚体的形成，并且除此之外还在宽的蛋白质浓度范围内增加存在的二聚体的量。在一些情况下，用增加进入细胞的蛋白质的前导序列重组合成多聚体特异的变异体是可取的。
可替代地，可以使用本领域技术人员已知的各种方法的任何一种来将编码多聚体特异的变异体的核酸导入到细胞中，方法如同源重组、稳定或瞬时转染或转导、病毒转导，如通过使用慢病毒或逆转录病毒（包括自我失活型载体，包括自我失活型慢病毒载体和自我失活型逆转录病毒载体）的病毒转导。在一个实施方式中，细胞是干细胞或iPS细胞，它们可以源自患者或源自供体。可以在体外扩增之前或之后将所得的细胞移植到患者体内。在一个实施方式中，进行核酸操作以纠正已经被转染或转导以表达多聚体特异的变异体的细胞中的基因异常。
在一个优选的实施方式中，蛋白质是NM23并且多聚体特异的变异体偏好二聚化和抑制高阶多聚体的形成，其净效果是：与亲本蛋白质相比，所表达的蛋白质的群体在宽浓度范围内具有增加的二聚体的量。以这种方式，作为生长因子的NM23二聚体甚至在移植进入患者体内后仍将促进细胞的扩增。在一个实施方式中，待治疗的遗传性疾病（genetic disorder）是镰状细胞性贫血，并且治疗包括刺激表达胎儿形式的血红蛋白或用于成年形式的纠正基因的细胞的生长。可以将生长因子变异体插入到细胞中以使它仅瞬时表达，例如通过使用自我失活型病毒载体。可替代地，在优选的实施方式中，多聚体特异的变异体是偏好二聚体形成的NM23变异体，可以将其永久地插入到基因组中。可选地，还可以将细胞转染或转导以表达MUC1或MUC1的片段，包括MUC1嵌合体或MUC1*，其中胞外域已被截短以基本上包括PSMGFR序列的大部分或全部。
在一些情况下，包括其中细胞被编码多聚体特异的变异体的核酸转染的那些情况，在5’末端修饰变异体的核酸以包括引起细胞分泌所表达的蛋白质的前导序列是可取的。此类序列为本领域技术人员所熟知并且通常包括源自抗体的序列，参见实施例13。
以下是引起细胞分泌出所表达的蛋白质的例示性前导序列。可以将这些序列或本领域技术人员已知的其他序列的任一种添加到变异体的核酸序列中，以使从细胞中分泌出所表达的蛋白质。可选地，该序列被添加至核酸序列的N-末端或5’端。以这种方式，可以在体外和离体以及体内容易地使用NM23突变、缺失、单链变异体和融合蛋白质嵌合体。
用于在大肠杆菌周质中蛋白质表达的序列
pelB（胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）的果胶酸裂合酶B）前导序列
（DNA）
aaatatcttcttcctactgctgctgctggtcttcttcttcttgctgctcaacctgctatggct（SEQ ID NO:153）（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）
（氨基酸）
KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（SEQ ID NO:154）
用于在哺乳动物细胞中蛋白质分泌的序列
人血清白蛋白信号肽
（DNA）
atgaaatgggttacttttatttctcttctttttcttttttcttctgcttattct（SEQ ID NO:155）（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）
（氨基酸）
MKWVTFISLLFLFSSAYS（SEQ ID NO:156）
人κ轻链的信号肽
（DNA）
atggattttcaagttcaaattttttcttttcttcttatttctgcttctgttattatgtctcgtggt（SEQ ID NO:157）（取决于用于每个氨基酸的密码子，其他DNA序列是可能的）
（氨基酸）
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG（SEQ I D NO:158）
被转染或转导以表达生长因子变异体（如偏好二聚化的NM23变异体）的细胞可以是体细胞、干细胞（包括造血干细胞和祖细胞）、或iPS细胞。在一个实施方式中，用编码偏好二聚体形成的NM23变异体的核酸转导体细胞（如成纤维细胞或真皮细胞（dermablast））。NM23变异体核酸可以与引起宿主细胞恢复至更不成熟的状态的一种或多种基因一起转导。这些其他基因可以包括但不限于Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Lin28和c-Myc。可以使用稳定转染或同源重组等方法转染或转导细胞以暂时地表达NM23变异体（以便其能够在有限的时间内促使细胞类型的扩增）或永久地表达NM23变异体。
本发明的方法可以用来提供组成性活性（constitutively active）的或比天然生长因子更具活性的生长因子以刺激特定细胞群体的增殖，细胞可以携带基因突变或纠正。在一个实施方式中，在携带了纠正基因或待表达的基因的序列的相同核酸、质粒或表达载体上携带增加生长因子的特异多聚体状态的百分比的一种重组体变异体。在另一个实施方式中，如果需要下调基因，可以使用不刺激生长的多聚体。本发明还包括这些方法在患者、在预定移植至患者体内的细胞中、在胚泡和胚胎中以及在受精卵或可用于体外受精的未受精卵中的应用。
在优选的实施方式中，生长因子是NM23，其中二聚体形式刺激生长，而高阶多聚体（如四聚体和六聚体）关闭NM23介导的刺激生长和诱导或维持多能性的路径。例如，NM23二聚体促进干细胞和祖细胞的生长和多能性，并且还促进癌症细胞的生长。六聚体或四聚体形式的NM23不促进干细胞或癌细胞的生长。因此，产生偏好二聚体形成的变异体的本发明的方法被用于促进干细胞、祖细胞和/或癌细胞的生长。在干细胞和祖细胞的情况下，高阶NM23多聚体可以用来诱导分化。
相反地，产生偏好四聚体、六聚体或高阶多聚体形成的变异体的本发明方法被用于抑制癌细胞的生长。可替代地，可以进一步修饰NM23变异体以将毒素携带至靶标来杀死癌细胞。NM23是在许多不同癌细胞的表面存在的MUC1*的配体。可以使用NM23来特异地靶向癌细胞从而递送药物或毒素以杀死该靶细胞。一个实例是使用称为皂草毒蛋白（saporin）的核糖体-失活型蛋白质。就其本身而言，皂草毒蛋白不能进入细胞，但是当偶联至结合到细胞表面的另一种蛋白质时，皂草毒蛋白/蛋白质复合物能够被内在化并且对细胞是有毒的。
因为NM23活化MUC1*生长因子受体，因此可以连同NM23变异体一起可选地在体外或体内表达MUC1或截短形式的MUC1（包括MUC1*，其中胞外域主要包括PSMGFR肽的序列）。与NM23和可选地待表达的基因一样，可以类似地由相同的表达质粒来表达MUC1或MUC1截短或MUC1变异体。
在另一个实施方式中，生长因子受体本身被工程改造为特异的多聚化状态来亦或促进亦或抑制生长。在优选的实施方式中，生长因子受体是MUC1*且优选的多聚体是二聚体。
产生偏好特异的多聚化状态的蛋白质的一种方法是识别偏好形成特异的多聚化状态的蛋白质的变异体。例如，表1列举了促进形成二聚体的一些NM23突变。
表1.偏好二聚体形成的NM23示例突变体
产生用于重组蛋白质的构建体以使一种或多种单体是已经连接的。例如，单链蛋白质，其中两种或多种单体亦或直接连接亦或通过例如在长度或序列上可以变化的接头间接连接以获得所需的生物学活性。接头在长度和序列方面可以变化。在优选的实施方式中，接头为5至100个氨基酸。在更优选的实施方式中，接头为10至75个氨基酸。在更加优选的实施方式中，接头为10个氨基酸或43个氨基酸。类似地，接头的序列可以由柔性的(GGGGS)n型接头变化至天然蛋白质中任何已知或推测的柔性的序列，包括天然序列的修饰物，其中插入了旨在提高柔性或溶解度几个突变。表2列举了一些优选的接头序列。
表2.示例接头
表3列举了一些优选的单链构建体，其中两种单体通过接头重组地连接。
表3.偏好二聚体形成的NM23变异体的实例
在一些情况下，接头序列本身倾向于形成同源二聚体或异源二聚体。例如，抗体的Fc区的部分与另一个Fc区二聚化。由亲本蛋白质的一部分加自然地二聚化的蛋白质的一部分组成的嵌合蛋白质是偏好二聚体形成的变异体。可替代地，使用来自IgM蛋白质的Fc序列的嵌合体将偏好形成高阶多聚体，如特征性的五聚体。融合至NM23突变体单体的抗体的修饰的铰链区优先地形成二聚体并且在本文中进行了详细的描述。
在另一种方法中，通过基因地将目标蛋白质制成为融合嵌合体来实现蛋白质二聚体，其中该融合嵌合体融合至具有二聚化结构域的蛋白质或蛋白质片段。可以通过制备重组嵌合体来产生多聚化的配体，其中各单体连接至多聚蛋白质的部分。例如，蛋白质Fos和Jun相互作用以使它们能够重组地连接至配体（该配体可以是相同的或不同的）以引起所得嵌合体的二聚化。表3列举了优选的构建体，它们的一些是嵌合体。
可以将半胱氨酸插入到目标蛋白质中以使通过形成二硫键来促进二聚体形成。本发明还包括将半胱氨酸插入接头以促成二聚化，接头不论是由天然氨基酸还是由非天然聚合物还是由小分子组成的皆可。表4包含优选变异体的列表，通过引入半胱氨酸增强了它们的二聚化。
表4.通过抗体的铰链区之间的二硫键形成而形成二聚体的实例
用于制备配体多聚体的再一种方法是通过化学偶联两种或多种单体配体。例如，可以使用双官能接头来化学地偶联两种蛋白质配体以制备同源二聚体或异源二聚体。接头可以是通过共价偶联两种单体以形成同源二聚体或异源二聚体来促进二聚化的化学交联剂或类似物。
同样可以实现的是，通过化学偶联处于二聚化状态时的蛋白质，例如将靶蛋白质以确定的几何形状固于在例如SAM上，以及通过接头直接或间接地化学偶联限定于模仿二聚化状态的几何形状时的蛋白质。可替代地，可以分离出二聚体，然后加入偶联剂以亦或直接地亦或者通过接头将两种蛋白质偶联在一起。
用于制备多聚配体的又一种方法是识别结合至靶受体的小分子，然后合成该小分子的多聚体。
在优选的实施方式中，优选的用于增强天然生物的相互作用（如生长因子的活性）的多聚化状态是二聚体。在更优选的实施方式中，被制成二聚化或制成以偏好二聚体形成的配体是NM23。优选的NM23同种型是H1、H2和H7（NME7），特别优选的是H1。在更加优选的实施方式中，NM23是人类的。还优选与用于增强生长因子活性的方法一起使用的是增强二聚化且最佳地抵抗高阶多聚体形成的突变体。例如，已经报道NM23-S120G和NM23-P96S突变体偏好二聚体形成并且抵抗四聚体和六聚体的形成，四聚体和六聚体不能活化MUC1*生长因子受体并且不能结合至核酸以诱导涉及多能性和癌症的基因的表达。但是，对于NM23-S120G突变体，申请人发现优选使蛋白质变性和复性以获得二聚体的显著群体。类似地，通过变性和复性增加了作为二聚体存在的P96S突变体的分数。C-末端缺失破坏了参与形成高阶多聚体的区域，并由此增加了处于二聚化形式的蛋白质的部分。因此，优选C-末端缺失的NM23野生型或突变体以增加二聚体群体的百分比和稳定性。特别优选已经偏好二聚体形成的C-末端缺失的突变体如S120G和/或P96S。在C-末端缺失了1至6个氨基酸的NM23是特别优选的。
尽管S120G和P96S突变是分别在人类癌症和发育异常的果蝇中识别出的自然发生的突变，但是本发明还包括特意地导入突变并识别那些亦或增加亦或降低形成二聚体的倾向性的突变。例如，为了增强生长因子的活性（其中该生长因子当在二聚体形式时是具有活性的），识别且优选偏好二聚体形成的突变。为了抑制生长因子活性，优选抵抗形成二聚体或偏好形成四聚体或六聚体的突变。可以使用亦或位点定向亦或随机诱变，其中通过多种方法识别偏好二聚体形成的那些突变，方法包括但不限于结构分析如晶体结构，在干细胞中支持、诱导或维持多能性的能力，结合至本质上包括PSMGFR肽序列的MUC1*肽的能力。此外，可以例如通过使用噬菌体展示和标准的随机诱变（其中通过突变体结合至干细胞或MUC1*肽的能力来识别所需的突变体）来识别偏好二聚体形成的NM23变异体。
类似地，可以用增加变异体穿透细胞膜的能力的序列进一步修饰NM23变异体或本发明的类似的多聚体特异的变异体。
同样将变得显而易见的是，经过基因工程改造以偏好二聚体形成的配体单体可以是野生型蛋白质或者是偏好二聚体形成或抵抗形成高阶多聚体的突变体或截短物。NM23的情况意在例示性的并且本发明还包括使用这些方法、接头、接头序列和/或使用其他蛋白质的部分或分子用于增加在处于二聚体形式时发挥出作用的其他试剂的活性的应用。
多聚化状态是很重要的另一种类型的蛋白质是转录因子。常见的是，转录因子只有在处于二聚化状态时才能结合至特定的核酸序列。然而，一些转录因子如肿瘤抑制因子p53，以四聚体结合DNA。还有其他转录因子只有当它们以八聚体存在时才发挥出特异的转录功能。本发明的方法可以用来制备这些转录因子的变异体以增加所需的活性，例如通过制备偏好二聚化的转录因子变异体。
因为结合至受体并且活化受体（且特别是生长因子受体）的配体经常需要处于二聚化状态以结合至和/或活化其生长因子受体功能，所以一种用于抑制生长的途径是使用上述方法之一来制备配体的多聚体，其中多于两个的配体被连接在一起或被促使形成高阶多聚体。为了抑制核酸结合，可以生成偏好形成高阶多聚体的变异体。
在优选的实施方式中，设计用于形成高阶多聚体的配体能够与野生型蛋白质相互作用以抑制该天然蛋白质形成二聚体的能力。例如，NM23结合至MUC1*生长因子受体并且诱导二聚化，这会引发生长、存活和多能性。依赖于其序列和浓度，NM23可以以单体、二聚体、四聚体或六聚体存在。重组NM23可以被复性或纯化使得能够分离出二聚体的群体。已经从人类癌症中分离出偏好二聚体形成且抵抗四聚体和六聚体的形成的NM23突变。因此，用于抑制癌细胞生长的一种途径可以是识别偏好形成高阶多聚体的NM23突变体，高阶多聚体不会诱导生长和多能性。特别优选的将是那些能够将野生型NM23招募进入它们的多聚体中以使它们不会形成癌症相关性二聚体的突变体。
众所周知，由配体诱导的其胞外结构域的二聚化而激活MUC1*生长因子受体。产生的二价抗体抵抗MUC1*的胞外结构域（PSMGFR序列：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:l）或
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:2）二聚化MUC1*受体并且以剂量依赖性方式刺激生长。剂量响应曲线是由二聚化而活化的I类生长因子受体的特征性的典型钟形曲线。当生长随着MUC1*的二聚体增加而增加而当NM23二聚体或二价抗体过量、每个受体被一个而不是两个生长因子结合时导致了钟形曲线。这实际上阻断生长因子受体的二聚化并且导致生长的降低。与这些发现相一致，添加的抗-MUC1*ecd抗体的单价Fab阻断受体二聚化并且最终抑制了生长，参见图1。类似地，二聚化形式的NM23刺激MUC1*阳性细胞的生长。
先前从人类成神经细胞瘤中分离出NM23突变体S120G。据报道，突变体NM23偏好二聚体形成并且抵抗高阶多聚体的形成，特别是已知野生型NM23形成的四聚体和六聚体。被报道偏好二聚化的其他NM23突变体是P96S突变和在C-末端缺失1至6个氨基酸。
然而，当NM23-WT（野生型）、S120G或P96S突变体被制成为重组蛋白质时，它们的多聚化状态取决于序列、它是如何被表达的、它是如何被收集和纯化的、以及浓度。例如，除了表达报道偏好二聚体形成的S120G突变体，许多表达/纯化方法产生完全由四聚体和六聚体组成的群体。蛋白质表达的其他方法产生包含六聚体、四聚体和小二聚体群体的NM23群体。产生显著群体的二聚体的用于表达和纯化NM23突变体的一种方法包括使所表达的蛋白质变性、然后再将其复性。在一个可选的步骤中，如在下文实施例4中描述的由尺寸排阻色谱法（FPLC）进一步纯化二聚体群体。
由FPLC（图2）进行NM23-WT或突变体S120G的三种不同制剂的表征。FPLC显示野生型NM23-WT几乎完全由六聚体组成，如同突变体的制剂之一“NM23-S120G-六聚体”S120G，其中使用了所表达的蛋白质的可溶性级分。S120G突变体的另一种制剂“NM23-S120G-混合”（其中使用了可溶性级分）由FPLC显示其是由包括约60%的二聚体的多聚体混合物组成的。进行了另一种突变体S120G的制剂，其中所表达的蛋白质被变性然后再根据实施例3b中描述的方法复性。FPLC显示制剂“NM23-S120G-二聚体”仅由二聚体和单体组成，其中二聚体部分占群体的80%。图3a显示，在非还原性凝胶上，该NM23二聚体以约40kDa的表观分子量运行，而单体和六聚体都以约20kDa的表观分子量运行，表明二聚体是由二硫键稳定的而六聚体则不是。
进行表面等离子体共振（SPR）实验以测量在各种NM23多聚体（单体、二聚体和六聚体）对MUC1*肽的结合亲和力方面是否具有差异。在Biacore3000仪器上进行SPR测量，其中组氨酸-标记的MUC1*肽（PSMGFR）被固定在SPR芯片上至饱和，该SPR芯片涂覆有在三乙二醇封端的硫醇的背景中以3.8%的NTA-Ni涂覆的自组装单层，参见实施例5、图3b和图5。图3b示出表面等离子体共振（SPR）测量的重叠，其显示四种不同的NM23制剂在对连接至SPR芯片表面的MUC1*胞外结构域肽（PSMGFR）的结合能力上具有巨大的差异。结果显示NM23对其同源受体MUC1*的结合的量是样品中存在多少二聚体的函数。SPR测量在芯片溶液界面上的蛋白质质量（protein mass），所以如果六聚体结合至MUC1*肽表面，其将产生大于二聚体结合的3倍的SPR信号。这意味着结合至MUC1*肽的NM23-WT或NM23-S120G-六聚体的量比结合的NM23-S120G-二聚体的量少约12倍。在对照实验中，将不相关的肽固定在相同的芯片上并且产生了极微量的背景结合，将其从所示的测量中减去。然而，通常认为由NM23-WT和NM23-S120G-六聚体生成的结合的量（两者几乎都由六聚体组成）-100RU处于系统的噪音范围内。
为了进一步测试各种NM23多聚体结合至其同源受体的能力，申请人进行了纳米颗粒实验，参见实施例6和图3c。在本实验中，用自组装型单层（SAM）涂覆金纳米颗粒，该SAM中掺入了NTA-Ni-硫醇。NTA-Ni部分捕获组氨酸标记的蛋白质。如果固定在纳米颗粒上的蛋白质彼此识别并且将连接的纳米颗粒拖拉并拢在一起，纳米金的固有属性使得溶液由特征的粉红色变成蓝色。如果添加于溶液中的二聚化蛋白质结合至颗粒-固定的蛋白质会发生同样的情况。将NM23-S120G-二聚体、NM23-WT或NM23-S120G-六聚体分别地添加到携带有MUCl*ecd肽（PSMGFR）的纳米颗粒中。图3c的照片显示只有二聚体形式的NM23结合至其同源受体MUC1*肽，使得溶液由粉红色转变为蓝色/灰色。不论是野生型NM23还是实际全部表达为六聚体的NM23-S120G突变体都未结合至MUN1*肽并且溶液保持粉红色并且不能与其中未添加NM23蛋白质的对照“无蛋白质”区分。为了确保所观察到的相互作用的特异性，加入产生用于抵抗PSMGFR肽的抗-MUC1*抗体的Fab以竞争性地抑制配体与肽的结合。如在图中可以看出的，Fab抑制NM23二聚体和MUC1*肽的相互作用，表明其是特异性结合。
测试了所有三个批次的NM23、-WT、S120G-六聚体和S120G-二聚体促进未分化的干细胞的生长的能力。将人类胚胎干细胞培养在含有8nM的NM23制剂之一的最低干细胞培养基中。在一个孔中加入游离MUCl*ecd肽（PSMGFR）以竞争性抑制NM23-S120G-二聚体至所有的多能干细胞上的MUC1*受体的结合。结果如图3（d-g）的照片所示。分化的干细胞具有不同于多能干细胞的形态，并且表现为增厚、变黑的细胞区域，而多能干细胞以单白亮的细胞层生长。如可以从图中看出的，只有二聚体制剂的NM23-120G（图3d）能够支持未分化的干细胞的生长。野生型NM23（图3f）导致干细胞在三天后开始分化，而NM23-S120G-六聚体甚至具有更多的分化（图3e）。然而，最大量的分化是由竞争性抑制NM23二聚体和MUC1*受体之间的相互作用所导致产生的（图3g）。
在本实验的另一部分中，测量了miR-145（其为发信号使干细胞退出多能性的微RNA（microRNA））的水平。本实验显示NM23二聚体与MUC1*之间的相互作用的破坏产生了miR-145的波峰（spike），这进一步确证了如下发现，即NM23二聚体与MUC1*之间的相互作用的破坏触发了分化且相反地相互作用促进多能性。在使用非变性凝胶进行凝胶电泳实验的同时表征了在这些实验中使用以测量它们支持多能干细胞生长的能力的蛋白质。图4的非变性凝胶显示NM23-WT几乎全部地由六聚体组成，NM23-S120G-六聚体制剂（prep）具有小群体的二聚体但主要包含六聚体。NM23-S120G-二聚体制剂主要包含二聚体但具有小部分四聚体。使用表面等离子体共振（SPR）测量了由FPLC显示包含60%二聚体的“NM23-S120G-混合”制剂（参见图2）和主要包含六聚体的NM23-WT（图2）结合至MUC1*ecd肽（PSMGFR）的能力。在本实验中，使处于五种不同浓度的每种蛋白质单独地流过用PSMGFR肽涂覆的芯片。图5中重叠的SPR迹线显示结合至MUC1*胞外结构域肽表面的“NM23-S120G-混合”蛋白质粗略地比NM23-WT多8倍。因为野生型蛋白质为六聚体，所以RU的数量必须除以3以与结合的二聚体的量进行比较。尽管野生型和S120G-二聚体两者都显示出在结合方面的浓度依赖性，但是结合的野生型六聚体的量如此少以至于其可能仍然处于系统的噪音范围内。
因此，偏好二聚体形成的NM23突变体、缺失突变体和工程改造变异体用于生长、维持和诱导多能性或多潜能性（例如在体细胞中）以及用于本文所公开的众多应用中是理想的。编码这些变异体的核酸也能够被转染进入细胞中以促进这些细胞的生长。制备了与天然蛋白质相比偏好特异的二聚化状态的蛋白质的示例性的变异体，表征并测试了它们作为特异的多聚体发挥作用的能力。制备并测试的与野生型蛋白质相比具有增加稳定二聚体的群体的NM23变异体列举于表1、3和4中。图27也提供了这类构建体的实例。它们的构建、表达和纯化的方面描述在实施例2、3和9中。与野生型蛋白质相比，它们都导致了稳定二聚体群体的增加。变异体中的一些可选地被复性以增加在体外应用时的二聚体群体。然而，它们不需要复性并且表达时即能够实现与二聚体相关的功能，如支持多能干细胞的生长和抑制分化。图11-图13、图15-图19和图24显示，在没有复性时，NM23变异体模仿二聚体并且具有与NM23-S120G复性二聚体一样或更好的功能，基于典型干细胞生长实验的结果表明变异体实现了所需的功能。
表1、3和4列举了偏好二聚体形成的NM23突变体、工程改造的构建体（其中两个NM23野生型或突变体单体通过接头连接而形成二聚体）和优先地形成二聚体的NM23融合蛋白质。表3列举和描述了生成、表达和表征的NM23变异体，并且测试了它们模拟天然NM23二聚体的行为的能力，特别是测试了它们模拟80%以上为二聚体形式的NM23-S120G-二聚体的行为的能力。在实施例2、实施例3、实施例9和实施例10中描述了用于生成构建体、表达蛋白质和在一些情形下复性的方法。在实施例5-实施例7和实施例11-实施例12中描述了用于测试所产生的变异体的功能的方法。
图6示出若干在表3中所描述的NM23变异体的非还原性（a）和还原性（b）凝胶的照片。还原性凝胶显示这些单链构建体以约等于NM23二聚体的分子量的表观分子量运行。非还原性凝胶显示在非常高的浓度下，存在一些高阶多聚体但是被例如处于细胞中的还原条件或被添加的DTT去除。
图7示出另外两个单链NM23变异体（为二聚体）纯化的PAGE分析。图8和图9示出确认NM23-S120G-IgG1Fc的表达和纯化的凝胶，该NM23-S120G-IgG1Fc为非单链构建体但优先形成二聚体的变异体，并且描述于表4中。图10a示出NM23-S120G-IgG1Fc变异体的FPLC表征，并且显示形成了二聚体的亚群，可以通过蛋白质复性和/或通过FPLC纯化二聚体级分来增加该亚群，在图10b的非还原性凝胶中突出显示。
在NM23变异体中培养多能人类干细胞并且测量它们促进未分化的干细胞的生长和抑制细胞的自发分化的能力。在加有8nM的亦或申请人的标准NM23-S120G-RS或NM23变异体的最低干细胞培养基中培养人类BGOlv/hOG和H9胚胎干细胞两者。有所有的情况下，所测试的NM23变异体完全地支持多能干细胞的生长。细胞形态为典型的未分化的干细胞并且缺乏表示分化的增厚或变黑的区域，参见图11-图13、图15-图19。
除了评估干细胞的形态作为证明NM23变异体发挥与天然二聚体或S120G二聚体一样良好的作用之外，将培养在含有NM23变异体的培养基中的干细胞的生长速率与培养在NM23-S120G“RS”的相同干细胞的生长速率进行了比较，该NM23-S120G“RS”经过复性并随后由FPLC纯化以使所分离的级分基本上为100%的二聚体，参见实施例11c。在这些实验中，将全都取自于同一来源（人类ES-BGOlv/hOG）的200,000干细胞培养于图20和图21中所示出的亦或NM23-S120G RS中亦或NM23变异体之一中。在接种的四天后，通过胰蛋白酶消化来收获细胞，并且在血细胞计数器上对细胞进行计数。如在图片中可以看出的，在每一种情况下，与NM23-S120G（“RS”）的分离的二聚体群体相比，变异体产生了更多的细胞。
作为评估NM23二聚体偏好性变异体的功能的另一种方法，进行定量PCR以测量多能性基因在培养于NM23变异体中的干细胞中的表达水平，参见实施例11d。图22比较了多能性基因Oct4和Nanog加MUC1和NM23在干细胞中的表达水平，该干细胞已经在NM23变异体中培养了至少4次传代。图22的图片显示，对于生长于NM23变异体中的细胞，多能性的这些关键指示基因的表达水平与培养于为纯二聚体群体的NM23-S120G-RS中的细胞相同或更好。
作为工程改造的NM23二聚体偏好性变异体的功能的又进一步测量，跟踪了它们从细胞表面向细胞核的迁移，并且将其与NM23-S120G-RS的迁移进行比较，参见实施例11e和图23-图24。已知NM23二聚体介导NUC1*-阳性癌细胞和全部为MUC1*-阳性的人类多能干细胞的生长。当在含有二聚体形式的NM23的培养基中孵育MUC1*-阳性癌细胞时，NM23二聚体结合至MUC1*受体，变成内在化的并且在30-60分钟内被易位至细胞核，在细胞核中它们可能作为转录因子而起作用。图23示出在存在或不存在0、16nM或128nM的NM23-S120G-RS（100%二聚体群体）下孵育的癌细胞的共聚焦图像。然后用核染色剂DAPI染色细胞，并且然后向该细胞中加入抗-NM23抗体和荧光标记的第二抗体。需要注意的是，内原性NM23也被抗体所染色。但是，只有当作为二聚体外源性地添加NM23时，细胞核中才会有可检测的NM23。先前确定的用于增强细胞生长和用于核定位的NM23-S120G的最佳浓度为8nM至64nM之间。在更高的浓度下，每个NM23二聚体结合至每个MUC1*受体而不是1个二聚体结合至两个MUC1*受体并使两个MUC1*受体二聚化。（参见图1的钟形曲线，出于相同的原因，其中过量的二价抗-MUC1*抗体抑制生长而不是刺激生长）。图23（b、e）显示如白色箭头所示NM23在细胞核中。
图24示出相同实验的共聚焦图像，不同之处在于外源添加的NM23为单链“二聚体”变异体NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC，其为由没有半胱氨酸的修饰的IgG1和IgG2a铰链区连接的两个NM23-S120G单体，参见实施例9c。如在图24中可以看出的，NM23单链变异体可容易地易位至细胞核中（b、e），如白色箭头所指示的。量化NM23-S120G RS（图23h）和单链变异体NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC（图24h）的NM23在细胞核中的量的相应图表显示工程改造的“二聚体”比已经分离为二聚体群体的NM23单体更好地易位至细胞核中。
这些实验表明，用接头连接两个单体或用强二聚化结构域的部分使目标蛋白质融合能够产生更稳定的“二聚体”，其在宽的浓度范围内作为二聚体发挥作用，而天然NM23的多聚化状态高度地依赖于浓度并且只有在非常低的纳摩尔浓度下才作为二聚体存在。偏好二聚化的突变体NM23蛋白质是为促进生长因子功能和多能性而对野生型蛋白质的改进，但是基于序列、表达和纯化的方法，它们在产生的二聚体的量方面以及在这些二聚体的稳定性方面存在很大的差别。不论是作为单链构建体还是作为如表3和4中列举的那些融合蛋白质的NM23变异体，都代表了对现有技术的改进，因这它们增加了形成的二聚体的部分、增加了二聚体稳定性，并且更重要的是能够在细胞或有机体中以伪二聚体（pseudo dimer）表达，而在这些细胞或有机体中不能进行用于形成“偏好二聚体形成”的突变体的二聚体所需要的表达方法和复性方法。
任何本发明的突变体、缺失体和/或单链或融合嵌合体，包括实施例2、9和10中描述的那些，都能够制成由在体外、离体和/或体内使用的表达细胞来分泌。引起表达的蛋白质被分泌的序列为本领域技术人员所熟知。特别地，将源自抗体的序列添加到蛋白质的N-末端或添加到目标基因的5’末端。除了包含前导序列之外，表达细胞类型不必限于大肠杆菌，并且还包括哺乳动物细胞、哺乳动物表达细胞、酵母、体细胞、干细胞、iPS细胞或经过诱导多能性或与起始细胞相比诱导至较不成熟的状态的细胞。
并不意在将NM23、突变体或其变异体的用途限于与人类细胞使用或在人体中使用。与NM23一样，MUC1*在哺乳动物中具有极大的序列同源性。图25示出小鼠胚胎干细胞在人类NM23二聚体中与它们在标准小鼠LIF中生长的一样良好。
表2示出能够与任何配体一起使用的各种接头，但是在优选的实施方式中与表1所示的NM23变异体一起使用。表2还列举了基因地融合至表1中所列举的配体单体以形成组成型活性形式的蛋白质的蛋白质的部分，其在特别优选的实施方式中为NM23。
除了偏好二聚体形成且抵抗高阶多聚体形成的S120G突变体之外，存在其他也偏好二聚体形成或稳定化的突变体和变异体。例如，更容易表达并维持作为稳定的二聚体的另一种NM23突变体是P96S突变。制备形成或稳定二聚体的变异体的另一种途径是使参与形成高阶多聚体（如四聚体和六聚体）的蛋白质的区域缺失。例如，在NM23-H1中，C-末端促进形成四聚体和六聚体。优选在该C-末端缺失1至9个氨基酸以生成具有增加的活性的NM23变异体，增加的活性包括增加的生长因子活性、增加的对MUC1*生长因子受体的结合和/或增加的对调节其他多能性和多潜能性基因的表达的核酸的结合。
在优选的实施方式中，从人类NM23-H1的C-末端缺失2个氨基酸（CΔ2）。在特别优选的实施方式中，缺失6个氨基酸（CΔ6）。为了使溶解度、二聚体的表达或二聚体的稳定化最大化，蛋白质可以制备为具有一个或多个突变加上缺失。例如，当作为重组蛋白质表达时，具有主要为二聚体的可溶级分的一种NM23变异体为NM23-P96S-CΔ6。这种NM23用于刺激干细胞或祖细胞的生长是理想的，因为它不需要被变性和复性、具有主要部分的为二聚体的可溶性级分、并且可以进一步通过尺寸排阻色谱法纯化的二聚体群体在很长一段时间内保持稳定。
图14c、14d、14e和14f分别示出NM23-P96S-CΔ2和NM23-P96S-CΔ6的凝胶和FPLC迹线。在实施例2c中描述了构建体设计和蛋白质表达及纯化。此外，图15示出在最低培养基中已经使用NM23-P96S-CΔ2和NM23-P96S-CΔ6增殖的人类ES细胞的照片。图22示出在用这种NM23变异体增殖后这些人类干细胞的基因表达。将基因表达水平与在a）至c）任一中相同人类胚胎细胞系的生长进行比较：a）来自成纤维细胞饲养细胞（fibroblast feeder cells）的bFGF和条件培养基；b）复性且纯化为二聚体的同源群体的NM23-S120G；或c）NM23-P96S-CΔ6。这些结果确认培养于两种形式的NM23中的干细胞在基因水平上是可比的。
如实施例2和9中所描述的产生在表1、3和4中所列举的其他NM23变异体。图11-图13和图15-图19显示它们有效地促进了人类干细胞的生长。因为MUC1的近膜区（membrane proximal regions）（即，MUC1*或PSMGFR区和自聚集结构域（IBR））在哺乳动物中高度保守的，申请人测试并确认NM23二聚体还促进小鼠干细胞的生长和维持。本发明还包括NM23二聚体且特别是本文所描述的变异体将用于在人类以及小鼠细胞中维持以及诱导多能性和多潜能性。
人类NM23-H1和其他哺乳动物直系同源物（包括但不限于小鼠NM23）的序列比对将阐明应该被突变或缺失的直系同源蛋白质的可比区。
癌细胞的生长
本文所描述的NM23变异体也可以用作用于治疗MUC1*-阳性癌症的药物递送的载体（vehicle）。例如，可以将细胞毒性剂化学地偶联至NM23或NM23变异体。毒素可以基因工程改造以使它们连接至NM23。可替代地，可以修饰该NM23变异体，例如用半胱氨酸或者用促进治疗剂化学偶联至NM23变异体的某些酶特异性序列修饰。
二聚形式的NM23结合至干细胞和祖细胞上的MUC1*受体。结合至MUC1*促进NM23二聚体的胞吞作用，此后它们被易位至细胞核，在细胞核中NM23以二聚体结合至DNA以调节参与生长和维持干细胞和祖细胞的多能性以及多潜能性的基因的转录。因此，一方面，本发明涉及使用本文所描述的方法来制备在生长、维持和诱导多能性中使用的偏好二聚体形成的NM23变异体。即，偏好二聚体形成的NM23变异体可以在体外使用以促进干细胞和祖细胞的生长并维持多能性或多潜能性。此外，本发明还包括将这些NM23变异体给予至患者以治疗能够受益于用未成熟的细胞（包括干细胞和祖细胞）的治疗的病症。可以全身性地或局部地向患者给予NM23和NM23变异体。
本发明还包括使用类似的方法来形成不是二聚体的多聚体，如高阶多聚体，包括但不限于四聚体或六聚体。此外，多聚体不必是蛋白质的活性状态。例如，在许多情况下，需要用组成性非活性形式的蛋白质来治疗患者。在优选的实施方式中，用非活性形式的生长因子来治疗患者。在更优选的实施方式中，非活性形式是六聚体。在更加优选的实施方式中，患者是癌症患者并且用六聚形式的NM23进行治疗。可以通过表达天然蛋白质来获得NM23六聚体。更优选的是其中使用接头或本文所描述的嵌合体策略连接的4-6个单体的变异体。例如，为了制备非活性的NM23变异体，可以制备NM23-抗体片段嵌合体，其中Fc区或绞链区取自IgM抗体以使该NM23能够偏好形成五聚体。
本发明不限于本文的具体实施方式的范围。事实上，除了本文的那些之外，基于上述描述以及附图，本发明的各种改变对本领域技术人员而言是明显的。意在将此类改变落入随附权利要求的范围内。以举例说明本发明的方式而不是以限制的方式提供下列实施例。
实施例
实施例1.由配体诱导的二聚化活化的MUC1*生长因子受体
I类生长因子受体由配体诱导的它们的胞外结构域的二聚化来活化。为了说明MUC1*被配体诱导的其胞外结构域的二聚化而活化，申请人用亦或二价抗-MUC1*抗体亦或相同抗体的单价Fab处理MUC1*阳性细胞，ZR75-30乳腺癌细胞。图1的图表示出二价抗体刺激生长直到其以过量的浓度添加，此时不是每个二价抗体使两个受体二聚化，而是每个抗体各自结合至一个受体。这抑制了生长。添加相同抗体的Fab导致细胞生长的抑制并且诱导细胞死亡。不论是二价的抗体还是抗-MUC1*抗体的一价Fab都不影响MUC1*-阴性HEK-293细胞（K293）.
实施例2.产生蛋白质构建体
实施例2a.NM23-WT
通过使用下列引物的聚合酶链反应（PCR）扩增NM23wt：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:3）
反向5’-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3’（SEQ ID NO:4）
然后纯化、消化（Ndel、Xhol）并且在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间克隆片段。
实施例2b.NM23-S120G
使用下列引物：5’-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3’（SEQ ID NO:5）和5’-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3’（SEQ ID NO:6），根据生产商的说明书使用GeneTailorTM位点定向突变系统（Life Technologies）制备NM23-H1突变体（丝氨酸#120突变为甘氨酸）。图2示出将野生型蛋白质的多聚化状态与非复性的S120G突变体和复性的S120G进行比较的叠加的FPLC迹线。图5-图6示出只有二聚形式的蛋白质结合至MUC1*（而不是六聚体）并且只有二聚体能够支持多能干细胞的生长。图16示出表达的并复性的蛋白质的非还原性SDS-PAGE表征和相应的FPLC迹线以及人类干细胞的照片，显示NM23-S120G支持多能干细胞生长的能力。
实施例2c.NM23P96S和缺失构建体
申请人使用下列引物：5’-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3’（SEQ ID NO:7）和5’-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3’（SEQ ID NO:8），根据生产商的说明书使用QuickChange位点定向诱变试剂盒（Agilent）产生NM23-H1突变体P96S（脯氨酸#96突变为丝氨酸）。用于PCR反应的模板是克隆在Ndel和Xhol限制性位点之间的NM23野生型。在序列确认后，由PCR产生缺失构建体。使用下列引物：5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgta ccttc-3’（SEQ ID NO:9）和5’-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3’（SEQ ID NO:10）扩增NM23P96SΔC1。使用下列引物：5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgt accttc-3’（SEQ ID NO:11）和5’-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3’（SEQ ID NO:12）扩增NM23P96SΔC2。使用下列引物：5’-atcgatcatatggccaactgtga gcgtaccttc-3’（SEQ ID NO:13）和5’-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3’（SEQ ID NO:14）扩增NM23P96SΔC6。纯化、消化（Ndel、AgeI）并且在表达载体pET21b的NdeI和AgeI限制性位点之间克隆所得的片段。先前通过使用重叠PCR方法由AgeI替换XhoI限制位点修饰了pET21b。当在NdeI和XhoI之间克隆NM23-P96S时观察到最佳的二聚体形成。当在NdeI和AgeI之间克隆时观察到所有缺失突变体的最佳二聚体形成。图14示出这些表达的蛋白质的非还原性SDS-PAGE表征和相应的FPLC迹线，其中该蛋白质是未复性的或FPLC纯化的。图15示出它们支持多能干细胞生长的能力。
实施例3a.蛋白质表达和可选的复性（重新折叠）/纯化
用1/10的过夜培养物接种LB肉汤（Luria-Bertani肉汤）并且在37℃下培养直到OD600达到至0.5。在这一点上，用0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，GoldBiotechnology）诱导重组蛋白质表达并且在5h后停止培养。通过离心（在4℃下6000rpm，10min）收获细胞后，用流动的缓冲液（PBS pH7.4，360mM NaCl和80mM咪唑）重悬浮细胞沉淀（cell pellet）。随后加入溶菌酶（1mg/mL，Sigma）、MgCl2（0.5mM）和DNAse（0.5ug/mL，Sigma）。在37℃下在旋转平台（275rpm）上孵育30min，并且在冰上超声5min。通过离心（在4℃下20000rpm，30min）去除不溶的细胞碎片。然后将澄清的裂解液施用至用流动缓冲液平衡的Ni-NTA柱（Qiagen）上。在将蛋白质从柱上洗脱下来之前，用添加有420mM咪唑的流动缓冲液（6CV）洗涤该柱（8CV）。
实施例3b.用于随后复性的可选的蛋白质变性
对于蛋白质变性，汇集洗脱级分并且通过加入1体积的l00mM Tris pH8.0+8M尿素变性，将溶液浓缩至一半并且加入另一体积的l00mM Tris pH8.0+8M尿素。重复该循环直到最终的尿素浓度为约7M。然后通过透析复性蛋白质。
复性方法（protocol）
将变性的蛋白质相对l00mM Tris pH8.0、4M尿素、0.2mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%丙三醇透析过夜；然后相对l00mM Tris pH8.0、2M尿素、0.2mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%丙三醇透析24h；接下来，将蛋白质相对100mMTris pH8.0、1M尿素、0.2mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%丙三醇透析24h；然后相对100mM Tris pH8.0、0.2mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%丙三醇透析8h；然后，将蛋白质相对25mM Tris pH8.0、0.2mM咪唑、0.1M L-精氨酸、1mM EDTA和5%丙三醇透析过夜；相对PBS pH7.4、0.2mM咪唑、1mM EDTA和5%丙三醇透析3x3h；相对PBS pH7.4、0.2mM咪唑、1mM EDTA和5%丙三醇透析过夜；最后在4℃下离心复性的蛋白质（18,500rpm）30min并且收集上清液。
可选的FPLC纯化
使用尺寸排除色谱法（也称为FPLC）从混合的集合体中进一步纯化特定的多聚体。通过尺寸排阻色谱法（Superdex200）"FPLC"进一步纯化二聚体。收集和汇集基本上为100%二聚体的FPLC级分，并且分成等分（aliquote）并在-80℃下存贮，并且在本文中将其称为NM23-S120G-RS或S120G-RS。汇集含有二聚体的级分。
实施例4.FPLC表征NM23野生型与三种不同制剂的重组NM23-S120G突变体的比较
典型地，将500μL待表征的各个样品装载在Superdex20010/300GL柱上。通过与由在表征样品蛋白质之间注射的分子量标准获得的FPLC迹线相比较确定各物类峰（species peak）的分子量。图2示出FPLC迹线的重叠，其表征了NM23-WT的多聚体组合物与从所表达的蛋白质的第一制剂的可溶级分（此处标记为NM23-S120G-六聚体）、从第二制剂的可溶级分（此处标记为NM23-S120G-混合）、或变性和复性的S120G的制剂（此处标记为NM23-S120G-二聚体）中纯化出的NM23-S120G的对比。将500μL各样品装载于Superdex20010/300GL上。以0.17mg/ml装载NM23-WT，以0.19mg/ml装载NM23-S120G-六聚体，以0.10mg/ml装载NM23-S120G-混合且以0.15mg/ml装载NM23-S120G-二聚体。NM23-WT和NM23-S120G-六聚体在96kDa处具有它们的主峰，这对应于NM23六聚体的分子量；NM23-S120G-混合和NM23-S120G-二聚体两者在29KDa处具有它们的主峰，这对应于二聚体，然而，二聚体在复性的制剂、NM23-S120G-二聚体中的相对比例要远大于自可溶部分中分离的级分。
实施例5.表面等离子体共振（SPR）以测试不同NM23多聚体结合至固定在SPR芯片上的MUC1*胞外结构域肽（PSMGFR）的能力
使用表面等离子体共振的技术测试重组NM23-S120G的三种不同制剂和NM23-WT（野生型）结合至MUC1*胞外域肽（PSMGFR序列）的能力。首先，由FPLC分析了不同的制剂以根据它们形成何种多聚体来表征它们。在图2中示出所测试的NM23品种的FPLC分析并且描述在以上实施例4中。还在不破坏二硫键的非还原性凝胶上通过凝胶电泳分析了样品，参见图3a。NM23-S120G二聚体以约40KDa显示在非还原性凝胶上。相反地，单体、四聚体和六聚体以约20KDa的表观分子量运行，这大概是因为高阶多聚体不依赖于二硫键形成。需要注意的是，在图2中通过FPLC以96KDa运行的同一制剂（六聚体）在非还原性凝胶上以20KDa运行。
使用Biacore3000仪器进行表面等离子体共振（SPR）实验。根据Bamdad,C.（The use of variable density self-assembled monolayers to probe the structure of a targetmolecule.Biophys J.1998Oct;75（4）:1989-96）的方法用自组装单层（SAM）涂覆祼露的金Biacore芯片。形成存在3.8%NTA-Ni的NTA-Ni-三乙二醇SAM，其结合至并且捕获组氨酸标记的蛋白质。使组氨酸标记的PSMGFR肽（MUCl*ecd肽）流过该芯片的表面并且固定至饱和。随后，将NM23-S120G的四种不同的制剂的每一种注射在稳定的肽表面上。
表3b的表面等离子共振（SPR）测量的重叠示出四种不同的NM23制剂在结合至连接到SPR芯片表面的MUC1*胞外域肽（PSMGFR）的能力方面的巨大差异。结果表明NM23结合至其同源受体MUC1*的量是样品中存在多少二聚体的函数。SPR测量芯片溶液界面上的蛋白质质量，所以如果六聚体结合至MUC1*肽表面，其将产生比二聚体结合大3倍的SPR信号。这意味着结合至MUC1*肽的NM23-WT或NM23-S120G-六聚体的量比结合的NM23-S120G-二聚体的量少约12倍。在对照实验中，将不相干的肽固定在同一芯片上并且产生极微量的背景结合，将其从所示出的测量结果中减去。然而，通常认为由NM23-WT和NM23-S120G-六聚体生成的结合的量（两者几乎都由六聚体组成）-100RU处于系统的噪音范围内。
进行了类似的SPR实验并且结果如图5所示。与基本上由六聚体组成的NM23-WT一起（图2）使用表面等离子共振（SPR）测量由FPLC示出为包含60%二聚体的“NM23-S120G-混合”制剂（参见图2）以测量它们结合至MUC1*ecd肽（PSMGFR序列）的能力。在本实验中，使处于五个不同浓度的每种蛋白质独立地流过用PSMGFR肽涂覆的芯片。在图5中示出的SPR迹线的叠加显示结合至MUC1*胞外域肽表面的“NM23-S120G-混合”蛋白质比NM23-WT大概多8倍。因为野生型蛋白质为六聚体，所以RU的数目必须除以3以与结合的二聚体的量相比较。虽然野生型和S120G-二聚体两者都显示出浓度依赖性结合，但是结合的野生型六聚体的量如此之少以至于其可以仍处于系统的噪音范围内。一并考虑，这些SPR实验表明六聚体形式的NM23不与MUC1*受体结合。
实施例6.进行纳米颗粒实验以进一步测试NM23二聚体与NM23六聚体相比结合至MUC1*ecd肽（PSMGFR）的能力
根据Thompson等人（dx.doi.org/10.1021/am200459a|ACS Appl.Mater.Interfaces2011,3,2979-2987）的方法在金纳米颗粒上形成NTA-Ni SAM。在该方法中，用使NTA-Ni-硫醇并入SAM中的自组装单层（SAM）涂覆金纳米颗粒。NTA-Ni部分捕获组氨酸标记的蛋白。如果固定在纳米颗粒上的蛋白质彼此识别并且将所连接的纳米颗粒拖拽靠近在一起，纳米金的内在性质导致溶液由特征的粉红色变为蓝色。如果添加至溶液中的二聚蛋白质结合至颗粒-固定的蛋白质，发生同样的情况。分别将NM23-S120G-二聚体、NM23-WT或NM23-S120G-六聚体加入到带有MUCl*ecd肽（PSMGFR）的纳米颗粒中。
图3c的照片示出只有二聚体形式的NM23结合至其同源受体MUC1*肽，使得溶液由粉红色变为蓝色/灰色。NM23-S120G-RS（复性且纯化的）和NM23-P96S-ΔC2（未复性的）结合至颗粒-固定的MUC1*肽。实质上都以六聚体表达的野生型NM23和NM23-S120G突变体都不与MUC1*肽结合，并且溶液保持粉红色且不能与其中未添加NM23蛋白质的对照“无蛋白质”区分。为确保所观察到的相互作用的特异性，添加产生用于抗PSMGFR肽的抗-MUC1*抗体的Fab以竞争性地抑制配体与肽的结合。如在图中可以看出的，Fab抑制NM23二聚体和MUC1*肽的相互作用，表明其是特异性结合。
实施例7.NM23二聚体与六聚体相比促进多能干细胞的生长的能力的功能性测试
测试了三批的NM23、-WT、S120G-六聚体和S120G-二聚体促进未分化的干细胞的生长的能力。将人类胚胎干细胞（H9）培养在含有8nM的NM23制剂之一的最低干细胞培养基（在以下实施例8中描述本培养基）中。在一个孔中，加入游离MUCl*ecd肽（PSMGFR）以竞争性地抑制NM23-S120G-二聚体对所有多能干细胞上的MUC1*受体的结合。将细胞以200,000细胞每孔接种于6-孔板上，该6-孔板已经涂覆有抗-MUC1*单克隆抗体（MN-C3）以使干细胞粘附。如通常的，每48小时换一次培养基。在第4天拍摄照片（Olympus IX71倒置显微镜）。结果如图3（d-g）的照片所示。分化的干细胞具有不同于多能干细胞的形态并且呈现为变厚、变黑的细胞区，而多能干细胞以单亮层细胞生长。如有图中可以看出的，只有二聚体制剂的NM23-S120G（d）能够支持未分化的干细胞的生长。野生型NM23（f）导致干细胞在三天后开始分化，而NM23-S120G-六聚体甚至具有更多的分化（e）。然而，最大量的分化是作为竞争性抑制NM23二聚体和MUC1*受体之间的相互作用的结果而产生的（g）。在对照孔中，在添加标准4ng/mL bFGF加50%MEF条件培养基的最低干细胞培养基中培养H9干细胞，其中将干细胞接种在Matrigel的层上。NM23-S120G-RS以及NM23变异体表现与这些对照一样好或更好。
在该实验的另一部分中，测量了miR-145（其为发信号使干细胞退出多能性的微RNA）的水平。本实验显示破坏NM23二聚体与MUC1*之间的相互作用产生了miR-145的波峰（spike），这进一步确证了如下发现，即破坏NM23二聚体与MUC1*之间的相互作用引发分化并且相反地该相互作用促进多能性。在通过使用非变性天然凝胶进行凝胶电泳实验的同时表征了在这些实验中使用的蛋白质以测量它们支持多能干细胞生长的能力。图4的非变性凝胶显示NM23-WT基本上由六聚体组成，NM23-S120G-六聚体制剂具有小群体的二聚体但主要包含六聚体。NM23-S120G-二聚体制剂主要地包含二聚体但具有小部分地四聚体。
实施例8.最低干细胞培养基（也称为“最低培养基”）
400ml DME/F12/GlutaM AX I（Invitrogen#10565-018）
100ml Knockout血清替代品（Invitrogen#10828-028）
5ml100x MEM非必需氨基酸溶液（Invitrogen#11140-050）
0.9ml（0.1mM）β-巯基乙醇（55mM储液，Invitrogen#21985-023）
2.5ml PSA（青霉素、链霉素、两性霉素）MP Biochem（#1674049）
实施例9.产生NM23变异体-构建体
单链NM23构建体
通过制备连接两个蛋白质单体的构建体可以将具有或不具有突变的NM23（如S120G、P96S或C-末端缺失突变体）工程改造为偏好二聚体形成。优选使得蛋白质抵抗四聚体和六聚体的形成的NM23-S120G或其他突变。表2给出了DNA序列，随后是所编码的氨基酸序列。图6示出已经复性的单链变异体的还原性和非还原性SDS-PAGE表征。该凝胶证实其各自以单体-接头-单体的表观分子量运行。该非还原性凝胶显示依赖于二硫键形成的小群体的高阶多聚体，通过加入如细胞质一样产生还原性环境的DTT来消除该二硫键。
实施例9a.NM23S120G GS2接头
使用如下引物由PCR在NM23S120G（3’）的阅读框内引入(GGGGS)x2接头：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:15）
反向5’-atcgatgctagcggatccgccaccgccggatccgccaccgccttcatagatccagttctgagcacagctcg-3’（SEQ ID NO:16）。
纯化、消化（NdeI，NheI）并且在表达载体pET21b的NdeI和NheI限制性位点之间克隆所得到的片段。
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增另一个NM23S120G片段：
正向5’-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3’（SEQ ID NO:17）
反向5’-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3’（SEQ ID NO:18）。
然后纯化、消化（NheI/XhoI）并且在先前克隆的包含(GGGGS)x2接头的NM23S120G的NheI和XhoI限制性位点之间的阅读框内克隆该片段。对于体外应用，使用可选的实施例3b的复性方法，其中可选添加1-5mM DTT纯化和/或复性所表达的蛋白质。图11示出FPLC分析（a）、复性的蛋白质的SDS-PAGE表征（b）和非复性的、非纯化的蛋白质支持多能干细胞的生长的能力（c-e）。图17示出这种变异体支持多能干细胞生长的能力而无需复性或纯化。图26示出这种变异体的非还原性SDS-PAGE表征的照片，该变异体未经复性，其显示主要群体为二聚体并且其基本上不含六聚体和其他高阶多聚体。
实施例9b.NM23S120G GS3接头
使用下列引物由PCR在NM23S120G（3’）的阅读框内引入(GGGGS)x3接头：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:19）
反向5’-atcgatgctagcggatccgccaccgccggatccgccaccgccggatccgccaccgcttcatagatccagttctgagcacagctcg-3’（SEQ ID NO:20）。
纯化、消化（NdeI，NheI）并且在表达载体pET21b的NdeI和NheI限制性位点之间克隆所获得的片段。
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增另一个NM23S120G片段：
正向5’-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3’（SEQ ID NO:21）
反向5’-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3’（SEQ ID NO:22）。
然后纯化、消化（NheI/XhoI）并且在先前克隆的包含(GGGGS)x3接头的NM23S120G的NheI和XhoI限制性位点之间的阅读框中克隆该片段。对于体外应用，可以使用可选的实施例3b的复性方法以可选添加1-5mM DTT纯化和/或复性所表达的蛋白质。
实施例9c.NM23-S120G-IgG1h noC（无半胱氨酸的修饰的IgG1的铰链区）
通过2个连续的PCR反应在NM23S120G（3’）的阅读框内引入无半胱氨酸的修饰的IgG1的铰链区。首先，使用了如下的一对引物：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:23）
反向IgG1#1tccggcgccggttttggcggtttagtatgggttttatcttcatagatccagttctgagca cagctcg（SEQ ID NO:24）；
纯化该PCR片段并且在使用下列引物的第二PCR反应中将其用作模板：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:25）
反向IgGl#2atcgatgctagcaccggtaccaggaccacccagcagttccggcgccggttttggc gtttagtatg（SEQ ID NO:26）。
纯化、消化（Ndel，NheI）并且在表达载体pET21b的NdeI和NheI限制性位点之间克隆所获得的片段。
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增另一个NM23S120G片段：
正向5’-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3’（SEQ ID NO:27）
反向5’-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3’（SEQ ID NO:28）。
然后纯化、消化（NheI/XhoI）并且在先前克隆的包含修饰的铰链区接头的NM23S120G的NheI和XhoI限制性位点之间的阅读框中克隆该片段。对于体外应用，可以使用可选的实施例3b的复性方法，其中可选添加的1-5mM DTT纯化和/或复性所表达的蛋白质。图7示出在镍柱上纯化所表达的蛋白质。图12示出FPLC分析（a）、复性蛋白质的SDS-PAGE表征（b）和非复性的、非纯化的蛋白质支持多能干细胞生长的能力（c-e）。图18示出这种变异体支持多能干细胞的生长的能力，而无需复性或纯化。图26示出这种变异体的非还原性SDS-PAGE表征的照片，该变异体未经复性，其显示主要群体为二聚体并且其基本上没有六聚体或其他高阶多聚体。
实施例9d.NM23S120G IgG2a noC（无半胱氨酸的修饰的IgG2a的铰链区）
由2个连续的PCR反应在NM23S120G（3'）的阅读框内引入无半胱氨酸的修饰的IgG2a的铰链区。首先使用了如下的一对引物：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:29）
反向IgG2a#l tcggaggtttcggaggtttaatagtcggaccaccagtttcatagatccagttct gagcacagctcg（SEQ ID NO:30）；
纯化该PCR片段并且在使用了下列引物的第二PCR反应中将其用作模板：
正向5’-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3’（SEQ ID NO:31）
反向IgG2a#2atcgatgctagccggaccacccagcaggttcggagcaggtttcggaggtttcggaggtttaatagtcg（SEQ ID NO:32）。
纯化、消化（NdeI，NheI）并且在表达载体pET21b的NdeI和NheI限制性位点之间克隆所获得的片段。
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增另一个NM23S120G片段：
正向5’-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3’（SEQ ID NO:33）
反向5’-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3’（SEQ ID NO:34）。
然后纯化、消化（NheI/XhoI）并且在先前克隆的包含修饰的铰链区接头的NM23S120G的NheI和XhoI限制性位点之间的阅读框内克隆该片段。对于体外应用，可以使用可选的实施例3b的复性方法，其中可选添加的1-5mM DTT纯化和/或复性所表达的蛋白质。图7示出在镍柱上纯化所表达的蛋白质。图12示出FPLC分析（a）、复性的蛋白质的SDS-PAGE表征（b）和非复性的、非纯化的蛋白质支持多能干细胞的生长的能力（c-e）。
实施例9e.NM23S120G IgG1h/IgG2ah noC（无半胱氨酸的修饰的IgGl和IgG2a的铰链区）
由4个连续的PCR反应在NM23S120G（3'）的阅读框内引入无半胱氨酸的修饰的IgGl和IgG2a铰链区。首先使用了如下的一对引物：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:35）
反向#1tccggcgccggttttggcggtttagtatgggttttatcttcatagatccagttctgagca cagctcg（SEQ IDNO:36）；
纯化该PCR片段并且在使用下列引物的第二PCR反应中将其用作模板：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:37）
反向#2tcggaccaccagtaccggtaccaggaccacccagcagttccggcgccggttttggc ggtttagtatg（SEQID NO:38）；
纯化该PCR片段并且在使用下列引物的第三PCR反应中将其用作模板：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:39）
反向#3tcggagcaggtttcggaggtttcggaggtttaatagtcggaccaccagtaccggta ccaggaccac（SEQID NO:40）；
纯化该PCR片段并且在使用下列引物的第四PCR反应中将其用作模板：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:41）
反向#4atcgatgctagccggaccacccagcaggttcggagcaggtttcggaggtttcggag（SEQ IDNO:42）。
纯化、消化（NdeI，NheI）并且在表达载体pET21b的NdeI和NheI限制性位点之间克隆所获得的片段。
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增另一个NM23S120G片段：
正向5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（SEQ ID NO:43）
反向5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（SEQ ID NO:44）。
然后纯化、消化（NheI/XhoI）并且在先前克隆的包含IgGl和IgG2a两者修饰的铰链区接头的NM23S120G的NheI和XhoI限制性位点之间的阅读框内克隆该片段。对于体外应用，可以使用可选的实施例3b的复性方法，其中可选添加1-5mM DTT纯化和/或复性所表达的蛋白质。图13示出FPLC分析（a）、复性的蛋白质的SDS-PAGE表征（b）和非复性的、非纯化的蛋白质支持多能干细胞的生长的能力（c-e）。图18示出这种变异体支持多能干细胞的生长的能力，其无需复性或纯化。图26示出未经复性的这种变异体的非还原性SDS-PAGE表征的照片，显示主要的群体为二聚体并且其基本上不含有六聚体和其他高阶多聚体。
实施例10.使NM23嵌合体二聚化
融合蛋白质是产生偏好二聚体形成的NM23变异体的另一种方法，其中NM23-wt或优选地S120G变异体基因被融合至天然地二聚化的蛋白质，并且如果包括S120G突变，那么所得的二聚体将抵抗形成高阶多聚体如四聚体和六聚体。做到这一点的方法之一是将NM23或结合至MUC1*肽的NM23的部分融合至抗体的Fc部分。抗体的该Fc部分通过半胱氨酸之间的二硫键同源二聚化。这种构建体由连接至IgG抗体的Fc区的NM23-S120G蛋白质组成。内含的组氨酸标记使得能够在NTA-Ni亲和柱上纯化。可替代地，可以在蛋白A或蛋白G柱上纯化融合蛋白质。用胃蛋白酶裂解使Fc区裂解并且释放出半胱氨酸正下方的部分。
实施例10a.NM23S120G-IgGl Fc（融合至Fc区抗体的NM23）
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）扩增NM23S120G：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:45）
反向5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（SEQ ID NO:46）。
然后纯化、消化（Ndel，XhoI）并且在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间克隆该片段。
使用下列引物由PCR扩增IgG1的Fc区：
正向5'-attgtgctcgagggttgtaagccttgcatatgtacagtcccag-3'（SEQ ID NO:47）
反向5'-gcactactcgagtttaccaggagagtgggagaggctcttctcag-3'（SEQ ID NO:48）。
纯化、消化（XhoI）并且在先前克隆的NM23S120G的阅读框内（在XhoI限制性位点处）克隆该片段。对于体外应用，可以纯化和/或复性所表达的蛋白质。如果蛋白质处于包涵体中：通过离心（在4℃下6000rpm，10min）收获细胞后，用流动的缓冲液（100mM NaH2PO4，l0mM Tris pH8.0，10mM咪唑和8M尿素）重悬浮细胞沉淀。在37℃于旋转平台（275rpm）上孵育该溶液30min，并且在冰上超声处理5min。通过离心（在4℃下20000rpm，30min）去除不溶的细胞碎片。然后将澄清裂解液施用到用流动缓冲液平衡的Ni-NTA柱（Qiagen）上。在使用补充有420mM咪唑的流动缓冲液将蛋白质从柱中洗脱下来（6CV）之前洗涤该柱（8CV）。在复性之前，汇集NTA-Ni洗脱级分并且加入5mM还原型谷胱甘肽（GSSH）和0.5mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）并且在4℃下搅拌孵育过夜。使用可选的实施例3b的复性方法将蛋白质复性。为了避免蛋白质被封锁在包涵体中，需要变性和复性，进行如下：可以将蛋白质表达物引导至表达细胞的周质中，这已被证明有利于二硫键形成并且使蛋白质能够正确地折叠和可溶。图8-图10示出这种变异体的纯化、SDS-PAGE和FPLC表征。
实施例10b.NM23S120G IgG1h（融合至IgG1的铰链区的NM23）
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）将IgG1铰链区3’融合至NM23S120G：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:49）
反向5'-atcgatctcgagaccaacacaaatacacggtttacaaccagaatcacgtggcaccggttcatagatccagttctgagcacagctcg-3'（SEQ ID NO:50）。
然后纯化、消化（Ndel，XhoI）并且在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间克隆该片段。对于在实施例10a中描述的体外应用，可以纯化和/或复性所表达的蛋白质。
实施例10c.NM23S120G IgG2ah（融合至IgG2a的铰链区的NM23）
使用下列引物由聚合酶链反应（PCR）将IgG2a铰链区3’融合至NM23S120G：
正向5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（SEQ ID NO:51）
反向5'atcgatctcgagacctggacatttacacggtggacacggtttaatggtcggaccacgcggttcatagatccagttctgagcacagctcg-3'（SEQ ID NO:52）。
然后纯化、消化（Ndel，XhoI）并且在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间克隆该片段。对于在实施例10a中描述的体外应用，可以纯化和/或复性所表达的蛋白质。
实施例11.NM23变异体的功能分析
实施例11a.形成稳定的二聚体的能力
首先，测试生成的NM23变异体形成二聚体的能力。单链构建体应当以单体-接头-单体的分子量迁移通过还原性SDS-PAGE凝胶。在非还原性凝胶上，单链变异体以二聚体的表观分子量迁移，而高阶多聚体一般以单体的表观分子量运行。典型的四聚体和六聚体不依赖于二硫键来多聚化，而天然NM23、NM23-S120G和NM23-P96S和其他变异体的二聚体则依赖于二硫键。非变性凝胶和FPLC还被用来确定变异体的多聚化状态。显示二聚体的形成的还原性和非还原性SDS-PAGE凝胶如图3、图6、图9、图10-图14、图16和图26所示。显示二聚体形成的FPLC迹线如图2、图10-图14和图16所示。图4示出非变性SDS-PAGE凝胶。
实施例11b.促进多能干细胞生长的能力
以200,000细胞每孔的密度将H9或BGOlv/hOG胚胎干细胞接种在Matrigel涂覆的或抗-MUCl*（MN-C3）抗体涂覆的6-孔细胞培养板上。细胞培养于添加有8nMNM23-S120G-RS或本发明的NM23变异体的最低干细胞培养基中（参见实施例8）。对于BGOlv/hOG细胞，每24小时换一次培养基，而对于H9细胞，每48小时换一次培养基。对于BGOlv/hOG细胞，在每次培养基替换时加入Rho激酶抑制剂，但是对于H9细胞，只在第一个48小时加入。将细胞培养4天，然后在放大倍率下拍照。图11-图13和图15-图19示出结果。细胞形态表明细胞是未分化的，原因在于它们是没有结块或变黑的单层。
实施例11c.培养在NM23变异体中的干细胞的生长速率
除了评估干细胞形态作为证明NM23变异体发挥天然二聚体或S120G二聚体的功能的证据之外，将培养在含有NM23变异体的培养基中的干细胞的生长速率与培养在NM23-S120G“RS”中的相同细胞的生长速率进行比较，NM23-S120G“RS”已经复性并且通过FPLC纯化以使所分离的级分基本上为100%的二聚体。在这些实施例中，将全部抽取自相同来源（人类ES-BGOlv/hOG）的200,000个干细胞培养在NM23-S120G RS或培养在图20和图21中示出的NM23变异体之一中。接种的4天后，通过胰蛋白酶消化收获细胞并且在血细胞计数器上计数细胞。如在图表中可以看出的，在每一种情况下，变异体比分离的NM23-S120G（“RS”）的二聚体群体产生更多的细胞。
实施例11d.RT-PCR分析培养在NM23变异体中的干细胞中的多能性基因的表达水平
作为评估NM23二聚体偏好性变异体的功能的另一种方法，进行定量PCR以测量培养在NM23变异体中的干细胞中的多能性基因的表达水平。图22比较了多能性基因Oct4和Nanog加MUC1和NM23在已经在NM23变异体中培养了至少4次传代的干细胞中的表达水平。图22的图表显示，对于在NM23变异体中生长的细胞，与培养在为纯二聚体群体的NM23-S120G RS中的细胞相比，多能性的这些关键指示基因的表达水平相同或更好。
实验细节：收集生长在不同NM23变异体中的干细胞。使细胞沉淀并且在-70℃下冻结。使用试剂提取总RNA。使用一步RT-PCR Master Mix试剂对RNA样品中的NANOG、OCT4、MUCl、NM23和GAPDH进行定量。使用比较Ct法分析实时PCR数据。通过计算目标Ct与对应GAPDH（ΔCt）之间的差值来获得每个样品中各转录本的相对量。从数据集中所有的其他数据中减去RS样品的ΔCt进行第二归一化（ΔΔCt）。
实施例11e.NM23变异体穿透细胞膜并且易位至细胞核的能力
作为对工程改造的NM23二聚体偏好性变异体的功能的进一步的测量，跟踪了它们从细胞表面至细胞核的迁移并且将其与NM23-S120G RS的迁移进行比较。已知NM23二聚体介导MUC1*-阳性癌细胞和人类多能干细胞（都为MUC1*-阳性的）的生长。当在含有二聚体形式的NM23的培养基中孵育MUC1*-阳性癌细胞时，NM23二聚合结合至MUC1*受体，被内在化并且在30-60分钟内易位到细胞核，在细胞核中它们可能作为转录因子发挥作用。图23示出在存在或不存在0、16nM或128nMNM23-S120G RS（100%二聚体群体）下孵育的癌细胞的共聚焦图像。然后用核染色剂DAPI染色细胞并且随后向细胞中加入抗-NM23抗体和荧光标记的第二抗体。需要注意的是，内源性NM23也被抗体染色。但是，只有当以二聚体外源性地加入NM23时，在核中才存在可检测到的NM23。先前已经确定用于增强细胞生长和用于NM23-S120G的核定位的最佳浓度为8nM至64nM。在更高的浓度下，每个NM23二聚体结合至每个MUC1*受体，而不是1个二聚体结合至两个MUC1*受体并且使两个MUC1*受体二聚化。（参见图1的钟形曲线，出于同样的原因，其中过量的二价抗-MUC1*抗体抑制而不是刺激生长）。图23（b、e）示出核中的NM23，如白色箭头所示。图24示出相同实验的共聚焦图像，不同之处是外源地添加的NM23是单链“二聚体”变异体NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC，其为由无半胱氨酸的修饰的IgG1和IgG2a铰链区连接的两个NM23-S120G单体，参见实施例9e。如从图24中可以看出的，NM23单链变异体容易地易位至核（b、e），如白色箭头所示。对应地定量NM23在核中的量的图表（对于NM23-S120G-RS（图23h）和对于单链变异体NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC（图24h））显示工程改造的“二聚体”比已经做为二聚体群体分离的NM23单体更好地易位至细胞核。
实验细节：最初将T47D乳腺癌细胞接种在含有10%FBS RPMI培养基的胶原蛋白-涂覆的8-孔室中培养24小时，然后在37℃下、5%CO2中血清饥饿（1%FBS RPMI）24小时。随后用16nM或128nM NM23S120GRS或NM23IgG1/IgG2a在10%FBS RPMI中培育T47D细胞30分钟。然后将T47D细胞固定在4％多聚甲醛中。在PBS+1%BSA+5%正常山羊血清+0.01%Triton-x（"封闭液（blocking buffer）"）中封闭细胞一小时，然后在室温下在含有一级抗体的封闭液中孵育一小时。然后用PBS洗涤细胞，随后用合适的二级抗体（Alexa-Fluor,Invitrogen）在室温下孵育一小时（保持在暗处）。在用PBS洗涤之后，用Prolong Gold+DAPI（Invitrogen）和盖玻片装裱细胞。在Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜上使T47D细胞可视化。
实施例12.跨物种功能
NM23支持具有多能性集落形态（pluripotent colony morphology）的小鼠ES细胞的增殖。
在用亦或1,000U/mL重组体mLIF（a、c）（EMD Millipore）亦或16nMNM23-S120G-RS（b、d）补充的小鼠ES细胞最低培养基（mESC-MM）中在灭活的MEF饲养细胞层上培养小鼠ES细胞（129/S6，EMD Millipore，Billerica，MA）两天，并且在相衬（phase-contrast）照明下以低倍率拍照。画面比例显示栏显示为500微米。在两种情况下，单细胞和由小数细胞组成的集落在第1天产生了较大的多细胞椭圆形的集落，该集落具有多能小鼠ES细胞的典型的明亮、确定边缘。由KnockOut D-MEM基本培养基、15%KnockOut血清替代品、IX GlutaMax I、IX OptiMEM非必需氨基酸、0.1mM B-ME（Life Technologies，Carlsbad，CA）和IX青霉素/链霉素（Lonza，Allendale，NJ）组成mESC-MM。
结果如图25所示并且显示小鼠干细胞在NM23（人类）中与它们在具有作为生长因子的小鼠LIF的小鼠干细胞培养基中生长的一样好。因此，本文所描述的NM23变异体可在小鼠细胞系统中使用并且小鼠NM23和NM23变异体可以在人类细胞系统中使用。
实施例13.产生由表达细胞分泌的构建体
可以将任何本发明的突变体、缺失体和/或单链或融合嵌合体（包括实施例2、实施例9和实施例10中描述的那些）制成由在体外、离体和/或体内中使用的表达细胞来分泌。引起表达的蛋白质被分泌的序列为本领域技术人员所熟知。特别地，将源自抗体的序列添加到蛋白质的N-末端或添加到目标基因的5’末端。除了包含前导序列之外，表达细胞类型不必限于大肠杆菌，并且还包括哺乳动物细胞、哺乳动物表达细胞、酵母、体细胞、干细胞、iPS细胞或经过诱导多能性或与起始细胞相比诱导至较不成熟的状态的细胞。
实施例14.比较重组NM23-WT、S120G和未复性的本发明的变异体
本发明的NM23变异体的益处之一在于它们被设计成自发地形成稳定的二聚体而无变性和复性的必要性，在体内设置中变性和复性是不能进行的。为了证明天然二聚化的单链和融合嵌合体的优点，表达了NM23-WT、NM23-S120G和变异体NM23-S120G-GS2、IgG1h-noC、IgG1h/IgG2ah-noC并且未经变性或复性，通过非还原性SDS-PAGE进行表征。图26的凝胶显示只有蛋白质变异体以二聚体迁移。野生型NM23和NM23-S120G（未复性的）在非还原性凝胶上以单体的表观分子量运行。如本文先前所讨论的，NM23六聚体在非还原性凝胶上以单体运行，原因在于其多聚化不依赖于二硫键，但通过FPLC已经表明其实际上是六聚体（参见图2、图3a和图4用于比较）。
实施例15.识别偏好二聚化且抵抗形成高阶多聚体的突变体
可以通过测序来自多种癌症的NM23来识别促进癌细胞或干细胞生长的突变。S120G突变体分离自成神经细胞瘤。可替代地，可以随机突变NM23编码DNA，然后测试所得的蛋白质以筛选促进癌细胞或干细胞的生长的突变体。限制因素是在基于细胞的测定中筛选许多可能的突变所需的时间量。用于测试突变体形成二聚体以及抵抗形成高阶多聚体的能力的一种方便方法是测试突变体结合至MUC1*肽的能力。正如申请人已经表明的，NM23四聚体和六聚体不能结合至MUC1*肽。一种同时识别形成二聚体而不是四聚体和六聚体的突变体的测定方法是纳米颗粒测定法，其中将MUC1*肽装载在金纳米颗粒上。在多孔板上，将每一种突变体加入至携带肽的纳米颗粒。如果突变体容易地形成二聚体，那么二聚NM23结合至颗粒-固定的MUC1*肽并且将颗粒拖拽靠近在一起，这将导致颗粒溶液由粉红色变为蓝色。如果以高浓度加入突变体，仍然能够形成四聚体和六聚体的该突变体将形成四聚体和六聚体，这将不能结合到肽并且溶液将保持粉红色。因此，可以容易地识别偏好二聚体形成且不形成非活性六聚体的突变体，原因在于甚至当以高浓度（例如多于500nM）添加它们时仍会将纳米颗粒溶液变蓝。
实施例16.
以100,000个细胞每孔的细胞密度将人类BGO1v/hOG胚胎干细胞接种在用12.5ug每孔单克隆抗-MUCl*抗体（MN-C3）涂覆的6-孔细胞培养板的Vita板上。将细胞在已经根据可选的实施例3的复性方法复性后的NM23变异体中培养2天。在最低干细胞培养基（参见实施例8）中以8nM使用的NM23变异体是NM23-S120G-RS（a、e）、NM23-S120G-GS2（"R"在图中表示复性的）（b、f）、NM23-S120G-IgG1h noC（c、g）和NM23-S120G-IgG1h/IgG2ah noC（d、h）。如从细胞形态可以看出的，生长为多能干细胞的所有干细胞都没有分化，缺乏成纤维细胞样细胞也缺乏其表明分化的增厚和变黑。
本文中引用的所有文献都通过引用以其整体并入。
本领域技术人员能够认识到或者仅仅使用常规实验能够确定许多等同于本发明的具体实施方式（特别是本文中所描述的）的等价形式。意在将这类等价形式包括在权利要求的范围内。

Claims (78)

1.一种重组制成的蛋白质构建体，其优先地形成特定的多聚体。
2.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是其生物活性状态。
3.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是二聚体。
4.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是其非活性状态。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中，所述多聚化状态是高阶多聚体。
6.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是生长因子。
7.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是转录因子。
8.根据权利要求3所述的蛋白质构建体，其中，所述二聚体是同源二聚体或异源二聚体。
9.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是哺乳动物蛋白质。
10.根据权利要求9所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是人类蛋白质。
11.根据权利要求9所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是小鼠蛋白质。
12.根据权利要求3所述的蛋白质构建体，包含两种单体或所述单体的片段。
13.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中，所述两种单体或所述单体的片段是通过接头肽连接在一起的，由此形成单体-接头-单体构建体。
14.根据权利要求13所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是生长因子或转录因子。
15.根据权利要求14所述的蛋白质构建体，其中，所述单体为NM23。
16.根据权利要求15所述的蛋白质构建体，其中，所述NM23是H1、H2或H7。
17.根据权利要求15所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是NM23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体并且抑制高阶多聚体的形成。
18.根据权利要求17所述的蛋白质构建体，其中，所述突变体NM23是S120G或P96S或NM23和P96S。
19.根据权利要求17所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是NM23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体，其中缺失了一至十个C-末端氨基酸。
20.根据权利要求19所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是NM23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体，其中缺失了一至六个C-末端氨基酸。
21.根据权利要求13所述的蛋白质构建体，其中，所述接头包括GS、GS2、GS3、IgG1铰链区、或IgG2a铰链区或它们的组合。
22.根据权利要求15所述的蛋白质构建体，其为
NM23S120G GS2、
NM23P96S GS2、
NM23P96S/S120G GS2、
NM23P96SΔC1GS2、
NM23P96SΔC2GS2、
NM23P96SΔC6GS2、
NM23P96SΔC1/S120G GS2、
NM23P96SΔC2/S120G GS2、
NM23P96SΔC6/S120G GS2、
NM23S120G GS3、
NM23P96S GS3、
NM23P96S/S120G GS3、
NM23P96SΔC1GS3、
NM23P96SΔC2GS3、
NM23P96SΔC6GS3、
NM23P96SΔC1/S120G GS3、
NM23P96SΔC2/S120G GS3、
NM23P96SΔC6/S120G GS3、
NM23S120G IgG1h noC、
NM23P96S IgG1h noC、
NM23P96S/S120G IgG1h noC、
NM23P96SΔC1IgG1h noC、
NM23P96SΔC2IgG1h noC、
NM23P96SΔC6IgG1h noC、
NM23P96SΔC1/S120G IgG1h noC、
NM23P96SΔC2/S120G IgG1h noC、
NM23P96SΔC6/S120G IgG1h noC、
NM23S120G IgG2ah noC、
NM23P96S IgG2ah noC、
NM23P96S/S120G IgG2ah noC、
NM23P96SΔC1IgG2ah noC、
NM23P96SΔC2IgG2ah noC、
NM23P96SΔC6IgG2ah noC、
NM23P96SΔC1/S120G IgG2ah noC、
NM23P96SΔC2/S120G IgG2ah noC、
NM23P96SΔC6/S120G IgG2ah noC、
NM23S120G IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96S IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96S/S120G IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96SΔC1IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96SΔC2IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96SΔC6IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96SΔC1/S120G IgG1h/IgG2ah noC、
NM23P96SΔC2/S120G IgG2ah noC、或
NM23P96SΔC6/S120G IgG2ah noC。
23.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，通过将蛋白质单体重组地连接至第二组件形成所述特定的多聚体。
24.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中，在所述第二组件之间形成所述特定的多聚体。
25.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是接头肽。
26.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是蛋白质或蛋白质片段。
27.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过化学键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
28.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过共价键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
29.根据权利要求28所述的蛋白质构建体，其中，所述共价键是二硫键。
30.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚体是二聚体。
31.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是IgG1铰链或IgG2a铰链。
32.根据权利要求31所述的蛋白质构建体，其为NM23-S120G-IgG1h、NM23-S120G-IgG2ah或NM23S120G IgG1Fc。
33.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过非共价键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
34.根据权利要求33所述的蛋白质构建体，其中所述第二组件是具有结合至另一种蛋白质的高亲和力的蛋白质。
35.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是抗体Fos或Jun的Fc区的全部或部分。
36.根据权利要求35所述的蛋白质构建体，其中，所述Fc区是IgG1Fc。
37.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件能够同源二聚化。
38.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件能够异源二聚化。
39.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，在所述蛋白质中插入半胱氨酸以通过二硫键促进多聚体形成。
40.根据权利要求26所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是IgM抗体的Fc结构域的片段。
41.根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质构建体，其包含促进进入细胞或进入所述细胞的细胞核的氨基酸序列。
42.根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质构建体，其包含促进所述蛋白质构建体从其表达的宿主细胞中分泌的氨基酸序列。
43.一种分离的核酸，包含编码根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质的核酸序列。
44.根据权利要求43所述的核酸，其中，所述核酸进一步包含编码促进进入细胞或进入所述细胞的细胞核的氨基酸序列的序列。
45.根据权利要求43所述的核酸，其中，所述核酸进一步包含编码促进所述蛋白质从其表达的宿主细胞中分泌的氨基酸序列的序列。
46.根据权利要求43所述的核酸，其中，所述核酸包含编码NM23或其偏好二聚体形成的突变体的核酸。
47.一种表达载体，包含根据权利要求43所述的核酸。
48.根据权利要求47所述的载体，其为质粒。
49.根据权利要求47所述的载体，其中，所述载体是病毒。
50.一种宿主细胞，包含根据权利要求47所述的载体。
51.一种用于增殖细胞的方法，包括用根据权利要求47所述的载体转染或转导所述细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
53.一种用于在体细胞中诱导多能性的方法，包括使用根据权利要求47所述的载体转染或转导所述细胞。
54.一种用于治疗患者的方法，所述患者患有可以通过给予未成熟细胞的治疗而得到缓解的病症，所述方法包括：
（i）用根据权利要求47所述的载体转染或转导宿主细胞以获得干细胞、祖细胞或iPS细胞；以及
（ii）将所获得的干细胞、祖细胞或iPS细胞给予到所述患者体内。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述载体中原属于所述细胞的一个或多个基因的核酸序列被修饰。
56.一种用于改变靶基因的表达的方法，包括下列步骤：
（i）制备编码转录因子变异体的核酸；以及
（ii）使所述核酸进入靶细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，进一步包括步骤（iii）：设计所述核酸以插入在接近所述靶基因的启动子位点的位置处。
58.根据权利要求56所述的方法，其中，所述靶细胞是干细胞或祖细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述祖细胞是造血细胞。
60.根据权利要求58所述的方法，其中，所述祖细胞是B细胞或B细胞前体。
61.根据权利要求56所述的方法，包括工程改造所述转录因子的多聚化状态以使如果需要表达所述目标基因则促进活性状态，如果需要抑制所述目标基因则促进不处于活性状态。
62.一种治愈或缓解疾病的方法，所述疾病能够受益于增加产生的干细胞或祖细胞，该方法包括向患有疾病、遗传缺陷或不健康病症或具有发展疾病、遗传缺陷或不健康病症的风险的患者给予权利要求44或45所述的细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是受精卵或未受精卵。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞获自待治疗的所述患者。
66.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是iPS细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述iPS细胞来自待治疗的所述患者。
68.一种用于识别偏好二聚化并且抵抗形成高阶多聚体的生长因子突变体的方法，包括测定所述生长因子对靶受体的结合的亲和力，其中高阶多聚体不能以与所述二聚体相同的亲和力结合到所述靶受体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述生长因子是NM23并且所述靶受体是MUC1*。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述靶受体是MUC1*胞外域肽，其基本上由具有GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:l）序列的PSMGFR肽组成。
71.根据权利要求4所述的蛋白质，所述蛋白质被基因工程改造以抵抗二聚体形成。
72.根据权利要求71所述的蛋白质，所述蛋白质被基因工程改造以偏好形成高阶多聚体。
73.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质被基因工程改造以偏好形成四聚体、五聚体或六聚体。
74.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述高阶多聚体包含基因融合至IgM抗体的所述蛋白质Fc部分。
75.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是生长因子。
76.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是NM23。
77.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是转录因子。
78.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是p53。
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