CN107556368A - 一种蛋白激酶多肽抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋白激酶多肽抑制剂PI‑38，其氨基酸序列为：Ser‑Gly‑Arg‑Val‑Met‑Arg‑Gly‑Pro‑Arg‑Ser‑Ala。所述多肽PI‑38能阻断p38MAPK蛋白与其效应蛋白的相互作用，再特异性地抑制p38激酶活性。

Description

一种蛋白激酶多肽抑制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蛋白酶多肽抑制剂。

背景技术

MAPKs是一类广泛存在于从酵母到高等植物与动物的蛋白激酶，它们负责将特定的细胞外刺激信号传导至细胞核，介导细胞产生特定反应，因而在细胞信号传递过程中占有相当重要的地位。p38 MAPK是1993年由Brewster等人在研究高渗环境对真菌的影响时发现的。以后又发现它也存在于哺乳动物的细胞内，也是MAPKs的亚类之一，其性质与JNK相似，同属应激激活的蛋白激酶。研究证明，p38MAPK通路的激活剂与JNK通路相似。一些能够激活JNK的促炎因子(TNFα、IL-1)、应激刺激(UV、H2O2、热休克、高渗与蛋白合成抑制剂)也可激活p38。此外，p38还可被脂多糖及G+细菌细胞壁成分所激活。激活p38的上游激酶包括MKK3，MKK4，MKK6以及MKK7，而p38下游效应蛋白包括MK2(MAP kinase-activated proteinkinase 2,MAPKAPK2)、MK3、MNK1(MAP Kinase Interaction protein kinase)、PRAK(p38regulated/activated protein kinase)、CK2(Casein Kinase 2)以及核内转录因子ATF₂(activating transcription factor-2)，ATF₁，Sap1(SRF accessory protein 1)，CHOP(growth arrest and DNA damage inducible gene 153,GADD153)，p53，STAT1，C/EBPβ，MEF2C(myocyte enhance factor 2C)以及MEF2A等。因此，p38MAPK广泛参与炎症反应、应激、发育、细胞生长与凋亡、细胞周期调控、缺血/再灌注损伤及心肌肥厚等生理、病理过程中的信号传导，从而成为重要的药物开发靶点。

目前已有的p38抑制剂分子多是一些小分子化合物，它们竞争性地结合于p38分子中的ATP结合位点或其它重要活性位点，从而抑制激酶的活性。但是由于激酶活性位点的保守性较强，体内数量众多的激酶分子都有相似的活性位点，因而此类抑制剂缺乏专一性；很多研究表明，这些抑制剂与其它激酶都有不同程度的交叉抑制作用，以及药物脱靶效应；此外在动物实验中，也表现出一定的基因与肝脏毒性。所以，目前还未有适合临床治疗的p38抑制剂药物。

近年来，由于抗体药物的深入研发及广泛上市应用，生物药物成为药物研发的一个热门领域。而多肽药物作为生物药物的一个重要组成部分，由于其分子量适中(比小分子化合物大比蛋白质小)、生物活性高、毒副作用小而成为医药研发的重点。而随着多肽生产工艺的进步、结构修饰手段的完善以及制剂水平的提高，制约多肽药物成药性的瓶颈问题逐步得到解决，从而使获批上市的多肽药物逐年增加。以2012年FDA的多肽药物数据为例，共有6个多肽药物获批上市，进入三期临床的多肽药物为14个，二期临床74个，一期临床40个。

发明内容

针对上述p38MAPK小分子抑制剂的缺陷，本发明提供一种能够阻断p38MAPK蛋白与其上下游效应因子相互作用，并有效抑制p38MAPK信号通路信号传导的多肽抑制剂PI-38。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种多肽PI-38，所述多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示，具体为：SGRVMRGPRSA。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽PI-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解p38MAPK激酶相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽PI-38在制备抑制炎症反应的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽PI-38在制备抑制肿瘤的药物中的应用。

所述肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌、淋巴癌、黑色素瘤、髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、脾癌。

根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽PI-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解类风湿性关节炎的药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包括活性成分多肽PI-38和药学上可接受的载体。

所述药物组合物包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂等。

所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明所述多肽PI-38作为活性成分时应为“有效量”的，所述“有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的药物组合物或药剂盒中，一种成分或制剂单元的“有效量”是指该成分在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效量”会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。

本发明所述多肽PI-38可以采用本领域技术人员已知的方法(例如固相合成方法)制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。

本发明研究表明，所述多肽PI-38能在体外阻断p38MAPK蛋白与其效应蛋白的相互作用，在体外特异性地抑制p38激酶活性。PI-38可以抑制细菌内毒素LPS刺激引起的人外周血单核细胞肿瘤坏死因子TNFα及白介素1β的分泌。PI-38还可以特异性抑制细菌内毒素LPS刺激的人肿瘤细胞中p38MAPK对效应分子的磷酸化作用。动物实验也表明，PI-38可以抑制炎症反应。

附图说明

图1为多肽PI-38质谱鉴定图；

图2为多肽PI-38对p38MAPK蛋白与其效应蛋白相互作用的阻断效果；

图3为多肽PI-38对p38MAPK蛋白激酶活性抑制作用；

图4为多肽PI-38对肿瘤细胞内p38的磷酸化的抑制作用；

图5为多肽PI-38对人外周血单核细胞TNFα及IL-1β分泌的抑制作用；

图6为多肽PI-38对炎性因子分泌的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1多肽PI-38的合成与纯化

1.按照Fmoc固相多肽合成法合成多肽PI-38，合成步骤如下所示：

1.1为保证多肽C-端为-CONH₂结构，选用Rink Amide树脂类作为高分子固相载体。

1.2去Fmoc保护基团：

1.2.1将所需高分子固相载体放入合成柱中，加入有机溶剂DMF(二甲基甲酰胺)浸泡10分钟后排放；通入20％的哌啶/DMF溶液盖过树脂表面，通N₂反应10分钟后排放；重复一遍通入20％哌啶/DMF、通N₂反应10分钟后排放。

1.2.2N₂保护下，通入DMF溶剂5遍，以彻底洗涤上述树脂。

1.3缩合反应:

氨基酸活化：称取所需摩尔量3倍的Fmoc-保护氨基酸，溶解于DMF溶剂中，配制成其饱和溶液，加入等摩尔量1-羟基苯并三唑(HOBT)及二异丙基碳二亚胺(DIC)，如果需要再加入DMF直至完全溶解，形成氨基酸活化液。

在N₂环境下，氨基酸活化液通入合成柱中，与其中高分子树脂充分接触，使高分子树脂上活性基团与活化的氨基酸发生(脱水)缩合反应生成肽键；室温下缩合反应时间为30分钟至1小时；反应后排放废液；

1.4按照多肽序列，重复步骤1.2至1.3操作直至完成整个肽链的合成。

1.5裂解及侧链保护基团的移除：

1.5.1配制三氟乙酸(TFA)混合裂解液“K”，配方如下：

三氟乙酸(TFA)(82.5％v/v)

苯酚(phenol)(5％v/v)

水(water)(5％v/v)

苯基甲基硫醚(thioanisole)(5％v/v)

1,2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)(2.5％v/v)

1.5.2实施步骤：

1.5.2.1按照步骤1.2所叙，先除去与固相载体相连的多肽N-端的Fmoc保护基团，用二氯甲烷洗去残余DMF，干燥，转入一干燥玻璃容器中；

1.5.2.2导入上述TFA裂解液“K”(30ml/克树脂)，在室温下温和搅拌反应4小时。

1.5.2.3反应完毕后，将树脂滤出，裂解液直接进入事先(-20℃)冷却的甲基异丁基醚中(30ml:5ml v/v)沉淀；

1.5.2.4高速离心(4000rmp，4℃)5分钟，弃去清液，用95％TFA溶解瓶底沉淀，再倒入冷却的甲基异丁基醚中(30ml:5ml v/v)沉淀；

1.5.2.5弃去清液，通入N2至甲基异丁基醚基本挥发，用少量的去离子水溶解沉淀物，经-80℃冷冻，在冷冻干燥机上干燥后，得到粉状微黄色粗肽。

2.多肽的分析和纯化：

由岛津LC-10ATVP型输液泵、岛津DGU-14A型脱气机、岛津SPD-10A型紫外检测器、Rheodyne 7725I进样阀、Phenomenex Nucleosil C18色谱柱(250×4.6mm I.D.)、WDL-95型色谱工作站构成HPLC分离系统。样品进样后以1.0mL/min的流速0-30分钟内，含0.1％三氟乙酸的5％乙腈水溶液至含0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液线性梯度淋洗，UV220nm检测的色谱条件，进行分离监测。色谱峰流出液收集于离心管留待随后的质谱分析。

质谱所用仪器为Bruker Daltonics公司BIFLEX型MALDI-TOF质谱仪，氮激光器，激光波长337nm，采用延时(引出Delayed extraction)和反射(Reflection)的工作方式，加速电压19.5kV，反射电压20kV，延时引出电压14.5kV，延时时间为50～200ns，正离子检测。将色谱峰收集液与适量的基质溶液混合后取约1微升溶液，滴加在样品靶上，待溶剂挥发样品结晶后，送入质谱仪进行质谱分析，累加30次单次扫描信号得到质谱图(见图1)。

多肽PI-38经HPLC纯度鉴定，其纯度大于98％，含11个氨基酸(SGRVMRGPRSA)，分子量1173Da。

上述多肽由宁波康贝生化有限公司合成。

实施例2PI-38对p38MAPK蛋白与其效应蛋白相互作用的阻断效果。

使用SPOT技术，将与p38MAPK蛋白有相互作用的MKK3b及MEF2A蛋白制备成多肽阵列芯片，用多肽阻断阵列上蛋白与p38重组蛋白的互做反应。

材料：多肽阵列实验室自制，氨基酸购自吉尔生化，p38重组蛋白购自GeneTex公司，人p38蛋白抗体购自CST，HRP标记抗人p38蛋白抗体的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，化学发光反应液购自Thermo公司

从-20度冰箱取出的多肽芯片，置于平皿中使用无水乙醇震荡洗涤3次，每次5分钟。之后多肽芯片膜放入平皿中，使用TBS-T溶液震荡洗涤3次，每次10分钟。随后将多肽芯片膜放入平皿中，加入封闭液(5％脱脂奶粉溶液)，室温震荡封闭4小时后，使用TBS-T溶液震荡洗涤膜一次，5分钟。用封闭液(5％脱脂奶粉溶液)稀释p38蛋白溶液为终浓度为0.3nM的反应溶液，使用终浓度为0.9nM的多肽与p38蛋白反应液共同孵育30分钟，将多肽芯片膜分别与含多肽或不含多肽的p38蛋白反应溶液室温震荡孵育2小时后，使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次10分钟。用上述封闭液稀释一抗(人p38蛋白抗体)溶液，稀释比例1:500，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2小时后，使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次15分钟。之后用封闭液稀释HRP标记的二抗溶液，通常稀释比例为1:5000(可根据抗体说明书推荐使用稀释度调整)，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2小时后，使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次15分钟。随后弃去多肽芯片膜上多余缓冲溶液，在膜上滴加化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2分钟，保持膜片湿润。将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，保存扫描图片，见图2。

图中方框选出的多肽点为多肽阻断p38蛋白与阵列多肽互做的位点，从图中可以看出多肽分别阻断p38与MKK3b及MEF2A的互做，表明多肽在分子水平上能够阻断重组p38蛋白与效应蛋白的互做。

实施例3PI-38对p38MAPK蛋白激酶活性抑制作用

p38激酶测定/抑制剂筛选试剂盒是检测p38蛋白活性的非定量酶学检测方法。试剂盒中检测用的酶标板是预包被有相当于ATF2的底物，ATF2上含有可被p38有效磷酸化的Thr氨基酸残基，检测抗体能特异的检测ATF2被p38激酶磷酸化的Thr。若加入活性多肽抑制剂，有抑制作用的活性多肽能够抑制p38的激酶活性，则特异抗体无法识别到ATF2蛋白上的磷酸化Thr。

材料：p38激酶测定/抑制剂筛选试剂盒购自Abnova公司，小分子抑制剂SB202190购自MCE公司，其它试剂均为试剂盒自带。

从试剂盒提供的酶标板上移取适当数量的酶标板孔置于冰上待用。分别在不同的板孔中添加10ul纯化的p38重组蛋白(终浓度10munits/孔)，10ul阳性对照SB202190(终浓度20uM)，以及10ul梯度稀释的多肽样品(终浓度分别为20nM，200nM，2μM，20μM，200μM)，随后向每孔中添加90ul的Kinase Reaction Buffer，盖好盖子30℃孵育60min。用WashBuffer清洗每一个板孔5次，倒掉剩余Wash Buffer，按标准拍板方法轻轻拍板去掉剩余Wash Buffer，或者吸取剩余液体。每孔分别加入100ul Anti-phospho-ATF2Thr71多抗(PPT-09)，盖上酶标板盖子室温放置30min。再次洗板(方法同上)后，每孔分别加入100ulHRP标记的anti-rabbit IgG，盖上酶标板盖子室温放置30min，倒掉不结合的液体部分。再次洗板(方法同上)，随后每孔分别加入100ul Substrate Reagent，盖上酶标板盖子室温放置5-15min。最后向每孔中加入100ul终止液，将酶标板放入酶标仪，在波长450nm处读数。

实验结果如图3和表1示，结果表明，加入不同浓度的多肽后，酶标板吸光度随着多肽浓度的升高逐步降低，表明p38激酶活性被多肽所抑制。

表1不同浓度多肽对p38MAPK蛋白激酶活性抑制作用

实施例4PI-38特异性抑制肿瘤细胞内p38的磷酸化激活

材料：人乳腺癌细胞(MCF-7)购自ATCC；细胞培养液RPMI1640购自Hyclone公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；anisomycin购自MCE公司；PVDF膜购自PALL公司；磷酸化ATF2，磷酸化HSP27，磷酸化p38抗体均购自Santa Cruz公司；Tublin抗体购自CST公司。

将MCF-7细胞在含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液中于37℃，5％CO2培养至80％汇片。将培养好的细胞按5×105细胞/孔，移至装有0.2ml新鲜的含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液的24孔细胞板中培养一天至80％汇片。然后更换新鲜的含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液，分别加入不同浓度的多肽抑制剂(5μM、10μM或25μM)处理半小时后，加入10μg/mL的anisomycin刺激细胞30分钟。弃去培养液上清，收集细胞总蛋白，进行12％SDS-PAGE电泳分离并电转至PVDF膜。分别使用磷酸化ATF2，磷酸化HSP27，磷酸化p38抗体及Tublin抗体(对照)进行western blot，检测相应的p38效应蛋白磷酸化水平。

结果如图4所示，表明多肽可以剂量依赖地抑制肿瘤细胞MCF-7内p38效应蛋白的磷酸化。

实施例5PI-38抑制人外周血单核细胞TNFα及IL-1β分泌实验

材料：健康人血采自实验室工作人员，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS来源于E.coli 055：B5)购自sigma公司，细胞培养液DMEM购自Hyclone公司，缓冲液DPBS及PBS购自北京索莱宝生物科技有限公司，人IL-1β，TNF-α的Elisa试剂盒购自北京百智生物科技有限公司。

从健康人的肝素抗凝全血中分离获得PBMCs(外周血淋巴细胞)。pH7.2浓度0.01M的杜氏磷酸缓冲液(DPBS)清洗细胞三次后，细胞重悬于含5％无内毒素胎牛血清和抗生素(penicillin–streptomycin)的DMEM培养基中，随后以2.5×10⁵个细胞/孔，将获得的PBMCs置于96孔细胞培养板中。pH7.2浓度0.01M的PBS配制的多肽抑制剂以不同的终浓度(0.0001-25μM)加入细胞中，与细胞共孵育1小时后，加入终浓度22ng/ml的LPS刺激细胞18小时。收集培养24小时后的细胞上清，Elisa试剂盒检测上清中细胞因子IL-1β，TNF-a的浓度。

结果见图5和表2，从图中可以看出，随着多肽抑制剂浓度的提高，IL-1β，TNF-a的分泌与对照比较都成下降趋势，表明多肽抑制剂有效抑制单核细胞中p38的活性。

表2多肽对人外周血单核细胞TNFα及IL-1β分泌的抑制作用

实施例6PI-38对小鼠急性炎症模型中炎性因子分泌的抑制作用

50只雄性昆明种小鼠(17-22g)(中国协和动物中心)随机分为5组，每组10只。先分别给药预处理：阳性药对照组给予消炎痛(中国河北永丰药业)灌胃给药(25mg/kg)、空白对照组给予腹腔注射等体积生理盐水、实验组分别给予腹腔注射活性多肽(PI38)低剂量(5mg/kg)、腹腔注射活性多肽中剂量(10mg/kg)和腹腔注射活性多肽(PI38)高剂量(20mg/kg)。半小时后分别将小鼠右耳前后两面各涂上二甲苯致炎剂20μL/耳，左耳为空白对照。2小时后，将小鼠断颈处死，沿耳廓基线剪下双耳，用8mm角膜环钻分别在同一部位打下耳片，用电子天平称重。用右耳耳片重量减去左耳耳片重量，计算出各组肿胀度(mg)，肿胀率(％)＝(空白对照组肿胀度-给药组肿胀度)/空白对照组肿胀度。

结果见图6和表3，从图中可以看出，多肽能够在动物炎症模型中抑制炎性因子的释放，表明多肽具有抗炎药物活性。

表3多肽对小鼠急性炎症模型中炎性因子分泌的抑制作用

序列表

<110> 北京博肽未名生物技术有限公司

<120> 一种蛋白激酶多肽抑制剂

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Gly Arg Val Met Arg Gly Pro Arg Ser Ala 11

Claims (8)

1.一种多肽PI-38，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的多肽PI-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解p38MAPK激酶相关疾病的药物中的应用。

3.如权利要求1所述的多肽PI-38在制备抑制炎症反应的药物中的应用。

4.如权利要求1所述的多肽PI-38在制备抑制肿瘤的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌、淋巴癌、黑色素瘤、髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、脾癌。

6.如权利要求1所述的多肽PI-38在制备治疗、预防、减轻和/或缓解类风湿性关节炎的药物中的应用。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括活性成分多肽PI-38和药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的药物组合物为注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液或丸剂中的任意一种。