CN110478488A - 葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用 - Google Patents

葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够从根本上逆转耐药性从而提升化疗药物的疗效并降低其毒副作用的方案。具体地，本发明提供了葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，该联用药物用于与治疗癌症的化疗药物联合使用，从而降低化疗药物因耐药性出现的药效降低，或降低因耐药性而增加化疗药物剂量时出现的毒副作用风险。

Description

葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用
技术领域
本发明属于医疗领域，涉及葡萄籽原花青素的一种应用，具体涉及葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用。
背景技术
化学治疗是目前针对癌症的主要治疗手段之一，其主要实施方式是采用化疗药物进行给药使癌细胞凋亡，从而达到治疗目的。
临床实践中，化疗药物在长期给药后容易使患者产生耐药性，即，化疗药物的有效剂量提升。这种情况下，若不增加化疗药物的剂量，则疗效降低；若增加化疗药物的剂量，则极易对正常细胞产生毒副作用。
现有技术中，为了延缓耐药的发生多采用靶向给药或联合用药的手段。然而，一方面，靶向给药仅能够改善化疗药物的作用位置，癌细胞仍然可以在长期用药后产生耐药性；另一方面，现有的联合用药主要是将几种不同的化疗药物先后或同时给药，其仍然不能从根本上降低细胞耐药性。也就是说，现有技术中还不存在能够从根本上解决癌症化疗过程中细胞耐药性问题的方案。
发明内容
为解决上述问题，提供一种能够从根本上逆转耐药性从而提升化疗药物的疗效并降低其毒副作用的方案，本发明提供了葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于，联用药物用于与治疗癌症的化疗药物联合使用，从而降低化疗药物因耐药性出现的药效降低，或降低因耐药性而增加化疗药物剂量时出现的毒副作用风险。
本发明提供的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用中，化疗药物所治疗的癌症可以是为白血病、骨肉瘤、神经母细胞瘤、肺癌、肝癌以及胃癌中的任一种。
进一步地，本发明提供的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用中，白血病还可以为急性髓性白血病或急性淋巴细胞性白血病。
本发明提供的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用中，联用药物与化疗药物的联合使用方式包括：联用药物与化疗药物同时给药治疗；以及化疗药物的化疗方案结束后对联用药物进行单独使用。
本发明提供的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用中，化疗药物含有阿糖胞苷、阿霉素、柔红霉素、高三尖杉酯碱、米托蒽醌、吡柔比星、长春新碱以及依托泊苷中的任一种或几种的组合物。
发明作用与效果
根据本发明提供的葡萄籽原花青素的应用，由于葡萄籽原花青素能够降低耐药相关蛋白1的表达，因此能够逆转化疗药物的耐药性，降低化疗药物在抗肿瘤治疗时的剂量，不仅能够避免化疗药物耐药性出现后导致的用药剂量增加，也能够相应地降低耐药后剂量增加而导致毒副作用增加的风险。
附图说明
图1是本发明实施例1的HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关蛋白(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平检测结果电泳图；
图2是本发明实施例1的HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关蛋白(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平结果分析条形图；
图3是本发明实施例2的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中mRNA水平结果分析条形图；
图4为本发明实施例4的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度结果图；
图5为实施例4的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度结果分析条形图；
图6为本发明实施例5不同GSPE浓度下的细胞凋亡的流式细胞检测结果图；
图7为本发明实施例5不同GSPE浓度下的细胞凋亡的结果分析条形图；
图8是本发明实施例6的不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量电泳图；
图9是本发明实施例6的不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量结果分析条形图；
图10是本发明实施例7的GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果电泳图；
图11是本发明实施例7的GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果分析条形图；
图12是本发明实施例7的GSPE在浓度25μg/ml时对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果电泳图；
图13是本发明实施例7的GSPE在浓度25μg/ml时对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果分析条形图。
具体实施方式
以下结合附图以及实施例来说明本发明的具体实施方式。应当理解，下述实施例仅仅用以解释说明本发明的技术方案，但并不用于限定本发明的保护范围。
下述各实施例中，未注明的试剂及材料均通过一般商业途径购得，未说明的实验操作及实验条件均参照本领域的常规操作及条件。
本发明采用HL-60和HL-60/ADR细胞对耐药性进行验证。其中，HL-60细胞是人早幼粒急性白血病细胞株，也是人原髓细胞白血病细胞，HL-60/ADR细胞是人白血病阿霉素耐药株，存在多药耐药性。
实施例1：HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中蛋白表达量分析
本实施例为HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中的蛋白表达量分析实验，实验方法如下。
1.1细胞总蛋白提取
1.1.1仪器：高速/冷冻离心机(德国eppendorf，5415D)
1.1.2试剂：
(1)全蛋白裂解液(上海康成生物工程有限公司)
(2)蛋白酶抑制剂混合液(上海康成生物工程有限公司公司)
(3)PMSF溶液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
(4)磷酸酶混合液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
1.1.3溶液配制
蛋白质抽提试剂：
1.1.4细胞收集(HL-60及HL-60/ADR细胞为悬浮细胞)
(1)HL-60及HL-60/ADR细胞于2×106接种于6cm的培养皿中，待细胞长48h后，小心转移细胞入15ml离心管，1500转/分，离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液。
(2)在离心管中加1ml PBS，重悬细胞转移至1.5ml管，1500转/分，离心5分钟弃上清。
1.1.5细胞裂解：根据细胞数量在离心管中加入预冷的含蛋白酶抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，旋涡器混匀，冰上裂解30分钟。
1.1.6高速/冷冻离心机预冷至4℃，14,000g离心30分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管分装3-4管，-70℃低温冰箱保存待用。
1.2蛋白浓度检测
1.2.1仪器：酶标仪(ELX-800，BIO-TEK INSTRUMENTS，INC.)
1.2.2试剂Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，货号：P0006)
(1)G250染色液
(2)蛋白标准(5mg/ml BSA)
1.2.3实验步骤：
(1)蛋白标准的制备
用PBS稀释蛋白标准(5mg/ml BSA),按照下表配制0,0.125,0.5,0.75,1,1.5mg/ml蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。
编号 稀释液体积 标准品体积 最终浓度
A 70μl 5mg/ml BSA 30μl 1.5mg/ml
B 30μl 从A管取60μl 1mg/ml
C 20μl 从B管取60μl 0.75mg/ml
D 30μl 从C管取60μl 0.5mg/ml
E 60μl 从D管取60μl 0.25mg/ml
F 60μl 从E管取60μl 0.125mg/ml
G 60μl 0μl 0mg/ml
(2)蛋白浓度检测
a.取5μl不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中。
b.取5μl样品到96孔板的样品孔中。样本稀释五倍，即2μl加至8μl的PBS中，最后取5μl加到96孔板的样品孔中。记录样品体积。
c.各孔加入250μl G250染色液。
d.用酶标仪测定A570nm波长的吸光度，可以立即测定吸光度。
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
1.3免疫印迹(Western blot)测定蛋白表达
1.3.1仪器
(1)bio-rad电泳仪器仪及配件
(2)ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统
1.3.2试剂
(1)SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天生物技术，编号：P0012AC)
(2)10X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液PH 8.3(上海生工生物，编号：C520001)
(3)10X印迹膜转印缓冲液(上海生工生物，编号：C520003)
(4)2X WB一抗/二抗稀释液(in PBS)(上海生工生物，编号：C520011)
(5)10X TBST WB漂洗液(上海生工生物，编号：C520009)
(6)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)(碧云天生物技术，编号：P0015F)
(7)BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)(碧云天生物技术，编号：P0072)
1.3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
(1)灌胶配置下层胶缓冲液,流出灌制上层胶所需的空间(梳子齿长加1cm)，再用ddH2O覆盖在下层胶最上面。待下层胶聚合后，倾出覆盖在上层的ddH2O，用滤纸吸净残留的液体。然后直接灌注上层胶，立即在上层胶插入干净的梳子。
(2)上样当上层胶聚合完全后，小心移除梳子，把凝胶固定于电泳装置上，在电泳槽中加入1X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液。将样本(含6XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液)混合液煮沸5min，使蛋白变性；然后按HL-60，HL-60/ADR顺序上样，每样本为40ug蛋白，将电泳装置与电泳相接，电压为80V。当指示剂澳酚蓝条带进入分离胶后,把电压提高到120V,继续电泳直至澳酚蓝条带到达分离胶底部。卸下玻璃板,小心取出凝胶。
(3)转膜切8张3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜,其大小与凝胶大小完全吻合,浸泡于转移缓冲液中,依次平放层叠3MM滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3MM滤纸,各层之间不留有气泡,同时做好加样顺序标记,放好转膜装置,在300mA条件下电转移90min。
(4)抗体结合将硝酸纤维素膜经TBST漂洗后,放入含5％牛血清白蛋白封闭液中,平放在缓慢摇动的摇床平台上,室温孵育120min。取出硝酸纤维素膜,加入含有1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的一抗中,4℃冰箱中过夜。次日,取出硝酸纤维素膜,用TBST漂洗10min×3次后,放入含1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的荧光二抗(1:10000)中,避光,室温平缓摇动2h,用TBST漂洗10min×3次,取出膜,避光保存。
(5)扫描硝酸纤维素膜置于ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统中扫描,分析结果。
本实施例中，通过上述western blot检测HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关蛋白(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平。
图1是本发明实施例1的HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关蛋白(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平检测结果电泳图，图2是本发明实施例1的HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关蛋白(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平结果分析条形图。
如图1及图2所示，与HL-60相比，HL-60/ADR细胞中MPR1和MDR1蛋白的表达水平显著增高，LRP的蛋白水平稍有增高。
实施例2：HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中mRNA水平分析
本实施例为HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中的蛋白表达量分析实验，实验方法如下。
2.1Trizol法提细胞总RNA(050403A)
2.1.1仪器及材料：高速/冷冻离心机(德国eppendorf，5415D)
2.1.2试剂：
(1)Trizol(2)DEPC水(3)氯仿(4)异丙醇(5)乙醇
2.1.3实验步骤
(1)细胞收集：a.HL-60及HL-60/ADR细胞于2×106接种于6cm的培养皿中，待细胞长48h后，小心转移细胞入15ml离心管，1500转/分，离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液；
(2)在离心管中加1ml PBS，重悬细胞转移至1.5ml管，1500转/分，离心5分钟弃上清；
(3)弃上清，加2ml Earle’s液，吸管轻轻吹起细胞，再2000转5min离心；
以下步骤起应避免RNA酶的污染
(4)将低温离心机预冷至4℃；
(5)加1ml Trizol，以1ml移液器轻轻将细胞及Trizol移至1.5ml离心管；
(6)以手剧烈摇晃离心管摇匀(不见白色的细胞块)，约50次，置室温10min；
(7)加氯仿1/5体积(0.2ml)，颠倒混匀10次，室温放置5min，(目的：分离RNA、DNA、蛋白质)4℃，12000g离心15min；
(8)小心吸出上层水相，约500μl于另一1.5ml离心管(小心避免水相和油相之间的杂质吸入)，
(9)加等体积异丙醇，颠倒混匀后置室温10min；
(10)4℃，12000g离心10min；
(11)小心取出离心管，注意观察沉淀块的大小和位置，小心倒去上清；
(12)加冰预冷的75％乙醇1ml，清洗RNA沉淀块；
(13)小心倒去上清(加乙醇后，沉淀块会悬浮)，将剩余上清用移液器小心吸出；
(14)将离心管口打开，置于超净工作台，空气自然干燥(约10-20分钟，应避免过干，导致难溶)；
(15)视沉淀块大小以30-60μl的DEPC水重溶(50℃水浴可助溶)；
(16)分装3-4管，其中1管装2μl用于浓度的测定；
(17)以封口膜封口后置低温冰箱保存。
2.2RNA浓度测定
2.2.1仪器：Nanodrop分光光度计20002000C(Thermo scientific)
2.2.1实验步骤：
(1)打开软件，选择检测RNA浓度
(2)抬起样品臂，把DEPC水加到检测基座上；
(3)放下样品臂，点击软件中的blank进行空白检测
(4)完成空白校准后，抬起样品臂，并用干净的无尘纸把上下基座上的DEPC擦干净后，再把样品加到检测基座上，放下样品臂，点击measure检测样本。
(5)检测完一个样本后进行下一个样本检测时，用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦干净，这样擦拭样品就可以避免样品在基座上的残留。
(6)检测完成后导出测量的值
2.3逆转录生成cDNA(050406A)
2.3.1仪器：PCR仪(Eppendorf，Mastercycler personal)
2.3.2试剂：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)(Takara货号：RR047)
2.3.3实验步骤
(1)去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。RNA样本加入的量为1ug(根据RNA浓度决定RNA的上样量)。
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL
gDNA Eraser 1.0μL
Total RNA
RNase Free dH2O Up to 10μL
混合均匀后放置室温5min。
(2)反转录反应
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
反应结束后放置4℃进行real time PCR。
2.4Real Time PCR
2.4.1仪器：Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System
2.4.2试剂：TB Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara货号：RR420)
本实施例所使用的人MRP1,MDR1,LRP，β-actin基因引物序列如下表所示：
上述引物由上海生工生物合成，配置成终浓度为0.2μM，用于后续实验。
2.4.3实验步骤
(1)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)，配置20μl体系。
(2)进行Real Time PCR反应
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Number of Cycles:1 95℃30秒
Stage 2：PCR反应
Number of Cycles:40
95℃ 3秒
60℃ 30秒
Stage 3：Melt Curve
(3)结果计算：用2-△△Ct法分析real-time PCR数据。
图3是本发明实施例2的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中mRNA水平结果分析条形图。
如图3所示，通过Real Time PCR检测HL-60及HL-60/ADR细胞耐药相关基因mRNA(MPR1,MDR1及LRP)的表达水平，结果显示，与HL-60相比，HL-60/ADR细胞中MPR1,MDR1基因mRNA的表达水平明显增高，而LRP增高不明显。
实施例3：8种不同药物在HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中的IC50及葡萄籽原花青素逆转耐药的效果分析
本实施例为8种不同药物在HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中的IC50及葡萄籽原花青素(以下记为GSPE)逆转耐药的效果分析实验。
本实施例所示使用的8中药物均为临床常用的癌症化疗药物，分别为：阿霉素(以下记为ADR)、柔红霉素(以下记为DNR)、依托泊苷(以下记为VP16)、长春新碱(以下记为VCR)、阿糖胞苷(以下记为Ara-C)、高三尖杉酯碱(以下记为HHT)、米托蒽醌(以下记为MTZ)、吡柔比星(以下记为THP)。实验方法如下。
3.1细胞处理
3.1.1细胞种板细胞以1×106/ml接种于96孔板，每孔接种100μl
3.1.2八种化疗药物原始浓度配制
八种化疗药物按下表配制：
3.1.3GSPE原液配置称取10mg GSPE用5mlddH2O溶解，并用0.22um针式过滤器过滤分装置于-20℃备用。
3.1.4HL-60细胞及HL-60/ADR细胞八种化疗药处理化疗药阿霉素(ADR)、柔红霉素(DNR)、依托泊苷(VP16)、长春新碱(VCR)、阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉酯碱(HHT)、米托蒽醌(MTZ)、吡柔比星(THP)以3倍浓度配置，在细胞接种后每孔加5Oμl，使终浓度为1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001μmol/L，培养24h后进行MTT测细胞活性。HL-60和HL-60/ADR细胞的药物配置区间及药物配置如下，其中溶剂为培养基+10％胎牛血清。
3.1.5HL-60/ADR细胞上述化疗药联合GSPE给药方案需要联合用GSPE的，配置化疗药物最高浓度时，以配置800μl为标准，最高浓度需加入30μl的GSPE原液，使得GSPE药物原始浓度为75μg/ml，后续用于溶解稀释化疗药的溶剂中需要加入3倍浓度的GSPE,即37.5μl的GSPE(原始浓度)加到962.5μl稀释溶剂。在细胞接种后每孔加5Oμl，使GSPE药物终浓度为25μg/ml及化疗药物终浓度为1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001μmol/L，培养24h后进行MTT测细胞活性。
3.2实验仪器ELX800多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)
3.3MTT比色法检测细胞活性
3.3.1MTT配置MTT原始浓度为2mg/ml，即2mg的MTT加到1ml的PBS中。
3.3.2实验步骤待细胞药物处理24h后，每孔加入5Oμl，稍微混匀使得MTT的终浓度为0.5mg/ml。于37℃在培养箱内孵育4h后，平板离心机2500rmp，离心10min，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
3.3.3结果分析以对照组的细胞存活度为100％，实验组细胞存活度(％)＝实验组吸光光度值/对照组吸光度值×100％。结果录入到GraphPad prism 5中，将浓度转化为对数浓度，再通过log(inhibitor)vs.normalized response--Variable slope这个功能计算IC50。
本实施例的8种不同药物在HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中的IC50及GSPE逆转耐药的效果分析结果如下表所示(按逆转率由高到低排序)。
上表中：
(a)IC50值以及对应的RSD％值为重复进行的三个独立实验(n＝3)的平均值和RSD％。
(b)RM表示耐药性倍数，其通过将每种药物在HL-60/ADR细胞或HL-60细胞中的IC50值相除来计算得到。
(c)RR表示逆转率，其通过减去不存在或存在GSPE时HL-60/ADR细胞的IC50值，然后除以HL-60/ADR细胞中不包含GSPE的IC50值计算得出。
另外，“#”表示相对于HL-60细胞的IC50值是否具有显著差异；“*”表示相对于不施用GSPE的HL-60/ARD细胞的IC50值；具体地，“#”或“*”表示P<0.05；“##”或“**”表示P<0.01。
从上表中可以看出，在未施用GSPE时，HL-60/ADR细胞对于8种化疗药物的IC50值均显著高于HL-60，说明该耐药细胞株对于8种化疗药物均具有明显的耐药性；在施用GSPE后，Ara-C组以及ADR组的HL-60/ADR细胞的IC50值均有显著降低，说明GSPE与ADR或DNR共同用药时能够降低其用药剂量，发挥逆转耐药的作用。
实施例4：HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度分析
本实施例为HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度分析实验，实验方法如下。
4.1细胞处理
4.1.1细胞接种HL-60及HL60-ADR细胞以1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔培养基为2ml。
4.1.2药物处理
(1)GSPE原液配置称取10mg GSPE用5mlddH2O溶解，并用0.22um针式过滤器过滤分装置于-20℃备用
(2)GSPE药物处理GSPE原液配置(2mg/ml),以5倍的浓度配置(如下表)，浓度分别为0，31.25，62.5，125μg/ml，并每孔加500ul，促使GSPE终浓度为0,6.25,12.5,25μg/ml，处理24h后收集细胞进行荧光强度测定。
配置给药浓度(μg/ml) 使用药物体积(浓度)(μl) 培养基稀释体积(μl)
125 125(原液) 1875
62.5 500(125μg/ml) 500
4.2仪器FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司产品)
4.3实验步骤
4.3.1待细胞药物处理24h后，细胞转至1.5ml的EP管中1500rmp离心5min，制备细胞悬液，调整密度为1×106/ml，加入终浓度为3ug/ml的阿霉素；
4.3.2常温孵育30min后，弃上清后用PBS洗涤重悬3次后过50μm尼龙网；
4.3.3用流式细胞仪测定荧光强度。由于阿霉素具有天然荧光，流式细胞仪采用激发波长为488nm，接收波长为550nm，数据用平均荧光强度表示。
图4为本发明实施例4的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度结果图，图5为实施例4的HL-60细胞和HL-60/ADR细胞中ADR和GSPE逆转的荧光强度结果分析条形图。
如图4及图5所示，HL-60/ADR细胞内阿霉素的荧光强度比HL-60明显降低，并随着GSPE浓度的升高(6.25,12.5μg/ml)明显增高。HL-60的MFI值为106.8±4.4，而HL-60/ADR的值为51.2±1.5。在药物作用24h后，HL-60/ADR细胞内阿霉素相关MFI由51.2±1.5上升至63.9±2.0。该结果说明，GSPE能够有效抑制HL-60/ADR细胞中的药物外排，升高HL-60/ADR细胞中ADR的浓度。
实施例5：不同GSPE浓度下的细胞凋亡
本实施例为不同GSPE浓度下的细胞凋亡分析实验，实验方法如下。
5.1细胞处理
5.1.1细胞接种HL60-ADR细胞以1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔培养基为2ml。
5.1.2药物处理
(1)GSPE原液配置称取10mg GSPE用5mlddH2O溶解，并用0.22μm针式过滤器过滤分装置于-20℃备用
(2)GSPE药物处理GSPE原液配置(2mg/ml),以5倍的浓度配置(如表)，浓度分别为0，31.25，62.5，125μg/ml，并每孔加500ul，促使GSPE终浓度为0,6.25,12.5,25μg/ml，处理24h后收集细胞进行蛋白免疫印迹。
配置给药浓度(μg/ml) 使用药物体积(浓度)(μl) 培养基稀释体积(μl)
125 125(原液) 1875
62.5 500(125μg/ml) 500
31.25 250(125μg/ml) 750
5.2仪器：FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品
5.3实验步骤
5.3.1细胞转至1.5ml的EP管中1500rmp离心5min，制备细胞悬液，调整密度为1×106/ml，取200ul，1000rpm 4℃离心5min；
5.3.2预冷的PBS1ml润洗2次，1000rpm 4℃离心5min；
5.3.3将细胞重悬于100ul binding buffer，加入5μlAnnexin-V-FITC混匀，室温避光孵育10min，再加5μl PI；
5.3.4室温避光孵育5min后加入400ul binding buffer混匀后，经过50μm尼龙网膜过滤细胞至流式检测管，用流式细胞仪上机检测
5.3.5结果处理用FlowJo7.6.1软件处理同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。
图6为本发明实施例5不同GSPE浓度下的细胞凋亡的流式细胞检测结果图，图7为本发明实施例5不同GSPE浓度下的细胞凋亡的结果分析条形图。
如图6及图7所示，流式细胞检测结果显示，随着GSPE浓度的增高，细胞凋亡率增高，并且以早期凋亡为主，凋亡率由(5.00±0.37)％上升至(22.32±2.82)％。该结果说明，GSPE自身对于耐药细胞也具有一定的促凋亡作用。
实施例6：不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量
本实施例为不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量分析实验，实验方法如下。
6.1细胞处理
6.1.1细胞接种HL60-ADR细胞以1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔培养基为2ml。
6.1.2药物处理
(1)GSPE原液配置称取10mg GSPE用5mlddH2O溶解，并用0.22um针式过滤器过滤分装置于-20℃备用
(2)GSPE药物处理GSPE原液配置(2mg/ml),以5倍的浓度配置(如下表)，浓度分别为0，31.25，62.5，125μg/ml，并每孔加500ul，促使GSPE终浓度为0,6.25,12.5,25μg/ml，处理24h后收集细胞进行蛋白免疫印迹。
配置给药浓度(μg/ml) 使用药物体积(浓度)(μl) 培养基稀释体积(μl)
125 125(原液) 1875
62.5 500(125μg/ml) 500
31.25 250(125μg/ml) 750
6.2细胞总蛋白提取
6.2.1仪器：高速/冷冻离心机(德国eppendorf，5415D)
6.2.2试剂：
(1)全蛋白裂解液(上海康成生物工程有限公司)
(2)蛋白酶抑制剂混合液(上海康成生物工程有限公司公司)
(3)PMSF溶液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
(4)磷酸酶混合液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
6.2.3溶液配制
蛋白质抽提试剂：
6.2.4细胞收集(HL-60及HL-60/ADR细胞为悬浮细胞)
(1)细胞处理24h后，小心转移细胞入15ml离心管，1500转/分，离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液。
(2)在离心管中加1ml PBS，重悬细胞转移至1.5ml管，1500转/分，离心5分钟弃上清。
6.2.5细胞裂解：根据细胞数量在离心管中加入预冷的含蛋白酶抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，旋涡器混匀，冰上裂解30分钟。
6.2.6高速/冷冻离心机预冷至4℃，14,000g离心30分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管分装3-4管，-70℃低温冰箱保存待用。
6.3蛋白浓度检测
6.3.1仪器：酶标仪(ELX-800，BIO-TEK INSTRUMENTS，INC.)
6.3.2试剂Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，货号：P0006)
(1)G250染色液
(2)蛋白标准(5mg/ml BSA)
6.3.3实验步骤：
(3)蛋白标准的制备
用PBS稀释蛋白标准(5mg/ml BSA),按照下表配制0,0.125,0.5,0.75,1,1.5mg/ml蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。
编号 稀释液体积 标准品体积 最终浓度
A 70μl 5mg/ml BSA 30μl 1.5mg/ml
B 30μl 从A管取60μl 1mg/ml
C 20μl 从B管取60μl 0.75mg/ml
D 30μl 从C管取60μl 0.5mg/ml
E 60μl 从D管取60μl 0.25mg/ml
F 60μl 从E管取60μl 0.125mg/ml
G 60μl 0μl 0mg/ml
(4)蛋白浓度检测
a.取5μl不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中；
b.取5μl样品到96孔板的样品孔中。样本稀释五倍，即2μl加至8μl的PBS中，最后取5μl加到96孔板的样品孔中。记录样品体积；
c.各孔加入250μl G250染色液；
d.用酶标仪测定A570nm波长的吸光度，可以立即测定吸光度；
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
6.4免疫印迹(Western blot)测定蛋白表达
6.4.1仪器
(1)bio-rad电泳仪器仪及配件
(2)ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统
6.4.2试剂
(1)SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天生物技术，编号：P0012AC)
(2)10X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液PH 8.3(上海生工生物，编号：C520001)
(3)10X印迹膜转印缓冲液(上海生工生物，编号：C520003)
(4)2X WB一抗/二抗稀释液(in PBS)(上海生工生物，编号：C520011)
(5)10X TBST WB漂洗液(上海生工生物，编号：C520009)
(6)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)(碧云天生物技术，编号：P0015F)
(7)BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)(碧云天生物技术，编号：P0072)
6.4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
(1)灌胶配置下层胶缓冲液,流出灌制上层胶所需的空间(梳子齿长加1cm)，再用ddH2O覆盖在下层胶最上面。待下层胶聚合后，倾出覆盖在上层的ddH2O，用滤纸吸净残留的液体。然后直接灌注上层胶，立即在上层胶插入干净的梳子。
(2)上样当上层胶聚合完全后，小心移除梳子，把凝胶固定于电泳装置上，在电泳槽中加入1X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液。将样本(含6XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液)混合液煮沸5min，使蛋白变性；然后按HL-60，HL-60/ADR顺序上样，每样本为40ug蛋白，将电泳装置与电泳相接，电压为80V。当指示剂澳酚蓝条带进入分离胶后,把电压提高到120V,继续电泳直至澳酚蓝条带到达分离胶底部。卸下玻璃板,小心取出凝胶。
(3)转膜切8张3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜,其大小与凝胶大小完全吻合,浸泡于转移缓冲液中,依次平放层叠3MM滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3MM滤纸,各层之间不留有气泡,同时做好加样顺序标记,放好转膜装置,在300mA条件下电转移90min。
(4)抗体结合将硝酸纤维素膜经TBST漂洗后,放入含5％牛血清白蛋白封闭液中,平放在缓慢摇动的摇床平台上,室温孵育120min。取出硝酸纤维素膜,加入含有1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的一抗中,4℃冰箱中过夜。次日,取出硝酸纤维素膜,用TBST漂洗10min×3次后,放入含1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的荧光二抗(1:10000)中,避光,室温平缓摇动2h,用TBST漂洗10min×3次,取出膜,避光保存。
(5)扫描硝酸纤维素膜置于ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统中扫描,分析结果。
图8是本发明实施例6的不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量电泳图，图9是本发明实施例6的不同GSPE浓度下的细胞耐药相关蛋白表达量结果分析条形图。
如图8及图9所示，随着GSPE浓度的增加，HL-60/ADR细胞中MPR1和LRP蛋白的表达水平显著降低，MDR1的蛋白水平稍有降低，说明GSPE能够显著降低细胞中MPR1和LRP这两种耐药相关蛋白的表达量，同时也能够一定程度上降低MDR1的表达量。
实施例7：GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响
本实施例为GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响分析实验，本实施例中所使用的LY294002是一种PI3K抑制剂。实验方法如下。
7.1细胞处理
7.1.1细胞接种HL60-ADR细胞以1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔培养基为2ml。
7.1.2药物处理
(1)GSPE原液配置称取10mg GSPE用5mlddH2O溶解，并用0.22um针式过滤器过滤分装置于-20℃备用
(2)第一组处理GSPE原液配置(2mg/ml),以5倍的浓度配置(如下表)，浓度分别为0，31.25，62.5，125μg/ml，并每孔加500ul，促使GSPE终浓度为0,6.25,12.5,25μg/ml，处理24h后收集细胞进行蛋白免疫印迹。
配置给药浓度(μg/ml) 使用药物体积(浓度)(μl) 培养基稀释体积(μl)
125 125(原液) 1875
62.5 500(125μg/ml) 500
31.25 250(125μg/ml) 750
(3)第二组药物处理LY294002原始浓度为32.5mmol/L，以5倍的浓度配置，为50μmol/L,即3.1μl加至2ml培养基中，药物配置如下表；每孔加500ul，促使GSPE终浓度为25μg/ml及LY294002终浓度为10μmol/L，处理24h后收集细胞进行蛋白免疫印迹。
药物组别设置 使用药物体积(浓度)(μl) 培养基稀释体积(μl)
GSPE 125(GSPE原液) 1875
LY294002 3.1(LY294002原液) 1996.9
LY294002+GSPE 3.1(LY294002原液)+125(GSPE原液) 1871.9
7.2细胞总蛋白提取
7.2.1仪器：高速/冷冻离心机(德国eppendorf，5415D)
7.2.2试剂：
(1)全蛋白裂解液(上海康成生物工程有限公司)
(2)蛋白酶抑制剂混合液(上海康成生物工程有限公司公司)
(3)PMSF溶液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
(4)磷酸酶混合液(上海康成生物工程有限公司公司公司)
7.2.3溶液配制
蛋白质抽提试剂：
7.2.4细胞收集(HL-60及HL-60/ADR细胞为悬浮细胞)
(1)细胞处理24h后，小心转移细胞入15ml离心管，1500转/分，离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液。
(2)在离心管中加1ml PBS，重悬细胞转移至1.5ml管，1500转/分，离心5分钟弃上清。
7.2.5细胞裂解：根据细胞数量在离心管中加入预冷的含蛋白酶抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，旋涡器混匀，冰上裂解30分钟。
7.2.6高速/冷冻离心机预冷至4℃，14,000g离心30分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管分装3-4管，-70℃低温冰箱保存待用。
7.3蛋白浓度检测
7.3.1仪器：酶标仪(ELX-800，BIO-TEK INSTRUMENTS，INC.)
7.3.2试剂Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，货号：P0006)
(1)G250染色液
(2)蛋白标准(5mg/ml BSA)
7.3.3实验步骤：
(5)蛋白标准的制备
用PBS稀释蛋白标准(5mg/ml BSA),按照下表配制0,0.125,0.5,0.75,1,1.5mg/ml蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。
编号 稀释液体积 标准品体积 最终浓度
A 70μl 5mg/ml BSA 30μl 1.5mg/ml
B 30μl 从A管取60μl 1mg/ml
C 20μl 从B管取60μl 0.75mg/ml
D 30μl 从C管取60μl 0.5mg/ml
E 60μl 从D管取60μl 0.25mg/ml
F 60μl 从E管取60μl 0.125mg/ml
G 60μl 0μl 0mg/ml
(6)蛋白浓度检测
a.取5μl不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中；
b.取5μl样品到96孔板的样品孔中。样本稀释五倍，即2μl加至8μl的PBS中，最后取5μl加到96孔板的样品孔中。记录样品体积；
c.各孔加入250μl G250染色液；
d.用酶标仪测定A570nm波长的吸光度，可以立即测定吸光度；
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
7.4免疫印迹(Western blot)测定蛋白表达
7.4.1仪器
(1)bio-rad电泳仪器仪及配件
(2)ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统
7.4.2试剂
(1)SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天生物技术，编号：P0012AC)
(2)10X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液PH 8.3(上海生工生物，编号：C520001)
(3)10X印迹膜转印缓冲液(上海生工生物，编号：C520003)
(4)2X WB一抗/二抗稀释液(in PBS)(上海生工生物，编号：C520011)
(5)10X TBST WB漂洗液(上海生工生物，编号：C520009)
(6)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)(碧云天生物技术，编号：P0015F)
(7)BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)(碧云天生物技术，编号：P0072)
7.4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
(1)灌胶配置下层胶缓冲液,流出灌制上层胶所需的空间(梳子齿长加1cm)，再用ddH2O覆盖在下层胶最上面。待下层胶聚合后，倾出覆盖在上层的ddH2O，用滤纸吸净残留的液体。然后直接灌注上层胶，立即在上层胶插入干净的梳子。
(2)上样当上层胶聚合完全后，小心移除梳子，把凝胶固定于电泳装置上，在电泳槽中加入1X Tris-Glycine SDS电泳缓冲液。将样本(含6XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液)混合液煮沸5min，使蛋白变性；然后按HL-60，HL-60/ADR顺序上样，每样本为40ug蛋白，将电泳装置与电泳相接，电压为80V。当指示剂澳酚蓝条带进入分离胶后,把电压提高到120V,继续电泳直至澳酚蓝条带到达分离胶底部。卸下玻璃板,小心取出凝胶。
(3)转膜切8张3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜,其大小与凝胶大小完全吻合,浸泡于转移缓冲液中,依次平放层叠3MM滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3MM滤纸,各层之间不留有气泡,同时做好加样顺序标记,放好转膜装置,在300mA条件下电转移90min。
(4)抗体结合将硝酸纤维素膜经TBST漂洗后,放入含5％牛血清白蛋白封闭液中,平放在缓慢摇动的摇床平台上,室温孵育120min。取出硝酸纤维素膜,加入含有1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的一抗中,4℃冰箱中过夜。次日,取出硝酸纤维素膜,用TBST漂洗10min×3次后,放入含1×WB一抗/二抗稀释液(in PBS)的荧光二抗(1:10000)中,避光,室温平缓摇动2h,用TBST漂洗10min×3次,取出膜,避光保存。
(5)扫描硝酸纤维素膜置于ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统中扫描,分析结果。
图10是本发明实施例7的GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果电泳图，图11是本发明实施例7的GSPE对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果分析条形图。
如图10以及图11所示，与未加入GSPE相比，25μg/mL的GSPE可以显著抑制Akt的磷酸化，P-Akt的表达量显著低于未加入GSPE的P-Akt的表达量。
图12是本发明实施例7的GSPE在浓度25μg/ml时对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果电泳图，其中“+”表示加入，“-”表示未加入；图13是本发明实施例7的GSPE在浓度25μg/ml时对HL-60/ADR细胞相关蛋白的影响结果分析条形图。
如图12以及图13所示，GSPE在浓度为25μg/ml时可抑制AKT磷酸化，其抑制效果与LY294002类似。
实施例的作用与效果
根据实施例1～实施例2可知，与HL-60相比，HL-60/ADR细胞中MPR1和MDR1蛋白的表达水平显著增高，LRP的蛋白表达水平稍有增高，但细胞中仅MRP1和MDR1的mRNA表达量增高，说明耐药细胞中主要以MPR1和MDR1的表达多于非耐药细胞为主。
根据实施例3～实施例5可知，GSPE与Ara-C或ADR共同用药时能够降低其抗肿瘤的有效剂量，并且还能够有效抑制HL-60/ADR细胞中的药物外排。另外，GSPE自身对于耐药细胞也具有一定的促凋亡作用。
根据实施例6～实施例7可知，GSPE能够显著降低细胞中MPR1和LRP这两种耐药相关蛋白的表达量，同时也能够一定程度上降低MDR1的表达量；同时，GSPE还具有AKT磷酸化抑制作用。
综上，GSPE能够通过抑制MRP1等耐药蛋白的表达并抑制AKT磷酸化，从而在与多种癌症化疗药物联用时降低化疗药物的有效剂量并抑制药物外排，达到逆转化疗药物耐药性的目的。由此，在癌症的化疗方案中，本发明的GSPE可作为联用药物与常规化疗药物联合使用，能够降低化疗药物在抗肿瘤治疗时的剂量，从而避免化疗药物耐药性出现后导致的用药剂量增加并降低耐药后剂量增加而导致毒副作用增加的风险。
另外，除了直接作为联用药物，该GSPE还可以与药学上可接受的载体、佐剂或媒介物配合制成相应的药物组合物作为联用药物。
最后说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的保护范围不限于上述实施例的描述范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于，所述联用药物用于与治疗癌症的化疗药物联合使用，从而降低所述化疗药物因耐药性出现的药效降低，或降低因耐药性而增加所述化疗药物剂量时出现的毒副作用风险。
2.根据权利要求1所述的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于：
其中，所述化疗药物所治疗的所述癌症为白血病、骨肉瘤、神经母细胞瘤、肺癌、肝癌以及胃癌中的任一种。
3.根据权利要求2所述的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于：
其中，所述白血病为急性髓性白血病或急性淋巴细胞性白血病。
4.根据权利要求1所述的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于：
其中，所述联用药物与所述化疗药物的联合使用方式包括：
所述联用药物与所述化疗药物同时给药治疗；以及
所述化疗药物的化疗方案结束后对所述联用药物进行单独使用。
5.根据权利要求1所述的葡萄籽原花青素在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用，其特征在于：
其中，所述化疗药物含有阿糖胞苷、多柔比星、柔红霉素、高三尖杉酯碱、米托蒽醌、吡柔比星、长春新碱以及依托泊苷中的任一种或几种的组合物。
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