CN105412393A - Gspe在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用，所述的细胞钙超载损伤为致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤，所述的GSPE对LPS经典的信号通路TLR4、NFkB没有影响，特异性阻断Orai1信号，实现阻断钙超载信号的目的。本发明发现GSPE能有效的阻断LPS对Orai1介导的SOCE的活化，并且阻断由Orai1介导的SOCE启动的细胞外钙离子内流，逆转脓毒症小鼠肺微血管内皮细胞钙超载损伤，降低脓毒症小鼠的死亡率。

Description

GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。

背景技术

已知钙离子通道Orai1介导的钙池可控性钙通道或钙离子释放活化钙通道(store-operatedcalcium/calciumreleaseactivatedcalcium,SOC/CRAC)是非兴奋性细胞钙离子内流的主要机制。革兰氏阴性细菌及其释放的内毒素造成的菌血症、内毒素血症直接作用于血管内皮细胞，导致血管内皮细胞损伤及功能障碍，毛细血管通透性增加，炎症介质释放，启动脓毒症的发生，因此血管内皮细胞受损是脓毒症发生的始动信号，居于中心环节。在此背景基础上，我们创新的发现：Orai1介导的钙池可控性钙离子内流机制（store-operatedcalciumentry,SOCE)直接造成全身毛细血管内皮细胞钙超载损伤，启动脓毒症的发生。而针对Orai1的靶向性药物可以有效的阻断Orai1介导的SOCE机制，从而逆转血管内皮细胞钙超载损伤，有效的治疗脓毒症。葡萄籽原花青素提取物GSPE(grapeseedprocyanidinextract,GSPE)的主要作用具有抗氧化和抗炎症反应，但对细胞钙离子代谢的作用没有报道。

发明内容

针对现有技术对治疗脓毒症存在的技术难题，本发明的目的在于提供一种GSPE在治疗血管细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。

本发明所述细胞钙超载损伤为致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。

本发明所述GSPE预处理的Orai1表达正常的小鼠脓毒症模型，发现Orai1显著被抑制，脓毒症小鼠的血管内皮细胞钙超载被显著逆转，从而证明GSPE是Orai1的天然的特异性抑制剂，能阻断Orai1介导的SOCE信号，逆转脓毒症Orai1介导的细胞钙超载损伤。

本发明所述GSPE对LPS经典的信号通路TLR4、NFkB没有影响，特异性阻断Orai1信号，实现阻断钙超载信号的目的。

本发明首次提供了Orai1介导的SOCE机制是GSPE阻断小鼠肺血管内皮细胞钙超载损伤的药物作用靶点。

所述的GSPE在制备治疗脓毒症靶向药物中的应用，以治疗脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。

本发明所述的GSPE还可加入其它治疗脓毒症的药物中，起到靶向作用，其中所述的其它治疗药物为抗感染类药物或重组人活化蛋白C，所述抗感染类药物为抗生素类、抗真菌类、抗病毒类、抗支原体类、抗肿瘤类或免疫抑制剂；其中所述抗生素类为β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、酰胺醇类或大环内脂类，所述抗真菌类为多烯类、三唑类、嘧啶类或棘白菌素类。

本发明所述GSPE可和适量药学上可以接受的载体制备成药物制剂，其中所述药用载体可以是pH缓冲系统，渗透压调节剂，防腐剂，稳定剂等辅助成分，优选自：磷酸钠(SodiumPhosphate)、琥珀酸钠(SodiumSuccinate)、组氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯20/80(Polysorbate20/80)、氯化钠(SodiumChloride)、蔗糖(Sucrose)、三羟甲基氨基甲烷(Trometamol)和乳糖等。

本发明所述的药物制剂为溶液制剂或干粉制剂，所述药物制剂的给药形式为静脉给药，皮下注射，腹腔内注射或肌肉注射。

本发明的有益效果为：首次发现Orai1介导的SOCE机制是GSPE阻断小鼠肺血管内皮细胞钙超载损伤的药物作用靶点，经试验证明，GSPE预处理的脓毒症小鼠肺血管内皮细胞Orai1表达被显著抑制，而TLR4、NFkB表达则没有被抑制，因此证明GSPE特异性抑制Orai1，阻断Orai1介导的SOCE机制，抑制细胞外钙离子内流，从而逆转细胞钙超载损伤。

附图说明

以下结合附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。

图1为GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞表达Orai、TLR4、NFkB水平的影响。

图2为GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞钙离子内流的影响。

图3为GSPE对脓毒症小鼠的死亡率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本研究采用基因敲除的方法构建Orai1基因表达缺陷的BALB/c小鼠模型，采用盲肠结扎穿孔CLP方法复制BALB/c小鼠腹腔感染脓毒症模型。应用钙成像及分子生物学的方法确定Orai1介导的SOCE是参与脓毒症细胞钙超载损伤的主要机制。LPS通过识别和活化TLR4信号、NFkB信号，进一步活化Orai1信号，启动Orai1介导的SOCE，引发细胞外钙离子内流机制，导致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。应用GSPE预处理的Orai1表达正常的小鼠脓毒症模型，发现Orai1显著被抑制，脓毒症小鼠的血管内皮细胞钙超载被显著逆转，从而证明GSPE是Orai1的天然的特异性抑制剂，能阻断Orai1介导的SOCE信号，逆转脓毒症Orai1介导的细胞钙超载损伤。

（一）实验材料：

1、构建Orai1基因敲除小鼠模型：采用RNA干扰技术原理，成功敲除BAB/c小鼠的Orai1基因，制备Orai1基因表达沉默小鼠，并获得子代，通过鉴定符合Orai1基因表达缺陷。

2、构建Orai1基因表达缺陷的脓毒症小鼠模型：采用CLP法（盲肠结扎穿孔）构建Orai1表达缺陷的脓毒症动物模型。

3、获得原代血管内皮细胞(HUVEC细胞）、以及原代腹腔巨噬细胞：摘取脓毒症小鼠肺组织分离小鼠肺血管内皮细胞；采用腹腔灌洗法获取小鼠腹腔巨噬细胞。

4、葡萄籽原花青素提取物GSPE，浓度200mg/kg，具有抗氧化和抗炎症的功效。

5、Orai1、TLR4、NFkB抗体，钙离子荧光探针，钙成像仪等。

（二）实验原理：

1、Orai1基因缺陷表达的脓毒症小鼠原代肺微血管内皮细胞和腹腔巨噬细胞的获得原理：

A）获得Orai1基因敲除小鼠：利用基因打靶技术和RNA干扰技术构建BAB/c小鼠Orai1纯合子表达缺陷小鼠，委托广州赛业有生物技术有限公司给予构建和鉴定。Orai1基因缺陷的小鼠的特点是肺血管内皮细胞膜SOC钙离子通道被关闭，细胞外钙离子无法通过SOC进入细胞内从而完成细胞钙内流。

B）Orai1表达缺陷小鼠脓毒症模型建立：采用盲肠结扎穿孔（CLP)实验的原理，在麻醉状态下给予Orai1表达缺陷小鼠开腹手术，暴露盲肠，对盲肠用4号注射器针头进行穿刺打孔，并横向贯穿盲肠，并使适量肠内容物流出，结扎盲肠，还纳经过穿孔并结扎的盲肠于腹腔，逐层关腹，手毕腹腔注射500ul无菌生理盐水进行液体复苏，然后正常饲养，观察小鼠的死亡率。CLP模型小鼠的死亡率为90%以上。

C）获得脓毒症小鼠肺血管内皮细胞：采用酶消化、免疫磁珠二次分选法分离纯化小鼠原代肺微血管内皮细胞。根据Orai1是否被敲除，分离Orai1基因敲除小鼠肺微血管内皮细胞，以及Orai1基因表达正常的小鼠肺微血管内皮细胞。

D）获得脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞：采用腹腔灌洗的方法收集获得脓毒症小鼠原代腹腔巨噬细胞。

2、GSPE药物对Orai1介导的血管内皮细胞钙超载的抑制研究：分离Orai1表达正常的脓毒症小鼠的肺血管内皮细胞，给予GSPE(25umol/L)处理原代细胞，利用钙成像技术观察原代脓毒症肺血管内皮细胞在GSPE处理前后的钙离子内流情况。

3、GSPE药物对Orai1介导的SOCE的表达抑制：运用Westernblot检测GSPE处理过的脓毒症小鼠肺血管内皮细胞的Orai1表达情况。

4、GSPE对脓毒症小鼠的生存率的影响：BALB/c小鼠给予GSPE灌胃（100mg/kg)，连续灌胃3天后，CLP法制作小鼠脓毒症模型，继续给予GSPE灌胃，12小时后分离脓毒症小鼠肺微血管内皮细胞，检测内皮细胞钙离子内流情况；同时检测肺血管内皮细胞Orai1介导SOCE的表达情况；余下脓毒症小鼠继续观察5天，记录小鼠死亡情况，计算生存率。

（三）研究结果：

1、GSPE预处理的脓毒症小鼠肺血管内皮细胞Orai1表达被显著抑制：与正常对照组比较，GSPE组连续灌胃，给予GSPE药物3天后，CLP法制作小鼠脓毒症模型，12h后摘取小鼠肺组织，分离小鼠肺血管内皮细胞，检测发现Orai1的表达显著下调，钙成像监测肺血管内皮细胞钙离子内流被显著抑制，而TLR4、NFkB表达则没有被抑制。因此证明GSPE特异性抑制Orai1，阻断Orai1介导的SOCE机制，抑制细胞外钙离子内流，逆转细胞钙超载损伤，而GSPE对LPS经典的信号通路TLR4、NFkB则没有影响，只特异性阻断了Orai1信号，阻断了钙超载信号。

如图1所示，GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞表达Orai、TLR4、NFkB水平的影响。

对照组（vehicle组）：正常喂养小鼠，不进行GSPE干预，其Orai1基因表型正常，开腹后即刻关腹，不做结肠结扎手术，为CLP脓毒症模型的对照组，TLR4、NFkB、Orai及内参对照actin表达水平为基线水平。

CLP对照组：正常喂养小鼠，不给予GSPE干预，进行CLP模型手术，其Orai基因型表达正常，脓毒症模型没有药物干预，TLR4、NFkB、Orai1表达水平与对照组1比较显著增强；

GSPE干预组：给予GSPE干预，Orai1基因型表达正常，进行CLP脓毒症模型手术，与没有进行GSPE干预的CLP模型组2比较，GSPE干预后TLR4和NFkB表达水平没有显著变化，而Orai1表达水平显著降低；

Orai基因敲除组：给予GSPE干预，Orai表达缺陷，进行CLP脓毒症模型手术，与组3类似，敲除Orai，并不影响TLR4及NFkB的表达，进行GSPE干预后也不影响TLR4和NFkB表达。结合上述提示，CLP脓毒症模型中，GSPE对TLR4和NFkB表达没有影响，而是特异性地抑制Orai1表达。

图2所示，GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞钙离子内流的影响。

vehicle组为正常对照组，正常喂养小鼠，不进行GSPE干预，其Orai1基因表型正常，开腹后即刻关腹，不做结肠结扎手术，为CLP脓毒症模型的对照组，本组肺血管内皮细胞钙离子内流为基线水平，其相对钙离子水平（relative[Ca]2+/vehicle)为1，其余三组的钙离子水平与其比较得出相对钙离子水平。

CLPcontrol为CLP对照组：正常喂养小鼠，不给予GSPE干预，进行CLP模型手术，其Orai基因型表达正常，脓毒症模型没有药物干预，本组肺血管内皮细胞钙离子内流水平与vehicle组比较显著升高。GSPE+CLP组为CLP对照组的基础上，给予GSPE干预，Orai1基因型表达正常，进行CLP脓毒症模型手术，与CLPcontrol组比较，GSPE干预后肺血管内皮细胞钙离子内流显著下降。

GSPE+Orai(-/-)组为Orai基因敲除组：给予GSPE干预，Orai表达缺陷，进行CLP脓毒症模型手术，与GSPE+CLP组类似，敲除Orai，进行GSPE干预后肺血管内皮细胞钙离子内流显著下降，甚至低于GSPE+CLP组。

结合上所述，GSPE能显著下调CLP脓毒症小鼠肺血管内皮细胞钙离子内流，其作用靶点是Orai1。

2、GSPE预处理的脓毒症小鼠模型的死亡率显著下降：与GSPE非处理组比较，GSPE预处理（GSPE100mg/kg，连续灌胃3天）组的小鼠5天死亡率显著降低。

如图3所示，GSPE对脓毒症小鼠的死亡率的影响，纵坐标为生存率（survival%)，横坐标为天数（days)。

vehicle(sham)即对照组，正常喂养，不给GSPE的5天生存率为100%；

CLPcontrol为CLP模型对照组，正常喂养不给GSPE，CLP模型的5天生存率为0；

GSPE+CLP为GSPE干预的脓毒症CLP组，给予GSPE脓毒症CLP小鼠生存率为60%；GSPE+Orai(-/-)为GSPE干预的Orai基因敲除的脓毒症小鼠，其5天生存率为40%。

结合上述，GSPE显著提高CLP小鼠的5天生存率。

3、首次发现Orai1介导的SOCE机制是GSPE阻断小鼠肺血管内皮细胞钙超载损伤的药物作用靶点。

本发明所举实施方式或者实施例对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所举实施方式或者实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞钙超载损伤为致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GSPE通过抑制Orai1的表达实现治疗细胞钙超载损伤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GSPE特异性阻断Orai1信号，对信号通路TLR4、NFkB没有影响。

5.GSPE在制备治疗脓毒症靶向药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述GSPE用于治疗脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述GSPE加入其它治疗脓毒症的药物中，起到靶向作用，其中所述的其它治疗药物为抗感染类药物或重组人活化蛋白C，所述抗感染类药物为抗生素类、抗真菌类、抗病毒类、抗支原体类、抗肿瘤类或免疫抑制剂；其中所述抗生素类为β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、酰胺醇类或大环内脂类，所述抗真菌类为多烯类、三唑类、嘧啶类或棘白菌素类。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述GSPE和适量药学上可以接受的载体制备成药物制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物制剂为溶液制剂或干粉制剂，所述药物制剂的给药形式为静脉给药，皮下注射，腹腔内注射或肌肉注射。