CN102985439A - Iap bir结构域结合化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年2月12日提交的美国临时专利申请61/303,809和2010年11月19日提交的美国临时专利申请61/415,638的优先权。
发明背景
凋亡或程序性细胞死亡通常在多细胞生物体中的健康组织的正常形成和维持中发生。其是一个复杂的过程，在没有炎症或坏死的迹象下导致损坏、患病或发育冗余细胞被去除。
已知固有的凋亡途径在多种疾病中失调，包括癌症和淋巴增殖性疾病，神经退行性疾病，自身免疫性疾病和炎性疾病，例如多发性硬化和类风湿关节炎。例如，癌细胞获得了克服或避免凋亡的能力，并且，尽管存在强大的促凋亡信号例如缺氧、内源性细胞因子、放射治疗和化疗，仍继续进行不恰当的增殖。不正常的抗凋亡的细胞也与自身免疫性疾病和炎性疾病相关。例如，在与风湿性关节炎(RA)相关的成纤维细胞样滑膜细胞和与牛皮癣相关的角化细胞中已经观察到凋亡抗性。在多种自身免疫性疾病或炎性疾病中也已经观察到了不正常地抗凋亡的T-细胞，例如多发性硬化、类风湿关节炎、先天性特发性血小板减少性紫癜和斑秃。也已经证明致病性效应细胞对正常的凋亡信号具有抗性。据信，对正常凋亡的抗性至少部分地由抗凋亡途径的活性或抗凋亡基因的表达的增加引起。
胱天蛋白酶是凋亡途径的主要组成部分。胱天蛋白酶是来源于半胱氨酸蛋白酶类的蛋白水解酶家族，已知其引发和执行凋亡。在正常细胞中，胱天蛋白酶以非活性的酶原存在，但被多种外部信号中的任一种催化地激活。胱天蛋白酶激活信号包括，例如，配体驱动死亡受体激活后细胞因子或免疫剂的释放，或基因毒性、化学毒性或辐射诱导的细胞损伤后线粒体因子的释放，例如细胞色素C。
凋亡蛋白抑制蛋白(IAP)构成了抑制胱天蛋白酶的蛋白家族，从而压制凋亡。由于它们在调节胱天蛋白酶活性方面的重要作用，IAP能够由大量的触发因素抑制程序性细胞死亡。IAP被认为在稳态或内源性细胞生长调控机制受损以及抗化疗药 物和放射治疗方面起作用。
IAP包含1-3个类似的结构域，被称为杆状病毒IAP重复序列(BIR)结构域。它们还包含在C-末端的RING型锌指结构域，具有通过其E3连接酶功能诱导IAP-结合分子的泛素化的能力。被称为XIAP、HIAP1(也被称为cIAP2)和HIAP2(cIAP1)的人类IAP各自具有3个BIR结构域，并具有羧基末端的RING锌指。被称为NAIP的另一IAP具有3个BIR结构域(BIR1、BIR2和BIR3)，但没有RING域。另一被称为Livin、TsIAP和MLIAP的IAP只具有单个BIR结构域和单个RING结构域。
X-染色体连锁凋亡抑制剂(XIAP)是能够通过直接结合抑制起始胱天蛋白酶(被称为胱天蛋白酶-9)和效应胱天蛋白酶(被称为胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7)的IAP的实例。通过BIR3结构域，XIAP结合并抑制胱天蛋白酶-9。XIAP的接头BIR2结构域抑制胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的活性。还已经将BIR结构域和IAP与肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)-1和-2的相互作用联系起来，并且与TAB 1(为通过NFkB激活影响生存信号转导的衔接蛋白)联系起来。XIAP还可以通过RING型锌指结构域的E3连接酶活性诱导胱天蛋白酶的去除，这诱导了泛素化介导的蛋白酶体降解。
因此，IAP通过抑制活性胱天蛋白酶和将细胞信号转导重新定向至促进生存模式起到了凋亡级联的直接制动器的作用。因此，蛋白质的IAP家族的一个或多个成员持续的过度表达使患病的细胞，例如癌细胞和自身免疫性疾病中涉及的细胞避免凋亡。事实上，已经证明IAP过度表达在多种癌症中预示了差的临床结果。此外，通过RNA反义或siRNA策略压制IAP表达使肿瘤细胞对各种各样的凋亡损伤(包括化疗、放疗和配体介导的死亡受体的活化)敏感。在XIAP的情况下，这已经在从白血病到卵巢癌的不同癌症中得以显示。cIAP1和cIAP2的过度表达也已经在不同的恶性肿瘤中观察到，包括髓母细胞瘤，肾细胞癌，胶质母细胞瘤和胃癌。由于这些原因，IAP是有效的治疗靶标并且抑制它们表达或功能的化合物被认为在与凋亡失调相关联的增殖性疾病(包括癌症，自身免疫性和炎性疾病)的治疗中具有显著效用。
发明概述
本文提供式1的化合物
或其盐，其中
R1为H或烷基；
R2为甲基或乙基；
R3为烷基、环烷基、杂环基、杂芳基或芳基，它们中的任一个可任选地被氨基、烷氨基或烷氧基进一步取代；
R4和R5各自独立地为H或烷基；
R6为H、卤素或烷氧基；
X为O、S、CH2、-(CH2)2-或CH-R7，其中R7为NR8、OR8、NC(O)OR8、NHC(O)R8或NHSO2R8，其中R8为烷基、环烷基、杂环基、芳基、芳烷基或杂芳基，它们中的任一个可被烷基或卤素任选地进一步取代；
且G为
(2)取代或未取代的唑(azole)或吡咯环，其任选地与取代或未取代的芳基、杂芳基、环烷基或杂环基稠合。本文也提供制备式1的化合物或其盐的方法、以及可用作制备式1的化合物或其盐的中间体的化合物
在另一个方面，本发明提供了包含式1的化合物或其盐和药学上可接受的载体的药物组合物、以及制备所述药物组合物的方法，所述方法包括将式1的化合物或其盐与药学上可接受的载体组合。
本发明进一步提供在细胞中增强凋亡的方法，所述方法包括使细胞与式的1化合物或其盐接触。本文还提供治疗以凋亡不足为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药如上所述的化合物或药物组合物以治疗所述疾 病或病症。
本文还提供包含式1的化合物或其盐和可检测标记的探针，以及使用所述探针以识别与IAP BIR结构域结合的化合物的方法，所述方法包括：(a)使IAP BIR结构域与所述探针相接触以形成探针：BIR结构域复合物，所述探针可被受试化合物置换；(b)测量来自所述探针的信号以建立参考水平；(c)使所述探针：BIR结构域复合物与受试化合物接触；(d)测量来自所述探针的信号；和(e)将来自步骤(d)的信号与所述参考水平比较，其中信号的变化(例如，所述信号相对于所述参考水平增加或减少)显示所述受试化合物与所述BIR结构域结合。
发明详述
本文提供式1的化合物：
或其盐。本发明非限制性地包括式1所描述的全部化合物及其盐。然而，为了进一步说明的目的，本文将讨论本发明优选的方面和要素。
根据式1，G可为具有以下结构的基团
其中R9为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。例如，R9可为任选地被卤素或烷氧基取代的苯基。
或者，G可为取代或未取代的唑或吡咯环，其任选地与取代或未取代的芳基、杂芳基、环烷基或杂环稠合。例如，G可为
其中X1为CH或N，R10为H、卤素、羟基、烷基、烷氧基、芳基、氨基或NHC(O)-烷基，且R11为氢、烷基或NHC(O)CH3。G也可为
其中X2为NH、NR12、O或S，且每个R12独立地为氢、任选被一个或多个烷基、烷氧基或卤素基团取代的烷基、环烷基、杂环基、NHC(O)CH3或苯基。
根据一个实施方案，G为：
或者取代或未取代的吡咯，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的咪唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的吡唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的三唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的噻唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的四唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的噁唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的异噁唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的噁二唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的吲哚，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的咪唑并[1，2-a]吡啶，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的咪唑并[1，2-a]嘧啶，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的中氮茚，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的四氢中氮茚，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的四氢咪唑并[1，2-a]吡啶，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的1H-苯并[d]咪唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-a]咪唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的苯并[d]噁唑，其具体实例包括但不限于：
或者取代或未取代的咪唑并[1，2-a]吡嗪，其具体实例包括但不限于：
R1可为任意的烷基，例如C1-C3烷基(例如甲基、乙基或丙基，包括异丙基)，优选甲基，且R2为甲基或乙基。
R3可为烷基、环烷基、杂环基、杂芳基或芳基，且可任选地被氨基、烷氨基或烷氧基进一步取代。合适的R3基的非限制性实例包括C1-C6或C1-C4烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等)、环己基、环丙基和四氢-2H-吡喃基。例如，R3可为：
R4和R5独立地为氢或烷基，例如C1-C6烷基。R6可为氢、卤素或烷氧基，例如C1-C6烷氧基。期望地，R6为氢、氟或C1-C3烷氧基，例如甲氧基或乙氧基。
X可为O、S、CH2、-(CH2)2-或CH-R7，其中R7为NR8、OR8、NHC(O)OR8、NHC(O)R8或NHSO2R8，且R8为烷基、环烷基、杂环基、芳基、芳烷基或杂芳基。R8可被烷基、烷氧基、卤代烷基或卤素进一步取代。根据一些实施方案，X为CH2。在其他实施方案中，X为CH-NHC(O)R8，且R8为烷基、芳基、芳烷基、烷氧基或杂芳基，它们中的任一个可任选地被烷基、烷氧基、卤代烷基或卤素进一步取代。在又一个实施方案中，X为CH-OR8且R8为可任选地被卤素进一步取代的芳基或芳烷基。X的具体实例包括但不限于：
或，更具体地：
任何前述的在通式和优选方面中的取代基可以任何组合使用，以提供式1的
化合物或其盐。式1的化合物或其盐的具体实例提供于表1和实施例。
每当指示结构中原子数的范围(例如C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C3烷基、卤代烷基、烷氨基、烯基等)时，具体考虑也可使用任何落入所指示的范围内的碳原子数的子范围或单个数。因此，例如，对于本文所涉及的任何化学基团(例如，烷基、卤代烷基、烷氨基、烯基等)所用的范围1-8个碳原子(例如C1-C8)、1-6个碳原子(例如C1-C6)、1-4个碳原子(例如C1-C4)、1-3个碳原子(例如C1-C3)或2-8个碳原子(例如C2-C8)的叙述适当时包括并具体描述了1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子，以及其任何子范围(例如适当时为1-2个碳原子、1-3个碳原子、1-4个碳原子、1-5个碳原子、1-6个碳原子、1-7个碳原子、1-8个碳原子、2-3个碳原子、2-4个碳原子、2-5个碳原子、2-6个碳原子、2-7个碳原子、2-8个碳原子、3-4个碳原子、3-5个碳原子、3-6个碳原子、3-7个碳原子、3-8个碳原子、4-5个碳原子、4-6个碳原子、4-7个碳原子、4-8个碳原子、5-6个碳原子、5-7个碳原子、5-8个碳原子、6-7个碳原子或6-8个碳原子)。
如本文所用，除非另有说明，术语“取代的”指被1至4个或更多个取代基取代的基团。取代基的实施例包括，例如，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳酰基、卤素、卤代烷基(例如三氟甲基)、卤代烷氧基(例如三氟甲氧基)、羟基、烷氧基、烷基硫醚、环烷氧基、杂环氧基(heterocylooxy)、氧代、烷酰基、芳基、芳烷基、烷芳基、杂芳基、杂芳烷基、烷基杂芳基、杂环基(heterocyclo)、芳氧基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳基烷氨基、环烷氨基、杂环氨基(heterocycloamino)、单取代氨和二取代氨基(其中氨基上的两个取代基选自烷基、芳基或芳烷基)、烷酰氨基、芳酰氨基、芳烷酰氨基、取代的烷酰氨基、取代的芳氨基、取代的芳烷酰氨基、硫醇、烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、环烷硫基、杂环硫基(heterocyclothio)、烷基硫碳基、芳基硫碳基、芳烷基硫碳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、磺酰氨基(例如SO2NH2)、取代的磺酰氨基、硝基、氰基、羧基、氨基甲酰基(例如CONH2)、取代的氨基甲酰基(例如CONH-烷基、CONH-芳基、CONH-芳烷基或其中氮上有两个选自烷基或芳烷基的取代基的实例)、烷氧羰基、芳基、取代的芳基、胍基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂芳基(例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基等)。
如本文所用，术语“唑”旨在包括五元含氮环，其含有至少一个其他的环成员氮、硫或氧。唑的非限制性实施例包括吡唑、咪唑、三唑、四唑、五唑、噻唑、 异噻唑、噁唑和异噁唑。
如本文所用，术语“吡咯”旨在包括报含一个氮原子的五元芳香杂环。如本文所用，吡咯也包括氢化衍生物1-、2-和3-吡咯啉。
如本文所用，术语“烷基”旨在包括具有特定数量的碳原子的支链和直链饱和脂族烃基(例如C1-C20烷基、C1-C8烷基、C1-C6烷基等)。例如，C1-C6-烷基包括具有以直链或支链排列的1、2、3、4、5或6个碳原子烷基。类似地，C1-C4烷基包括具有以直链或支链排列的1、2、3或4个碳原子的烷基，C1-C20-烷基包括具有以直链或支链排列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基。代表性的饱和直链烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而代表性的饱和支链烷基包括-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基戊基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2，2-二乙基戊基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。烷基可为未取代或取代的。为了描述本发明的目的，适当时，术语“烷基”包括“亚烷基”。
如本文所用，术语“烯基”旨在表示具有特定数量的碳原子的不饱和直链或支链烃基，其中所述碳原子中的至少两个以双键相互连接，并具有E或Z型区域化学或其组合。例如，C2-C6烯基包括具有以直链或支链排列的2、3、4、5或6个碳原子的烃基，所述碳原子中的至少两个以双键连接在一起。C2-C6烯基的实例包括乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、-1-己烯基、-2-己烯基、-3-己烯基、-1-庚烯基、-2-庚烯基、-3-庚烯基、-1-辛烯基、-2-辛烯基、-3-辛烯基、-1-壬烯基、-2-壬烯基、-3-壬烯基、-1-癸烯基、-2-癸烯基、-3-癸烯基等。烯基可为未取代或取代的。为了描述本发明的目的，适当时，术语“烯基”包括“亚烯基”。
如本文所用，术语“炔基”旨在表示其中具有特定数量的碳原子且其中至少 两个碳原子以三键连接在一起的不饱和的直链烃基。例如C2-C4炔基中的C2-C4定义为包括链中具有2、3或4个碳原子、所述碳原子中的至少两个以三键连接在一起的基团。这类炔基的实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基、-4-戊炔基、-1-己炔基、-2-己炔基、-5-己炔基、-1-庚炔基、-2-庚炔基、-6-庚炔基、-1-辛炔基、-2-辛炔基、-7-辛炔基、-1-壬炔基、-2-壬炔基、-8-壬炔基、-1-癸炔基、-2-癸炔基、-9-癸炔基等。炔基可为未取代或取代的。为了描述本发明的目的，术语“炔基”包括“亚炔基”。
如本文所用，术语“环烷基”旨在表示其中具有特定数量的碳原子的单环饱和脂族烃基，例如，C3-C7环烷基中的C3-C7定义为具有以单环排列的3、4、5、6或7个碳的基团。如上定义的C3-C7环烷基的实例包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。为了描述本发明的目的，术语“环烷基”包括“亚环烷基”。
如本文所用，术语“环烯基”旨在表示其中具有特定数量的碳原子的单环不饱和脂族烃基，例如，C3-C7环烯基中的C3-C7定义为包括具有以单环排列的3、4、5、6或7个碳的基团。如上定义的C3-C7环烯基的实例包括但不限于，环戊烯基和环己烯基。为了描述本发明的目的，术语“环烯基”包括“亚环烯基”。
如本文所用，术语“卤代”或“卤素”旨在表示氟、氯、溴和碘。
如本文所用，术语“卤代烷基”旨在表示如上定义的烷基，其中每个氢原子可连续地被卤素原子所替代。卤代烷基的实例包括但不限于，CH2F、CHF2和CF3。
如本文所用，单独的或与其它基团组合的术语“芳基”指包含6个碳原子的碳环芳香性单环基团，其可进一步地与另一个或另两个5-或6-元碳环基团稠合，所述5-或6-元碳环基团可为芳香性的、饱和或不饱和的。芳基包括但不限于，苯基、茚满基、1-萘基、2-萘基、四氢萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基和5-菲基。所述芳基可在环烷基环或芳香性环的合适位置处连接至另一个基团。例如：
所画的垂直于环成员之间的键的线，例如以上的箭头线，表示可连接至任何 适合的环原子的键(例如位于任何合适的环成员处的连接点)。为了描述本发明的目的，适当时，术语“芳基”包括“亚芳基”。
如本文所用，术语“杂芳基”旨在指表示具有最多十个原子的单环或双环环系，其中至少一个环为芳香性的，且含有1-4个选自O、N和S的杂原子。杂芳基取代基可通过环碳原子或一个杂原子连接。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、苯并咪唑基、苯并[b]噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、呫吨基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、异噻唑基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、异噁唑基、呋咱基(furazanyl)、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、噻唑并[4，5-b]-吡啶、以及荧光素衍生物例如：
如本文所用，术语“杂环基”旨在表示包含1-4个选自O、N和S的杂原子的5、6或7元非芳香性环系。杂环的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、咪唑烷基、吗啉基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、以及 
为了描述本发明的目的，术语“杂环基”包括“亚杂环基”。
如本文所用，单独的或与其它基团组合的术语“杂双环”旨在表示与另一个环状基团稠合的如上定义的杂环，所述另一个环状基团为杂环、芳基或本文所定义的任何其它环状基团。这类杂双环的实例包括但不限于，香豆素、苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯、2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英和3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂 。
如本文所用，术语“杂原子”旨在表示O、S或N。
在一定程度上，任何所指示的取代基可与本文所述的合成方法不相容，该取 代基可用适合的保护基(PG)保护，所述保护基对于这些方法中所用的反应条件来说是稳定的。可在所述方法的反应顺序中的合适点将所述保护基除去以提供期望的中间体或目标化合物。适合的保护基以及使用这类适合的保护基来保护不同的取代基和脱保护的方法为本领域技术人员所熟知；其实例可见于T.Greene和P.Wuts的Protecting Groups in Chemical Synthesis(第三版)，John Wiley&Sons，NY(1999)，其全部内容通过援引加入本文。通篇使用的保护基的实例包括但不限于Fmoc、Bn、Boc、CBz和COCF3。在一些情况下，取代基可以是特别挑选地，其在本发明方法所用的反应条件下为反应性的。在这些情况下，所述反应条件将所选择的取代基转化为另一取代基，所述另一取代基在本发明方法的中间体化合物中是有用的或者是目标化合物中期望的取代基。
本发明包括本文所述化合物的任何盐，特别是药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括，例如，与无机酸或有机酸形成的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。碱加成盐包括由无机碱或有机碱与游离酸的加成所制备的那些。衍生自无机碱的盐包括但不限于，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯、仲和叔胺、取代胺(包括自然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴胺、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。优选地，所述盐保留了游离酸或游离碱形式的化合物的期望的生物学效力和性质。
式1的化合物或其盐优选结合IAP的BIR结构域。BIR结合蛋白质的实例包括但不限于，胱天蛋白酶和线粒体衍生的BIR结合蛋白质例如Smac、Omi/WTR2A等。IAP的实例包括，但不限于人类或小鼠NAIP(Birc 1)、HIAP-1(cIAP2、Birc 3)、HIAP-2(cIAP1、Birc 2)、XIAP(Birc 4)、生存素(Birc 5)、livin(ML-IAP、Birc 7)、ILP-2(Birc 8)和Apollon/BRUCE(Birc 6)(参见例如美国专利6,107,041；6,133,437；6,156,535；6,541,457；6,656,704；6,689,562；Deveraux和Reed，Genes Dev.13，239-252，1999；Kasof和Gomes，J.Biol.Chem.，276，3238-3246，2001； Vucic等，Curr.Biol.10，1359-1366，2000；Ashab等，FEBS Lett.，495，56-60，2001，其内容通过援引加入本文)。IAP的BIR结构域记载于相关文献中，其典型的特征为具有在特定顺序内的多个不变的氨基酸残基，包括保守的半胱氨酸和一个保守的组氨酸残基。一些人类IAP的BIR结构域残基包括，例如XIAP的残基21-93(BIR1)、159-230(BIR2)和258-330(BIR3)(参考Swiss-Prot P98170)、HIAP-1的残基41-113(BIR1)、179-250(BIR2)和264-336(BIR3)(参考XP-006267)、以及HIAP-2的残基24-96(BIR1)、164-235(BIR2)和250-322(BIR3)(参考XP-006267)(参见Verhagen等，Genome Biology，2(7)：综述3009.1-3009.10(2001))。
期望地，式1的化合物或其盐结合至XIAP的BIR结构域，更优选结合至人类的XIAP。BIR结构结合可通过任何适合的技术来检测。例如，BIR结构域结合可在能够与已知BIR结构域结合蛋白质的结合相竞争的受试化合物的基础上检测(例如，抑制或防止已知BIR结构域结合蛋白质向给定BIR结构域的结合)。天然存在和合成的BIR结构域结合蛋白质是本领域已知的。在一些实施方案中，式1的化合物或其盐结合一种或多种IAP(例如NAIP、HIAP-1、HIAP-2、XIAP、生存素、livin、ILP-2或Apollon/BRUCE)，其Ki为小于或约500μM、250μM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM、500nM、250nM、100nM或50nM(其中越低的Ki值代表越高的亲合力)。在一些实施方案中，式1的化合物或其盐结合一种或多种IAP，其Ki为约500μM-约50nM，例如约250μM-约50nM、约100μM-约1μM或者约1μM-约50nM。在一些实施方案中，式1的化合物或其盐以上述范围之一中的Ki结合XIAP和HIAP2。
本文所述化合物可含有一个或多个不对称中心、手性轴和手性平面。因此，这些化合物可存在对映体、非对映体和其他立体异构形式，且可按照绝对立体化学(例如(R)-或(S)-或者氨基酸的(D)-或(L)-)和/或旋光度(例如(+)和(-))来定义。本发明旨在包括任何和全部此类可能的立体异构体，无论其以纯的形式或基本纯的形式(例如旋光纯的形式)存在或作为任何比例的异构体的混合物，包括外消旋混合物存在。旋光的(+)和(-)、(R)-和(S)-或者(D)-和(L)-异构体可通过使用旋光试剂、底物、催化剂或溶剂(手性合成子或手性试剂)的手性(不对称)合成来制备，或通过不对称转换将一种对映体转换为另一种对映体来制备。或者，异构体可使用常规技术由异构体形式的混合物(例如外消旋混合物)拆分得到，所述常规技术非限制性地包括反相HPLC、形成可通过结晶分离的非对映异构盐、气-液 或液相色谱、一种立体异构体与对映体特异性试剂的选择性反应。当所期望的对映体通过分离技术转化为另一种化学实体时，可能需要额外的步骤以形成所期望的对映体形式。
本发明的某些化合物在某些条件下也可以阴离子、阳离子或两性离子形式存在。本文所述的式1和其他化学式的化合物特别包括这类替代形式。
根据一个优选的实施方案，当向哺乳动物特别是人类给药时，式1的化合物或其盐提供口服生物利用度。期望地，式1的化合物或其盐显示约10％或更高、约15％或更高或者约20％或高的口服生物利用度。更优选地，式1的化合物或其盐显示约25％或高、约30％或高、约50％或更高或者甚至约75％或更高(例如约80％或更高、约90％或更高或者约95％或更高)的口服生物利用度。在一些实施方案中，式1的化合物或其盐显示约25％-约50％、约50％-约75％或者约75％-约100％的口服生物利用度。
合成方法
本文所述的本发明化合物可以通过多种技术中的任一种来制备。根据本发明的一个方面，所述化合物可根据路线1-4图示的方法A-C中的任一种来制备。
方法A提供制备式1的化合物或其盐的方法、以及制备与之相关的中间体化合物的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：(1)将脯氨醛衍生物(1-i)与具有式 的胺相结合，随后用氢化物还原，以提供中间体化合物1-ii，其中PG1为保护基；(2)用与PG1不同的保护基(PG2)保护中间体化合物1-ii的氨基，随后将PG1脱保护以提供中间体化合物1-iii；(3)用氨基酸偶联剂使中间体化合物1-iii与PG3(H)N(R3)CHCO2H偶联，其中PG3为不同于PG2的保护基，随后将PG3脱保护以提供中间体化合物1-iv；(4)用氨基酸偶联剂使中间体化合物1-iv与PG4(R1)N(R2)CHCO2H偶联，其中PG4为不同于PG2的保护基，以提供中间体化合物1-v；(5)将中间体化合物1-v的PG2脱保护以提供中间体化合物1-vi；和(6)通过使中间体化合物1-vi与式LG-C(O)-G的化合物相结合来酰基化中间体化合物1-vi，其中“LG”为离去基，随后将PG4脱保护以提供式1的化合物或其盐。方法A图示于以下路线1。方法A的每个中间体化合物、以及每个独立的用于制备所述中间体化合物的制备步骤被认为是本发明的额外方面。因此，本文提 供路线1的式1-i至1-v中任一个的化合物，包括其盐。本文还提供制备式1的化合物或其盐或者路线1的式1-i至1-vi中任一个中间体化合物包括其盐的方法，所述方法包括如上所述的方法A的步骤(1)-(6)中的一个或多个。
路线1
方法B提供制备式1的化合物或其盐的替代方法、以及制备与之相关的中间体化合物的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：(1)用氨基酸偶联剂使脯氨醇衍生物(中间体化合物2-i)与式PG3(H)N(R3)CHCO2H的化合物偶联，其中PG3为保护基，随后将PG3脱保护以提供中间体化合物2-ii；(2)使中间体化合物2-ii与式PG4(R1)N(R2)CHCO2H的化合物偶联以提供中间体化合物2-iii，其中PG4为保护基；(3)氧化中间体化合物2-iii以提供相应的醛，中间体化合物2-iv；(4)将化合物2-iv还原胺化，例如，通过使化合物2-iv与胺结合随后用适当的氢化物还原，以提供中间体化合物1-vi；(5)通过使化合物1-vi与式LG-C(O)-G化合物相结合来酰化化合物1-vi，其中LG为离去基，随后将PG4脱保护，以提供式1的化合物或其盐。方法B图示于以下路线2。方法B的每个中间体化合物、以及每个独立的用于制备所述中间体化合物的制备步骤被认为是本发明的额外方面。因此，本文提供路线2的式2-i至2-iv中任一个或式1-vi的化合物，包括其盐。本文还提供制备式1的化合物或其盐或者路线2的式2-i至2-iv中任一个的中间体化合物包括其盐的方法，所述方法包括如上所述的方法B的步骤(1)-(5)中的一个或多个。
路线2
方法C提供了另一种制备式1的化合物或其盐的替代方法、以及制备与之相关的中间体化合物的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：(1)通过使中间体化合物1-ii与式LG-C(O)-G的化合物相结合来酰化中间体化合物1-ii(如方法A中所描述的制备或通过其他方法制备)，其中PG1为保护基，随后将PG1脱保护以提供中间体化合物4-i；(2)用氨基酸偶联剂使化合物4-i与具有式PG3(H)N(R3)CHCO2H的化合物偶联，其中PG3为保护基，随后将PG3脱保护以提供中间体化合物4-ii；(3)用氨基酸偶联剂使中间体化合物4-ii与具有式PG4(R1)N(R2)CHCO2H的化合物偶联以提供中间体化合物1-vi，其中PG4为保护基，随后将PG4脱保护以提供式1的化合物或其盐。方法C图示于以下路线3。方法C的每个中间体化合物、以及每个独立的用于制备所述中间体化合物的制备步骤被认为是本发明的额外方面。因此，本文提供路线3的式4-i或4-ii的化合物，包括其盐。本文还提供制备式1的化合物或其盐者或路线3的式4-i或4-ii的中间体化合物包括其盐的方法，所述方法包括如上所述的方法C的步骤(1)-(3)中的一个或多个。
路线3
应用
本发明的化合物可以用于任何目的。然而，我们相信，如本文提供的式1的化合物和其盐尤其可用作IAP BIR结构域结合化合物。因此，本文描述的式1的化合物和其盐可用于在细胞或个体中(特别是在显示出不正常地低水平的凋亡的细 胞中或者在罹患或易患与不足的凋亡相关的疾病或病症的个体中)增强凋亡。不足的凋亡指的是在给定条件下不正常的凋亡水平或程度，或导致或者引起病理状态的凋亡水平或程度。因此，不足的凋亡包括例如，其中由于有害于个体的细胞没有凋亡而引起疾病或疾病继续下去的状态。与不足的凋亡相关的病症或疾病包括细胞增殖性疾病和病症，包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和通过医疗过程诱导的细胞增殖，所述医疗过程包括但不限于外科手术、血管成形术等。
因此，本文提供在细胞中增强或诱导凋亡的方法，所述方法包括将式1的化合物或其盐给予细胞。可以通过任何合适的方法将式1的化合物或其盐给予细胞，例如，使所述细胞与式1的化合物或其盐或者包含式1的化合物或其盐的组合物接触。靶细胞可以包括任何类型的显示出不足凋亡的细胞，换句话说，靶细胞以抗凋亡为特征或其发挥出可以被凋亡废止的病态功能，其包括但不限于癌细胞和炎性细胞。癌细胞可以是任何类型的恶性肿瘤，包括但不限于卵巢癌、结直肠癌、血癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌细胞。炎性细胞可以是任何类型的，包括但不限于B-细胞、T-细胞、巨噬细胞，树突状细胞和粒细胞。靶细胞的另外的实例包括异位的子宫内膜细胞和银屑病角质形成细胞。
如果与不存在式1额化合物或其盐的情况下显示的凋亡水平相比，在存在式1的化合物或其盐的情况下的凋亡水平以任意程度增加，那么细胞或细胞群的凋亡被增强。因此，凋亡的增强包括诱导不会凋亡的细胞发生凋亡，以及增加细胞发生凋亡的速率，增加细胞群中凋亡细胞的数量，或增加细胞对凋亡刺激的敏感性。当在细胞群中测量时，优选发生凋亡的细胞的数量至少增加约25％，更优选至少约50％、至少约75％或者至少约100％(例如，至少增加一倍或两倍)。可以使用任何用于测量和比较细胞中凋亡水平的技术以检测凋亡的增强。这些技术可以基于例如细胞增殖的变化，细胞膜渗透性的增加，线粒体代谢活性降低，DNA断裂(DNA梯状条带)或染色质浓缩，膜不对称性的改变(例如，磷脂酰丝氨酸由细胞质到膜的细胞外侧的易位)，凋亡胱天蛋白酶的活化，细胞色素C或凋亡抑制因子(AIF)通过线粒体释放进入细胞质，或任何其它已知作为凋亡指示的基础。
式1的化合物和其盐还可以用于改变炎性细胞因子从免疫系统细胞的释放，因此降低所述细胞炎性潜力。炎性细胞因子包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子。如果任一种或多种细胞因子在存在式1的化合物或其盐的情况下的释放量或速率比所述一种或多种细胞因子在不存在所述式1的化合物或其盐的情况下的释放量或速率有任何程度的增加或减少，那么细胞因子的释放被改变。期望地，任一种 或多种细胞因子的释放量或速率改变了(增加或减少)至少约25％，更优选至少约50％、至少约75％或者至少约100％(例如至少增加1倍或2倍)。可以使用任何用于测量和比较细胞中细胞因子释放水平的技术以检测炎性细胞因子释放的改变。这些技术可以，例如，直接依据样品或细胞培养物中细胞因子量的变化，或间接地通过检测细胞对于增加的或减少的细胞因子浓度的应答。
不希望被任何特别的理论或机理限制，我们相信式1的化合物结合或抑制XIAP、cIAP-1和/或cIAP-2。因此，在相关的方面，本发明提供降低细胞中XIAP、cIAP-1和/或cIAP-2的活性或蛋白质水平的方法，所述方法包括使所述细胞与式1的化合物或其盐接触。可以通过已知的测定和蛋白质定量技术测量XIAP、cIAP-1和/或cIAP-2的活性和蛋白质水平。本方法的所有其它方面如先前所描述的。
本文描述的本发明的化合物可以体外给药到细胞。如本文所用，术语“体外(in vitro)”指的是细胞不在活体中。本发明的化合物还可以体内或体外给药到细胞。如本文所用，术语“体内(in vivo)”指的是细胞是活体的一部分，例如，当细胞在宿主个体中时。本文中使用的术语“离体(ex vivo)”指的是体外给药化合物至细胞或细胞群，随后将所述细胞或细胞群给予宿主个体。通常，所述细胞与所述个体是自体同源的。
当将所述化合物给药到个体的细胞时，所述个体理想地是哺乳动物，尤其是人。根据本发明这一方面的方法最适合用于罹患与不足的凋亡相关的疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病的个体，或者用于有形成所述疾病的危险的个体。当所述细胞在个体中时，式1的化合物或其盐可以通过向所述个体给药式1的化合物或其盐或者包含式1的化合物或其盐的组合物(例如，药物组合物)来向所述细胞给药。优选地，向罹患与不足的凋亡相关的疾病或者自身免疫性疾病或炎性疾病的个体的细胞给药式1的化合物或其盐对治疗所述疾病是有效的。因此，本发明还提供治疗与不足的凋亡相关的疾病或者自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药式1的化合物或其盐。如本文中使用的，术语“治疗”旨在包括将疾病或病症的任意症状减轻至任意程度，或防止其发作。术语“治疗”还包括抑制、阻止或逆转患病细胞的生长或增殖或者疾病或病症的进展或扩散(转移)，或者改变炎性细胞因子的释放。治疗包括预防性治疗，例如，在手术移除癌症或肿瘤细胞之后治疗患者以防止所述癌症或肿瘤的再生长，或例如治疗以防止致病性细胞在导致疾病例如哮喘、MS等的条件下生存。
与不足的凋亡相关的疾病或病症包括以不适当的高水平的细胞分裂、不适当 的低水平的凋亡或此二者为特征的增殖性疾病。此类疾病可以包括在正常程序性细胞死亡或凋亡机制(TRAIL，FAS，凋亡体(apoptosome))方面有缺陷的那些。
自身免疫性病症或炎性病症的实例(其中抗凋亡促进病理或其中增加凋亡可以是治疗上有利的)包括多发性硬化、动脉粥样硬化、关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))等。本发明的另一方面提供以式1的化合物或其盐单独地或者与细胞因子或死亡受体配体例如Fas、TRAIL或TRAIL-受体激动剂抗体联合使用来诱导细胞(例如类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞)凋亡的方法。
其中凋亡抗性导致病状或其中增加凋亡可以是治疗上有利的疾病包括所有类型的癌症，包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌。可通过本发明的化合物、组合物和方法治疗的其它癌症包括但不限于在以下表中列举的那些：
式1的化合物或其盐可以纯的形式或基本上纯的形式使用，或作为包含式1的化合物或其盐和合适的载体的组合物使用。当要将所述组合物给药于个体或患者，特别是人类个体或患者时，所述载体应当是药学上可接受的载体。如本文所用，术语“个体”和“患者”旨在表示人类以及非人类哺乳动物，例如灵长类、猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔、大鼠、小鼠等。
本发明的药物组合物可以通过将本发明的化合物和合适的载体组合来制备。 所述载体可以是任何常规使用的那些并且只受物理-化学考量的限制，例如溶解性、与活性化合物无反应性和给药途径。本领域技术人员应当理解，除了以下描述的药物组合物，本发明的方法的活性化合物可以配制为包合复合物，例如环糊精包合复合物或脂质体。
本文描述的药学上可接受的载体，例如媒介物、辅剂、赋形剂和稀释剂，对本领域技术人员来说是已知的并且容易为公众所获得。优选地，所述药学上可接受的载体对活性剂来说是化学惰性的并在使用条件下不具有有害的副作用或毒性。
本发明方法的药物组合物有多种合适的制剂。所述制剂可以为例如固体、半固体或液体，包括片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。
制备这些剂型的实际方法对本领域技术人员是已知的或是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990)。在任何情况下，待给药的组合物包含治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以治疗如上所述的疾病状态。
可以配制所述药物组合物以用于任何给药途径，包括例如口服给药、局部给药、经皮给药、经黏膜给药、气雾剂/吸入给药、肠胃外给药(包括但不限于皮下、静脉内、肌内、胸骨内、腹腔内、脑内、骨内和真皮内)、直肠给药、舌下给药、眼部给药、鼻内给药和阴道给药。本领域技术人员应当理解给药本发明的化合物的途径是已知的，并且，虽然可以使用多于一种途径给药特定的化合物，但特定的一种途径可以比另一种途径提供更直接和更有效的反映。为了进一步解释的目的，描述以下配方，它们决不旨在限制本发明。
可注射的制剂是可能适于本发明的制剂之一。对可注射组合物的有效的药物载体的要求对本领域普通技术人员来说是众所周知的(参见例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers著，第238-250页(1982)，和ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，第四版，第622-630页(1986))。适用于肠胃外给药的制剂包括含水的和无水的等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与拟接受者的血液等渗的溶质，以及含水的和无水的无菌混悬剂，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。本发明的化合物可以在药物载体中在生理上可接受的稀释剂中给药，例如无菌液体或液体混合物，例如水，盐水，葡萄糖水溶液和相关糖溶液， 醇例如乙醇、异丙醇或十六烷基醇，二醇例如丙二醇或聚乙二醇，二甲基亚砜，甘油缩酮例如2，2-二甲基-1，3-二噁烷4-甲醇，醚例如聚乙二醇400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或者加入或不加入药学上可接受的表面活性剂的乙酰化脂肪酸甘油酯，例如肥皂或清洁剂，助悬剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药学上的辅剂，包括聚乙二醇化的或脂肪酸改性的甘油和甘油三酸酯。
可用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于肠胃外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于肠胃外制剂的合适的肥皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，而且合适的清洁剂包括(a)阳离子清洁剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶卤化物，(b)阴离子清洁剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和甘油一酯硫酸盐，和磺基琥珀酸盐，(c)非离子清洁剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性清洁剂，例如烷基-b-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。
所述肠胃外制剂通常在溶液中包含约0.01wt％至约10wt％的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射位点的刺激，此类组合物可以包含一种或多种具有约12至约17的亲水-亲脂平衡(HLB)的非离子表面活性剂。在这些配方中表面活性剂的量通常在约5wt％至约15wt％的范围。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及通过环氧丙烷和丙二醇的缩合形成的具有疏水基质的高分子量环氧乙烷加合物。所述肠胃外制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下存储，在临使用之前只需要添加注射用无菌液体赋形剂，例如水。临时的注射溶液和混悬剂可以由先前描述的无菌粉末、颗粒和片剂种类制备。
局部制剂对本领域技术人员是众所周知的。此类制剂在本发明中特别适合于施用于皮肤。载体可以合适地包括溶液、乳剂、药膏或凝胶基质。所述基质例如可以包括以下物质中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂例如水和醇，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以在局部给药的药物组合物中存在。如果打算经皮肤给药，所述组合物可以包括透皮贴剂或离子透入装置。 局部制剂包含的本发明的化合物浓度可以为约0.1％至约10％w/v(重量每单位体积)。
适用于口服给药的制剂可以包括：(a)液体溶液，例如溶解在稀释剂中的有效量的活性化合物；(b)胶囊、小药囊(sachet)、片剂、锭剂和含片，各自包含预定量的固体或颗粒形式的活性成分；(c)散剂；(d)在适当液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体制剂可以包含稀释剂，例如水、盐水和醇，例如乙醇、苄醇和聚乙烯醇，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳的明胶类型，包含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填料，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括以下物质中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容的赋形剂。锭剂形式可以包含在调味剂中的活性成分，所述调味剂通常为蔗糖、阿拉伯树胶或黄芪胶，此外，软锭剂包括在惰性基质(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)中的活性成分，乳剂、凝胶剂等除了活性成分还包含例如现有技术已知的赋形剂。所述口服制剂通常包含约0.1wt％至约70wt％的活性成分。
可以将本发明的化合物单独地或与其它合适的组分组合起来制成气雾剂以通过吸入给药。这些气雾剂可以置于加压的可接受的压缩气体中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。它们还可以被制备成无压力制剂的药物，例如在喷雾器或雾化器中。此类喷雾剂也可以用于喷雾黏膜。
另外，本发明的化合物或包括这些化合物的组合物通过与各种基质(例如乳化基质或水溶性基质)混合制成栓剂。适于阴道给药的制剂可以作为子宫托、止血塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂提供，除了包含活性成分之外，其还包含例如现有技术已知的适当的载体。
或者，本文描述的本发明的化合物可以改变成贮库形式，以使本发明的化合物以时间和在身体内的部分都受控的方式释放到被给药的身体中(参见，例如美国专利4,450,150)。活性化合物的贮库形式可以是例如包含化合物和多孔材料例如聚合物的可植入组合物，其中所述化合物被包覆或分散在整个所述多孔材料中。随后将所述贮库植入到身体中期望的位置并且将所述化合物以预定的速率通过在整个所述多孔材料从所述植入物释放。
在一些情况下，本发明的化合物可以有利的通过允许鞘内递送的植入泵给药。当给药的药物不能充分地透过血脑屏障时，此类递送方法对于递送药物至CNS尤其有用。
制备这些剂型的实际方法是已知的，或对本领域技术人员是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990)。在任何情况下，待给药的组合物应当包含治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐以治疗如以上描述的疾病状态。
本领域普通技术人员会容易地理解，本文描述的本发明的化合物可以以任何方式修改以增加所述化合物的治疗功效。例如，化合物或抑制剂可以直接地或通过接头(linker)间接地接合到靶向部分。将化合物或抑制剂接合到靶向部分的实践在现有技术中是已知的。如本文所用，术语“靶向部分”指的是任何分子或药剂，其具体地识别和结合细胞表面受体，以使所述靶向部分将化合物或抑制剂的递送导向到表面表达了所述受体的细胞群。靶向部分包括但不限于与细胞表面受体结合的抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任何其它天然或非天然存在的配体。如本文所用，术语“接头”指的是将化合物或抑制剂桥连到所述靶向部分的任何药剂或分子。本领域的普通技术人员理解，化合物或抑制剂上对于所述化合物或抑制剂的功能不必要的位点是连接接头和/或靶向部分的理想位点，条件是所述接头和/或靶向部分，一旦连接到所述化合物或抑制剂，不妨害所述化合物或抑制剂的功能。
被认为治疗上有效的量取决于很多因素而变化，包括所采用的具体化合物、待治疗的病症的准确类型和严重性以及患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；和给药方式。一般地，治疗有效的每日剂量可以为约0.1mg至约40mg/kg身体重量，每天一次或每天两次。
联合治疗
式1的化合物或其盐或者包含其的组合物可以根据本文描述的方法单独或与一种或多种另外的活性成分联合使用。例如，两种或多种不同的式1的化合物或其盐可以一起使用，或一种或多种式1的化合物或其盐可以与一种或多种其它治疗有效的化合物配合使用。当式1的化合物或其盐与一种或多种另外的活性化合物(无论是另一种式1的化合物或不同的化合物)配合使用时，所述一种或多种另外的化合物可以在给药所述式1的化合物或其盐同时、之前或之后给药。此外， 当同时给药时，所述一种或多种另外的化合物可以与所述式1的化合物或其盐在同一组合物中给药，或在不同的组合物中给药。
用于与式1的化合物或其盐联合使用另外的治疗剂的选择至少部分取决于待治疗的特定疾病或病症。根据本发明的一个方面，式1的化合物或其盐与直接或间接刺激死亡受体凋亡途径的药剂联合给药。不希望被任何特定的理论限制，我们相信，式1的化合物或其盐和刺激死亡受体凋亡途径的药剂(例如，死亡受体激动剂)的联合使用产生了增强的作用，并在一些情况下产生协同作用。所述死亡受体激动剂可以是任何能够刺激死亡受体介导的促凋亡响应的药剂。这些药剂包括可溶的TRAIL、TRAIL 受体激动剂和任何增加个体的TRAIL循环水平的药剂，包括免疫系统调节剂，例如可以诱导细胞因子(例如白介素或肿瘤坏死因子(TNF))释放的干扰素α或电离辐射(例如，UVB)。
TRAIL 受体激动剂包括任何通过刺激TRAIL死亡受体模拟TRAIL的化合物。此类化合物可以包括例如TRAIL受体的小分子激动剂或抗体激动剂。针对死亡受体TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的激动剂抗体是优选的，特别是被称为HGS-ETR1和HGS-ETR2的抗体。示例性的激动剂抗体包括描述在美国专利7,244,429、美国专利申请公布2007/0179086、2002/0004227、2006/0269554、2005/0079172、2007/0292411、2006/0270837(现为美国专利7,361,341)、2009/0026429、2006/0269555、2004/0214235和2007/0298039以及国际专利公布WO2006/017961和WO98/51793中的那些。这些公开中的每一个以其整体通过援引加入本文。在优选的实施方式中，本发明的化合物与这些TRAIL受体激动剂抗体中的一种或多种联合使用以治疗癌症和其他肿瘤。
可用于与式1的化合物或其盐联合的其它药剂包括例如雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊烯基蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPARδ激动剂、固有多药耐药的抑制剂、抗呕吐药物、用于治疗贫血或嗜中性白血球减少症的药剂、增强免疫的药物、蛋白酶抑制剂例如硼替佐米和MG 132(7-Leu-Leu-醛)(参见He等，Oncogene(2004)23，2554-2558)、HDAC抑制剂例如丁酸钠、丁酸苯酯、异羟肟酸、细胞周期蛋白四肽等(参见Rosato等，Molecular Cancer Therapeutics(2003)，1273-1284)、蛋白酶体中糜蛋白酶样活性的抑制剂、和E3连接酶抑制剂。其它这些试剂在WO 03/099211(PCT/US03/15861)中描述。
其它已知的化疗剂可以与式1的化合物或其盐联合使用，尤其是用于治疗对化疗敏感的癌症或其它增殖性疾病。任何化疗剂都可与式1的化合物或其盐联合使用。化疗剂的选择可以部分取决于正在被治疗的癌症或增殖性疾病的特定类型。示例性的化疗剂在以下段落中描述。本文描述的化疗剂仅仅说明性的，决不是限制性的。
长春花生物碱和微管破坏化合物：长春花生物碱包括长春新碱、长春碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨和脱水长春碱。多拉司他汀是在长春花生物碱结合域处主要干扰微管蛋白的寡肽。多拉司他汀包括多拉司他汀-10(NCS 376128)、多拉司他汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3和LU103793(西马多丁)。Cryptophycins(例如cryptophycin 1和cryptophycin 52(LY355703))在长春花生物碱结合域内结合微管蛋白并诱导G2/M阻滞和凋亡。
其它微管破坏化合物描述在美国专利6,458,765；6,433,187；6,323,315；6,258,841；6,143,721；6,127,377；6,103,698；6,023,626；5,985,837；5,965,537；5,955,423；5,952,298；5,939,527；5,886,025；5,831,002；5,741,892；5,665,860；5,654,399；5,635,483；5,599,902；5,530,097；5,521,284；5,504,191；4,879,278；4,816,444，以及美国专利申请公布2003/0153505A1；2003/0083263A1；和2003/0055002A1中。
紫杉烷类(Taxanes)和其它微管稳定化合物：紫杉烷类包括紫杉醇、多西他赛、RPR 109881 A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、IDN5109和IDN5390。紫杉烷类似物包括BMS-184476、BMS-188797，功能相关的非紫杉烷类包括埃博霉素(例如，埃博霉素A、埃博霉素B(EPO906)，脱氧埃博霉素B和埃博霉素B内酰胺(BMS-247550)、eleutherobin、discodermolide、2-epi-discodermolide/2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide和laulimalide。
其它微管稳定化合物描述在美国专利6,624,317；6,610,736；6,605,599；6,589,968；6,583,290；6,576,658；6,515,017；6,531,497；6,500,858；6,498,257；6,495,594；6,489,314；6,458,976；6,441,186；6,441,025；6,414,015；6,387,927；6,380,395；6,380,394；6,362,217；6,359,140；6,306,893；6,302,838；6,300,355；6,291,690；6,291,684；6,268,381；6,262,107；6,262,094；6,147,234；6,136,808；6,127,406；6,100,411；6,096,909；6,025,385；6,011,056；5,965,718；5,955,489； 5,919,815；5,912,263；5,840,750；5,821,263；5,767,297；5,728,725；5,721,268；5,719,177；5,714,513；5,587,489；5,473,057；5,407,674；5,250,722；5,010,099；和4,939,168；和美国专利申请公布2003/0186965A1；2003/0176710A1；2003/0176473A1；2003/0144523A1；2003/0134883A1；2003/0087888A1；2003/0060623A1；2003/0045711A1；2003/0023082A1；2002/0198256A1；2002/0193361A1；2002/0188014A1；2002/0165257A1；2002/0156110A1；2002/0128471A1；2002/0045609A1；2002/0022651A1；2002/0016356A1；2002/0002292A1中，它们各自通过援引加入本文。
其它可以与本发明的化合物一起给药的化疗剂在以下表格中列出：
当待要治疗的疾病或病症是炎性或自身免疫性病症(特别是类风湿性关节炎(RA))时，式1的化合物或其盐可以与一种或多种非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、皮质激素类和改善疾病的抗风湿药联合给药。可与式1或其盐联合用于这类应用的其它药剂包括白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗剂治疗例如阿那白滞素(KineretTM)、tocilizumab(ActemraTM)、羟氯喹(PlaquenilTM)、柳氮磺胺吡啶(AzulfidineTM)、来氟米特(AravaTM)，肿瘤坏死因子抑制剂例如依那西普(EnbrelTM)、阿达木单抗(HumiraTM)和英夫利昔单抗(RemicadeTM)，T-细胞共刺激阻断剂例如阿贝西普(OrenciaTM)，B-细胞消耗剂例如利妥昔单抗(RituxanTM)、那 他珠单抗(TysabriTM)，肌内注射的黄金和其他免疫调节剂和细胞毒性剂如硫唑嘌呤(ImuranTM)、环磷酰胺和环孢霉素A(NeoralTM，SandimmuneTM)。
其它可与式1的化合物或其盐联合用于治疗RA的药剂包括氨甲蝶呤、阿伦单抗(CampathTM)、抗-RANKL MAb(denosumab)、抗-Blys MAb belimumab(LymphoStat-BTM)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol)(CimziaTM)、p38抑制剂、JAK抑制剂、抗-TNF药剂、抗-CD20MAbs、抗-IL/ILR靶向剂例如靶向IL-1、IL-5、IL-6(toclizumab)、II-4、IL-13和IL-23的那些。
另外的联合还可以包括降低上述药剂的毒性(例如肝毒性、神经毒性、肾毒性等)的药剂。
筛选试验
本发明的化合物还可以用于筛选其它与IAP BIR结构域结合的化合物的方法。大体而言，为了将本发明的化合物用于鉴别与IAP BIR结构域结合的化合物的方法中，将所述IAP与载体结合并将本发明的化合物添加到试验中。或者，可以将本发明的化合物结合到载体上并加入IAP。
有很多方法测定本发明的化合物与BIR结构域的结合。在一种方法中，本发明的化合物例如可以是荧光或放射性标记的并且直接测定结合。例如，可以通过将IAP连接到固体载体上，加入可检测标记的本发明化合物，洗去过量的试剂，并测定所述可检测标记的量是否是存在于所述固体载体上的量来实施该方法。可以使用多个本领域技术人员已知的封闭和洗涤步骤。
在一些情况下，只标记一种组分。例如，可以标记BIR结构域中的特定残基。或者，可以将多于一种组分标记上不同的标记；例如使用I125标记BIR结构域，并使用荧光标记来标记探针。
本发明的化合物还可以用作竞争剂以筛选另外的候选药物或者受试化合物。如本文所用，术语“候选药物”或“受试化合物”可互换使用，表示要测试生物活性的任何分子，例如蛋白质、寡肽、小的有机分子、多糖、多核苷酸等。所述化合物可能能够直接或间接地改变IAP的生物活性。
候选药物可以包括多种化学种类，然而通常它们是分子量大于100并小于约2500道尔顿的小有机分子。候选药物通常包含与蛋白质结构上相互作用(例如氢键和亲脂性结合)所必需的官能团，并通常包括至少一个胺、羰基、羟基、醚或者羧基基团。所述候选药物通常包含用一或多个官能团取代的环状碳结构或杂环 结构和/或芳香性结构或多环芳香性结构。
候选药物可以得自任何数量的来源，包括合成或天然化合物库。例如多种手段可用于随机和直接合成广泛的有机化合物和生物分子，包括随机化的寡核苷酸的表达。或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可用的或容易制备的。此外，天然或合成制备的库和化合物易于通过常规化学、物理和生化手段改性。
可以通过在第一样品中将IAP BIR结构域和探针结合以形成探针：BIR结构域复合物，然后添加来自第二样品的受试化合物，来实施竞争性筛选试验。测定该试验的结合，并且两个样品的结合方面的变化或差异表示存在能够与BIR结构域结合并潜在地调节IAP活性的受试化合物。
因此，作为本发明的一个方面，本文提供包含本发明的化合物和可检测标记或亲和标志的探针。可检测标记包括任何可以与本发明的化合物结合的化学部分，以致当包括所述标记的化合物与BIR结构域缔合时，所述标记允许直接或间接检测所述化合物。优选地，所述标记还允许定量。亲和标志是促进与它们相连的化合物的分离或纯化的部分。
如本文所用，术语“探针”旨在表示用可检测标记或亲和标志标记的式1的化合物或其盐，并且其能够共价或非共价与IAP BIR结构域结合。例如，当所述探针非共价结合时，其可以被受试化合物置换。例如，当所述探针共价结合时，其可以用于形成可以被量化并被受试化合物抑制的交联的加合物。
在一种情况下，所述受试化合物的结合通过使用竞争性结合试验来测定。在该实施方案中，所述探针是用荧光标记标记的。在某些情况下，所述受试化合物和所述探针之间可以存在竞争性结合。显示所述探针导致与对照相比发生荧光变化的受试化合物被认为与BIR区域结合。
在一种情况下，所述受试化合物可以被标记。首先将所述受试化合物或本发明的化合物或者将二者一起加入到IAP BIR结构域，持续足以结合以形成复合物的时间。
所述探针：BIR结构域复合物的形成通常需要在4-40℃温育10分钟到约1小时，以允许高通量筛选。通常除去或洗去任何过量的试剂。然后加入受试化合物，随后，标记的组分的存在或不存在指示与BIR结构域的结合。
在一种情况下，首先加入探针，然后加入受试化合物。探针的置换是受试化合物与BIR结构域结合并因此能够结合至并潜在地调节IAP活性的标志。可以标 记任一种组分。例如，在洗液中存在探针表明被受试化合物置换。或者，如果受试化合物被标记，那么探针在载体上的存在表明发生了置换。
在一种情况下，可以首先添加受试化合物，温育并洗涤，随后加入探针。没有被探针结合可能表明受试化合物以更高的亲合力与BIR结构域结合。因此，如果在载体上检测到探针并伴随着没有受试化合物结合，则可能表明受试化合物能够结合到BIR结构域。
通过筛选受试化合物调节IAP活性的能力来试验调节，调节包括如上所述使受试化合物与IAP BIR结构域结合，并且测定IAP生物活性的变化。因此，在这种情况下，受试化合物应当既与BIR结构域结合(但这并非是必须的)，又如本文所定义的改变其生物活性。
在所述试验中可使用阳性对照和阴性对照。所有对照和受试样品均进行多次以获得统计学显著的结果。在温育后，洗涤样品除去非特异性结合的物质并测定结合的探针的量。例如，在使用放射性标记的情况下，可以在闪烁计数器中对所述样品进行计数以测定结合的化合物的量。
通常，取决于标记的性质，在试验中检测的信号可以包括荧光、共振能量转移、时间分辨荧光、放射性、荧光偏振、等离子体共振或化学发光等。可用于进行本发明的筛选试验的可检测标记包括荧光标记，例如荧光素、俄勒冈绿、丹磺酰、罗丹明、四甲基罗丹明、德克萨斯红、Eu3+；化学发光标记，例如荧光素酶；比色标记；酶标记物；或放射性同位素例如氚、I125等。可用于进行本发明的筛选试验的亲和标志包括生物素、聚组氨酸等。
实施例
以下术语和缩写、构建体和一般步骤在实施例中使用：
缩写和术语
Boc：叔丁氧基羰基；
Boc-Chg-OH：Boc-L-2(环己基)甘氨酸；
Boc-N-MeAla-OH：N-Boc-N-甲基丙胺酸；
CBz：苄氧羰基；
DIPEA：二异丙基乙胺；
DMAP：4-(二甲基氨基)吡啶；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DTT：二硫苏糖醇；
EDC：3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
EDTA：乙二胺四乙酸；
Fmoc：N-(9-芴基甲氧羰基)；
HBTU：O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐；
HCI：盐酸；
HOAc：乙酸；
HOBt：1-羟基苯并三唑；
HPLC：高效液相色谱；
LCMS：液相色谱-质谱；
MeOH：甲醇；
MgSO4：硫酸镁；
MS：质谱；
Ms：甲磺酰基；
NaHCO3：碳酸氢钠；
Pd/C：钯炭；
TEA：三乙胺；
TFA：三氟乙酸；
THF：四氢呋喃；
TMEDA：N，N，N，N-四甲基乙二胺；
Ts：对甲苯磺酰基.
IC50：达到50％最大响应的特定化合物的量、浓度或剂量。
EC50：达到50％细胞生存抑制的特定化合物的量、浓度或剂量。
用于表达的分子构建体
GST-XIAP连接的BIR3RING：通过BamH1和AVA I将氨基酸246-497的XIAP编码序列克隆入PGEX4T3。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白表达和纯化。
GST-HIAP2(cIAP-1)接头BIR 3：通过BamH1和Xhol将氨基酸251-363的HIAP2编码序列克隆入PGex4T3。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白表达和纯化。
GST-HIAP1(cIAP-2)接头BIR 3：通过BamH1和Xhol将氨基酸236-349的HIAP1编码序列克隆入PGex4T3。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白表达和纯化。
GST-接头BIR 2BIR3Ring：通过BamH1和Xhol将氨基酸93-497的XIAP编码序列克隆入PGex4T1。使用引物TTAATAGGATCCATCAACGGCTTTTATC和GCTGCATGTGTGTCAGAGG，采用标准PCR条件，从pGex4t3中的全长XIAP扩增氨基酸93-497。将PCR片段TA克隆入pCR-2.1(invitrogen)。通过BamH1/Xhol消化将接头BIR 2BIR 3Ring亚克隆入pGex4T1。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白表达和纯化。
全长人XIAP，AEG质粒数23(AEG plasmid number 23)。通过BamH1和Xhol限制位点将氨基酸1-497的XIAP编码序列克隆入GST融合载体PGEX4T3。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白纯化。
GST-XIAP接头BIR 2：通过BamH1和Xhol将氨基酸93-497的XIAP接头BIR2编码序列克隆入pGex4T3。将质粒转化入大肠杆菌DH5α用于蛋白表达和纯化。
重组蛋白质的表达
将谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记蛋白在大肠杆菌菌株DH5α中表达。为了表达全长XIAP，将XIAP-BIR域、cIAP-1、cIAP-2和Livin各自或其组合转化的细菌在37℃于加有50μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤(LB)培养基中培养整夜。然后将整夜培养的培养物用新鲜的加有氨苄青霉素的LB培养基稀释25倍，并使细菌生长至A600＝0.6，然后用1mM异丙基-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷诱导3小时。在诱导时，将细胞在5000RPM离心10分钟并除去培养基。从1升培养物中获得的各球粒接受10ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM DTT，1mM PMSF，2mg/ml溶酶体，100μg/ml))，在轻微震荡下于4℃温育。温育20分钟后，将细胞悬浮液在-80℃放置整夜或者直到需要时。
重组蛋白的纯化
为了纯化重组蛋白，将球粒在冰上解冻并且用25ml的裂解缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.6，0.1mM EDTA，100mM NaCl，100μg/mL的溶酶体)/500ml原始培养基再悬浮，在冰上温育15分钟，并且在液氮和37℃的水浴中进行5周期的冷冻 /解冻循环。将混合物使用探针超声波仪超声处理直至悬浮液不再粘滞，并且在13000g离心20分钟以收集可溶的部分(上清液)。
将得到的上清液与3ml谷胱苷肽-琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)在4℃混合20分钟。然后，将所述凝胶珠用1X三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)洗涤三次，以去除未结合的蛋白质。将保留的蛋白质用1ml的含10mM还原的谷胱甘肽的50mM的TRIS pH 8.0洗提2次。将洗提的蛋白质分别保存并且向它们加入合适的试剂以在-80℃保存。通过SDS-PAGE判断，纯化的蛋白质为＞90％纯度。纯化的蛋白质的蛋白浓度通过Bradford法测定。
在大肠杆菌AD494细胞中，使用pet28ACPP32构建体将His-标记蛋白表达于大肠杆菌菌株中。如上所述制备可溶性蛋白部分。为了蛋白纯化，根据厂商操作指南使用装有NiSO4的螯合琼脂糖凝胶(Pharmacia)，通过亲和色谱法纯化上清液。简而言之，将上清液使用2ml的琼脂糖凝胶在4℃下加载到NiSO4填装的琼脂糖凝胶中，保持20分钟。随后，将所述球用包含500mMNaCl的10mMMOPS(pH7.0)洗三次以去除未结合的蛋白质。保留的蛋白质用2ml的洗提缓冲液(含500mM咪唑的Tris溶液pH 8.0)洗提，并且向它们加入合适的试剂以在-80℃保存。通过SDS-PAGE确定，洗提的蛋白质的纯度＞90％纯度。纯化的蛋白质的蛋白浓度通过Bradford法测定。
探针P1和P2的制备
在2-氯三苯甲基氯树脂上使用标准Fmoc化学制备荧光肽探针P1，即，Fmoc-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr(t-Bu)-Leu-Pro-Gly(t-Bu)-Gly-OH(参见Int.J.Pept.Prot.Res.38：555-561，1991)。从树脂上的切割使用在二氯甲烷中的20％乙酸进行，这使得侧链仍旧封闭。在室温下使用在二甲基甲酰胺(DMF)中的过量的二异丙基碳二亚胺(DIC)将C-端保护的羧酸与4’-(氨基甲基)荧光素偶联(Molecular Probes，A-1351；Eugene，Oreg.)，并且用硅胶色谱纯化(二氯甲烷中的10％甲醇)。使用DMF中的20％哌啶除去N-端Fmoc保护基，并且以硅胶色谱纯化(二氯甲烷中的20％甲醇，0.5％HOAc)。最后，使用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的95％三氟乙酸除去叔丁基侧链保护基，以提供探针P1(HPLC测定纯度＞95％)。
使用WO2007/131,366中所描述的方法制备探针P2。
探针P2
实施例1
以下实施例图示了化合物5-e的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线5：中间体5-e的合成
步骤1：向冷却至0℃的Boc-Chg-OH(9.16g，35.6mmol)的DMF溶液依次加入DIPEA(10.33mL，59.3mmol)、HOBt(4.81g，35.6mmol)和HBTU(13.50
g，35.6mmol)。搅拌10分钟后加入(S)-脯氨醇(3.0g，29.7mmol)然后于室温下搅拌反应混合物过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸、NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体5-a。
步骤2：向中间体5-a(10.10g，29.7mmol)中加入含4N HCl的1，4-二噁烷(30mL)并于室温下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体5-b·HCl。MS(m/z)M+1＝240.2。
步骤3：向冷却至0℃的Boc-N-Me-Ala-OH(6.02g，29.6mmol)的DMF溶液依次加入DIPEA(20.70mL，118mmol)、HOBt(6.35g，41.5mmol)和HBTU(14.61g，38.5mmol)。搅拌10分钟后加入中间体5-b·HCl(8.20g，29.6mmol)且于室温下搅拌反应混合物过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸、NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体5-c。
步骤4：向冷却至0℃的中间体5-c(1.20g，2.82mmol)的CH2Cl2溶液依次加入碳酸氢钠(2.36g，28.2mmol)和Dess-Martin氧化剂(1.49g，3.52mmol)且随后于10℃搅拌反应2小时。加入NaHCO3水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体5-d。
步骤5：向中间体5-d(500mg，1.18mmol)的CH2Cl2溶液加入苯乙胺(283uL，1.88mmol)。于室温下搅拌2小时后加入三乙酰氧基硼氢化钠(300mg，1.41mmol)和甲醇且于室温下搅拌反应过夜。加入饱和NaHCO3水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体5-e。MS(m/z)M+1＝528.4。
实施例2
以下实施例图示了化合物6-h的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线6：中间体6-h的合成
步骤1：向N-(叔丁氧基羰基)-L-脯氨醛6-a(10.0g，50.2mmol)的二氯甲烷溶液(300mL)加入苯乙胺(6.52mL，50.2mmol)。于室温下搅拌2小时后，将反应冷却至0℃，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(21.0g，100.3mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物过夜。加入10％Na2CO3水溶液，分离有机层，用二氯甲烷萃取水相，合并的有机萃取物用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体6-b。将中间体6-b溶于二乙醚(125mL)，将溶液冷却至0℃并加入含1N HCl的二乙醚(50.0mL，50.0mmol)。沉淀形成，通过过滤收 集作为白色固体的中间体6-b·HCl。MS(m/z)M+1＝305.2。
步骤2：向冷却至0℃的中间体6-b(6.11g，20.08mmol)的1，4-二噁烷(50.0mL)和水(50mL)的溶液加入NaHCO3(8.43g，100.0mmol)。搅拌15分钟后加入苄基氯甲酸酯(3.43mL，24.10mmol)并随后于室温下搅拌反应2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体6-c。
步骤3：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(67.1mL)加入中间体6-c(8.41g，19.18mmol)中并于室温下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为米色固体的中间体6-d·HCl。MS(m/z)M+1＝339.3。
步骤4：向冷却至0℃的中间体6-d(394mg，1.05mmol)的DMF溶液依次加入(S)-2-Boc-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸(300mg，1.15mmol)、HATU(520mg，1.36mmol)、HOAt(48uL，0.21mmol)和DIPEA(733uL，4.21mmol)并随后于室温下搅拌反应过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为浅黄色油的期望中间体6-e。
步骤5：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.68mL)加入中间体6-e(610mg，1.05mmol)中并于0℃下搅拌溶液4小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的期望中间体6-f·HCl。MS(m/z)M+1＝480.4.
步骤6：向冷却至0℃的中间体6-f·HCl(271mg，0.52mmol)的DMF溶液依次加入Boc-N-Me-Ala-OH(117mg，0.58mmol)、HATU(240mg，0.63mmol)、HOAt(175uL，0.10mmol)和DIPEA(366uL，2.10mmol)并随后于室温下搅拌反应2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为浅黄色油的期望中间体6-g。
步骤7：N2下，向中间体6-g(277mg，0.41mmol)的THF溶液搅拌加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(89mg)。用H2吹洗反应混合物并搅拌3小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体6-h。MS(m/z)M+1＝531.5。
实施例3
以下实施例图示了化合物7-d的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中 用作中间体。
路线7：中间体7-d的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体6-d·HCl(95.90g，256mmol)的DMF(1300mL)溶液依次加入Boc-tBu-gly-OH(65.10g，281mmol)、HOAt(42.6mL，25.6mmol)、HATU(107g，281mmol)和DIPEA(179mL，1023mmol)并随后于0℃搅拌反应30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的期望中间体7-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(480mL)加入含中间体7-a(141.00g，256mmol)的甲醇(130mL)中并于0℃搅拌溶液30分钟随后于室温下搅拌3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体7-b·HCl。MS(m/z)M+1＝452.4。
步骤3：向冷却至0℃的中间体7-b·HCl(85.00g，174mmol)的DMF(870mL)依次加入Boc-N-Me-Ala-OH(38.90g，192mmol)、HOAt(37.70，22.64mmol)、HATU(72.80g，56.3mmol)和DIPEA(122mL，192mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵 水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体7-c。
步骤4：N2下，向中间体7-c(1.56g，2.45mmol)的甲醇溶液中搅拌加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(500mg)。用H2吹洗反应混合物并搅拌3小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液，以得到作为无色油的中间体7-d。MS(m/z)M+1＝503.5。
实施例4
以下实施例图示了化合物5的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线8：化合物5的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体5-e(150mg，0.28mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(56mg，0.34mmol)、HATU(162mg，0.42mmol)和DIPEA(500uL，2.87mmol)。于室温下搅拌反应混合物2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体8-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.8mL)加入含中间体8-a(99mg，0.14mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于室温下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物 并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物5·2HCl。MS(m/z)M+1＝574.4。
实施例5
以下实施例图示了化合物3的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线9：化合物3的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体6-h(221mg，0.41mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(74.7mg，0.45mmol)、HATU(206mg，0.54mmol)和DIPEA(218uL，1.24mmol)。于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体9-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(554uL)加入含中间体9-a(107mg，0.15mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物3·2HCl。MS(m/z)M+1＝576.4。
实施例6
以下实施例图示了化合物6的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线10：化合物6的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体7-d(1.97g，3.94mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(642mg，3.94mmol)、HATU(1.94g，5.12mmol)和DIPEA(2.05mL，11.81mmol)。于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体10-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(9.40mL)加入含中间体10-a(1.74g，2.69mmol)的乙酸乙酯(5mL)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物6·2HCl。MS(m/z)M+1＝548.4。
实施例7
以下实施例图示了化合物9的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线11：化合物9的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体7-d(200mg，0.39mmol)的二氯甲烷溶液依次加入DIPEA(174uL，0.99mmol)和2-氯-2-氧代乙酸乙酯(109mg，0.79mmol)。于室温下搅拌反应混合物3小时。加入1N HCl和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体11-a。
步骤2：向冷却至0℃的中间体11-a(215mg，0.35mmol)的THF溶液加入2N LiOH水溶液(1.0mL，2.0mmol)并于室温下搅拌反应1小时。加入1N HCl和乙酸乙酯，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，以提供作为白色固体的中间体11-b。
步骤3：向冷却至0℃的中间体11-b(200mg，0.34mmol)的DMF溶液依次加入苯胺(41uL，0.45mmol)、DIPEA(61uL，0.34mmol)和HATU(172mg，0.45mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用1N HCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体11-c。
步骤4：向冷却至0℃的中间体11-c(230mg，0.35mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)加入TFA(2mL)并随后于0℃下搅拌反应1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物9·TFA。MS(m/z)M+1＝550.1。
实施例8
以下实施例图示了化合物12-g的制备，其可式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线12：中间体12-g的合成
步骤1：向N-(叔丁氧基羰基)-L-脯氨醛6-a(30.0g，151.0mmol)的二氯甲 烷溶液(1000mL)加入2-(4-氟苯基)乙胺(19.79mL，151.0mmol)。于室温下搅拌2小时后，将反应冷却至0℃，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(38.3g，181.0mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物过夜。加入10％Na2CO3水溶液(800mL)，分离有机层，用二氯甲烷萃取水相，用盐水洗涤合并的有机萃取物，MgSO4干燥、过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体12-a。将中间体12-a溶于二乙醚(400mL)，将溶液冷却至0℃并加入含1N HCl的二乙醚(151.0mL，151.0mmol)。沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的中间体12-a·HCl。MS(m/z)M+1＝323.3。
步骤2：向冷却至0℃的中间体12-a·HCl(40.0g，111.0mmol)在1，4-二噁烷(300mL)和水(300mL)中的溶液加入NaHCO3(46.8g，557.0mmol)。搅拌15分钟后加入氯甲酸苄酯(17.50mL，123.0mmol)并随后于室温下搅拌反应1.5小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体12-b。
步骤3：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(139mL)加入中间体12-b(50.7g，111.0mmol)中并于0℃下搅拌溶液2.5小时。减压下除去挥发物并用二乙醚和己烷研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体12-c·HCl。MS(m/z)M+1＝357.3。
步骤4：向冷却至0℃的中间体12-c·HCI(38.9g，99.0mmol)的DMF溶液在30分钟内依次滴加Boc-tBu-gly-OH(15.07g，65.1mmol)、HATU(48.9g，129.0mmol)、HOAt(24.75mL，14.85mmol)和DIPEA(69.0mL，396.0mmol)并随后于0℃搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体12-d。
步骤5：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(108mL)加入含中间体12-d(49.0g，86.0mmol)的乙酸乙酯(10mL)中并于0℃下搅拌反应混合物4小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体12-e·HCl。MS(m/z)M+1＝470.5。
步骤6：向冷却至0℃的中间体12-e·HCl(10.4g，20.55mmol)的DMF溶液在30分钟内依次滴加Boc-NMe-Ala-OH(5.01g，24.66mmol)、HATU(10.94g，28.8mmol)、HOAt(5.14mL，3.08mmol)和DIPEA(14.32mL，82.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体12-f。
步骤7：N2下，向中间体2-f(8.50g，16.32nimol)的MeOH溶液(100mL)加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(3.4g)。用H2吹洗反应混合物并搅拌1小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体12-g。MS(m/z)M+1＝521.5。
实施例9
以下实施例图示了化合物40的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线13：化合物40的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(610mg，1.17mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(177mg，1.40mmol)、HATU(624mg，1.64mmol)和DIPEA(816uL，4.69mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化，提供作为白色泡沫的中间体13-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(2.3mL)加入中间体13-a(590mg，0.93 mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)溶液中并于0℃下搅拌混合物3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物40·2HCl。MS(m/z)M+1＝529.5。
实施例10
以下实施例图示了化合物50的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线14：化合物50的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(400mg，0.76mmol)的DMF溶液依次加入1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸锂盐(226mg，1.15mmol)、HATU(467mg，1.23mmol)和DIPEA(535uL，3.07mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化，提供作为白色泡沫的中间体14-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入含中间体14-a(282mg， 0.40mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液5小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物50·2HCl。MS(m/z)M+1＝592.5。
实施例11
以下实施例图示了化合物63的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线15：化合物63的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(15.17g，29.1mmol)的DMF溶液依次加入6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)(9.16g，35.0mmol)、HATU(13.29g，35.0mmol)和DIPEA(20.0mL，17mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯；分离有机层、用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤、无水MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体15-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(82.0mL)加入含中间体15-a(14.96g，21.88mmol)的乙酸乙酯(11mL)中并于0℃下搅拌溶液3小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物63·2HCl。MS(m/z)M+1＝584.5。
实施例12
以下实施例图示化合物66的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线16：化合物66的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(350mg，0.67mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)(208mg，1.0mmol)、HATU(435mg，1.14mmol)和DIPEA(468uL，2.69mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯；分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体16-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入含中间体16-a(515mg，0.78mmol)的MeOH(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物66·2HCl。MS(m/z)M+1＝609.5。
实施例13
以下实施例图示化合物67的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线17：化合物67的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(856mg，1.64mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(340mg，2.13mmol)、HATU(875mg，2.30mmol)和DIPEA(859uL，4.93mmol)并于0℃下搅拌反应混合物30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体17-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入含中间体17-a(515mg，0.78mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物67·2HCl。MS(m/z)M+1＝555.6。
实施例14
以下实施例图示了化合物68的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线18：化合物68的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(300mg，0.57mmol)的DMF溶液依次加入中氮茚-2-羧酸(107mg，0.66mmol)、HATU(285mg，0.75mmol)和DIPEA(301uL，1.72mmol)并于0℃下搅拌反应混合物30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体18-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入含中间体18-a(360mg，0.54mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物68·HCl。MS(m/z)M+1＝564.5。
实施例15
以下实施例图示了化合物62的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线19：化合物62的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(300mg，0.57mmol)的DMF溶液依次加入苯并[d]噁唑-2-羧酸钠(139mg，0.74mmol)、HATU(263mg，0.69mmol)和DIPEA(401uL，2.30mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体19-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.20mL)加入中间体19-a(294mg，0.44mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物62·HCl。MS(m/z)M+1＝566.5。
实施例16
以下实施例图示化合物53的制备，其为式的1化合物或其盐。
路线20：化合物53的合成
步骤1：向冷却至0℃的(2S，4S)-1-(叔丁氧基羰基)-4-苯氧基吡咯烷-2-羧酸20-a(1.40g，4.56mmol)的THF溶液加入硼烷四氢呋喃络合物(18.22ml，18.2mmol)，于0℃下搅拌反应15分钟并于室温下搅拌过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体20-b。
步骤2：向中间体20-b(1.33g，4.53mmol)在DMSO(5.24mL，73.9mmol)和二氯甲烷(10mL)中的溶液加入TEA(2.53mL，18.13mmol)和吡啶-三氧化硫络合物(1.44g，9.07mmol)，然后于0℃下搅拌反应30分钟并于室温下搅拌30分钟。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水 溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体20-c。
步骤3：向中间体20-c(1.32g，4.53mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(595μL，4.53mmol)。搅拌30分钟后于0℃下加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.21g，5.44mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用1N NaOH水溶液、水和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体20-d。
步骤4：向冷却至0℃的中间体20-d(1.87g，4.51mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(1.21g，4.96mmol)、HATU(2.05g，5.41mmol)和DIPEA(2.36mL，3.53mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体20-e。
步骤5：将含4NHCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入中间体20-e(800mg，1.43mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体20-f·2HCl。MS(m/z)M+1＝460.4。
步骤6：向冷却至0℃的中间体20-f·2HCl(709mg，1.43mmol)的DMF溶液依次加入Boc-tBu-gly-OH(397mg，1.71mmol)、HOAt(357uL，0.21mmol)、HATU(707mg，1.85mmol)和DIPEA(1.0mL，5.72mmol)并随后于室温下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体20-g。
步骤7：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入中间体20-g(651mg，0.96mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体20-h·2HCl。MS(m/z)M+1＝573.5
步骤8：向冷却至0℃的中间体20-h·2HCl(300mg，0.49mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(140mg，0.69mmol)、HOAt(123uL，0.07mmol)、HATU(281mg，0.73mmol)和DIPEA(344uL，1.97mmol)并随后于室温下搅拌反应过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体20-i。
步骤9：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.0mL)加入中间体20-i(348mg，0.45mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物53·2HCl。MS(m/z)M+1＝658.5。
实施例17
以下实施例图示化合物21-k的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线21：中间体21-k的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体21-a·HCl(10.0g，35.6mmol)在1，4-二噁烷(89mL)和水(89mL)中的溶液依次加入碳酸氢钠(8.98g，107.0mmol)和氯甲酸苄酯(6.72g，37.4mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入二乙醚(200 mL)，分离有机层，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为无色油的中间体21-b。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(30.0mL)加入中间体21-b(13.0g，34.4mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体21-c·HCl。MS(m/z)M+1＝279.3。
步骤3：向冷却至0℃的中间体21-c·HCl(10.52g，33.4mmol)的DMF溶液依次加入Boc-tBu-gly-OH(8.50g，36.8mmol)、HOAt(5.57mL，3.34mmol)、HATU(13.98g，36.8mmol)和DIPEA(23.35mL，134.0mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的期望中间体21-d。
步骤4：将含4NHCl的1，4-二噁烷(30.0mL)加入中间体21-d(15.8g，32.1mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体21-e·HCl。MS(m/z)M+1＝392.5
步骤5：向冷却至0℃的中间体21-e·HCl(15.2g，35.5mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(7.58g，37.3mmol)、HOAt(5.92mL，3.55mmol)、HATU(14.86g，39.1mmol)和DIPEA(24.8mL，142.0mmol)并随后于室温下搅拌反应2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体21-f。
步骤6：向冷却至0℃的中间体21-f(20.2g，35.0mmol)的THF溶液加入硼氢化锂(1.60g，73.6mmol)并于室温下搅拌反应1小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体21-g。
步骤7：向冷却至0℃的中间体21-g(10.1g，18.41mmol)在DMSO(5.23mL，73.6mmol)和二氯甲烷(184mL)中的溶液加入DIPEA(11.22mL，64.4mmol)和吡啶三氧化硫络合物(8.79g，55.2mmol)，然后于0℃下搅拌反应2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体21-h。
步骤8：向中间体21-h(10.60g，19.39mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(2.70g，19.39mmol)。于室温下搅拌过夜后于0℃下分批加入三乙酰氧 基硼氢化钠(4.93g，23.27mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和NaHCO3水溶液，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥、过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体21-i。MS(m/z)M+1＝670.6。
步骤9：向冷却至0℃的中间体21-i(10.0g，14.93mmol)和咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(84-c)(3.64g，14.93mmol)的DMF溶液依次加入HATU(6.24g，16.42mmol)和DIPEA(10.43mL，59.70mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为米色泡沫的中间体21-j。
步骤10：向中间体21-j(2.75g，3.37mmol)的TEA溶液(4.0mL，28.7mmol)依次加入氯化钯(II)(60mg，0.34mmol)和三乙基硅烷(1.34mL，8.45mmol)。用H2吹洗反应混合物并于室温下搅拌2小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液以得到作为米色固体的中间体21-k。MS(m/z)M+1＝681.7。
实施例18
以下实施例图示了化合物55的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线22：化合物55的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体21-k(420mg，0.61mmol)的二氯甲烷溶液(2.0mL)依次加入DIPEA(385uL，2.20mmol)、DMAP(4.50mg，0.03mmol)和乙酰氯(63uL，0.88mmol)并于室温下搅拌反应18小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色固体的中间体22-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(2.0mL)加入中间体22-a(230mg，0.32mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物55·2HCl。MS(m/z)M+1＝623.5。
实施例19
以下实施例图示了化合物59的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线23：化合物59的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体21-k(420mg，0.61mmol)的吡啶溶液(4.0mL)依次加入DIPEA(323uL，1.85mmol)、DMAP(3.8mg，0.03mmol)和苯磺酰氯(79uL，0.61mmol)并于室温下搅拌反应过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色固体的中间体23-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(2.0mL)加入中间体23-a(100mg，0.12mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物59·2HCl。MS(m/z)M+1＝721.5。
实施例20
以下实施例图示了化合物24-d的制备，其可式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线24：中间体24-d的合成
步骤1：向冷却至-10℃的中间体12-c·HCl(13.7g，34.9mmol)的DMF溶液依次加入Boc-Thr(Me)-OH(8.1g，34.9mmol)、HATU(14.6g，38.4mmol)、HOAt(63.9mL，38.4mmol)和DIPEA(24.4mL，139.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体24-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(94.0mL)加入含中间体24-a(10.8g，18.9mmol)的乙酸乙酯(10mL)中并于0℃搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体24-b·HCl。MS(m/z)M+1＝472.5。
步骤3：向冷却至0℃的中间体24-b·HCl(25.0g，49.2mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(12.0g，59.0mmol)、HATU(26.2g，68.9mmol)、HOAt(12.3mL，7.38mmol)和DIPEA(34.3mL，197mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体24-c。
步骤4：N2下，向中间体24-c(15.88g，23.67mmol)的MeOH溶液(118mL)加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(3.53g)。用H2吹洗反应混合物并搅拌5小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液以得到作为无色油的中间体24-d。MS(m/z)M+1＝537.5。
实施例21
以下实施例图示了化合物58的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线25：化合物58的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体24-d(15.0g，28.7mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)(5.79g，34.40mmol)、HATU(13.10g，34.40mmol)和DIPEA(20.0mL，115.0mmol)并于0℃下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体25-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(69.20mL)加入含中间体25-a(12.30g，18.45mmol)的乙酸乙酯(9.20mL)中并于0℃下搅拌溶液3小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物58·2HCl。MS(m/z)M+1＝567.5。
实施例22
以下实施例图示了化合物72的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线26：化合物72的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体24-d(400mg，0.76mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)(212mg，1.0mmol)、HATU(437mg，1.14mmol)和DIPEA(400uL，2.29mmol)并于室温下搅拌反应混合物30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体26-a。
步骤2：将含4NHCL的1，4-二噁烷(1.30mL)加入含中间体26-a(385mg，0.54mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物72·2HCl。MS(m/z) M+1＝611.5。
实施例23
以下实施例图示了化合物73的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线27：化合物73的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体24-d(580mg，1.11mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(168mg，1.33mmol)、HATU(591mg，1.55mmol)和DIPEA(581uL，3.33mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体27-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(2.0mL)加入含中间体27-a(510mg，0.81mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物73·2HCl。MS(m/z) M+1＝531.5。
实施例24
以下实施例图示了化合物75的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线28：化合物75的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体24-d(1.8g，3.44mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(743mg，4.48mmol)、HATU(2.0g，5.51mmol)和DIPEA(1.80mL，10.33mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤和真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体28-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(6.17mL)加入含中间体28-a(1.62g，2.46mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物75·2HCl。MS(m/z)M+1＝557.4。
实施例25
以下实施例图示了化合物74的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线29：化合物74的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体24-d(956mg，1.82mmol)的DMF溶液依次加入6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)(575mg，2.19mmol)、HATU(1.04g，2.74mmol)和DIPEA(958uL，5.49mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体29-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(3.65mL)加入含中间体29-a(1.0g，1.45mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物74·2HCl。MS(m/z)M+1＝586.4。
实施例26
以下实施例图示了化合物30-d的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线30：中间体30-d的合成
步骤1：向冷却至-10℃的中间体12-c·HCl(13.7g，34.9mmol)的DMF溶液依次加入Boc-Thr(Et)-OH(8.1g，34.9mmol)、HATU(14.6g，38.4mmol)、HOAt(63.9mL，38.4mmol)和DIPEA(24.4mL，139.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体30-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(94.0mL)加入含中间体30-a(10.8g，18.9mmol)的乙酸乙酯(10mL)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体30-b·HCl。MS(m/z)M+1＝486.5。
步骤3：向冷却至0℃的中间体30-b·HCl(25.0g，49.2mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(12.0g，59.0mmol)、HATU(26.2g，68.9mmol)、HOAt(12.3mL，7.38mmol)和DIPEA(34.3mL，197mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。 通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体30-c。
步骤4：N2下，向中间体30-c(15.88g，23.67mmol)的MeOH(118mL)溶液中加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(3.53g)。用H2吹洗反应混合物并搅拌1小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液，以提供作为无色油的中间体30-d。MS(m/z)M+1＝537.5。
实施例27
以下实施例图示了化合物76的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线31：化合物76的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体30-d(2.0g，3.73mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(564mg，4.47mmol)、HATU(1.70g，4.47mmol)和DIPEA(2.60mL，14.91mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白 色泡沫的中间体31-a。
步骤2：将在1，4-二噁烷(11.05mL)中的4N HCl加入中间体31-a(1.90g，2.95mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物76·2HCl。MS(m/z)M+1＝545.5。
实施例28
以下实施例图示了化合物78的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线32：化合物78的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体30-d(2.0g，3.73mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)(752mg，4.47mmol)、HATU(1.70g，4.47mmol)和DIPEA(2.60mL，14.91mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体32-a。
步骤2：将在1，4-二噁烷(8.81mL)中的4N HCl加入在乙酸乙酯(0.783mL) 中的中间体32-a(1.60g，2.35mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物78·2HCl。MS(m/z)M+1＝581.4。
实施例29
以下实施例图示了化合物79的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线33：化合物79的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体30-d(1.6g，2.98mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)(632mg，2.98mmol)、HATU(1.36g，3.58mmol)和DIPEA(2.0L，11.93mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体33-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(6.62mL)加入中间体33-a(1.28g，1.76mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时于0℃下。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物，以提供作为白色固体的化合物79·2HCl。MS(m/z)M+1＝625.5。
实施例30
以下实施例图示了化合物80的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线34：化合物80的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体30-d(1.60g，2.98mmol)的DMF溶液依次加入6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)(937mg，3.58mmol)、HATU(1.36g，3.58mmol)和DIPEA(2.07mL，11.93mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体34-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(7.93mL)加入中间体34-a(1.48g，2.11 mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物80·2HCl。MS(m/z)M+1＝600.5。
实施例31
以下实施例图示了化合物81的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线35：化合物81的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体30-d(1.6g，2.98mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(566mg，3.58mmol)、HATU(1.36g，3.58mmol)和DIPEA(2.0mL，11.93mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体35-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(6.48mL)加入中间体35-a(1.45g，2.16mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作 为白色固体的化合物81·2HCl。MS(m/z)M+1＝571.5。
实施例32
以下实施例图示了化合物36-h的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线36：中间体36-h的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体21-a·HCl(15.0g，53.4mmol)的二氯甲烷溶液依次加入DIPEA(37.3mL，214.0mmol)、DMAP(326mg，2.67mmol)和苯甲酰氯(6.82mL，58.8mmol)并随后于室温下搅拌反应过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干 燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的期望中间体36-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(141.0mL)加入中间体36-a(19.6g，56.3mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体36-b·HCl。MS(m/z)M+1＝249.2。
步骤3：向冷却至0℃的中间体36-b·HCl(14.7g，51.6mmol)的DMF溶液依次加入Boc-tBu-Gly-OH(13.13g，56.8mmol)、HOAt(8.60mL，5.16mmol)、HATU(21.59g，56.8mmol)和DIPEA(36.1mL，207.0mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的期望中间体36-c。
步骤4：将含4N HCl的1，4-二噁烷(130.0mL)加入中间体36-c(24.0g，52.0mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的中间体36-d·HCl。MS(m/z)M+1＝362.2。
步骤5：向冷却至0℃的中间体36-d·HCl(10.73g，52.8mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(10.73g，52.8mmol)、HOAt(8.80mL，5.28mmol)、HATU(22.07g，58.1mmol)和DIPEA(36.9mL，211.0mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体36-e。
步骤6：向冷却至0℃的中间体36-e(29.0g，53.0mmol)的THF溶液加入硼氢化锂(2.42g，111.0mmol)并于室温下搅拌反应1小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体36-f。
步骤7：向冷却至0℃的中间体36-f(25.8g，49.7mmol)在DMSO(14.13mL，199.0mmol)和二氯甲烷(200mL)中的溶液加入DIPEA(30.3mL，174.0mmol)和吡啶三氧化硫络合物(23.75g，149.0mmol)，然后于0℃下搅拌反应1小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体36-g。
步骤8：向中间体36-g(25.7g，49.7mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(6.21mL，47.4mmol)。于室温下搅拌过夜后，0℃下分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(21.14g，95.0mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物2小时。加入 饱和NaHCO3水溶液，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体36-h。向中间体36-h(27.4g，42.8mmol)的二乙醚溶液(500mL)加入含1N HCl的二乙醚(52.1mL，52.1mmol)，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的中间体36-h·HCl。MS(m/z)M+1＝640.6。
实施例33
以下实施例图示了化合物49的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线37：化合物49的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体36-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(507mg，3.11mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(2.06mL，11.83mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作 为白色泡沫的中间体37-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.19mL)加入中间体37-a(1.0g，1.27mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物49·2HCl。MS(m/z)M+1＝685.5。
实施例34
以下实施例图示了化合物69的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线38：化合物69的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体36-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂(85-d)(525mg，3.11mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(2.06mL，11.83mmol)并于室温下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱 纯化提供作为白色泡沫的中间体38-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.19mL)加入中间体38-a(1.24g，1.58mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物69·2HCl。MS(m/z)M+1＝684.4。
实施例35
以下实施例图示了化合物86的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线39：化合物86的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体36-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(448mg，3.55mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(2.06mL，11.83mmol)并于室温下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤和真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作 为白色泡沫的中间体39-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(4.68mL)加入中间体39-a(1.40g，1.87mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物86·2HCl。MS(m/z)M+1＝648.5。
实施例36
以下实施例图示化合物87的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线40：化合物87的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体36-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂(88-e)(662mg，3.11mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(2.06mL，11.83mmol)并于室温下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶 色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体40-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(5.92mL)加入中间体40-a(1.40g，1.87mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物87·2HCl。MS(m/z)M+1＝728.5。
实施例37
以下实施例图示了化合物89的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线41：化合物89的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体36-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(589mg，3.55mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(2.06mL，11.83mmol)并于室温下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。 通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体41-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.29mL)加入中间体41-a(1.02g，1.32mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物89·2HCl。MS(m/z)M+1＝674.5。
实施例38
以下实施例图示了化合物42-h的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线42：中间体42-h的合成
步骤1：向冷却至0℃的(2S，4R)-甲基4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯HCl盐42-a(4.0g，22.02mmol)的DMF溶液依次加入Boc-tBu-Gly-OH(6.11g，26.4mmol)、HOAt (5.51mL，3.30mmol)、HATU(10.89g，28.6mmol)和DIPEA(15.39mL，88.0mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为米色固体的期望中间体42-b。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(80mL)加入中间体42-b(7.89g，22.0mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体42-c·HCl。MS(m/z)M+1＝259.1。
步骤3：向冷却至0℃的Boc-NMe-Ala-OH(7.16g，35.2mmol)的DMF溶液依次加入HOBt(5.73g，37.4mmol)、HBTU(14.19g，37.4mmol)和DIPEA(19.23mL，40.0mmol)。搅拌10分钟后，加入中间体42-c(6.49g，25.1mmol)并随后于室温下搅拌反应过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的期望中间体42-d。
步骤4：向中间体42-d(2.32g，5.23mmol)、4-氟苯酚(704mg，6.28mmol)和三苯基膦(1.92g，7.32mmol)的THF溶液滴加DIAD(1.42mL，7.32mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供作为无色油的期望中间体42-e。
步骤5：向冷却至0℃的中间体42-e(4.6g，8.56mmol)的THF溶液加入硼氢化锂(559mg，25.7mmol)并于室温下搅拌反应3小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体42-f。
步骤6：向冷却至0℃的中间体42-f(4.2g，8.24mmol)在DMSO(2.33mL，33.0mmol)和二氯甲烷(80mL)中的溶液加入DIPEA(5.04mL，28.8mmol)和吡啶三氧化硫络合物(3.94g，24.72mmol)，然后于0℃下搅拌反应1小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为米色固体的中间体42-g。
步骤7：向中间体42-g(3.8g，7.49mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(935uL，7.13mmol)。于室温下搅拌过夜后，0℃下分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(3.18g，14.26mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和NaHCO3水溶液，分离有机层，用盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提 供作为黄色油的中间体42-g。向中间体42-g的二乙醚溶液(100mL)加入1NHCl的二乙醚(7.84mL，7.84mmol)，沉淀形成，通过过滤收集作为米色固体中间体42-h·HCl。MS(m/z)M+1＝631.5。
实施例39
以下实施例图示了化合物82的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线43：化合物82的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体42-h·HCl(1.50g，2.24mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(397mg，3.15mmol)、HATU(1.19g，3.15mmol)和DIPEA(1.57mL，8.99mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶 液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体43-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(4.50mL)加入中间体43-a(1.10g，1.48mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物82·2HCl。MS(m/z)M+1＝639.5。
实施例40
以下实施例图示了化合物83的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线44：化合物83的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体42-h·HCl(1.40g，2.01mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(447mg，2.94mmol)、 HATU(1.12g，2.94mmol)和DIPEA(1.46mL，8.39mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化是供作为白色泡沫的中间体44-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(6.69mL)加入中间体44-a(1.02g，1.33mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物83·2HCl。MS(m/z)M+1＝665.5。
实施例41
以下实施例图示了化合物84的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线45：化合物84的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体42-h·HCl(2.0g，2.96mmol)的DMF溶液 依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂(85-d)(494mg，2.94mmol)、HATU(1.11g，2.94mmol)和DIPEA(1.46mL，8.39mmol)并于室温下搅拌反应混合物3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体45-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(5.97mL)加入中间体45-a(926mg，1.19mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物84·2HCl。MS(m/z)M+1＝675.5。
实施例42
以下实施例图示了化合物10的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线46：化合物10的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-a·HCl(25.0g，69.7mmol)的DMF溶液于45分钟之内依次滴加咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(13.64g，84.0mmol)、HATU(34.4g，91.0mmol)和DIPEA(48.5mL，279.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱 和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为米色泡沫的中间体46-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(171mL)加入中间体46-a(32.0g，68.4mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。加入二乙醚并通过过滤收集作为白色固体的中间体46-b·2HCl。MS(m/z)M+1＝368.3。
步骤3：向冷却至0℃的中间体46-b·2HCl(25.0g，56.8mmol)的DMF溶液于30分钟之内依次滴加Boc-tBu-gly-OH(14.44g，62.5mmol)、HATU(28.1g，73.8mmol)、HOAt(14.19mL，8.52mmol)和DIPEA(39.6mL，227.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应45分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体46-c。
步骤4：将含4NHCl的1，4-二噁烷(62.4mL)加入中间体46-c(14.5g，24.97mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚并通过过滤收集作为白色固体的中间体46-d·2HCl。MS(m/z)M+1＝481.5。
步骤5：向冷却至0℃的中间体46-d·2HCl(13.8g，26.7mmol)的DMF溶液于30分钟之内依次滴加Boc-NMe-Ala-OH(5.97g，29.4mmol)、HATU(13.19g，34.7mmol)、HOAt(6.67mL，4.0mmol)和DIPEA(18.6mL，107.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体46-e。
步骤6：将含4N HCl的1，4-二噁烷(58.2mL)加入含中间体46-e(15.5g，23.28mmol)的乙酸乙酯(5mL)中并于0℃下搅拌溶液1.5小时。加入二乙醚并通过过滤收集作为白色固体的化合物10·2HCl。MS(m/z)M+1＝566.5。
实施例43
以下实施例图示了化合物47-d的制备，其可在式1化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线47：中间体47-d的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-c·HCl(29.57g，75.0mmol)的DMF溶液于30分钟之内依次加入Boc-Chg-OH(22.27g，87.0mmol)、HATU(42.9g，113.0mmol)、HOAt(18.82mL，11.29mmol)和DIPEA(41.4mL，226.0mmol)并随后于室温下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体47-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(188mL)加入含中间体47-a(44.7g，75.0mmol)的乙酸乙酯(10mL)中并于0℃下搅拌溶液4小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色泡沫的中间体47-b·HCl。MS(m/z) M+1＝596.4。
步骤3：向冷却至0℃的中间体47-b·HCl(25.8g，48.50mmol)的DMF溶液于30分钟之内依次滴加Boc-NMe-Ala-OH(11.33g，55.8mmol)、HATU(25.8g，67.9mmol)、HOAt(8.08mL，4.85mmol)和DIPEA(33.8mL，194.0mmol)并随后于0℃下搅拌反应1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体47-c。
步骤4：N2下，向中间体47-c(23.7g，34.8mmol)的MeOH(100mL)溶液中加入10％Pd/C(50％w/w水含量)(7.4g)。用H2吹洗反应混合物并搅拌2小时。然后通过硅藻土过滤反应并真空浓缩滤液以提供作为白色泡沫的中间体47-d。MS(m/z)M+1＝547.4。
实施例44
以下实施例图示了化合物20的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线48：化合物20的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(17.9g，32.7mmol)的DMF溶液于30分钟之内依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(84-c)(9.59g，39.3mmol)、 HATU(18.67g，49.1mmol)和DIPEA(17.11mL，98.0mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体48-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(44.5mL)加入含中间体48-a(12.32g，17.81mmol)的乙酸乙酯(10mL)中并于0℃下搅拌溶液4小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物20·2HCl。MS(m/z)M+1＝592.4。
实施例45
以下实施例图示了化合物103的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线49：化合物103的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(500mg，0.91mmol)的DMF溶液依次加入6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)(276mg，1.05mmol)、HATU(522mg，1.37mmol)和DIPEA(478uL，2.74mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶 液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体49-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(882uL)加入含中间体49-a(250mg，0.35mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物103·2HCl。MS(m/z)M+1＝610.3。
实施例46
以下实施例图示了化合物18的制备，其为式1的化合物或其盐。
路线50：化合物18的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(303mg，0.55mmol)的DMF溶液依次加入DIPEA(483uL，2.77mmol)和咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羰酰氯(250mg，1.38mmol)并于室温下搅拌反应混合物30分钟。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体50-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.85mL)加入含中间体50-a(366mg， 0.53mmol)的甲醇(200uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物18·2HCl。MS(m/z)M+1＝591.4。
实施例47
以下实施例图示了化合物120的制备，其为式1的化合物。
路线51：化合物120的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(500mg，0.91mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(138mg，1.09mmol)、HATU(522mg，1.37mmol)和DIPEA(478uL，2.74mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体51-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(918uL)加入含中间体51-a(240mg，0.37mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发 物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物120·2HCl。MS(m/z)M+1＝555.3。
实施例48
以下实施例图示了化合物113的制备，其为式1的化合物。
路线52：化合物113的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(500mg，0.91mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(152mg，915mmol)、HATU(522g，1.37mmol)和DIPEA(478uL，2.74mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体52-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.37mL)加入含中间体52-a(373mg，0.54mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物113·2HCl。MS(m/z)M+1＝581.3。
实施例49
以下实施例图示了化合物104的制备，其为式1的化合物。
路线53：化合物104的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体47-d(500mg，0.91mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)(224mg，1.05mmol)、HATU(522mg，1.37mmol)和DIPEA(478uL，2.74mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体53-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(886uL)加入含中间体53-a(260mg，0.35mmol)的乙酸乙酯(0.5mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物104·2HCl。MS(m/z)M+1＝635.3。
实施例50
以下实施例图示了化合物91的制备，其为式1的化合物。
路线54：化合物91的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.50g，2.88mmol)的DMF溶液依次加入1-环戊基-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(831mg，4.47mmol)、HATU(1.31g，3.46mmol)和DIPEA(2.0mL，11.52mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体54-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(8.79mL)加入含中间体54-a(1.20g，1.75mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液1.5小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物91·2HCl。MS(m/z)M+1＝583.5。
实施例51
以下实施例图示了化合物93的制备，其为式1的化合物。
路线55：化合物93的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.40g，2.69mmol)的DMF溶液依次加入1-环己基-1H-咪唑-4-羧酸(783mg，4.03mmol)、HATU(1.23g，3.23mmol)和DIPEA(1.87mL，10.76mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体55-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(5.17mL)加入中间体55-a(960mg，1.37mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液1.5小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物93·2HCl。MS(m/z)M+1＝597.4。
实施例52
以下实施例图示了化合物94的制备，其为式1的化合物。
路线56：化合物94的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.60g，3.07mmol)的DMF溶液依次加入1-异丙基-1H-咪唑-4-羧酸锂(734mg，4.76mmol)、HATU(1.40g，3.69mmol)和DIPEA(2.14mL，12.29mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体56-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(4.14mL)加入含中间体56-a(850mg，1.10mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物94·2HCl。MS(m/z)M+1＝557.4。
实施例53
以下实施例图示了化合物95的制备，其为式1的化合物。
路线57：化合物95的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.30g，2.49mmol)的DMF溶液依次加入1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(89-d)(656mg，3.25mmol)、HATU(1.23g，3.25mmol)和DIPEA(1.74mL，10.0mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体57-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(4.43mL)加入含中间体57-a(960mg，1.18mmol)的乙酸乙酯(1.0mL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提作为白色固体的供化合物95·2HCl。MS(m/z)M+1＝599.4。
实施例54
以下实施例图示了化合物61的制备，其为式1的化合物。
路线58：化合物61的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(350mg，0.67mmol)的DMF溶液依次加入1-苯基-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(190mg，1.0mmol)、HATU(435mg，1.14mmol)和DIPEA(468uL，2.69mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体58-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.25mL)加入含中间体58-a(345mg，0.50mmol)的甲醇(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物61·2HCl。MS(m/z)M+1＝591.5。
实施例55
以下实施例图示化合物122的制备，其为式1的化合物。
路线59：化合物122的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(213mg，0.41mmol)的DMF溶液依次加入1-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(90-c)(100mg，0.53mmol)、HATU(203mg，0.53mmol)和DIPEA(286uL，1.64mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体59-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.22mL)加入含中间体59-a(244mg，0.32mmol)的乙酸乙酯(325uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物122·2HCl。MS(m/z)M+1＝590.2。
实施例56
以下实施例图示了化合物109的制备，其为式1的化合物。
路线60：化合物109的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(229mg，0.44mmol)的DMF溶液依次加入5-苯基-1H-咪唑-2-羧酸(195mg，0.87mmol)、HATU(220mg，0.57mmol)和DIPEA(310uL，1.78mmol)并于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体60-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(2.22mL)加入含中间体60-a(307mg，0.44mmol)的乙酸乙酯(445uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物109·2HCl。MS(m/z)M+1＝591.2。
实施例57
以下实施例图示了化合物90的制备，其为式1的化合物。
路线61：化合物90的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(598mg，0.44mmol)的DMF溶液依次加入1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸(217mg，1.15mmol)、HATU(526mg，1.38mmol)和DIPEA(803uL，4.61mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体61-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.13mL)加入含中间体61-a(577mg，0.83mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物90·2HCl。MS(m/z)M+1＝591.4。
实施例58
以下实施例图示了化合物88的制备，其为式1的化合物。
路线62：化合物88的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.2g，2.30mmol)的DMF溶液依次加入5-苯基-1H-吡唑-3-羧酸(455mg，2.42mmol)、HATU(1.0g，2.77mmol)和DIPEA(1.60mL，9.22mmol)并于0℃下搅拌反应混合物2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体62-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(6.15mL)加入含中间体62-a(850mg，1.23mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液1.5小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物88·2HCl。MS(m/z)M+1＝591.4。
实施例59
以下实施例图示了化合物117的制备，其为式1的化合物。
路线63：化合物117的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(1.0g，1.92mmol)的DMF溶液依次加入5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-羧酸钠盐(91-c)(1.36g，6.41mmol)、HATU(2.19g，5.76mmol)和DIPEA(1.34mL，7.68mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体63-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(10.0mL)加入中间体63-a(453mg，0.65mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为白色固体的化合物117·2HCl。MS(m/z)M+1＝593.2。
实施例60
以下实施例图示了化合物115的制备，其为式1的化合物。
路线64：化合物115的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(847g，1.62mmol)的DMF溶液依次加入5-苯基异噁唑-3-羧酸(431mg，2.27mmol)、HATU(1.05g，2.77mmol)和DIPEA(1.13mL，6.51mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体64-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(5.0mL)加入中间体64-a(356mg，0.51mmol)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物115·2HCl。MS(m/z)M+1＝592.1。
实施例61
以下实施例图示了化合物65-i的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线65：中间体65-i的合成
步骤1：向(2S，4R)-1-Boc-2-甲基-4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯(18.0g，73.4mmol)、4-氟苯酚(9.05g，81.0mmol)和三苯基膦(21.17g，81.0mmol)在THF中的溶液滴加DIAD(17.07g，84.0mmol)的THF溶液(20mL)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并用硅胶色谱纯化残余物以提供作为黄色固体的期望中间体65-b。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(78mL，312mmol)加入中间体65-b(21.2 g，62.5mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时，于室温下搅拌溶液30分钟。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的中间体65-c·HCl。MS(m/z)M+1＝240.0。
步骤3：向冷却至0℃的中间体65-c·HCI(14.2g，51.5mmol)的DMF溶液依次加入Boc-Thr(Me)-OH(13.22g，56.7mmol)、HATU(21.54g，56.7mmol)、HOAt(8.58mL，5.15mmol)和DIPEA(36.0mL，206mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体65-d。
步骤4：将含4N HCl的1，4-二噁烷(63.3mL)加入中间体65-d(23.0g，50.6mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时，随后于室温下搅拌溶液30分钟。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的中间体65-e·HCl。MS(m/z)M+1＝355.2。
步骤5：向冷却至0℃的中间体65-e·HCl(16.2g，41.4mmol)的DMF溶液依次加入Boc-NMe-Ala-OH(9.27g，45.6mmol)、HATU(1734g，45.6mmol)、HOAt(6.91mL，4.14mmol)和DIPEA(29.0mL，166.0mmol)并随后于室温下搅拌反应3小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的期望中间体65-f。
步骤6：向冷却至0℃的中间体65-f(23.0g，42.6mmol)的THF溶液加入硼氢化锂(1.95g，90.0mmol)并于室温下搅拌反应过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体65-g。
步骤7：向冷却至0℃的中间体65-g(8.7g，17.01mmol)在DMSO(4.83mL，68.0mmol)和二氯甲烷(150mL)中的溶液加入DIPEA(10.40mL，59.5mmol)和吡啶三氧化硫络合物(8.12g，51.0mmol)，然后于室温下搅拌反应过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体65-h。
步骤8：向中间体65-h(8.0g，15.70mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(1.87mL，14.3mmol)。于室温下搅拌2小时后，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(6.37g，28.5mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和 NaHCO3水溶液，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为黄色油的中间体65-i。向中间体65-i的二乙醚(100mL)溶液加入含1N HCl的二乙醚(15.7mL)，沉淀形成，通过过滤收集作为米色固体的中间体65-i·HCl。MS(m/z)M+1＝633.4。
实施例62
以下实施例图示了化合物100的制备，其为式1的化合物。
路线66：化合物100的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(1.5g，2.24mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸(464mg，2.84mmol)、HATU(992mg，2.61mmol)和DIPEA(1.65mL，9.48mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体 66-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(2.0mL)加入中间体66-a(760mg，0.97mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时，随后于室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物100·2HCl。MS(m/z)M+1＝678.5。
实施例63
以下实施例图示了化合物102的制备，其为式1的化合物。
路线67：化合物102的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(2.0g，2.98mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)(641mg，3.79mmol)、HATU(1.32g，3.48mmol)和DIPEA(2.20mL，12.64mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水 洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体67-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.0mL)加入中间体67-a(900mg，1.16mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时，随后于室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物102·2HCl。MS(m/z)M+1＝677.5。
实施例64
以下实施例图示了化合物99的制备，其为式1的化合物。
路线68：化合物99的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(2.0g，2.98mmol)的DMF溶液依次加入1-甲基-1H-咪唑-4-羧酸(478mg，3.79mmol)、HATU(1.32g，3.48mmol)和DIPEA(2.20mL，12.64mmol)，于0℃下搅拌反应混合物1小时并于室温下搅 拌过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体68-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(3.0ml.)加入中间体68-a(900mg，1.16mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时和随后于室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯，沉淀形成并通过过滤收集作为白色固体的化合物99·2HCl。MS(m/z)M+1＝641.4。
实施例65
以下实施例图示了化合物114的制备，其为式1的化合物。
路线69：化合物114的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(600mg，0.90mmol)的DMF溶液依次加入6，7-二氢-5-H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)(236mg，1.42mmol)、HATU(397mg，1.04mmol)和DIPEA(662uL，3.79mmol)，于0℃下搅拌反应 混合物1小时并于室温下搅拌2小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体69-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(750uL)加入中间体69-a(230mg，0.30mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时，随后于室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物114·2HCl。MS(m/z)M+1＝667.1。
实施例66
以下实施例图示了化合物107的制备，其为式1的化合物。
方案70：化合物107的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(600mg，0.87mmol)的DMF溶液依次加入6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)(298mg，1.13mmol)、HATU(397mg，1.04mmol)和DIPEA(662uL，3.79mmol)，于0℃下搅拌反应 混合物1小时并于室温下搅拌过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体70-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.41mL)加入中间体70-a(450mg，0.56mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。加入乙酸乙酯，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物107·2HCl。MS(m/z)M+1＝696.3。
实施例67
以下实施例图示了化合物108的制备，其为式1的化合物。
联系71：化合物108的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体65-i·HCl(600mg，0.87mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)(303mg，1.42mmol)、HATU(397mg，1.04mmol)和DIPEA(662uL，3.79mmol)，于0℃下搅拌反应混合 物1小时并于室温下搅拌过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体71-a。
步骤2：0℃下，将含4NHCl的1，4-二噁烷(670uL)加入中间体71-a(220mg，0.26mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。加入乙酸乙酯，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物108·2HCl。MS(m/z)M+1＝721.1。
实施例68
以下实施例图示了化合物72-d的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线72：中间体72-d的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体42-d(18.0g，40.6mmol)的DMF溶液依次加入咪唑(3.32g，48.7mmol)、DMAP(496mg，4.06mmol)和叔丁基氯二甲基硅烷(6.73mL，44.6mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空 浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为无色油的中间体72-a。
步骤2：向冷却至0℃的中间体72-a(6.0g，10.76mmol)的THF溶液加入硼氢化锂(1.17g，53.8mmol)并于室温下搅拌反应过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体72-b。
步骤3：向冷却至0℃的中间体72-b(5.6g，10.57mmol)的DMSO(3.0mL，42.3mmol)和二氯甲烷(80mL)的溶液加入TEA(5.89mL，42.3mmol)和吡啶三氧化硫络合物(5.05g，31.7mmol)，然后于0℃下搅拌反应30分钟并于室温下搅拌1小时。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用10％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为白色泡沫的中间体72-c。
步骤4：向中间体72-c(3.0g，5.68mmol)的二氯甲烷溶液加入2-(4-氟苯基)乙胺(746uL，5.68mmol)。于室温下搅拌过夜后，将反应冷却至-5℃，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.54g，11.37mmol)并随后于室温下搅拌反应混合物2小时。加入饱和NaHCO3水溶液，分离有机层，用盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为黄色泡沫的中间体72-d。向中间体72-d的二乙醚溶液(100mL)加入含1N HCl的二乙醚(5.68mL)，沉淀形成，通过过滤收集作为米色固体的中间体72-d·HCl。MS(m/z)M+1＝651.6。
实施例69
以下实施例图示了化合物73-b的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线73：中间体73-b的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体72-d·HCl(7.02g，10.78mmol)的DMF溶液依次加入咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)(3.08g，18.33mmol)、HATU(6.97 g，18.33mmol)和DIPEA(7.53mL，43.1mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体73-a。
步骤2：向冷却至0℃的中间体73-a(6.14g，7.72mmol)的THF溶液加入1.0M TBAF的THF溶液(10.04mL，10.04mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体73-b。
实施例70
以下实施例图示了化合物111的制备，其为式1的化合物。
路线74：化合物111的合成
步骤1：向中间体73-b(1.95g，2.86mmol)、4-(三氟甲氧基)苯酚(561mg，3.15mmol)和三苯基膦(901mg，3.44mmol)的THF溶液滴加DIAD(724uL， 3.72mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供作为无色油的期望中间体74-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(6.85mL)加入含中间体74-a(921mg，1.09mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物111·2HCl。MS(m/z)M+1＝741.3。
实施例71
以下实施例图示了化合物106的制备，其为式1的化合物。
路线75：化合物106的合成
步骤1：向中间体73-b(2.30g，3.38mmol)、吡啶-4-醇(353mg，3.72mmol)和三苯基膦(1.06g，4.05mmol)的THF溶液滴加DIAD(854uL，4.39mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供作为无色油 的期望中间体75-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(9.24mL)加入含中间体75-a(1.12g，1.47mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物106·3HCl。MS(m/z)M+1＝658.1。
实施例72
以下实施例图示了化合物105的制备，其为式1的化合物。
路线76：化合物105的合成
步骤1：向中间体73-b(1.79g，2.63mmol)、4-甲氧基苯酚(359mg，2.89mmol)和三苯基膦(828mg，3.16mmol)的THF溶液滴加DIAD(665uL，3.42mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供期望作为无色油的中间体76-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(4.05mL)加入含中间体76-a(510mg，0.64mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物105·2HCl。MS(m/z)M+1＝687.1。
实施例73
以下实施例图示了化合物77-b的制备，其可在式1的化合物或其盐的制备中用作中间体。
路线77：中间体77-b的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体72-d·HCl(3.0g，4.61mmol)的DMF溶液依次加入1-N-甲基咪唑羧酸(988mg，7.83mmol)、HATU(2.98g，7.83mmol)和DIPEA(3.22mL，18.43mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体77-a。
步骤2：向冷却至0℃的中间体77-a(570mg，0.75mmol)的THF溶液加入1.0M TBAF的THF溶液(970uL，0.97mmol)并于室温下搅拌反应混合物2小时。加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色泡沫的中间体77-b。
实施例74
以下实施例图示了化合物97的制备，其为式1的化合物。
路线78：化合物97的合成
步骤1：向中间体77-b(700mg，1.08mmol)、4-(三氟甲氧基)苯酚(445mg，2.49mmol)和三苯基膦(712mg，2.71mmol)的THF溶液加入DIAD(549uL，2.82mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供作为无色油的期望中间体78-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(6.0mL)加入含中间体78-a(450mg，0.56mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成并通过过滤收集作为白色固体的化合物97·2HCl。MS(m/z)M+1＝705.4。
实施例75
以下实施例图示了化合物96的制备，其为式1的化合物。
路线79：化合物96的合成
步骤1：向中间体77-b(484mg，0.75mmol)、4-甲氧基苯酚(214mg，1.72mmol)和三苯基膦(492mg，1.87mmol)的THF溶液加入DIAD(379uL，195mmol)并随后于室温下搅拌反应2天。加入二乙醚和己烷，沉淀形成，通过过滤移出三苯基膦氧化物。减压下除去挥发物并通过硅胶色谱纯化残余物以提供作为米色固体的期望中间体79-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(2.80mL)加入中间体79-a(420mg，0.56mmol)的乙酸乙酯(500uL)中并于0℃下搅拌溶液2小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物96·2HCl。MS(m/z)M+1＝651.4。
实施例76
以下实施例图示了化合物123的制备，其为式1的化合物。
路线80：化合物123的合成
步骤1：0℃下，向中间体12-g(0.478g，0.919mmol)的DMF溶液依次加入5-苯基噁唑-2-羧酸钠盐(92-d)(0.194g，0.919mmol)、HATU(1.05g，2.76mmol)和DIPEA(0.642mL，3.68mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体80-a。
步骤2：0℃下，将含4N HCl的1，4-二噁烷(5mL，20.0mmol)加入中间体80-a(390mg，0.564mmol)中并于0℃下搅拌溶液3小时。加入二乙醚，沉淀形成，通过过滤收集作为白色固体的化合物123·2HCl。MS m/z M+1＝592.2。
实施例77
以下实施例图示了化合物125的制备，其为式1的化合物。
路线81：化合物125的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体12-g(316mg，0.608mmol)的DMF溶液依次加入1-(4-氟苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸钠(93-c)(0.2g，0.790mmol)、HATU(0.347g，0.912mmol)和DIPEA(0.423mL，2.431mmol)并于室温下搅拌反应混合物过夜。加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液，分离有机层，用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体81-a。
步骤2：将含4NHCl的1，4-二噁烷(1.5mL，6.06mmol)加入含中间体81-a(0.43g，0.606mmol)的乙酸乙酯(1.2mL)溶液中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研制残余物以提供作为灰白色固体的化合物125·2HCl。MS m/zM+1＝610.1。
实施例78
以下实施例图示了化合物119的制备，其为式1的化合物。
路线82：化合物119的合成
步骤1：向冷却至0℃的中间体42-h(250mg，0.396mmol)的DMF溶液依次加入2-(4-氟苯基)-2H-1，2，3-三唑-4-羧酸(94-d)(130mg，0.630mmol)、HATU(271mg，0.713mmol)和DIPEA(207uL，1.189mmol)。于0℃下搅拌反应混合物3小时并于室温下搅拌过夜。加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液；分离有机层。用乙酸乙酯萃取水相，合并的有机萃取物用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体82-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(924uL，3.70mmol)加入中间体82-a(303mg，0.370mmol)中并于0℃下搅拌溶液1小时。减压下除去挥发物并用二乙醚研 制残余物以提供作为白色固体的化合物119·2HCl。MS m/z M+1＝720.1。
实施例79
以下实施例图示了化合物126的制备，其为式1的化合物。
路线83：化合物126的合成
步骤1：0℃下，向中间体12-g(300mg，0.576mmol)的DMF溶液依次加入2-(4-氟苯基)-2H-四唑-5-羧酸钠盐(95-d)(190mg，0.749mmol)、HATU(329mg，0.864mmol)和DIPEA(400uL，2.305mmol)。于0℃下搅拌反应混合物1小时。加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液；分离有机层。用乙酸乙酯萃取水相，合并的有机萃取物用饱和氯化铵水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以得到中间体83-a。
步骤2：将含4N HCl的1，4-二噁烷(1.76mL，7.03mmol)加入中间体83-a (303mg，0.370mmol)的溶液中并于0℃下搅拌溶液2小时。减压下除去挥发物。通过反相色谱纯化提供作为白色固体的化合物126·2HCl。MS m/z M+1＝611.1。
实施例80
以下实施例图示了咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(84-c)的制备。
路线84：84-c的合成
步骤1：向冷却至0℃的2-氨基嘧啶84-a(50.00g，526mmol)的DMF溶液(375mL)加入3-溴-2-氧代丙酸(88.00g，526mmol)。于0℃下搅拌反应2小时并随后经过2小时温热至室温并搅拌18小时。加入乙腈(650mL)；沉淀形成并通过过滤收集。用乙腈和二乙醚冲洗沉淀并真空干燥，以获得作为白色固体的中间体84-b·HBr。MS m/z M+1＝182.0。
步骤2：向中间体84-b·HBr(98.80g，377mmol)的THF悬浮液(600mL)加入N，N-二甲基乙酰胺(48mL)。于80℃下搅拌反应48小时，冷却至室温并倒入乙腈(700mL)。沉淀形成并通过过滤收集，用乙腈和二乙醚冲洗并真空干燥，以得到作为米色固体的咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(84-c)。MS m/zM+1＝164.2。
实施例81
以下实施例图示了咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)的制备。
路线85：85-d的合成
步骤1：向2-氨基吡啶85-a(20.00g，213mmol)的THF溶液(417mL)加入溴丙酮酸乙酯(30.0mL，215mmol)。于室温下搅拌反应混合物18小时。沉淀形成并通过过滤收集，并用THF冲洗以提供作为黄色固体的中间体85-b·HBr。
步骤2：向中间体85-b·HBr的乙醇悬浮液(550mL)加入AcOH(5mL)并加热回流混合物3小时以得到澄清溶液。真空浓缩溶液，沉淀形成并用二乙醚研制；通过过滤收集作为米色固体的中间体85-c·HBr，将其溶解于水(0.5L)中并通过使用NaOH球碱化至pH 8。用乙酸乙酯萃取该溶液四次，合并的有机层用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以提供作为灰白色固体的中间体85-c。
步骤3：向中间体85-c(26.40g，0.139mmol)的乙醇溶液(140mL)加入2M LiOH水溶液(70mL，140mmol)并于室温下搅拌反应5小时。将反应混合物冷却至0℃，沉淀形成，通过过滤收集并用二乙醚冲洗以获得作为白色固体的咪唑并[1，2-a]吡啶-2-羧酸锂盐(85-d)。1HNMR(200MHz，CD3OD)，δppm 8.41(d，J＝6.6Hz，1H)，8.11(S，1H)，7.53(d，J＝9.2Hz，1H)，7.29(dd，J＝8.0Hz，J＝7.3Hz，1H)，6.90(dd，J＝6.7Hz，J＝6.71H)。
实施例82
以下实施例图示6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)的制备。
路线86：86-c的合成
步骤1：0℃下，向5-氟嘧啶-2-胺86-a(3.17g，28.0mmol)的DMF溶液(14mL)加入溴丙酮酸(7.73g，53.4mmol)。于0℃下搅拌反应混合物2小时并随后于室温下搅拌2天。用丙酮稀释反应；沉淀形成并通过过滤收集作为米色固体的中间体86-b·HBr。
步骤2：70℃下搅拌中间体86-b·HBr(8.40g，30.0mmol)在THF(100mL)和AcOH(10mL)中的悬浮液72小时。加入THF并通过过滤收集沉淀，用THF和二乙醚冲洗并真空干燥，以提供作为淡米色固体的6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-羧酸的HBr盐(86-c)。MS m/zM+1＝182.0。
实施例83
以下实施例图示了6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)的制备。
路线87：87-e的合成
步骤1：10℃下，向中间体87-a(5.00g，70.3mmol)的THF溶液加入丙炔酸乙酯(6.90g，70.3mmol)。于室温下搅拌反应混合物1小时并真空浓缩以提供作为黄色油的中间体87-b。
步骤2：向中间体87-b(1.90g，70.3mmol)的乙腈溶液(1400mL)加入4-硝基苯四氟硼酸重氮盐(16.66g，70.3mmol)并于室温下搅拌反应1小时以提供中间体87-c的溶液。
步骤3：向中间体87-c的溶液加入TEA(19.0mL，141mmol)并加热回流反应混合物2小时，冷却至室温并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为棕色固体的中间体87-d。MS m/z M+Na＝202.9。
步骤4：向中间体87-d(5.36g，29.7mmol)的THF溶液加入2N LiOH水溶液(32.7mL，65.4mmol)。于室温下搅拌反应混合物48小时并真空浓缩，以获得作为淡米色固体的6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-a]咪唑-2-羧酸锂盐(87-e)。MS m/z M+1＝153.0。
实施例84
以下实施例图示了1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)的制备。
路线88：88-e的合成
步骤1：0℃下，向氧化锌(7.32g，90mmol)的甲酸溶液(20.7mL，540mmol)加入4-氟苯胺88-a(20.00g，180mmol)。于70℃下搅拌反应混合物1小时，冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并经过硅藻土垫过滤。用水、10％Na2CO3水溶液和盐水洗涤滤液，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以得到作为米色固体的中间体88-b。MS m/zM+1＝140.0。
步骤2：向中间体88-b(8.35g，60.0mmol)的二氯甲烷溶液(111mL)依次加入三苯基膦(17.79g，67.8mmol)、TEA(8.32mL，60.0mmol)和四氯化碳(6.21mL，64.2mmol)。于室温下搅拌72小时后，将反应混合物冷却至0℃。沉淀形成，通过过滤收集并弃去。浓缩滤液并悬浮于冷的二乙醚中。通过过滤收集 不溶残余物并弃去。真空浓缩滤液以提供作为棕色油的中间体88-c。
步骤3：向用氮气吹扫的氧化铜(1.20g，8.40mmol)和1，10-菲咯啉(3.03g，16.80mmol)的THF悬浮液(400mL)依次加入中间体88-c(7.27g，60.0mmol)和异氰基乙酸乙酯(9.2mL，84mmol)。于70℃下搅拌18小时后将反应混合物冷却至室温并经过硅藻土垫过滤。真空浓缩滤液。通过硅胶色谱纯化提供作为淡黄色固体的中间体88-d。MS m/z M+1＝235.0。
步骤4：向中间体88-d(10.47g，44.7mmol)的THF溶液加入2N LiOH水溶液(24.6mL，49.2mmol)。于室温下搅拌过夜后，真空浓缩反应混合物。所得残余物用水稀释并用二氯甲烷萃取。弃去有机部分并真空浓缩水层以提供作为淡黄色固体的1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(88-e)。MS m/zM+1＝207。
实施例85
以下实施例图示了1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(89-d)的制备。
路线89：89-d的合成
步骤1：0℃下，向2-异氰基乙酸乙酯89-a(5g，44.2mmol)的无水乙醇溶液(50mL)加入1，1-二甲氧基-N，N-二甲基甲胺(10.53g，88mmol)。于室温下搅拌过夜后，真空浓缩反应混合物。通过在中性铝上的色谱纯化提供作为黄色油的中间体89-b。
步骤2：向密封管加入中间体89-b(1.00g，5.95mmol)和四氢-2H-吡喃-4-胺(1.80g，17.84mmol)。将管填充氮气、密封并于70℃下加热2小时。冷却至室温后，通过硅胶色谱纯化反应混合物以提供作为米色固体的中间体89-c。
步骤3：向中间体89-c(0.72g，3.22mmol)在3∶1甲醇/水混合物中的溶液加 入LiOH(0.116g，4.83mmol)。于室温下搅拌8小时后，真空浓缩反应混合物以得到作为白色泡沫的1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-4-羧酸锂盐(89-d)。MS m/zM+1＝197.0。
实施例86
以下实施例图示了1-苯基-1H-吡咯-3-羧酸锂盐(90-c)的制备。
路线90：90-c的合成
步骤1：向干燥的密封管加入1H-吡咯-3-羧酸甲酯90-a(150mg，1.199mmol)、碘化铜(I)(11.4mg，0.060mmol)、K3PO4(534mg，2.52mmol)、碘苯(160uL，1.439mmol)和甲苯(1.2mL)。将氮气鼓泡通过混合物5分钟，随后加入N1，N2-二甲基乙烷-1，2-二胺(21mg，0.240mmol)。将管密封并于100℃下搅拌反应过夜。然后，用乙酸乙酯稀释并在硅藻土垫上过滤。滤液用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以得到中间体90-b。MS m/zM+1＝202.2。
步骤2：向中间体90-b(241mg，1.198mmol)在2∶1THF/水混合物中的溶液加入LiOH(92mg，3.832mmol)。于50℃下加热反应混合物过夜并真空浓缩。将残余物溶于水，用二氯甲烷和二乙醚萃取并弃去有机萃取物。使用37％HCl水溶液将水相酸化至pH 2并用二氯甲烷萃取两次。合并的有机萃取物用无水MgSO4干燥并真空浓缩，以得到作为白色固体的1-苯基-1H-吡咯-3-羧酸锂(90-c)。MS m/zM+Na＝210.2。
实施例87
以下实施例图示了5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-羧酸钠盐(91-c)的制备。
路线91：91-c的合成
步骤1：向2-氯-2-氧代乙酸乙酯91-a(5.61g，41.1mmol)的甲苯溶液加入5-苯基-1H-四唑(6.00g，41.1mmol)。回流搅拌2小时后，用乙酸乙酯和水稀释反应混合物。有机层用1N HCl水溶液、水和盐水洗涤两次，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为黄色固体的中间体91-b。MS m/zM+1＝219.1。
步骤2：0℃下，向中间体91-b(1.40g，6.42mmol)的THF溶液加入1NNaOH水溶液(6.7mL，6.74mmol)。于室温下搅拌反应混合物2小时并真空浓缩，以提供作为白色固体的5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-羧酸钠盐(91-c)。MS m/z M+1＝191.1。
实施例88
以下实施例图示了5-苯基噁唑-2-羧酸钠盐(92-d)的制备。
路线92：92-d的合成
步骤1：0℃下，向甘氨酸乙酯盐酸盐92-a(4.64g，33.2mmol)的二氯甲烷溶液依次加入苯甲酰氯(3.22mL，27.7mmol)和TEA(11.49mL，83mmol)。于0℃下搅拌反应混合物2小时并于室温下搅拌过夜。加入乙酸乙酯和水，分离有机层，用1N HCl洗涤两次，随后用水和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空 浓缩以得到作为油的中间体92-b。
步骤2：向中间体92-b(1.10g，4.68mmol)的甲苯溶液(5.0mL)加入磷酰氯(2.18mL，23.38mmol)。回流加热反应混合物过夜并冷却至室温。加入乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液，分离有机层，用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为白色固体的中间体92-c。MS m/zM+1＝218.1。
步骤2：0℃下，向中间体92-c(200mg，0.921mmol)的THF溶液加入1NNaOH水溶液(1.1mL，1.105mmol)。于室温下搅拌3小时后，真空浓缩反应混合物以得到作为白色固体的5-苯基噁唑-2-羧酸钠盐(92-d)。MS m/z M+1＝190.2。
实施例89
以下实施例图示了1-(4-氟苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸钠盐(93-c)的制备。
路线93：93-c的合成
步骤1：向1-氟-4-碘苯93-a(0.926g，4.17mmol)在DMSO(4.0mL)和水(0.44mL)中的溶液依次加入叠氮化钠(0.325g，5.01mmol)、碳酸钠(0.088g，0.833mmol)、L-脯氨酸(0.096g，0.833mmol)、丙炔酸乙酯(0.409g，4.17mmol)、L-抗坏血酸钠(0.207g，1.043mmol)和硫酸铜(II)(0.052g，0.208mmol)。于65℃下搅拌反应混合物18小时并冷却至室温。加入氨水(1mL)、乙酸乙酯(25mL)和水(20mL)。进行相分离并用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机萃取物用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过反相色谱纯化提供中间体93-b。MSm/zM+1＝236.1。
步骤2：向中间体93-b(200mg，0.850mmol)的THF溶液加入2N NaOH水溶液(0.425mL，0.850mmol)。于室温下搅拌18小时后，真空浓缩反应混合物以提供作为黄色固体的1-(4-氟苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸钠(93-c)。MS m/zM+Na＝230.0。
实施例90
以下实施例图示2-(4-氟苯基)-2H-1，2，3-三唑-4-羧酸钠盐(94-d)的制备。
路线94：94-d的合成
步骤1：向94-a(1.75g，15.08mmol)的乙醇溶液(16mL)加入4-氟苯基肼(1.90g，15.08mmol)并于70℃下搅拌反应30分钟。加入水(16mL)，将反应混合物加热至85℃，浓缩至三分之一并在冰浴中冷却。黄色沉淀形成并通过过滤收集。将沉淀溶于25％乙醇/甲苯混合物(40mL)。将烧瓶装备冷凝器和Dean-Stark分水器，加热回流反应混合物，直至全部的乙醇被收集于Dean-Stark分水器中。将混合物冷却至室温；沉淀形成，通过过滤收集作为棕色固体的中间体94-b。
步骤2：于室温下搅拌中间体94-b(1.64g，7.32mmol)的乙酸酐溶液(13.8mL，146mmol)30分钟。用水(60mL)稀释反应，搅拌30分钟并通过过滤收集所得沉淀。在乙酸乙酯和水之间分配固体。分离各层；有机层用无水MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物溶于THF并加入碳酸铯(2.62g，8.05mmol)。于室温下搅拌混合物30分钟并过滤。真空浓缩滤液；将残余物溶于二乙醚并用水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得固体溶于2M HCl水溶液(50mL)，加入多聚甲醛(0.433g，14.41mmol)并回流加热反应混合物2小时。冷却至室温后，用二乙醚萃取混合物。分离有机层并用水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化提供作为淡黄色固体的中间体94-c。
步骤3：0℃下，向中间体94-c(300mg，1.569mmol)的甲醇溶液(15mL) 加入氰化钾(171mg，2.62mmol)和氧化锰(IV)(1078mg，12.40mmol)。于室温下搅拌反应混合物18小时，在硅藻土垫上过滤并用甲醇冲洗滤饼。真空浓缩滤液。通过硅胶色谱纯化提供作为淡黄色固体的2-(4-氟苯基)-2H-1，2，3-三唑-4-羧酸钠(94-d)。MS m/z M+1＝244.2。
实施例91
以下实施例图示2-(4-氟苯基)-2H-四唑-5-羧酸钠盐(95-e)的制备。
路线95：95-e的合成
步骤1：向4-氟苯胺95-a(2.00g，18.00mmol)在乙醇(5.7mL)和水(2.0mL)中的溶液加入37％HCl水溶液(3.7mL，45.0mmol)并将反应混合物冷却至-5℃。向混合物滴加5N亚硝酸钠水溶液(3.96mL，19.80mmol)，随后加入6N乙酸钠水溶液(9.0mL，54.0mmol)。于0℃下搅拌反应混合物10分钟，随后加入2-氯-3-氧代丁酸乙酯(2.96g，18.00mmol)并于27℃下继续搅拌过夜。加入THF(20mL)，将反应混合物加热至40℃并转入分液漏斗。分离水层并弃去。有机层含有作为THF溶液的中间体95-b。MS m/zM+Na＝267.1。
步骤2：0℃下，向中间体95-b(4.40g，18mmol)的THF溶液加入25％NH4OH水溶液(16mL，108mmol)。于室温下搅拌反应混合物3小时并转入分液漏斗。分离水层并弃去。浓缩有机层并用二乙醚/己烷混合物研制残余物；沉淀形成并收集作为红砖状固体的中间体95-c。
步骤3：向中间体95-c(1.36g，6.04mmol)的THF溶液(27mL)加入乙酸(1.1mL，18.12mmol)并将反应混合物加热至85℃。向反应加入2.6N亚硝酸钠水溶液(2.8mL，7.25mmol)，于85℃下搅拌混合物4小时并真空浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯并用饱和NaHCO3水溶液洗涤，分离各层并用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机层用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱纯化提供作为黄色固体的中间体95-d。MS m/z M+Na＝258.9。
步骤4：向中间体95-d(840mg，3.56mmol)的THF溶液加入2NNaOH水溶液(1.78mL，3.56mmol)。于50℃下搅拌反应混合物18小时并真空浓缩以提供作为黄色固体的2-(4-氟苯基)-2H-四唑-5-羧酸钠盐(95-e)。MS m/z M+1＝209.1。
根据以上方法或其微小改变所制备的化合物图示于表1。因为得到表1的化合物而需要的对上述方法的微小改变和适当原料的使用对本领域技术人员而言是显而易见的。
表1
实施例9
以下实施例说明式1化合物或其盐的用途。
基于荧光偏振的竞争性试验
使用荧光偏振(FP)试验测定式1的化合物对目标BIR结构域的结合。使用GENios酶标仪(TECAN)Pro仪评价荧光偏振，激发滤光片设置在485nm，发射滤光片设置在535nm。在试验中使用的蛋白质最终量相应于在P1或P2荧光(FITC)探针饱和试验中获得最大FP值的80％所需的蛋白质的量。在一定量的建立的目标蛋白质、荧光探针和所选化合物在试验缓冲液(50mM Hepes，pH 7.5，250mcg/mL γ-球蛋白，2mM DTT，1％DMSO)中的10点连续稀释液的存在下评价化合物效力(IC50)和选择性。
使用未处理的空白(black)96孔板(Corning#3915)和100微升的总体积进行试验，一式两份，所述100微升的总体积包含25微升在试验缓冲液中最终浓度为2nM的荧光探针，25微升稀释的化合物，25微升在试验缓冲液中的BIR蛋白质和25微升试验缓冲液。仅使用缓冲液(空白)或仅使用在缓冲液中的探针(G-因子)作为对照以进行校准。将板在室温下黑暗中温育1小时并且使用Genios Pro FP记录仪记录FP值(以毫偏振单位(mP)计)。
随后将测量的FP值(mP)对化合物浓度作图，并且使用适用于Windows系统的GraphPad Prism(第4.02版)，GraphPad Software，San Diego California USA和/或CambridgeSoft BioAssay Enterprise(第10.1版)，基于S形剂量-响应(可变斜率)曲线拟合计算IC50值。IC50值是50％的示踪剂被替换时受试化合物的浓度。由如上所述的计算的IC50值并根据描述在Nikolovska-Coleska，Z.(2004)AnalBiochem 332，261-273中的方程得到ki值。结果示于表2，其中A＝小于25nM；B＝小于250nM；C＝小于1000nM；D＝大于1000nM。根据表1中显示的化合物编号确认表2中的化合物。结果显示，式1的化合物表现出良好的亲合力。
表2
细胞培养和细胞死亡试验
将结直肠癌HCT116细胞以2000个细胞每孔的密度单层培养在在96孔板中的McCoy的5a培养基(HyClone)中，所述培养基添加了2.2g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清(HyClone)和1％的青霉素/链霉素(HyClone)。24小时后，用HGS ETR1(30ng/ml)和化合物一式三份地处理孔。将细胞在化合物和HGS激动性Trail受体抗体ETR1(Mapatumamab，30ng/ml)的存在下温育72小时。剩余细胞的代谢活力通过MTT(噻唑蓝溴化四唑，Sigma)测定来评估。
EC50值(与未处理的对照物相比在化合物的存在下50％细胞存活)使用BioAssay软件(CambridgeSoft)和GraphPad Prism(Graph Pad Software Inc.)从生存曲线来计算。结果提供在下文表3中，其中A＝小于50nM；B＝小于250nM；C＝小于1000nM；D＝大于1000nM。根据表1中显示的化合物编号确认表3中的化合物。结果显示，式1的受试化合物表现出强大的效力。
表3
佐剂诱导性关节炎(AIA)模型
在用合成佐剂脂样胺(lipoidal amine)(LA)激发之日前，使雄性Lewis大鼠(Charles River，125-150g)适应动物设施一周。在实验日(d)＝0，当同龄组的平均体重(BW)为165-200g时，用异氟烷麻醉大鼠，将下背部剃光，并用酒精擦拭，随后将0.1ml溶解在完全弗氏佐剂(CFA)中的LA(在CFA中50mg/mL的LA)皮下注射在尾根部。在实验日d＝7，剂量每只动物的BW并且用电子测径器(QuantuMike千分尺；Mitutoyo)测量踝关节宽度。基于脚踝宽度平衡各组并且开始进行治疗。从d＝7至d＝14，使用受试化合物5、6、7或10(参见表1)(10、30和60mg/kg，PO)、地塞米松(0.15mg/kg，PO)、或仅是溶媒(5mL/kg，PO)每天一次(QD)或每天两次(BID)口服(PO)治疗动物，并每天记录BW和踝关节宽度。
与对照相比，最高剂量的受试化合物表现出足肿胀的降低大于50％。一些化合物在更低的测试剂量下显示出类似的效果。这些结果表明了受试化合物对于该适应症的有效性。
胶原诱导性关节炎(CIA)：半治疗性给药(semi-therapeutic dosing)
使雄性B10RIII小鼠(7-8周大，Jackson Labs)适应动物设施一周。随后在实验第0天和第15天，用乳化在添加了结核分枝杆菌的CFA中的胶原蛋白对它们进行激发。从实验第12天开始，将受试化合物6、7或10(参见表1)以3、10、30mg/kg(PO BID)、或将地塞米松(0.2mg/kg，阳性对照)向动物给药。在研究的持续时间内，使用公认的评分系统评估临床关节炎的严重程度。
受试化合物在最高剂量下表现出关节炎评分的降低大于50％。一些化合物在更低的测试剂量下显示出类似的效果。这些结果表明受试化合物对于该适应症的有效性。
CIA：治疗性给药
使雄性B10 RIII小鼠(7-8周大，Jackson Labs)适应动物设施一周。随后在实验第0天和第15天，用乳化在添加了结核分枝杆菌的CFA中的胶原蛋白对它们进行激发。从实验第15天开始，将受试化合物10、40、45或66(参见表1)以3、10、30mg/kg(PO BID)或将地塞米松(0.2mg/kg，阳性对照)向动物给药。在研究持续时间内，使用公认的评分系统评估临床关节炎的严重程度。
与溶媒(水)对照相比，受试化合物在最高剂量下降低了受治疗动物的平均关节炎得分。
MDA-MB-231化合物+Mapatubamab异种移植物研究
在实验第0天，使雌性裸鼠在右胁皮下接受5X106MDA-MB-231(CD)细胞(0.1ml体积)。当平均肿瘤尺寸达到～100mm3时，基于肿瘤尺寸使用平衡设计形成各组，并且开始给药。每天给予受试化合物10或7(参见表1)(或仅给予相应的溶媒)，且每周2次给予mapatubamab(或仅给予相应的溶媒)。在整个研究中，每周两次测量肿瘤尺寸和体重。
与对照相比，当以(30和60mg/g，PO，QD)与mapatubamab(10mg/kg，IV)联合给药时，化合物10和7将肿瘤体积减少50％，表明受试化合物和mapatubamab之间的联合功效。
MDA-MB-231化合物+紫杉醇异种移植物研究
在实验第1天，使雌性CD-1裸鼠在右胁皮下接受5X 106MDA-MB-231(CD)细胞(0.1mL体积，细胞悬浮于无血清培养基中)。当平均肿瘤尺寸达到～100mm3时，基于肿瘤尺寸使用平衡设计形成各组。随后将化合物10、7、20、40、45、58、63和66以30和100mg/kg每周两次PO给药，共两周。在开始治疗时将紫杉醇(20mg/kg，IP)与受试化合物联合给药，随后在研究的持续期间每周给药一次。每周两次测量肿瘤尺寸和体重。
受试化合物在异种移植物研究中实现了停滞或肿瘤消退。
最大耐受剂量(MTD)研究：
使雄性CD-1小鼠(抵达时20-25g，Charles River)适应动物设施4天，并随后随机分配到治疗组中。每周两次通过管饲法向动物给药在水中的化合物63、58、45、10、20、40和66(15、70或350mg/kg，PO)或仅给予水(5mL/kg，PO)，共6次治疗。在整个实验中监测体重和一般健康状况。在最后一次给药(第19天)24小时后，将动物用异氟烷麻醉，并且收集血液用于血清生化。血清生化参数限于随机血糖、尿素、肌酐、总蛋白、白蛋白、球蛋白，A∶G比值、总胆红素、AST、ALT、碱性磷酸酶、GGT和淀粉酶。放血后，对动物进行全面尸检并且记录脑、心、肝、脾、肾、胃(空的)和小肠(空的，从胃到盲肠)的器官重量。因为某些治疗是抑制体重的(见下文)，将器官重量标准化为脑的重量，随后表示为相对于溶媒治疗对照组的百分比变化。
作为治疗的结果，小鼠显示出积极的生长曲线和最小的或没有临床症状，其中对于350mg/kg剂量的化合物63和40观察到微小的重量损失。
化合物在血浆中的药代动力学(PK)
通过IV或口服给药，将化合物5、6、7、10、17、34、58，63、66、77、78、80、81、86、87、99和114给药于CD-1小鼠。给药之后，通过HPLC-质谱测定受治疗小鼠血浆中的药物浓度，并相对于受试化合物的标准曲线评价药物浓度。由血浆浓度测定时间-浓度曲线(AUC)下面积，并且计算口服生物利用度(％F)
式1的受试化合物在CD-1小鼠中表现出良好的口服生物利用度(19-100％F)。另外，选自受试组化合物的化合物表现出对于人类等效剂量的阳性全尺度律(positive allometric scaling)。
本文引用的所有文献，包括出版物、专利申请和专利通过援引以相同程度加入本文，如同单独地且具体地指出每一文献通过援引加入本文并以其整体描述于本文中。
除非本文另有说明或明显与语境相矛盾，在描述本发明的语境中(尤其在以下权利要求的语境中)使用的英文术语“a”、“an”和“the”以及类似的指示应解释为覆盖了单数和复数。除非另有说明，术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，指的是“包括但不限于”)。除非本文另有说明，本文列举的数值范围仅仅旨在作为逐一地提及落在所述范围内的每一个单独的值的简便方法，并且每一个单独的值被加入到说明书中，如同它在本文中被单独地列举。除非本文另有说明或明显与语境相矛盾，本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有要求，本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并不对本发明的范围加以限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未被主张的要素对于实施本发明来说是必要的。
本文描述了本发明优选的实施方案，包括本发明发明人知道的实施本发明的最佳方式。在阅读了以上说明之后，这些优选的实施方案的变体可能对本领域普通技术人员会变得显而易见。本发明人期望本领域技术人员适当采用这些变体，本发明人预期本发明以与本文所具体描述的不同的方式来实施。因此，如适用法律所允许的，本发明包括本文所附的权利要求所述的主题的所有修该和等同。此外，除非本文另有指明或明显地与语境相矛盾，本发明包括以所有可能变体形式的上述要素的任意组合。
Claims (34)
1.式1的化合物：
或其盐，其中
R1为H或烷基；
R2为甲基或乙基；
R3为烷基、环烷基、杂环基、杂芳基或芳基，它们中的任一个可任选地被氨基、烷氨基或烷氧基进一步取代；
R4和R5各自独立地为H或烷基；
R6为H、卤素或烷氧基；
X为O、S、CH2、-(CH2)2-或CH-R7，其中R7为NR8、OR8、NC(O)OR8、NHC(O)R8或NHSO2R8，其中R8为烷基、环烷基、杂环基、芳基、芳烷基或杂芳基，它们中的任一个可任选地被烷基或卤素进一步取代；
且G为
(1)
其中R9为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或
(2)取代或未取代的唑或吡咯环，其任选地与取代或未取代的芳基、杂芳基、环烷基或杂环基稠合。
2.权利要求1的化合物，其中G为
且R9为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
3.权利要求1的化合物，其中G为
且X1为CH或N，R10为H、卤素、羟基、烷基、烷氧基、芳基、氨基或NHC(O)-烷基，且R11为氢、烷基或NHC(O)CH3；
或G为
其中X2为NH、NR12、O或S，且每个R12独立地为氢、任选被一个或多个烷基、烷氧基或卤素基团取代的烷基、环烷基、杂环基、NHC(O)CH3或苯基。
4.权利要求1的化合物，其中G为
其中R11为NHC(O)CH3或苯基；
其中R11为NHC(O)CH3或苯基；或
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中R6为H、F或甲氧基。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为-CH2-。
7.权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为CH-NHC(O)R8且R8为烷基、芳基、芳烷基、烷氧基或杂芳基，它们中的任一个可任选地被烷基或卤素进一步取代。
8.权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为CH-OR8且R8为芳基或芳烷基，其可任选地被卤素进一步取代。
9.权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为：
10.权利要求1-9中任一项的化合物，其中R4和R5均为氢。
11.权利要求1-10中任一项的化合物，其中R1和R2均为甲基。
12.权利要求1-11中任一项的化合物，其中R3为叔丁基、环己基、四氢吡喃基、
13.权利要求1的化合物，其中所述化合物为：
或
或其药学上可接受的盐。
14.在细胞中增强凋亡的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-13中任一项的化合物接触。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞是癌细胞。
16.改变炎症细胞因子从细胞的释放的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-13中任一项的化合物接触。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞是淋巴细胞、粒细胞或抗原呈递细胞。
18.权利要求14的方法，其中所述细胞在个体中，并且通过向所述个体给药权利要求1-13中任一项的化合物使所述细胞与所述化合物接触。
19.权利要求14-18中任一项的方法，所述方法进一步包括在给药权利要求1-13中任一项的化合物之前、同时或之后向所述个体给药化疗剂。
20.权利要求14-19中任一项的方法，所述方法进一步包括在给药权利要求1-13中任一项的化合物之前、同时或之后向所述个体给药死亡受体激动剂。
21.权利要求20的方法，其中所述死亡受体激动剂为TRAIL。
22.权利要求21的方法，其中所述死亡受体激动剂是TRAIL受体抗体。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述死亡受体激动剂以产生协同作用的量给药。
24.权利要求14-23中任一项的方法，其中所述个体是人。
25.权利要求24的方法，其中所述个体罹患增殖性疾病。
26.权利要求25的方法，其中所述增殖性疾病是癌症。
27.权利要求25的方法，其中所述增殖性疾病是自身免疫性疾病或炎性病症。
28.权利要求1-13中任一项的化合物，其用于按照权利要求14-27中任一项的方法在细胞中增强凋亡。
29.权利要求1-13中任一项的化合物，其用作治疗增殖性疾病的药物。
30.权利要求1-13中任一项的化合物制备用于治疗增殖性疾病的药物的用途。
31.式1-i至式1-vi、式2-i至式2-iv、式4-i或式4-ii中任一个的化合物。
32.制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括使化合物1-vi与式LG-C(O)-G的化合物相结合，其中LG为离去基且PG4为保护基，随后将PG4脱保护以提供式1的化合物：
其中所述方法任选地进一步包括
(a)将化合物1-v的PG2脱保护以提供化合物1-vi，其中PG2为保护基；
其中所述方法任选地进一步包括
(b)使化合物1-iv与PG4(R1)N(R2)CHCO2H偶联，以提供化合物1-v，其中PG4为不同于PG2的保护基；
其中所述方法任选地进一步包括
(c)使化合物1-iii与PG3(H)N(R3)CHCO2H偶联，其中PG3为不同于PG2的保护基，随后将PG3脱保护以提供化合物1-iv；
其中所述方法任选地进一步包括
(d)用不同于PG1的保护基(PG2)保护化合物1-ii的氨基，随后将PG1脱保护以提供化合物1-iii；
其中所述方法任选地进一步包括
(e)使化合物1-i与具有式
的胺相结合，其中PG1为保护基，随
后用氢化物还原，以提供化合物1-ii：
33.制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括使化合物1-vi与式LG-C(O)-G的化合物相结合，其中LG为离去基，随后将PG4脱保护，以提供式1的化合物：
其中所述方法任选地进一步包括
(a)将化合物2-iv还原胺化以提供化合物1-vi：
其中所述方法任选地进一步包括
(b)氧化化合物2-iii以提供化合物2-iv：
其中所述方法任选地进一步包括
(c)使化合物2-ii与式PG4(R1)N(R2)CHCO2H的化合物偶联以提供化合物2-iii，其中PG4为保护基：
其中所述方法任选地进一步包括
(d)使化合物2-i与式PG3(H)N(R3)CHCO2H的化合物偶联，其中PG3为保护基，随后将PG3脱保护以提供中间体化合物2-ii：
34.制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括将化合物1-vi脱保护以提供式1的化合物：
其中所述方法任选地进一步包括
(a)使化合物4-ii与具有式PG4(R1)N(R2)CHCO2H的化合物偶联以提供化合物1-vi，其中PG4为保护基：
其中所述方法任选地进一步包括
(b)使化合物4-i与具有式PG3(H)N(R3)CHCO2H的化合物偶联，其中PG3为保护基，随后将PG3脱保护以提供化合物4-ii：
其中所述方法任选地进一步包括
(c)使化合物1-ii与式LG-C(O)-G的化合物相结合，其中PG1为保护基，随后将PG1脱保护以提供中间体化合物4-i：
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