CN105705158A - 结合MAP激酶p38的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:1)或包括所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分，或包括1-5个氨基酸改变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。该化合物用于结合和抑制MAP激酶p38α，并作为研究工具用于药物发现、医学，特别是用于治疗炎性病症。

Description

结合MAP激酶p38的化合物
本发明涉及化合物及其用途。具体地，其涉及肽及其在抑制分裂素激活蛋白激酶p38α(简称MAP激酶p38α)和治疗炎性病症中的用途。
为免生疑问，多数情况下，本说明书全文将使用术语MAP激酶p38α。然而，所述酶还已知为以下习惯名称和术语：分裂素激活蛋白激酶14(简称MAP激酶14和MAPK14)和IUB分类EC2.2.11.24。其还有其他名称：细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白(简称CSAID-结合蛋白和CSBP)，MAP激酶MXI2，MAX-相互作用蛋白2，及应激激活蛋白激酶2a(简称SAPK2a)。所述酶还具有Uniprot标识符Q16539。本说明书中有时还将该酶称为p38α。
本说明书中，明显地出版前的文件的列表或讨论不应必然视为承认所述文件是现有技术的一部分或是公知常识。
MAP激酶p38α在炎症中起重要作用，其一直是基础研究和药物发现中大量工作的主题。Schieven(2009)Curr.Top.Med.Chem.9,1038-1048概述了集中于p38激酶在炎症中的作用的生物学。p38激酶通过先天免疫系统的细胞调控关键炎症介质的产生，包括TNFα、IL-1β和COX-2。另外，p38还充当细胞因子例如TNFα的下游，介导它们的部分效果。近来，已发现p38在响应T细胞包括Th17和调节性T细胞中起作用。与其在炎症中的重要作用一致，最近的证据表明，细胞可利用各种反馈机制来调控和维持p38信号传导。由p38激酶调控的生物过程表明了对抑制剂的各种潜在迹象和复杂性程度，这已证明是对围绕该目标的药物发现工作的挑战。
Karcher&Laufer(2009)Curr.Top.Med.Chem.9,655-676说明，自1993年以来，已对大量的p38MAP激酶抑制剂进行了表征。除了众所周知的吡啶基咪唑以外，已鉴定了多种新的支架，但可能是由于高毒性或选择性差，只有少数进入了II期临床研究。根据Karcher&Laufer，为了获得安全的药物特性，高效能、边缘性的(marginal)CYP450(细胞色素P450)相互作用和毒性，以及高水平的选择性将是可取的。
与MAP激酶p38α的核底物MEF2A和激活剂MKK3b上的对接位点(dockingsite)复合的MAP激酶p38α的晶体结构是已知的(Changetal(2002)Cell9,1241-1249)。
以前的小分子抑制剂对MAP激酶p38α缺乏选择性，并在人类临床试验中有一系列毒性，包括明显的肝毒性。据本发明人所知，没有MAP激酶p38α化合物成功进入市场，大多数在IIb期人类临床试验中失败。
MAP激酶p38α在炎症信号级联(signallingcascade)中起重要作用，因此认为它的抑制在一些人类疾病适应症特别是炎性病症中具有有益作用。这些包括但不限于皮肤炎性疾病例如特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、皮肤疤痕。MAP激酶p38α的激活也可在其他疾病中发挥基础作用，涉及炎症包括紧缩性阻塞性肺疾病(constrictiveobstructivepulmonarydisease)、哮喘、炎性肠病、动脉粥样硬化、癌症和类风湿性关节炎。
本文所描述的发明提供化合物，其用于结合并抑制MAP激酶p38α，并且其作为研究工具用于药物发现和人类医学和兽医学中，特别是用于治疗炎性病症。这样的炎性病症可存在于一些哺乳动物中，包括人类和犬。有利地，提供对MAP激酶p38α具有选择性并基本上不结合或抑制其它蛋白激酶的化合物。
WO2009/021137涉及各种激酶抑制肽。WO2011/126882涉及抗炎D3肽。
本发明的第一个方面提供一种化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)或包括所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分或包括1-5个氨基酸改变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。
除非另有说明，本说明书全文使用IUB/IUPAC的氨基酸的单字母码，并以传统的N-至C-端方向提供氨基酸序列。通常，所述氨基酸是L-氨基酸，但如下所示，在本发明的一些实施方案中，其中的一些氨基酸可以是D-氨基酸。变体中改变的氨基酸通常是天然氨基酸，其包括由遗传密码编码的20个氨基酸，还包括其他天然氨基酸例如羟基脯氨酸、硒代蛋氨酸和卡尼汀。然而，一些实施方案中，一个或多个改变的氨基酸可以是非天然氨基酸，例如烯丙基丙氨酸(allylalanine)和二苯基丙氨酸(diphenylalanine)。
通常，当SEQIDNo:1或其部分中的氨基酸改变时，氨基酸变为保守氨基酸。例如，认为在以下氨基酸组中的氨基酸是保守的变化：(N,Q)，(K,R)，(S,T)，(I,L,M)，(F,Y)。因此，方便地，化合物中I氨基酸残基可改变为L氨基酸残基，或者N氨基酸残基可改变为Q氨基酸残基，和/或化合物中K氨基酸残基可改变为R氨基酸残基等。
本发明第一个方面的化合物方便地可包括来自SEQIDNo:1的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸，或可包括1-5个氨基酸改变的SEQIDNo:1的所述7-17个或所有18个连续氨基酸的变体。通常，可改变化合物中存在的氨基酸序列SEQIDNo:1中或其7-17个氨基酸部分中的1、2、3、4或5个氨基酸。优选地，如果其部分包括15个或更少(例如11、12、13、14或15个氨基酸)的连续氨基酸，可改变不超过4个氨基酸(例如3个、2个、1个或0个)。优选地，如果其部分包括10个或更少(例如9或10个氨基酸)的连续氨基酸，可改变不超过3个氨基酸(例如2个、1个或0个)。优选地，如果其部分包括7个或8个连续氨基酸，可改变不超过2个氨基酸(例如1个或0个)。优选地可改变不超过约25％数量的SEQIDNo:1或其部分的氨基酸残基。进一步优选地，可改变不超过约20％或15％数量的SEQIDNo:1或其部分的氨基酸残基。％可通过以下步骤计算：确定与SEQIDNo:1或其适当部分相比改变的氨基酸残基的数量，除以对应于SEQIDNo:1的部分中的氨基酸残基的数量，再乘以100。例如，肽ALIFQKIMW有两个不同于SEQIDNo:1的部分的氨基酸残基(下划线标出，粗体)，使用其可以制备RALLIFQKIMW。因此，改变的残基的％计算为2/11×100％＝18.2％。
优选地，本发明第一个方面的化合物包括氨基酸序列RXXXXFQ，其中X是任何氨基酸。更优选地，本发明第一个方面的化合物包括氨基酸序列RALLIFQ。更优选地，本发明第一个方面的化合物包括氨基酸序列RALLIFQKIM。
在一个实施方案中，本发明第一个方面的化合物可表示为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18。优选地，X4可以是R、K、Q或H，X9可以是F、Y或H，X10可以是Q、N、K或R。优选地，该化合物是其中X4是R、X9是F或X10是Q的化合物。更优选地，该化合物是其中X4是R、X9是F和X10是Q的化合物。
优选地，该化合物中存在以下中的至少3种情况：X1是H，X2是K，X3是S，X5是A，X6是L，X7是L，X8是I，X11是K，X12是I，X13是M，X14是W，X15是L，X16是R，X17是R和X18是Q。优选地该化合物存在至少4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14个前述氨基酸位置。
特别优选地，该化合物是其中X2是K、X8是I、X13是M或X16是R的化合物。特别优选地，该化合物是其中X2是K、X8是I、X13是M和X16是R的化合物。
本发明的化合物还包括其中X1是A、V、I或L，X2是A、R、I或L，X3是A、V、S、T、N或Q，X4是R、K、Q或H，X5是A、V、I或L，X6是L、I、A或V，X7是A、V、I或L，X8是A、V、I或L，X9是F、Y或H，X10是Q、N、K或R，X11是K、Q或R，X12是I、L、V或A，X13是M、L、I、C，X14是W、A、V、I、L、M或F，X15是L、I、A或V，X16是A、V、I、L、R、K、Q或H，X17是A、V、I或L，和/或X18是Q、A、V、I或L的那些化合物。
还应当认识到，在化合物包括少于SEQIDNo:1的18个氨基酸残基的实施方案中，特定位置X可以是“空的(null)”(即不包括氨基酸残基)。因此，例如，当化合物包括17个连续氨基酸残基的部分SEQIDNo:1时，或者X1是空的或者X18是空的。同样地，当化合物包括16个连续氨基酸残基的部分SEQIDNo:1时，X1和X2，或者X1和X18或者X17和X18是空的，对于连续氨基酸残基的部分SEQIDNo:1，以此类推。
优选地本发明第一个或第二个方面的化合物的氨基酸序列具有7-18个氨基酸。例如，氨基酸序列可具有8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸。优选地化合物具有8-18个氨基酸。还优选地化合物具有11-18个氨基酸。通常，当本发明第一个或第二个方面的化合物由肽组成时，其分子量小于30000道尔顿，优选地小于25000道尔顿，更优选地小于20000道尔顿。通常，当本发明第一个或第二个方面的化合物包括连接如下所讨论的另一部分(meoity)的肽部分(peptideportion)时，本发明的化合物的分子量通常为10000道尔顿和100000道尔顿之间，例如20000道尔顿和80000道尔顿之间，例如20000道尔顿和50000道尔顿之间。
本发明的化合物包括那些包含或组成为以下氨基酸序列的化合物，(R,K,Q,H)AL(L,A,V,I,L)I(F,Y,H)(Q,N,K,R)KIM(W,A,V,I,L)，其中来自括号内的每组的一个氨基酸在该位置上使用，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。因此，本发明包括包含氨基酸序列X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14的化合物，其中X4是R、K、Q或H，X5是A，X6是L，X7是L、A、V、I或L，X8是I，X9是F、Y或H，X10是Q、N、K或R，X11是K，X12是I，X13是M，以及X14是W、A、V、I或L，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。在该实施方案中，X1、X2、X3、X15、X16、X17和X18的每个都是“空的”(即，该位置不存在氨基酸残基)。
本发明的化合物包括：
HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)、
HKSRALLIFQKIMWLRR(SEQIDNo:2)、
HKSRALLIFQKIMWLR(SEQIDNo:3)、
HKSRALLIFQKIMWL(SEQIDNo:4)、
HKSRALLIFQKIMW(SEQIDNo:5)、
KSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:6)、
SRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:7)、
SRALLIFQKIM(SEQIDNo:8)、
SRALLIFQ(SEQIDNo:9)、
HALAIFQKIMW(SEQIDNo:10)、
HKSRALAIFQKIMALRRQ(SEQIDNo:11)、
AKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:12)、
HKSRAALIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:13)、
HKSRALLIFQKIMWARRQ(SEQIDNo:14)、
HKSRALLIFQKIMWLRAQ(SEQIDNo:15)、
HKSRALLIFQKIMWLRRA(SEQIDNo:16)和
SRALLIFQKI(SEQIDNo:17)。
本发明化合物的氨基酸序列是肽，该术语包括具有氨基酸残基(H-Cα-[侧链])但可由如下所讨论的肽键(-CO-NH-)或非肽键连接的化合物。
通过以引用的方式并入本文并在此引用的Luetal(1981)J.Org.Chem.46,3433公开的固相多肽合成(solid-phasepeptidesynthesis)的Fmoc-聚酰胺模式(modeFmoc-polyamidemode)可合成肽。用于肽合成的试剂容易商购获得。
本发明化合物的纯化可通过技术例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和(主要地)反相高效液相色谱法中的任何一种或组合实现。肽的分析可使用薄层色谱法、反相高效液相色谱法、酸解后的氨基酸分析，以及通过快速原子轰击(FAB)质谱分析来实施。
本发明优选的化合物由氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)或所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分组成，或包括1-5个氨基酸改变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。进一步的优选与上面一样。如下所讨论，优选地本发明的化合物是N-乙酰化的，特别优选地，由氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)组成的化合物是N-乙酰化的。当所有氨基酸是L-氨基酸且所有氨基酸残基之间有肽键时，由氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)组成并且是N-乙酰化的化合物的编号是BB2702。
本发明的化合物可包括至少一个D-氨基酸残基，例如1个或2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个D-氨基酸。通常，本发明的化合物包含0个、1个、2个或3个D-氨基酸。本发明的化合物中D-氨基酸的存在可用于防止蛋白酶引起的化合物的降解。使肽对蛋白质降解有抵抗力的其他方法包括封闭N-和/或C-端氨基酸残基。因此，在一些实施方案中，使N-和/或C-端氨基酸残基封闭。合适的封闭方法包括N-端乙酰化或在N-端合并焦谷氨酸残基(pyroglutamateresidue)。
有许多不同的方法来设计和合成不含有酰胺键的肽化合物。在例如以引用的方式并入本文的Sherman&Spatola(1990)J.Am.Chem.Soc.112,433所公开的一种方法中，一个或多个酰胺键由各种化学官能团以基本上同配的方式(isotericmanner)替换。
Retro-inverso模拟肽，其中肽键是反向的，可通过本领域已知的方法合成，例如Mézièreetal(1997)J.Immunol.1593230-3237中描述的方法，其以引用的方式并入本文。该方法涉及使伪肽(pseudopeptides)包括涉及骨架而不是侧链方向的改变。Retro-inverso肽包括NH-CO键而不是CO-NH肽键，其更能抗蛋白水解。
将环部分(cyclicmoiety)引入到肽基框架(peptide-basedframework)中可能是有利的。该环部分限制了肽结构的构象空间，这可导致肽对MAP激酶p38α的亲和力增强。该策略的附加优势是，将环部分引入肽中可能还导致肽对细胞肽酶(cellularpeptidases)的选择性降低。
虽然优选本发明的化合物是所定义的肽，但在本发明的一些实施方案中，该化合物由连接另一部分的肽组成。可连接肽的方便部分包括聚乙二醇(PEG)和肽序列，例如增强向细胞递送的TAT和触角足(antennapedia)。
聚乙二醇化是本领域技术人员熟知的方法，其中修饰(肽或其他化合物)以使一个或多个聚乙二醇(PEG)分子与一个或多个氨基酸的侧链共价连接。其是最重要的分子变构化学技术(MASC)之一。可使用其他MASC技术，这样的技术可提高化合物的药效性质，例如延长其在体内的血清半衰期。通过首先激活PEG部分以使其与本发明的化合物反应并结合来形成PEG-肽缀合物。PEG部分在分子量和构象上变化很大，其中早期(early)部分(单官能PEG，mPEG)是分子量为12kDa或更小的直线型，后期(later)部分的分子量增加。PEG2，最近创新的PEG技术涉及30kDa(或更小)的mPEG结合至赖氨酸氨基酸(尽管聚乙二醇化可扩展为将PEG添加至其他氨基酸)，经过进一步反应形成表现得像更大分子量的直线型mPEG的支链结构(Kozlowskietal.,(2001),Biodrugs15,419–429)。Robertsetal(2002)AdvDrugDelivRev54,459–476,Bhadraetal.,(2002)Pharmazie57,5–29,Kozlowskietal.,(2001)JControlRelease72,217–224和Veronese(2001)Biomaterials22,405–417进一步描述了可用于使PEG分子共价连接至本发明的化合物的方法，其以引用的方式并入本文。
本发明化合物的聚乙二醇化的潜在优势包括降低肾清除率，对一些产品来说，这导致了皮下施用后更持续的吸收以及限制性分布，可能导致更恒定和持续的血浆浓度，并因此增加临床疗效。其他潜在优势包括降低治疗化合物的免疫原性，以及较低的毒性。
本发明的化合物是一种能够结合MAP激酶p38α的化合物。MAP激酶p38α是氨基酸序列(SEQIDNo:18)如图1所示的人体酶。方便地，该酶可与多肽序列例如GST融合，这可使其固定在固体底物上。
当本发明的化合物是肽时，测定与MAP激酶p38α结合的适宜方式是使用噬菌体展示技术。编码先导肽(peptideleads)的DNA可以克隆至M13gpIII噬菌粒载体，转化至E.coliTG1细胞，并置于2％葡萄糖、2xTY、100μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的板上。生长出菌落用于生产所述的噬菌体颗粒(Scott&Smith(1990)Science249,386-390)。对于试验，在室温下将1μg的MAP激酶p38α涂覆于在100μlPBS中的MaxiSorpTM聚苯乙烯板(NuncTMbrand,FisherScientific,Loughborough,U.K.)上1小时，然后用PBS清洗一次，随后在室温下用含2％BSA的PBS封闭1小时。每个孔中加入100μl的噬菌体上清液，并在室温下培养1小时。将板用PBS/Tween20清洗四次，用PBS清洗两次。辣根过氧化物酶缀合的(horseradishperoxidase-conjugated)(HRP)抗-M13第二抗体(GEHealthcareU.K.Ltd.,ChalfontSt.Giles,U.K.)以1:5000在含2％BSA的PBS中稀释，并在室温下培养一小时，然后进行上述的清洗。进行McGregor&Robins(2001)Anal.Biochem.294,108-117所述的ELISA试验。用SureBlueTMB过氧化物酶底物(InsightBiotechnology(洞察生物技术),Middlesex,U.K.)进行试验，并在450nm下读取。用与如上所述相同的ELISA条件，检测结合MAP激酶p38α的肽对生物素化MAP激酶p38α和链霉亲合素(streptavidin)的特异性，然后检测对链霉亲合素涂覆板(StreptaWell；RocheDiagnosticsLtd.,BurgessHill,U.K.)中所有以0.5μg涂覆的β-半乳糖苷酶、BclX、抗-FLAGM2抗体、卵清蛋白和溶解酵素的特异性。该方法可用于建立结合MAP激酶p38α的直接特异性肽，通过对照背景上增加的色度信号(colorimericsignal)来表示结合。
特别优选的是，本发明的化合物是一种竞争性结合MAP激酶p38α的具有SEQIDNo:1的肽(都是L-氨基酸，且氨基酸残基之间包括肽键，所述肽是N-乙酰化的，即BB2702)的化合物。如下可测定化合物是否是一种竞争结合MAP激酶p38α的具有SEQIDNo:1的肽的化合物。
荧光标记(即用荧光团)N-乙酰化的肽HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)(即BB2702)，并使其结合MAP激酶p38α。该肽被化合物替换(replacement)指示为该化合物结合MAP激酶p38α，并可通过荧光偏振(fluorescencepolarization)测量。荧光偏振是实证的荧光检测技术，使用平面偏振激发(planepolarizedexcitation)测量产生的荧光发射的垂直和水平分量。任何荧光标记复合体的偏振值(以mP单位测量)与所述复合体的分子转动速度负相关。由于分子转动进而与其分子体积负相关，因此当荧光标记肽与任何足够大以减缓其分子转动速率的分子(该情况中是MAP激酶p38α)相互作用时，荧光标记肽会具有较高的偏振值。因此，偏振信号的振幅用于定量测定荧光标记肽结合的范围，而不需要任何过滤或清洗分离步骤。使用荧光偏振检测方法的替换结合试验(displacementbindingassay)的原理是荧光标记肽和未标记化合物之间对结合MAP激酶p38α对接位点的竞争。与未标记化合物的结合引起荧光标记肽替换和mP信号损失。任何信号损失均指示替换。与少量的信号损失指示较少的替换相比，大量的信号损失指示更多的替换。任何数量的荧光偏振读写器均可用于测量替换。
更进一步优选的是，本发明的化合物是一种抑制MAP激酶p38α的化合物。如下可测定MAP激酶p38α的抑制。髓鞘碱性蛋白(MBP)是MAP激酶p38α的底物，并在该酶和ATP的存在下磷酸化。磷酸化事件可使用能识别磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基的抗体监控，或通过测量放射性标记的磷酸盐合并到蛋白质中来监控。通过MBP磷酸化的降低来测量抑制。BB2702直接抑制MAP激酶p38α，并抑制MAP激酶p38α的激活。这可以通过考虑到BB2702对磷酸化和未磷酸化的MAP激酶p38α的活性看出(参见下面实施例9中的表3)。本发明的化合物可通过MKK6抑制MAP激酶p38α的激活。
特别优选的是，本发明的化合物是一种结合并抑制MAP激酶p38α、但基本上不结合和抑制Jnnk、PKCd、p38b、AMPK、AurA、GK3b、RAF1、JNK3、VEGF、p38g、PKCb、PKCa、PDHK2、PDK1、MKK6、p27KIP、Cdk2KIP、PrakKIP、Chk1KIP、EgfrKIP、KdrKIP、EGFKIP、Zap70KIP、IGFRKIP、SrcKIP、FakKIP、Jak3KIP、AktCIRA和MekCCEK中任何一个的化合物。使用标准方法并利用商业服务来测定化合物是否抑制这些和其它蛋白激酶。例如，可使用MerckMillipore’sKinaseProfilerTM及其第54版的服务试验协议(ServiceAssayprotocol)。
优选地，对于所列出的、本发明的化合物基本上不结合的如果不是所有酶但至少是一种酶，本发明的化合物的IC50值>1μM，更优选>5μM或>10μM。
优选的是，本发明的化合物对人类MAP激酶p38α的IC50<1μM。如使用下面的方法所测量的，更优选的是，本发明的化合物的IC50<0.1μM，优选<0.05μM，更优选<0.01μM，进一步优选<0.001μM。通过使用增加浓度的化合物测试固定浓度的MAP激酶p38α的抑制程度来计算IC50。当以y轴为抑制程度、x轴为肽浓度在对数量表(logscale)上绘制时，通常会提供从0或最低浓度处的0％抑制直至最高剂量处的100％抑制的S形曲线。达到50％抑制的点被称为抑制浓度50或IC50，用于在酶的固定浓度处建立化合物的效力。
如实施例8中更详细的讨论，化合物HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)(BB2702)的IC50为0.007μM，并显示对MAP激酶p38α有非常高的选择性。不受任何理论束缚，本发明人认为该高选择性部分是由于化合物与不存在于其他蛋白激酶中的MAP激酶p38α上的位点结合，而不与ATP结合口袋(bindingpocket)结合。认为该位点在人类MAP激酶p38α和犬MAP激酶p38α之间是保守的。ATP结合口袋是在所有蛋白激酶和其他许多ATP结合蛋白中发现的保守的ATP结合口袋，所以可存在于人类(或犬类)蛋白质组的数以百计的蛋白质中。由于在许多不同的蛋白质中发现了口袋，并由于其负责ATP的结合，因此，产生阻断ATP结合蛋白质从而防止酶活性的选择性抑制化合物是非常具有挑战性的。另一方面，活性位点之外的位点的多样性更大，且经常只与单一靶蛋白相关。因此，MAP激酶p38α上活性位点之外的位点可能是人类(或犬类)蛋白质组中这种性质的唯一位点，与其他这样的位点没有明显的同源性，因此提供了化合物与其结合的非常高的选择性的机会。因此，通过在不寻常的、可能是唯一的结合口袋处结合化合物来抑制MAP激酶p38α，提供了选择性抑制MAP激酶p38α的更大可能性，并因此避免了偏离目标的副作用和毒性。
本发明的第三个方面提供抑制MAP激酶p38α的方法，该方法包括将所述激酶与本发明的化合物接触。通常，该方法在体外实施。因此，发现本发明的化合物用作分析MAP激酶p38α的试剂。本发明还包括用于分析MAP激酶p38α的部分的试剂盒，该试剂盒包括本发明的化合物和MAP激酶p38α的底物。MAP激酶p38α的合适底物包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、MK2/MAPKAPK2、MNK-1、PRAK和MSK1。MBP是优选的底物。因此，本发明还包括本发明的化合物用于抑制MAP激酶p38α的用途。
已知MAP激酶p38α的抑制是治疗上有用的，特别是用于治疗炎性病症。因此，本发明的第四个方面提供本发明的化合物在治疗个体的医学中的用途。所述个体可以是人类或非人类动物，例如非人类哺乳动物。由于氨基酸序列与人类MAP激酶p38α(MK14_HUMANSEQIDNo:18)和犬类MAP激酶p38α(MK14_CANFASEQIDNo:19)相似性的程度(99.4％同一性)(参见图1)，因此该化合物特别适用于人和犬的治疗。本发明的化合物还可以用于治疗MAP激酶p38α与人类酶序列具有实质上序列相似性(例如，>90％同一性)的其他动物。
该化合物可以单独使用或者与其他治疗化合物联合使用。因此，本发明的第五个方面提供包括本发明的化合物和一种或多种其他治疗化合物的组合物，例如抗炎化合物或抗感染(例如抗菌或抗病毒)化合物或抗增殖化合物。
本发明的第六个方面提供包括本发明化合物，或本发明第五个方面的组合物，以及药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。所述赋形剂和载体必须是与本发明化合物相容并且对其接受者无害意义上的“可接受的”。根据化合物或组合物的施用途径和化合物或组合物是否可用于人类或兽类使用，可以选择本领域已知的合适的药物赋形剂和载体。
本发明的化合物或其制剂可以以如下更详细讨论的任何方便的方法施用。治疗可由一定时间内的单次给药或施用或者多次给药或施用组成。
该制剂可以是活性成分的单位剂量，包括每日剂量或单位、每日分次剂量或其适当部分。
本发明的化合物通常以药物制剂的形式，可选地以无毒的有机酸或无机酸或碱加成盐的形式，以药学上可接受的形式，局部或口服或通过任何非肠道途径施用。依据疾病或待治疗的个体，以及给药途径，该组合可以以各种剂量施用。
例如，本发明的化合物可以以片剂、胶囊剂、卵形剂型(ovule)、酏剂(elixir)、溶液剂或混悬剂的形式经口服、口腔(buccally)、鼻内、眼内、局部、直肠或舌下施用，其可以含有用于立即、延迟或控制释放应用的调味剂或着色剂。本发明的化合物还可通过海绵体内注射施用。
这样的片剂可含有赋形剂例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，分散剂例如淀粉(优选玉米、土豆或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和一些复杂的硅酸盐，以及造粒粘结剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶(acacia)。此外，可包括润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。
相似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充剂。就这一点而言，优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、奶糖(milksugar)或高分子量的聚乙二醇。对于水性悬浮剂和/或酏剂，本发明的化合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，与乳化剂和/或悬浮剂以及与稀释剂例如水、乙醇、丙二醇和甘油，以及它们的组合联合。
本发明的化合物也可以非肠道施用，例如静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、心室内、胸骨内(intrasternally)、胸内(intrathoracically)、颅内(intracranially)、肌内(intra-muscularly)、皮下或皮内施用，或者它们可以通过输注技术施用。它们可以以可含有其它物质的无菌水溶液的形式使用，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果必要的话，水溶液应当是适当缓冲的(优选pH为3-9)。在无菌条件下制备合适的非肠道制剂很容易通过本领域技术人员公知的标准制药技术来完成。
适于非肠道施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有使制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿(ampoule)和小瓶，并且在使用前可以存储在仅需要加入无菌液体载体例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
本发明的化合物也可经鼻内或通过吸入施用，以干粉吸入器或使用合适的推进剂从加压容器、泵、喷雾器或雾化器(nebuliser)呈现的气雾喷雾器的形式方便地递送，所述合适的推进剂例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，一氢氟烷例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA)，二氧化碳或其它合适的气体。在加压喷雾器的情况下，可以通过提供递送定量(meteredamount)的阀门来确定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂例如脱水山梨醇三油酸酯。吸入器或吹入器中使用的胶囊和套筒(cartridge)(例如，由明胶制成)可配制成含有本发明化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选配置气雾剂或干粉制剂以使每个定量剂量或“每一喷(puff)”含有至少1μg的本发明的化合物用于递送给患者。应理解的是，气雾剂的总日剂量因患者而异，并且可以全天以单剂量或更通常地以分剂量施用。
或者，本发明的化合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以以洗液、溶液、乳膏、软膏或扑粉(dustingpowder)的形式局部应用。本发明的化合物也可经皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂。它们也可以通过眼睛途径施用，特别是用于治疗眼睛的疾病。
对于眼科应用，本发明的化合物可使用纳米颗粒系统配制或在等渗的、pH调节的、无菌的生理盐水中配制成微粒化悬浮液，或优选地，在等渗的、pH调节的、无菌的生理盐水中配制成溶液，任选地与防腐剂例如苯扎氯铵(benzylalkoniumchloride)联合。或者，它们可以在软膏例如凡士林中配制。
对于局部应用于皮肤，本发明的化合物可以配制成含有悬浮于或溶解于例如一种或多种下列物质的混合物中的活性化合物的合适软膏：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，它们可以配制成悬浮于或溶解于例如一种或多种下列物质的混合物中的合适洗剂或乳膏：矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的化合物也可与已证明具有组织和细胞穿透性质的纳米颗粒一起配制。
此外，对于局部应用，本发明的化合物(单独或与其它活性成分或材料组合)可应用于或浸渍到伤口敷料(wounddressing)，以提供可用于治疗炎性病症或提高个体的伤口愈合的敷料。
适于在口中局部施用的制剂包括糖锭，包括调味基质中的活性成分，调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；锭剂，包括惰性基质例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；以及漱口水，包括合适的液体载体中的活性成分。
本发明的化合物可使用可注射的持续释放的药物递送系统递送。这些经过专门设计以减少注射频率。这样的系统的实例是在生物可降解微球中封装重组人类生长激素(rhGH)的NutropinDepot，一旦注入，其在持续期间内缓慢释放rhGH。
本发明的化合物可通过将药物直接释放到所需部位的手术植入装置施用。例如，Vitrasert将更昔洛韦直接释放到眼睛中以治疗CMV视网膜炎。该有毒剂直接应用于疾病的部位实现了有效治疗，而没有药物显著的系统性副作用。
电穿孔治疗(EPT)系统也可用于肽的施用。向细胞递送脉冲电场的装置增加了细胞膜对药物的渗透性，导致细胞内药物递送显著增强。
肽可以通过电掺入(electroincorporation)(EI)递送。当皮肤表面上直径达30微米的小颗粒经历与电穿孔所用的相同或相似的电脉冲时，发生EI。EI中，驱动这些颗粒穿过角质层并进入皮肤的更深层。颗粒可以装载或涂覆有药物或基因，或可以简单地充当在皮肤中产生孔的“子弹”，药物可通过孔进入。
肽递送的另一种方法是热敏感的ReGel注射系统。低于体温时，ReGel是注射液体，而在体温时其立即形成慢慢侵蚀和溶解成已知安全的可生物降解聚合物的凝胶储层(reservoir)。由于生物聚合物溶解，活性药物随时间递送。
本发明的化合物可以通过“特洛伊肽(Trojanpeptides)”引入到细胞中。这些是一类被称为贯穿性的多肽，其具有转运性质并能运载亲水性化合物跨越质膜。该系统能使寡肽直接定位到细胞质和细胞核，并且可以是非细胞型特异性的和高效的。参见Derossietal(1998),TrendsCellBiol8,84-87，其以引用的方式并入本文。
施用于个体的本发明化合物的量可由执业医师(医生或兽医)而定，并取决于所述个体是人或动物(和动物的类型)，待治疗的条件以及施用途径和频率。方便地，本发明的化合物可以以载体制剂(carrierformulation)施用到皮肤上，以使每2cm2的炎症面积递送10μg-100mg的载体制剂，例如100μg、1mg、5mg、10mg或50mg。
本发明的第七个方面提供了治疗个体炎性病症的方法，该方法包括向个体施用本发明的化合物或本发明第五个方面的组合物。可以以任何顺序或同时向个体施用本发明的化合物和其他治疗化合物。
本发明的第八个方面提供了本发明的化合物或本发明第五个方面的组合物用于治疗个体炎性病症。在一个实施方案中，如上所讨论，个体可能已经或正在或将施用另一种治疗剂。
本发明的第九个方面提供了本发明的化合物或本发明第五个方面的组合物在制备用于治疗个体炎性病症的药物中的用途。在一个实施方案中，如上所讨论，个体可能已经或正在或将施用另一种治疗剂。
待治疗的炎性病症包括其中含有MAP激酶p38α的炎性通路在其病理中起作用的那些。通过本发明的化合物治疗的炎性病症包括，但不限于，皮肤炎性疾病例如特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、皮肤疤痕。MAP激酶p38α的激活也可在涉及炎症的其他疾病中发挥基础作用，包括紧缩性阻塞性肺疾病、哮喘、炎性肠病、动脉粥样硬化、癌症和类风湿性关节炎，这些病症也可以使用本发明的化合物进行治疗。治疗的炎性病症可以是个体经历的暂时的、规则的或长久的病症。
本发明的第十个方面提供了用于鉴定结合MAP激酶p38α的分子的方法，该方法包括确定所述分子是否在本发明的化合物结合MAP激酶p38α的位置结合MAP激酶p38α。
对本发明第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个和第十个方面的任一个中使用的化合物的偏好，与对本发明的第一个和第二个方面中的化合物是相同的。
尽管可使用其他化合物，但优选的是，本发明第十个方面的方法中施用的化合物是具有氨基酸序列SEQIDNo:1的肽。
本发明第十个方面的方法可用于鉴定用于选择性抑制MAP激酶p38α及用于抗炎疗法的分子。有多种方式鉴定测试分子是否在与具有氨基酸序列SEQIDNo:1的肽相同的位置结合MAP激酶p38α。一种方法是在测试分子和本发明的化合物例如具有氨基酸序列SEQIDNo:1的肽或本发明的另一种化合物之间进行生化竞争试验，根据其结合MAP激酶p38α的结合位点，例如通过使用上述讨论的荧光偏振法，以确定测试分子是否能替换具有氨基酸序列SEQIDNo:1的肽或本发明的另一种化合物。通常，具有氨基酸序列SEQIDNo:1的肽或本发明的另一种化合物用可检测的例如荧光的标签来标记。在另一个实施方案中，使用基于亲和力的试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)。另一种方法是使用计算化学。通过X-射线结晶或2维核磁共振产生的高分辨率结构信息可用于建立精确的计算模型MAP激酶p38α以及肽例如BB2702的精确对接。肽的接口揭示了然后可用于计算上对接小分子和其他肽的关键的相互作用点。这将允许选择包括可能利用相同的口袋和关键相互作用表面的肽的化合物，而不需要筛选几百万的化合物。然后，被认为具有高可能性抑制MAP激酶p38α的候选分子可以例如使用经典的生物化学磷酸化试验进行进一步筛选。
一旦鉴定分子，通常实施进一步的分析。例如，可实施以下步骤：(a)测定结合MAP激酶p38α的分子的IC50值，(b)测定其在希拉细胞(Helacell)中对TNF刺激的作用，(c)对与MAP激酶p38α的结合进行NMR研究，(d)分析对MAP激酶p38α的选择性，(e)X-射线分析分子，以及(f)分子和MAP激酶p38α的共结晶研究，包括X-射线衍射研究。
可合成和进一步研究鉴定的分子。优选的分子是选择性结合MAP激酶p38α的那些分子，其IC50<1μM、优选<0.1μM、更优选<0.05μM、进一步更优选<0.01μM、还更优选<0.001μM，且基本上不抑制Jnnk、PKCd、p38b、AMPK、AurA、GK3b、RAF1、JNK3、VEGF、p38g、PKCb、PKCa、PDHK2、PDK1、MKK6、p27KIP、Cdk2、Prak、Chk1、Egfr、Kdr、EGF、Zap70、IGFR、Src、Fak、Jak3、AktCIRA和Mek中的任一个。例如，对于所列出的、所述分子基本上不结合的如果不是所有酶但至少是一种酶，优选的分子是IC50值>1μM，更优选>5μM或>10μM的分子。
该方法可进一步包括将鉴定的化合物配制成药学上可接受的组合物的步骤。本发明还包括制备含有使用本发明第十个方面的方法鉴定的分子的药物组合物的方法，该方法包括将所鉴定的分子与药学上可接受的载体混合的步骤。
现在参考以下附图和实施例以非限制性方式描述本发明。
图1：人类和犬类MAP激酶p38α的氨基酸序列比对。人类和犬序列之间有358个相同的位置(99.44％同一性)；
图2：丙氨酸扫描数据；
图3：BB2702对基础磷酸化的(basalphosphorylated)MAP激酶p38α的作用；
图4：使用BIAcore分析测量结合亲和力。OH-p38α与BB2702结合；
图5：WO01/04102中脲基喹唑啉的结构；以及
图6：LPS刺激的THP-1细胞中BB2702对TNFα产量的抑制。X轴是nMBB2702：1＝1000nM，2＝100nM，3＝10nM，4＝1nM，5＝没有LPS刺激。Y轴是TNFα产量，单位pg/ml。
实施例1：肽
使用标准的合成化学制备以下肽。
1.BB2700SRALLIFQKI(SEQIDNo:17)(N-乙酰化的)
2.BB2702HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)(N-乙酰化的)
实施例2：丙氨酸扫描实验
BB2702氨基酸序列为：HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)，它是N-乙酰化的。氨基酸扫描使得能够建立肽的构效关系。通过依顺序用具有侧链的最小氨基酸丙氨酸替换活性肽的每个氨基酸并检测新的肽的活性，可以了解哪个氨基酸残基位点对于活性而言是重要的，哪个位点是不可建立的。因此举例来说，如果用丙氨酸替换位点4的精氨酸，会看到对新肽抑制MAP激酶p38α的能力的大的负面影响。因此，我们可推断在对MAP激酶p38α的结合和抑制中位点4的精氨酸是所述肽的重要相互作用点。因为对肽BB2702的18个位点中的每一个都实施了上述操作，所以我们建立了在肽上对于抑制p38αMAP激酶必要的关键残基位点的认知。使用该方法示出了序列中对于结合而言关键的残基。下文中黑体加下划线标出的位点上的残基对于以高亲和力结合MAP激酶p38α是非常重要的，并且其通过丙氨酸扫描实验和生化测定中用于评价抑制MAP激酶p38α能力的评估来确定。斜体加下划线标出的位点上的这些残基是重要的，但是对结合的影响较小。
HSALLKIWLRQ
实施例3：MAP激酶P38α测定
材料
MKK6
GST-融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)中表达。原液12mg/ml。-80℃下保存。(MKK6基础活性足以激活蛋白P38α)。
MAP激酶P38α
6-hisC-myc标记的蛋白在大肠杆菌中表达。原液10mg/ml。-80℃下保存。
髓鞘碱性蛋白(MBP)(GibcoBRL13228-010)
将25mg溶于3.75ml激酶缓冲液(含有β-ME)
γ33P-ATP(AmershamAH9968250uCi)
ATP(SigmaA-7699)
在蒸馏水中的1mM原液(stock)。-80℃下保存。
MagnesiumAcetate(SigmaM-0631)
在水中的1M原液。4℃下保存。
三氯乙酸(TCA)(Sigma490-10)
在水中制备20％溶液和2％溶液。室温下保存。
激酶缓冲液
0.1mMEGTA(SigmaE-4378)。50mMTris/HClpH7.4(SigmaT-4003)。0.1mM原钒酸钠(SigmaS-6508)。4℃下保存。每毫升缓冲液加入1μlβ-巯基-乙醇(SigmaM-7522)配制后立即使用。[0.038g(38mg)EGTA(SIGMAE-4378)。7.58gmTRIS/HCL预制(pre-set)PH7.4(SIGMAT-4003)。0.018g(18mg)原钒酸钠(SIGMAS-6508)。用蒸馏水补足至1升。每毫升缓冲液加入1μlβ-巯基-乙醇(SigmaM-7522)配制后立即使用。在4℃下保存。]
96孔板
与DMSO一起使用(Corningincorporated(Costar)3365(聚丙烯)。
测定板(Corningincorporated(Costar)3596(聚苯乙烯-平底有盖)。
滤板(CambarraPackard6005174(装有GF/C过滤器))。
实施例4：MAP激酶p38α方案(版本1)(酶浓度6.5μg/ml)
酶激活
使用前将人MAP激酶p38α通过与MKK6在30℃下一起孵育3小时来激活。激活的孵育物(incubate)含有550μl激酶缓冲液、75μl(1mM)ATP、75μl(100mM)MgAc、50μl(10mg/ml)P38α和5μl(12mg/ml)MKK6。可将该激活的孵育物分成等份并在-20℃下保存。
方法
参照化合物是SB203580(IC50＝0.025μM)
在DMSO中将化合物配置成10mM：Wt(mg)/MWt×100＝要加入的DMSO的量(ml)。
在DMSO中制备连续稀释液(第一稀释板)
*在96孔板(聚丙烯)中。
*除了第一排以外，所有排中有100μlDMSO。
*第一孔中有50μl化合物和DMSO。
*全板50μl并混合。
然后将这些连续稀释液在激酶缓冲液中以1:10稀释(第二稀释板)。
*在96孔板(聚苯乙烯)中。
*所有的排中必须有90μl激酶缓冲液。
*10μl化合物稀释液(3–1排)(20μM–0.006μM(终浓度))。
将10μl在激酶缓冲液中的10％DMSO加至“最大”和“最小”对照孔。
制备工作酶溶液：对于每个96孔板，混合2.50ml激酶缓冲液、500μl髓鞘碱性蛋白(在激酶缓冲液中6.66mg/ml)和50μl激活的P38α(在“最小”对照孔中激活的酶被激酶缓冲液替代)。加30μl至所有检测孔中。
制备标记的ATP溶液:对于每个96孔板，加入50μlMgAc(1M)、900μl蒸馏水、50μlATP(1mM)和5μCi(0.5–1μl)γ33P-ATP。
加10μl至所有孔。
将板密封并在室温下温柔搅动(板振荡器(plateshaker))孵育板60分钟。
通过加入50μl/孔的20％TCA溶液终止反应。*100mlTCA+400mlmilliQ水。
使用微细胞收集器(microcellharvester)捕获在滤板上沉淀的MBP。使用2％TCA(约100ml)洗涤整个板并使用0.75％磷酸(约100ml)以终止冲洗所述收集器。将板过夜晾干。
加入25μlMicro-scintillant至每个检测孔，在topcount闪烁计数器上进行读取(每分钟计数)。
实施例5：MAP激酶p38α方案(版本2)(酶浓度0.5μg/ml)
酶激活
使用前将人MAP激酶p38α通过与MKK6在30℃下一起孵育3小时来激活。激活的孵育物含有550μl激酶缓冲液、75μl(1mM)ATP、75μl(100mM)MgAc、50μl(10mg/ml)P38α和5μl(12mg/ml)MKK6。可将该激活的孵育物分成等份并在-20℃下保存。
方法
参照化合物是SB203580(IC50＝0.025μM)
在DMSO中将化合物配置成10mM。
Wt(mg)/MWt×100＝要加入的DMSO的量(ml)。
在DMSO中制备连续稀释液(第一稀释板)
.*在96孔板(聚丙烯)中。
*除了第一排以外，所有排中有100μlDMSO。
*第一孔中50μl化合物和DMSO。
*全板50μl并混合。
然后将这些连续稀释液在激酶缓冲液中以1:10稀释(第二稀释板)。
*在96孔板(聚苯乙烯)中。
*所有的排中必须有90μl激酶缓冲液。
*转移并混合10μl化合物稀释液(5–12排)(2.22μM–0.001μM(终浓度))。
从稀释板2转移10μl至测定板(一式两份)(2％DMSO终浓度)。
将10μl在激酶缓冲液中的10％DMSO加至“最大”和“最小”对照孔。
制备工作酶溶液：对于每个96孔板，混合2.55ml激酶缓冲液、500μl髓鞘碱性蛋白(在激酶缓冲液中6.66mg/ml)和3.8μl激活的P38α(在“最小”对照孔中激活的酶被激酶缓冲液替代)。加30μl至所有检测孔中。
制备标记的ATP溶液:对于每个96孔板，加入50μlMgAc(1M)、900μl蒸馏水、50μlATP(1mM)和5μCi(0.5–1μl)γ33P-ATP。
加10μl至所有孔。
将板密封并在室温下温柔搅动(板振荡器)孵育板60分钟。
通过加入50μl/孔的20％TCA溶液终止反应。*100mlTCA+400mlmilliQ水。
使用微细胞收集器捕获在滤板上沉淀的MBP。使用2％TCA(约100ml)洗涤整个板并使用0.75％磷酸(约100ml)以终止冲洗所述收集器。将板干燥过夜。
加入25μlMicro-scintillant至每个检测孔，在topcount闪烁计数器上进行读取(每分钟计数)。
实施例6：BB2702对Hela细胞中基础p38α活性的影响
使用Hela细胞模拟炎症反应的某些方面，例如细胞因子产生。尤其是响应脂多糖(LPS)或其它促炎刺激物(proinflammatorystimuli)的TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8炎性细胞因子的产生。这可以借助于依赖或不依赖MAP激酶p38α的方法。MAP激酶p38α的小分子抑制剂SB203580常常用于研究MAP激酶p38α在该炎性信号级联反应中的作用。图3示出了BB2702对Hela细胞中p38α基础磷酸化状态的影响。Phosphop38α是激活形式的p38α，能够进行下游信号传送并导致产生炎性细胞因子。在表2(下文实施例8中)中已经证明了在生化测定中BB2702抑制p38α激活。在此证明了在没有任何刺激物的情况下，BB2702抑制细胞模型中的p38α磷酸化，因此证明了在BB2702的存在下p38α活性降低。从该数据可推断BB2702引起了对基础p38α活性的抑制。
如图3中所示，BB2702减少基础激活的p38α。BB2702通过其上游激活激酶例如MKK6或MKK3，或通过自体磷酸化(autophosphorylation)阻止MAP激酶p38α的磷酸化。
实施例7：BB2702与MAP激酶p38α相互作用的BIA核心分析 (BIAcoreanalysis)
使用溶液中抑制测定(inhibitioninsolutionassays)(ISA；Karlsson,R.(1994)Real-timecompetitiveanalysisofinteractionsbetweenlow-molecular-weightligandsinsolutionandsurfaceimmobilizedreceptors(溶液中的低分子量配体和表面固定的受体之间的相互作用的实时竞争分析).Anal.Biochem.221,142-151)，用Biacore3000检测结合相互作用。将已知结合激酶嘌呤位点的靶定义化合物(脲基喹唑啉(ureidoquinazoline)化合物，图5)固定在传感器芯片上。将MAP激酶p38α与各种浓度的检测化合物孵育30分钟，然后使其流过传感器。未结合的p38α与给出信号的靶定义化合物相关，这可能与游离浓度相关。分析剂量-响应数据以估算Kd值(例如1或3，其中Ki′＝Kd)，因为由靶定义化合物引起的竞争没有引起中点的明显移动。在pH8.5下以5μL/min的速率进行7分钟注射(注射11.5mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺与75mg/mL1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的混合物，然后是在10mMHEPES(pH7.4)、0.15MNaCl、3.4mMEDTA、0.005％(v/v)表面活性剂P20、4％(v/v)二甲基亚砜中的400μM化合物，最后是1mM乙醇胺)，将靶定义化合物通过氨基偶联固定到研究级CM-5芯片上。固定水平通常为约3000个共振单元(resonanceunits)。在没有靶定义化合物的情况下制备参照流通池。所有测量使用的流速为20μL/min并且做减法以消除折光率变化和注射噪音(injectionnoise)。通过注射5μL100mMNaOH实现表面再生。当响应随着时间线性增加时，使用60秒的报告点(reportpoint)用非磷酸化或磷酸化的p38α校准芯片。响应是线性的，直到至少400nM蛋白。Kd测量在10-50nMp38α下进行，并且被确认为是25nM。该结合亲和力与生物化学上推导的为7nM的Ki是不相违的。
图4示出了BIA核心分析的结果。
实施例8：BB2702对MAP激酶p38α结合的NMR研究
用于抑制由MKK6引起的MAP激酶p38α激活的BB2702(IC50＝1nM)与由PDK1引起的底物激酶激活(substratekinaseactivation)涉及的PRK2衍生的疏水PDK1-相互作用片段或‘PIF’-口袋结合基序共享序列基序(LIFQKI)(Balendranetal(1999)Curr.Biol.9,393-402)。在PDK1的晶体结构中(Biondietal(2002)EMBOJ.21(16),4219-28)，对称相关的PDK1分子的αG螺旋占据了催化结构域N-端叶片(lobe)“后”侧上的疏水基序结合口袋，模仿与底物激酶的分子间相互作用。然而，MAP激酶p38α缺乏等同的疏水基序结合口袋：MAP激酶p38αN-端叶片的该区域被其本身的C-端螺旋代替占据，因此通过等效相互作用介导该BB2702肽有效结合MAP激酶p38α似乎是不可能的。
另一方面，来自MEF2A转录因子和MAP激酶p38α的其他底物的肽的晶体结构，以及最近的MAP激酶p38α和MK2之间的复合体的晶体结构显示，MAP激酶p38α具有形成于C-端叶片上的底物对接槽，邻近ATP结合位点(Changetal(2002)Mol.Cell.9(6),1241-9；terHaaretal(2007)J.Biol.Chem.282(13),9733-9)。发明人推断，尽管与已知的MAP激酶p38α底物激酶对接基序缺少明显的序列相似性，但该对接槽可能是BB2702和MAP激酶p38α之间相互作用的一个可能位点。为了研究该位点，发明人使用NMP来监控由结合BB2702和MEF2A肽诱导的MAP激酶p38α光谱的骨架酰胺化学位移扰动(CSP)。BB2702肽的亚化学剂量浓度诱导NMR时间量表的慢交换限制中的化学位移变化，与高亲和力(<1μM)结合一致，如预期的，在1:1化学计量下，所述位移基本上是饱和的(数据未显示)。MEF2A肽的结合显示了与由BB2702肽诱导的那些相似模式的CSP：许多相同共振态的激酶受到影响，表明两种肽可能共享相似的或重叠的结合位点。此外，与MEF2A肽结合激酶对接槽相似，CSP与小分子ATP竞争的p38抑制剂明显不同(Sullivanetal(2005)Biochemistry44(50),16475-90)。然而，与BB2702肽相反，MEF2A肽的结合弱得多，从NMR滴定数据的预计Kd是250μM。为了进一步探讨MEF2A肽和BB2702肽结合位点之间的关系，然后发明人将BB2702肽加入到具有MEF2A肽前结合(pre-bound)的MAP激酶p38α样品中。BB2702(240μM)完全能替换MEF2A肽(5mM)，总结为BB2702肽单独结合的CSP模式(图5B)。相反，与其较弱亲和力一致，当添加顺序相反时，根据未改变的CSP判断，MEF2A肽(1mM)不能替换BB2702肽(150μM)(数据未显示)。总之，NMR数据支持了假设，即BB2702肽可结合或接近于用于与上游激酶调节剂对接的p38α上的槽。
实验细节
将BB2702滴定至均匀的15N,2H-标记的6His-MAP激酶p38α的样品(120μM)中(Sullivanetal(2005)Biochemistry44(50),16475-90)，或者其自身，或者添加MEF2A转录因子衍射肽(Changetal(2002)Mol.Cell.9(6),1241-9)(RKPDLRVVIPPSS)。每次添加后获得1H-15NTROSY-HSQCNMR波谱。如Sullivanetal(2005)所述，298K下，在配置有HCN三重共振冷冻探针的600MHzVarianInova光谱仪上记录NMR实验。
实施例9：BB2702的选择性
下表1比较了2种选择的肽的活性和其抑制磷酸化并因此抑制MKK6或MKK3下激活p38α的能力。其也显示了抑制激活的p38α能力的编码肽磷酸化许多底物的能力。表中的数据显示，BB2702抑制由MKK6而不是MKK3引起的磷酸化，此外，直接抑制任何有活性的p38α以防止MBP或MK2的磷酸化。因此，BB2702通过抑制p38α的激活和通过钝化有活性的p38α起作用。
表2和表3(下面)：BB2702抑制其他蛋白激酶的能力通过在10μM的肽下对超过30种蛋白激酶测试来评价。这是选择性板。在抑制剂结合ATP结合口袋的地方，可以预期超过这个数目的激酶缺少选择性。然而，BB2702对高达10μM的大多数激酶靶是不活跃的，实际上仅在6种激酶中看到了轻微活性，但当与p38α相比时，该6种激酶具有总共500-1000倍选择性。最活跃的脱靶效应是针对MAPK激酶家族的高度同源的家族成员p38β。然而，即使在这里，选择性超过100倍。总之，我们可以得出结论，即BB2702对p38α抑制是非常有选择性的。
实施例10：LPS刺激的THP-1细胞中由BB2702引起的TNFα 产量的抑制
图6表明，当THP-1细胞以剂量依赖的方式用BB2702处理、然后用LPS(脂多糖)刺激时，已知为p38α下游的炎性细胞因子TNFα的产量明显下降。这表明，在公认的THP-1细胞炎症模型中，BB2702可抑制由p38α介导的炎性信号。
在用LPS(10μg/mL)刺激之前，用不同剂量的BB2702(1nM、10nM、100nM、1000nM)预培养THP-1细胞5小时。用ELISA测定细胞上清液中的TNF-α，一式两份。呈现的数据为5个实验的平均值，每个实验重复操作两次。每个的标准偏差落入平均值的15％内。

Claims (27)

1.一种化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)或包括所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分，或包括1-5个氨基酸改变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，与SEQIDNo:1的位置相比，位置4是R，位置9是F，位置10是Q。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，与SEQIDNo:1的位置相比，位置2是K、R或H，位置8是I、L或M，位置13是M、I或L，和/或位置16是R、H或K。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，与SEQIDNo:1的位置相比，是K，位置8是I，位置13是M或位置16是R。
5.根据权利要求3所述的化合物，其中，与SEQIDNo:1的位置相比，位置2是K，位置8是I，位置13是M和位置16是R。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其分子量小于25000道尔顿。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其由所述氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)或者所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分组成，或包括1-5个氨基酸改变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MAP激酶p38α。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其由所述氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:1)组成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其选自以下氨基酸序列：
HKSRALLIFQKIMWLRR(SEQIDNo:2)，
HKSRALLIFQKIMWLR(SEQIDNo:3)，
HKSRALLIFQKIMWL(SEQIDNo:4)，
HKSRALLIFQKIMW(SEQIDNo:5)，
KSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:6)，
SRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:7)，
SRALLIFQKIM(SEQIDNo:8)，
SRALLIFQ(SEQIDNo:9)，
HALAIFQKIMW(SEQIDNo:10)，
HKSRALAIFQKIMALRRQ(SEQIDNo:11)，
AKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:12)，
HKSRAALIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:13)，
HKSRALLIFQKIMWARRQ(SEQIDNo:14)，
HKSRALLIFQKIMWLRAQ(SEQIDNo:15)，
HKSRALLIFQKIMWLRRA(SEQIDNo:16)或
SRALLIFQKI(SEQIDNo:17)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其在氨基酸之间包含至少一个非肽键。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其包含至少一个D-氨基酸残基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述N-和/或C-端残基是封闭的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是结合至另一部分的肽。
14.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其基本上抗蛋白酶消化。
15.一种组合物，其包括权利要求1-14中任一项所述的化合物和一种或多种其他治疗化合物，例如抗炎化合物，抗感染化合物例如抗真菌化合物或抗增殖化合物。
16.权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物，用于医学。
17.一种药物组合物，其包括权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
18.一种抑制MAP激酶p38α的方法，所述方法包括使所述激酶与权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物接触。
19.权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物在抑制MAP激酶p38α中的用途。
20.一种治疗个体炎性病症的方法，所述方法包括向个体施用权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物。
21.权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物，用于治疗个体炎性病症。
22.权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15所述的组合物在制备用于治疗个体炎性病症的药物中的用途。
23.一种鉴定结合MAP激酶p38α的分子的方法，所述方法包括确定所述分子是否在权利要求1-14中任一项所述的化合物结合MAP激酶p38α的位置处结合MAP激酶p38α。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括将鉴定的分子配制为药学上可接受的组合物的步骤。
25.一种制备药物组合物的方法，其包括执行权利要求23所述的方法，以及将鉴定的分子与药学上可接受的载体混合的步骤。
26.如本文所公开的结合MAP激酶p38α的任何新肽。
27.如本文所公开的结合MAP激酶p38α的任何新肽，用于治疗个体炎性病症。
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