JP2016534104A - Ｍａｐキナーゼｐ３８結合化合物 - Google Patents

Abstract

アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）を含むか、または前記アミノ酸配列の７もしくはそれ以上のアミノ酸の部分を含むか、または前記アミノ酸配列もしくはその前記部分の１から５のアミノ酸が変更された変異体を含む化合物であって、この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する。この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合してそれを阻害するために有用であり、かつ特に炎症状態を処置するための創薬および医学における研究ツールとして有用である。【選択図】図３

Description

本発明は、化合物およびその使用に関する。特に、本発明はペプチドと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼｐ３８アルファ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐ３８ ａｌｐｈａ）（略称ＭＡＰキナーゼｐ３８α）の阻害および炎症状態の処置におけるそのペプチドの使用とに関する。

疑問を回避するために、この明細書全体のほとんどの部分ではＭＡＰキナーゼｐ３８αという用語が用いられる。しかし、この酵素は以下の推奨名および用語によっても公知である。すなわち、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４（略称ＭＡＰキナーゼ１４およびＭＡＰＫ１４）、およびＩＵＢ分類ＥＣ２．２．１１．２４である。この酵素はさらに以下の代替名称を有する。すなわち、サイトカイン抑制性抗炎症薬結合タンパク質（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（略称ＣＳＡＩＤ結合タンパク質およびＣＳＢＰ）、ＭＡＰキナーゼＭＸＩ２、ＭＡＸ相互作用タンパク質２、およびストレス活性化プロテインキナーゼ２ａ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２ａ）（略称ＳＡＰＫ２ａ）である。加えて、この酵素はユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）識別子Ｑ１６５３９を有する。本明細書において、この酵素はｐ３８αと呼ばれることもある。

本明細書における、明らかに先行的に公表された文献のリストまたは考察は、必ずしもその文献が当該技術水準の一部であるか、または一般常識であるという認識として受取られるべきではない。

ＭＡＰキナーゼｐ３８αは炎症の中心的役割を果たしており、基礎研究および創薬のどちらにおいても広範囲の努力の対象となっている。非特許文献１は、ｐ３８キナーゼの生物学をその炎症における役割に焦点を当てて概説している。ｐ３８キナーゼは、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、およびＣＯＸ−２を含む、自然免疫系の細胞による主要な炎症メディエータの生成を調節する。加えてｐ３８は、たとえばＴＮＦアルファなどのサイトカインの下流で作用し、そのサイトカインの効果の一部に介在する。近年、ｐ３８はＴｈ１７および調節性Ｔ細胞を含むＴ細胞の応答にも役割を有することが見出されている。炎症におけるｐ３８の重要な役割と一致して、細胞はｐ３８のシグナル伝達を調節および維持するためにさまざまなフィードバック機構を用いている可能性があることが、近年の証拠から示唆されている。ｐ３８キナーゼによって調節される生物プロセスから、阻害剤に対する多様な効能の可能性と、この標的に関する創薬の努力が困難であることが立証されるほどのレベルの複雑性との両方が示唆される。

非特許文献２には、１９９３年以来、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの膨大な数の阻害剤が特徴付けられてきたことが示されている。周知のピリジニルイミダゾールに加え、複数の新規のスカフォールドが同定されているが、おそらくは毒性が高いことおよび選択性が低いことから、第ＩＩ相臨床試験に進んだものはごく少数である。非特許文献２によると、安全な薬物プロファイルを得るためには、効力が高いこと、ＣＹＰ４５０（チトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０）相互作用および毒性が下限に近いこと、ならびに高レベルの選択性があることが望ましい。

ＭＡＰキナーゼｐ３８αの核基質ＭＥＦ２Ａおよび活性化因子ＭＫＫ３ｂのドッキング部位に対して複合体を形成したＭＡＰキナーゼｐ３８αの結晶構造が公知である（非特許文献３）。

過去の小分子阻害剤は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する選択性の欠如、およびヒト臨床試験における顕著な肝毒性を含むある範囲の毒性という問題を有した。発明者の知る限り、市販に達することに成功したＭＡＰキナーゼｐ３８α化合物は存在せず、そのほとんどは第ＩＩｂ相のヒト臨床試験において失敗している。

ＭＡＰキナーゼｐ３８αは、炎症シグナル伝達カスケードにおける中心的役割を果たしており、したがってＭＡＰキナーゼｐ３８αの阻害は、ある範囲のヒト疾患徴候、特に炎症状態において有益な役割を有すると考えられる。これらの炎症状態は、たとえばアトピー性皮膚炎、乾癬、尋常性ざ瘡、皮膚瘢痕などの皮膚の炎症性疾患を含むが、それに限定されない。加えて、ＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性化は、収縮性閉塞性肺疾患、喘息、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化、癌、および関節リウマチを含む、炎症を伴うその他の疾患において基本的役割を果たし得る。

本明細書に記載される発明は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合してそれを阻害するために有用であり、かつ特に炎症状態を処置するための創薬ならびにヒト医学および獣医学における研究ツールとして有用な化合物を提供する。こうした炎症状態は、ヒトおよびイヌを含むある範囲の哺乳動物に存在し得る。有利には、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対して選択的であって、他のプロテインキナーゼに対しては実質的に結合も阻害もしない化合物が提供される。

特許文献１は、さまざまなキナーゼ阻害ペプチドに関する。特許文献２は、抗炎症性Ｄ３ペプチドに関する。

国際公開第２００９／０２１１３７号 国際公開第２０１１／１２６８８２号

シーベン（Ｓｃｈｉｅｖｅｎ）著、（２００９）、「カレント・トピックス・イン・メディカル・ケミストリー（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」９、１０３８−１０４８ カーチャー（Ｋａｒｃｈｅｒ）およびラウファー（Ｌａｕｆｅｒ）著、（２００９）、「カレント・トピックス・イン・メディカル・ケミストリー（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」９、６５５−６７６ チャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、（２００２）、「セル（Ｃｅｌｌ）」９、１２４１−１２４９

本発明の第１の局面は、アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）を含むか、または前記アミノ酸配列の７もしくはそれ以上のアミノ酸の部分を含むか、または前記アミノ酸配列もしくはその前記部分の１から５のアミノ酸が変更された変異体を含む化合物を提供し、この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する。

別様に注記されない限り、本明細書全体にわたってアミノ酸に対するＩＵＢ／ＩＵＰＡＣ１文字コードが使用されており、アミノ酸配列は従来のＮ末端からＣ末端の方向に与えられる。典型的にアミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、下に注記されるとおり、本発明のいくつかの実施形態においては、アミノ酸のいくつかがＤ−アミノ酸であり得る。変異体において変更されたアミノ酸は、典型的には天然に存在するアミノ酸であり、それらのアミノ酸は遺伝子コードによってコードされる２０アミノ酸を含み、さらにたとえばヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、およびカルニチンなどのその他の天然アミノ酸を含む。しかし、いくつかの実施形態においては、変更されたアミノ酸の１つまたはそれ以上が、たとえばアリルアラニンおよびジフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸であってもよい。

典型的に、配列番号１またはその一部分のうちのアミノ酸が変更されるとき、そのアミノ酸は保存的アミノ酸に変更される。たとえば、以下のアミノ酸グループ内のアミノ酸は保存的変更であると考えられる。（Ｎ，Ｑ）、（Ｋ，Ｒ）、（Ｓ，Ｔ）、（Ｉ，Ｌ，Ｍ）、（Ｆ，Ｙ）。すなわち、好都合にはＩアミノ酸残基はＬアミノ酸残基に変更されてもよく、化合物においてＮアミノ酸残基はＱアミノ酸残基に変更されてもよく、および／または化合物においてＫアミノ酸残基はＲアミノ酸残基に変更されてもよく、他も同様である。

好都合には、本発明の第１の局面の化合物は、配列番号１からの７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の連続するアミノ酸を含んでもよいし、または１から５のアミノ酸が変更された、配列番号１からの前記７から１７もしくは１８すべての連続するアミノ酸の変異体を含んでもよい。典型的には、化合物中に存在するアミノ酸配列の配列番号１、またはその７から１７アミノ酸の部分における１、２、３、４または５アミノ酸が変更されてもよい。そのアミノ酸配列の部分が１５以下の連続するアミノ酸（たとえば１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸など）を含むとき、４以下のアミノ酸が変更されることが好ましい（たとえば３、２、１または０など）。加えて、そのアミノ酸配列の部分が１０以下の連続するアミノ酸（たとえば９または１０など）を含むとき、３以下のアミノ酸が変更されることが好ましい（たとえば２、１または０など）。加えて、そのアミノ酸配列の部分が７または８の連続するアミノ酸を含むとき、２以下のアミノ酸が変更されることが好ましい（たとえば１または０など）。配列番号１またはその一部分のアミノ酸残基数の約２５％以下が変更されることが好ましい。さらに、配列番号１またはその一部分のアミノ酸残基数の約２０％または１５％以下が変更されることが好ましい。この％は、配列番号１またはその適切な部分と比較したときに変更されているアミノ酸残基の数を定めて、配列番号１に対応する部分のアミノ酸残基数で割り、１００を掛けることによって算出できる。たとえば、ペプチドＨＡＬＡＩＦＱＫＩＭＷは、それを調製し得る配列番号１の部分、すなわちＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷと異なる２アミノ残基（下線、太字）を有する。よって変更された残基の％は、２／１１×１００％＝１８．２％と算出される。

好ましくは、本発明の第１の局面の化合物はアミノ酸配列ＲＸＸＸＸＦＱを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。より好ましくは、本発明の第１の局面の化合物はアミノ酸配列ＲＡＬＬＩＦＱを含む。さらにより好ましくは、本発明の第１の局面の化合物はアミノ酸配列ＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭを含む。

一実施形態において、本発明の第１の局面に従う化合物は、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８と表され得る。好ましくは、Ｘ_４はＲ、Ｋ、ＱまたはＨであってもよく、Ｘ_９はＦ、ＹまたはＨであってもよく、Ｘ_１０はＱ、Ｎ、ＫまたはＲであってもよい。好ましくは、化合物においてＸ_４はＲであるか、Ｘ_９はＦであるか、またはＸ_１０はＱである。より好ましくは、化合物においてＸ_４はＲであり、Ｘ_９はＦであり、かつＸ_１０はＱである。

化合物において、次のうちの少なくとも３つが起こることが好ましい。すなわち、Ｘ_１がＨであり、Ｘ_２がＫであり、Ｘ_３がＳであり、Ｘ_５がＡであり、Ｘ_６がＬであり、Ｘ_７がＬであり、Ｘ_８がＩであり、Ｘ_１１がＫであり、Ｘ_１２がＩであり、Ｘ_１３がＭであり、Ｘ_１４がＷであり、Ｘ_１５がＬであり、Ｘ_１６がＲであり、Ｘ_１７がＲであり、Ｘ_１８がＱである。化合物において、この直前のアミノ酸位置のうちの少なくとも４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４が起こることが好ましい。

化合物においてＸ_２がＫであるか、Ｘ_８がＩであるか、Ｘ_１３がＭであるか、またはＸ_１６がＲであることが特に好ましい。化合物においてＸ_２がＫであり、Ｘ_８がＩであり、Ｘ_１３がＭであり、かつＸ_１６がＲであることが特に好ましい。

本発明の化合物はさらに、Ｘ_１がＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであり、Ｘ_２がＡ、Ｒ、ＩもしくはＬであり、Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱであり、Ｘ_４がＲ、Ｋ、ＱもしくはＨであり、Ｘ_５がＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであり、Ｘ_６がＬ、Ｉ、ＡもしくはＶであり、Ｘ_７がＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであり、Ｘ_８がＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであり、Ｘ_９がＦ、ＹもしくはＨであり、Ｘ_１０がＱ、Ｎ、ＫもしくはＲであり、Ｘ_１１がＫ、ＱもしくはＲであり、Ｘ_１２がＩ、Ｌ、ＶもしくはＡであり、Ｘ_１３がＭ、Ｌ、Ｉ、Ｃであり、Ｘ_１４がＷ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭもしくはＦであり、Ｘ_１５がＬ、Ｉ、ＡもしくはＶであり、Ｘ_１６がＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｋ、ＱもしくはＨであり、Ｘ_１７がＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであり、および／またはＸ_１８がＱ、Ａ、Ｖ、ＩもしくはＬである化合物を含む。

加えて、化合物が配列番号１の１８アミノ酸残基よりも少数を含んでいる実施形態においては、特定の位置Ｘが「ヌル」（すなわちアミノ酸残基を含まない）であり得ることが認識されるだろう。よってたとえば、化合物が配列番号１の１７の連続するアミノ酸残基の部分を含むときは、Ｘ_１がヌルであるか、またはＸ_１８がヌルであるかのいずれかである。同様に、化合物が配列番号１の１６の連続するアミノ酸残基の部分を含むときは、Ｘ_１およびＸ_２、またはＸ_１およびＸ_１８、またはＸ_１７およびＸ_１８がヌルであり、配列番号１の連続するアミノ酸残基の部分に対して他も同様である。

本発明の第１または第２の局面の化合物のアミノ酸配列は、７から１８アミノ酸を有することが好ましい。たとえば、アミノ酸配列は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸を有してもよい。化合物は８から１８アミノ酸を有することが好ましい。加えて、化合物は１１から１８アミノ酸を有することが好ましい。典型的に、本発明の第１または第２の局面の化合物がペプチドからなるとき、そのペプチドは３００００ダルトン未満、好ましくは２５０００ダルトン未満、より好ましくは２００００ダルトン未満の分子量を有する。典型的に、以下に考察されるとおり、本発明の第１または第２の局面の化合物が別の部分に結合されたペプチド部分を含むとき、本発明の化合物は典型的に１００００ダルトンから１０００００ダルトン、たとえば２００００ダルトンから８００００ダルトン、たとえば２００００ダルトンから５００００ダルトンなどの分子量を有してもよい。

本発明の化合物は、アミノ酸配列（Ｒ，Ｋ，Ｑ，Ｈ）ＡＬ（Ｌ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ）Ｉ（Ｆ，Ｙ，Ｈ）（Ｑ，Ｎ，Ｋ，Ｒ）ＫＩＭ（Ｗ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ）を含むか、またはこのアミノ酸配列からなる化合物を含み、ここでは括弧内の各組から１つのアミノ酸がその位置に用いられ、この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する。よって、本発明はアミノ酸配列Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４を含む化合物を含み、ここでＸ_４はＲ、Ｋ、ＱまたはＨであり、Ｘ_５はＡであり、Ｘ_６はＬであり、Ｘ_７はＬ、Ａ、Ｖ、ＩまたはＬであり、Ｘ_８はＩであり、Ｘ_９はＦ、ＹまたはＨであり、Ｘ_１０はＱ、Ｎ、ＫまたはＲであり、Ｘ_１１はＫであり、Ｘ_１２はＩであり、Ｘ_１３はＭであり、Ｘ_１４はＷ、Ａ、Ｖ、ＩまたはＬであり、この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する。この実施形態において、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７およびＸ_１８の各々は「ヌル」である（すなわち、その位置にはアミノ酸残基が存在しない）。

本発明の化合物は、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲ（配列番号２）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲ（配列番号３）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬ（配列番号４）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷ（配列番号５）、ＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号６）、ＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号７）、ＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭ（配列番号８）、ＳＲＡＬＬＩＦＱ（配列番号９）、ＨＡＬＡＩＦＱＫＩＭＷ（配列番号１０）、ＨＫＳＲＡＬＡＩＦＱＫＩＭＡＬＲＲＱ（配列番号１１）、ＡＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１２）、ＨＫＳＲＡＡＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１３）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＡＲＲＱ（配列番号１４）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＡＱ（配列番号１５）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＡ（配列番号１６）、およびＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩ（配列番号１７）を含む。

本発明の化合物のアミノ酸配列はペプチドであり、以下に考察されるとおり、我々はこの用語に、アミノ酸残基（Ｈ−Ｃα−［側鎖］）を有するがペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）または非ペプチド結合によって連結され得る化合物を含ませている。

ペプチドは、本明細書において引用により援用されるルー（Ｌｕ）ら（１９８１）ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４６、３４３３およびその参考文献によって開示される固相ペプチド合成のＦｍｏｃ−ポリアミドモードによって合成されてもよい。ペプチド合成のための試薬は、容易に商業的に入手可能である。

本発明の化合物の精製は、たとえば分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、および（主に）逆相高速液体クロマトグラフィなどの技術の、任意の１つまたは組み合わせによってもたらされてもよい。薄層クロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ、酸加水分解後のアミノ酸分析、および高速原子衝撃（ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：ＦＡＢ）質量分析を用いることによって、ペプチドの分析が行われてもよい。

本発明の好ましい化合物は、アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）、もしくは前記アミノ酸配列の７もしくはそれ以上のアミノ酸の部分からなるか、または前記アミノ酸配列もしくはその前記部分の１から５のアミノ酸が変更された変異体を含み、この化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する。さらなる選択は上記と同じである。以下に考察されるとおり、本発明の化合物はＮ−アセチル化されることが好ましい。特に、アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）からなる化合物がＮ−アセチル化されることが好ましい。アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）からなり、かつＮ−アセチル化された化合物に対して、すべてのアミノ酸がＬ−アミノ酸であり、かつすべてのアミノ酸残基の間にペプチド結合が存在するときには、コード名ＢＢ２７０２が与えられる。

本発明の化合物は、たとえば１、２または３または４または５または６または７または８のＤ−アミノ酸など、少なくとも１つのＤ−アミノ酸残基を含んでもよい。典型的に、本発明の化合物は０、１、２または３のＤ−アミノ酸を含む。本発明の化合物中にＤ−アミノ酸が存在することは、プロテアーゼによる化合物の分解を防ぐために有用であり得る。ペプチドをタンパク質分解耐性にするためのその他の方法は、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基をブロックすることを含む。よっていくつかの実施形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基はブロックされる。好適なブロック法は、Ｎ末端のアセチル化、またはＮ末端にピログルタミン酸残基を取込むことを含む。

アミド結合を含有しないペプチド化合物の設計および合成に対して、いくつかの異なるアプローチが存在する。たとえば、本明細書において引用により援用されるシャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）およびスパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ）（１９９０）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１１２、４３３によって開示されるものなどの１つのアプローチにおいては、１つまたはそれ以上のアミド結合が本質的に等配電子の（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）態様で、さまざまな化学官能基によって置換されている。

ペプチド結合が逆転されているレトロインベルソペプチド模倣薬は、たとえば本明細書において引用により援用されるメジエール（Ｍｅｚｉｅｒｅ）ら（１９９７）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５９、３２３０−３２３７に記載されるものなどの、当該技術分野において公知の方法によって合成され得る。このアプローチは、側鎖の配向ではなく主鎖を伴う変更を含有する擬ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロインベルソ（Ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）ペプチドは、タンパク質分解に対する耐性がより高い。

ペプチドに基づくフレームワークに環状部分を導入することが有利であり得る。環状部分はペプチド構造の配座空間を制限するため、それによってＭＡＰキナーゼｐ３８αに対するペプチドの親和性が増加され得る。この戦略の付加的な利点は、ペプチドに環状部分を導入することによって、細胞ペプチダーゼに対する感受性が減少したペプチドがもたらされ得ることである。

本発明の化合物は定義されるとおりのペプチドであることが好ましいが、本発明のいくつかの実施形態において、化合物は別の部分に連結されたペプチドからなる。ペプチドが連結され得る好都合な部分は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）ならびに、たとえば細胞への送達を増強するＴＡＴおよびアンテナペディアなどのペプチド配列を含む。

ＰＥＧ化は当業者に周知の方法であり、この方法では、１つまたはそれ以上のアミノ酸の側鎖に１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が共有結合的に付着されるように、（ペプチドまたはその他の化合物）が修飾される。ＰＥＧ化は、最も重要な分子改変構造化学技術（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＭＡＳＣ）の１つである。他のＭＡＳＣ技術が用いられてもよい。こうした技術は、たとえばインビボにおける化合物の血清半減期を延長するなど、化合物の薬力学的特性を改善し得る。ＰＥＧ−ペプチド複合体は、最初にＰＥＧ部分が本発明の化合物と反応して結合するようにＰＥＧ部分を活性化することによって形成される。ＰＥＧ部分の分子量および配座にはかなりの変動があり、１２ｋＤａ以下の分子量を有する直鎖である初期部分（単官能ＰＥＧ（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＰＥＧ）；ｍＰＥＧ）と、増加した分子量の後期部分とを有する。ＰＥＧ技術における最近の革新であるＰＥＧ２は、３０ｋＤａ（またはそれ以下）のｍＰＥＧをリジンアミノ酸にカップリングすることを伴い（ＰＥＧを他のアミノ酸に付加するようにＰＥＧ化を拡張できるが）、リジンアミノ酸をさらに反応させて、もっと大きい分子量の直鎖ｍＰＥＧと同様に振る舞う分岐鎖構造を形成する（コズロウスキー（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ）ら、（２００１）、バイオドラッグス（Ｂｉｏｄｒｕｇｓ）１５、４１９−４２９）。本発明の化合物にＰＥＧ分子を共有結合的に付着させるために使用され得る方法は、すべて本明細書において引用により援用される、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら（２００２）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ）５４、４５９−４７６、バードラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、（２００２）ファルマジー（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ）５７、５−２９、コズロウスキーら、（２００１）ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）７２、２１７−２２４、およびベロネース（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）（２００１）バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）２２、４０５−４１７にさらに記載されている。

本発明の化合物のＰＥＧ化による利点となり得るものには、腎クリアランスの低減が含まれ、これはいくつかの生成物に対して皮下投与後のより持続した吸着をもたらすものであり、さらに分布の制限が含まれ、これによっておそらくはより一定かつ持続した血漿濃度がもたらされるために、臨床的有効性が増加する。さらなる利点となり得るものには、治療化合物の免疫原性の低下、および毒性の低下が含まれる。

本発明の化合物は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合し得る化合物である。ＭＡＰキナーゼｐ３８αはヒトの酵素であり、そのアミノ酸配列（配列番号１８）が図１に与えられている。好都合には、この酵素を固体基体上に固定化することを可能にする、たとえばＧＳＴなどのポリペプチド配列とこの酵素とを融合してもよい。

本発明の化合物がペプチドであるとき、ＭＡＰキナーゼｐ３８αへの結合を判定する好適なやり方は、ファージディスプレイ技術を使用することである。ペプチドリードをコードするＤＮＡをＭ１３ ｇｐＩＩＩファージミドベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に形質転換し、２％グルコース、２ｘＴＹ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレートに蒔いてもよい。記載されるとおりのファージ粒子の生成のために、コロニーを成長させる（スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（１９９０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９、３８６−３９０）。アッセイのために、１００μｌのＰＢＳ中で１μｇのＭＡＰキナーゼｐ３８αをＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ（商標）ブランド、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ラフバラ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ）、英国）の上に、室温にて１時間コートし、次いでＰＢＳで１回洗浄し、その後２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液によって室温にて１時間ブロッキングする。ウェル当り１００μｌのファージ上清を加え、室温にて１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で４回、ＰＢＳで２回洗浄する。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＨＲＰ）抗Ｍ１３二次抗体（ＧＥヘルスケアＵ．Ｋ．社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕ．Ｋ．Ｌｔｄ．）、チャルフォント・セント・ジャイルス（Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ）、英国）を、２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１：５０００に希釈し、室温にて１時間インキュベートした後に上記と同様に洗浄する。記載されるとおりにＥＬＩＳＡアッセイを行う（マグレガー（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）およびロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ）（２００１）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２９４、１０８−１１７。ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（インサイト・バイオテクノロジー（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ミドルセックス（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ）、英国）によってアッセイを現像し、４５０ｎｍにて読取った。ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合したペプチドについて、ビオチン化ＭＡＰキナーゼｐ３８αおよびストレプトアビジンに対する特異性をテストし、次いでβ−ガラクトシダーゼ、ＢｃｌＸ、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体、オボアルブミンおよびリゾチームに対する特異性をテストし、これらはすべて０．５μｇにて、上述と同じＥＬＩＳＡ条件を用いて、ストレプトアビジンコートプレート（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ；ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、バージェスヒル（Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｈｉｌｌ）、英国）内にコートされる。この方法は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する直接的特異的ペプチド結合を確立するために用いることができ、結合は対照バックグラウンドよりも増加した比色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｒｉｃ）シグナルによって示される。

本発明の化合物は、配列番号１を有するペプチド（すべてＬ−アミノ酸であり、かつアミノ酸残基間にペプチド結合を含有し、そのペプチドはＮ−アセチル化されており、すなわちＢＢ２７０２である）のＭＡＰキナーゼｐ３８αへの結合に競合する化合物であることが特に好ましい。ある化合物が配列番号１を有するペプチドのＭＡＰキナーゼｐ３８αへの結合に競合し得るものであるか否かは、次のとおりに判定できる。

Ｎ−アセチル化ペプチドＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）（すなわちＢＢ２７０２）を蛍光的に（すなわちフルオロフォアによって）ラベルし、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合させる。化合物によるこのペプチドの置換は、その化合物がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合することを示すものであり、それを蛍光偏光によって測定できる。蛍光偏光は経験的な蛍光検出技術であり、平面偏光励起を用いて生成された蛍光発光の鉛直および水平成分を測定する。任意のフルオロフォアラベル複合体に対する偏光値（ｍＰ単位で測定される）は、その複合体の分子回転の速度と逆相関される。次いで分子回転はその分子容と逆相関されるため、蛍光ラベルペプチドが、自身の分子回転の速度を遅くするために十分に大きい任意の分子（この場合にはＭＡＰキナーゼｐ３８α）と相互作用するとき、蛍光ラベルペプチドはより高い偏光値を有することとなる。よって、フィルタ処理または洗浄分離ステップを何ら必要とすることなく、蛍光ラベルペプチドの結合の程度を定量的に定めるために、偏光シグナルの大きさが用いられる。この置換結合アッセイの原理は、蛍光偏光検出法を用いた、ＭＡＰキナーゼｐ３８αドッキング部位への結合に対する蛍光ラベルペプチドと非ラベル化合物との競合である。非ラベル化合物の結合によって、蛍光ラベルペプチドの置換およびｍＰシグナルの損失がもたらされる。任意のシグナル損失が置換を示す。より低い置換を示す小さいシグナル損失よりも、大きいシグナル損失の方が高い置換を示す。置換を測定するために、任意の数の蛍光偏光リーダが使用され得る。

本発明の化合物がＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害する化合物であることが、さらになお好ましい。ＭＡＰキナーゼｐ３８αの阻害は、次のとおりに判定され得る。ミエリン塩基性タンパク質（Ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＢＰ）はＭＡＰキナーゼｐ３８αの基質であり、この酵素およびＡＴＰの存在下でリン酸化される。リン酸化されたセリンまたはスレオニン残基を認識する抗体を用いるか、または放射ラベルされたリン酸のタンパク質への取込みを測定することによって、このリン酸化事象をモニタしてもよい。ＭＢＰのリン酸化の減少によって、阻害が測定される。ＢＢ２７０２はＭＡＰキナーゼｐ３８αを直接阻害し、かつＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性化を阻害する。このことは、リン酸化および非リン酸化ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対するＢＢ２７０２の活性を考慮することによって分かる（以下の実施例９の表３を参照）。本発明の化合物は、ＭＫＫ６によるＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性化を阻害してもよい。

本発明の化合物は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合してそれを阻害する化合物であるが、Ｊｎｎｋ、ＰＫＣｄ、ｐ３８ｂ、ＡＭＰＫ、ＡｕｒＡ、ＧＫ３ｂ、ＲＡＦ１、ＪＮＫ３、ＶＥＧＦ、ｐ３８ｇ、ＰＫＣｂ、ＰＫＣａ、ＰＤＨＫ２、ＰＤＫ１、ＭＫＫ６、ｐ２７ ＫＩＰ、Ｃｄｋ２ ＫＩＰ、Ｐｒａｋ ＫＩＰ、Ｃｈｋ１ ＫＩＰ、Ｅｇｆｒ ＫＩＰ、Ｋｄｒ ＫＩＰ、ＥＧＦ ＫＩＰ、Ｚａｐ７０ ＫＩＰ、ＩＧＦＲ ＫＩＰ、Ｓｒｃ ＫＩＰ、Ｆａｋ ＫＩＰ、Ｊａｋ３ ＫＩＰ、Ａｋｔ ＣＩＲＡ、およびＭｅｋ ＣＣＥＫのいずれかに実質的に結合してそれを阻害することはないことが特に好ましい。標準的な方法を用いて、ある化合物がこれらおよびその他のプロテインキナーゼを阻害するかどうかを判定するための商業的サービスが利用可能である。たとえば、メルク・ミリポア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＫｉｎａｓｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）およびそのサービス・アッセイ（Ｓｅｒｖｉｃｅ Ａｓｓａｙ）プロトコルのバージョン５４が使用されてもよい。

好ましくは、本発明の化合物は、その化合物が実質的に結合しない列挙された酵素のうち、すべてではなくても少なくとも１つに対して、ＩＣ_５０値＞１μΜ、より好ましくは＞５μΜまたは＞１０μΜを有する。

本発明の化合物は、ヒトＭＡＰキナーゼｐ３８αに対してＩＣ_５０＜１μΜを有することが好ましい。本発明の化合物は、次の方法を用いて測定されるときに、ＩＣ_５０＜０．１μΜ、好ましくは＜０．０５μΜ、より好ましくは＜０．０１μΜ、およびさらにより好ましくは＜０．００１μΜを有することがより好ましい。ＩＣ_５０は、増加する濃度の化合物を用いて、固定濃度のＭＡＰキナーゼｐ３８αの阻害の程度をテストすることによって算出される。対数目盛において、ｙ軸に阻害の程度を、ｘ軸にペプチド濃度をプロットするとき、通常は０または最低濃度における０％阻害から最高用量における１００％阻害までのＳ字曲線が得られる。５０％阻害が得られる点は阻害濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）５０またはＩＣ_５０と呼ばれ、固定濃度の酵素に対する化合物の効力を確立するために用いられる。

実施例８においてより詳細に考察されるとおり、化合物ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）（ＢＢ２７０２）はＩＣ_５０ ０．００７μΜを有し、かつＭＡＰキナーゼｐ３８αに対して非常に高い選択性を示す。いかなる理論に結び付けられることもなく、この高い選択性の理由の一部は、この化合物がＡＴＰ結合ポケットに結合するのではなく、他のプロテインキナーゼに存在しないＭＡＰキナーゼｐ３８α上の部位に結合することによるものであると発明者は考える。この部位はヒトＭＡＰキナーゼｐ３８αとイヌＭＡＰキナーゼｐ３８αとの間で保存されていると考えられる。ＡＴＰ結合ポケットは、すべてのプロテインキナーゼおよび多くのＡＴＰ結合タンパク質に見出される保存されたＡＴＰ結合ポケットであるため、ヒト（またはイヌ）のプロテオーム中の何百ものタンパク質に存在するであろう。このポケットは多くの異なるタンパク質に見出され、かつＡＴＰ結合の原因となるものであることから、タンパク質へのＡＴＰ結合を阻止して酵素活性を妨げるような選択的阻害化合物を生成することは非常に困難である。他方で、活性部位の外側の部位はそれよりもかなり多様であり、しばしば単一の標的タンパク質としか結合しない。したがって、ＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性部位の外側の部位は、ヒト（またはイヌ）のプロテオームにおいてこの性質を有する唯一の部位であるかもしれず、他のこうした部位とは顕著な相同性を有さないために、その部位に結合する化合物に非常に高い選択性の確率を提供し得る。よって、通常とは異なる、おそらくは一意の結合ポケットに化合物が結合することによるＭＡＰキナーゼｐ３８αの阻害は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αの選択的阻害の可能性を大幅に高めるものであり、したがってオフターゲットの副作用および毒性が回避される。

本発明の第３の局面は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害するための方法を提供し、この方法は、前記キナーゼと本発明の化合物とを接触させるステップを含む。典型的に、この方法はインビトロで行われる。よって本発明の化合物は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを分析するための試薬としての用途を見出す。本発明はさらに、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを分析するための部分のキットを含み、このキットは本発明の化合物と、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する基質とを含む。ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する好適な基質は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＫ２／ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＭＮＫ−１、ＰＲＡＫ、およびＭＳＫ１を含む。ＭＢＰは好ましい基質である。したがって本発明はさらに、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害するための本発明の化合物の使用を含む。

ＭＡＰキナーゼｐ３８αの阻害は治療上有用であり、特に炎症状態の処置において有用であることが公知である。よって本発明の第４の局面は、個体を処置するための医薬に使用するための、本発明の化合物を提供する。個体はヒトであってもよいし、たとえばヒト以外の哺乳動物など、ヒト以外の動物であってもよい。ヒトＭＡＰキナーゼｐ３８α（ＭＫ１４＿ＨＵＭＡＮ 配列番号１８）とイヌＭＡＰキナーゼｐ３８α（ＭＫ１４＿ＣＡＮＦＡ 配列番号１９）とのアミノ酸配列類似性の程度（９９．４％同一）（図１を参照）のために、この化合物はヒトおよびイヌの処置に特に好適である。加えて、本発明の化合物は、ヒトの酵素配列とかなりの配列類似性（例、＞９０％同一）を有するＭＡＰキナーゼｐ３８αを有する他の動物の処置にも有用であり得る。

この化合物は単独で使用されてもよいし、他の治療化合物と組み合わせて使用されてもよい。よって本発明の第５の局面は、本発明の化合物と、たとえば抗炎症または抗感染（例、抗細菌もしくは抗ウイルス）または抗増殖化合物などの、１つまたはそれ以上のその他の治療化合物とを含む組成物を提供する。

本発明の第６の局面は、本発明の化合物または本発明の第５の局面の組成物と、薬学的に許容できる賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。賦形剤および担体は、本発明の化合物に適合し、かつそのレシピエントに対して有害ではないという意味において「許容できる」必要がある。好適な医薬賦形剤および担体は、その化合物または組成物に対する投与経路、およびその化合物または組成物がヒトに対して使用されるか動物に使用されるかによって、当該技術分野において公知であるとおりに選択され得る。

本発明の化合物またはその調合物は、以下により詳細に考察される任意の従来の方法によって投与されてもよい。処置は、単一の用量または投与からなっていても、ある期間にわたる複数の用量または投与からなっていてもよい。

調合物は、活性成分の１日の用量または単位、１日のサブ用量またはその適切な一部分を含有する単位用量であってもよい。

本発明の化合物は通常、医薬調合物の形で、任意には薬学的に許容できる形の無毒の有機または無機の酸または塩基付加塩の形で、局所もしくは経口投与されるか、または任意の非経口経路によって投与される。処置される疾患および個体、ならびに投与経路に依存して、組成物は用量を変動させて投与されてもよい。

たとえば、本発明の化合物は、即時放出、遅延性放出、または徐放の適用のための、香味料または着色剤を含有し得る、錠剤、カプセル、膣坐剤、エリキシル剤、溶液または懸濁物の形で、経口、頬側、鼻腔内、眼内、局所、直腸または舌下に投与され得る。加えて、本発明の化合物は陰茎海綿体内注射を介して投与されてもよい。

こうした錠剤は、たとえば微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、たとえばデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびにたとえばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、およびアラビアゴムなどの顆粒結合剤を含有してもよい。加えて、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルクなどの潤滑剤が含まれてもよい。

ゼラチンカプセル内の賦形剤として、類似のタイプの固体組成物が用いられてもよい。これに関して好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁物および／またはエリキシル剤に対して、本発明の化合物は、さまざまな甘味料または香味料、着色物質または染料、乳化および／または懸濁剤、ならびにたとえば水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンなどの希釈剤、ならびにその組み合わせと組み合わされてもよい。

さらに、本発明の化合物は非経口的に投与されてもよく、たとえば静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、胸腔内、頭蓋内、筋肉内、皮下、または皮内などに投与されてもよいし、注入技術によって投与されてもよい。化合物は無菌水溶液の形で使用されてもよく、この無菌水溶液は、たとえば溶液を血液と等張性にするために十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含有してもよい。必要であれば、水溶液は好適に（好ましくはｐＨ３から９に）緩衝されるべきである。無菌条件下での好適な非経口調合物の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。

非経口投与のために好適な調合物は、抗酸化剤と、緩衝液と、静菌剤と、調合物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質とを含有し得る水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに、懸濁剤と濃化剤とを含み得る水性および非水性の無菌懸濁物を含む。調合物は、たとえば密閉されたアンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の容器に入れて提供されてもよく、使用直前に注射のためにたとえば水などの無菌液体担体を加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）の状態で保存されてもよい。前述した種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から、即時の注射溶液および懸濁物が調製され得る。

さらに、本発明の化合物は鼻腔内または吸入によって投与されてもよく、好都合には、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、たとえば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の好適な気体などの好適な噴霧剤の使用によって、乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレー提示の形で、加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器から送達される。加圧エアロゾルの場合、計測された量を送達するための弁を提供することによって、用量単位が定められ得る。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、たとえば溶媒としてエタノールおよび噴霧剤の混合物などを用い、付加的にたとえばソルビタントリオレアートなどの潤滑剤を含有し得る、活性化合物の溶液または懸濁物を含有してもよい。吸入器または吹き付け器において用いるための（たとえばゼラチンなどから作られた）カプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物と、たとえばラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤とを含有するように調合されてもよい。

各計量用量または「一吹き」が、患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１μｇ含有するように、エアロゾルまたは乾燥粉末調合物を調整することが好ましい。エアロゾルによる１日の全体用量は患者毎に異なり、単一用量で投与されてもよいし、より一般的には１日の間に分割された用量で投与されてもよいことが認識されるだろう。

代替的に、本発明の化合物を坐剤またはペッサリーの形で投与してもよいし、それらの化合物をローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所的に適用してもよい。さらに、本発明の化合物を、たとえば皮膚パッチの使用などによって経皮投与してもよい。さらに、特に眼の疾患を処置するために、それらの化合物を眼球経路によって投与してもよい。

眼への使用のために、本発明の化合物はナノ粒子系を用いて調合されてもよいし、等張性のｐＨ調整された無菌食塩水中の微粒子化懸濁物として調合されてもよいし、好ましくは等張性のｐＨ調整された無菌食塩水中の溶液として、任意にはたとえば塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて調合されてもよい。代替的に、それらの化合物は、たとえばペトロラタムなどの軟膏に調合されてもよい。

皮膚への局所的適用のために、本発明の化合物は、たとえば以下の１つまたはそれ以上との混合物などに懸濁または溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として調合されてもよい。すなわち、鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水である。代替的に、それらの化合物は、たとえば以下の１つまたはそれ以上の混合物などに懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして調合されてもよい。すなわち、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水である。さらに、本発明の化合物は、組織および細胞への浸透品質が証明されたナノ粒子とともに調合されてもよい。

さらに、局所的適用のために、本発明の化合物（単独または他の活性成分もしくは材料との組み合わせ）は、個体における炎症状態を処置するか、または創傷治癒を改善するために使用され得る包帯を提供するように、創傷被覆に適用または含浸されてもよい。

口内の局所的投与のために好適な調合物は、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムである香味付けされたベースに活性成分を含むトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）；たとえばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性ベースに活性成分を含むトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）；ならびに、好適な液体担体に活性成分を含む口腔洗浄剤を含む。

本発明の化合物は、注射可能な徐放薬物送達系を用いて送達されてもよい。これらの系は、注射の頻度を減らすように特定的に設計される。こうした系の一例はＮｕｔｒｏｐｉｎ（登録商標）デポであり、これは生分解性のミクロスフェア内に組み換えヒト成長ホルモン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ：ｒｈＧＨ）を封入したものであって、注射されたときに持続的な期間にわたってｒｈＧＨをゆっくりと放出する。

本発明の化合物は、必要な部位に薬物を直接放出する、外科的に移植されるデバイスによって投与されてもよい。たとえばビトラサート（Ｖｉｔｒａｓｅｒｔ）（登録商標）は、ＣＭＶ網膜炎を処置するために、眼の中にガンシクロビルを直接放出する。この有毒な薬剤を疾患部位に直接適用することによって、薬物の顕著な全身性副作用なしに有効な治療が達成される。

さらに、ペプチドの投与のためにエレクトロポレーション治療（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ：ＥＰＴ）システムが用いられてもよい。細胞にパルス電界を送達するデバイスは、薬物に対する細胞膜の透過性を高めることによって、細胞内薬物送達の顕著な増強をもたらす。

エレクトロインコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：ＥＩ）によってペプチドが送達されてもよい。皮膚の表面上の、直径最大３０ミクロンの小さい粒子が、エレクトロポレーションに用いられるのと同一または類似の電気パルスを受けるときにＥＩが起こる。ＥＩにおけるこれらの粒子は、角質層を通って皮膚のより深層まで駆動される。この粒子に薬物または遺伝子が添加またはコートされてもよいし、この粒子は単に皮膚に細孔を生成する「弾丸」として作用して、その細孔から薬物が入り得るようにしてもよい。

ペプチド送達の代替的方法は、熱感受性のＲｅＧｅｌ注射用システムである。ＲｅＧｅｌは体温より低い温度では注射可能な液体であるが、体温によって即座にゲルリザーバを形成し、これはゆっくりと侵食され溶解して、公知の安全な生分解性ポリマーとなる。このバイオポリマーの溶解の際に、時間とともに活性薬物が送達される。

本発明の化合物は、「トロイの（Ｔｒｏｊａｎ）ペプチド」によって細胞に導入されてもよい。これらのペプチドは、移動する特性を有し、細胞膜を横切って親水性の化合物を運ぶことのできるペネトラチンと呼ばれるクラスのポリペプチドである。この系は、細胞質および核へのオリゴペプチドの直接ターゲティングを可能にし、かつおそらく細胞型特異的ではなく、高効率である。本明細書において引用により援用されるデロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら（１９９８）、トレンド・イン・セル・バイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ）８、８４−８７を参照されたい。

個体に投与すべき本発明の化合物の量は、医療従事者（医師または獣医）によって決定されてもよく、その個体がヒトであるか動物であるか（および動物の種類）、処置される状態、ならびに投与の経路および頻度によって決まる。好都合には、本発明の化合物は、担体調合物において炎症面積２ｃｍ^２当り１０μｇから１００ｍｇ、たとえば１００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇまたは５０ｍｇなどが送達されるように、担体調合物に入れて皮膚に投与されてもよい。

本発明の第７の局面は、個体における炎症状態を処置するための方法を提供し、この方法は、本発明の化合物または本発明の第５の局面の組成物を個体に投与するステップを含む。個体には、本発明の化合物と、その他の治療化合物とが、任意の順序で連続的に投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。

本発明の第８の局面は、個体における炎症状態の処置に使用するための、本発明の化合物または本発明の第５の局面の組成物を提供する。一実施形態において、上に考察されるとおり、個体は別の治療薬剤をすでに投与されていてもよいし、投与中であってもよいし、将来投与されてもよい。

本発明の第９の局面は、個体における炎症状態を処置するための薬物の製造における、本発明の化合物または本発明の第５の局面に従う組成物の使用を提供する。一実施形態において、上に考察されるとおり、個体は別の治療薬剤をすでに投与されていてもよいし、投与中であってもよいし、将来投与されてもよい。

処置される炎症状態は、その病理にＭＡＰキナーゼｐ３８αを含む炎症経路が役割を果たしているような炎症状態を含む。本発明の化合物による処置に対する炎症状態は、たとえばアトピー性皮膚炎、乾癬、尋常性ざ瘡、皮膚瘢痕などの皮膚の炎症性疾患を含むが、それに限定されない。加えて、ＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性化は、収縮性閉塞性肺疾患、喘息、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化、癌、および関節リウマチを含む、炎症を伴うその他の疾患において基本的役割を果たす可能性があり、これらの状態も本発明の化合物を用いて処置され得る。処置される炎症状態は、個体が経験する一時的、定期的または持続的な状態であってもよい。

本発明の第１０の局面は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する分子を同定するための方法を提供し、この方法は、本発明の化合物がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する位置において、その分子がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合するかどうかを判定するステップを含む。

本発明の第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、および第１０の局面のいずれかにおいて使用するための化合物に対する選択は、第１および第２の局面における本発明の化合物に対する選択と同じである。

本発明の第１０の局面の方法において用いられる化合物は、アミノ酸配列の配列番号１を有するペプチドであることが好ましいが、本発明の他の化合物が使用されてもよい。

本発明の第１０の局面の方法は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを選択的に阻害するために有用であり、かつ抗炎症治療に有用である分子を同定するために使用され得る。アミノ酸配列の配列番号１を有するペプチドと同じ位置でテスト分子がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合するかどうかを識別するための、さまざまなやり方が存在する。１つのやり方は、たとえば上に考察した蛍光偏光法などを用いることによって、テスト分子がアミノ酸配列の配列番号１を有するペプチドまたは本発明の別の化合物をＭＡＰキナーゼｐ３８αにおけるその結合部位から置換できるかどうかを定めるために、テスト分子と、たとえばアミノ酸配列の配列番号１を有するペプチドなどの本発明の化合物または本発明の別の化合物との生化学的競合アッセイを行うというものである。典型的に、アミノ酸配列の配列番号１を有するペプチドまたは本発明の別の化合物は、たとえば蛍光などの検出可能なラベルによってラベルされる。別の実施形態においては、親和性に基づくアッセイ、または酵素結合イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）が使用される。別のやり方は、計算化学を用いるものである。Ｘ線結晶化または２次元核磁気共鳴を介して生成された高分解能構造情報を用いて、正確な計算モデルＭＡＰキナーゼｐ３８αと、たとえばＢＢ２７０２などのペプチドの正確なドッキングとを構築してもよい。次いで、そのペプチドのドッキングによって明らかになる主要な相互作用点を用いて、小さい分子およびその他のペプチドを計算的にドッキングさせ得る。これによって、何百万もの化合物をスクリーニングする必要なく、同じポケットおよび主要な相互作用表面を使用し得るペプチドを含む化合物の選択が可能になる。次いで、たとえば古典的な生化学的リン酸化アッセイなどを用いて、ＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害する確率が高いと考えられる候補分子をさらにスクリーニングしてもよい。

ある分子が同定されると、典型的にはさらなる分析が行われる。たとえば以下のステップが実行されてもよい。（ａ）ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する分子のＩＣ_５０値の決定、（ｂ）Ｈｅｌａ細胞におけるＴＮＦ刺激に対するその影響を定めること、（ｃ）ＭＡＰキナーゼｐ３８αへの結合のＮＭＲ研究、（ｄ）ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対する選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）の分析、（ｅ）分子のＸ線分析、および（ｆ）Ｘ線回折研究を含む、分子とＭＡＰキナーゼｐ３８αとの共結晶化研究。

同定された分子を合成して、さらに研究してもよい。好ましい分子は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに選択的に結合し、かつＩＣ_５０＜１μΜ、好ましくは＜０．１μΜ、より好ましくは＜０．０５μΜ、さらにより好ましくは＜０．０１μΜ、およびさらにより好ましくは＜０．００１μΜを有し、かつＪｎｎｋ、ＰＫＣｄ、ｐ３８ｂ、ＡＭＰＫ、ＡｕｒＡ、ＧＫ３ｂ、ＲＡＦ１、ＪＮＫ３、ＶＥＧＦ、ｐ３８ｇ、ＰＫＣｂ、ＰＫＣａ、ＰＤＨＫ２、ＰＤＫ１、ＭＫＫ６、ｐ２７ ＫＩＰ、Ｃｄｋ２、Ｐｒａｋ、Ｃｈｋ１、Ｅｇｆｒ、Ｋｄｒ、ＥＧＦ、Ｚａｐ７０、ＩＧＦＲ、Ｓｒｃ、Ｆａｋ、Ｊａｋ３、Ａｋｔ ＣＩＲＡ、およびＭｅｋのいずれをも実質的に阻害しないような分子である。たとえば、好ましい分子は、その分子が実質的に阻害しない列挙された酵素のうち、すべてではなくても少なくとも１つに対してＩＣ_５０値＞１μΜ、より好ましくは＞５μΜまたは＞１０μΜを有する分子である。

この方法はさらに、同定された化合物を薬学的に許容できる組成物に調合するステップを含んでもよい。本発明はさらに、本発明の第１０の局面の方法を用いて同定された分子を含有する医薬組成物を作製する方法を含み、この方法は、こうして同定された分子を薬学的に許容できる担体と混合するステップを含む。

以下の図面および実施例を参照して、限定的でないやり方で本発明を説明する。

ヒトおよびイヌのＭＡＰキナーゼｐ３８αのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ヒトおよびイヌの配列には３５８の同一位置が存在する（９９．４４％の同一性）。 アラニン走査データを示す図である。 基礎リン酸化ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対するＢＢ２７０２の影響を示す図である。 ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を用いた結合親和性の測定を示す図である。ＢＢ２７０２に対するＯＨ−ｐ３８αの結合。 国際公開０１／０４１０２号からのウレイドキナゾリンの構造を示す図である。 ＢＢ２７０２によるＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα生成の阻害を示す図である。Ｘ軸はｎＭ ＢＢ２７０２を示し、すなわち１＝１０００ｎＭ；２＝１００ｎＭ；３＝１０ｎＭ；４＝１ｎＭ；５＝ＬＰＳ刺激なしである。Ｙ軸はＴＮＦａ生成をｐｇ／ｍｌ単位で示す。

実施例１：ペプチド
標準的な合成化学を用いて、次のペプチドを調製した。
１．ＢＢ２７００ ＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩ（配列番号１７）（Ｎ−アセチル化）
２．ＢＢ２７０２ ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）（Ｎ−アセチル化）

実施例２：アラニン走査実験
ＢＢ２７０２アミノ酸配列は、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）であり、これはＮ−アセチル化されている。アラニン走査は、ペプチドの構造活性関係の構築を可能にする。活性ペプチドの各アミノ酸を、側鎖を有する最小アミノ酸であるアラニンによって順次置換し、その新たなペプチドの活性をテストすることによって、どのアミノ酸残基位置が活性にとって重要であるか、およびどの位置が重要でないかの図を構築できる。たとえば、我々が位置４のアルギニンをアラニンに置換するとき、我々は新たなペプチドがＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害する能力において大きな負の影響を知る。よって我々は、位置４のアルギニンがＭＡＰキナーゼｐ３８αへの結合およびその阻害におけるペプチドの重要な相互作用点であると結論付けることができる。ペプチドＢＢ２７０２の１８の位置の各々に対してこれを実行することによって、我々はｐ３８αＭＡＰキナーゼの阻害に必要なペプチドの主要残基部位の知識を構築する。このアプローチを用いて、結合のための配列中の主要な残基を示す。下の下線付き太字の位置にある残基は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αと高親和性で結合するために非常に重要であり、これらはＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害する能力を評価するためのアラニン走査実験および生化学アッセイにおける活性の評価によって判定されたものである。下線付き斜字体の位置にある残基は、重要であるが結合への影響が小さいものである。

実施例３：ＭＡＰキナーゼＰ３８αアッセイ
材料
ＭＫＫ６
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＧＳＴ融合タンパク質。ストック溶液１２ｍｇ／ｍｌ。−８０℃にて保存。（ＭＫＫ６の基礎活性はＰ３８αを活性化するために十分である。）

ＭＡＰキナーゼＰ３８α
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された６−ｈｉｓ Ｃ−ｍｙｃタグ付きタンパク質。ストック溶液１０ｍｇ／ｍｌ。−８０℃にて保存。

ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）１３２２８−０１０）
２５ｍｇを３．７５ｍｌキナーゼ緩衝液（およびβ−ΜΕ）に溶解する

γ^３３Ｐ−ＡＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＡＨ９９６８ ２５０ｕＣｉ）

ＡＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ａ−７６９９）
ガラス蒸留水による１ｍＭストック。−８０℃にて保存。

酢酸マグネシウム（シグマＭ−０６３１）
１Ｍのストック水溶液。４℃にて保存。

トリクロロ酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＴＣＡ）（シグマ４９０−１０）
２０％および２％の水溶液の両方を調製。室温にて保存。

キナーゼ緩衝液
０．１ｍＭ ＥＧＴＡ（シグマＥ−４３７８）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４（シグマＴ−４００３）。０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム溶液（シグマＳ−６５０８）。４℃にて保存。使用直前に、緩衝液１ｍｌ当り１μｌのβ−メルカプトエタノール（シグマＭ−７５２２）を加える。［０．０３８ｇ（３８ｍｇ）ＥＧＴＡ（シグマＥ−４３７８）。７．５８ｇｍ ＴＲＩＳ／ＨＣＬプリセットＰＨ７．４（シグマＴ−４００３）。０．０１８ｇ（１８ｍｇ）オルトバナジン酸ナトリウム（シグマＳ−６５０８）。ガラス蒸留水にて１リットルにする。使用直前に、緩衝液１ｍｌ当り１μｌのβ−メルカプトエタノール（シグマＭ−７５２２）を加える。４℃にて保存。］

９６ウェルプレート
ＤＭＳＯ用（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））３３６５（ポリプロピレン）。
アッセイプレート（コーニング社（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））３５９６（ポリスチレン−平底、蓋付き）。
フィルタプレート（キャンバラ・パッカード（Ｃａｍｂａｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ）６００５１７４（および結合されたＧＦ／Ｃフィルタ））。

実施例４：ＭＡＰキナーゼｐ３８αプロトコル（バージョン１）（酵素濃度６．５μｇ／ｍｌ）
酵素活性化
ヒトＭＡＰキナーゼｐ３８αを使用する前に、ＭＫＫ６とともに３０℃にて３時間インキュベートすることによって活性化する。活性化インキュベートは、５５０μｌのキナーゼ緩衝液、７５μｌ（１ｍＭ）のＡＴＰ、７５μｌ（１００ｍＭ）のＭｇＡｃ、５０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）のＰ３８α、および５μｌ（１２ｍｇ／ｍｌ）のＭＫＫ６を含有する。この活性化インキュベートをアリコートして−２０℃にて保存してもよい。

方法
基準化合物はＳＢ２０３５８０（ＩＣ_５０＝０．０２５ｕＭ）である

化合物をＤＭＳＯにて１０ｍＭにする：Ｗｔ（ｍｇ）／ＭＷｔ×１００＝添加すべきＤＭＳＯの量（ｍｌ））。

ＤＭＳＯにて段階希釈液を作製する（第１の希釈プレート）
＊９６ウェルプレート（ポリプロピレン）に入れる。
＊第１行を除くすべての行に１００μｌのＤＭＳＯを入れる。
＊ＤＭＳＯとともに第１のウェルに５０μｌの化合物を入れる。
＊混合しながらプレート全体に５０μｌ。

次いで、これらの段階希釈液をキナーゼ緩衝液にて１：１０に希釈する（第２の希釈プレート）。
＊９６ウェルプレート（ポリスチレン）に入れる。
＊必要なすべての行に９０μｌのキナーゼ緩衝液を入れる。
＊１０μｌの化合物希釈液（行３−１）（２０μΜ−０．００６μΜ（最終濃度）。

「最大」および「最小」対照ウェルに、１０％ＤＭＳＯのキナーゼ緩衝液溶液を１０ｕｌ加える。

ワーキング酵素溶液の作製。各９６ウェルプレートに対して、２．５０ｍｌのキナーゼ緩衝液と、５００μｌのミエリン塩基性タンパク質（６．６６ｍｇ／ｍｌのキナーゼ緩衝液溶液）と、５０μｌの活性化Ｐ３８α（「最小」対照ウェルにおいては活性化酵素をキナーゼ緩衝液に置き換える）とを混合する。すべてのテストウェルに３０μｌを加える。

ラベルＡＴＰ溶液の調製。各９６ウェルプレートに対して、５０μｌのＭｇＡｃ（１Ｍ）と、９００μｌの蒸留水と、５０μｌのＡＴＰ（１ｍＭ）と、５μＣｉ（０．５〜１μｌ）のγ^３３Ｐ−ＡＴＰとを加える。

すべてのウェルに１０μｌを加える。

プレートを密封し、穏やかに撹拌（プレート振とう機）しながら室温にて６０分間インキュベートする。

ウェル当り５０μｌの２０％ＴＣＡ溶液を加えることによって反応を停止する。＊１００ｍｌ ＴＣＡ＋４００ｍｌミリＱ水。

マイクロセルハーベスターを用いて、フィルタプレート上に沈殿したＭＢＰを捕捉する。２％ＴＣＡ（約１００ｍｌ）を用いてプレートを洗浄し、０．７５％リン酸（約１００ｍｌ）を用いてハーベスターのリンスを終了する。プレートを一晩乾燥させる。

各テストウェルに２５μｌのマイクロシンチラントを加え、トップカウントシンチレーションカウンタにおいて読取る（１分当りのカウント）。

実施例５：ＭＡＰキナーゼ３８αプロトコル（バージョン２）（酵素濃度０．５ｕｇ／ｍｌ）
酵素活性化。
ヒトＭＡＰキナーゼｐ３８αを使用する前に、ＭＫＫ６とともに３０℃にて３時間インキュベートすることによって活性化する。活性化インキュベートは、５５０μｌのキナーゼ緩衝液、７５μｌ（１ｍＭ）のＡＴＰ、７５μｌ（１００ｍＭ）のＭｇＡｃ、５０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）のＰ３８α、および５μｌ（１２ｍｇ／ｍｌ）のＭＫＫ６を含有する。この活性化インキュベートをアリコートして−２０℃にて保存してもよい。

方法
基準化合物はＳＢ２０３５８０（ＩＣ５０＝０．０２５ｕＭ）である

化合物をＤＭＳＯにて１０ｍＭにする。
Ｗｔ（ｍｇ）／ＭＷｔ×１００＝添加すべきＤＭＳＯの量（ｍｌ））

ＤＭＳＯにて段階希釈液を作製する（第１の希釈プレート）
＊９６ウェルプレート（ポリプロピレン）に入れる。
＊第１行を除くすべての行に１００μｌのＤＭＳＯを入れる。
＊ＤＭＳＯとともに第１のウェルに５０μｌの化合物を入れる。
＊混合しながらプレート全体に５０μｌ。

次いで、これらの段階希釈液をキナーゼ緩衝液にて１：１０に希釈する（第２の希釈プレート）。
＊９６ウェルプレート（ポリスチレン）に入れる。
＊必要なすべての行に９０μｌのキナーゼ緩衝液を入れる。
＊１０μｌの化合物希釈液（行５−１２）（２．２２μΜ−０．００１μΜ（最終濃度））を移して混合する。
１０μｌを希釈プレート２からアッセイプレートに移す（２つ組で）（２％ＤＭＳＯ最終濃度）。

「最大」および「最小」対照ウェルに、１０％ＤＭＳＯのキナーゼ緩衝液溶液を１０μｌ加える。

ワーキング酵素溶液の作製。各９６ウェルプレートに対して、２．５５ｍｌのキナーゼ緩衝液と、５００μｌのミエリン塩基性タンパク質（６．６６ｍｇ／ｍｌのキナーゼ緩衝液溶液）と、３．８μｌの活性化Ｐ３８α（「最小」対照ウェルにおいては活性化酵素をキナーゼ緩衝液に置き換える）とを混合する。すべてのテストウェルに３０μｌを加える。

ラベルＡＴＰ溶液の調製。各９６ウェルプレートに対して、５０μｌのＭｇＡｃ（１Ｍ）と、９００μｌの蒸留水と、５０μｌのＡＴＰ（１ｍＭ）と、５μＣｉ（０．５〜１μｌ）のγ^３３Ｐ−ＡＴＰとを加える。

すべてのウェルに１０μｌを加える。

プレートを密封し、穏やかに撹拌（プレート振とう機）しながら室温にて６０分間インキュベートする。

ウェル当り５０μｌの２０％ＴＣＡ溶液を加えることによって反応を停止する。＊１００ｍｌ ＴＣＡ＋４００ｍｌミリＱ水。

マイクロセルハーベスターを用いて、フィルタプレート上に沈殿したＭＢＰを捕捉する。２％ＴＣＡ（約１００ｍｌ）を用いてプレートを洗浄し、０．７５％リン酸（約１００ｍｌ）を用いてハーベスターのリンスを終了する。プレートを一晩乾燥させる。

各テストウェルに２５μｌのマイクロシンチラントを加え、トップカウントシンチレーションカウンタにおいて読取る（１分当りのカウント）。

実施例６：Ｈｅｌａ細胞における基礎ｐ３８α活性に対するＢＢ２７０２の影響
たとえばサイトカイン生成など、炎症反応の特定の局面をモデル化するために、Ｈｅｌａ細胞を用いる。特に、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ＬＰＳ）またはその他の炎症促進性刺激に応答した、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８炎症性サイトカインの生成である。この生成は、ＭＡＰキナーゼｐ３８α依存性または非依存性の手段を介するものであってもよい。この炎症シグナル伝達カスケードにおけるＭＡＰキナーゼｐ３８αの役割を探索するために、しばしばＭＡＰキナーゼｐ３８αの小分子阻害剤ＳＢ２０３５８０を使用する。図３は、Ｈｅｌａ細胞におけるｐ３８αの基礎リン酸化状態に対するＢＢ２７０２の影響をみている。ホスホｐ３８αはｐ３８αの活性形であり、下流シグナル伝達を行って炎症性サイトカインの生成をもたらし得る。我々は（下の実施例８の）表２において、生化学アッセイにおいてＢＢ２７０２がｐ３８α活性化を阻害することを実証している。ここで我々は、ＢＢ２７０２があらゆる刺激の不在下で細胞モデルにおけるｐ３８αリン酸化を抑制することを実証しており、つまりＢＢ２７０２の存在下でｐ３８α活性が低減することを実証している。このデータから、ＢＢ２７０２は基礎ｐ３８α活性の抑制をもたらすことを我々は結論付け得る。

図３に示されるとおり、ＢＢ２７０２は基礎活性化ｐ３８αを低減する。ＢＢ２７０２は、ＭＡＰキナーゼｐ３８αの、たとえばＭＫＫ６もしくはＭＫＫ３などの上流活性化キナーゼによるリン酸化、または自己リン酸化によるリン酸化を妨げる。

実施例７：ＢＢ２７０２とＭＡＰキナーゼｐ３８αとの相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析 Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００を用いて、溶液中阻害アッセイ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）（ＩＳＡ；カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）、Ｒ．（１９９４）溶液中の低分子量リガンドと表面固定化受容体との相互作用のリアルタイム競合分析（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２２１、１４２−１５１）を用いて、結合相互作用を検出した。キナーゼのプリン部位に結合することが公知である標的決定化合物（ウレイドキナゾリン化合物、図５）を、センサチップ上に固定化した。ＭＡＰキナーゼｐ３８αをさまざまな濃度のテスト化合物とともに３０分間インキュベートしてから、センサ上に流した。非結合ｐ３８αは標的決定化合物と結合してシグナルを与え、このシグナルは遊離濃度に関係し得た。標的決定化合物による競合は中点の顕著なシフトをもたらさなかったため、用量−応答データを分析してＫ_ｄ値（例、１または３、ここでＫ_ｉ’＝Ｋ_ｄ）を推定した。１１．５ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと７５ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩との混合物を７分間注入した後に、４００μＭの化合物を加えた１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、４％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、および最後に１ｍＭエタノールアミン、ｐＨ８．５を流速５μＬ／ｍｉｎで注射することを用いた、研究グレードのＣＭ−５チップへのアミンカップリングによって、標的決定化合物を固定化した。典型的な固定化レベルは、約３０００共鳴単位であった。標的決定化合物を有さない基準フローセルを調製した。すべての測定は流速２０μＬ／ｍｉｎを使用しており、屈折率の変化および注入ノイズを排除するために減算を行った。５μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨを注入することによって、表面再生を達成した。応答が時間とともに線形的に増加していたときの６０ｓのレポートポイントを用いて、非リン酸化またはリン酸化ｐ３８αのいずれかによってチップを較正した。最大で少なくとも４００ｎＭのタンパク質まで、応答は線形的であった。１０〜５０ｎＭのｐ３８αにおいてＫ_ｄ測定を行い、２５ｎＭであることを確認した。この結合親和性は、生化学的に導出したＫｉの７ｎＭと矛盾しない。

図４は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析の結果を示す。

実施例８：ＭＡＰキナーゼｐ３８αに対するＢＢ２７０２の結合のＮＭＲ研究
ＭＫＫ６によるＭＡＰキナーゼｐ３８αの活性化を阻害するためのＢＢ２７０２（ＩＣ_５０＝１ｎＭ）は、ＰＲＫ２由来の疎水性ＰＤＫ１相互作用フラグメント（ＰＤＫ１−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）または「ＰＩＦ」、すなわちＰＤＫ１による基質キナーゼ活性化に関係するポケット結合モチーフ（バレンドラン（Ｂａｌｅｎｄｒａｎ）ら（１９９９）カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．）９、３９３−４０２）と、配列モチーフ（ＬＩＦＱＫＩ）を共有している。ＰＤＫ１の結晶構造（ビオンディ（Ｂｉｏｎｄｉ）ら（２００２）ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）２１（１６）、４２１９−２８）において、対称性に関するＰＤＫ１分子のαＧヘリックスは、触媒ドメインＮ末端ローブの「後ろ」側の疎水性モチーフ結合ポケットを占有しており、基質キナーゼとの分子間相互作用を模倣している。しかし、ＭＡＰキナーゼｐ３８αは同等の疎水性モチーフ結合ポケットを欠いている。代わりにＭＡＰキナーゼｐ３８αのＮ末端ローブのこの領域は自身のＣ末端ヘリックスに占有されているため、このＢＢ２７０２ペプチドのＭＡＰキナーゼｐ３８αへの強力な結合は、同等の相互作用の介在によるものではないと考えられる。

他方で、ＭＥＦ２Ａ転写因子およびその他のＭＡＰキナーゼｐ３８αの基質からのペプチドの結晶構造、ならびにより最近ではＭＡＰキナーゼｐ３８αとＭＫ２との複合体の結晶構造から、ＭＡＰキナーゼｐ３８αはＡＴＰ結合部位に近接するＣ末端ローブに基質ドッキング溝を有することが明らかになった（チャンら（２００２）モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．）９（６）、１２４１−９；テル・ハール（ｔｅｒ Ｈａａｒ）ら（２００７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２８２（１３）、９７３３−９）。公知のＭＡＰキナーゼｐ３８α基質キナーゼドッキングモチーフとの明白な配列類似性はないが、我々はこのドッキング溝がＢＢ２７０２とＭＡＰキナーゼｐ３８αとの１つの相互作用部位である可能性があると考えた。このことを調べるために、我々はＮＭＲを用いて、ＢＢ２７０２およびＭＥＦ２Ａペプチドの結合によって誘導されるＭＡＰキナーゼｐ３８αのスペクトルの主鎖アミド化学シフト摂動（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ：ＣＳＰ）をモニタした。準化学量論的濃度のＢＢ２７０２ペプチドは、ＮＭＲ時間尺度における遅い交換限界にて化学シフト変化を誘導し、これは高親和性（＜１μＭ）結合と一致し、予期されるとおり、このシフトは１：１化学量論において本質的に飽和した（データは示さず）。ＭＥＦ２Ａペプチドの結合は、ＢＢ２７０２ペプチドによって誘導されたものと類似のパターンのＣＳＰを示した。キナーゼの同じ共鳴の多くが影響されており、これら２つのペプチドが類似または重複する結合部位を共有する可能性が示唆された。さらに、キナーゼのドッキング溝へのＭＥＦ２Ａペプチドの結合と一致して、ＣＳＰは小分子ＡＴＰ競合ｐ３８阻害剤のものとは顕著に異なっていた（サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら（２００５）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４４（５０）、１６４７５−９０）。しかし、ＢＢ２７０２ペプチドとは対照的に、ＭＥＦ２Ａペプチドの結合はかなり弱く、ＮＭＲ滴定データからの予測Ｋ_ｄは２５０μＭである。ＭＥＦ２ＡおよびＢＢ２７０２ペプチドに対する結合部位の関係をさらに探索するために、次いで我々は、ＭＥＦ２Ａペプチドを予め結合させたＭＡＰキナーゼｐ３８αのサンプルにＢＢ２７０２ペプチドを加えた。ＢＢ２７０２（２４０μΜ）はＭＥＦ２Ａペプチド（５ｍＭ）を完全に置換でき、ＢＢ２７０２ペプチド結合のみのＣＳＰパターンを再現した（図５Ｂ）。これに対し、添加の順序を逆にしたときにＣＳＰが変化しなかったことから判断して、ＭＥＦ２Ａペプチド（１ｍＭ）は、その親和性が弱いことに一致して、ＢＢ２７０２ペプチド（１５０μΜ）を置換できなかった（データは示さず）。まとめると、上流キナーゼ制御因子とドッキングするために使用されるｐ３８αの溝の中またはその近くにＢＢ２７０２ペプチドが結合するのではないかという仮説を、ＮＭＲデータは支持している。

実験の詳細
ＢＢ２７０２を、そのままで、またはＭＥＦ２Ａ転写因子由来ペプチド（チャンら（２００２）モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．）９（６）、１２４１−９）（ＲＫＰＤＬＲＶＶＩＰＰＳＳ）に加えて、均一に^１５Ｎ，^２Ｈ−ラベルした６Ｈｉｓ−ＭＡＰキナーゼｐ３８α（１２０μΜ）のサンプルに滴定した（サリバンら（２００５）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４４（５０）、１６４７５−９０）。各添加後に、^１Ｈ−^１５Ｎ ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを取得した。サリバンら（２００５）に記載されるＨＣＮ三重共鳴クライオプローブを備えた６００ＭＨｚバリアン・イノバ（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ）分光計において、２９８ＫにてＮＭＲ実験を記録した。

実施例９：ＢＢ２７０２の選択性
下の表１は、２つの選択されたペプチドの活性、およびそれらがＭＫＫ６またはＭＫＫ３の下のｐ３８αのリン酸化すなわち活性化を阻害する能力を比較するものである。表１はさらに、コードされたペプチドが、活性化ｐ３８αがいくつかの基質をリン酸化する能力を阻害する能力を示す。表中のデータは、ＢＢ２７０２がＭＫＫ３ではなくＭＫＫ６によるｐ３８αのリン酸化を阻害することを示し、さらにあらゆる活性ｐ３８αは直接阻害されて、ＭＢＰまたはＭＫ２のリン酸化が妨げられることを示す。よってＢＢ２７０２は、ｐ３８αの活性化の阻害と、活性ｐ３８αの不活性化との両方によって作用する。

表２および表３（下記）。１０μＭのペプチドに対して３０を超えるプロテインキナーゼをテストすることによって、ＢＢ２７０２が他のプロテインキナーゼを阻害する能力を評価した。これは選択性パネルである。阻害剤がＡＴＰ結合ポケットに結合するとき、この数のキナーゼに対する選択性はないことが予期され得る。しかし、ＢＢ２７０２は最高１０μＭまではほとんどのキナーゼ標的に対して不活性であり、６つのキナーゼにおいてはわずかな活性がみられたが、ｐ３８αに比べると全体で５００倍から１０００倍の選択性を有する。最も活性の高いオフターゲット効果は、キナーゼのＭＡＰＫファミリーの中で相同性の高いファミリーメンバーであるｐ３８βに対するものである。しかし、ここでも選択性は１００倍を超える。要約すると、我々は、ＢＢ２７０２がｐ３８α阻害に対して極度に選択性が高いと結論付け得る。

実施例１０：ＢＢ２７０２によるＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα生成の阻害
図６は、ＴＨＰ−１細胞を用量依存性の態様でＢＢ２７０２によって処置し、次いでＬＰＳ（リポ多糖）で刺激するときに、ｐ３８αの下流にあることが公知である炎症性サイトカインのＴＮＦαの生成が有意に低減することを示す。このことは、容認されたＴＨＰ−１細胞炎症モデルにおいてｐ３８αの介在する炎症シグナル伝達をＢＢ２７０２が阻害できることを実証するものである。

ＴＨＰ−１細胞をさまざまな用量のＢＢ２７０２（１、１０、１００ １０００ｎＭ）とともにプレインキュベートした後に、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）によって５時間刺激した。ＥＬＩＳＡによって、細胞上清中のＴＮＦ−αを２つ組で決定した。データは、各々２つ組で行った５回の実験の平均を示す。各々に対する標準偏差は、平均値の１５％以内である。

Claims (27)

1. アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）を含むか、または前記アミノ酸配列の７もしくはそれ以上のアミノ酸の部分を含むか、または前記アミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列の前記部分の１から５のアミノ酸が変更された変異体を含む化合物であって、前記化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する、化合物。
2. 配列番号１の位置と比較したときに、位置４はＲであり、位置９はＦであり、かつ位置１０はＱである、請求項１に記載の化合物。
3. 配列番号１の位置と比較したときに、位置２はＫ、ＲもしくはＨであり、位置８はＩ、ＬもしくはＭであり、位置１３はＭ、ＩもしくはＬであり、および／または、位置１６はＲ、ＨもしくはＫである、請求項１または請求項２に記載の化合物。
4. 配列番号１の位置と比較したときに、Ｋであるか、位置８はＩであるか、位置１３はＭであるか、または位置１６はＲである、請求項３に記載の化合物。
5. 配列番号１の位置と比較したときに、位置２はＫであり、位置８はＩであり、位置１３はＭであり、かつ位置１６はＲである、請求項３に記載の化合物。
6. ２５０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
7. 前記アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）か、または前記アミノ酸配列の７もしくはそれ以上のアミノ酸の部分からなっているか、または前記アミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列の前記部分の１から５のアミノ酸が変更された変異体を含む化合物であって、前記化合物はＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
8. 前記アミノ酸配列ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１）からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
9. 以下のアミノ酸配列：ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲ（配列番号２）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲ（配列番号３）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬ（配列番号４）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷ（配列番号５）、ＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号６）、ＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号７）、ＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭ（配列番号８）、ＳＲＡＬＬＩＦＱ（配列番号９）、ＨＡＬＡＩＦＱＫＩＭＷ（配列番号１０）、ＨＫＳＲＡＬＡＩＦＱＫＩＭＡＬＲＲＱ（配列番号１１）、ＡＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１２）、ＨＫＳＲＡＡＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＱ（配列番号１３）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＡＲＲＱ（配列番号１４）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＡＱ（配列番号１５）、ＨＫＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩＭＷＬＲＲＡ（配列番号１６）、またはＳＲＡＬＬＩＦＱＫＩ（配列番号１７）からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
10. 複数のアミノ酸の間に少なくとも１つの非ペプチド結合を含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
11. 少なくとも１つのＤ−アミノ酸残基を含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
12. Ｎ末端および／またはＣ末端残基がブロックされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
13. 前記化合物は、別の部分に連結されたペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
14. プロテアーゼ消化に対して実質的に耐性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、および１つまたはそれ以上のさらなる治療化合物、たとえば抗炎症、抗細菌などの抗感染、または抗増殖化合物などを含む、組成物。
16. 医薬に使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物と、薬学的に許容できる賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
18. ＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害するための方法であって、前記方法は、前記キナーゼと、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
19. ＭＡＰキナーゼｐ３８αを阻害するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物の使用。
20. 個体における炎症状態を処置するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物を個体に投与するステップを含む、方法。
21. 個体における炎症状態の処置に使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物。
22. 個体における炎症状態を処置するための薬物の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５に記載の組成物の使用。
23. ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する分子を同定するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する位置において、前記分子がＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合するかどうかを判定するステップを含む、方法。
24. 同定された前記分子を薬学的に許容できる組成物に調合するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
25. 医薬組成物を作製する方法であって、請求項２３に記載の方法を実行するステップと、同定された前記分子を薬学的に許容できる担体と混合するステップとを含む、方法。
26. ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する、本明細書に開示される任意の新規ペプチド。
27. 個体における炎症状態の処置に使用するための、ＭＡＰキナーゼｐ３８αに結合する、本明細書に開示される任意の新規ペプチド。

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