CN101318012A - β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及β－抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用。具体地说，本发明涉及β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。

Description

β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及β抑制蛋白1的抑制剂在制备用于治疗或预防对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病中的用途。

背景技术

在生物体内，T细胞和B细胞构成了获得性免疫系统保护着机体免受病原体的侵害。为保证机体正常的免疫应答，这些细胞的凋亡是被精确地调控着的。在胸腺中，根据TCR信号的强弱，大部分T细胞经过阴性选择和阳性选择凋亡了。生存下来的T细胞进入外周血系统形成外周血CD4⁺和CD8⁺T细胞库。外周血中的CD4⁺T细胞由于胸腺中的新细胞输入和外周血中CD4⁺T的细胞凋亡维持着其的动态平衡(1，2)。当CD4⁺T细胞接触到其特异抗原时，细胞开始分裂、分化成有功能的CD4⁺T细胞。这些有功能的CD4⁺T细胞在清除了外来抗原后需要及时凋亡，否则会对正常机体产生伤害。参与这些有功能的CD4⁺T细胞凋亡的信号通路主要有：激活引起的细胞凋亡(AICD)和激活细胞的自发凋亡(ACAD)。在所有这些CD4⁺T细胞发育过程中，控制CD4⁺T细胞凋亡的调节分子的表达异常可能破坏CD4⁺T细胞平衡，使针对自身抗原的CD4⁺T细胞存活下来或者延长CD4⁺T细胞的免疫应答，从而导致很多免疫疾病，如自身免疫病和淋巴细胞增多症等(3-6)。

在哺乳动物中，CD4⁺T细胞的凋亡主要由两条通路来介导(1，6)。一条是通过细胞表面受体，如：TNF和Fas等受体。它们主要介导激活CD4⁺T细胞的凋亡。这些受体的激活能直接通过招募和活化caspase来诱导细胞凋亡(7-11)。与这条通路对应的介导CD4⁺T细胞凋亡的途径是Bcl-2家族蛋白介导的线粒体通路。这个蛋白家族包括抗凋亡和促凋亡两大类分子，这些分子协同地调控着线粒体膜的完整性以及存在于线粒体中促调亡蛋白的释放(12，13)。实验表明：Bcl-2家族蛋白主要介导因细胞因子缺少，胁迫或激活的CD4⁺T细胞的自发凋亡(1，14-17)。Bcl-2是这个蛋白家族的原型蛋白。在Bcl-2敲除小鼠中，T细胞很容易凋亡并且当小鼠变老的时候，出现白细胞减少症(18)。而在Bcl-2过表达的小鼠中，T细胞对很多凋亡刺激不敏感(15，16)，机体的免疫应答时间变长并且小鼠会自发出现一些自身免疫病的症状(19)。

β抑制蛋白家族(βarrs)包含β抑制蛋白1(βarr1)、β抑制蛋白2(βarr2)等。它们是具有多种功能的信号分子(20)，一方面，它们能介导多种受体的内吞(21-24)。另一方面，它们通过和很多信号分子的结合调节这些信号通路，如：Src家族激酶的活性，一些MAPK信号通路(20，25，26)。β-抑制蛋白1(基因号：NM-004041)是GPCRs的重要调节蛋白，在细胞质与细胞核中都有分布。近来，人们又发现，βarr1不仅在细胞质里调节着信号通路，在核里它能直接调控基因的转录(27)。表明：βarr1的有些功能是通过影响基因的表达来实现的。βarrs是一类泛表达的蛋白，但它的蛋白水平在神经细胞和免疫细胞中相对更高，如(28，29)报道和图2A所示。最近的研究发现，βarr2在初级免疫细胞中负调节Toll-like受体的信号传导。而另一实验室发现，βarr2^-/-小鼠在哮喘模型中的发病及病情显著低于其野生型(30，31)。但是到现在为止，人们仍然没有发现βarr1在免疫细胞中的功能。

发明内容

经过研究，本发明者发现，βarr1正调控CD4⁺T细胞的存活和其在体内的动态平衡。βarr1的这个功能很可能是通过其核内功能实现的，在核内它能促进Bcl-2基因区组蛋白H4的乙酰化水平和该基因的表达。本申请实施例中进一步阐明了βarr1调节CD4⁺T细胞存活的重要生理意义：1)在自身免疫脱髓鞘疾病小鼠模型EAE的实验中，βarr1敲除小鼠对EAE的诱导很不敏感而βarr1转基因小鼠的发病相对野生型有明显的增加；2)在自身免疫脱髓鞘疾病MS的病人外周血CD4⁺T细胞中，βarr1和Bcl-2的表达显著地高于正常对照。而这种βarr1和Bcl-2的高表达对CD4⁺T细胞的存活是重要的。因此，本发明提供了一种新的调控CD4⁺T细胞生理功能的分子机制，并且为利用这种分子机制来治疗自身免疫疾病提供了基础。

具体而言，本发明一方面涉及β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。

本发明另一方面提供了用于治疗或预防对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的β抑制蛋白1的抑制剂作为活性组分，以及药学上可接受的载体，其中所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质。

本发明还有一方面还提供了一种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物的方法，该方法包括：a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病药物。

本发明的其它目的和优点可以通过下文的详细描述和具体实施例来获知。

附图说明

图1显示了β-抑制蛋白1正调控CD4⁺T细胞的动态平衡和存活。图中：(A)分离βarr1^-/-(1KO)，βarr1tg(1TG)和野生型(WT)小鼠脾细胞(上)以及淋巴细胞(下)，流式细胞分析CD4和CD8分子在这些细胞上的表达。FACS图是每组10只小鼠中的代表。数字显示的是每个区域的细胞百分比。(B，C)从βarr1^-/-，βarr1tg和野生型小鼠中分离CD4⁺和CD8⁺T细胞，这些细胞用CD3和CD28的抗体激活(C)或不激活(B)。随后，细胞培养在单纯的培养液里。活细胞的数量是通过排除PI和膜联蛋白V阳性的细胞得到。三次平行实验，^*P＜0.05，^**P＜0.01和相应对照比较。(D，E)βarr1^-/-，βarr1tg和野生型小鼠每组5只腹腔注射100μg SEB。尾静脉取血，外周血中TCR V_β ^8.1/2+或V_β ⁶⁺阳性的CD4⁺和CD8⁺T量用流式细胞分析得到。数据从三次平行实验得到，^*P＜0.05，^**P＜0.01和相应对照比较。

图2显示了β-抑制蛋白1在小鼠不同组织的表达以及βarr1^-/-小鼠的淋巴细胞的发育。(A)免疫印迹的方法检测小鼠不同组织中βarr1和βarr2的表达，肌动蛋白作为上样量的内参。(B)流式细胞分析βarr1^-/-和wt小鼠(13-18周)来源的脾脏细胞和淋巴细胞中CD3和B220的表达，FACS图是每组5只小鼠中的代表。数字显示的是每个区域的细胞百分比。脾脏细胞(上)和淋巴细胞(下)中特异细胞群的细胞数也显示了。(C)流式细胞分析βarr1^-/-和wt小鼠(13-18周)来源的胸腺细胞中CD4和CD8的表达。FACS图是每组大于5只小鼠中的代表。数字显示的是每个区域的细胞百分比。特异细胞群的细胞数也显示了。DP表示双阳性，DN表示双阴性，SP表示单阳性。^**P＜0.05和相应对照比较。

图3显示了β-抑制蛋白1对CD4⁺T细胞中IL-2分泌、Akt和Erk激活的影响。(A)脾脏CD4⁺T细胞用相应量的CD3和CD28的抗体激活，24小时后用ELISA检测培液中IL-2的水平。数据来源于三次平行实验。(B)βarr1^-/-和wt小鼠来源的脾脏CD4⁺T细胞用相应量的CD3和CD28的抗体激活或不激活，免疫印迹实验检测磷酸化的(p-)Akt，(p-)Erk和所有的Akt，Erk水平。图是两次次平行实验中的代表。

图4显示了不同处理后，β-抑制蛋白和p300的表达以及β-抑制蛋白1对Bcl-2家族基因的转录影响。(A)Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，免疫印迹实验检测其对这些蛋白表达的影响。(B)Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，RT-qPCR实验检测Bcl-2，Bax，Bim，Bad和Bcl-xl的转录水平，HPRT来归一化上样量。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。

图5显示了β-抑制蛋白1促进CD4⁺T细胞中Bcl-2的表达。(A)脾脏CD4⁺T细胞用CD3和CD28的抗体激活相应的时间，免疫印迹实验分析βarr1，Bcl-2和Bax的表达。肌动蛋白用作上样的内参。(B，C，D)从βarr1^-/-(C)，βarr1tg(B)，βarr2^-/-(D)和野生型小鼠脾脏中分离CD4⁺T细胞，并按上所述方法激活相应的时间。细胞取样后，用RT-qPCR和免疫印迹分别检测Bcl-2和Bax的mRNA水平和Bcl-2，Bax及βarr1的蛋白水平。mHPRT是RT-qPCR实验的内参，而肌动蛋白是免疫印迹实验的内参。所有的免疫印迹和RT-qPCR实验平行做三次以上，^**P＜0.01和相应对照比较。

图6显示了β-抑制蛋白1通过转录促进Bcl-2的表达以及β-抑制蛋白1对CREB和NF-kappa B报告基因的影响。(A)Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，RT-qPCR和免疫印迹实验检测Bcl-2和Bax的表达水平。(B，C)Jurkat细胞中转染βgal或βarr133小时后，用0，5，10μg放线菌酮(CHX)(B)或0，2，4μM放线菌素D(Act)(C)处理细胞15小时，RT-qPCR和免疫印迹实验检测Bcl-2和Bax的表达水平。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。(D)HEK293细胞中，单转染CREB-luciferase报告基因质粒或和不同量的βarr1质粒共转。数据用相对于对照的上调倍数表示。10μM毛喉素(FK)是阳性对照。数据来源于三次平行实验。(E)HEK293细胞中，单转染NF-kappa B-荧光素酶报告基因质粒或和不同量的βarr1质粒共转。数据用相对于对照的上调倍数表示。TNF-α是阳性对照。数据来源于三次平行实验。^*P＜0.05，^**P＜0.01和相应对照比较。

图7显示了β-抑制蛋白1促进CD4⁺T细胞中Bcl-2基因座组蛋白H4乙酰化的水平。脾脏CD4⁺T细胞用CD3和CD28的抗体激活，细胞在不同时间取样后用CHIP实验分析。在CHIP实验中用了组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化的抗体。在上样中和抗体染色质沉淀中Bcl-2和Bax基因启动子区的序列用qPCR分析。数据用上样中的量来归一化。(A)使用了wt小鼠的CD4⁺T细胞，并且分析了组蛋白H4(左)乙酰化和H3(右)乙酰化的水平。(B)使用了βarr1tg和wt小鼠的CD4⁺T细胞。(C)使用了βarr1^-/-和wt小鼠的CD4⁺T细胞。(D)用CHIP-qPCR实验分析βarr1^-/-和wt小鼠的CD4⁺T细胞中Bcl-2基因区的组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化水平。图上给出了同一位点wt和βarr1^-/-组蛋白乙酰化水平的比值。“0”代表转录起始位点，“u”代表转录起始位点上游。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。

图8显示了p300在β-抑制蛋白1上调Bcl-2转录中的作用。

(A-D)转染有如图所示质粒的Jurkat细胞用CHIP实验分析组蛋白H4(A，C)和H3(B，D)的乙酰化水平。在上样和免疫沉淀复合物中Bcl-2(A，B，C，D)和Bax(A，B)启动子区的DNA序列用qPCR检测。(E，F)转染有如图所示质粒的Jurkat细胞用RT-qPCR实验分析Bcl-2(E)和Bax(F)的转录水平。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。

图9显示了β-抑制蛋白1促进小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎。(A)在6-8周的βarr1^-/-，βarr1tg和wt小鼠中诱导EAE，诱导后每天观察小鼠的发病情况。数据是4次实验的总和，包括10只βarr1^-/-，10只βarr1tg和14只wt小鼠。(B)从EAE小鼠中取出脊髓，固定并用苏木精曙红观察炎性侵染以及Luxol fast blue观察脊髓的脱髓鞘程度。图中所示是3-4只小鼠中的典型。(C)小鼠诱导EAE 8天以后，用MOG肽段重刺激小鼠脾脏细胞检测细胞增殖。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。(D)小鼠诱导EAE 8天以后，从脾脏细胞中分离得到CD4⁺和CD8⁺T细胞。无血清培液诱导这些细胞凋亡，存活的细胞通过排除PI和膜联蛋白V阳性的细胞得到。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。

图10显示了β-抑制蛋白1和多发性硬化疾病相关。(A，B)从14位多发性硬化病人和14位健康人的外周血中分离得到CD4⁺T细胞，用RT-qPCR检测βarr1(A)和Bcl-2(B)的转录水平。^*P＜0.05，^**P＜0.01和相应对照比较。(C)从多发性硬化病人来源的MBP特异的CD4⁺T细胞克隆中，用带有βarr1 siRNA慢病毒干扰βarr1的表达。免疫印迹试验检测βarr1和Bcl-2的表达水平。图中所示是三次实验中的典型。(D)用带有βarr1 siRNA的慢病毒感染MBP特异的CD4⁺T细胞克隆。无血清培液诱导这些细胞凋亡，存活并带有GFP的细胞是通过排除PI阳性的细胞得到的。数据来源于三次平行实验，^**P＜0.01和相应对照比较。

图11显示了在EAE诱导后β-抑制蛋白1在CD4⁺T细胞中的表达，以及CD4⁺和CD8⁺T细胞中，β-抑制蛋白1的亚细胞定位。(A)免疫印迹实验检测诱导了EAE八天的小鼠脾CD4⁺T细胞中的βarr1水平。图是两次平行实验中的典型。(B)免疫印迹实验检测CD4⁺和CD8⁺T细胞中的β-抑制蛋白1水平。图是三次平行实验中的典型。(C，D)CD4⁺和CD8⁺T细胞如前所述激活0(C)或72(D)小时，βarr1在核内和细胞浆中的水平用免疫印迹实验检测。图是三次平行实验中的典型。

具体实施方式

CD4⁺T在获得性免疫中起着重要的功能，对这类细胞凋亡的不正常调节可能导致自身免疫的发生。βarr1是一已发现的在G蛋白偶联受体信号通路中起多种功能的蛋白，并且它亦有在核内直接调控基因转录的功能。在本发明中，发明人发现βarr1正调控CD4⁺T细胞的存活。在βarr1敲除小鼠中，幼稚和激活的CD4⁺T在体内和体外实验条件下都比其野生型易于凋亡。βarr1在CD4⁺T细胞中调控着Bcl-2基因区组蛋白H4的乙酰化水平并影响其基因表达。在多发性硬化的小鼠模型EAE中，βarr1敲除小鼠的病理严重程度明显低于其野生型，而βarr1转基因小鼠的病理严重程度却明显增加。多发性硬化病人外周血CD4⁺T细胞中βarr1的表达显著高于正常人。而从病人来源并与自身抗原反应的CD4⁺T细胞中导入βarr1 siRNAi降低其表达，这类CD4⁺T细胞在细胞因子胁迫的情况下凋亡显著增加，从而揭示了βarr1在调控CD4⁺T细胞存活和自身免疫中的一个新功能，并且为自身免疫病的治疗提供了新的靶点。

因此，本发明第一方面涉及β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。

(I)β抑制蛋白1的抑制剂

本文的术语“β抑制蛋白1的抑制剂”具有较广的含义，其包括直接或间接(例如通过反应性中间物、代谢物等)作用于β抑制蛋白1从而抑制或降低β抑制蛋白1的生物活性的物质，具体包括：(i)在蛋白质水平上通过相互作用直接抑制β抑制蛋白1的生物活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的物质。此处所述的“β抑制蛋白1的(生物)活性”指的是β抑制蛋白1促进CD4+T细胞存活的活性、促进Bcl-2表达的活性或促进Bcl-2基因座区组蛋白乙酰化水平的活性。

本领域技术人员应当理解，本文的β抑制蛋白1的范围不仅包括β-抑制蛋白1的全长序列，而且还包括了所述蛋白的各种变异形式、片段、衍生物或类似物，只要所述变异形式、片段、衍生物或类似物具有上述相同或相似的活性。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代的蛋白，或是与其相同(同源)或基本上相同(同源)且有相同或相似生物活性或功能的多肽，例如有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。这些类似物或衍生物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。

在一个较佳的实施方案中，可抑制β抑制蛋白1活性的物质是特异性结合β抑制蛋白1从而抑制其活性的物质，例如，对β抑制蛋白1有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指该抗体能结合于β抑制蛋白1但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。该抗体的范围内还包括了抗体的各种修饰形式、及其片段如Fab′或(Fab)₂片段等。所述抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术制备，如免疫动物产生多克隆抗体或杂交瘤生产单克隆抗体。另外，除抗体外的其它已知能和β抑制蛋白1特异性结合的其受体、配体也在所述“可抑制β抑制蛋白1活性的物质”的范围内。

在另一实施方案中，可抑制β抑制蛋白1活性的物质是本领域技术人员已知的具有此抑制效果的化合物，例如，放线菌素、放线菌酮或其药学上可接受的盐、衍生物或类似物。本领域技术人员也完全能够根据本发明所述的筛选方法来从候选物中选出其它可抑制β抑制蛋白1活性的物质。另外，已知一些G蛋白偶联受体的激动剂也能通过影响βarr1在细胞核和细胞质的分布从而间接影响βarr1的活性。这些G蛋白偶联受体的激动剂例如包括，但不局限于，如δ阿片受体和κ阿片受体的激动剂等。因此，这些G蛋白偶联受体的激动剂也包括在本发明的范围内。

“抑制编码β抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的那些物质”主要指的是在基因水平上通过间接作用于β抑制蛋白1的基因来影响β抑制蛋白1的表达，从而抑制其活性的那些物质，通常是核酸类物质。

在一个实施方案中，这些物质例是β抑制蛋白1的编码基因(基因号：NM-004041)的全部或部分序列的反义序列。该反义序列的长度通常可在5-200、较佳为10-100、更佳为20-50个碱基之间。此种反义核酸分子可用化学方法来合成，采用的是天然的核苷酸或设计成可提高分子生物稳定性或增高与β抑制蛋白1mRNA或β抑制蛋白1基因形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸。该反义序列也可用生物学方法制得，用表达载体以重组质粒，嗜菌粒或减毒病毒形式引入细胞内，在该细胞内反义序列在高度有效的调节区之控制下产生，其活性可由引入载体的细胞类型决定。

在另一实施方案中，抑制编码β抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的那些物质是小干扰RNA(siRNA)。RNA干扰是一种新近发现的体内基因沉默现象。小干扰RNA是外源性双链RNA的加工产物，其在细胞内能介导RNA干扰效应，识别特异性mRNA，沉默同源基因表达。在针对哺乳动物细胞设计siRNA时，较为有效的siRNA具有20-30个碱基、更佳为21-25个碱基大小，其3‘端宜有两个突出碱基。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。本领域技术人员通常可采用以下几个步骤来设计siRNA：(1)选择siRNA靶位点；(2)序列同源性分析；(3)设计阴性对照。设计出的siRNA也同样可以用化学合成方法或体外转录法来合成。关于β抑制蛋白1siRNA的构建的具体例子，可以参见Parruti，G.等人，J Biol Chem 268，9753-61(1993)。

在还有一个实施方案中，抑制编码β抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的那些物质是核酶。核酶是能够特异性地与靶RNA分子配对，继而在特定的位点切割后者，中止相应蛋白产生的核糖核酸分子。目前已知有七大类自然存在的核酶，即一类内含子、二类内含子、RNase P的RNA亚基、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒核酶、和VS核酶。在核酶家族中，锤头状核酶为最小(长约40-50个核苷酸)，有结构简单和设计简易的优点。例如，可直接用化学方法合成DNA序列，然后利用DNA重组技术连接到重组质粒中转录制得所述核酶，然后在试管内对所设计的核酶对RNA底物分子的剪切特异性和效率的验证。另外，可用PCR技术来扩增RNA(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)。将核酶的基因克隆到质粒、腺病毒、或逆转录病毒载体中。

在获得上述抑制编码β抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的核酸序列(如反义序列、核酶或小干扰RNA)后，就可用常规技术例如转化、转染、感染及物理技术(如电穿孔及微量注射)将其引入对象细胞内。另外也可用化学方法例如DNA共同沉淀及掺入脂质体的方法或是以气溶胶或灌洗形式来输送。用来转移核酸分子的适当的病毒载体、质粒或克隆载体为本领域所知。适当的病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体及DNA病毒载体等。这些技术对于本领域技术人员而言均是熟知的。

另外，在本发明中，也可考虑通过基因变换方法(如用等位基因置换、插入失活及缺失形成进行定向基因诱变)来干扰编码β抑制蛋白1的基因的转录，从而选择性地抑制β抑制蛋白1的活性。

(II)用途

本发明的β抑制蛋白1的抑制剂可用于治疗对象体内与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。本发明适用的哺乳动物对象包括人、家畜和农场动物、非人灵长类、以及动物园、运动场动物，或宠物，如狗、马、猫、奶牛等。在一个较佳的实施方案中，所述哺乳动物是人。

本文所述的“CD4⁺T细胞凋亡异常”的含义是，与正常对象的CD4⁺T细胞相比，CD4⁺T细胞凋亡水平降低、存活能力提高。所述CD4⁺T细胞凋亡尤指外周血中的发生CD4⁺T细胞凋亡。

与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病具体包括自身免疫疾病、淋巴细胞增多症。自身免疫病是指机体所产生的自身抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍而引起的疾病。导致自身免疫疾病的根本机制是免疫耐受性的终止和破坏。自身免疫性疾病往往同时具有以下特点：①患者血液中可测行高效价自身抗体和(或)自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞。②自身抗体和(或)自身致敏淋巴细胞作用于靶抗原所在组织、细胞，造成相应组织器官的病理性损伤和功能障碍。③在动物实验中可复制出相似的病理模型，并能通过患者的血清或淋巴细胞使疾病被动转移。④病情转归与自身免疫反应强度密切相关。⑤除一些病因明了的继发性自免疫性疾病可随原发疾病的治愈而消退外，多数原因不明的自身免疫常呈反复发作和慢性迁延。

适合用本发明来进行治疗或预防的自身免疫疾病包括，但不局限于，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、I型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症等。

在较佳的实施方案中，适合用本发明来进行治疗或预防的自身免疫疾病包括脱髓鞘疾病、多发性硬化或I型糖尿病。

(III)药物组合物

本发明还提供了一种用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的β抑制蛋白1的抑制剂作为活性组分，以及药学上可接受的载体，其中所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质。

本发明的药物组合物含有本文详细描述的抑制β抑制蛋白1的物质或用本发明的方法鉴定出的物质。该活性物质可以单独给予，但是通常是和药物载体等一同给予，这可根据所选的给药途径和标准医药实践来选择。给药剂量应当是“有效量”，即治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。给药剂量随用途及已知因素(例如特定物质的药效学特性及其给药方式及途径；接受者的年龄、健康情况及体重；病情性质及程度；伴随治疗种类，治疗频度及期望效果)而异。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体或赋形剂，其应当与本发明的β抑制蛋白1的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或赋形剂或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。另外，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

本文详细描述的或用本发明方法鉴定的一种以上的物质还可以和其它药剂联合使用。它们可以作为单独分开的剂型同时或并行给药，或作为各组分治疗剂的物理组合物以单独或组合的剂型给药。本发明的物质可经口、经外用、直肠、胃肠外、局部、吸入方式使用。该物质也可经由控释或缓释胶囊系统及其它药物输送技术给药。

例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，可将活性物质与药学上可接受的无毒、口服、惰性载体(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；对于液体剂型的经口给药，口服活性物质可与任一种药学上可接受的口服、无毒惰性载体(如乙醇，甘油，水等)合并。如果需要，也可将合适的粘合剂，润滑剂，崩解剂，及着色剂搀混于剂型中。合适的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类如葡葡糖或β-乳糖，玉米增甜剂，天然及合成的树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡类等。可用于这些剂型的合适的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂的例子包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄原胶等。本发明所述的药物组合物也可以脂质体输药系统形式给药，例如小的单层囊，大的单层囊及多层囊。脂质体可由各种磷脂(如胆固醇，硬脂基胺或磷脂酰胆碱)形成。本发明详细描述的以及用本发明方法鉴别的物质也可与可溶性聚合物偶合，这些聚合物为可定向的药物载体。这些聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或被棕榈酰基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。这些物质也可与用于控制药物释放的可生物降解的聚合物偶合。合适的聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及聚乙醇酸的共聚物，聚ε-己内酯，聚羟丁酸，聚原酸酯类，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类，水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。合适的药物载体及药物的制法在《雷明顿医药科学》MackPublishing Company中有所描述，这是本领域的标准参考文献。

(IV)鉴定方法

本发明另一方面还提供了一种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物的方法，该方法包括：

a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；

b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；

c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例

材料和方法

1.病人样品

在该研究中，明确诊断是复发缓和型多发性硬化的病人志愿者来自复旦大学华山医院和交通大学瑞金医院神经内科门诊部。按照当地医院条例经过病人的知情同意以后，抽取病人的外周血液样品。此研究中的健康人志愿者来自中科院上海分院生化细胞所的员工或学生，部分来自上海市血液中心。他们如前所述也经过知情同意。

2.人T细胞样品制备

T细胞用鼠源抗人的抗CD4的抗体标记后，用山羊抗鼠IgG磁珠，分离柱以及AutoMACS分离装置进行分离纯化，通过FACS检验得到纯度大于90％的CD4⁺T细胞。

3.小鼠

C57BL/6小鼠是从中科院上海实验动物中心购得。具有C57BL/6背景的βarr1^-/-和βarr2^-/-小鼠是由美国杜克大学医学中心Robert J.Lefkowitz博士惠赠。βarr1tg小鼠如：Rapid xenograft tumor growth in beta-arrestinl transgenic mice due to theelevation of tumor angiogenesis Lin Zoul，2，Rongxi Yangl，3and Gang Peil描述产生，并且和C57BL/6回交9代以上。动物的饲养和操作是按照中科院上海生命科学院实验动物委员会的条例进行。所用的动物在无病原体的环境下饲养，并且在实验之前进行基因组的鉴定。

4.抗体、试剂、质粒和干扰siRNA

鼠源的抗Bcl-2和Bax的抗体，PE偶联的抗鼠CD4、CD8、B220、和V_β ⁶的抗体以及FITC偶联的抗鼠CD4、CD8、CD3和V_β ⁸的抗体购于BD Biosciences公司。抗βarrs(A1CT)的兔源多克隆抗体由Robert J.Lefkowitz博士惠赠。抗乙酰化组蛋白H4和组蛋白H3的抗体购自Upstate Biotechnology公司。IRDyeTM800CW偶联的抗鼠IgG和抗兔IgG纯化的抗体是从Rockland公司购得。抗肌动蛋白的抗体和试剂放线菌素D以及地塞米松是从Sigma公司购得。抗Erk和抗ser217/221磷酸化的Erk的抗体是Cell Signaling公司的产品，而抗Akt和抗ser473磷酸化的Akt的抗体是从上海KANGCHEN公司购得。SEB是由北京Biotinge Biomedicine公司生产。编码βgal，HA-βarr1(如前所述)(29)、HA-βarr2、βarr1Q394L的质粒是按照先前描述构建的(32)。pBS/U6/βarr1 siRNA、pBS/U6/βarr2 siRNA和pBS/U6/非特异siRNA的质粒是如前描述构建的(29)。p300野生型和其活性区突变体(C/H1缺失)质粒是从Upstate公司购得。人MBP小肽是由安德生癌症中心小肽中心实验室合成并纯化的。小肽的纯度大于90％。

5.流式细胞分析

细胞重悬在含有1％BSA的PBS缓冲液中。用相应细胞表面抗原的荧光抗体如：CD4、CD8、CD3、B220、TCR V_β ⁸和V_β ⁶等抗体在推荐的缓冲液中4度孵育1小时。标记了的细胞经过洗涤后用BD公司的FACSAria仪器分析。

6.细胞纯化、激活和培养

小鼠的脾脏细胞用纯化的兔源抗鼠的CD4抗体或兔源抗鼠的CD8抗体标记后，用山羊抗兔的IgG磁珠，分离柱以及AutoMACS分离装置进行分离纯化，通过FACS检验，得T细胞的纯度大于95％。分离纯化后的T细胞在包被有大颊鼠源抗鼠的CD3(CD3ε链)单克隆抗体培养皿中和CD28单克隆抗体共同刺激下激活。培养用的是RPMI1640培液加上10％的胎牛血清，2mM L-glutamine，5mM 2-ME，和100单位/ml的青霉素。髓磷脂基质蛋白(MBP)特异的CD4⁺T细胞是培养在含有20μg/ml的MBP小肽(33)和100U/ml的人重组IL-2的RPMI1640培养液中。

7.逆转录和实时定量PCR

实验中所有的总RNA都按照Invitrogen使用指南用TRIzol提取。在逆转录的实验中，使用了oligo(dT)引物和superscript II系统。所有定量的基因转录实验都由qPCR完成。使用的qPCR系统主要包括：Brilliant SYBR Green QPCR Master MIX和一个Light Cycler检测仪(Stratagene)。使用的引物有：鼠Bcl-2-sense，5’-TTC TCCTTC CAG CCT GAG AGC AA-3’(SEQ ID NO：1)，antisense，5’-ATG ACC CCA CCGAAC TCA AAG-3(SEQ ID NO：2)’；鼠Bax-sense，5’-AGG ATG CGT CCA CCAAG-3’(SEQ ID NO：3)，antisense，5’-AAG TAG AAG AGG GCA ACC AC-3’(SEQ IDNO：4)；鼠HPRT-sense，5’-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G-3’(SEQ IDNO：5)，antisense，5’-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3’(SEQ ID NO：6)；鼠HPRT作为cDNA输入对照；人HPRT-sense，5’-CCT GCT GGA TTA CAT CAA AGCACT G-3’(SEQ ID NO：7)，antisense，5’-TCC AAC ACT TCG TGG GGT CCT-3’(SEQ ID NO：8)；人Bax-sense 5’-ATC CAG GAT CGA GCA GGG CG-3’(SEQ ID NO：9)，antisense，5’-ACT CGC TCA GCT TCT TGG TG-3’(SEQ ID NO：10)；人Bim-sense，5’-CAA TGG CTA ACT GGG ACT A-3’(SEQ ID NO：11)，antisense，5’-TCTTCG GCT GCT TGG TAA-3’(SEQ ID NO：12)；人Bad-sense，5’-CCA GAG TTTGAG CCG AGT GAG-3’(SEQ ID NO：13)，antisense，5’-GCT GTG CTG CCC AGAGGT T-3’(SEQ ID NO：14)；人Bcl-xl-sense，5’-CAA CCC ATC CTG GCA CCT-3’(SEQ ID NO：15)，antisense，5’-CGA TCC GAC TCA CCA ATA CC-3’(SEQ ID NO：16)；人βarr1-sense，5’-GGG ACG CGA GTG TTC AAG AA-3’(SEQ ID NO：17)，antisense，5’-ACA AAC AGG TCC TTG CGA AAG-3’(SEQ ID NO：18)。人Bcl-2的转录水平使用Tagman探针来完成的：Bcl-2-sense，5’-CCT GTG GAT GAC TGA GTACCT GAA-3’(SEQ ID NO：19)，antisense，5’-CAG CCA GGA GAA ATC AAA CAGA-3’(SEQ ID NO：20)，Taqman探针，5’-FAGG ATA ACG GAG GCT GGG ATG CCTTTP-3’(SEQ ID NO：21)。

8.EAE的诱导和评估

在EAE诱导中使用的MOG抗原35-55位的氨基酸残基序列为：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys。该肽段是从BioAsia Biotechnology公司购得，其纯度大于95％。急性的EAE诱导是这样进行的：第一天，皮下注射含有300μg MOG肽段和5mg/ml热灭活的肺结核分支杆菌H37Ra肽链(BD公司生产)的CFA，以及尾静脉注射200ng/小鼠的百日咳毒素。第三天，再次尾静脉注射200ng/小鼠的百日咳毒素。诱导了EAE的小鼠每天进行称量和病情观察。按照发病的严重程度对小鼠进行打分，具体是：0，没有任何病情的症状；1，尾巴无力；2，一条或两条后肢轻瘫；3，两后肢瘫痪；4，前肢轻瘫；5，垂死或死亡。

9.细胞存活分析

T细胞养在无血清的RPMI 1640培养基中。按图上显示的时间点，用膜联蛋白-V-FLUOS标记试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)通过排除PI和膜联蛋白(annxin)V阳性的细胞得到存活细胞的百分比。在检测GFP阳性细胞存活的实验中，单通过排除PI阳性的细胞得到存活细胞的百分比。

10.组织化学观察

从诱导20天的EAE小鼠中取出组织，4％福尔马林固定，石蜡包埋。然后用Luxol fast blue或者H&E进行染色。最后，用光学显微镜进行观察照相。共有3-4只小鼠的脊髓，每只小鼠取3段样品进行脱髓鞘程度和感染程度的定量检测(34)。

11.染色质免疫共沉淀

染色质免疫共沉淀(CHIP)是根据Upstate生物公司的CHIP试剂盒进行的。在上样中和免疫沉淀复合物中特异基因启动子区的序列是通过qPCR来检测的。特异基因启动子区引物的设计选在转录起始位点上游1000到下游500的碱基区域内。所得到的结果是由沉淀中的量用上样量规一化得到。使用的基因启动子区和Bcl-2基因位点的引物有：鼠Bcl-2启动子：sense，5’-GGC AAA CCC TCC CCC ACC ACCTC-3’(SEQ ID NO：22)，antisense，5’-CCA CCG GAC CGC TTC AGA CCT C-3’(SEQID NO：23)；鼠Bax启动子，sense，5’-GGG GAA ACA ACC AAC TCT GG-3’(SEQID NO：24)，antisense 5’-CAT CAC TGC CGC TGC CTC T-3’(SEQ ID NO：25)；鼠Bcl-2基因位点u25,000sense，5’-GCT GTT TAT CAG TTA GTG GGT C-3’(SEQ IDNO：26)，antisense 5’-GGG TCA GAA GTG GGA GTG-3’(SEQ ID NO：27)；u20,000sense，5’-TGC CAA GGT TAG CAG GAC-3’(SEQ ID NO：28)，antisense，5’-CCAGAG GAC AAA TGA GGG-3’(SEQ ID NO：29)；u15,000sense，5’-CAT TTG TCTGCC CTA TCT-3’(SEQ ID NO：30)，antisense，5’-TTA ACT GGG AAC ACC TCA-3’(SEQ ID NO：31)；u10,000sense，5’-AGT GCT TAT CGC TCT TCC-3’(SEQ ID NO：32)，antisense，5’-CTC CAA ACC TGA CCC TCT-3’(SEQ ID NO：33)；u5,000sense，5’-GCA GCA AAC AAT CTT CAT-3’(SEQ ID NO：34)，antisense，5’-ACA CCA ATACCA ACC CTA-3’(SEQ ID NO：35)；50,000sense，5’-CCT TCT CAA TCA GCC AGCAT-3’(SEQ ID NO：36)，antisense，5’-AAG CAA GCC TCC TCA CCC-3’(SEQ ID NO：37)；100,000sense，5’-CAC TCA GAG AAG AAT TCA CAC AGA A-3’(SEQ ID NO：38)，antisense 5’-TTC TGT GTG AAT TCT TCT CTG AGT G-3’(SEQ ID NO：39)；150,000sense，5’-CCC CAG AAC TCA TGT CTC-3’(SEQ ID NO：40)，antisense，5’-TTC CAA TGC TCT CCC AAA-3’(SEQ ID NO：41)；175,000sense，5’-CAG AGTGAG TAT TGG AGG AG-3’(SEQ ID NO：42)，antisense，5’-AAA GAC AGT GGTGGG AAA-3’(SEQ ID NO：43)；176,000sense，5’-TGA CCC TGA GGA GAT GGA-3’(SEQ ID NO：44)，antisense，5’-GGT ATG ACC TGG GCT TCG-3’(SEQ ID NO：45)；181,000sense，5’-AGG AGC AAA CTC AGG AAT-3’(SEQ ID NO：46)，antisense，5’-AGT CAC AAA GAT GGC AGA-3’(SEQ ID NO：47)；186,000sense，5’-CAG ACGCAC CAC TGA TTT-3’(SEQ ID NO：48)，antisense，5’-AGC AGC CAG CAG ACTTAC-3’(SEQ ID NO：49)；191,000sense，5’-TAC GAG CGA TAC ATA CAA C-3’(SEQ ID NO：50)，antisense，5’-CTA GAG CCA GTC CTT CTT-3’(SEQ ID NO：51).人启动子区：Bcl-2sense，5’-GCG ACT CCT GAT TCA TTG-3’(SEQ ID NO：52)，antisense 5’-AGG TGC GTT TCC CTG TA-3’(SEQ ID NO：53)；Bax sense，5’-TATCGG GAG ATG CTC ATT GGA-3’(SEQ ID NO：54)，antisense，5’-CCC TCG GGAGGT TTG GTC-3’(SEQ ID NO：55)。

12.免疫印迹

在免疫印迹实验中，蛋白条带通过增强的化学发光方法检测。在一些实验中，采用了IRDye800CW偶联二抗荧光定量的方法。这些实验中的图片由Odyssey远红外图像系统(Li-Cor Bioscience公司)取得。

13.细胞增殖实验

在细胞增殖实验中，5×10⁵的鼠脾脏细胞培养在含有MOG或不含MOG的DMEM完全培养基中72小时。在进行细胞分析前16-18个小时的时候，加入1μCi的[3H]胸苷。DNA中掺入的[3H]胸苷用β板检测仪进行检测。

14.细胞系

Jurkat和HEK293细胞是从American Type Culture Collection公司购得，并分别在RPMI1640或者MEM(Gibco-BRL公司)培养液中进行培养。Jurkat细胞用Amaxa的转染试剂盒进行转染，而HEK293细胞用磷酸钙的方法进行转染。

15.细胞因子的检测

2×10⁵的CD4⁺T细胞如前所述用CD3和CD28抗体激活24小时，细胞上清收集后根据PIERCE公司的使用指南用IL-2ELISA试剂盒进行检测。同时，用纯化并已知浓度的重组鼠IL-2做定量用的标准线。

16.细胞核组分的提取

细胞核组分按照以前的描述经过一些改动进行提取(27)。具体地：用各种方法处理后的细胞洗涤后重悬于400μl的低渗缓冲液中，冰浴10分钟。后加3μl 10％的NP-40混匀，继续冰浴5分钟。短暂离心后，所得沉淀即为细胞核组分粗提物。该组分经洗涤，重悬于低渗缓冲液中4度摇晃1小时。再经离心，得到的上清即为细胞核组分。

17.报告基因实验

HEK293细胞中共转染Clontech公司的pNF-kappa-B-Luc或pCREB-TA-Luc，和pRL-TK，以及一些图中所显示的质粒。转染36小时以后，用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶的活性。用10ng/ml毛喉素(FK)处理和10ng/ml rhTNF-α处理的细胞作为实验的阳性对照。

18.数据处理和统计

定量实验数据用平均数±s.e.m表示。用one-way ANOVA检测数据间是否有统计学差异，然后再用Bonferroni post-hoc对多组数据或tow-tailed Student’s t检测两组数据间的显著性差异。

实验结果

1.βarr1正调节外周血CD4⁺T细胞的动态平衡和存活

在研究βarr1敲除(βarr1^-/-)小鼠免疫系统的时候发现：当小鼠在13周以后外周淋巴系统中CD4⁺T细胞的数量明显变少(图1A和2B)。CD4⁺T细胞的数量是由胸腺中进入的CD4⁺T细胞和外周CD4⁺T细胞的凋亡来维持的。发明人检测了βarr1^-/-小鼠和野生型(wt)小鼠中胸腺细胞CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的数量，发现并没有改变(图2C)。随后，发明人检测了外周血CD4⁺T细胞的凋亡。从βarr1^-/-小鼠，βarr1转基因(βarr1tg)小鼠和wt小鼠脾脏分离得到CD4⁺T细胞，用抗-CD3和抗-CD28抗体激活或者不激活，然后在无血清也无细胞因子的培养基中培养。图1B和1C显示，激活了的βarr1tg CD4⁺T细胞生存能力比其野生型明显增加，而βarr1^-/-的CD4⁺T细胞无论是在其幼稚还是激活状态下都明显比其野生型对凋亡更敏感。这些数据表明：βarr1促进CD4⁺T细胞体外的生存能力。

为了进一步表明体内的情况，发明人用SEB来注射小鼠。SEB在体内能特异地激活CD4⁺V_β8.1/2T细胞而对CD4⁺V_β6.1T细胞没有影响(16)。如图1D和1E所示：各基因型的小鼠中，CD4⁺V_β8.1/2T细胞的数量在SEB注射三天后显著增加，而在注射七天后有明显的下降。在此后的几天中观察到：βarr1tg的CD4⁺V_β8.1/2T细胞凋亡明显少于wt的，而βarr1^-/-小鼠的CD4⁺V_β8.1/2T细胞凋亡比wt增多。这些结果表明：在体内βarr1也能促进CD4⁺T细胞的存活。IL-2是促进幼稚和激活的CD4⁺T细胞的一个重要细胞因子(55-57)。当CD4⁺T细胞在体外激活后，它们产生大量的IL-2(1)。然而，如图3A所示：βarr1^-/-CD4⁺T细胞产生IL-2的能力比其wt要略强。因此，βarr1不可能是通过影响CD4⁺T细胞IL-2的产生来调节这些细胞存活的。

2.βarr1促进Bcl-2的表达

进一步研究了βarr1促进CD4⁺T细胞存活可能的分子机制。考虑到：Akt(38)和Erk(39)的激活能促进CD4⁺T细胞存活，并且βarr1本身能正调节Akt和Erk的活性(20)，因此，研究了是否是由于βarr1上调Akt或Erk的活性从而促进CD4⁺T细胞的存活能力。βarr1^-/-和wt的CD4⁺T细胞如前所述那样在体外激活，用Akt和Erk的磷酸化抗体来检测它们的活性。如图3B所示，在幼稚和激活了的CD4⁺T细胞中，βarr1^-/-并没有影响Erk的磷酸化水平；而Akt的磷酸化水平在激活状态下的CD4⁺T细胞中有所下降。因为，βarr1能同时促进幼稚和激活了的CD4⁺T细胞的存活，而βarr1并没有影响幼稚CD4⁺T细胞中Akt和Erk的磷酸化水平，所以，推测βarr1促进CD4⁺T细胞的存活还有其他的机制。Affymetrix基因芯片数据表明：通过siRNA抑制βarr1的表达能降低抗凋亡分子Bcl-2的表达，但并不影响Bcl-2家族其他蛋白的表达，如：Bim，Bax和Bcl-xl等。在Jurkat T细胞中进一步验证了这些结果(图4)，并且发现是核内的βarr1调控着Bcl-2的表达，因为βarr2和βarr1Q394L(βarr1不进核的突变体)(32，40)并没有此功能。

Bcl-2是调节幼稚和激活T细胞存活的一个重要分子(1，16)，因此进一步检测了在CD4⁺T细胞中βarr1和Bcl-2的表达情况。CD4⁺T细胞如上述方法激活以后，βarr1和Bcl-2的蛋白水平在前两天中逐步下降，而在激活后第三天升高并在随后保持该水平(图5A)。当进一步在激活40到64小时这段时间内检测βarr1和Bcl-2的表达情况，发现βarr1蛋白水平的升高早于Bcl-2(图5A)。是不是在CD4⁺T细胞中，βarr1调节着Bcl-2的表达呢？发明人同时激活βarr1tg小鼠和wt的CD4⁺T细胞，并检测βarr1和Bcl-2的mRNA和蛋白水平。结果发现：βarr1tg小鼠来源的CD4⁺T细胞在激活48小时后βarr1的水平明显比其野生型高，和此一致的是Bcl-2的mRNA和蛋白水平也在该时间有显著升高(图5B)。当βarr1^-/-和wt小鼠来源的CD4⁺T细胞在体外激活后，Bcl-2的mRNA和蛋白水平在激活后没有变化并保持在野生型里最低的水平(图5C)。在实验中发现，βarr2的蛋白水平也在CD4⁺T细胞激活过程中有跟βarr1类似的变化。发明人在βarr2^-/-的CD4⁺T细胞检测了Bcl-2的mRNA和蛋白水平，发现Bcl-2表达正常(图5D)。这些结果表明：βarr1而不是βarr2调节着CD4⁺T细胞中Bcl-2的表达，这可能是导致βarr1^-/-和βarr1tg的CD4⁺T细胞存活能力异常的原因，因为这跟Bcl-2敲除和转基因的CD4⁺T细胞存活能力很类似(18)。

因为在CD4⁺T细胞激活过程中Bcl-2的mRNA和蛋白水平同时变化，所以发明人用Jurkat T细胞来证明：βarr1是否通过影响Bcl-2的转录来调节它的表达。和图4一致(图6A)，在Jurkat T细胞中过表达或用siRNA下调βarr1能促进或抑制Bcl-2的mRNA和蛋白水平。进一步，发明人用转录抑制剂和蛋白合成抑制剂，发现它们都能有效地抑制βarr1对Bcl-2表达的上调(图6B和6C)。由此可见，βarr1是通过促进Bcl-2的转录来调节它的表达的。有报道发现CREB(41)和NF-kappa B(42)是影响Bcl-2表达的转录因子。但发明人发现βarr1并不能在报告基因系统中影响CREB和NF-kappa B报告基因的活性(图6D和6E)。由此可见，βarr1可能是通过其他方式来调控Bcl-2表达的。

3.βarr1促进Bcl-2基因座区组蛋白乙酰化水平

另一条βarr1调控基因表达的方式是通过上调特异基因启动子区的组蛋白H4的乙酰化水平(27)。在CD4⁺T细胞激活过程中，发明人发现Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平的变化模式和Bcl-2表达很相似(图7A)。Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平在CD4⁺T细胞激活后逐渐下降，到48小时的时候达到最低，随后到72小时的时候又上升。而作为组蛋白H4乙酰化水平的对照蛋白H3乙酰化水平并没有改变。进一步发明人发现，和βarr1对Bcl-2表达影响一致，βarr1也影响着Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平。在βarr1tg CD4⁺T细胞激活48时，Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平相对于野生型有显著的升高(图7B)。而当βarr1^-/-CD4⁺T细胞激活后，Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平一直保持在相当于野生型中最低的水平(图7C)。进一步，发明人发现βarr1影响着Bcl-2基因座区从转录起始点上游10,000bp到下游186,000bp染色体区的组蛋白H4乙酰化水平(图7D)。这些实验表明：βarr1很可能是通过促进Bcl-2基因座区组蛋白H4乙酰化水平来上调Bcl-2基因表达的。

4.p300在βarr1上调Bcl-2表达中的是必需的

细胞内组蛋白的乙酰化水平是由组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰化酶调控着的。以前的研究发现：βarr1促进组蛋白H4的乙酰化水平是通过结合组蛋白乙酰化酶p300(43)并把它募集到特异基因的启动子区实现的(27)。因此，发明人检测了p300在βarr1上调Bcl-2表达中的作用。和前面结果一致的是：在Jurkat细胞中，βarr1而不是βarr2或βarr1Q394L促进Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平(图8A)。进一步，发明人发现p300也能促进Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平和mRNA水平，而且这种促进能被共表达βarr1进一步加强而被共表达βarr1 siRNA所抑制(图8C和8E)。p300DN(p300的无活性突变体)能显著降低Bcl-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平和Bcl-2mRNA水平，并也能阻断βarr1对其的促进作用(图8C和8E)。这些结果显示p300在βarr1介导的Bcl-2基因启动子区H4乙酰化水平的升高和Bcl-2转录的增加中起重要作用。

5.βarr1在自身免疫病多发性硬化的作用

信号调控分子对CD4⁺T细胞凋亡的精细调控能使CD4⁺T细胞不至于产生自身免疫性。考虑到βarr1在CD4⁺T细胞凋亡调控中的重要作用，发明人进一步研究其是否会影响自身免疫。小鼠的EAE模型是多发性硬化(MS)的一个很好的动物模型(44)。在该模型中，人们认为CD4⁺T细胞起了主导作用并且它的发病机理比较清楚。发明人用MOG35-55来免疫三种不同基因型的小鼠，诱导其产生EAE。随后观测20天如图9A所示，发现βarr1^-/-小鼠的发病起始点比wt小鼠有显著后延(wt：9.7±2.9天vs.βarr1^-/-：16.3±3.0天)并且病的严重程度也显著下降(最大平均病情评分wt：3.2±0.27vs.βarr1^-/-：1.4±0.4)。而在βarr1tg小鼠中，虽然发病起始点跟wt小鼠没有显著差别(wt：9.7±2.9天vs.βarr1tg：8.7±0.8天)，但是病的严重程度却明显增加(最大平均病情评分βarr1tg：4.2±0.3vs.wt：3.2±0.2)。与此结果一致的是，当发明人检测小鼠脊髓病变程度的时候发现，βarr1^-/-小鼠的炎性细胞侵染和脊髓脱髓鞘程度较轻；而βarr1tg小鼠却刚好相反(图9B)。这些数据表明βarr1在这个EAE模型中起着正调节的作用。因为，βarr1能促进CD4⁺T细胞的存活，是否该机制参与到βarr1对自身免疫的正调控中了呢？发明人首先用MOG35-55来重新刺激EAE小鼠的脾淋巴细胞，发现βarr1tg小鼠脾淋巴细胞的增殖明显高于野生型的，而βarr1^{- /-}小鼠的则较低(图9C)。进一步，发明人用MOG35-55重刺激EAE小鼠脾淋巴细胞中纯化得到的MOG特异的CD4⁺T细胞，并观察在细胞因子胁迫下这些CD4⁺T细胞的存活。和图1B和1C一致的是：从βarr1tg小鼠来的MOG特异的CD4⁺T细胞明显比野生型的存活能力强，而从βarr1^-/-小鼠中来的CD4⁺T细胞存活能力则较差(图9D)。这些结果表明βarr1在EAE模型中起着正调节的作用，这可能是由于促进CD4⁺T细胞的存活能力来实现的。

几年前，Anne vroon和他的同事们发现在小鼠诱导EAE以后，βarr1在外周血中的水平显著升高了(45)。发明人进一步发现从EAE小鼠中来的CD4⁺T细胞中的βarr1的蛋白水平有显著升高(图11A)。鉴于这些发现，发明人检测了βarr1在多发性硬化病人CD4⁺T细胞中的表达，如图10A和10B所示：多发性硬化病人CD4⁺T细胞中βarr1和Bcl-2的转录水平明显高于健康人。进一步，用带有βarr1 siRNA的逆转录病毒感染从多发性硬化病人来源的MBP特异的CD4⁺T细胞(46)，发现Bcl-2的表达显著下调了(图10C)。而当这些MBP特异的CD4⁺T细胞被感染带有βarr1siRNA的逆转录病毒后经受细胞因子胁迫时，这些细胞明显比感染了带有空载体的逆转录病毒更易凋亡(图10D)。这些结果表明，在多发性硬化病人中，针对自身抗原的CD4⁺T细胞有较高的βarr1表达水平，这可能促进了这些细胞的存活能力从而使它们逃脱机体的监管机制促进多发性硬化的发展。

讨论

在哺乳动物中，免疫系统是体内最动态的系统之一。而免疫系统中免疫细胞的调亡受很多胞外和胞内信号的调控以维持其正常的生理功能。βarr1是一个具有多种功能的信号分子，参与很多信号通路的调节。此外，它还具有直接进核调控特异基因转录的能力。发明人在本发明中发现，βarr1能特异地调节CD4⁺T细胞的存活和动态平衡，从而影响机体的获得性免疫应答。虽然，在激活的CD4⁺T细胞中Akt的活性受到一定抑制，但是，βarr1影响CD4⁺T细胞存活的这个能力主要还是通过其核内功能实现的。在无论是幼稚的还是激活了的CD4⁺T细胞核内，βarr1上调Bcl-2基因启动子区组蛋白H4乙酰化的水平，从而促进Bcl-2基因的表达。进一步的研究发现：βarr1在自身免疫引起的脱髓鞘疾病和链唑霉素引起的I型糖尿病中起着重要的作用。在自身免疫引起的脱髓鞘疾病中，那些特异致脑炎的CD4⁺T细胞中βarr1的高表达促进这些细胞在体内的存活能力。因此，发明人的结果表明，βarr1在CD4⁺T细胞存活以及人和鼠的自身免疫疾病中起着重要的调节作用。

细致的机制分析发现：βarr1在CD4⁺T细胞中对Bcl-2表达的调控是通过影响表观遗传修饰来实现的。Bcl-2是通过调控线粒体膜的完整性和存在于线粒体中促调亡蛋白的释放来调节细胞存活的(12)。在T细胞中，Bcl-2必须维持在适当的水平，否则就会引起T细胞动态平衡的打破和免疫应答的混乱。然而到目前为止，对于Bcl-2在T细胞中的调控机制，人们还不是很清楚。发明人发现不管在幼稚的还是激活的CD4⁺T细胞中，βarr1促进Bcl-2基因区组蛋白乙酰化的水平和Bcl-2基因的转录水平。也发现βarr1在CD4⁺T细胞中的这种功能在人和鼠中是保守的。因此，这些实验在揭示了一个新颖的调控CD4⁺T细胞存活的机制以外，还发现了一种调节Bcl-2基因表达的表观遗传机制。而这种机制以前是没有被报道过的。

在这个研究中，βarr1促进T细胞的存活功能主要针对于外周血的CD4⁺而不是CD8⁺T细胞或是胸腺T细胞。在胸腺T细胞中，如图2A中显示的那样：βarr1的表达水平明显要低于其在脾脏细胞或是淋巴结细胞的表达水平。这种表达水平的差异可能是导致βarr1在胸腺T细胞中作用小的原因。然而，从图11B中可以看到，βarr1表达水平在CD4⁺和CD8⁺T细胞中的差异不是很明显。但是，βarr1对CD4⁺和CD8⁺T细胞存活的影响却有显著的差异。和野生型细胞比较，βarr1^-/-CD4⁺T细胞的存活能力显著降低，而βarr1^-/-CD8⁺T细胞却没有明显差别。细致的机制显示：是核内的βarr1上调了Bcl-2基因区组蛋白的乙酰化水平和其转录水平，因为过表达βarr1的不进核内突变体βarr1Q394L并不影响Bcl-2的表达。因此，发明人猜想是否βarr1在CD4⁺和CD8⁺T细胞的亚细胞定位有区别。如图11C和11D所示，不论在幼稚的还是激活的CD4⁺T细胞中，βarr1在核内的表达水平都比CD8⁺T细胞的高。因此，可能是βarr1在CD4⁺和CD8⁺T细胞中亚细胞水平分布的不一样导致了βarr1对CD4⁺和CD8⁺T细胞存活影响的不一样。

以前的研究表明：当GPCR激活以后，βarr1和βarr2被招募到细胞膜上；在那里它们和磷酸化的GPCR结合引起受体的内吞和信号的终止(47)。然而，现在越来越多的证据表明这两个βarr在功能上和受体的特异性上有很多差别。在发明人这个研究中，βarr1而不是βarr2促进Bcl-2基因区的乙酰化水平和其转录水平。发明人的这个结果和先前的结论是一致的(27)，这可能是这两个βarr在亚细胞水平的分布上不一样导致的。虽然，在此功能上这两个βarr不一样，但是，从动物水平来看它们都能调控免疫反应。在这个研究中，发明人发现βarr1能促进CD4⁺T细胞的存活和自身免疫；而另一个早先的研究表明，βarr2敲除的小鼠在哮喘模型实验中其症状明显低于野生型小鼠，而这可能是由于βarr2影响了免疫细胞的迁移导致的。从这些结果可以看出：虽然βarrs影响的细胞机制不一样，但都在免疫系统中起着促进免疫反应的功能。

发明人实验室最近的研究表明：βarr1具有在核内直接调控基因转录的功能；而该功能是受一些GPCRs影响的(27)。另外，在体外激活的CD4⁺T细胞中，NguyenK.和Miller B.C.发现有delta阿片受体(DOR)的表达(48)。有趣的是，发明人在体外的实验中发现：DOR的激活能βarr1依赖地上调Bcl-2的表达。这些数据显示，βarr1可能作为一个重要的信号调节分子介导外界促进CD4⁺T细胞存活的信号从而影响获得性免疫应答。考虑到βarr1在CD4⁺T细胞中内在的生理功能，这些结果不仅揭示了在正常生理条件下调节免疫系统的一种机制，也为自身免疫病如多发性硬化提供了一种可能的治疗靶点。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

参考文献

1.Marrack，P.& Kappler，J.Control of T cell viability.Annu Rev Immunol 22，765-87(2004).

2.Stockinger，B.，Kassiotis，G.& Bourgeois，C.Homeostasis and T cell regulation.Curr OpinImmunol 16，775-9(2004).

3.Strasser，A.& Pellegrini，M.T-lymphocyte death during shutdown of an immune response.Trends Immunol 25，610-5(2004).

4.Bidere，N.，Su，H.C.& Lenardo，M.J.Genetic disorders of programmed cell death in theimmune system.Annu Rev Immunol 24，321-52(2006).

5.Hughes，P.，Bouillet，P.& Strasser，A.Role of Bim and other Bcl-2 family members inautoimmune and degenerative diseases.Curr Dir Autoimmun 9，74-94(2006).

6.Marsden，V.S.& Strasser，A.Control of apoptosis in the immune system：Bcl-2，BH3-onlyproteins and more.Annu Rev Immunol 21，71-105(2003).

7.Brunner，T.et al.Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction mediates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas.Nature 373，441-4(1995).

8.Martinez-Lorenzo，M.J.et al.Involvement of APO2 ligand/TRAIL in activation-induced deathof Jurkat and human peripheral blood T cells.Eur J Immunol 28，2714-25(1998).

9.Dhein，J.，Walczak，H.，Baumler，C.，Debatin，K.M.& Krammer，P.H.Autocrine T-cell suicidemediated by APO-1/(Fas/CD95).Nature 373，438-41(1995).

10.Ju，S.T.et al.Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cellactivation.Nature 373，444-8(1995).

11.Sytwu，H.K.，Liblau，R.S.& McDevitt，H.O.The roles of Fas/APO-1(CD95)and TNF inantigen-induced programmed cell death in T cell receptor transgenic mice.Immunity 5，17-30(1996).

12.Hengartner，M.O.The biochemistry of apoptosis.Nature 407，770-6(2000).

13.Strasser，A.，O′Connor，L.& Dixit，V.M.Apoptosis signaling.Annu Rev Biochem 69，217-45(2000).

14.Bouillet，P.et al.Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses，leukocyte homeostasis，and to preclude autoimmunity.Science 286，1735-8(1999).

15.Strasser，A.，Harris，A.W.& Cory，S.bcl-2 transgene inhibits T cell death and perturbs thymicself-censorship.Cell 67，889-99(1991).

16.Hildeman，D.A.et al.Activated T cell death in vivo mediated by proapoptotic bcl-2 familymember bim.Immunity 16，759-67(2002).

17.Grayson，J.M.，Zajac，A.J.，Altman，J.D.& Ahmed，R.Cutting edge：increased expression ofBcl-2in antigen-specific memory CD8+T cells.J Immunol 164，3950-4(2000).

18.Veis，D.J.，Sorenson，C.M.，Shutter，J.R.& Korsmeyer，S.J.Bcl-2-deficient mice demonstratefulminant lymphoid apoptosis，polycystic kidneys，and hypopigmented hair.Cell 75，229-40(1993).

19.Strasser，A.et al.Enforced BCL2 expression in B-lymphoid cells prolongs antibody responsesand elicits autoimmune disease.Proc Natl Acad Sci U S A 88，8661-5(1991).

20.Dewire，S.M.，Ahn，S.，Lefkowitz，R.J.& Shenoy，S.K.beta-Arrestins and Cell Signaling.Annu Rev Physiol 69，483-510(2007).

21.Wilbanks，A.M.et al.Beta-arrestin 2 regulates zebrafish development through the hedgehogsignaling pathway.Science 306，2264-7(2004).

22.Chen，W.et al.Beta-arrestin 2 mediates endocytosis of type III TGF-beta receptor and down-regulation of its signaling.Science 301，1394-7(2003).

23.Chen，W.et al.Activity-dependent internalization of smoothened mediated by beta-arrestin 2 andGRK2.Science 306，2257-60(2004).

24.Perry，S.J.& Lefkowitz，R.J.Arresting developments in heptahelical receptor signaling andregulation.Trends Cell Biol 12，130-8(2002).

25.Luttrell，L.M.et al.Activation and targeting of extracellular signal-regulated kinases by beta-arrestin scaffolds.Proc Natl Acad Sci U S A 98，2449-54(2001).

26.DeFea，K.A.et al.The proliferative and antiapoptotic effects of substance P are facilitated byformation of a beta-arrestin-dependent scaffolding complex.Proc Natl Acad Sci U S A 97，11086-91(2000).

27.Kang，J.et al.A nuclear function of beta-arrestin1 in GPCR signaling：regulation of histoneacetylation and gene transcription.Cell 123，833-47(2005).

28.Ferguson，S.S.，Barak，L.S.，Zhang，J.& Caron，M.G.G-protein-coupled receptor regulation：role of G-protein-coupled receptor kinases and arrestins.Can J Physiol Pharmacol 74，1095-110(1996).

29.Parruti，G.et al.Molecular analysis of human beta-arrestin-1：cloning，tissue distribution，andregulation of expression.Identification of two isoforms generated by alternative splicing.J Biol Chem 268，9753-61(1993).

30.Walker，J.K.et al.Beta-arrestin-2 regulates the development of allergic asthma.J Clin Invest 112，566-74(2003).

31.Wang，Y.et al.Association of beta-arrestin and TRAF6 negatively regulates Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling.Nat Immunol 7，139-47(2006).

32.Wang，P.，Wu，Y.，Ge，X.，Ma，L.& Pei，G.Subcellular localization of beta-arrestins isdetermined by their intact N domain and the nuclear export signal at the C terminus.J Biol Chem 278，11648-53(2003).

33.Ora，K.et al.T-cell recognition of an immunodominant myelin basic protein epitope in multiplesclerosis.Nature 346，183-7(1990).

34.Zappia，E.et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitisinducing T-cell anergy.Blood 106，1755-61(2005).

35.Ben-Sasson，S.Z.，Makedonski，K.，Hu-Li，J.& Paul，W.E.Survival and cytokine polarization ofnaive CD4(+)T cells in vitro is largely dependent on exogenous cytokines.Eur J Immunol 30，1308-17(2000).

36.DiSanto，J.P.，Guy-Grand，D.，Fisher，A.& Tarakhovsky，A.Critical role for the commoncytokine receptor gamma chain in intrathymic and peripheral T cell selection.J Exp Med 183，1111-8(1996).

37.Nakajima，H.，Shores，E.W.，Noguchi，M.& Leonard，W.J.The common cytokine receptorgamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.J Exp Med 185，189-95(1997).

38.Kane，L.P.& Weiss，A.The PI-3 kinase/Akt pathway and T cell activation：pleiotropic pathwaysdownstream of PIP3.Immunol Rev 192，7-20(2003).

39.Gendron，S.，Couture，J.& Aoudjit，F.Integrin alpha2beta1 inhibits Fas-mediated apoptosis in Tlymphocytes by protein phosphatase 2A-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.J Biol Chem 278，48633-43(2003).

40.Scott，M.G.et al.Differential nucleocytoplasmic shuttling of beta-arrestins.Characterization of aleucine-rich nuclear export signal in beta-arrestin2.J Biol Chem 277，37693-701(2002).

41.Jambal，P.et al.Cytokine-mediated down-regulation of the transcription factor cAMP-responseelement-binding protein in pancreatic beta-cells.J Biol Chem 278，23055-65(2003).

42.Tamatani，M.et al.Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaBactivation in primary hippocampal neurons.J Biol Chem 274，8531-8(1999).

43.Ogryzko，V.V.，Schiltz，R.L.，Russanova，V.，Howard，B.H.& Nakatani，Y.The transcriptionalcoactivators p300 and CBP are histone acetyltransferases.Cell 87，953-9(1996).

44.Sospedra，M.& Martin，R.Immunology of multiple sclerosis.Annu Rev Immunol 23，683-747(2005).

45.Vroon，A.，Lombardi，M.S.，Kavelaars，A.& Heijnen，C.J.Changes in the G-protein-coupledreceptor desensitization machinery during relapsing-progressive experimental allergic encephalomyelitis.JNeuroimmunol 137，79-86(2003).

46.Zang，Y.C.，Hong，J.，Rivera，V.M.，Killian，J.& Zhang，J.Z.Human anti-idiotypic T cellsinduced by TCR peptides corresponding to a common CDR3 sequence motif in myelin basic protein-reactiveT cells.Int Immunol 15，1073-80(2003).

47.Oakley，R.H.，Laporte，S.A.，Holt，J.A.，Caron，M.G.& Barak，L.S.Differential affinities ofvisual arrestin，beta arrestin1，and beta arrestin2 for G protein-coupled receptors delineate two major classes ofreceptors.J Biol Chem 275，17201-10(2000).

48.Nguyen，K.& Miller，B.C.CD28 costimulation induces delta opioid receptor expression duringanti-CD3 activation of T cells.J Immunol 168，4440-5(2002).

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用

<130>073066

<160>55

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ttctccttcc agcctgagag caa                            23

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

atgaccccac cgaactcaaa g                              21

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

aggatgcgtc caccaag                                   17

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

aagtagaaga gggcaaccac                                20

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

cctgctggat tacattaaag cactg                         25

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ttcaacactt cgagaggtcc t                             21

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cctgctggat tacatcaaag cactg                         25

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

tccaacactt cgtggggtcc t                             21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

atccaggatc gagcagggcg                               20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

actcgctcag cttcttggtg                               20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

caatggctaa ctgggacta                               19

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

tcttcggctg cttggtaa                                18

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

ccagagtttg agccgagtga g                            21

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

gctgtgctgc ccagaggtt                               19

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

caacccatcc tggcacct                                18

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

cgatccgact caccaatacc                              20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

gggacgcgag tgttcaagaa                              20

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

acaaacaggt ccttgcgaaa g                            21

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

cctgtggatg actgagtacc tgaa                         24

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

cagccaggag aaatcaaaca ga                           22

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Taqman探针

<400>21

aggataacgg aggctgggat gccttt                       26

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

ggcaaaccct cccccaccac ctc                          23

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

ccaccggacc gcttcagacc tc                           22

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

ggggaaacaa ccaactctgg                              20

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>25

catcactgcc gctgcctct                               19

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>26

gctgtttatc agttagtggg tc                           22

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>27

gggtcagaag tgggagtg                                18

<210>28

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>28

tgccaaggtt agcaggac                                18

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>29

ccagaggaca aatgaggg                                18

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>30

catttgtctg ccctatct                                18

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>31

ttaactggga acacctca                                18

<210>32

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>32

agtgcttatc gctcttcc                                18

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>33

ctccaaacct gaccctct                                18

<210>34

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>34

gcagcaaaca atcttcat                                18

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>35

acaccaatac caacccta                                18

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>36

ccttctcaat cagccagcat                              20

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>37

aagcaagcct cctcaccc                                18

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>38

cactcagaga agaattcaca cagaa                        25

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>39

ttctgtgtga attcttctct gagtg                       25

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>40

ccccagaact catgtctc                               18

<210>41

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>41

ttccaatgct ctcccaaa                                18

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>42

cagagtgagt attggaggag                              20

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>43

aaagacagtg gtgggaaa                               18

<210>44

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>44

tgaccctgag gagatgga                               18

<210>45

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>45

ggtatgacct gggcttcg                               18

<210>46

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>46

aggagcaaac tcaggaat                               18

<210>47

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>47

agtcacaaag atggcaga                                18

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>48

cagacgcacc actgattt                                18

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>49

agcagccagc agacttac                                18

<210>50

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>50

tacgagcgat acatacaac                               19

<210>51

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>51

ctagagccag tccttctt                               18

<210>52

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>52

gcgactcctg attcattg                               18

<210>53

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>53

aggtgcgttt ccctgta                                 17

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>54

tatcgggaga tgctcattgg a                            21

<210>55

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>55

ccctcgggag gtttggtc                                18

Claims (10)

1.β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制β抑制蛋白1活性的物质选自放线菌素、放线菌酮或β抑制蛋白1的特异性抗体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质是小干扰RNA、β抑制蛋白1的编码基因全部或部分序列的反义序列或核酶。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质负载于载体内。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或DNA病毒载体。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病选自自身免疫疾病或淋巴细胞增多症。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、I型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症。

9.一种用于治疗或预防对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的β抑制蛋白1的抑制剂作为活性组分，以及药学上可接受的载体，其中所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质。

10.一种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病的药物的方法，该方法包括：

a)使所述候选物质与表达β-抑制蛋白1的细胞接触；

b)鉴定β-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内β-抑制蛋白1表达水平相比较；

c)选出使细胞核内β-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病药物。

Images