JP2021531013A - Ｉｌ２アゴニスト - Google Patents

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Abstract

本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ２）の変異体に関する。一実施形態では、ＩＬ２変異体は、制御性Ｔ細胞よりもエフェクタＴ細胞を活性化する。特に、本発明は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドに関し、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｋαβγ）のアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の少なくとも酸性または塩基性アミノ酸残基を有する位置で置換されている。あるいは、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインは、少なくとも（ｉ）ＩＬ＿２Ｋαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換および（ｉｉ）ＩＬ＿２Ｋβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは宿主細胞を含む医薬組成物、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞または医薬組成物を使用する治療的または予防的治療方法、ならびに前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞または医薬組成物を含む医薬製剤に関する。

Description

本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ２）の変異体に関する。特に、本発明は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドに関し、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の少なくとも酸性または塩基性アミノ酸残基を有する位置で置換されている。一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を、好ましくはβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性よりも大幅に低下させる。一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞よりもエフェクタＴ細胞を活性化する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは宿主細胞を含む医薬組成物、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞または医薬組成物を使用する治療的または予防的治療方法、ならびに前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞または医薬組成物を含む医薬製剤に関する。
免疫系は、病原体関連疾患だけでなく癌、自己免疫、アレルギーにおいても重要な役割を果たす。Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫応答の重要なメディエータである。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接溶解することができる。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む様々な免疫サブセットの腫瘍への流入を媒介することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をプライミングするのを許可することができ、ＩＦＮγを介したＭＨＣの上方制御と増殖阻害によって腫瘍細胞に直接作用することができる。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、ワクチン接種またはＴ細胞の養子移入によって誘導することができる。ｍＲＮＡに基づくワクチンプラットフォームの文脈において、ｍＲＮＡは、免疫刺激のための追加のアジュバントを必要とせずに、リポソーム製剤（ＲＮＡ‐リポプレックス、ＲＮＡ−ＬＰＸ）によって二次リンパ器官に位置する抗原提示細胞に送達され得る（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５）；Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６−４０１（２０１６））。
サイトカインは免疫において重要な役割を果たす。例えば、インターロイキン‐２（ＩＬ２）は強力な免疫刺激因子であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫系の多様な細胞を活性化する。ＩＬ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の分化、増殖、生存およびエフェクタ機能を支持することが公知であり（Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０−７（２００３））、何十年にもわたって後期悪性黒色腫の治療において使用されてきた（Ｍａａｓ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｌｌｅｎｓ，Ｈ．Ｆ．＆Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６，１４１−８（１９９３））。したがって、Ｔ細胞ワクチンまたは（ナイーブもしくはＴ細胞受容体トランスジェニックまたはキメラ抗原受容体トランスジェニック）Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入などの免疫療法は、ＩＬ２のようなサイトカインの同時投与から恩恵を受けることができる。しかしながら、組換えＩＬ２の１つの難点は、その短い血漿半減期である（Ｌｏｔｚｅ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ １９８６，２５６，３１１７−２４．；Ｗｅｓｔ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８９８−９０５（１９８７））。これにより、大量のＩＬ２を頻繁に注入する必要が生じ、血管漏出症候群（ＶＬＳ）などの重篤な副作用につながる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８８９−９７（１９８７））。ＶＬＳは、肺と肝臓に血管内液の蓄積をもたらし、肺水腫および肝障害を生じさせる。最近まで、ＶＬＳはＩＬ２活性化ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていた。しかし、最近の報告では、ＶＬＳの原因として、ＩＬ２が肺内皮細胞に直接結合することが指摘されている（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０７（２６）１１９０６−１１９１１（２０１０））。ＩＬ２の２番目の難点は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激するその固有の能力である。Ｔｒｅｇは、抗腫瘍エフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の機能を抑制することができるため、癌患者の生存率の低下と相関する（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１−７（２０１４））。ＩＬ２は、高親和性および中親和性型として存在するＩＬ２受容体を介してシグナル伝達する。高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）は、ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）、ＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ）およびＣＤ１３２（ＩＬ２Ｒγ）で構成され、Ｔｒｅｇならびに活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で発現される。Ｔｒｅｇの活性化は免疫抑制を増悪させ、意図される治療応答を潜在的に損ない得る。中親和性受容体（ＩＬ２Ｒβγ）はＣＤ２５を欠いており、ナイーブＴ細胞とメモリＴ細胞およびＮＫ細胞に多く見られる。その結果、ＩＬ２は、ＣＤ２５を発現するＴｒｅｇ（Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．１３，ｅ１００２１３９（２０１６））ならびに活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に刺激する。さらに、ナイーブＴ細胞とメモリＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化するには高用量のＩＬ２が必要である。ＣＤ２５発現細胞に対する選択性を失うような方法でＩＬ２を改変し、それによってナイーブＴ細胞とメモリＴ細胞およびＮＫ細胞の刺激能を相対的に増加させる試みは、その抗腫瘍能を改善することが示された（Ａｒｅｎａｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８，１−１３（２０１６））。
Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５） Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６−４０１（２０１６） Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０−７（２００３） Ｍａａｓ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｌｌｅｎｓ，Ｈ．Ｆ．＆Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６，１４１−８（１９９３） Ｌｏｔｚｅ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ １９８６，２５６，３１１７−２４ Ｗｅｓｔ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８９８−９０５（１９８７） Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８８９−９７（１９８７） Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０７（２６）１１９０６−１１９１１（２０１０） Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１−７（２０１４） Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．１３，ｅ１００２１３９（２０１６） Ａｒｅｎａｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８，１−１３（２０１６）
ワクチン、特に癌ワクチン、および他の免疫療法、特に癌免疫療法、例えば（ナイーブもしくはＴ細胞受容体トランスジェニックまたはキメラ抗原受容体トランスジェニック）Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子移入の有効性を高めるための新しい戦略が必要とされている。
発明人は、高親和性ＩＬ２受容体ＩＬ２Ｒαβγを発現する細胞と比較して、中親和性ＩＬ２受容体ＩＬ２Ｒβγを発現する細胞を選択的に活性化するヒトＩＬ２の変異体を発見した。
ＩＬ２の結合表面上の特異的結合残基の適切な修飾によるＩＬ２とＩＬ２Ｒαとの相互作用の破壊は、ＩＬ２Ｒαβγを発現する細胞への有効な結合（したがって活性化）を妨げると仮定された。しかし、ＩＬ２Ｒβγを発現している細胞では、細胞への結合が依然として起こる。制御性Ｔ細胞上の高親和性ＩＬ２受容体よりも、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞およびエフェクタＴ細胞などの特定のＴ細胞ならびにＮＫ細胞上の中親和性ＩＬ２受容体を選択的に活性化できるＩＬ２変異体は、野生型ＩＬ２よりも改善された治療指数と減少した毒性プロフィールを有すると予想される。改善された治療指数を有するＩＬ２変異体は、免疫系の刺激を必要とする障害の治療、例えば癌の治療（直接および／または補助療法として）における使用範囲が有意に拡大する。特に、ＩＬ２変異体ＲＮＡの投与は、複数のＴ細胞およびＮＫ細胞に基づく（癌）免疫療法の治療効果を高めるための有望なアプローチである。
本開示は、新規ＩＬ２変異体を提供する。具体的には、ＣＤ２５結合に影響を及ぼす変異（「ｍｕｔＣＤ２５」）を含み、任意でＩＬ２Ｒβγ結合を増強する変異（「ｍｕｔβγ」）をさらに含み、それによってＴｒｅｇ増殖を減少させ、エフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の刺激を増加させるＩＬ２の変異体が記載される。インビトロで、ｍＲＮＡにコードされたＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体は、野生型ＩＬ２よりも弱いＩＬ２Ｒαβγ陽性Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＣＤ２５への結合の減少を明らかにした。ｍｕｔＣＤ２５変異を含まないｍｕｔβγ変異体は、すべてのＴ細胞を増殖させる効力を強力に増加させたが、野生型ＩＬ２と比較してＴｒｅｇの選択的な増殖も増加させた。重要な点として、ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異の組合せは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させる効果を維持しながら、ＩＬ２を介したＴｒｅｇ増殖の大幅な減少をもたらした。インビボでは、全身アベイラビリティのためにマウスの肝臓を標的とする、ＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体をコードするナノ粒子製剤化ｍＲＮＡは、Ｔｒｅｇと比較してＲＮＡ−ＬＰＸワクチン接種によって誘導されるエフェクタＴ細胞応答を選択的にまたはもっぱら増強した。ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異の組合せは、ｍｕｔＣＤ２５ ＩＬ２変異体の効力をさらに増強し、野生型ＩＬ２と比較して有意に少ないＴｒｅｇ増殖および高いＣＤ８対Ｔｒｅｇ比を有する抗原特異的Ｔ細胞の選択的な増殖をもたらした。
一実施形態では、ヘテロトリマーＩＬ２受容体複合体、ＩＬ２Ｒαβγのアルファ（α）サブユニットと接触するＩＬ２の領域にアミノ酸置換を有し、ヘテロトリマーに結合して活性化するその能力を低下させる（本明細書では「ｍｕｔＣＤ２５」変異とも称される）ＩＬ２変異体が本明細書に記載される。ＩＬ２Ｒαβγ複合体は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で構成的に発現される。したがって、本明細書に記載のＩＬ２置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を、ナイーブＴ細胞とメモリＴ細胞およびＮＫ細胞上に優勢な受容体複合体であるＩＬ２Ｒβγに対する親和性よりも大幅に低下させる。インビボで本明細書に記載のＩＬ２変異体を使用する治療は、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇよりもＣＤ８ Ｔ細胞などのＴ細胞の活性化に有利に働いて、抗腫瘍効果を提供する。
一態様では、本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドに関し、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の少なくとも酸性または塩基性アミノ酸残基を有する位置で置換されており、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基（グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）またはアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、特にグルタミン酸）である場合、置換は塩基性アミノ酸残基（リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、特にリジン）によるものであり、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基（リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、特にリジン）である場合、置換は酸性アミノ酸残基（グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）またはアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、特にグルタミン酸）によるものである。異なる実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の酸性または塩基性アミノ酸残基を有する１つ以上、例えば２つ以上または３つ以上、例えば２、３、４、５、６、７または８つのそのような位置で置換されている。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２は、配列番号１７に従うアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの塩基性アミノ酸残基と接触する。一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの酸性アミノ酸残基と接触する。
一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を低下させる。一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性よりも大幅に低下させる。
一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）よりもエフェクタＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２５−および／またはＦｏｘＰ３−であるＣＤ４＋Ｔ細胞）を選択的に活性化する。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位（リジン）、４３位（リジン）、６１位（グルタミン酸）および６２位（グルタミン酸）の少なくとも１つで置換されている。
異なる実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、少なくとも以下の位置で置換されている：
−３５位、
−４３位、
−６１位、
−６２位、
−３５位および４３位、
−３５位および６１位、
−３５位および６２位、
−４３位および６１位、
−４３位および６２位、
−６１位および６２位、
−３５位、４３位および６１位、
−３５位、４３位および６２位、
−３５位、６１位および６２位、
−４３位、６１位および６２位、または
−３５位、４３位、６１位および６２位。
一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、４３位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、６１位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６２位が置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換され、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６１位および６２位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換され、６２位がリジンで置換されている。
一態様では、本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドに関し、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位（リジン）、４３位（リジン）、６１位（グルタミン酸）および６２位（グルタミン酸）の少なくとも１つにおいて置換されている。一実施形態では、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基である場合、置換は塩基性アミノ酸残基によるものであり、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基である場合、置換は酸性アミノ酸残基によるものである。
異なる実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、少なくとも以下の位置で置換されている：
−３５位、
−４３位、
−６１位、
−６２位、
−３５位および４３位、
−３５位および６１位、
−３５位および６２位、
−４３位および６１位、
−４３位および６２位、
−６１位および６２位、
−３５位、４３位および６１位、
−３５位、４３位および６２位、
−３５位、６１位および６２位、
−４３位、６１位および６２位、または
−３５位、４３位、６１位および６２位。
一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、４３位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、６１位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６２位が置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換され、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６１位および６２位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換され、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２は、配列番号１７に従うアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を低下させる。一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性よりも大幅に低下させる。
一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）よりもエフェクタＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２５−および／またはＦｏｘＰ３−であるＣＤ４＋Ｔ細胞）を選択的に活性化する。
一実施形態では、上記の置換されたＩＬ２またはその機能的変異体（ＩＬ２ムテイン）は、他の非置換残基では野生型ＩＬ２と同一のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、上記のＩＬ２ムテインは、野生型ヒトＩＬ２内の１つ以上の部位または他の残基においてアミノ酸置換などのアミノ酸修飾を有する。一実施形態では、そのようなアミノ酸置換は、野生型ＩＬ２と比較した場合、ＩＬ２Ｒβγに対する相対的に増加した親和性をもたらす（本明細書では「ｍｕｔβγ」変異とも称される）。そのような変異体は、強力なＩＬ２シグナル伝達アゴニストである。一実施形態では、そのようなアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒβおよび／またはＩＬ２Ｒγと接触するアミノ酸残基に存する。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けられた、２４位、６５位、７４位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９２位、および９３位の少なくとも１つで置換されている。置換されたアミノ酸残基（１つまたは複数）は、必ずというわけではないが、保存的置換であり得る。例えば、変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉであり得る。
一実施形態では、ＩＬ２ムテインは、以下のアミノ酸置換のセットを含む：８０Ｆ／８１Ｄ／８５Ｖ／８６Ｖ／９２Ｆ。ＩＬ２ムテインは、アミノ酸置換４２Ａをさらに含み得る。ＩＬ２ムテインは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上をさらに含み得る：２４Ｖ、６５Ｈ、７４Ｒ、７４Ｈ、７４Ｎ、７４Ｓ、８９Ｖ、９３Ｉ。
いくつかの実施形態では、ＩＬ２ムテインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む：
（ｉ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉ）７４Ｈ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉｉ）７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｖ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖｉ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ；
（ｖｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ。
一態様では、本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドに関し、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、少なくとも（ｉ）ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換（本明細書では「ｍｕｔＣＤ２５」変異とも称される）および（ｉ）ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換（本明細書では「ｍｕｔβγ」変異とも称される）を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）よりもエフェクタＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２５−および／またはＦｏｘＰ３−であるＣＤ４＋Ｔ細胞）を選択的に活性化する。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒαと接触するＩＬ２またはその機能的変異体のアミノ酸残基に存する。一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性よりも大幅に低下させる。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｌ７２、およびＹ１０７からなる群より選択されるＩＬ２またはその機能的変異体の１つ以上の位置における置換を含む。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の酸性または塩基性アミノ酸残基を有するＩＬ２またはその機能的変異体の１つ以上の位置に存し、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基（グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）またはアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、特にグルタミン酸）である場合、置換は塩基性アミノ酸残基（リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、特にリジン）によるものであり、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基（リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、特にリジン）である場合、置換は酸性アミノ酸残基（グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）またはアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、特にグルタミン酸）によるものである。異なる実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の酸性または塩基性アミノ酸残基を有する１つ以上、例えば２つ以上または３つ以上、例えば２、３、４、５、６、７または８つのそのような位置で置換されている。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの塩基性アミノ酸残基と接触する。一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基は、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの酸性アミノ酸残基と接触する。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２は、配列番号１７に従うアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位（リジン）、４３位（リジン）、６１位（グルタミン酸）および６２位（グルタミン酸）の少なくとも１つにおける置換を含む。
異なる実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、以下からなる群より選択される、ＩＬ２またはその機能的変異体の１つ以上の位置に存する：
−３５位、
−４３位、
−６１位、
−６２位、
−３５位および４３位、
−３５位および６１位、
−３５位および６２位、
−４３位および６１位、
−４３位および６２位、
−６１位および６２位、
−３５位、４３位および６１位、
−３５位、４３位および６２位、
−３５位、６１位および６２位、
−４３位、６１位および６２位、または
−３５位、４３位、６１位および６２位。
一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、４３位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、６１位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６２位が置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換され、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６１位および６２位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換され、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒβおよび／またはＩＬ２Ｒγと接触するＩＬ２のアミノ酸残基に存する。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ９、Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｄ２０、Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｎ８８、Ｉ９２、Ｌ９４、およびＥ９５からなる群より選択されるＩＬ２の１つ以上の位置における置換を含む。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、２４位、６５位、７４位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９２位、および９３位の少なくとも１つにおける置換を含む。置換されたアミノ酸残基（１つまたは複数）は、必ずというわけではないが、保存的置換であり得る。例えば、変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉであり得る。
一実施形態では、ＩＬ２ムテインは、以下のアミノ酸置換のセットを含む：８０Ｆ／８１Ｄ／８５Ｖ／８６Ｖ／９２Ｆ。ＩＬ２ムテインは、アミノ酸置換４２Ａをさらに含み得る。ＩＬ２ムテインは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上をさらに含み得る：２４Ｖ、６５Ｈ、７４Ｒ、７４Ｈ、７４Ｎ、７４Ｓ、８９Ｖ、９３Ｉ。
いくつかの実施形態では、ＩＬ２ムテインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む：
（ｉ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉ）７４Ｈ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉｉ）７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｖ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖｉ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ；
（ｖｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ。
本明細書に記載のＩＬ２ムテインは、薬物動態修飾基に結合することができ、したがって、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２」であり得る。
一態様では、本発明は、ＩＬ２またはＩＬ２ムテインに融合したその機能的変異体に対して異種であるアミノ酸配列をさらに含む延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２である、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一実施形態では、ＩＬ２またはその機能的変異体に対して異種であるアミノ酸配列は、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される。一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
一態様では、本発明は、配列表の配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６などの配列番号２〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
上記のポリペプチドは、本明細書では「ＩＬ２変異体ポリペプチド」または単に「ＩＬ２変異体」とも称される。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む医薬組成物に関する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象を治療する方法に関する。一実施形態では、対象は癌を有する。
一実施形態では、対象は、１つ以上の免疫療法を使用して、例えばワクチン接種またはＴ細胞の養子移入、例えばＴ細胞ワクチンまたは（ナイーブもしくはＴ細胞受容体トランスジェニックまたはキメラ抗原受容体トランスジェニック）Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入を使用してさらに治療される。
抗原が、それ自体でまたはポリヌクレオチドとして、特に抗原をコードするＲＮＡ（例えば、本明細書では「抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質」とも称される、ワクチン接種に使用されるペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）として送達されるワクチンの有効性は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドを同時投与することによって増加させることができ、ＩＬ２変異体ポリペプチドは、それ自体でまたはポリヌクレオチド、特にＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡとして送達される。ワクチンは、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡが全身アベイラビリティのために肝臓を標的とする場合に特に有効である。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を産生できる。抗原をコードするｍＲＮＡは、好ましくは二次リンパ器官を標的とする。さらに、ワクチンは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤がさらに投与される場合に特に有効である。
一態様では、本発明は、対象に以下のものを投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法に関する：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物；および
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質、または前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
一実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一実施形態では、対象において免疫応答を誘導するための方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ。
一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）よりもエフェクタＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２５−および／またはＦｏｘＰ３−であるＣＤ４＋Ｔ細胞）を選択的に活性化する。
一実施形態では、方法は、対象における癌を治療または予防するための方法であり、抗原は腫瘍関連抗原である。
一態様では、本発明は、対象に以下のものを投与することを含む、対象における癌を治療または予防するための方法に関する：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物；および
ｂ．対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質、または前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
一実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一実施形態では、対象における癌を治療または予防するための方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
ｂ．対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ。
一実施形態では、癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
一実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、および任意で免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する。
一態様では、本発明は、以下のものを含む医薬製剤に関する：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書の記載の医薬組成物。
一実施形態では、医薬製剤は、以下のものをさらに含む：
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質、または前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
一実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一実施形態では、医薬製剤は、以下のものを含む：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ。
医薬製剤の一実施形態では、ＲＮＡは、液体形態、固体形態、またはそれらの組合せから選択される形態で存在する。一実施形態では、固体形態は、凍結形態または脱水形態である。一実施形態では、脱水形態は、凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である。
一実施形態では、医薬製剤は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
一実施形態では、医薬製剤はキットである。一実施形態では、医薬製剤は医薬組成物である。
一実施形態では、医薬製剤は、各成分ａおよびｂを別々の容器内に含む。
一実施形態では、医薬製剤は医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む。
一実施形態では、医薬製剤は、癌を治療または予防するための医薬製剤の使用説明書をさらに含み、抗原は腫瘍関連抗原である。
一態様では、本発明は、医薬用途のための本明細書に記載の医薬製剤に関する。
一実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的治療を含む。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための本明細書に記載の医薬製剤に関し、抗原は腫瘍関連抗原である。
一実施形態では、癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象を治療する方法で使用するための前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記宿主細胞、または前記医薬組成物に関する。
一実施形態では、対象は癌を有する。
さらなる態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導するための方法で使用するための本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物に関し、前記方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記宿主細胞、または前記医薬組成物；および
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質、または前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
一実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一実施形態では、対象において免疫応答を誘導するための方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ。
一実施形態では、ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）よりもエフェクタＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２５−および／またはＦｏｘＰ３−であるＣＤ４＋Ｔ細胞）を選択的に活性化する。
一実施形態では、方法は、対象における癌を治療または予防するための方法であり、抗原は腫瘍関連抗原である。
さらなる態様では、本発明は、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物に関し、前記方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記宿主細胞、または前記医薬組成物；および
ｂ．対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質、または前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
一実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
一実施形態では、対象における癌を治療または予防するための方法は、対象に以下のものを投与することを含む：
ａ．本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
ｂ．対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ。
一実施形態では、癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
一実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、および任意で免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する。
ＲＮＡにコードされたＩＬ２変異体のインビトロ発現とＩＬ２Ｒβγ結合。１．２×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を６ウェルプレートに播種し、約８０％の集密度に達した後、総量３．２５ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、３μｇ ｍＲＮＡでリポフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ １μＬあたり４００ｎｇの複合体化ｍＲＮＡ）。３７°Ｃ、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、上清を収集し、その段階希釈液を、ヒト細胞株ＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγを発現する中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）と共にインキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙを使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって、３日後に増殖応答を測定した。示されているデータは、ｎ＝２の技術的複製物の平均±標準偏差（ＳＤ）である。ＲＬＵ＝相対発光単位。 ＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体のＣＤ２５結合。１００ｎｇのプレートに結合した組換えヒトＣＤ２５（Ａ）またはマウスＣＤ２５（Ｂ）を、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７のリポフェクションからの１：２に希釈したＩＬ２変異体含有上清と共にインキュベートし、結合タンパク質をＨＲＰ結合抗ヒト血清アルブミン抗体によって検出した。ｈＡｌｂのみをコードするｍＲＮＡでリポフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の上清を陰性対照として使用した。示されているデータは、ｎ＝２の技術的複製物の平均±ＳＤである。 高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）依存性細胞培養物におけるＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の生物活性。ＣＤ２５ｈｉｇｈマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖応答を示す。細胞をＩＬ２変異体含有上清の段階希釈液と共に３日間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙを使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。示されているデータは、ＥＣ５０値を計算するための４つのパラメータの対数近似を適用したｎ＝２〜３の技術的複製物の平均±ＳＤである。ＲＬＵ＝相対発光単位。 ＩＬ２を介した抗原非特異的増殖の増強によって測定したヒトＰＢＭＣの様々なＴ細胞サブセットでのＩＬ２変異体の生物活性。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１）およびＩＬ２変異体含有上清の段階希釈液と共に４日間インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡとＤ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＢとＥ）、およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞（ＣとＦ）の増殖をフローサイトメトリによって測定した。１例の代表的なドナーからのデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４ソフトウェアを使用して計算し、４つのパラメータの対数近似を適用した増殖指数の平均値として示す。エラーバー（ＳＤ）は、実験内の変動を示す（１例のドナーからの細胞を使用した３つの複製物）。 ＩＬ２を介した抗原非特異的増殖の増強によって測定したヒトＰＢＭＣの様々なＴ細胞サブセットでのＩＬ２変異体の生物活性。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１）およびＩＬ２変異体含有上清の段階希釈液と共に４日間インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡとＤ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＢとＥ）、およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞（ＣとＦ）の増殖をフローサイトメトリによって測定した。１例の代表的なドナーからのデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４ソフトウェアを使用して計算し、４つのパラメータの対数近似を適用した増殖指数の平均値として示す。エラーバー（ＳＤ）は、実験内の変動を示す（１例のドナーからの細胞を使用した３つの複製物）。 中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）および高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）依存性細胞培養物における様々なＩＬ２変異体の相対的生物活性。（Ａ〜Ｂ）ヒト細胞株ＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγを発現する中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）および（Ｃ〜Ｄ）高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）を発現するマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖応答を示す。細胞培養物を、ＩＬ２変異体含有上清の段階希釈液と共に３日間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙを使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。示されているデータは、ＥＣ５０値を計算するための４つのパラメータの対数近似を適用したｎ＝２〜３の技術的複製物の平均±ＳＤである。ＲＬＵ＝相対発光単位 ＳＴＡＴ５のＩＬ２を介したリン酸化によって測定したヒトＰＢＭＣの様々なＴ細胞サブセットでのＩＬ２変異体の機能的特性。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔエフェクタ細胞およびメモリ細胞（Ｂ）、ならびにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃ）でのＳＴＡＴ５リン酸化（ｐＳＴＡＴ５）の用量反応曲線。ＰＢＭＣをＩＬ２変異体含有上清の段階希釈液と共にインキュベートし、続いてＳＴＡＴ５のリン酸化を様々なＴ細胞サブセットにおいてフローサイトメトリによって分析した。示されているデータは、ＥＣ５０値を計算するための４つのパラメータの対数近似を適用したｎ＝２の技術的複製物の平均±ＳＤである。 インビボでのＴ細胞ワクチン接種に対するＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果 Ａ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化されたｈＡｌｂ−ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ ＲＮＡの漸増用量を静脈内投与した。肝臓重量（Ｂ）；血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）活性（Ｃ）；血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ｄ）、ＣＤ８陽性細胞（Ｅ）、ＣＤ４５陽性細胞（Ｆ）、またはＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｇ）；およびＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率（Ｈ）を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｉ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ））。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｈ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｉ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 インビボでのＴ細胞ワクチン接種に対するＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果 Ａ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化されたｈＡｌｂ−ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ ＲＮＡの漸増用量を静脈内投与した。肝臓重量（Ｂ）；血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）活性（Ｃ）；血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ｄ）、ＣＤ８陽性細胞（Ｅ）、ＣＤ４５陽性細胞（Ｆ）、またはＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｇ）；およびＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率（Ｈ）を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｉ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ））。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｈ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｉ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 インビボでのＴ細胞ワクチン接種に対するＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果 Ａ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化されたｈＡｌｂ−ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ ＲＮＡの漸増用量を静脈内投与した。肝臓重量（Ｂ）；血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）活性（Ｃ）；血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ｄ）、ＣＤ８陽性細胞（Ｅ）、ＣＤ４５陽性細胞（Ｆ）、またはＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｇ）；およびＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率（Ｈ）を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｉ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ））。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｈ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｉ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 インビボでのＴ細胞ワクチン接種に対するＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果 Ａ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化されたｈＡｌｂ−ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ ＲＮＡの漸増用量を静脈内投与した。肝臓重量（Ｂ）；血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）活性（Ｃ）；血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ｄ）、ＣＤ８陽性細胞（Ｅ）、ＣＤ４５陽性細胞（Ｆ）、またはＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｇ）；およびＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率（Ｈ）を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｉ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ））。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｈ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｉ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔβγ変異の追加によるＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果の改善 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）またはＬＮＰとして製剤化された異なる用量のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ、ｈＩＬ２＿Ａ６−ｈＡｌｂおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ ＲＮＡを静脈内投与した。ｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｂ）およびＣＤ４ ＣＤ８陰性ＣＤ４９ｂ陽性ＮＫ細胞（Ｄ）の頻度を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｃ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋ＳＥＭ）。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ａ、Ｂ、Ｄ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｃ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔβγ変異の追加によるＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の効果の改善 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内（ｉ．ｖ．）ワクチン接種した。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）またはＬＮＰとして製剤化された異なる用量のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ、ｈＩＬ２＿Ａ６−ｈＡｌｂおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ ＲＮＡを静脈内投与した。ｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４ ＦｏｘＰ３ ＣＤ２５陽性細胞（Ｂ）およびＣＤ４ ＣＤ８陰性ＣＤ４９ｂ陽性ＮＫ細胞（Ｄ）の頻度を示す。点は個々のマウスを表し、線は群平均を表す。Ｃ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋ＳＥＭ）。統計的有意性は、一元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ａ、Ｂ、Ｄ）、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定（Ｃ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異を組み合わせたＩＬ２変異体は、野生型ＩＬ２およびｍｕｔβγ ＩＬ２変異体よりも優れている ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、０日目と７日目に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ−ＬＰＸを、３日目と１０日目にサイトカインＲＮＡ−ＬＮＰ（図に示されている用量）を静脈内ワクチン接種した。フローサイトメトリによる血液リンパ球の分析（実施例８参照）を７日目と１４日目に実施した（Ａ）。Ｂ、血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｃ、ＣＤ４ ＣＤ２５ ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ／μｌ血液（平均±ＳＥＭ）。Ｄ、血液１μｌあたりのＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。抗原特異的Ｔ細胞（Ｅ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｆ）対Ｔｒｅｇの比率を示す（平均±ＳＥＭ）。Ｇ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋ＳＥＭ）。Ｈ、ＣＤ１２７陰性ＫＬＲＧ１テトラマーＣＤ８陽性Ｔ細胞の平均（±ＳＥＭ）割合を示す。Ｉ、血液１μｌあたりのＣＤ４９陽性ＣＤ４ ＣＤ８陰性ＮＫ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｈ、マウスあたりのＫＬＲＧ１陽性ＮＫ細胞の割合を示す（線は群平均を表す）。統計的有意性は、二元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｆ、Ｈ、Ｉ）またはシダック検定（Ｇ）、または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定（Ｊ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異を組み合わせたＩＬ２変異体は、野生型ＩＬ２およびｍｕｔβγ ＩＬ２変異体よりも優れている ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、０日目と７日目に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ−ＬＰＸを、３日目と１０日目にサイトカインＲＮＡ−ＬＮＰ（図に示されている用量）を静脈内ワクチン接種した。フローサイトメトリによる血液リンパ球の分析（実施例８参照）を７日目と１４日目に実施した（Ａ）。Ｂ、血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｃ、ＣＤ４ ＣＤ２５ ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ／μｌ血液（平均±ＳＥＭ）。Ｄ、血液１μｌあたりのＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。抗原特異的Ｔ細胞（Ｅ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｆ）対Ｔｒｅｇの比率を示す（平均±ＳＥＭ）。Ｇ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋ＳＥＭ）。Ｈ、ＣＤ１２７陰性ＫＬＲＧ１テトラマーＣＤ８陽性Ｔ細胞の平均（±ＳＥＭ）割合を示す。Ｉ、血液１μｌあたりのＣＤ４９陽性ＣＤ４ ＣＤ８陰性ＮＫ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｈ、マウスあたりのＫＬＲＧ１陽性ＮＫ細胞の割合を示す（線は群平均を表す）。統計的有意性は、二元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｆ、Ｈ、Ｉ）またはシダック検定（Ｇ）、または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定（Ｊ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異を組み合わせたＩＬ２変異体は、野生型ＩＬ２およびｍｕｔβγ ＩＬ２変異体よりも優れている ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、０日目と７日目に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ−ＬＰＸを、３日目と１０日目にサイトカインＲＮＡ−ＬＮＰ（図に示されている用量）を静脈内ワクチン接種した。フローサイトメトリによる血液リンパ球の分析（実施例８参照）を７日目と１４日目に実施した（Ａ）。Ｂ、血液１μｌあたりのｇｐ７０抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｃ、ＣＤ４ ＣＤ２５ ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ／μｌ血液（平均±ＳＥＭ）。Ｄ、血液１μｌあたりのＣＤ８陽性Ｔ細胞数（平均±ＳＥＭ）。抗原特異的Ｔ細胞（Ｅ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｆ）対Ｔｒｅｇの比率を示す（平均±ＳＥＭ）。Ｇ、処置されたマウスのそれぞれの平均ｈＡｌｂ対照値に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の倍率変化を示す（平均＋ＳＥＭ）。Ｈ、ＣＤ１２７陰性ＫＬＲＧ１テトラマーＣＤ８陽性Ｔ細胞の平均（±ＳＥＭ）割合を示す。Ｉ、血液１μｌあたりのＣＤ４９陽性ＣＤ４ ＣＤ８陰性ＮＫ細胞数（平均±ＳＥＭ）。Ｈ、マウスあたりのＫＬＲＧ１陽性ＮＫ細胞の割合を示す（線は群平均を表す）。統計的有意性は、二元配置分散分析とダネットの多重比較検定（Ｂ〜Ｆ、Ｈ、Ｉ）またはシダック検定（Ｇ）、または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定（Ｊ）を使用して決定した。すべての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して実施した。ｎ．ｓ．：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの変異を組み合わせたＩＬ２変異体の投与はＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝７）に、０日目、７日目および１４日目に２０μｇのＢ１６＿Ｍ３０（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５））ＲＮＡ−ＬＰＸおよび３μｇのｈＡｌｂ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２またはｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ ＲＮＡ−ＬＮＰを静脈内投与した。１９日目に血液リンパ球をフローサイトメトリによって分析した（Ａ）。Ｂ１６＿Ｍ３０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞株のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ネオエピトープである（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５））。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓの同時投与のみが、ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞／非Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋）およびＢ１６＿Ｍ３０特異的テトラマー＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をそれぞれ増加させ（Ｂ、Ｃ）、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は増加させなかった。
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。
「約」という用語はおよそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個々に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
以下において、本開示のすべての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
定義
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」または「阻害する」とは、レベル、例えば結合レベルの、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少または全体的な減少を生じさせる能力を意味する。
「増加させる」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上、および最大約５０、約１００または約１５０までの、ペプチド結合によって互いに連結された連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約５０アミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常、同義語として使用される。
「治療用タンパク質」は、治療有効量で対象に提供された場合、対象の状態または病状に対してプラスのまたは有利な作用を及ぼす。一実施形態では、治療用タンパク質は治癒的または緩和的特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、緩和する、和らげる、逆転させる、発症を遅延させる、または重症度を軽減するために投与され得る。治療用タンパク質は予防特性を有し、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチド全体を含み、治療的に活性なその断片を指すこともできる。それはまた、タンパク質の治療的に活性な変異体を含み得る。治療的に活性なタンパク質の例には、サイトカインが含まれるが、これに限定されない。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列である配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得られる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、例えばオープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得られる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「変異体」または「変異体タンパク質」または「変異体ポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するもしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであり得るか、または野生型ポリペプチドの改変型であり得る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば親と比較して１〜約２０のアミノ酸修飾、好ましくは１〜約１０または１〜約５のアミノ酸修飾を有する。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、その後修飾されて変異体を生じる未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、または野生型ポリペプチドの変異体もしくは操作型であり得る。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型タンパク質またはポリペプチドは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、すべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体および種ホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置き換えることが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換には、以下の群内の置換が含まれる：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最適な配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動のほかに、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８、または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、当業者によって、例えば組換えＤＮＡ操作によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価の任意の断片または変異体に関する。サイトカインに関して、１つの特定の機能は、断片もしくは変異体が由来するアミノ酸配列によって、および／または断片もしくは変異体が由来するアミノ酸配列が結合する受容体（１つまたは複数）への結合によって示される１つ以上の免疫調節活性である。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では広く解釈されるように使用され、修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基のすべてまたは大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（１つまたは複数）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書ではまた、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることが企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５'非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３'非翻訳領域（３'−ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
一実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを有し得る。修飾リボヌクレオチドの例には、限定されることなく、５−メチルシチジン、プソイドウリジンおよび／または１−メチルプソイドウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５'キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５'−三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５'キャップ類似体によって修飾され得る。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められる構造を指し、一般に独特の５'−５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、５'キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに付加され得る。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'−ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'−ＵＴＲ）に存在し得る。５'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の、５'末端に位置する。５'−ＵＴＲは、５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。３'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終結コドンの下流の、３'末端に位置するが、「３'−ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'−ＵＴＲは、ポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは３'−ポリ（Ａ）配列を含む。「ポリ（Ａ）配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関する。本開示によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約８０、または少なくとも約１００、および最大約５００、最大約４００、最大約３００、最大約２００、または最大約１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含む。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の集合体に指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内などの適切な環境に存在する場合、翻訳過程中にそれがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の集合体に指令できることを意味する。一実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。細胞は、コードされたペプチドもしくはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質内および／もしくは核内で）産生し得るか、コードされたペプチドもしくはタンパク質を分泌し得るか、またはそれを表面上で産生し得る。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
本明細書で使用される場合、「半減期」は、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度が、例えば分解および／または天然の機構によるクリアランスもしくは隔離のために、インビボで５０％減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長ＰＫインターロイキン（ＩＬ）は、インビボで安定化されており、その半減期は、例えば血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合によって増加し、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者に明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程；前記対象から定期的な間隔で血液試料または他の試料を収集する工程；前記血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えばＫｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓなどの標準的なハンドブックおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に提供されている。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，２ｎｄ Ｒｅｖ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２）も参照されたい。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質（約５〜２０ｋＤａ）のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周りの細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない（用語が一部重複しているにもかかわらず）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマスト細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む、幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
インターロイキン−２（ＩＬ２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニットのマルチサブユニットＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒ）を介して媒介される：ｐ５５（ＩＬ２Ｒα、アルファサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても知られる）、ｐ７５（ＩＬ２Ｒβ、ベータサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても知られる）およびｐ６４（ＩＬ２Ｒγ、ガンマサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても知られる）。ＩＬ２に対するＴ細胞応答は、（１）ＩＬ２の濃度；（２）細胞表面上のＩＬ２Ｒ分子の数；および（３）ＩＬ２が占有するＩＬ２Ｒの数（すなわちＩＬ２とＩＬ２Ｒの間の結合相互作用の親和性）を含む様々な因子に依存する（Ｓｍｉｔｈ，「Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｑｕａｎｔａｌ」Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７６６：２６３−２７１，１９９５））。ＩＬ２：ＩＬ２Ｒ複合体はリガンド結合時に内在化され、様々な成分が異なる選別を受ける。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして投与された場合、ＩＬ２は急速な全身クリアランスを有する（半減期が１２．９分の初期クリアランス期、続いて半減期が８５分のより緩やかなクリアランス期）（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２００９−２０１７，１９９０）。
真核細胞では、ヒトＩＬ２は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０アミノ酸が除去されて成熟した分泌型ＩＬ２が生成される。組換えヒトＩＬ２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞および哺乳動物ＣＯＳ細胞において産生されている。
癌患者におけるＩＬ２の全身投与の結果は理想からほど遠い。患者の１５〜２０％は高用量のＩＬ２に客観的に応答するが、大多数は応答せず、多くが、吐き気、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックを含む重篤で生命を脅かす副作用を経験する。用量を減らし、投与レジメンを調整することによって血清濃度を低下させる試みがなされており、毒性は低くなるが、そのような治療は有効性も低かった。
本開示によれば、特定の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、薬物動態学的修飾基を含む。一実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体部分またはムテインは、薬物動態学的修飾基に結合される。以下、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２」と称される、得られた分子は、遊離ＩＬ２と比較して延長された循環半減期を有する。延長ＰＫ ＩＬ２の延長された循環半減期は、インビボで血清ＩＬ２濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的に、Ｔ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強につながる。その有利な薬物動態プロフィールのために、非修飾ＩＬ２と比較した場合、延長ＰＫ ＩＬ２はより少ない頻度で、より長期間投与することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒトＩＬ２」または「野生型ヒトＩＬ２」は、天然または組換えのいずれであるかにかかわらず、タンパク質が大腸菌において細胞内画分として発現される場合に必然的に含まれる追加のＮ末端メチオニンを伴うまたは伴わない、天然ヒトＩＬ２の通常発生する１３３アミノ酸配列（追加の２０個のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを除く）を有するＩＬ２を意味し、そのアミノ酸配列は、Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ．ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８０，７４３７−７４４１（１９８３）に記載されている。一実施形態では、ヒトＩＬ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒトＩＬ２の機能的変異体は、配列番号１７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるであるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒトＩＬ２の機能的変異体は、ＩＬ２受容体、特にＩＬ２受容体のアルファサブユニットに結合する。
本明細書に記載の特定の実施形態では、ＩＬ２変異体部分またはムテインは、異種ポリペプチド（すなわちＩＬ２ではなく、好ましくはＩＬ２の変異体ではないポリペプチド）に融合される。異種ポリペプチドは、ＩＬ２の循環半減期を増加させることができる。以下でさらに詳細に論じるように、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであり得る。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ２ムテイン」は、ＩＬ２の変異体（その機能的変異体を含む）、特にＩＬ２タンパク質への特定の置換が行われているポリペプチドを意味する。一実施形態では、ヒトＩＬ２タンパク質への置換は、少なくともαβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のアルファサブユニットと接触する位置で行われている。一実施形態では、そのような位置は、野生型ヒトＩＬ２において酸性または塩基性アミノ酸残基を有し、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基である場合、置換は塩基性アミノ酸残基によるものであり、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基である場合、置換は酸性アミノ酸残基によるものである。特に好ましい実施形態は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位のリジン（Ｌｙｓ）残基、４３位のリジン（Ｌｙｓ）残基、６１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基および６２位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基、またはそれらの任意の組合せを含む。
ＩＬ２ムテインは、他の非置換残基では野生型ＩＬ２と同一のアミノ酸配列を有し得る（すなわち、ＩＬ２ムテインは、「ｍｕｔＣＤ２５」変異、例えば配列番号２〜６のいずれか１つの配列が配列番号１７の配列とは異なる変異を含む）。しかしながら、ＩＬ２ムテインはまた、天然のＩＬ２ポリペプチド鎖の中または他の残基における１つ以上の部位でのアミノ酸の挿入、欠失、置換および修飾によっても特徴付けられ得る。本発明に従って、そのような挿入、欠失、置換および修飾は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を低下させながら、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を保持するＩＬ２ムテインをもたらし得る。
例えば、ＩＬ２ムテインはまた、例えば、野生型ＩＬ２と比較した場合、ＩＬ２Ｒβγに対する相対的に増加した親和性をもたらす、天然のＩＬ２ポリペプチド鎖内の１つ以上の部位または他の残基におけるアミノ酸置換によっても特徴付けられ得、そのためＩＬ２を介した刺激はもはやＩＬ２Ｒαの係合を必要としない（すなわちＩＬ２ムテインは、ｍｕｔＣＤ２５変異に加えて「ｍｕｔβγ」変異、例えば配列番号１８の配列が配列番号１７の配列とは異なる変異も含む）。そのような変異体は、強力なＩＬ２シグナル伝達アゴニストである。これらの変異は、ＩＬ２Ｒβおよび／またはＩＬ２Ｒγと接触するアミノ酸残基に存在し得る。
様々な実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２ムテインは、野生型ＩＬ２の２４位、６５位、７４位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９２位、および９３位の残基の１つ以上の置換によって野生型ＩＬ２とは異なり得る。置換されたアミノ酸残基（１つまたは複数）は、必ずというわけではないが、保存的置換であり得る。
例えば、変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉであり得る。
一実施形態では、ＩＬ２ムテインが提供され、ムテインは以下のアミノ酸置換のセットを含む：８０Ｆ／８１Ｄ／８５Ｖ／８６Ｖ／９２Ｆ。ムテインは、アミノ酸置換４２Ａをさらに含み得る。ムテインは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上をさらに含み得る：２４Ｖ、６５Ｈ、７４Ｒ、７４Ｈ、７４Ｎ、７４Ｓ、８９Ｖ、９３Ｉ。
いくつかの実施形態では、ＩＬ２ムテインが提供され、ムテインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む：
（ｉ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉ）７４Ｈ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｉｉ）７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｉｖ）７４Ｎ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆ；
（ｖｉ）８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ；
（ｖｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）１８Ｒ、２２Ｅ、７４Ｓ、８０Ｆ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｖ、９２Ｆ、９３Ｉ、１２６Ｔ。
「野生型ＩＬ２に従って番号付けされた」とは、選択されたアミノ酸を、そのアミノ酸が野生型ＩＬ２の成熟配列において通常生じる位置を参照して同定することを意味する。ＩＬ２ムテインに挿入または欠失が行われる場合、当業者は、特定の位置で通常生じるアミノ酸がムテイン内の位置でシフトされ得ることを理解するであろう。しかしながら、シフトされたアミノ酸の位置は、隣接するアミノ酸と野生型ＩＬ２のアミノ酸に隣接するアミノ酸との精査および相関によって容易に決定することができる。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって生成することができる。そのような方法は、ＩＬ２をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入すること、またはＩＬ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質のインビトロ合成によるものを含む。例えば、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築し、それらの配列を、適切に形質転換された宿主または任意の他の適切な発現系において発現させ得る。この方法は、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドおよび／またはそれをコードするＲＮＡを生成する。しかしながら、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドはまた、あまり好ましくはないが、化学合成によっても生成され得る。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ２がＩＬ２Ｒαβγに結合する親和性よりも低い親和性でＩＬ２Ｒαβγに結合し得る。一実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ２がＩＬ２Ｒβγに結合する親和性よりも高い親和性でＩＬ２Ｒβγに結合し得る。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドのＩＬ２Ｒαβγに対する親和性は、野生型ＩＬ２がＩＬ２Ｒαβγに結合する親和性よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍低い可能性がある。さらに、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドのＩＬ２Ｒβγに対する親和性は、野生型ＩＬ２がＩＬ２Ｒβγに結合する親和性よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い可能性がある。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、ＩＬ２Ｒβγに対して、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い親和性を有し得る。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、特にエフェクタＴ細胞および／またはＮＫ細胞を刺激する能力と比較した場合、制御性Ｔ細胞を刺激する能力が野生型ＩＬ２よりも低下している可能性がある。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸残基の変異（例えば欠失、付加、または置換）を有し得る。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ２と少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、以下の特性の１つ以上、好ましくはすべてを有する：
１）ＩＬ２Ｒβγにおけるアゴニスト作用。この特性は、ＩＬ２に依存する細胞株を用いたインビトロ増殖アッセイで直接評価することができる。
２）野生型ＩＬ２と比較して、制御性Ｔ細胞のインビトロおよび／またはインビボ集団を刺激する能力の喪失。この特性は、例えば、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導するムテインの能力を、野生型ＩＬ２の能力と比較して検討することによって評価できる。
３）動物モデルでの天然ＩＬ２に関する治療効果の増加。この特性は、例えば、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドと野生型ＩＬ２の抗腫瘍または抗転移効果を、移植可能な腫瘍モデル（例えばＢ１６黒色腫）における単剤療法として比較することによって評価できる。また、目的のワクチンに対する細胞性および／または体液性応答の増強作用を通して評価することもできる。
多くの免疫細胞は、活性化時にＩＬ２Ｒαβγを一過性に上方制御して、ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングを含む免疫応答を開始する際のＩＬ２感受性を高める。ＩＬ２によるいくらかのＩＬ２Ｒαβγ結合が必要であり得るため、本発明は、野生型ＩＬ２などのＩＬ２Ｒβγに対して選択的な親和性を示さないＩＬ２（その機能的変異体を含む）と組み合わせた、本明細書に記載のＩＬ２Ｒβγ選択的ＩＬ２変異体ポリペプチドの混合物の使用を想定する。特定の実施形態では、ＩＬ２Ｒβγに対して選択的な親和性を示さないＩＬ２に対する本明細書に記載のＩＬ２Ｒβγ選択的ＩＬ２変異体ポリペプチドのモル比は、５０：１〜１：１、２０：１〜２：１、１０：１〜５：１、または５：１〜３：１である。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、ＩＬ２変異体部分と異種ポリペプチド（すなわちＩＬ２またはその変異体ではないポリペプチド）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。ＩＬ２変異体は、循環半減期を増加させる延長ＰＫ基に融合し得る。延長ＰＫ基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはその変異体の循環半減期を増加させる他のＰＫ基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンドメイン（例えばマウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。
本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたは一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長ＰＫ基の例には、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）、ＦｃまたはＦｃ断片およびその変異体、トランスフェリンおよびその変異体、ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号に開示されている）が含まれる。他の例示的な延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１；２２：８６８−８７６およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；１６：９０３−１５に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ ＩＬ」は、延長ＰＫ基と組み合わせたインターロイキン（ＩＬ）部分（ＩＬ変異体部分を含む）を指す。一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬは、ＩＬ部分が延長ＰＫ基に連結または融合されている融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、ＩＬ２部分がＨＳＡと融合されているＨＳＡ／ＩＬ２融合物である。
特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬの血清半減期は、ＩＬ単独（すなわち延長ＰＫ基に融合されていないＩＬ）と比較して増加している。特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬの血清半減期は、ＩＬ単独の血清半減期と比較して少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、または１０００％長い。特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬの血清半減期は、ＩＬ単独の血清半減期より少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬの血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミン、またはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、そのすべてが「アルブミン」という用語に含まれる）を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン（またはその断片もしくは変異体）に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）と、治療用タンパク質、特にＩＬ２（またはその変異体）などの少なくとも１分子のタンパク質との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合している核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、ひとたびアルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」、または「部分」（例えば「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と称され得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療用タンパク質（治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない）および少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない）を含む。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたＲＮＡの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環に分泌される。ＲＮＡの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で起こる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合の形成、適切な折り畳み、炭水化物の付加とプロセシング（例えばＮ−結合型およびＯ−結合型グリコシル化など）、特異的タンパク質分解切断、ならびに／または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのＮ末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態のＲＮＡによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断されているプロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「プロセシングされた形態のアルブミン融合タンパク質」は、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも称される、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指す。
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの器官へとクリアランスされ、最終的に治療用タンパク質が体内からクリアランスされるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の変異体を指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、雌鶏およびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物由来であり得る。
特定の実施態様では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくは変異体、例えば米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、および国際公開第２０１１／０５１４７８９号に開示されているものである。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミンおよび「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン（およびその断片と変異体）ならびに他の種由来のアルブミン（およびその断片と変異体）を包含する。
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含み得るか、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその１つ以上の断片を含み得る。そのような断片は、１０個以上のアミノ酸の長さであり得るか、またはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにわたるＨＳＡの１つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、ＨＳＡ断片は、ＨＳＡの成熟形態である。
一般的に言えば、アルブミン断片または変異体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくは変異体であり得る。アルブミンは、ヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、アルブミンは、配列番号２１のアミノ酸配列または配列番号２１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンを含み、Ｃ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端とＣ末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。一実施形態では、異なる治療用タンパク質は、同じまたは関連する疾患、障害、または状態を治療または予防するために有用であり得る。一実施形態では、異なる治療用タンパク質は両方ともサイトカインであり、異なる治療用タンパク質の一方はＩＬ２変異体であり、他方は、好ましくはＩＦＮβなどのインターフェロンである。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端に融合したＩＦＮβおよびＣ末端に融合したＩＬ２変異体を有する。
一実施形態では、治療用タンパク質（１つまたは複数）は、ペプチドリンカー（１つまたは複数）を介してアルブミンに結合される。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間の、より大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるようにアミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば上部、中間および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわちヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えばヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃおよびＦｃ変異体分子を包含する。本明細書に記載されるように、任意のＦｃドメインを、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然のＦｃドメインとは異なるように修飾し得ることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクタ機能（例えばＦｃγＲ結合）が低下している。
本明細書に記載されるポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、Ｆｃドメインもしくはその断片、またはＦｃドメインもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、そのすべてが「Ｆｃドメイン」という用語に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から入手し得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）種または非ヒト霊長動物（例えばチンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。
さらに、Ｆｃドメイン（またはその断片もしくは変異体）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えばマウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な寄託物の形で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠く、および／または免疫原性を低下させるための特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその断片もしくは変異体）は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から導くことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／０２８７１５３号、米国特許出願第２００７／０００３５４９号、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２００７／０２６９４２２号、米国特許出願第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第２００９／０８３８０４号、および国際公開第２００９／１３３２０８号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわちヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
特定の態様では、本開示による使用に適した延長ＰＫ ＩＬは、１つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列中の２つ以上のドメイン（例えば延長ＰＫ部分およびＩＬ２などのＩＬ部分）を接続するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、ＩＬ２部分をＨＳＡドメインに接続し得る。
例えばＩＬ２に延長ＰＫ基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーには、グリシン−セリンポリペプチドリンカー、グリシン−プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーが含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンポリペプチドリンカー、すなわちグリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、「マーカ」または「レポータ」をコードする配列を含むことができる。マーカまたはレポータ遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β−ガラクトシダーゼ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。
本開示による使用に適したペプチドおよびタンパク質抗原は、典型的には、免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を含む。ペプチドまたはタンパク質またはエピトープは、標的抗原、すなわちそれに対して免疫応答が誘発されるべき抗原に由来し得る。例えば、ペプチドもしくはタンパク質抗原またはペプチドもしくはタンパク質抗原内に含まれるエピトープは、標的抗原または標的抗原の断片もしくは変異体であり得る。
本開示に従って（それ自体で、またはペプチドおよびタンパク質抗原をコードするＲＮＡとして）投与されるペプチドおよびタンパク質抗原、すなわちワクチン抗原は、好ましくは、抗原を投与される対象においてＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または増殖をもたらす。前記刺激された、プライミングされたおよび／または拡大されたＴ細胞は、好ましくは標的抗原、特に疾患細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられる。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原、またはその断片もしくは変異体を含み得る。一実施形態では、そのような断片または変異体は、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原の変異体」という用語は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす作用物質を意味し、刺激、プライミングおよび／または拡大されたＴ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とする。したがって、本開示に従って投与されるワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る、疾患関連抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得る、または疾患関連抗原もしくはその断片に相同である抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。本開示に従って投与されるワクチン抗原が、疾患関連抗原の断片または疾患関連抗原の断片に相同であるアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、疾患関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープ、または疾患関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープに相同である配列を含み得る。したがって、本開示によれば、投与される抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片、または疾患関連抗原の免疫原性断片に相同であるアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞を刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原は（疾患関連抗原と同様に）、Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、抗原提示細胞などの細胞によって提示され得ることが好ましい。本開示に従って投与されるワクチン抗原は、組換え抗原であり得る。
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的作用の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的作用を発揮することを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化のために使用される抗原または抗原変異体の免疫学的作用または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞などの対象の免疫系に暴露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ作用を発揮する。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞への分化を引き起こす過程を指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのそのプロセシング産物は、一実施形態では、Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。したがって、疾患関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連し得るか、または癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。腫瘍抗原は、典型的には癌細胞によって選択的に発現され（例えば非癌細胞上よりも癌細胞においてより高いレベルで発現される）、いくつかの場合には、癌細胞によってのみ発現される。腫瘍抗原の例には、限定されることなく、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β‐カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−６、クローディン−１８．２およびクローディン−１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ−１が含まれる。
「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５〜約１００、例えば約５〜約５０、より好ましくは約８〜約３０、最も好ましくは約１０〜約２５アミノ酸の長さであり得、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０〜約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８〜約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０〜約２５アミノ酸長であり、特に約１３〜約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または類似の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であると見なされる。Ｔ細胞の特異性は、例えばクロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で、様々な標準的技術のいずれかを使用して評価し得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を防止するＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは免疫抑制性であり、一般にエフェクタＴ細胞の誘導と増殖を抑制または下方制御する。Ｔｒｅｇは、バイオマーカであるＣＤ４、ＦｏｘＰ３、およびＣＤ２５を発現する。
本明細書で使用される場合、「ナイーブＴ細胞」という用語は、活性化またはメモリＴ細胞とは異なり、末梢内でそれらの同族抗原に遭遇していない成熟Ｔ細胞を指す。ナイーブＴ細胞は一般に、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、活性化マーカＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在、およびメモリＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「メモリＴ細胞」という用語は、以前にそれらの同族抗原に遭遇し、それに応答したＴ細胞のサブグループまたは亜集団を指す。抗原との２回目の遭遇時に、メモリＴ細胞は、免疫系が最初に抗原に応答したときよりも速く、より強い免疫応答を開始するように再生され得る。メモリＴ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得、通常はＣＤ４５ＲＯを発現し得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で提供されるように、ＮＫ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
一実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原であり、エピトープを含むペプチドもしくはタンパク質またはその断片（例えばエピトープ）は、腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、様々な癌で発現されることが一般的に公知の「標準」抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、それまで免疫系によって認識されていなかった「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。腫瘍抗原がネオ抗原である場合、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ネオ抗原のエピトープまたは断片を含む。
癌の変異は各個人によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するために使用できる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現のための特に興味深い抗原提示細胞である。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療効果を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定は、本明細書に記載のＲＮＡによってコードされ得る個別化ワクチンのための複数のエピトープを、例えばエピトープが任意にリンカーによって分離されている単一のポリペプチドとして提供し得る。本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０のエピトープをコードする。例示的な実施形態には、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と称される）をコードするＲＮＡおよび少なくとも１０のエピトープ（「デカトープ」と称される）をコードするＲＮＡが含まれる。
ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む、２〜１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０個を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１００個を超えるアミノ酸であり得る。
ペプチドまたはタンパク質抗原は、ペプチドまたはタンパク質に対する抗体およびＴ細胞応答を生じさせる免疫系の能力を誘導または増加させることができる任意のペプチドまたはタンパク質であり得る。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載される他の治療薬（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ、および任意でエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）と組み合わせて使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、抗原のＴ細胞受容体認識の大きさおよび質を調節する共刺激および阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ２８結合を置き換えるＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９との間の相互作用である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、妨げるまたは調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害性シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイントブロッカータンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣物、例えばＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を防げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３とそのリガンド、またはＴＩＭ−３とそのリガンドとの間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント阻害剤はまた、分子（またはその変異体）自体の可溶性形態、例えば可溶性ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１融合物の形態であってもよい。
「プログラム死１（ＰＤ−１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。ＰＤ−１は、インビボで以前に活性化されたＴ細胞上で主に発現され、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の２つのリガンドに結合する。本明細書で使用される「ＰＤ−１」という用語は、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ−１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）」は、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ−１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（もう１つはＰＤ−Ｌ２）である。本明細書で使用される「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−Ｌ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することによって免疫系を下方制御する。本明細書で使用される「ＣＴＬＡ−４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）、ｈＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ−４と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによるリンパ球活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を高め、ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞の機能を阻害する。本明細書で使用される「ＬＡＧ３」という用語は、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）」は、ＴＨ１細胞応答の阻害によるリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類の癌で上方制御されるガレクチン９である。本明細書で使用される「ＴＩＭ３」という用語は、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｂ７ファミリー」は、未定義の受容体との阻害性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーはＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４を包含し、どちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方制御される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法での使用に適した免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、またはＴＩＭ３を標的とする抗体である。これらのリガンドと受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２−２６４，２０１２で総説されている。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する小分子である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＰＤ−１受容体とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体は、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−１に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＴＬＡ４を標的とし、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＬＡＧ３を標的とし、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の成分である。特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４である。したがって、本開示の特定の実施形態は、Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。Ｂ７ファミリーは定義された受容体を有さないが、これらのリガンドは腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で上方制御される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を増強できることを示している。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＩＭ３を標的とし、ガレクチン９とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
標的化が、例えばＴ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ２）に反映されるような抗腫瘍免疫応答などの免疫応答の刺激をもたらすことを条件として、他の免疫チェックポイント標的もまた、アンタゴニストまたは抗体によって標的化され得ることが当業者に理解されるであろう。
本開示によれば、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない、様々な種に由来し得る。
本明細書に記載される抗体には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１、カッパもしくはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
抗体の「抗原結合部分」（もしくは単に「結合部分」）または抗体の「抗原結合断片」（もしくは単に「結合断片」）という用語または同様の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ'）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）任意で合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）として作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号にさらに開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチド、特にＩＬ２変異体ポリペプチドおよび／または抗原が、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡの形態で投与されることは、本発明によれば特に好ましい。一実施形態では、本明細書に記載の異なるペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、異なるＲＮＡ分子によってコードされる。
本開示によれば、本明細書に記載のＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは標的細胞によって翻訳されて、コードされたペプチドまたはタンパク質を生成する。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるＲＮＡ（ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ、および任意でエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）の特定組織への標的化送達を含む。
一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡが、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。
一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は脾臓の樹状細胞である。
「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
ＲＮＡは、カチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して注射可能なナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質の溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームをＲＮＡと混合することによって調製され得る。脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的化するために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質とＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成し得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電したＲＮＡを脂質マトリックスに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質の例には、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、２，３−ジ（テトラデコキシ）プロピル−（２−ヒドロキシエチル）−ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。
ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷と負電荷の全体的な比率および物理的安定性を調整するために、さらなる脂質を組み込んでもよい。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、または約３：１〜約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約２：１である。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷とＲＮＡに存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。
生理的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、正電荷と負電荷の電荷比が約１．９：２〜約１：２などの正味の負電荷を有する。特定の実施形態では、生理的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷と負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
ＲＮＡ送達システムは、肝臓への固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性のナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲートの親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関係する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質またはコレステロールコンジュゲート）によって引き起こされる。
本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドの標的送達の一実施形態では、標的器官は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。そのような標的組織への送達は、特に、この器官または組織におけるＩＬ２変異体ポリペプチドの存在が望ましい場合、および／または大量のＩＬ２変異体ポリペプチドを発現することが望ましい場合、および／またはＩＬ２変異体ポリペプチドの全身的な存在、特に有意の量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。
一実施形態では、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡは、肝臓を標的とするための製剤中で投与される。そのような製剤は、本明細書で上記に記載されている。
肝臓へのＲＮＡのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってＲＮＡを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面とｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、ナノミセルが生理的条件下でＲＮＡの卓越したインビボ安定性を提供するため、有用なシステムである。さらに、密なＰＥＧパリセードで構成されるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。
本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子およびさらなる作用物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤は、治療的または予防的治療のための医薬組成物または薬剤中で投与されてもよく、任意の適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な作用物質を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。本開示の文脈において、医薬組成物は、本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子および／またはさらなる作用物質を含む。
本開示の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得るか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。ケモカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが含まれる。
本開示による医薬組成物は、一般に「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的に有効な量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする作用物質に関する。さらに、「希釈剤」という用語には、流体、液体もしくは固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上が含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体には、限定されることなく、滅菌水、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準製薬法に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、胃腸管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、胃腸管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与による。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物（例えばＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡ、エピトープおよび任意で免疫チェックポイント阻害剤を含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）が同じ患者に投与される過程を意味する。ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡとエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。投与が連続的に行われる場合、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡは、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡの投与の前または後に投与され得る。投与が同時に行われる場合、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡとエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同じ組成物内で投与される必要はない。ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、１回以上投与されてもよく、各成分の投与回数は同じであっても異なっていてもよい。さらに、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同じ部位に投与される必要はない。
ＩＬ２変異体ポリペプチド、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法は、様々な疾患、特に癌、自己免疫疾患、感染症などの対象へのＩＬ２、特に本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドの提供が治療または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的治療において、高齢者または免疫無防備状態の個体における免疫刺激のための癌ワクチンおよび従来のワクチン療法のワクチンアジュバントにおいて、ならびにＨＩＶまたはヒトＳＣＩＤ患者において、または任意の適切な動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける免疫系の一般的な刺激を必要とする他の治療用途において使用され得る。ＩＬ２は多くの作用を有する。これらのいくつかは、Ｔ細胞、特にメモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞および／もしくはエフェクタＴ細胞、ならびに／またはＮＫ細胞の刺激である。本明細書に記載のＩＬ２変異体ポリペプチドは、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞および／またはエフェクタＴ細胞などの中親和性ＩＬ２受容体のみを発現する細胞型に対して活性を有するが、制御性Ｔ細胞などの高親和性ＩＬ２受容体には活性を有さない。したがって、ＩＬ２が、そのＴ細胞活性により、有効な治療法を提供すると期待される疾患の治療における、ＩＬ２変異体ポリペプチド、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＩＬ２変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法の使用が企図される。
あるいは、または患者への直接投与の方法に加えて、いくつかの実施形態では、ＩＬ２変異体ポリペプチドをエクスビボの方法で使用することができる。例えば、細胞（例えば患者から単離され、培養物中に配置または維持される末梢血リンパ球または精製されたリンパ球の集団）は、培養培地にてインビトロで培養することができ、接触工程は、ＩＬ２変異体ポリペプチドおよび／またはそれらをコードするポリヌクレオチドを培養培地に添加することによって影響され得る。培養工程は、例えば増殖を刺激するため、または目的の抗原（例えば癌抗原もしくはウイルス抗原）に反応性である細胞の集団を拡大するために、細胞を刺激するかまたは他の薬剤で処理するさらなる工程を含み得る。次いで、細胞は、処理された後、患者に投与される。
「疾患」という用語は、個体の身体を侵す異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、苦痛、社会問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした、対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、予防は、疾患、状態または障害と闘う目的での個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的治療」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長（増加）させる任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していてもよくまたは有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与して、治療的であり得るかまたは部分的もしくは完全に保護的であり得る、対象における前記エピトープを含む抗原に対する免疫応答を誘発し得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫防御反応が生じるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的治療において有用である。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。細胞性免疫応答には、限定されることなく、抗原を発現し、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子による抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答が含まれる。細胞応答はＴリンパ球に関連し、Ｔリンパ球は、免疫応答を制御することによって中心的な役割を果たすヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）、または感染した細胞もしくは癌細胞におけるアポトーシスを誘導するキラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＣＴＬとも称される）として分類され得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物を投与することは、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を含む。特定の実施形態では、腫瘍抗原はクラスＩ ＭＨＣ分子と共に提示される。
本開示は、保護的、防御的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導前に存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」には、「免疫応答を増強する（または増強すること）」が含まれる。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫または抗原ワクチン接種を含む。
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療的または予防的理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する過程を表す。
本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子およびさらなる作用物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を前記対象に提供することが治療効果または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的治療に使用され得る。例えば、ウイルスに由来する抗原またはエピトープを提供することは、前記ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープを提供することは、癌細胞が前記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療に有用であり得る。
一実施形態では、本開示は、脾臓組織を標的とする本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子などのＲＮＡ製剤が投与される実施形態を想定する。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載されるような、例えばエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。ＲＮＡは、樹状細胞などの脾臓内の抗原提示細胞によって取り込まれ、ペプチドまたはタンパク質を発現する。抗原提示細胞による任意のプロセシングおよび提示に続いて、エピトープに対する免疫応答が生じ、エピトープまたはエピトープを含む抗原が関与する疾患の予防的および／または治療的治療がもたらされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡによって誘導される免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞による抗原またはエピトープなどのその断片の提示、ならびにこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。例えば、ＲＮＡによってコードされるペプチドもしくはタンパク質またはそのプロセシング産物は、抗原提示細胞上に発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。次に、ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞によって認識され、それらの活性化をもたらすことができる。
したがって、本開示は、抗原が関与する疾患、好ましくは癌疾患の予防的および／または治療的治療に使用するための、本明細書に記載されるＲＮＡに関する。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内に外来病原体を非特異的に飲み込み、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、Ｔ細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化と免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初は未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用と低いＴ細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体の周囲環境を絶えずサンプリングしている。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの断片を細胞表面に提示する。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化の共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として機能し、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞、ならびに非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってＢ細胞も活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞関連の免疫応答を積極的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面で）少なくとも１つの抗原または抗原性断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
「抗原が関与する疾患」または「エピトープが関与する疾患」という用語は、抗原またはエピトープが関係する任意の疾患、例えば抗原またはエピトープの存在によって特徴付けられる疾患を指す。抗原またはエピトープが関与する疾患は、感染症、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり得、エピトープはそのような抗原に由来し得る。
「感染症」という用語は、個体から個体へ、または生物から生物へと伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患（例えば普通の風邪）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、例えばウイルス性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患が含まれ、これらの疾患は、それぞれウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる。これに関して、感染症は、例えば肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、およびインフルエンザであり得る。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
癌治療における併用戦略は、結果として生じる相乗効果のために望ましい場合があり、これは単剤療法アプローチの影響よりもかなり強力であり得る。一実施形態では、医薬組成物は免疫療法剤と共に投与される。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特定の免疫応答および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）の活性化に関与し得る任意の作用物質に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘束されることを望むものではないが、抗体は、アポトーシスを誘導する、シグナル伝達経路の成分をブロックする、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、様々な機構を通して癌細胞に対する治療効果を達成することができる。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導し得るか、または補体タンパク質に結合して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られる直接的な細胞傷害性をもたらし得る。本開示と組み合わせて使用し得る抗癌抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）の非限定的な例には、アバゴボマブ（ＣＡ−１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ−００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ−β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ−Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬΙβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマ（ＣＡ−１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ−Ｒ ａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ−１２５）、オキセルマブ（ＯＸ−４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（ＭＵＣ１）、ペルツズマ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（α−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（ＩＬ１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４−１ ＢＢ）、ボロキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ １６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）が含まれる。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関するすべての記述は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さについての承認を構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の機器、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
（実施例１）
構築物の設計およびｍＲＮＡの作製
サイトカインをコードするｍＲＮＡのインビトロ転写は、ｐＳＴ１−Ｔ７−ＡＧＡ−ｄＥａｒＩ−ｈＡｇ−ＭＣＳ−ＦＩ−Ａ３０ＬＡ７０プラスミド骨格および誘導体ＤＮＡ構築物に基づいた。これらのプラスミド構築物は、５'ＵＴＲ（非翻訳領域、ホモサピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ヘモグロビンサブユニットα１（ｈＡｇ）の５'−ＵＴＲの誘導体）、３'ＦＩエレメント（Ｆはスプリットのアミノ末端エンハンサの１３６ヌクレオチド長の３´−ＵＴＲ断片であるｍＲＮＡであり、Ｉはミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ＲＮＡの１４２ヌクレオチド長の断片であり、両方ともホモサピエンスにおいて同定されている；国際公開第２０１７／０６０３１４号）、および１００ヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部と、７０ヌクレオチドの後にリンカーを含む。サイトカインおよび血清アルブミン（ｈＡｌｂ）をコードする配列はホモサピエンスに由来し、以下で説明するｍｕｔＩＬ２変異体の意図した変異を除いて、結果として生じるアミノ酸配列の変化は導入しなかった（ｈＩＬ２：ＮＰ＿０００５７７．２；ＮＣＢＩタンパク質リソース；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／）。ｈＡｌｂを、ＩＬ２変異体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに、インビトロおよびインビボで同様に有効である両方の配向で付加した（データは示していない）。コードされるタンパク質は、それぞれのタンパク質の天然シグナルペプチドであるＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）を備える。融合タンパク質の場合、Ｎ末端部分のＳＰのみを維持し、さらなる部分については成熟部分（ＳＰのないタンパク質）のみをコードした。終止コドンは、ほとんどのＣ末端部分についてのみ導入した。サイトカインおよびｈＡｌｂ融合構築物の異なるタンパク質部分は、グリシンおよびセリン残基をコードする３０ヌクレオチド長のリンカー配列によって分離した。ｈＩＬ２配列の変異を導入して、ＣＤ２５結合を改変し（「ｍｕｔＣＤ２５」変異と称し、それぞれの構築物をｈＩＬ２＿Ａｘと命名し、ｘは以下で定義される）、およびＩＬ２Ｒβγへの結合を改変した（「ｍｕｔβγ」変異と称し、それぞれの構築物を追加の「ｓ」で表示し、例えばｈＩＬ２ｓまたはｈＩＬ２＿Ａ４ｓと表示する）。ｈＩＬ２＿Ａ１の場合、成熟ドメインの４つのアミノ酸残基置換を導入し、３８位のアルギニンをアラニンに変更し（Ｒ３８Ａ）、４２位のフェニルアラニンをアラニンに変更し（Ｆ４２Ａ）、４５位のチロシンをアラニンに変更し（Ｙ４５Ａ）、６２位のグルタミン酸をアラニンに変更した（Ｅ６２Ａ）（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０，６２３０−６２３８（２０１３））。ｈＩＬ２＿Ａ２については、成熟ドメインのアミノ酸残基置換は、Ｋ３５Ａ、Ｋ４３ＡおよびＥ６１Ａである。ｈＩＬ２＿Ａ３については、置換Ｋ３５Ｅ、Ｋ４３ＥおよびＥ６１Ｋを導入し、ｈＩＬ２＿Ａ４にはＫ４３ＥおよびＥ６１Ｋ、ｈＩＬ２＿Ａ５にはＥ６１Ｋ、およびｈＩＬ２＿Ａ６にはＥ６２Ｋ変異を導入した。ｈＩＬ２ ｍｕｔβγ変異体の生成のために、それぞれのｈＩＬ２変異体の成熟ドメインのアミノ酸残基を、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６ＶおよびＩ９２Ｆの方法で置換した（Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４８４，５２９−５３３（２０１２））。ｍＲＮＡは、通常のヌクレオシドであるウリジンを１−メチルプソイドウリジンに置き換えて、Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７−８７（２００７））によって記述されているようにインビトロ転写によって生成した。得られたｍＲＮＡはキャップ１構造を備えており、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）分子を枯渇させた。精製したｍＲＮＡをＨ２Ｏで溶出し、さらに使用するまで−８０°Ｃで保存した。記載されているすべてのｍＲＮＡ構築物のインビトロ転写は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＲＮＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨで実施された。その後の実験で使用したすべての構築物のリストを表１に示す。
Figure 2021531013
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Figure 2021531013
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（実施例２）
ＲＮＡにコードされたＩＬ２変異体のインビトロ発現およびＩＬ２Ｒβγ結合
生成されたｍＲＮＡのインビトロ発現を、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞へのｍＲＮＡのリポフェクションと、それに続くＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体によるＩＬ２Ｒβγ発現レポータ細胞のＣＤ２５非依存性活性化の分析によって分析した（図１）。リポフェクションの１日前に、１．２ｘ１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、６ウェルプレート中の３ｍＬ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号３１９６６−０２１）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）に播種した。リポフェクションのために、３μｇのｍＲＮＡを無菌のＲＮアーゼ不含条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ０１５）１μＬあたり４００ｎｇのｍＲＮＡを使用して製剤化し、１０ｃｍ２の培養皿ごとに約８０％の集密度でＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞に適用した。２０時間の発現後に、上清を無菌条件下で収集し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。ＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体のＩＬ２Ｒβγ依存性生物活性を、中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を発現するＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγ細胞の特異的増殖応答を測定することによって評価した。この細胞株は、ＩＬ２Ｒ共通γ鎖を天然に発現するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ−１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２００３）から、Ｆａｒｎｅｒ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８６，４５６８−４５７８（１９９５）と同様に、ヒトＩＬ２Ｒβ鎖の配列をコードするレトロウイルスベクター（遺伝子ＩＤ：３５６０）による形質導入によって生成した。手短に言うと、ＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγ細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１１３６００７０）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７００１０）に再懸濁した。合計５，０００細胞／ウェルを白色９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号１００７２１５１）に播種し、ＩＬ２変異体含有上清の４倍段階希釈液と共にインキュベートした。３日間の培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２４２）を使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。発光をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）で記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットした。
（実施例３）
ＲＮＡにコードされたＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の組換えＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）への結合
ｍＲＮＡにコードされたＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の組換えＣＤ２５への結合をＥＬＩＳＡによって分析した（図２）。ここで、１μｇ／ｍＬの組換えヒトまたはマウスＣＤ２５（Ｃ−Ｆｃ、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎカタログ番号ＣＪ７８、ＣＫ３２）を、１００μＬのＤＰＢＳ中で高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３９４５４）に被覆した。ＨＥＫ−２９３−Ｔ−１７のリポフェクションによって生成されたＩＬ２変異体含有上清（実施例２に記載）を、被覆したＣＤ２５に適用し、結合したタンパク質をＨＲＰ結合抗ヒト血清アルブミン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ８９４１）によって検出した。一般的なＥＬＩＳＡ試薬と手順を、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ００８）のプロトコルに従って適用した。
図２に示すように、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２はヒトとマウスの両方のＣＤ２５に強く結合した。ヒトＣＤ２５に関しては、ｍｕｔＣＤ２５変異体Ａ１、Ａ３、Ａ４およびＡ６の結合は完全に失われたが、変異体Ａ２およびＡ５は、ヒトＣＤ２５へのいくらかの残留結合を示した（図２Ａ）。対照的に、すべてのｍｕｔＣＤ２５変異体がマウスＣＤ２５に結合する能力を喪失した（図２Ｂ）。
（実施例４）
ＲＮＡにコードされたＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体のＣＤ２５依存性ＣＴＬＬ−２増殖に対する生物活性。
ＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の生物学的活性を、ＣＤ２５を高発現するマウスＣＴＬＬ−２細胞（マウスＣ５７ＢＬ／６ Ｔ細胞株、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２１４）のサイトカイン依存性増殖を分析することによって評価した（図３）。手短に言うと、ＣＴＬＬ−２細胞を回収し、ＤＰＢＳで２回洗浄して残留ＩＬ２を除去し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１１３６００７０）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７００１０）に再懸濁した。合計５，０００細胞／ウェルを白色９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号１００７２１５１）に播種し、４倍に段階希釈したＩＬ２変異体含有上清（実施例２に記載）と共にインキュベートした。３日間の培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２４２）を使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。発光をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）で記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットした。
野生型ｈＡＬｂ−ｈＩＬ２は、用量依存的にＣＴＬＬ−２細胞の増殖を誘導し、５０％効果濃度（ＥＣ５０）は０．２１４４％上清であった（図３）。ｍｕｔＣＤ２５変異体Ａ２およびＡ５は、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と同等に機能し、それぞれ０．１９３３％上清および０．２１２７％上清の範囲のＥＣ５０値にも反映された。対照的に、ＩＬ２変異体Ａ１はＥＣ５０値の約１０００倍の減少を示し、ＣＴＬＬ−２細胞に対する生物学的活性をほぼ欠如していた。しかし、変異体Ａ３、Ａ４、およびＡ６は、Ａ３では１５．１０％上清、Ａ４では１１．４３％上清、およびＡ６では７．７８５％上清の範囲のＥＣ５０値でＣＴＬＬ−２細胞の増殖を誘導し、それにより、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約５０倍減少した中間の生物学的活性を示した（図３）。
（実施例５）
ＲＮＡにコードされたＩＬ２変異体のヒトＰＢＭＣ増殖に対する生物活性。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を測定するために、ＰＢＭＣを最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１）およびＩＬ２変異体をコードするｍＲＮＡを含むＨＥＫ２９３Ｔ／１７のリポフェクションに由来する上清または対照上清と共にインキュベートした。手短に言うと、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号１７−１４４０−０３）密度勾配分離によって健常ドナーのバフィコートから得た。１．６μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５６４）を使用してＰＢＭＣを標識した。ウェルあたり７５，０００個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号７３４−１７９７）中の５％血漿由来ヒト血清（ＰＨＳ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ ｌｎｃ．、カタログ番号Ａ２５７６１）を添加したｌｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１２４４０−０５３）に播種し、各ドナーについて事前に決定された最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１００；最終濃度０．０３〜０．０９μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。並行して、ＩＬ２変異体含有上清の４倍段階希釈液（実施例２を参照）を、５％ＰＨＳを添加したＩＭＤＭで生成した。播種した細胞をＩＬ２変異体上清と１：１で混合し（播種した細胞の培地の容量を参照）、３７℃、５％ＣＯ２で４日間刺激した。ＰＢＭＣを回収し、フローサイトメトリで分析した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＤ−ＰＢＳ）ですべて１：１００に希釈した以下の試薬で染色した：抗ヒトＣＤ４−ＰＥ（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０−００４９）、抗ヒトＣＤ８−ＰＥ（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０−００８８）、抗ヒトＣＤ５６−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７−０５６７−４２）および７−ＡＡＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ０７７０４）。フローサイトメトリ分析を、増殖読み出しとしてＣＦＳＥ希釈を用いてＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。取得した増殖データを、ＦｌｏｗＪｏ １０．４ソフトウェアを使用して分析し、エクスポートした拡張指数値を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットした。
高親和性ＩＬ２Ｒαβγ依存性ＣＴＬＬ−２増殖アッセイにおいて野生型ＩＬ２と同一に機能する変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ５に加えて、他のすべての変異体を、ヒトバルクＰＢＭＣを用いた抗原非特異的増殖アッセイで分析した。野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｂ）、およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図４Ｃ）のＣＤ３誘導増殖を強力に増強することによって、他のすべてのＩＬ２変異体と比較して優れた生物学的活性を示した。ＣＤ２５結合能力が低下した、試験したすべての変異体は、中間表現型を示した。変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６は、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約５０倍の効力の低下に匹敵する機能を示したが、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ１およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ３は、生物学的活性の低下に向けてさらに強いシフトを伴う重ね合わせ可能な用量反応曲線を示し、すなわちｈＡｌｂ−ｈＩＬ２よりも約７５倍低い生物活性を示した。記載した変異体について観察された差異は、評価した３つのリンパ球サブセットすべての間で同等であったが、ＮＫ細胞の増殖は、一般にＴ細胞の増殖ほど顕著ではなかった。
中間表現型を有するｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６を、ＩＬ２Ｒβγ複合体への結合を増加させると記載したｍｕｔβγ変異を追加で含む変異体とさらに比較した（実施例１も参照）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ｍｕｔβγ変異の追加によってブーストされない優れた生物学的活性を示し、計算されたＥＣ５０値にも反映された（表２）。ｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞で約５０倍、ＣＤ８＋Ｔ細胞で約１００倍の生物学的活性の低下を示した。他のｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の効力は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４と比較して、両方のＴ細胞サブセットでさらに２倍減少した。しかし、ｍｕｔβγ変異の追加は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する両方のｍｕｔＣＤ２５変異体（すなわちｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６）の生物学的活性をブーストし、その結果、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓと比較して、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓの生物活性を４〜７倍だけ低下させ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓの生物活性を９〜１６倍低下させた（図４ＤおよびＥ、表２）。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞では、ｍｕｔβγ変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２が最も高い生物活性を示し、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２の生物活性をわずかに上回った（それぞれ０．６０８４％上清および１．６６２％上清のＥＣ５０値、表２を参照）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞では、ｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の効力は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して３〜８倍だけ減少した。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６へのｍｕｔβγ変異の追加は、変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓの生物学的活性を野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２のレベルに回復させた（図４Ｆ）。
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（実施例６）
中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）対高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）を発現するＩＬ２依存性レポータ細胞株における様々なＩＬ２変異体の相対的生物活性の比較。
様々なＩＬ２変異体の生物学的活性の決定因子としてのＩＬ２Ｒα鎖（ＣＤ２５）の役割を分析するために、高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）を発現するマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２の特異的増殖応答を、ＩＬ２Ｒβ鎖も発現するように形質導入された、ＩＬ２Ｒ共通γ鎖を天然に発現するヒト赤白血病細胞株である、中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を発現するＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγ細胞と比較した（実施例２を参照）。手短に言うと、ＣＴＬＬ−２およびＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγ細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１１３６００７０）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７００１０）に再懸濁した。合計５，０００細胞／ウェルを白色９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号１００７２１５１）に播種し、ＩＬ２変異体含有上清の５つの４倍段階希釈液（実施例２に記載）と共にインキュベートした。３日間の培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２４２）を使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。発光をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）で記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびＣＤ２５結合親和性が低下したｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体（すなわちｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４および＿Ａ６）は、ＣＤ２５非依存性のＩＬ２Ｒβγ発現ＴＦ−１＿ＩＬ２Ｒβγ細胞で同等に機能し、用量反応曲線はほぼ重ね合わせ可能であった（図５Ａ、Ｂ）。これは、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２での２．３５２％上清からｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６での３．６５７％上清の範囲の計算されたＥＣ５０値にも反映されている（表３）。さらに、ＩＬ２Ｒβへの結合親和性が増強したｍｕｔβγ変異体（すなわちｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ）は、予想されたように生物学的活性の増加に向けて１０〜３０倍のシフトを示し、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓについては同等のＥＣ５０値（それぞれ０．０８０％上清および０．１０７％上清）ならびにｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓではわずかに低い活性（ＥＣ５０＝０．３３８％上清）であった。
極めて対照的に、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２とｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体の間の大きな違いは、ＣＤ２５依存性のＩＬ２Ｒαβγ発現ＣＴＬＬ−２培養物で見ることができる（図５Ｃ、Ｄ）。ここで、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ｍｕｔβγ変異の追加によってさらにブーストすることができなかった最も高い生物学的活性を示した（表４；ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２とｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓについて０．１１５％上清対０．２４０％上清のＥＣ５０）。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４の活性は約１９倍減少したが（ＥＣ５０＝２．１９％上清）、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の場合は約３００倍減少した（ＥＣ５０＝３３．７２％上清）。対応するｍｕｔβγ変異体、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、増強された生物学的活性を示したが、それぞれ０．５１７および１．５７５のＥＣ５０値で、依然としてｈＡｌｂ−ｈＩＬ２よりも活性が低かった。
Figure 2021531013
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（実施例７）
ＳＴＡＴ５リン酸化を読み出しとして使用した、ヒトＰＢＭＣにおける様々なＴ細胞サブセットに対するｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体の活性の比較。
ＣＤ２５が欠損しているかまたは発現される様々なＴ細胞サブセットに対するｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体の活性を評価するために、ヒトＰＢＭＣ全体をｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体で刺激し、様々なサイトカイン希釈でＳＴＡＴ５リン酸化をアッセイした。手短に言うと、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号１７−１４４０−０３）密度勾配分離によって健常ドナーのバフィコートから得た。ＰＢＭＣをＤ−ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１４１９０２５０）で２回洗浄し、室温で３００×ｇ、５分間の遠心分離によって収集した。ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）を添加したｌｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１２４４０−０５３）に再懸濁し、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で１時間静置した。次に、９６ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ＧｍｂＨ、カタログ番号６５１１０１）のウェルあたり１００，０００個のＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび２倍のＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号０４９０６８４５００１）を添加したＩＭＤＭに播種した。並行して、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体含有上清の５つの４倍段階希釈液（実施例２に記載）を、１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭで生成した。播種した細胞をｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体上清と１：１で混合し（播種した細胞の培地の容量を参照）、３７℃および５％ＣＯ２で１０分間刺激した。次に、１：１，０００の固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０を添加し、細胞を３７°Ｃおよび５％ＣＯ２でさらに５分間刺激した。ホルムアルデヒド（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、カタログ番号Ｐ０８７．４）を２％まで添加して細胞を固定し、氷上で１０分間インキュベートした。固定したＰＢＭＣを氷冷Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、１００％氷冷メタノールを用いて氷上で３０分間透過処理した。透過処理したＰＢＭＣを１倍の透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号００−８３３３−５６）で２回洗浄し、その後１倍の透過処理緩衝液中で遮光して２〜８°Ｃで３０分間、１：５のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、カタログ番号６１２５９８）、１：２５のＰｅｒＣＰ−Ｃ（商標）５．５マウス抗ヒトＣＤ２５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、カタログ番号５６０５０３）、１：２５のＡＰＣラット抗ＦＯＸＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、１７−４７７６−４１）、１：２５のＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、カタログ番号５６５９９７）、および１：２５のＢＶ５１０マウス抗ヒトＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、カタログ番号５６３２５６）で染色した。染色したＰＢＭＣを氷冷した１倍透過処理緩衝液で２回洗浄し、最後に２％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号０３６９０−１００ＭＬ）を添加したＤ−ＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリ分析をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ）で実施し、取得したデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．３を使用して分析した。用量反応曲線およびＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で計算した。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞では、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ＣＤ２５結合親和性が低下したすべてのＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体（ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４／＿Ａ６）およびそのそれぞれのｍｕｔβγ変異体（ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ）よりも優れた効力を示した（図６および表５、６）。詳細には、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の生物学的活性はｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約３２０倍大幅に低下したが、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４は中間の表現型を示した（ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約１７０倍低い活性）。両方のｍｕｔＣＤ２５変異体の生物活性はｍｕｔβγ変異の追加によってブースト可能であり、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓはｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓより優れ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較してそれぞれ約６倍および約２１倍低い活性を示した。最も活性な変異体はｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓであり、その生物学的活性はｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約１５倍も増強されていた。ＣＤ２５の発現がない場合、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２の効力は４０倍を超えて大幅に低下した（図６、表５、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇと比較してＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を参照）が、依然としてｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６よりも優れていた。同じことが、対応するｍｕｔβγ変異を含む変異体にも当てはまる：ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓは、ＣＤ２５陰性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方で最も高い生物学的活性を示し（表７〜８を参照、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約５〜１０倍増加した効力）、続いてｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞ではｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と同等に機能し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞ではｈＡｌｂ−ｈＩＬ２よりさらに優れていた（表７〜８を参照；ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して約２倍増加した生物学的活性）。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓと比較すると、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓの生物学的活性はわずかに低下しており、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞ではまだｈＡｌｂ−ｈＩＬ２とほぼ同じように機能するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞では活性が低下していた。最も重要な点として、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で個々のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体ごとに決定したＥＣ５０値と、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞で決定したＥＣ５０値の比率を使用すると（表５）、各ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体の「制御性Ｔ細胞バイアス」を計算することが可能になる（表９）。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対する効力と比較して、制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞に対して４０〜６０倍のバイアスを示す。極めて対照的に、ｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６を見ると、この制御性Ｔ細胞のバイアスはわずかに１．２〜１．９倍に減少している。対応するｍｕｔβγ変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、４．４〜７．１倍のわずかに増加した制御性Ｔ細胞バイアスを伴う。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対する効力と比較すると、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞に対して６３〜１８２倍の最も強いバイアスを示す。
Figure 2021531013
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（実施例８）
インビボでのＴ細胞ワクチン接種に対するＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の作用
その後、ＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＩＬ２＿Ａ６がインビボでＲＮＡワクチンによって誘導されるＴ細胞応答に及ぼす影響を特徴付けた。Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されているように、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原ｇｐ７０（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ）をコードする２０μｇのＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内ワクチン接種した。Ｇｐ７０は、例えば結腸癌細胞株ＣＴ２６に認められる腫瘍抗原である。ｇｐ７０標的ワクチンの抗腫瘍効果は、誘導されるｇｐ７０特異的Ｔ細胞の数が増えるにつれて増加する（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６−４０１（２０１６）および未発表）。ワクチン接種の３日後、ｈＡｌｂ（陰性対照）またはＬＮＰとして製剤化された漸増用量のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ ＲＮＡを、図７に示すように静脈内投与した。７日目に、フローサイトメトリ（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）による血液リンパ球サブセットおよびｇｐ７０特異的Ｔ細胞（ＭＨＣテトラマー、ＭＢＬ）の免疫表現型検査を含む分析を実施した（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されている染色）。
実施例４および実施例６に記載されているように、ｍｕｔＣＤ２５変異体は、ＩＬ２Ｒαβγ陽性ＣＴＬＬ−２細胞を刺激する効力が低下している。このため、ＣＤ８対Ｔｒｅｇの比率を改善しつつ、ｇｐ７０特異的エフェクタＴ細胞に対してｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と同等の効果を誘導できるように、野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２より約３倍高い用量のｍｕｔＣＤ２５変異体を試験した。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２のみがＩＬ２媒介毒性の指標としての肝臓重量の有意な増加を示し、より高用量にもかかわらず、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体は有意な増加を示さなかった（図７Ｂ）。同様に、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）（図７Ｃ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼまたはリパーゼ活性（Ｉｎｄｉｋｏ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および肺重量の増加は観察されなかった（データは示していない）。野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２および両方のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体は、フローサイトメトリによって決定されたように、血中のｇｐ７０特異的Ｔ細胞の用量依存的な増加をもたらし、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４の最高用量で最も強いブーストおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６で最も弱いブーストが観察された（図７Ｄ）。興味深いことに、特にｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４５＋白血球の非常に強力な増加をもたらした（図７Ｅ、Ｆ）。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４と比較して、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の投与はＴｒｅｇの増加をもたらさなかった（図７Ｇ）。重要な点として、両方のｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体がＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率の増加を媒介し、腫瘍を促進するＴｒｅｇよりもＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的な拡大を明らかにした（図７Ｈ）。比較すると、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率を用量依存的に低下させた。ｈＡｌｂ対照に対するｇｐ７０特異的または非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の倍率変化を比較すると、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４はｇｐ７０特異的Ｔ細胞の選択的な拡大をもたらすが、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６は拡大をもたらさない（図７Ｉ）。総合すると、これらの結果は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４変異体がＣＤ２５結合能を有さないかまたは低下しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率の増加などの癌免疫療法に有益な効果をもたらすことを示す。
（実施例９）
ｍｕｔβγ変異の追加によるＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の有効性の改善
変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６は、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率を大幅に増加させたが、抗原特異的Ｔ細胞の強力な増殖には、活性化Ｔ細胞上の高親和性ＩＬ２Ｒαβγへの結合が減少するため、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較してはるかに高い用量が必要であった。したがって、インビボでのｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の効力が、インビトロですべてのＩＬ２Ｒβγ陽性細胞への結合を改善することが示されたｍｕｔβγ変異の導入によってさらに改善できるかどうかを試験した（実施例５〜７；Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４８４，５２９−５３３（２０１２））。実施例８と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ−ＬＰＸを静脈内ワクチン接種し、３日後にサイトカインＲＮＡ−ＬＮＰを注射した（図７Ａ）。この実験では、ｍｕｔβγ変異による改善が十分にカバーされることを確認し、治療用量の下限を試験するために、サイトカインＲＮＡ−ＬＮＰ用量を大幅に低減した。ワクチン接種の７日後、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＤ２５ ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇを分析した（図８）。
実施例８に示すように、抗原特異的Ｔ細胞およびＴｒｅｇの頻度は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４の投与によって増加したが、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６の投与によっては増加しなかった（図８Ａ、Ｂ）。驚くべきことに、両方ともｍｕｔβγ変異を含む変異体ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、Ｔｒｅｇの頻度（または細胞数、データは示していない）の検出可能な増加を伴わずに抗原特異的Ｔ細胞の頻度をさらに増加させた。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６を超える、抗原非特異的ＣＤ８ Ｔ細胞よりも抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の選択的な増加をもたらした（図８Ｃ）。さらに、すべての構築物は、末梢リンパ球のほぼ５０％までＮＫ細胞の頻度（および細胞数、データは示していない）を強力に拡大した（図８Ｄ）。ここで、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、高用量ではｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４と同様の有効性を示したが、低用量ではより優れていた。要約すると、これは、ｍｕｔβγ変異がＴｒｅｇの頻度を増加させることなくｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ ｍｕｔＣＤ２５変異体の有効性をさらに改善できることを示す。
（実施例１０）
ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγ変異の両方の変異を含むｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体は、ｍｕｔβγ変異を含むＩＬ２および野生型ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して優れている
実施例９では、ｍｕｔＣＤ２５変異体へのｍｕｔβγ変異の導入が、Ｔｒｅｇの頻度を増加させることなく抗原特異的Ｔ細胞を刺激する効力を高めることを示した。次に、ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの両方の変異を含むＩＬ２変異体が、ｍｕｔβγを含むＩＬ２変異体（ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓ）よりも優れているかどうかを試験したいと考えた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、０日目と７日目に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ−ＬＰＸを、３日目と１０日目にサイトカインＲＮＡ−ＬＮＰ（図に示されている用量）を静脈内ワクチン接種した。フローサイトメトリによる血液リンパ球の分析（実施例８を参照）を７日目と１４日目に実施した（図９Ａ）。抗原特異的Ｔ細胞数は、ｈＡｌｂ対照と比較してすべてのＩＬ２変異体でブーストされた（図９Ｂ）。重要な点として、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびより低い程度でｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓはＴｒｅｇを拡大したが、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓで処置した群では、Ｔｒｅｇ数は増加しなかった（図９Ｃ）。ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓによるＴｒｅｇ増殖の欠如は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓ変異体の効果を上回る、２回目の処置後の抗原特異的Ｔ細胞の強力なブーストを説明し得る（図９Ｂ）。比較すると、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓの場合、抗原特異的Ｔ細胞の拡大は、おそらく誘導されたＴｒｅｇによるエフェクタＴ細胞の抑制に起因して、２回目の処置後に減速する（図９Ｂ、Ｃ）。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞数は、ｍｕｔＣＤ２５およびｍｕｔβγ変異を含むｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ変異体によって最も強力に増加した（図９Ｄ）。結果として、抗原特異的Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比（図９Ｅ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比（図９Ｆ）は両方とも、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓと比較して、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ変異体の投与によって大幅に増加した。すべてのｈＡｌｂ−ｈＩＬ２変異体、特にｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓとｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、非特異的ＣＤ８＋（テトラマー−／ＣＤ８＋）Ｔ細胞と比較して抗原特異的Ｔ細胞（テトラマー＋／ＣＤ８＋）を選択的に拡大した（図９Ｇ）。興味深いことに、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓは、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓよりも低い頻度のＫＬＲＧ１＋ＣＤ１２７−短命エフェクタＴ細胞（ＳＬＥＣ）を誘導した（図９Ｈ）。ＳＬＥＣの高い頻度は、記憶形成の可能性の低下のために、Ｔ細胞応答の寿命にマイナスの影響を及ぼす（Ｊｏｓｈｉ，Ｎ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７，２８１−２９５（２００７））。さらに、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓ変異体は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２よりもはるかに強力に、およびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２ｓよりもわずかに強力にＮＫ細胞を拡大した（図９Ｉ）。ｍｕｔβγ変異を含むすべての変異体は、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２と比較して有意に高い割合のＫＬＲＧ１発現ＮＫ細胞を生じさせ、エフェクタ表現型が活性化されていることを示した（図９Ｊ）。ＫＬＲＧ１陽性ＮＫ細胞は、肺転移性疾患から保護することが示された（Ｒｅｎｎｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３，ｅ２８３２８（２０１４））。活性化されたＮＫ細胞の短命な性質のために、ｍｕｔβγ変異を含むすべての変異体で最初の処置後にＮＫ細胞数が減少するが、依然としてｈＡｌｂ対照群より高いままである（図９Ｉ）。
要約すると、ｍｕｔＣＤ２５変異とｍｕｔβγの変異の組合せは、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２の有効性を有意にブーストして、Ｔｒｅｇの拡大を伴わずに抗原特異的Ｔ細胞およびＮＫ細胞を増加させ、（抗原特異的）ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの比率の強力な増加をもたらす。
（実施例１１）
ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓの投与はＣＤ４＋Ｔ細胞応答をブーストする
以前の実験で、本発明人は、ｍｕｔＣＤ２５とｍｕｔβγの両方の変異を含むＩＬ２変異体の投与が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を増強することを明らかにした。ＣＤ４＋Ｔ細胞がこれらのＩＬ２変異体から恩恵を受けるかどうかをさらに試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝７）に、０日目、７日目および１４日目に２０μｇのＢ１６＿Ｍ３０（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５））ＲＮＡ−ＬＰＸおよび３μｇのｈＡｌｂ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２またはｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ ＲＮＡ−ＬＮＰを静脈内投与した。フローサイトメトリによる血液リンパ球の分析（実施例８を参照）を１９日目に実施した（図１０Ａ）。Ｂ１６＿Ｍ３０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞株のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ネオエピトープである（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５））。
図１０Ｂおよび１０Ｃに示すように、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓの同時投与のみが、ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞／非Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋）およびＢ１６＿Ｍ３０特異的テトラマー＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をそれぞれ増加させ、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２は増加させなかった。
（実施例１２）
ｍｕｔＣＤ２５変異とｍｕｔβγ変異を組み合わせたＩＬ２変異体は、癌ワクチン接種の抗腫瘍効果を増強する
ワクチン接種によって誘導される腫瘍抗原特異的Ｔ細胞は腫瘍増殖を制御することができ、一方ＴｒｅｇはエフェクタＴ細胞の作用を阻害する（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２−６９６（２０１５））。本発明人は以前に、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２がＣＴ２６腫瘍担持マウスにおけるｇｐ７０ ＲＮＡワクチン接種の抗腫瘍効果を有意に改善できることを示した。したがって、ｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ４ｓおよびｈＡｌｂ−ｈＩＬ２＿Ａ６ｓなどのＴｒｅｇを増加させないｈＡｌｂ−ｈＩＬ２の改善された変異体は、治療上さらにより有効であると予想される。

Claims (52)

  1. ヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドであって、前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のアルファサブユニットと接触する野生型ヒトＩＬ２内の少なくとも酸性または塩基性アミノ酸残基を有する位置で置換されており、前記アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の酸性アミノ酸残基である場合、前記置換は塩基性アミノ酸残基によるものであり、および前記アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２内の塩基性アミノ酸残基である場合、前記置換は酸性アミノ酸残基によるものである、ポリペプチド。
  2. 野生型ヒトＩＬ２が、配列番号１７に従うアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 野生型ヒトＩＬ２内の前記酸性アミノ酸残基が、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの塩基性アミノ酸残基と接触する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 野生型ヒトＩＬ２内の前記塩基性アミノ酸残基が、ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットの酸性アミノ酸残基と接触する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記置換がＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を低下させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記置換が、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性をβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性よりも大幅に低下させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドが、制御性Ｔ細胞よりもエフェクタＴ細胞を選択的に活性化する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して、および野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位（リジン）、４３位（リジン）、６１位（グルタミン酸）および６２位（グルタミン酸）の少なくとも１つで置換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. ３５位が置換されている、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. ３５位がグルタミン酸で置換されている、請求項８または９に記載のポリペプチド。
  11. ４３位が置換されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. ４３位がグルタミン酸で置換されている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. ６１位が置換されている、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. ６１位がリジンで置換されている、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. ６２位が置換されている、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. ６２位がリジンで置換されている、請求項８〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. ４３位および６１位が置換されている、請求項８〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. ４３位がグルタミン酸で置換され、および６１位がリジンで置換されている、請求項８〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. ３５位、４３位および６１位が置換されている、請求項８〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. ３５位がグルタミン酸で置換され、４３位がグルタミン酸で置換され、および６１位がリジンで置換されている、請求項８〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. ６１位および６２位が置換されている、請求項８〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. ６１位がリジンで置換され、および６２位がリジンで置換されている、請求項８〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. ヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むポリペプチドであって、前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、少なくとも（ｉ）ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換および（ｉ）ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチド。
  25. ＩＬ２Ｒαβγのアルファサブユニットに対する親和性を低下させる前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｌ７２、およびＹ１０７からなる群より選択されるＩＬ２またはその機能的変異体の１つ以上の位置における置換を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｋ９、Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｄ２０、Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｎ８８、Ｉ９２、Ｌ９４、およびＥ９５からなる群より選択されるＩＬ２の１つ以上の位置における置換を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する前記１つ以上のアミノ酸置換が、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、９２Ｆの置換のセットを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. 前記ＩＬ２または前記置換されたＩＬ２もしくはその機能的変異体に融合した前記ＩＬ２の機能的変異体に対して異種であるアミノ酸配列をさらに含む延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  29. 前記ＩＬ２またはその機能的変異体に対して異種であるアミノ酸配列が、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される、請求項２８に記載のポリペプチド。
  30. 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
  32. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  33. ＲＮＡである、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. 請求項３２または３３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  35. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３２もしくは３３に記載のポリヌクレオチド、または請求項３４に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
  36. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３２もしくは３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の宿主細胞、または請求項３５に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象を治療する方法。
  37. 前記対象が癌を有する、請求項３６に記載の方法。
  38. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、
    ａ．請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３２もしくは３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の宿主細胞、または請求項３５に記載の医薬組成物；および
    ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    を投与することを含む方法。
  39. 前記ペプチドまたはポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記治療が制御性Ｔ細胞よりもエフェクタＴ細胞を活性化する、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記抗原が腫瘍関連抗原である、対象における癌を治療または予防するための方法である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 対象における癌を治療または予防するための方法であって、前記対象に、
    ａ．請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３２もしくは３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の宿主細胞、または請求項３５に記載の医薬組成物；および
    ｂ．前記対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    を投与することを含む方法。
  43. 前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、請求項３７、および４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. ａ．請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３２もしくは３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の宿主細胞、または請求項３５に記載の医薬組成物
    を含む医薬製剤。
  45. ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    をさらに含む、請求項４４に記載の医薬製剤。
  46. 各成分ａおよびｂを別々の容器内に含む、請求項４５に記載の医薬製剤。
  47. 医薬組成物である、請求項４４または４５に記載の医薬製剤。
  48. 前記抗原が腫瘍関連抗原である、癌を治療または予防するための前記医薬製剤の使用説明書をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  49. 医薬用途のための、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  50. 前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的治療を含む、請求項４９に記載の医薬製剤。
  51. 前記抗原が腫瘍関連抗原である、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  52. 前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
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