KR20030088448A

KR20030088448A - 인터루킨-18 변이체, 이들의 생산 및 용도

Info

Publication number: KR20030088448A
Application number: KR10-2003-7011581A
Authority: KR
Inventors: 차알스 디나렐로; 수현 김
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2003-11-19
Also published as: US20090286855A1; EA200300987A1; WO2002101049A3; KR100862136B1; EP1392830A2; US7875709B2; DE60208692D1; SI1392830T1; WO2002101049A2; ATE315647T1; EA005769B1; MXPA03008110A; CN1764723A; US7524488B2; DK1392830T3; UA79235C2; CA2438851C; DE60208692T2; JP2004530432A; BR0207933A

Abstract

본원 발명은 IL-18BP에 대하여 야생형 단백질 IL-18 분자보다 낮은 친화성을 갖는 IL-18 변이체를 제시한다.

Description

인터루킨-18 변이체, 이들의 생산 및 용도{INTERLEUKIN-18 MUTANTS, THEIR PRODUCTION AND USE}

1989년에, 생쥐 비장 세포로부터 인터페론-γ(IFN-γ)을 유도하는 엔도톡신-유도된 혈청 활성물질이 보고되었다(Nakamura et al., 1989). 이런 혈청 활성물질은 IFN-γ의 직접적인 유도물질뿐만 아니라 IL-2, IFN-/, TNF 또는 유사분열물질과 함께 보조-자극자극물질로 기능하였다. 포스트-엔도톡신 생쥐 혈청으로부터 활성물질을 정제하려는 시도에서 상동성 50-55 kDa 단백질이 동정되었다(Nakamura et al., 1993). 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산의 보조-촉진물질로 작용할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성물질을 중화시키지 못한다는 것은 상기 활성물질이 별개의 인자라는 것을 암시한다. 1995년에 이들 과학자들은 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 프로피오니 박테리움 아크네 (P. acne)로 사전처리된 생쥐로부터 얻은 간의 추출물에 존재한다는 것을 확인하였다(Okamura et a., 1995). 상기 모델에서는 간 대식세포 개체군(쿠퍼 세포)이 확대되고 사전처리된 생쥐에서는 치명적이지 않은 저량의 박테리아리포폴리사카라이드(LPS)가 치명적이다. IFN-γ-유도 인자(IGIF)(이후, 인터루킨-18(IL-18))로 명명된 인자는 1,200 g의 프로피오니 박테리움 아크네 (P. acne)-처리된 생쥐 간으로부터 균질하게 정제되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열로부터 유래된 축중 올리고뉴클레오티드는 뮤린 IL-18 cDNA를 클론하는데 사용되었다(Okamura et al., 1995). IL-18과 인터루킨-12(IL-12)에 대한 메신저 RNA는 활성화된 대식세포에서 쉽게 탐지된다. IL-18은 자체로서는 IFN-γ을 유도하지 않지만 유사분열 물질이나 IL-12와 함께 보조-자극물질로서 주로 기능한다. IL-18에 대한 사람 cDNA 서열은 1996년에 보고되었다(도 1A SEQ ID NO:1).

인터루킨 IL-18은 IL-1 계통의 단백질과 구조적 특징을 공유한다(Nakamura et al., 1993; Okamura et al., 1995; Ushio et al., 1996; Bazan et al., 1996).

4개의 나선 번들 구조를 갖는 대부분의 다른 사이토킨과 달리, IL-18과 IL-1β는 β-주름 시트 구조를 갖는다(Tsutsui et al., 1996). IL-1β와 유사하게, IL-18은 신호 펩티드가 결핍된 생물학적 불활성 선구물질(프로IL-18)로 합성된다(Ushio et al., 1996). IL-1β와 IL-18 선구물질은 P1 위치의 아스파르트산 잔기 뒤에서 이들 선구물질을 절단하는 카스파제 1(IL-1β-전환 효소, ICE)에 의해 절단된다. 생성된 성숙 사이토킨은 세포로부터 쉽게 방출된다(Ghayur et al., 1997; Gu et al., 1997).

IL-18은 1형 T 보조(Th1) 세포에 의한 사이토킨 생산(IFN-γ, IL-2, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)의 보조-자극물질(Kohno et al., 1997) 및 뮤린 고유 킬러 세포 클론의 FAS 리간드-매개된 세포독성의 보조-자극물질(Tsutsui et al.,1996)이다.

Th1 림프구는 종양에 대한 면역 반응에 관여한다(Seki et al., 2000). Th1 반응은 사이토킨 IL-2, IL-12, IL-18, IFN-γ의 분비 및 특정 종양 항원을 인식하는 특이적인 세포독성 T 림프구의 발생을 수반한다. 또한, Th1 반응은 많은 미생물에 대한 숙주 방어의 중요한 무기이다. 하지만, Th1 반응은 바람직하지 않은 효과, 예를 들면 여러 자가면역 질환, 염증, 장기 이식 거부반응의 발생과 연관될 수도 있다.

성숙 단백질을 인코드하는 벡터를 이용하여 대장균(E. coli)에서 성숙 IL-18을 발현하려는 시도는 완전한 활성의 사이토킨을 제공하는데 실패하였다. 완전한 생물학적 활성 사람 IL-18의 발생에 효과적인 발현 시스템이 치료용도, 예를 들면 악성암 또는 IFN-γ 유도가 요구되는 질환을 위하여 개발되었다(WO 00/61768). 이런 시스템에서, IL-18 선구물질 카스파제-1 절단 부위는 Xa 인자 부위(ICE/Xa)로 대체되고, IL-18 ICE/Xa 선구물질을 인코드하는 벡터는 대장균(E. coli)의 형질전환에 사용된다. 대장균(E. coli)에서 상기 IL-18 선구물질의 발현이후, 성숙 IL-18은 시험관내에서 Xa 인자 절단으로 얻는다. Xa 인자 절단으로 만들어진 이런 성숙 IL-18은 완전한 활성을 보였다.

일반적으로, 사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)은 개별적인 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이다. 이들은 세포 표면 수용체의 양자택일적 절단접합 또는 단백분해 절단으로 만들어진다. 이들 가용성 수용체는 이전에 예로써 IL-6과 IFN-γ(Novick et al., 1989), TNF(Engelmann etal., 1989; Engelmann et al., 1990), IL-1과 IL-4(Maliszewski et al., 1990), IFN-α/β(Novick et al., 1994; Novick et al., 1992)의 가용성 수용체로 보고되었다.

TNFR/FAS 계통의 일원인 사이토킨 결합 단백질 오스테오프로제테인(osteoprotegerin(OPG, 또는 파골세포 저해 인자-OCIF)은 가용성 수용체중 분비된 단백질로만 존재하는 첫 번째 실례로 보인다(Anderson et al., 1997; Simonet et al., 1997; Yasuda et al., 1998).

IL-18 결합 단백질(IL-18BP)은 IL-18 칼럼에서 요로부터 친화성 정제되었다(Novick et al., 1999). IL-18BP는 IFN-γ와 IL-8의 IL-18 유도, 시험관내에서 NF-kB의 활성화, 생체내에서 IFN-γ의 유도를 완전히 소멸시킨다. IL-18BP는 비장에서 조직적으로 발현되는 가용성 순환 단백질이며 면역글로불린 대과에 속한다. 가장 풍부한 IL-18BP 동소체인 절단접합된 변이 동소체 a는 빠른 온-레이트와 느린 오프-레이트로 IL-18에 대한 높은 친화성 및 대략 400 pM의 해리 상수(Kd)를 보인다(Kim et al., 1999).

IL-18과 IL-18BP의 상호작용에 관여하는 잔기는 IL-1과 IL1R I형의 상호작용(Vigers et al., 1997)에 기초하여 컴퓨터 모델링(Kim et al., 1999)으로 설명되었다. IL-18BP와 IL-18의 결합 모델에서, IL-18의 42번 위치에서 Glu 잔기와 89번 위치에서 Lys 잔기는 IL-18BP에서 각각 Lys-130과 Glu-114와 결합하는 것으로 제안되었다(Kim et al., 1999).

IL-18은 많은 세포에서 조직적으로 존재하고(Puren et al., 1999) 건강한 인체에서 순환한다(Urushihara et al., 2000). IL-18에 대한 IL-18BP의 높은 친화성 및 순환계에서 발견되는 높은 농도의 IL-18BP(IL-18보다 20배 몰 과량)는 사이토킨 생물학에서 독특한 환경을 나타낸다. 따라서, 순환계에 존재하는 대부분의 IL-18 분자는 IL-18BP에 결합한다. IL-18에 대하여 세포 표면 수용체와 경합하는 순환 IL-18BP는 천연 항-염증과 면역억제 분자로 작용할 수 있다.

바이러스 작용제는 IL-18BP 유사 단백질을 인코드한다, 예를 들면 전염성 연속종(M. Contagiosum) 바이러스 단백질 MC53과 MC54는 포유동물 IL-18BP에 현저한 상동성을 보유한다(Novick et al., 1999). 전염성 연속종(M. Contagiosum) 단백질 MC53과 MC54는 IL-18BP에서와 유사한 방식으로 사람 IL-18과 결합하여 이를 중화시키는 능력을 보유한다(Xiang and Moss, 1999). IL-18BP와 상동한 결지증(ectromelia) 폭스바이러스는 시험관내에서 사람 IL-18에 결합하고 이의 활성을 저해한다. p13 결실 변이 바이러스로 감염된 생쥐는 감소된 수준의 감염도를 보였다(Born et al., 2000). 따라서, 감염도 정도는 IL-18BP의 존재와 상관하는 것으로 보인다.

높은 수준의 순환 IL-18BP는 감염과 자가면역 질환의 발생에서 런어웨이 Th1 반응에 대한 고유 방어일 수 있다. 하지만, IL-18은 종양에 대한 숙주 방어에 중요한 Th1 반응에 기여한다. 따라서, IL-18BP는 숙주가 종양 세포에 대항하는 세포독성 T 세포를 발생시키지 못하도록 야기할 수 있다. 실제로, IL-18이 생쥐에서 종양에 대한 숙주 방어를 촉진한다는 증거가 있다. 가령, 동계 생쥐에서 뮤린 IL-12 또는 뮤린 IL-18을 발현하는 뮤린 유방암종 세포는 대조 비-발현 세포보다 종양발생이 덜하였고 좀더 느리게 종양을 형성하였다(Coughlin et al., 1998). 항체 중화 연구에서 항종양 효과는 IFN-γ을 요구하는 것으로 밝혀졌다. 다른 연구에서, B7-1을 발현하는 B16 흑색종(CD80)을 갖는 실험동물에 IL-18의 전신 투여는 흑색종 형성과 종양 성장의 극적인 억제 및 생존의 현저한 증가를 결과하였다(Cho et al., 2000).

사이토킨은 암에서 면역요법의 효능을 증가시키는 어쥬번트로 사용된다. 가령, IL-2는 신장 세포 암종 또는 흑색종에 투여된다(Collob et al., 2000). 종종, 사이토킨 치료의 중요한 결과는 심각한 전신 독성 프로필이다. 환자 자신의 종양이나 수상돌기 세포에 의해 발현되는 사이토킨을 이용하는 것이 이런 문제점의 논리적 해결방안이다. 하지만, IL-18이 종양 면역요법에서 어쥬번트로 국소적으로 사용되면, 국소 환경에서 IL-18을 중화시키는 조직 수준 IL-18BP의 능력이 여전히 발휘되고, 따라서 이의 효능이 현저하게 감소된다.

백혈병과 고형 종양을 치료하기 위한 비-골수형성 동종 이식물(소형 이식물)의 사용은 이식편-대-백혈병과 이식편-대-종양 반응을 점점 더 성공적으로 유도하고 있다(Slavin S., 2000; Slavin et al., 2000). 전이성 신장 세포 암종 환자를 치료하는데 동종 말초혈 줄기 세포(Childs et al., 2000) 또는 수상돌기 세포(Kugler et al., 2000)를 사용한 2가지 연구는 대단한 성공을 거두었다. 이들 연구는 확대되고 검증을 받아야 하지만, 암의 면역요법에 이식편-대-종양 반응이 활용될 수 있다는 생각은 인정을 받고 있다(Slavin, 2000). IL-18이 이들 성공적인 치료 방식에 관여하는 것으로 보이기 때문에, IL-18BP의 중화 효과가 완전히 제거된다면 추가적인 개선이 달성될 수 있다.

IL-18(IFN-γ, 유도 인자)의 변이체는 EP0845530에서 기술한다. 기술된 IL-18 변이체는 IL-18에서 1, 2, 3 또는 4개의 시스테인 잔기가 세린이나 알라닌 잔기로 대체된 분자이다(도 1B). 이들 변이체는 완전한 공통 서열을 보유하였다(도 1B). 모든 분리된 변이체는 야생형 IL-18보다 높은 안정성을 보인다. 변이체의 안정성 정도는 분자에서 대체되는 Cys 잔기 숫자에 직접적으로 비례한다. EP0845530에서는 이들 변이체를 중화시키는 IL-18BP의 능력에 대해서는 전혀 언급하지 않고 있다.

따라서, IL-18BP에 결합할 수 없거나 또는 낮은 친화성으로 결합하는 완전 활성 IL-18 변이체의 생산 및 치료적 활용은 매우 바람직하다.

본원 발명의 요약

본원 발명은 IL-18 결합 단백질과의 상호작용에 관여하는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 IL-18 변이 폴리펩티드에 관한다. 좀더 구체적으로, 돌연변이는 치환, 바람직하게는 비-보존성 부가 또는 결실이다. 상기 폴리펩티드에서 돌연변이되는 잔기는 Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149, Leu-189, 바람직하게는 Glu-42와 Lys-89이다.

한 구체예에서, Glu-42, Lys-89, 또는 Glu-42와 Lys-89 둘 모두 비-극성 아미노산, 바람직하게는 아닐린으로 치환된다.

이에 더하여, 본원 발명은 상기 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:3, SEQID N:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA를 제시한다.

한 구체예에서, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA는 신호 펩티드, 바람직하게는 hGH의 신호 펩티드에 융합된다. 더 나아가, 본원 발명은 적절한 숙주 세포, 예를 들면 원핵이나 진핵 숙주 세포에서 상기 DNA에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 상기 DNA-포함 벡터를 제시한다.

이에 더하여, 본원 발명은 Th1 반응에 의해 예방 또는 완화되는 질환, 바람직하게는 바이러스 질환이나 암을 치료하는 상기 폴리펩티드-함유 제약학적 조성물을 제시한다.

본원 발명은 야생형 단백질에 비하여 향상된 생물활성을 갖는 IL-18 변이체에 관한다.

도 1A는 WT IL-18 선구물질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 및 상이하게 변이된 IL-18 단백질을 작제하는데 이용되는 프라이머 위치를 도시한다. 폭이 넓은 화살표는 성숙 IL-18 단백질 코딩 서열이 시작되는 위치를 표시한다.

도 1B는 성숙 IL-18의 아미노산 서열을 도시한다. 상이한 종의 IL-18간 공통 서열은 박스로 표시한다. 시스티딘은 밑줄로 표시한다. 암색 박스는 본원 발명에 따른 IL-18에서 돌연변이된 잔기를 나타낸다.

도 2는 본원 발명에 따른 IL-18 변이체의 개요를 도시한다. His-6은 IL-18 선구물질의 N 말단에 융합된 6개 히스티딘의 위치를 나타낸다. 화살표는 ICE 절단 부위가 Xa 인자 절단 부위(x)로 대체된 위치를 나타낸다. WT는 야생형 성숙 IL-18을 나타낸다. E42A는 Glu-42에서 Ala 돌연변이를 나타내고, K89A는 Lys89에서 Ala 돌연변이를 나타내며, E42A/K89A는 이중 돌연변이를 나타낸다. 선구물질/x/WT에 기초하여, 3가지 IL-18 변이체(E42A, K89A, E42A+K89A)는 2단계 PCR로 만들어진다.

도 3A는 IL-12(0.5 ng/㎖)의 존재하에 도 3B에서 x-축에 표시된 농도로 WT IL-18과 변이 단백질에 의한 NKO 세포에서 IFN-의 유도를 도시한다.

도 3B는 IL-12(1.0 ng/㎖)의 존재하에 x-축에 표시된 농도로 WT IL-18과 변이 단백질에 의한 PBMC 세포에서 IFN-의 유도를 도시한다.

도 4는 NKO 세포에서 사람 IL-18 WT과 변이 단백질에 의한 IFN-유도에서 IL-18BP의 효과를 도시한다. 변이체와 WT IL-18(30 ng/㎖)은 실온에서 1시간동안 x-축(도 3B)에 표시된 농도로 IL-18BP와 함께 배양하고 IL-12(0.5 ng/㎖)로 자극된 NKO 세포에 첨가한다.

도 4B는 PBMC 세포에서 사람 IL-18 WT와 변이 단백질에 의한 IFN-유도에서 IL-18BP의 효과를 도시한다. 변이체와 WT IL-18(30 ng/㎖)은 실온에서 1시간동안 x-축에 표시된 농도로 IL-18BP와 함께 배양하고 IL-12(1.0 ng/㎖)로 자극된 NKO 세포에 첨가한다.

도 5는 IL-18 WT와 변이 단백질에 의한 IL-8의 유도를 도시한다. PBMC는 IL-18 WT 또는 변이체(30 ng/㎖)와 함께 배양한다. 폴리믹신 B(1 g/㎖)는 PBMC에 첨가하기에 앞서 30분동안 IL-18과 혼합한다. 24시간후, 상층액은 이전하고 ECL로 IL-18 농도를 분석한다(실시예 9). 3번의 실험중 하나를 도시한다.

본원 발명은 야생형(WT IL-18)과 비교하여 IL-18BP에 의한 중화에 감수성이 덜한 IL-18 변이체나 이의 활성 단편, 뮤테인, 또는 임의의 다른 단백질이나 이의 펩티드 유도체에 관한다. 좀더 구체적으로, IL-18BP에 의한 중화에 감수성이 덜한 활성 IL-18 변이체를 만들기 위하여 WT IL-18의 하나이상, 바람직하게는 30개 이하, 좀더 바람직하게는 최대 10개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 제거되고, 아니면 대안으로 하나이상, 바람직하게는 30개 이하, 좀더 바람직하게는 최대 10개의 아미노산이 부가된다. 아미노산은 별개의 아미노산으로 치환될 수 있는데, 특히 비-보존성 치환이 바람직하다. 좀더 구체적으로, 돌연변이는 IL-18BP와의 결합에 관여하는 것으로 추정되는 잔기, 예를 들면 Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149, Leu-189, 바람직하게는 Glu-42 및/또는 Lys-89를 표적으로 한다(Kim et al., 1999).

IL-18M은 진핵이나 원핵 발현계에서 세포내 또는 주변세포질에서 생산되고 배지로 분비될 수 있다. 생성된 IL-18M은 가용성이나 불용성 형태(봉입체)로 회수될 수 있다.

IL-18M 선구물질 cDNA를 포함하는 벡터는 정확하게 조합된 IL-18 선구물질의 원핵 시스템에서 발현에 사용될 수 있다. 후속으로, 성숙한 완전 활성 단백질은 시험관내에서 ICE 절단으로 얻을 수 있다. 프로테아제, 바람직하게는 Xa 인자에 대한 특정 절단 부위를 인코드하는 서열은 IL-18M 선구물질에서 ICE 서열을 대체할 수 있다.

효과적인 신호 펩티드, 바람직하게는 성숙 IL-18M의 cDNA에 융합된 사람 성장 호르몬 신호 펩티드를 인코드하는 발현 벡터는 진핵 발현과 분비에 사용될 수 있다.

변이체 작제에 사용되는 모체 IL-18 cDNA는 생쥐 또는 사람 종으로부터 선택될 수 있다.

IL-18M은 간편한 정제를 위하여 히스티딘을 에피토프에 붙일 수 있다. 재조합 IL-18M은 통상적인 방법이나 친화성 방법으로 정제할 수 있다. 생성된 IL-18M의 함량은 특이적 ELISA로 모니터할 수 있다.

IL-18M은 Th1 반응, 구체적으로 IL-18 치료에 의해 예방이나 감소되는 질환, 예를 들면 미생물 감염이나 암을 치료하는 제약학적 제제에 사용될 수 있다. 야생형 단백질 대신에 변이체를 사용할 때의 이점은 IL-18BP 중화에 대한 저항성에 있다.

좀더 구체적으로, IL-18M은 종양 면역요법에서 종양 항원에 대한 어쥬번트로서 전신이나 국소적으로 투여될 수 있다.

환자로부터 유래된 종양 세포는 분리하고 IL-18M을 분비하도록 유전자 조작하며 국소 예방접종을 위하여 동일 환자에 재-이식할 수 있다(Coughlin et al., 1998). 더 나아가, IL-18을 발현하는 변형된 종양 세포를 동종 수상돌기세포(항원 제시 세포)에 융합하여 종양 항원성 및 결과적으로 항-종양 반응을 증가시킬 수 있다.

IL-18M은 DNA 예방접종에서 어쥬번트로 투여될 수 있다(Tuting et al., 1998). 사이토킨 IL-12와 IFN-의 사용에서와 유사한 방식으로, 경피 종양 항원 예방접종은 유전자 건(gene gun)으로 실시할 수 있다. 이는 종양 항원과 IL-18M 모두를 인코드하는 DNA로 피부에 내재하는 수상돌기 세포의 트랜스펙션을 결과한다. 대안으로, 수상돌기 세포는ex vivo가공하고 이후 입양 전이(adoptive transfer)한다.

IL-18M은 이식편-대-종양 요법에서 어쥬번트로 사용될 수 있다. 동종 줄기 세포는 암 환자에 조직을 이식하는데 사용될 수 있다. 동종 세포의 이식으로 유도된 이식편-대-종양 거부반응을 증가시키기 위하여, IL-18M은 유전자 조작된 동계 수상돌기 세포 또는 환자로부터 얻은 종양 세포에서 IL-18M 발현에 의해 전신이나 국소적으로 투여될 수 있다.

본원 발명은 적절한 특정 실시예와 함께 기술하지만, 이들 실시예는 본원 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본원 발명의 범주에 속하는 다른 측면, 이점, 개변은 본원 발명의 당업자에게 자명하다.

실시예 1: Xa 인자 절단을 위한 WT 프로IL-18 히스티딘 태그 융합 단백질의 발현을 위한 벡터의 작제

대장균(E. coli)에서 정확하게 조합된 IL-18을 만들기 위하여, IL-18 선구물질에서 ICE 절단 부위는 Xa 절단 부위로 대체한다. 후속으로, 시험관내에서 Xa로IL-18 선구물질을 절단하여 활성 단백질을 얻는다(WO 00/61768).

발현 플라스미드를 만드는데 사용되는 사람 IL-18 선구물질을 인코드하는 cDNA 서열(프로IL-18, 유전자 은행 수탁 번호 D49950, 도1)은 선행 문헌(Ghayur etal., 1997)에서 밝힌 바와 같이 분리한다.

Xa 절단 부위로 ICE 절단 부위의 대체는 2단계 PCR 반응(도 1의 프라이머 참조)으로 달성한다. PCR 반응 1: IL-18 cDNA의 선구단편은 ORF의 상류에 위치한 EcoRI 부위를 보유하는 센서 프라이머(Pr 1): 5'-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG(SEQ ID NO: 11) 및 ICE 부위(33-LESD-36)에서 6개 뉴클레오티드가 Xa 인자 부위(33-IEGR-36)를 인코드하도록 변화된 역 프라이머(Pr 2): 5'-AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC(SEQ ID NO: 12)로 얻는다. 성숙 IL-18을 인코드하는 증폭된 DNA 단편은 Pr2에 상보적인 센서 프라이머(Pr 3): 5'-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT(SEQ ID NO: 13) 및 IL-18 코딩 서열의 하류에 BamHI 부위를 보유하는 역 프라이머(Pr 4): 5'-ATATGGATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG(SEQ ID NO: 14)로 얻는다. 선구물질 108bp와 성숙 474 bp IL-18 DNA는 1% 아가로즈에서 전기영동으로 분리하고 겔 추출 장치(GIBCO/BRL)로 용리한다.

PCR 반응 2: PCR 반응 1에서 얻은 2가지 DNA 단편은 1:1 비율로 혼합하고 프라이머 Pr1 및 Pr4와 함께 사용하여 ICE 부위가 Xa 인자 부위로 대체된 완전 사람 IL-18 cDNA(ICE/Xa)를 얻는다.

프로IL-18(ICE/Xa) cDNA는 EcoRI과 BamHI(GIBCO/BRL) 제한 부위로 BlueScript 플라스미드(Stratagene)에 결찰시킨다. 이 플라스미드는 서열 확인에 사용된다. 인코드된 예측 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 도시한다. 대장균(E. coli) 발현을 위하여, IL-18 DNA 삽입체는 EcoRI과 XbaI 부위(BlueScript에서 기원)로 pPROEX HTa 벡터(GIBCO/BRL)에 재-결찰시킨다. 상기 벡터에서 생성 단백질은 히스티딘 태그에 N-말단 융합된다.

실시예 2: E42A, K89A, E42A/K89A 변이체의 작제

IL-18에서 돌연변이는 저해물질 IL-18BP와의 결합에 중요한 것으로 예측되는 잔기에서 만들었다(Kim et al., 2000). 3가지 변이체: E42A, K89A, F42A/K89A가 만들어졌다. 이들 돌연변이는 후술된 프라이머와 주형을 사용하여 실시예 1에서 밝힌 2단계 PCR 반응으로 얻는다(프라이머는 도 2에 도시한다).

E42A 변이체

PCR 반응 1: PCR 반응에 주형으로 프로IL-18(ICE/Xa)을 사용하여 변이체 E42A를 만드는데 사용되는 프라이머 쌍은 다음과 같다: A쌍 - Pr 1(실시예 1)과 글루탐산(E42) 대신에 알라닌을 인코드하는 역 프라이머(Pr 5): 5'-TAA TTT AGATGCAAG CTT GCC(SEQ ID NO: 15) 및 B쌍 - 글루탐산 대신에 알라닌(GAA에서 GCA로)을 인코드하는 센서 프라이머(Pr 6): 5'-GGC AAG CTTGCATCT AAA TTA(SEQ ID NO: 16)와 역 프라이머 Pr 4(실시예 1).

PCR 반응 2: PCR 반응 1에서 얻은 2개의 DNA 단편은 프라이머 Pr 1과 Pr 4를 이용한 2차 PCR 반응에 주형으로 사용된다.

K89A 변이체

PCR 반응 1: 1차 PCR 반응에 주형으로 프로IL-18(ICE/Xa)을 사용하여 변이체 K89A를 만드는데 사용되는 프라이머 쌍은 다음과 같다: A쌍 - Pr 1(실시예 1)과 리신(K89) 대신에 알라닌을 인코드하는 역 프라이머(Pr 7): 5'-CTG GCT ATCTGCATA CAT ACT(SEQ ID NO: 17) 및 B쌍 - 리신 대신에 알라닌(AAA에서 GCA로)을 인코드하는 센서 프라이머(Pr 8): 5'-AGT ATG TATGCAGAT AGC CAG(SEQ ID NO: 18)와 역 프라이머 Pr 4(실시예 1).

E42K/K89A 변이체

이중 돌연변이 E42A/K89A 변이체에 사용되는 프라이머는 F42A 돌연변이에 사용되는 것과 동일하고, K89A 변이체 cDNA는 반응 주형으로 사용된다.

3가지 IL-18 돌연변이된 유전자 각각은 서열 확인을 위하여 BlueScript 벡터에 결찰시킨다. IL-18 선구물질 E42A, K89A, E42A/K89A 변이체에 대한 예측 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5에 도시한다. 대장균(E. coli) 발현을 위하여, 3가지 IL-18 DNA 삽입체 각각은 EcoRI과 XbaI 부위를 사용하여 pPROEX HTa 벡터(GIBCO/BRL)에 재-결찰시킨다. 생성 단백질은 히스티딘에 N-말단 융합된다(도 1).

단백질 발현과 정제

IL-18 변이체 선구물질은 대장균(E. coli)에서 발현시키고 히스티딘 태그로 친화성 정제하며, 개별 성숙 분자는 Xa 인자로 단백분해 절단하여 얻는다.

4가지 pROEX HTu/IL-18 플라스미드(WT와 3개의 변이체) 각각은 DHQ 균주의 콤피던트 대장균(E. coli) 세포에 도입하고 선행 문헌(11)에서 밝힌 바와 같이 발현시킨다. 25 ㎖ 하룻밤 배양액은 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 450 ㎖ LB 배양액에 접종물로 사용하고 0.6-1 OD₆₀₀의 세포 밀도에 도달할 때까지 배양한다. 단백질 발현은 이소프로필티오갈락토시드(IPTG 0.3 mM) 처리로 유도하고 37℃에서 교반하면서 3시간동안 배양한다. 배양된 박테리아 세포는 원심분리(4℃에서 15분동안 5,000 xg)로 수거하고, 펠렛은 30 ㎖ Talon 완충액(50 mM NaH₂PO₄/20 mM Tris-HCl/100 mM NaCl, pH 8)에 현탁시킨다. 세포는 얼음에서 초음파처리(2 x 30s 연사)로 용해시킨다. 가용성 단백질은 원심분리(4℃에서 30분동안 4,000 xg)로 수득하고 3 ㎖ 미니-Talon 칼럼(CLONTECH)에 가한다. 이후, Talon 칼럼은 30 충진 부피의 Talon 완충액으로 세척하고 Talon 완충액에 녹인 6 ㎖의 100 mM 이미다졸로 용리한다. 용출액은 4℃에서 20시간동안 Xa 인자 완충액(20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/2mM CsCl₂)에 투석한다. 0.2 ㎖ Talon 친화성-정제된 N-말단 His x6 융합 프로IL-18은 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오르화물(GIBCO/BRL)의 존재하에 실온에서 4시간동안 4 ㎍ Xa 인자 효소(New England Biolabs)와 함께 배양한다. 생성된 IL-18의 함량은 특이적 ELISA(R&D Systems)로 모니터한다. 성숙 IL-18 WT, E42A, K89A, E42A/K89A 변이체에 대한 예측 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8에 도시한다.

실시예 4: 웨스턴 블랏에 의한 E42A, K89A, E42A/K89A IL-18 변이체의 특성화

정제된 IL-18 변이체는 성숙 IL-18에 특이적인 다클론 항체와 단클론 항체로 웨스턴 블랏을 실시한다.

동량의 Talon 친화성 정제된 선구물질과 성숙 단백질(Xa 인자 절단이후) IL-18 WT와 변이체 형태는 환원 조건하에 SDS/PAGE(10% 아크릴아마이드)로 분리한다. 단백질은 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 이후 일차 항체(IL-18 선구물질을 인식하는 재조합 성숙 형태의 사람 IL-18에 대한 토끼 항-사람 IL-18 다클론 항체 또는 단클론 항체 클론 8-31-4(IgG2a)(Puren et al., 1999))와 함께 배양한다. 24시간 배양후, 상응하는 이차 항체인 염소 항-생쥐 또는 당나귀 항-토끼 IgG 과산화효소(Jackson Immuno Research)를 첨가하고 ECL(New England Nuclear Life Science Products)로 현상시킨다.

다클론 항체 항-사람 IL-18에 의한 프로IL-18의 염색은 WT와 3가지 변이체 각각에 대하여 강도가 동일하였다. 유사하게, 다클론 항혈청을 사용하여 성숙 형태의 IL-18 WT와 3가지 변이체 각각에서 얻은 신호는 강도가 동일하였다. 겉보기 분자량은 개별 IL-18 형태가 정확한 크기를 갖는다는 것을 암시한다. 대조적으로, 단클론 항체가 사용되면, 2가지 변이체 K89A와 E42A/K89A는 WT와 E42A 변이체보다 좀더 강하게 염색되는 것으로 보이는데, 이는 단클론 항체의 친화성이 이들 변이체에 대하여 좀더 강하다는 것을 시사한다.

실시예 5: E42A, K89A, E42A/K89A IL-18 변이체 단백질의 생물활성 특성화

정제된 성숙 형태의 IL-18/ICE/Xa는 사람 고유 살해 세포(실시예 8)와 PBMC(실시예 7)에서 IFN-γ의 동등-유도 및 PBMC에서 IL-8의 유도를 분석한다.

IL-18은 IL-12(또는 IL-15)가 보조-촉진물질로 사용되지 않으면 이들 세포에서 IFN-γ을 유도하지 않는다. 낮은 농도의 IL-12(1-2 ng/㎖(PreproTech RockyHill, NJ))가 소량의 IFN-γ을 유도하긴 하지만, IL-18과 IL-18의 동시 처리는 IFN-γ 생성을 현저하게 증가시킨다. 생성된 IFN-γ은 실시예 9에서 밝힌 바와 같이 세포에서 모니터한다. WT IL-18/ICE/Xa 및 IL-12에 의한 NKO 세포에서 IFN-γ의 유도는 프로IL-18의 ICE 가공(Gu et al., 1997)에 기인한 재조합 성숙 사람 IL-18 및 IL-12에 의한 유도에 필적하였다. 이들 결과는 IL-18이 대장균(E. coli)에서 정확하게 조합되고 Xa 인자에 의해 정확하게 가공된다는 것을 시사한다.

돌연변이된 IL-18의 활성을 검사하기 위하여 NKO 세포에서 변이체 또는 WT IL-18과 IL-12의 자극에 의한 IFN-γ 생산의 유도를 평가하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, WT IL-18은 7.5 ng/㎖에서 시작하여 점진적으로 최대 60 ng/㎖(최대 검사 농도)까지 IFN-γ의 유도물질로서 활성을 보였다. 3가지 돌연변이된 IL-18 형태 각각은 이들 세포에서 WT보다 높은 생물학적 활성을 보였다. 가령, 단일 돌연변이 E42A는 각 검사 농도에서 WT 형태의 2배 활성을 보였다. 단일 돌연변이 KB9A는 7.5 ng/㎖ 농도에서 WT의 4배 활성을 보였다. 이중 돌연변이 E42A/K89A는 가장 활발한 IL-18을 결과하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, E42A 돌연변이된 IL-18은 600 pg/㎖ IFN-γ를 유도하고 최대 활성은 60 ng/㎖ IL-18 WT로 사전 처리에 의해 30 ng/㎖ 농도에서 관찰되었고, K89A 변이체는 15 ng/㎖에서, 이중 변이체는 7.5 ng/㎖에서 관찰되었다. 따라서, 변이체 E42A, K89A, E42A/K89A는 WT보다 각각 2배, 4배, 8배 더 강력하다.

새로 분리된 사람 PBMC에서 IFN-γ 생산을 검사할 때 유사한 결과가 관찰되었다(실시예 7). 이들 세포에서, IL-12와 IL-18에 의한 동시-자극은 IFN-γ 생산을 결과한 반면, 2가지 사이토킨중 1가지 단독은 INF-γ을 유도하지 않았다. 이중 변이체 E42A/K89A는 가장 높은 활성을 보였다.

이런 결과는 Ala 잔기에 의한 2개의 극성 아미노산 Glu 42 및/또는 Lys 89의 대체가 IL-18의 생물 활성에 지속적인 증가를 유도한다는 것을 시사한다.

IL-18은 PBMC 제형(실시예 7)에서 CD14+ 세포에 IL-8을 유도하는 것으로 알려져 있다. IL-18이 IL-12 보조-자극의 필요없이 이들 세포에서 IL-8 생산을 유도하긴 하지만, IL-8의 유도는 IFN-γ의 유도에서보다 높은 농도의 IL-18이 요구된다. 따라서 PBMC의 IL-18 WT와 변이체 자극에 의한 IL-8의 유도를 검사한다. 생성된 IL-8은 실시예 9에서 밝힌 특이적 분석법으로 세포 배지에서 모니터한다. 도 4에서는 2가지 단일 돌연변이가 IL-8의 유도에서 WT와 필적하고 이중 돌연변이된 IL-18이 야생형보다 현저하게 더 많은 IL-8(3.5배)을 유도한다는 것을 보여준다.

이들 결과는 이중 변이체 E42A/K89A가 가장 높은 생물 활성을 보인다는 것을 시사한다.

실시예 6: IL-18BP에 의한 IL-18 변이체의 중화

돌연변이는 저해물질 IL-18BP에 의한 IL-18 결합에 중요한 것으로 예측되는 잔기에 의도하였다. 따라서, IL-18의 생물학적 활성, 예를 들면 IFN-γ 생산을 중화시키는 IL-18BP의 능력(실시예 8)을 특이적으로 평가하였다.

상이한 농도의 IL-18BP(CHO 세포 생산된 재조합 his-6-태그된 사람 IL-18BP(Interpharm Laboratories, Ness Ziona, Israel Kim et al., 2000))는 WT IL-18 또는 이의 변이된 형태(30 ng/㎖ 최종 농도)와 함께 사전-배양하고, 이후 세포배양액에 첨가한다.

도 4A에 도시된 바와 같이, NKO 세포로부터 얻은 WT IL-18에 의한 IFN-γ의 동등-유도에 대한 IL-18BP의 50% 저해 농도는 대략 15 ng/㎖이었다(3.7 ng/㎖ IL-18BP에서는 저해가 진행되지 않는데 이 수치를 100% 활성으로 가정한다). E42A의 단일 돌연변이는 IL-18BP에 의한 유사한 용량-저해 농도를 결과하였다.

하지만, 변이체 K89A가 IL-18BP와 함께 배양될 때 NKO 세포에서 IFN-γ의 동등-유도물질로 작용하는 능력은 덜 중화되었다(도 5A). 120 ng/㎖의 농도에서만 활성에서 통계학적으로 현저한 감소가 관찰될 수 있었다. 대조적으로, IL-18BP는 이중 IL-18 변이체 E42A/K89A를 중화시키지 못하였다.

도 4B에 도시된 바와 같이, IL-18은 NKO 세포보다는 PBMC에서 검사될 때 IL-18BP에 의한 중화에 좀더 민감하다. WT IL-18을 중화시키는데 필요한 IL-18BP 함량은 3.7 ng/㎖(최소 검사 농도)이었다. 단일 돌연변이 E42A는 WT IL-18과 유사하게 반응하는데, 이런 사실은 낮은 농도의 IL-18BP가 PBMC에서 이의 생물 활성을 중화시킨다는 관찰 결과에 의해 뒷받침된다. 대조적으로, 단일 돌연변이 K89A는 120 ng/㎖에서 중화되었다. NKO 세포에서 IL-18BP에 의한 IL-18 변이체의 중화와 관련된 결과와 유사하게, 이중 변이체 E42A/K89A는 PBMC에서 IL-18BP에 의해 경미한 영향을 받았다.

이들 결과는 변이체 E89A와 이중 변이체 E42A/K89A가 자연 저해물질 IL-18BP의 영향을 좀더 적게 받는다는 것을 시사한다.

실시예 7: 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 분리와 배양 및 IFN-γ의 유도

건강한 사람 공여자의 혈소판 헌혈(plateletpheresis)로부터 얻은 잔류성 백혈구는 혈액 튜브로부터 세척하고 Histopaque에서 원심분리한다. PBMC는 접촉면으로부터 흡입하고 발열원-없음 식염수(Baxter Health Care, Mundelein, IL)에서 3회 세척하며 10% FBS(GIBCO/BRL Grand Island, NY)로 보충된 RPMI 1640 배지에서 ㎖당 5 x 10⁶세포로 재현탁시킨다. 세포는 1 ng/㎖ IL-12 존재하에 재조합 사람 IL-18 및 WT IL-18(ICF/Xa)이나 3가지 변이체의 농도를 변화시키면서 RPMI 1640 배지만을 함유하는 편평 바닥 96-웰 평판(Becton Dickinson)(대조)에 배양한다. 일부 실험에서, IL-18 제형은 세포에 첨가하기에 앞서 폴리믹신 B(1 ㎍/㎖, Sigma)와 먼저 혼합한다. 세포는 5% CO₂로 가습된 대기하에 37℃에서 16-20시간동안 배양하고, 이후 배양 상층액은 IFN-γ 측정을 위하여 수거한다.

실시예 8: NKO 세포주에서 IFN-γ의 유도

최초의 모체 NK92 세포주는 Hans Klingerman으로부터 구하였다(Gong et al., 1994). 본 연구에 사용되는 사람 NKO 세포주는 상기 세포주의 서브클론이다. NKO 세포는 10% FBS와 50 pg/㎖ IL-2(R&D Systems) 및 200 pg/㎖ IL-15(PeproTech)를 함유하는 보충된 RPMI 1640 배지에 유지시킨다. 분석을 위하여, NKO 세포는 RPMI 1640 배지에서 ㎖당 0.5 x 10⁶세포로 현탁시키고 96-웰 평판에서 0.5 ng/㎖ IL-12((PeproTech Rocky Hill, NJ) 및 상이한 농도의 재조합 사람 IL-18 WT, IL-18(ICE/Xa), 또는 E42A, K89A, E42A/K89A IL-18 변이체로 0.2 ㎖ 부피로 자극한다.5% CO₂로 가습된 대기하에 37℃에서 16-20시간후, 배양 상층액은 IFN-γ 측정을 위하여 수거한다.

실시예 9: 사이토킨 분석

액상 전기화학발광(ECL) 방법으로 세포 배양 배지에서 IFN-γ(13)과 IL-8(12)을 측정한다. ECL 함량은 Origen 분석기(Igen, Gaitherburg, MD)로 측정한다. IFN-γ과 IL-8의 검출 한계는 각각 62 pg/㎖와 40 pg/㎖이었다.

실시예 10: 통계 분석

데이터는 평균 ±SEM으로 표시한다. 군 평균은 Fisher 최소 유의차(LSD: Least Significant difference) 방법을 이용하여 ANOVA로 비교한다. 통계학적 유의성은 95% 신뢰 수준이내이면 수용된다. ANOVA와 상관분석은 통계 패키지 STATVIEW 512+(Brain Power, Calabasas, CA)로 실시한다.

실시예 11: CHO 세포에서 성숙 IL-18 변이체의 생산

CHO 세포에서 성숙 IL-18 변이체의 발현과 분비를 위하여, 야생형과 변이체 IL-18BP의 성숙 단백질을 인코드하는 DNA 서열은 실시예 1에서 밝힌 반응과 유사한 2단계 PCR 반응으로 사람 성장 호르몬(hGH) 신호 펩티드의 DNA 서열에 결찰시킨다. 각 IL-18 변이체의 증폭을 위한 1차 PCR 반응의 주형은 IL-18과 hGH 신호 펩티드의 중복 서열을 보유하는 센서 프라이머(Pr 9) 및 종결 코돈과 제한 효소 부위인 IL-18의 마지막 12개 뉴클레오티드를 인코드하는 역 프라이머(Pr 10)로 실시예 2에 따라 수득되는 상응하는 구조체이다. 성장 호르몬 신호 펩티드의 증폭을 위하여, 제한 효소 부위인 hGH 신호 펩티드의 첫 12개 뉴클레오티드를 보유하는 센서 프라이머(Pr 11) 및 hGH 신호 펩티드와 IL-18 성숙 단백질의 중복 서열을 보유하는 역 프라이머(Pr 12)와 함께 플라스미드 pXGH가 사용된다. IL-18의 성숙 서열에 융합된 hGH의 신호 펩티드를 인코드하는 단편의 증폭을 위한 2차 PCR의 주형은 1차 PCR 반응물 및 제한 부위를 보유하는 프라이머 Pr 10과 Pr 11로부터 정제된 증폭된 단편이다. 융합 단편은 정제하고 적절한 제한 효소로 절단하며 포유동물 발현 벡터에 클론한다.

상기 플라스미드는 유전자 마커로 생쥐 DHFR 유전자를 보유하는 플라스미드와 함께 CHO(DHFR-) 세포를 트랜스펙션시키는데 사용된다. 저항성 세포는 선택 배지에 분리하고 ELISA 분석으로 IL-18 생산을 분석한다.

안정적으로 트랜스펙션된 세포는 MTX의 농도를 증가시키면서 수회 유전자 증폭을 실시한다. 유전자 증폭 과정의 종결 시점에서, 클론은 계단 희석(limiting dilution)으로 분리한다. 서브클로닝이후, 생산을 위하여 높은 특이적 생산성과 생산 안정성을 보이는 클론을 선별한다.

참고문헌

1. Anderson, D.M., Maraskovsky, E., Billingsley, w.L., Dougall, W.C., Tometsko, M.E., Roux, E.R., Teepe, M.C., Dubose, R..F, Cosman, D., Galibert, L.(1997) "A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic cell function." Nature, 390, 175-179.

2. Bazan, J.F., Timans, J.C. and Kaselein, R.A. (1996)"A newly definedinterleukin-1?" Nature 379, 591.

3. Born, T.L,, Morrison, L.A., Esteban, d.J., VandenBos, T., Thebeau, L.G., Chen, N., Spriggs, M.K., Sims, J.E., Buller, R.M.(2000)"A poxvirus protein that binds to and interactivates IL-18, and inhibitors NK cell response." J Immunol 164, 3246-54.

4. Childs, R., Chernoff, A., Contentin, N., Bahceci, E., Schrump, D., Leitman, S., Read, E.J., Tisdale, J., Dunbar, C., Linehan, W.M., Young, N.S., Barrett, A.J.(2000)"Regression of metastatic renal-cell carcinoma after nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation." N Engl J Med 343, 750-8,

5. Cho, D., Kim, T.G., Lee, W., Hwang, Y.I., CHO, H.I., Han, H., Kwon, O., Kim, D., Park, H., Houh, D.(2000)"Interleukin-18 and the costimulatory molecule B7-1 have a synergistic anti-tumor effect on murine melanoma; implication of combined immunotherapy for poorly immunogenic malignancy" J Invest Dermatol, 114, 928-34.

6. Coughlin, C.M., Salhany, K.E., Wysocka, M., Aruga, E., Kurzawa, H., Chang, A.E., Hunter, C.A., Fox, J.C., Trichieri, G. and Lee, W.M.(19998)"Interleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis." J Clin Invest mar, 101, 1441-52.

7. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. and Wallach. D.(1989)"A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity" J. Biol. Chem. 264, 11974-11980.

8. Engelmann, H., Novick, D. and Walach, D.(1990)"Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors." J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.

9. Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., and Allen, H.(1997)"Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production." Nature 386, 619-623.

10. Gollob, J.A., Mier, J.W., Veenstra, K., McDermott, D.F., Clancy, D., Clancy, M., Atkins, M.B.(2000)"Phase I trial of twice-weekly intravenous interleukin 12 in patients with metastatic renal cell cancer or malignant melanoma: ability to maintain IFN-gamma induction is associated with clinical response." Clin Cancer Res, 5, 1678-92.

11. Gong, J.H., Maki, G., Klingemann, H.H.(1994)"Characterization of a human cell line(NK-92) with phenotypical and functional characteristics ofactivated natural killer cells." Leukemia 8:652.

12. Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino, K., Okamura, H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., tanimoto, T., Flavell, R.A., Sato, V., Harding, M.W., Livingston, D.J., and Su, M.S.(1997)"Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-1beta converting enzyme." Science 275, 206-209.

13. Kim. S.H., Eisenstein, M., Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M., and Dinarello, C.A.(2000)"Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18." Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 1190-5.

14. Kohno, K., J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, and M. Kurimoto.(1997)"IFN-gamma-inducing factor(IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12." J. Immunol. 158:1541-1550.

15. Kugler, A., Stuhler, G., Walden, P., Zoller, G., Zobywalski, A., Brossart, P., Trefzer, U., Ullrich, S., Muller, C.A., Becker, V., Gross, A.J., Hemmerlein, B., Kanz, L., Muller, G.A., Ringert, R.H.(2000)"Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrides." Nat Med, 3. 332-6.

16. Nakamura, K., Okamura, H., Waden, M., Nagata, K. and Tamura,T.(1989)"Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production." Infect. Immun., 57, 590-5 issn: 0019-9567.

17. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, T. and Tamura, T.(1993)"Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma interferon production." Infect. Immun., 61, 64-70.

18. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. and Rubinstein. M.(1989)"Soluble cytokine receptors are present in normal human urine." J. Exp. Med., 170, 1409-14.

19. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M.(1992)"soluble Interferon-alpha Receptor Molecules are present in Body Fluids." FEBS Lett, 314, 445-8.

20. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M.(1994)"The Human Interferon alpha/beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning." Cell 77, 391-400.

21. Novick, D., Kim, S., Fantuzzi, G., Reznikov, L.L., Dinarello, C.A. and Rubinstein, M.(1999)"Interleukin-18 Binding Protein: A Novel Modulator of the Th1 Cytokine Response." Immunity 10, 127, 36.

22. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M.(1995)"Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by Tcells." Nature, 378, 88-91.

23. Puren, A.J., Fantuzzi, G., Dinarello, C.A.(1999)"Gene expression, synthesis and secretion of interleukin 18 and interleukin 1 beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen cells." Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 2256-61.

24. Seki, S., Habu, Y., Kawamura, T., Takeda, K., Dobashi, H., Ohkawa, T., Hiraide, H.(2000)"The liver as a crucial organ in the first line of host defense: the roles of Kupffer cells, natural killer(NK) cells and NK1.1 Ag+ T cells in T helper 1 immune response." Immunol Rev, 174, 35-46.

25. Simonet, W.S., Lacey, D.L., Dunstan, C.R., Kelly, M., Chang, M.S., Luthy, R., Nguyen, H.Q., Wooden, S., Bennett, L., Boone, T., Shimamoto, G., DeRose, M., Elliott, R., Colombero, A., Tan, H.L., Trail, G., Sullivan, J., Davy, E., Bucay, N., Renshaw-Gegg, L., Hughes, T.M., Hill, D., Pattison, W., Campbell, P., Boyle, W.J.(1997)."Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density." Cell, 89, 309-19.

26. Slavin, S.(2000)"Immunotherapy of cancer with alloreactive lymphocytes." N Engl J Med, 343, 802-3.

27. Slavin, S., Or, R., Prighozina, T., Gurevitch, O., Aker, M., Panighari, S., Shapira, M., Nagle, A.(2000)"Immunotherapy of hematologic malignancies and metastatic solid tumors in experimental animals and man"Bone Marrow Transplant Suppl, 2:S54-7.

28. Tsutsui, H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino, H. Okamura, y. Miyazawa, and K. Kaneda.(1996)"IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones." J. Immunol., 157, 396-73 issn: 0022-1767.

29. Tuting, T., Wilson, C.C., Martin, D.M., Kasamon, Y.L., Rowles, J., ma, D.I., Slingluff, C.L., Wagner, S.N., van der Bruggen, P., Baar, J., Lotze, M.T., Storkus, W.J.(1998)"Autologous human monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and IFN-alpha." J Immunol, 160, 1139-47.

30. Urushihara, N., Iwagaki, H., Yahi, T., Kohka, H., Kobashi, K., Morimoto, Y., Yoshino, T., Tanimoto, T., Kurimoto, M., Tanaka, N.(2000)"Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia." J Pediatr Surg, 35, 446-9.

31. Ushino, S., Namba, M., Okura, T., Hattori, K., Nukada, Y., Akita, K., Tanabe, F., Konishi, K., Micallef, M., Fujii, M., Torigoe, K., Tanimoto, T., Fukuda, S., Ikeda, M., Okamura, H., and Kurimoto, M.(1996) J. Immunol., 156, 4274-9.

32. Vigers, G.P., Anderson, L.J., Caffes, P., Brandhuber, B.J.(1997)"Crystal structure of the type-I interleukin-1 receptor complexed with interleukin-1beta." Nature, 386, 190-4.

33. Xiang, Y. and Moss, B.(1999)"IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human poxvirus-encoded proteins." Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 11537-42.

34. Yusuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Mochizuki, S.I., Yano, K., Fujise, N., Sato, Y., Goto, M., Yamaguchi, K., Kuriyama, M., Kanno, T., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, T., Higashio, K.(1998)"Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor(OCIF) and osteoprotegerin(OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro." Endocrinology, 139, 1329-37.

전술한 참고문헌은 본원에 순전히 참고로 한다.

Claims

IL-18 변이 폴리펩티드에 있어서, IL-18 결합 단백질과의 상호작용에 관여하는 하나이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 보유하는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 돌연변이는 치환, 부가 또는 결실인 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 2항에 있어서, 치환은 비-보존성인 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 1항, 2항, 3항중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149, Leu-189에서 선택되는 잔기에 존재하는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 4항에 있어서, 돌연변이는 Glu-42와 Lys-89에서 선택되는 잔기에 존재하는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 5항에 있어서, 돌연변이는 Glu-42 잔기에 존재하는 것을 특징으로 하는IL-18 변이 폴리펩티드.
제 5항에 있어서, 돌연변이는 Lys-89 잔기에 존재하는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 5항에 있어서, 돌연변이는 Glu-42와 Lys-89 잔기 모두에 존재하는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 6항에 있어서, Glu-42 잔기는 비-극성 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 9항에 있어서, Glu-42는 Ala 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 7항에 있어서, Lys-89 잔기는 비-극성 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 11항에 있어서, Lys-89는 Ala 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 8항에 있어서, Glu-42와 Lys-89 잔기 모두 비-극성 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 13항에 있어서, Glu-42와 Lys-89 잔기 모두 Ala 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 IL-18 변이 폴리펩티드.
제 1항 내지 14항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 분리된 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항, 19항, 20항, 21항중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 22항에 있어서, 신호 펩티드는 성장 호르몬의 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항 내지 23항중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는 벡터에 있어서, 적절한 숙주 세포에서 상기 DNA에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 24항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 25항에 있어서, DNA는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5에서 선택되는 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 24항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 27항에 있어서, DNA는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8에서 선택되는 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 27항에 있어서, 제 22항 또는 23항에 따른 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 28항에 있어서, DNA는 사람 성장 호르몬 신호 펩티드를 인코드하는 서열에 결찰되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 내지 14항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, Th1 반응에 의해 예방 또는 완화되는 질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 31항에 있어서, 암의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 31항에 있어서, 바이러스 질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.