JP2000513931A - ヒトｐｂｍｃ由来の分泌蛋白をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分泌蛋白をコードするポリヌクレオチドに選択的な方法を用いて、分泌蛋白をコードしているポリヌクレオチドを含むヒトＰＢＭＣ ｃＤＮＡライブラリーから単離された２つのクローン「Ｃ１９５ １」および「Ｃ１９５ ４」を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＰＢＭＣ由来の分泌蛋白をコードするポリヌクレオチド 本願は、１９９６年６月１７日出願の第０８／６６４５９６号の一部継続出願 であった１９９６年９月２７日出願の第０８／７２１９２６号の一部継続出願で ある。 発明の分野 本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドによりコード される蛋白、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよび蛋白の治療、診断および 研究用途を提供する。 発明の背景 蛋白性因子（例えば、リンホカイン、インターフェロン、ＣＳＦｓおよびイン ターロイキンのごときサイトカインを包含）の発見を目的とした方法は、この１ ０年間に急速に成熟した。現在では常套的なハイブリダイゼーションクローニン グおよび発現クローニング法は、発見された蛋白に直接関連した情報（すなわち 、ハイブリダイゼーションクローニングの場合には蛋白の部分ＤＮＡ／アミノ酸 配列；発現クローニングの場合には蛋白の活性）に依存するという意味において 、新規ポリペプチドを「直接的に」クローン化する。シグナル配列クローニング （現在よく認識されている分泌リーダー配列モチーフの存在に基づいてＤＮＡ配 列を単離する）、ならびに種々のＰＣＲによるあるいは低い厳密性によるハイブ リダイゼーションクローニング法のごとき、より最近の「間接的」クローニング 法は、リーダー配列のクローニングの場合には分泌されるという性質により、あ るいはＰＣＲによる方法の場合には細胞または組織源により、活性を有するとこ とが知られている蛋白に関する多数のＤＮＡ／アミノ酸配列を使用可能にするこ とによって現在の技術水準を高めてきた。本発明が関連するのはこれらの蛋白 およびポリヌクレオチドである。 発明の概要 １の具体例において、本発明は、下記のものを提供する： （ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１４からヌクレオチド４３３までのヌクレ オチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の 全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の 成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｈ）生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド； （ｉ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４の全 長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｊ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードするポリヌクレオチド； （ｋ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４の成 熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｌ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードするポリヌクレオチド； （ｍ）配列番号：６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｎ）配列番号：６のヌクレオチド１４からヌクレオチド７３３までのヌクレ オチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｏ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｐ）生物学的活性を有する配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド； （ｑ）上記（ａ）〜（ｅ）または（ｉ）〜（ｎ）のポリヌクレオチドの対立遺 伝子変種であるポリヌクレオチド； （ｒ）上記（ｇ）、（ｈ）、（ｏ）または（ｐ）の蛋白の種相同体をコードす るポリヌクレオチド。 好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号：１のヌクレオチド１４か らヌクレオチド４３３までのヌクレオチド配列；受託番号ＡＴＣＣ９８０７９と して寄託されたクローンＣ１９５ １の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチ ド配列；または受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他の好ましい具体例 において、ポリヌクレオチドは、受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託された クローンＣ１９５ １のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長または成熟 蛋白をコードする。さらに他の好ましい具体例において、かかるポリヌクレオチ ドは配列番号：２のアミノ酸５２からアミノ酸１４０までのアミノ酸配列を含む 蛋白をコードする。 他の好ましい具体例は、配列番号：６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ チド；配列番号：６のヌクレオチド１４からヌクレオチド７３３までのヌクレオ チド配列；配列番号：７のアミノ酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチ ド；または生物学的活性を有する配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメントを 含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを含む。 他の具体例は配列番号：１または配列番号：３のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝 子ならびに配列番号：５、配列番号：６または配列番号：７のｃＤＮＡ配列に対 応する遺伝子を提供する。 他の具体例において、本発明は、以下のものからなる群から選択されるアミノ 酸配列を含む蛋白であって、他の哺乳動物蛋白を実質的に含まない蛋白を含む組 成物を提供する： （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸５２からアミノ酸１４０までのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント； （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列； （ｅ）配列番号：７のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号：７のアミノ酸１からアミノ酸１４０までのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメント；および （ｈ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列。好ましくは、かかる蛋白は 、配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：２のアミノ酸５２からアミノ酸 １４０までのアミノ酸配列を含む。他の好ましい具体例において、かかる蛋白は 、配列番号：７のアミノ酸配列または配列番号：７のアミノ酸１からアミノ酸１ ４０までのアミノ酸配列を含む。 特定の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは発現制御配列に作動可能 に連結される。また本発明は、かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された 、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞を包含する宿主細胞を提供する。 蛋白の製造方法も提供され、該方法は： （ａ）かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された宿主細胞の培養を適当 な培地中で増殖させ；ついで （ｂ）培養物から蛋白を精製する ことを含む。 かかる方法に従って製造される蛋白も本発明により提供される。好ましい具体 例は、かかる方法により製造された蛋白が当該蛋白の成熟形態であるものである 。 本発明蛋白組成物は、さらに医薬上許容される担体を含んでいてもよい。かか る蛋白と特異的に反応する抗体を含む組成物も、本発明により提供される。 本発明蛋白および医薬上許容される担体を含む治療上有効量の組成物を哺乳動 物対象に投与することを含む、医学的状態の予防、治療または改善のための方法 も提供される。 図面の簡単な説明 図１は、本明細書開示のクローンの寄託に使用したｐＥＤ６おおびｐＮｏｔＳ ベクターを図式的に示したものである。 詳細な説明 単離蛋白およびポリヌクレオチド 本発明に開示した各クローンおよび蛋白に関してヌクレオチドおよびアミノ酸 配列を以下に説明する。いくつかの例において、配列は仮のものであり、いくつ かの不正確または不明確な塩基またはアミノ酸を含んでいるかもしれない。既知 方法により寄託クローンの配列決定を行うことにより各クローンの実際のヌクレ オチド配列を容易に決定することができる。次いで、推定アミノ酸配列（全長な らびに成熟の両方）をかかるヌクレオチド配列から決定することができる。適当 な細胞中でクローンを発現させ、蛋白を集め、次いで、その配列を決定すること により、個々のクローンによりコードされる蛋白のアミノ酸配列も決定すること ができる。 各開示蛋白について、出願人は、出願時に利用可能な配列の情報を用いて最も よく同定できる読み枠であると決定されたものを同定した。報告されている配列 の情報において一部不明確なものがあるので、報告した蛋白配列は「Ｘａａ」な るものを含む。これらの「Ｘａａ」は、（１）ヌクレオチド配列が不明確であっ たために同定できない残基、または（２）（ヌクレオチド配列が明確に決定され たならば）出願人が存在するはずがないと考える決定ヌクレオチド配列中のスト ップコドンを示す。 本明細書の用語「分泌」蛋白は、適当な宿主細胞において発現された場合、膜 を通過して輸送されるものをいい、輸送にはそのアミノ酸配列中のシグナル配列 の輸送も含まれる。「分泌」蛋白は、発現される細胞から全体的に分泌される蛋 白（例えば、可溶性蛋白）または部分的に分泌される蛋白（例えば、受容体）を 包含するが、これらに限らない。また「分泌」蛋白は、小胞体の膜を通過して輸 送されるものを包含するが、これに限らない。 クローン「Ｃ１９５ １」 本発明ポリヌクレオチドはクローン「Ｃ１９５ １」として同定された。 Ｃ１９５ １は、ヒトＰＢＭＣ ｃＤＮＡライブラリーから、分泌蛋白をコード するｃＤＮＡに選択的な方法を用いて単離された。Ｃ１９５ １は全長のクロー ンであり、分泌蛋白（本明細書において「Ｃ１９５ １蛋白」ともいう）の全コ ーディング配列を含む。 今回決定されたＣ１９５ １の５’部分のヌクレオチド配列を配列番号：１に 示す。現在出願人が、コーディング領域に対する正しい読み枠であると考えるも のを配列番号：２に示す。上記ヌクレオチド配列に対応するＣ１９５ １蛋白の 推定アミノ酸配列を配列番号：２に示す。ポリＡテイルを含む、Ｃ１９５ １の ３’部分由来のさらなるヌクレオチド配列を配列番号：３に示す。 クローンＣ１９５ １を含む寄託物から得られるＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ制限フ ラグメントは約１３５０ｂｐのはずである。 Ｃ１９５ １に関する本明細書開示クレオチド配列を、BLASTA/BLASTXおよびF ASTA検索プロトコールを用いてGenBankデータベースに対して検索した。 Ｃ１９５ １は、"ygllg06.rl Homo sapiens cDNA clone 31937 5'"（BlastN,受 託番号R17211）および"ym15f12.rl Homo sapiens cDNA clone 48025 5'"（Blast N,受託番号H11976）として同定された２個のＥＳＴに対する少なくともある程度 の 同一性を示した。Ｃ１９５ １はＷＤモチーフも含んでいる。同一性に基づけば 、Ｃ１９５ １蛋白および同一性を有する各蛋白またはペプチドは少なくともい くつかの活性を共有している可能性がある。 クローン「Ｃ１９５ ４」はＣ１９５ １のさらなる単離体である。今回決定 されたＣ１９５ ４の５’部分のヌクレオチド配列を配列番号：５に示す。 Ｃ１９５ ４についてのさらなる内部ヌクレオチド配列を配列番号：６に示す。 現在出願人が、コーディング領域についての正しい読み枠であると考えるものを 配列番号：７に示す。上記ヌクレオチド配列に対応するＣ１９５ ４蛋白の推定 アミノ酸配列を配列番号：７に示す。ポリＡテイルを含む、Ｃ１９５ ４の３’ 部分由来のさらなるヌクレオチド配列を配列番号：８に示す。 Ｃ１９５ ４由来のさらなる配列を用いたデータベースの検索により、ヒトＦ ＡＮ蛋白（X96586,Fasta）に関するｍＲＮＡに対して少なくともある程度の同一 性が明かとなり、Ｃ１９５ １またはＣ１９５ ４はこの蛋白といくつかの活性 を共有している可能性がある。 クローンの寄託 クローンＣ１９５ １を１９９６年６月１５日にAmerican Type Culture Coll ectionに受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託し、該クローンを該寄託物から 得ることができる。これはＣ１９５ １を含有する細胞と他のクローンを含有す る細胞との混合物を含む複合体寄託物である。各クローンはこの複合体寄託物の 形態で別々の細菌細胞（E．coli）中にトランスフェクションされた。 Ｃ１９５ １のさらなる単離体（「Ｃ１９５ ４」と同定）を１９９６年９月２ ６日にAmerican Type Culture Collectionに受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として 寄託し、該クローンを該寄託物から得ることができる。 ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化（５’部位はＥｃｏＲＩ、３’部位はＮｏｔＩ）を 行って、かかるクローンの適当なサイズのフラグメントを得ることにより各クロ ーンを寄託ベクターから取ることができる（おおよそのクローンサイズフラグメ ントを下に示す）。図１に示すｐＥＤ６またはｐＮｏｔＳベクターのいずれかに 入れて各クローンを寄託した。いくつかの場合において、寄託クローンは、寄託 単離体において「ひっくりかえって」いる（すなわち、逆方向になっている）可 能性がある。かかる場合であっても、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ消化によりｃＤ ＮＡインサートを単離することができる。しかしながら、適当なベクターにおい て発現のための正しい方向にｃＤＮＡを配置するために、ＮｏｔＩは５’部位を 生成し、ＥｃｏＲＩは３’部位を生成するであろう。ｃＤＮＡが寄託されたベク ターからｃＤＮＡを発現させてもよい。 特定のクローンを含んでいる細菌細胞を下記のようにして複合寄託物から得る ことができる。 特定のクローンに関して知られた配列になるよう、オリゴヌクレオチドプロー ブまたはプローブを設計すべきである。この配列は本明細書中の配列、またはそ れらの配列の組み合わせから誘導することができる。各全長クローンの単離に使 用したオリゴヌクレオチドプローブの配列を下に示し、それらは目的クローンの 単離において最も信頼できるはずである。クローン プローブ配列 Ｃ１９５ １ 配列番号：４ Ｃ１９５ ４ 配列番号：４ 位置２にＮを含む上記配列において、当該位置は、好ましいプローブ／プライ マー中において、ヌクレオチドではなくてむしろビオチン化ホスホラミダイト残 基により占められる（例えば、ビオチン化ホスホラミダイト（１−ジメトキシト リチルオキシ−２−（Ｎ−ビオチニル−４−アミノブチル）−プロピル−３−Ｏ −（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイトを用 いることにより製造される）。 好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの設計はこれらのパラメーターに従 うべきである： （ａ）もしあったとしても、不明確な塩基（Ｎ）が最少である配列の領域とな るように設計すべきである； （ｂ）Ｔｍが約８０℃（ＡまたはＴそれぞれについては２℃、ＧまたはＣそれ ぞれについては４℃と仮定）となるように設計すべきである。 好ましくは、オリゴヌクレオチド標識に広く用いられる方法を用い、Ｔ４ポリ ヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドをγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（比活性 ６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で標識すべきである。他の標識方法を用いることも できる。好ましくは、取り込まれなかった標識をゲル濾過または他の確立されて いる方法により除去すべきである。プローブ中に取り込まれた放射活性量をシン チレーションカウンターで測定することにより定量すべきである。好ましくは、 得られたプローブの比活性は約４ｅ＋６ｄｐｍ／ｐｍｏｌｅとなるべきである。 好ましくは、全長クローンのプールを含む細菌培養物を融解し、１００μｌの ストックを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５ｍｌの滅菌Ｌブロス を入れた滅菌培養フラスコへの接種に用いるべきである。好ましくは、培養物を ３７℃で増殖させて飽和状態とすべきであり、好ましくは、飽和培養物を新鮮Ｌ ブロスで希釈すべきである。好ましくは、これらの希釈物の一部をプレーティン グして、１５０ｍｍのペトリ皿中の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１． ５％の寒天を含有するＬブロスを含む固体細菌用培地上で３７℃で一晩増殖させ た場合、約５０００個の明確な、しかもよく分離したコロニーが生じる希釈率お よび体積を決定すべきである。明確な、しかもよく分離したコロニーを得るため の他の既知方法を用いることもできる。 次いで、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法を用いてコロニーをニト ロセルロースフィルターに移し、溶解、変性、次いで、焼き付けを行うべきであ る。 次いで、好ましくは、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、およ び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘストックは１７５．３ｇＮ ａＣｌ／リットル、８８．２ｇクエン酸ナトリウム、ＮａＯＨでｐＨ７．０とす る）（１５０ｍｍフィルター１枚あたり約１０ｍｌ）中で穏やかに撹拌しながら ６５℃で１時間インキュベーションする。次いで、好ましくはプローブをハイ ブリダイゼーションミックスに添加して濃度が１ｅ＋６ ｄｐｍ／ｍｌより大ま たはこれと等しくなるようにする。ついで、好ましくはフィルターを穏やかに撹 拌しながら６５℃で一晩インキュベーションする。ついで、好ましくはフィルタ ーを室温において撹拌せずに５００ｍｌの２Ｘ ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで洗浄 し、好ましくはその後、室温においておだやかに振盪しながら５００ｍｌの２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分洗浄する。６５℃、３０分ないし１時間、０ ．１ＸＳＳＣ／０．５％ＳＤＳでの３回目の洗浄が最適である。次いで、好まし くはフィルターを乾燥し、十分な時間オートラジオグラフィーに供してＸ線フィ ルムに陽性物を可視化させる。他の既知ハイブリダイゼーション方法を用いるこ ともできる。 陽性コロニーを拾い、培地中で増殖させ、次いで、標準的手順を用いてプラス ミドＤＮＡを単離する。次いで、制限分析、ハイブリダイゼーション分析または ＤＮＡ配列決定によりクローンを証明することができる。 生物学的活性を示すことのできる本発明蛋白のフラグメントも本発明に含まれ る。蛋白のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは例えばH.U.Saragovi ，et al.，Bio/Technology 10，773-778(1992)およびR.S.McDowell，et al.，J ．Amer．Chem．Soc．114，9245-9253（1992）(参照により両文献を本明細書に記 載されているものとみなす)に記載されたような既知方法を用いて環化させても よい。多くの目的（蛋白結合部位の結合手を増加させることを包含）のために、 かかるフラグメントを免疫グロブリンのごときキャリヤ分子に融合させてもよい 。例えば、蛋白のフラグメントを「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦ ｃ部分に融合させてもよい。２価形態の蛋白については、かかる融合をＩｇＧ分 子のＦｃ部分に対して行うことができる。他の免疫グロブリンイソタイプを用い てかかる融合物を得てもよい。例えば、蛋白−ＩｇＭ融合物は、１０価形態の本 発明蛋白を生じるであろう。 また本発明は全長および成熟形態の開示蛋白を提供する。かかる蛋白の全長形 態は、開示クローンのヌクレオチド配列の翻訳により配列表において同定されて いる。かかる蛋白の成熟形態を、適当な哺乳動物細胞または他の宿主細胞におけ る開示全長ポリヌクレオチド（好ましくは、ＡＴＣＣに寄託されたもの）の発現 により得てもよい。蛋白の成熟形態の配列を全長形態のアミノ酸配列から決定し てもよい。 また本発明は、本明細書開示のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子を提供する。対 応遺伝子は本明細書開示の配列の同定および／または増幅に関する情報を用いて 既知方法により単離できる。かかる方法は、同定のための開示配列の情報および ／または適当なゲノムライブラリーまたは他のゲノム材料の源にある遺伝子の増 幅により得られるプローブまたはプライマーの調製を包含する。 本発明蛋白が膜結合している（例えば、受容体である）である場合、本発明は かかる蛋白の可溶性形態も提供する。かかる形態において、蛋白の細胞内および 膜貫通ドメインの一部または全体を取り外して、発現された蛋白が細胞から十分 に分泌されるようにする。本発明蛋白の細胞内および膜貫通ドメインを、配列の 情報からかかるドメインを決定するための既知手法により同定することができる 。 開示ポリヌクレオチドの種相同体も、本発明により提供される。本明細書に示 す配列から適当なプローブまたはプライマーを作成し、次いで、所望種由来の適 当な核酸源をスクリーニングすることにより種相同体を単離し同定してもよい。 また本発明は、開示ポリヌクレオチドまたは蛋白の対立遺伝子変種を包含する 。すなわち、本発明は、本明細書開示のポリヌクレオチドによりコードされるの と同一、同種または関連のある蛋白をコードする単離ポリヌクレオチドの自然発 生的別形態を包含する。 本発明単離ポリヌクレオチドを、Kaufman et al.，Nucleic Acids Res．19，4 485-4490(1991)に開示のｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのごとき発現制御配 列に作動可能に連結して、蛋白を組み換え的に製造してもよい。多くの適当な発 現制御配列が当該分野において知られており、F．Kaufman，Methodsin Enzymolo gy 185，537-566(1990)が典型例である。本明細書で定義する「作動可能に連結 」とは、本発明単離ポリヌクレオチドおよび発現制御配列がベクターまたは細胞 中に置かれ、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランス フェクション）された宿主細胞により蛋白が発現されるようになって いることを意味する。 多くのタイプの細胞は本発明蛋白の発現に適した宿主細胞として作用しうる。 哺乳動物宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０ ５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常２ 倍体細胞、１次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、１次エクスプラント 、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたは Jurkat細胞を包含する。 別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごとき原核細胞において 蛋白を製造することが可能である。潜在的に適当な酵母株は、Saccharomyces ce revisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異 種蛋白を発現可能な酵母株を包含する。潜在的に適当な細菌株は、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白を発現可 能な細菌株を包含する。蛋白が酵母または細菌において生成される場合、その中 で生成された蛋白を、例えば適当部位のリン酸化またはグリコシレーションによ り修飾して機能的蛋白を得る必要があるかもしれない。既知化学的または酵素的 方法を用いでかかる共有結合を行ってもよい。 本発明単離ポリヌクレオチドを１種またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適 当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより蛋白を得ても よい。バギュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばIn vitrogen，San Diego，California，USAからのキット形態（MaxBac^Rキット）で 市販されでおり、かかる方法は当該分野においてよく知られており、Summersお よびSmith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No．1555（1987 ）（参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載のようなものが ある。本明細書で用いるように、本発明ポリヌクレオチドを発現可能な昆虫細胞 は「形質転換」されている。 組み換え蛋白の発現に適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することに より本発明蛋白を製造してもよい。次いで、得られた発現蛋白を、ゲル濾過およ びイオン交換クロマトグラフィーのごとき既知精製プロセスを用いてかかる培養 物（すなわち、培養培地または細胞抽出物）から精製してもよい。また、蛋白の 精製は、蛋白に結合するであろう作用剤を含有するアフィニティーカラム；コン カナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール^RまたはCibacrom blue 3GAセ ファロース^Rのごときアフィニティーカラムによる１またはそれ以上のカラム工 程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂 を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる１またはそれ以上の工程； あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含する。 別法として、本発明蛋白を精製容易形態として発現させてもよい。例えば、マ ルトース結合蛋白（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トンスフェラーゼ（ＧＳＴ） またはチオレドキシン（ＴＲＸ）との融合蛋白のごとき融合蛋白として発現させ てもよい。かかる融合蛋白の発現および精製のためのキットは、それぞれNew En glan BioLab(Beverly,MA)、Pharmacia(Piscataway,NJ)およびInVitrogenから市 販されている。蛋白にエピトープでタグを付し、次いで、かかるエピトープに指 向された特異的抗体を用いることにより精製することもできる。１のかかるエピ トーブ（「フラッグ」）はKodak(New Haeven，CT)から市販されている。 最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を 有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィ ー（ＲＰ−ＰＬＣ）工程を用いてさらに蛋白を精製することができる。いくつか またはすべての上記精製工程を種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み 換え蛋白を得ることもできる。かくして精製された蛋白は他の哺乳動物蛋白を実 質的に含まず、本発明により「単離蛋白」と定義される。 本発明蛋白をトランスジェニック動物の生産物として、例えば、蛋白をコード しているヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるト ランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳の成分として発現させて もよい。 既知の慣用的化学合成により蛋白を製造してもよい。合成的手段による本発明 蛋白の構築方法は当業者に知られている。合成的に構築された蛋白配列は、１次 、 ２次または３次構造および／またはコンホーメーション特性を共有することによ って、蛋白活性をはじめとする共通の生物学的特性を有する可能性がある。よっ て、それらを、治療化合物のスクリーニングおよび抗体の生成にための免疫学的 プロセスにおいて、天然の精製蛋白の生物学的活性または免疫学的置換物として 使用してもよい。 本明細書に示す蛋曲ま、精製蛋白のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列によ り特徴づけられる蛋白を包含するが、その中に自然にあるいは誘導体化によって 修飾されていてもよい。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列の修飾は既知方法を 用いて当業者により行われうる。蛋白配列中の目的とされる修飾は、コーディン グ配列中の選択アミノ酸残基の変化、置換、交換、挿入または欠失を包含する。 例えば、１個またはそれ以上のシステイン残基を欠失させ、あるいは別のアミノ 酸と交換して分子のコンホーメーションを変化させてもよい。かかる変化、置換 、交換、挿入または欠失のための方法は当業者によく知られている（例えば、米 国特許第４１５８５８４号参照）。好ましくは、かかる変化、置換、交換、挿入 または欠失は蛋白の所望活性を保持するものである。 全体的または部分的に蛋白活性を保持すると期待され、かくしてスクリーニン グまたは他の免疫学的方法に有用でありうる蛋白配列の他のフラグメントおよび 誘導体も、本明細書の開示から当業者により作成されうる。かかる修飾は本発明 により包含されると確信される。用途および生物学的活性 本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白は、下記の１またはそれ以上の用途または 生物学的活性（本明細書に引用されたアッセイに関連するものも含む）を示すと 考えられる。本発明蛋白に関して説明された用途または活性は、かかる蛋白の投 与または使用により、あるいはかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの 投与または使用（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡ導入に適したベクターのごと き）により提供されうる。研究用途および有用性 本発明により提供されるポリヌクレオチドは、研究集団によって種々の目的に 使用されうる。分析用に、特徴づけまたは治療用途に、対応蛋白が優先的に発現 される（構成的に、または組織分化もしくは発達の特定段階において、または疾 病状態において発現される）組織のマーカーとして、さらにはサザンゲルの分子 量マーカーとして、染色体の同定または関連遺伝子位置のマッピングのための染 色体マーカーまたはタグとして（標識された場合）、患者の内在性ＤＮＡと比較 して潜在的な遺伝病の同定を行うために、ハイブリダイゼーションするプローブ として用いて新規な関連ＤＮＡ配列を発見するために、遺伝学的フィンガープリ ンティングのためのＰＣＲプライマーを得るための情報源として、他の新規ポリ ヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知配列を差し引くためのプローブと して、「遺伝子チップ」または他の支持体に結合させるためにオリゴマーを選択 し作成するために、発現パターンの試験のために、ＤＮＡ免疫法を用いて抗蛋白 抗体を生成させるために、ならびに抗ＤＮＡ抗体を生成させ、あるいはさらなる 免疫応答を誘導するための抗原として、ポリヌクレオチドを使用することができ る。別の蛋白に結合または潜在的に結合（例えば、受容体−リガンド相互作用に おけるように）する蛋白をコードしている場合、結合する他の蛋白を同定し、あ るいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するための相互作用トラップアッセ イ（例えば、Gyuris et al.，Cell 75:791-803(1993)に記載されたような）にお いてポリヌクレオチドを使用することができる。 本発明により提供される蛋白は、高処理量スクリーニングのための一群の多数 の蛋白を含む、生物学的活性を決定するためのアッセイに；抗体の生成または他 の免疫応答を誘導するために；生物学的液体中の蛋白（またはその受容体）のレ ベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識試薬を包 含）として；対応蛋白が優先的に発現される（構成的に、または組織分化もしく は発達の特定段階において、または疾病状態において発現される）組織のマーカ ーとして；ならびに、もちろん関連受容体またはリガンドを単離するために用い てもよい。蛋白がもう１つの蛋白に結合または潜在的に結合する場合、結合する 他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するために蛋 白を使用することができる。これらの結合相互作用に関与する蛋白を用いて、結 合相互作用に関するペプチドまたは小型分子状阻害剤またはアゴニストのスクリ ーニングを行うこともできる。 これらの研究用途のいずれかまたはすべては、研究用製品として商品化するた めに試薬グレードまたはキットのフォーマットへと発展させることができる。 上記用途を実行するための方法は当業者によく知られている。かかる方法を開 示する文献は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F．Fritsch and T．Maniatis eds.，1989,および"Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techn iques"，Academic Press，Berger，S.L．and A.R．Kimmel eds.，1987を包含す るが、これらに限らない。 栄養としての用途 本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白を栄養源または添加物として使用すること ができる。かかる用途は、蛋白またはアミノ酸添加物としての用途、炭素源とし ての用途、窒素源としての用途および炭水化物源としての用途を包含するが、こ れらに限らない。かかる場合、本発明蛋白またはポリヌクレオチドを特定の生物 のエサとして添加してもよく、あるいは粉末、ピル、溶液、懸濁液またはカプセ ルの形態のごとき別個の個体または液体調合物として投与することもできる。微 生物の場合、微生物が培養される培地に本発明蛋白またはポリヌクレオチドを添 加することができる。 サイトカインおよび細胞増殖／分化活性 本発明蛋白はサイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導もしくは阻害）または細 胞分化活性（誘導もしくは阻害）を示しうるか、またはある種の細胞集団におい て他のサイトカインの産生を誘導しうる。今日まで見いだされてきた多くの蛋白 性因子（すべての既知サイトカインを包含）は、１またはそれ以上の因子依存的 細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、よって、アッセイはサイトカイン 活性の便利な確認法として役立つ。本発明蛋白の活性は、細胞系（３２Ｄ、ＤＡ ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒ ｅＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを包含するが、これらに限らない）のため の多くの常套的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれかにより確認される。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイは、に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン生成および／または増 殖に関するアッセイは、 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 造血およびリンパ生成細胞の増殖および分化についてのアッセイは、 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 抗原に対するＴ細胞クローンの応答についてのアッセイ（特に、増殖およびサ イトカイン産生を測定することによりＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびに直接的な Ｔ細胞の効果を同定する）は、 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 免疫刺激または抑制活性 また本発明蛋白は、本明細書記載のアッセイにおける活性（これらに限らない ）を包含する免疫刺激または免疫抑制活性を示すものであってもよい。蛋白は、 種々の欠乏症および障害（重症の免疫欠乏合併症（ＳＣＩＤ）を包含）において 有用である可能性があり、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の増殖をアップ レギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにおいて、ならびにＮ Ｋ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を有効ならしめることにおいて有用で ありうる。これらの免疫欠乏症は遺伝的なものであってもよく、またウイルス（ 例えば、ＨＩＶ）ならびに細菌または真菌感染により引き起こされるものであ ってもよく、あるいは自己免疫疾患により引き起こされるものであってもよい。 より詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染物質により引き起こされる 感染性疾患、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリ ア、レシュマニア、マラリアおよびカンジダ種のごとき種々の真菌感染症を、本 発明蛋白を用いて治療可能である。もちろん、この点において、免疫系に対する ブーストが指示される場合、すなわち、癌の治療において、本発明蛋白を用いて よい。 本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、 全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guilla in-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症 、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明の かかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および 症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状（例えば、喘息（特に アレルギー性喘息）および関連呼吸器系の問題を包含）を本発明蛋白を用いて治 療してもよい。免疫抑制が望まれる他の状態（例えば、器官移植を包含）を、本 発明蛋白を用いて治療してもよい。 本発明蛋白を用いて、多くのやり方で免疫応答を可能にすることもできる。ダ ウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形 態のものであってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むもので あってもよい。Ｔ細胞応答を抑制することにより、あるいはＴ細胞中に特異的な 耐性を誘導することにより、あるいはその両方により活性化Ｔ細胞の機能を阻害 してもよい。一般的には、Ｔ細胞応答の免疫抑制は活性のある、非抗原特異的な プロセスであり、Ｔ細胞を抑制剤に連続的に曝露することを必要とする。耐性と は、Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーを意味し、一般的には抗原特異的 であり耐性化剤への曝露を止めた後も持続するという点で免疫抑制とは異なる。 操作上は、耐性化剤の不存在下で特異的抗原に曝露した際のＴ細胞応答の欠如に より耐性が示されうる。 １またはそれ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えばＢ７のごとき）を 包含するが、これに限らない）をダウンレギュレーションすることまたは妨害す ること、例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成の妨害は、組 織、皮膚および器官の移植および対宿主移植片疾患（ＧＶＨＤ）において有用で あろう。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させ るはずである。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶反応は、組織片が Ｔ細胞により外来のものと認識されることにより開始され、次いで、移植片を破 壊する免疫反応が起こる。免疫細胞上でのＢ７リンパ球抗原とその本来的なリガ ンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（別のＢリンパ球抗原（例えば 、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するモノマー形態のペプチドと混合された、 あるいは単独の、Ｂ７−２活性を有する可溶性でモノマー形態のペプチド）の移 植前の投与は、応答的な同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の本来 のリガンドへの分子の結合を誘導する可能性がある。この点においてＢリンパ球 抗原機能をブロックすることは、Ｔ細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合 成を妨害し、かくして、免疫抑制剤として作用する。そのうえ、同時刺激の欠如 はＴ細胞の反応を失わせるのに十分でありうる。Ｂリンパ球抗原ブロッキング試 薬による長期の耐性の誘導により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の 必要性が回避されうる。対象において十分な免疫抑制または耐性を達成するため には、Ｂリンパ球抗原の組み合わせの機能をブロックすることも必要かもしれな い。 器官移植拒絶反応またはＧＶＨＤを妨害することにおける個々のブロッキング 試薬の有効性を、ヒトにおける有効性を推定しうる動物モデルを用いて評価する ことができる。使用可能な適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およ びマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、それらは両方ともインビボで のＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用された（Lensch ow et al.，Science 257:789-792(1992)およびTurka et al.，Proc Natl．Acad ．Sci．USA，89:11102-11105(1992)に記載されている）。さらに、ＧＶＨＤのネ ズミモデル（Paul ed.，Fundamental Immunology，Ravan Press，New York，198 9，pp.846-847参照）を用いて、インビボでの当該疾患の進行に対するＢリンパ 球抗原機能のブロッキング効果を決定することができる。 また、抗原機能をブロックすることは自己免疫疾患の治療にとり治療的に有用 でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾病の病 理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適当な活 性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨害することは疾病の徴候を減 少または除去しうる。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を破壊するこ とによりＴ細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与を用いてＴ細胞活性化を阻 害し、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはＴ細胞由来のサイトカインの産 生を妨害することができる。さらに、ブロッキング試薬は、疾病の長期の寛解を 導く可能性のある自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的耐性を誘導しうる。自己免疫疾 患の予防または改善におけるブロッキング試薬の有効性を、ヒトの自己免疫疾患 についての十分に特徴づけられた多くの動物モデルを用いて決定することができ る。例は、ネズミの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮ ＺＢハイブリッドマウスにおける全身性深在性エリトマトーデス、ネズミ自己免 疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびネ ズミの実験的重症筋無力症（Paul ed.，Fundamental Immunology，Raven Press ，New York，1989，pp.840-856）を包含する。 免疫応答をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能（好まし くは、Ｂリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションは治療に有用でもある。 免疫応答のアップレギュレーションは存在している免疫応答を促進する形態また は最初の免疫応答を除去する形態であってよい。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を 刺激することによる免疫応答の促進は、ウイルス感染の場合に有用でありうる。 さらに、インフルエンザ、通常のかぜ、および脳炎のごとき全身的なウイルス性 疾患を、刺激性形態のＢリンパ球抗原を全身投与することにより改善してもよい 。 別法として、Ｔ細胞を患者から取り、本発明ペプチドを発現するＡＣＰｓを付 加したウイルス抗原とともにインビトロにおいてＴ細胞を同時刺激するか、また は刺激性形態の本発明可溶性ペプチドと一緒にし、次いで、インビトロで活性化 されたＴ細胞を患者体内に再導入することにより、感染患者における抗ウイルス 免疫応答を促進してもよい。抗ウイルス免疫応答を促進するもう１つの方法は、 感染細胞を患者から取り、本明細書記載の本発明蛋白をコードする核酸をそれら にトランスフェクションして細胞がその表面に蛋白全体または一部を発現するよ うにし、次いで、トランスフェクション細胞を患者体内に再導入することであろ う。すると、感染細胞はインビボにおいて同時刺激シグナルをＴ細胞に伝えるこ とができ、そのことによりＴ細胞を活性化することができよう。 もう１つの適用例において、抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の アップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫性の誘導において有用でありうる 。本発明の少なくとも１種のペプチドをコードする核酸でトランスフェクション された腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌 腫）を対象に投与して対象中の腫瘍特異的耐性を克服することができる。所望な らば、腫瘍細胞をトランスフェクションしてペプチドの組み合わせを発現させる ことができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、Ｂ７−２様活性を有するペプ チドのみ、またはＢ７−１様活性および／またはＢ７−３様活性を有するペプチ ドと組み合わせて発現することを指令する発現ベクターで、エクスビボにおいて トランスフェクションすることができる。トランスフェクションされた腫瘍細胞 を患者に戻して、トランスフェクションされた細胞の表面上にペプチドを発現さ せる。別法として、遺伝子治療法を用いてインビボでのトランスフェクションの ために腫瘍細胞を標的化することができる。 腫瘍細胞表面上におけるＢリンパ球抗原の活性を有する本発明ペプチドの存在 は、Ｔ細胞に必要な同時刺激シグナルを提供して、Ｔ細胞により媒介されるトラ ンスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣ クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠く腫瘍細胞、あるいは十分量のＭＨＣ クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラ スＩα鎖蛋白およびβ₂マイクログロブリン蛋白またはＭＨＣクラスＩＩα鎖お よびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白の全体または一部（例えば、末端切断蛋白の細胞 質ドメイン）をコードしている核酸でトランスフェクションして、そのことによ りクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ蛋白を細胞表面上に発現させることができる 。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペ プ チドと組み合わせた適当なクラスＩまたはクラスＩＩ ＨＭＣの発現は、Ｔ細胞 により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導 する。所望により、不変鎖のごとき、ＭＨＣクラスＩＩ結合蛋白の発現をブロッ クするアンチセンス構築物をコードしている遺伝子を、Ｂリンパ球抗原の活性を 有するペプチドをコードしているＤＮＡとともに同時トランスフェクションして 腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導こともできる。よって、 ヒト対象におけるＴ細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象における腫瘍 特異的耐性を克服するに十分でありうる。 本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい： 胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびイソタイプスイッチングのためのアッ セイ（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を転調させ、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに 影響する蛋白を同定する）は、Maliazewski,J.Immunol.144:3028-3033,1990に記 載されているアッセイを包含するが、これに限らず、さらにＢ細胞の機能のアッ セイは、In vitro antibody production,Mond,J.J.and Brunswick,M.In Current Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1 pp.3.8.1-3.8.16,John Wile y and Sons,Tronto 1994に記載のアッセイを包含する。 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（特に、主としてＴｈ１およひＣＴＬ応 答を発生させる蛋白を同定する）は、に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 樹枝状細胞依存的アッセイ（特に、無処理のＴ細胞を活性化する樹枝状細胞に より発現される蛋白を同定する）は、 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（特に、超抗体誘導後のアポトーシス を防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する ）は、 に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。 初期段階のＴ細胞のコミットメント（commitment）および発達のアッセイは、 Antica et al.,Blood 84:111-117,1994;Fine et al.,Cellular Immunology 155:111-122,1994;Galy et al.,Blood 85:2770-2778,1995;Toki et al.,Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 88:7548-7551,1991に記載のアッセイを包含するが、これらに 限らない。造血調節活性 本発明蛋白は、造血の調節において有用であり、それゆえ、骨髄およびリンパ 球欠乏症の治療において有用である。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系 を支持する最低限の生物学的活性でさえも、造血の調節への関与を示している。 例えば、赤血球系前駆細胞のみの増殖を支持すること、あるいは他のサイトカイ ンと組み合わされて、例えば種々の貧血の治療に有用性を示すこと、あるいは放 射線療法／化学療法と組み合わされて赤芽前駆細胞および／または赤芽細胞の産 生を刺激すること；顆粒球のごとき骨髄細胞および単球／マクロファージの増殖 を支持すること（すなわち、伝統的なＣＳＦ活性）、例えば、化学療法と組み合 わされて、引き続き起こる骨髄抑制を防止することに有用であり；巨核細胞の増 殖、次いで、血小板の増殖を支持すること、またそれにより血小板減少症のごと き種々の血小板疾患を予防または治療することに有用であり、また一般的には血 小板輸液の代わりにあるいはそれと相補的に使用され；さらに／あるいは造血幹 細胞（成熟して上記のすべての造血細胞となり、それゆえ、種々の幹細胞疾患（ 通常には、移植により治療される疾患であり、例えば、再生不良性貧血および発 作性ヘモグロビン尿症）において有用性がわかる）の増殖を支持することに有用 であり、さらにはインビボまたはエクスビボでの放射線／化学療法後（すなわち 、骨髄移植と組み合わされる）、あるいは遺伝子治療のために遺伝子操作された 後の幹細胞コンパートメントの正常細胞としての再増殖においても有用である。 本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。 種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている 。 胚の幹細胞の分化のアッセイ（特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する ）は、Johansson et al.Cellular Biology 15:141-151,1995;Keller et al.,Mol ecular and Cellular Biology 13:473-486,1993;McClanahan et al.,Blood81:2903-2915,1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない 。 幹細胞生存および分化のアッセイ（特に、リンパー造血を調節する蛋白を同定 する）は、 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 組織増殖活性 本発明蛋白は、骨、軟骨、鍵、靭帯および／または神経組織の成長または再生 、ならびに傷の治癒および組織修復に用いる組成物において、さらに熱傷、裂傷 および潰瘍の治療において有用性を有する。 骨が正常に形成されない環境において軟骨および／または骨の成長誘導する本 発明蛋白は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒 における用途がある。本発明蛋白を用いるかかる調合物は、閉鎖性骨折ならびに 解放性骨折の軽減に有用であり、また人工関節の固定の改善にも有用である。骨 形成剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷による、あるいは腫瘍 学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の修復に貢献し、さらに美容整形外 科手術においても有用である。 本発明蛋白を歯周病の治療および他の歯の修復プロセスに用いてもよい。かか る作用剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、 あるいは骨形成細胞前駆体の分化を誘導しうる。本発明蛋白は、例えば、骨およ び／または軟骨修復の刺激により、あるいは炎症または炎症プロセスにより媒介 される組織破壊のプロセス（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等）をブロックす ることにより、骨粗鬆症または骨関節炎の治療においても有用でありうる。 本発明蛋白によるものとしてもよい組織発生活性のもう１つのカテゴリーは鍵 ／靭帯の形成である。鍵／靭帯様組織または他の組織が正常に形成されない環境 におけるかかる組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の動物におけ る鍵または靭帯の裂傷、変形および他の鍵または靭帯の欠損の治癒、に適用され る。鍵／靭帯様組織誘導蛋白を用いるかかる調合物は、鍵または靭帯組織に対す るダメージの予防ならびに鍵または靭帯の骨または他の組織への固定の改善に用 いてもよい。本発明組成物により誘導されるデノボ鍵／靭帯様組織形成は、先天 性の、外傷による、あるいは腫瘍学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の 修復に貢献し、さらに鍵または靭帯の付着または修復のための美容整形外科手術 においても有用である。本発明組成物は、鍵−または靭帯−形成細胞を誘引する ための環境を提供し、鍵−または靭帯−形成細胞の増殖を刺激し、鍵−または靭 帯−形成細胞の前駆体の分化を誘導し、あるいはインビボに戻した場合に組織修 復を行うようにエクスビボでの鍵／靭帯細胞または前駆体の増殖を誘導しうる。 本発明組成物は、鍵炎、手根骨トンネル症候群および他の鍵または靭帯の欠損に も有用である。本発明組成物は、適当なマトリックスおよび／または当該分野で よく知られた担体のごとき隔離剤を含んでいてもよい。 本発明蛋白は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生に、すなわち 、中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシーならびに機械的疾患および外 傷性疾患（神経細胞または神経組織に対する変性、死もしくは外傷を包含）の治 療にも有用でありうる。より詳細には、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーおよ び局在化ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾病、ならびにアルツハイマー病 、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性外側脊髄硬化症およびShy-Drager 症 候群のごとき中枢神経系の疾病の治療に蛋白を使用してもよい。本発明により治 療してもよいさらなる症状は、脊髄疾患のごとき機械的疾患および外傷性疾患、 頭部外傷ならびに卒中のごとき脳血管系の疾患を包含する。化学療法または他の 医学的療法により引き起こされる末梢ニューロパシーは、本発明蛋白を用いて治 療可能である。 また本発明蛋白は、圧迫性潰瘍、血管機能不全に関連した潰瘍、外科的および 外傷による創傷等（これらに限らない）を包含する非治癒性創傷のより好ましく 迅速な閉口の促進にも有用でありうる。 また本発明蛋白は、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を包含 ）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）、および血管（血管内皮を包含）組織の ごとき他の組織の発生、あるいはかかる組織を構成している細胞の増殖促進のた めの活性を示しうる。望ましい効果の一部は、線維症性瘢痕を抑制することによ る正常組織の再生であってもよい。本発明蛋白は脈管形成活性も示しうる。 本発明蛋白は、腸の保護または再生、および肺または肝臓の線維症、種々の組 織の再灌流傷害、および全身的なサイトカインのダメージにより生じる症状の治 療にも有用でありうる。 本発明蛋白は、前駆体組織または細胞からの上記組織の分化促進または抑制； あるいは上記組織の増殖抑制にも有用でありうる。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、以下の方法により測定してもよい： 組織再生活性のアッセイは、国際公開ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、鍵） ；国際公開ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；国際公開ＷＯ９１／ ０７４９１（皮膚、内皮）に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らな い。 創傷治癒活性のアッセイは、Maibach，HI and Rovee，DT，eds.，Year Book M edical Publishers，Inc.，Chicago（Eaglstein and Mertz,J．Invest．Dermato l 71:382-384(1978)により修飾されている）に記載されたものを包含するが、こ れらに限らない。アクチビン／インヒビン活性 また、本発明蛋白はアクチビン−またはインヒビン−関連活性を示しうる。イ ンヒビン類は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出抑制能により特徴づけられ、 アクチビン類は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出刺激能により特徴づけられ る。よって、本発明蛋白は、単独であるいはインヒビンαファミリーのメンバー とのヘテロダイマーの形態で、メスの哺乳動物の繁殖力を減少させ、オスの哺乳 動物の精子形成減少させるインヒビンの能力に基づく不妊薬として有用でありう る。十分な量の他のインヒビンの投与により、これらの哺乳動物において不妊を 誘導することができる。別法として、本発明蛋白は、ホモダイマーとしてあるい はインヒビン−βグループの他の蛋白のサブユニットとのヘテロダイマーとして 、下垂体前葉細胞からのＦＳＨ放出の刺激におけるアクチビン分子の能力に基づ いて、繁殖力を誘導する治療薬として有用でありうる。例えば、米国特許第４７ ９８８８５号参照。また本発明蛋白は、性的に未成熟な哺乳動物における繁殖の 向上に有用である可能性があり、その結果、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家 畜の生存期間中の繁殖力が増大する。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい： アクチビン／インヒビン活性のアッセイは、Vale et al.,Endocrinology 91:5 62-572,1972;Ling et al.,Nature 321:779-782,1986;Vale et al.,Nature 321:7 76-779,1986;Mason et al.,Nature 318:659-663,1985;Forage et al.,Proc.Natl .Acad.Sci.USA 83:3091-3095,1986に記載のアッセイを包含するが、これらに限 らない。 化学走性／ケモキネシス活性 本発明蛋白は、哺乳動物細胞、例えば単球、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸 球および／または内皮細胞の化学走性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカ インとして作用）を有する可能性がある。化学走性およびケモキネシス蛋白を用 いて所望細胞集団を所望作用部位に動員または誘引することができる。化学走性 またはケモキネシス蛋白は、組織に対する傷害および他の外傷の治療ならびに局 所的な感染の治療に特に有利である。例えば、リンパ球、単球または好中球の腫 瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する免疫応答を改善しう る。 特定の蛋白またはペプチドは特定の細胞集団に対して化学走性活性を有してお り、刺激可能な場合には、直接的または間接的にかかる細胞集団の方向または運 動を指令する。好ましくは、蛋白またはペプチドは、細胞の方向づけられた運動 を直接的に刺激する能力を有する。特定の蛋白が細胞集団に対する化学走性活性 を有するかどうかを、かかる蛋白またはペプチドを細胞化学走性の既知アッセイ に用いることにより容易に決定することができる。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 化学走性活性のアッセイ（化学走性を誘導または妨害する蛋白を同定するアッ セイ）は、細胞の膜を越えた移動を誘導する蛋白の能力ならびに１の細胞集団の 他の細胞集団への付着を誘導する蛋白の能力を測定するアッセイを含む。移動お よび付着に適したアッセイは、 に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。 止血および血栓溶解活性 また、本発明蛋白は、止血または血栓溶解活性を示す可能性がある。結果とし て、かかる蛋白は、種々の凝血疾患（血友病のごとき遺伝性疾患を包含）の治療 に有用であり、あるいは外傷、手術または他の原因により生じた傷害の治療にお ける凝血および他の止血を促進しうる。本発明蛋白は、血栓の溶解または血栓形 成阻害ならびにそれらにより生じる症状（例えば、心筋梗塞および中枢神経系血 管の梗塞（例えば、卒中）のごとき）の治療および予防に有用でありうる。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 止血およ：び血栓溶解活性のアッセイは、 Linet et al.,J.Clin.Pharmacol.26:131-140,1986;Burdick et al.,Thrombosis Res.45:413-419,1987;Humphrey et al.,Fibrinolysis 5:71-79(1991)；Schaub,P rostaglandins 35:467-474,1988に記載のアッセイを包含するが、これらに限ら ない。 受容体／リガンド活性 また、本発明蛋白は、受容体、受容体リガンドまたは受容体／リガンド相互作 用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性を示しうる。かかる受容体およびリ ガンドの例は、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼお よびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞− 細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド（細胞付着分子（セレク チン、インテグリンおよびそれらのリガンドのごとき）ならびに抗原提示、抗原 認識、細胞性および体液性免疫応答の発生に関与する受容体／リガンド対などを 包含）を包含するがこれらに限らない。受容体およびリガンドは、関連する受容 体／リガンド相互作用に対する潜在的なペプチドまたは小型分子阻害剤のスクリ ーニングにも有用である。本発明蛋白（受容体およびリガンドのフラグメントを 包含するが、これらに限らない）は、それ自体、受容体／リガンド相互作用の阻 害剤としで有用でありうる。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 受容体−リガンド活性の適当なアッセイは、 175:59-68,l!)94; Stittetal.,Ccll80:661-670,1995に記載のアッセイを包含す るが、これらに限らない。 抗炎症活性 本発明蛋白は抗炎症活性を示しうる。抗炎症活性は、刺激応答に関与している 細胞に刺激を与えることにより、細胞−細胞相互作用（例えば、付着のごとき） を阻害または促進することにより、炎症プロセスに関与している細胞の化学走性 を阻害または促進することにより、細胞溢出を阻害または促進することにより、 あるいは炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産生を刺激また は抑制することにより発揮される。かかる活性を示す蛋白を用いて炎症の症状（ 慢性もしくは急性症状を包含、感染に関連した炎症（敗血性ショック、敗血症も しくは全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）のごとき）、虚血−再潅流傷害、エン ドトキシンによる致命的傷害、関節炎、補体により媒介される超急性拒否反応、 腎炎、サイトカインもしくはケモカインにより誘導される肺の傷害、炎症性腸疾 患、クローン病またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のごときサイトカインの過剰産生 から生じる疾病を包含するがこれらに限らない）を治療することができる。本発 明蛋白は、アナフィラキシーおよび抗原性物質もしくは材料に対する過敏症の治 療にも有用でありうる。 腫瘍阻害活性 腫瘍の免疫学的治療または予防に関する上記活性のほかに、本発明蛋白は他の 抗腫瘍活性を示しうる。ある蛋白は腫瘍増殖を直接的または間接的に（例えば、 ＡＤＣＣを介して）阻害しうる。ある蛋白は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に 作用して、腫瘍増殖を支持するに必要な組織の形成を阻害し（例えば、脈管形成 を阻害することにより）、腫瘍増殖を阻害する他の因子、作用剤または細胞タイ プの産生を引き起こすことにより、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、作用剤ま たは細胞タイプを除去または阻害することにより腫瘍阻害活性を示しうる。他の活性 本発明蛋白は、下記のさらなる活性または効果の１つまたはそれ以上を示しう る：細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫（これらに限らず）を包含する感染 性因子の殺傷；身長、体重、体毛の色、目の色、皮膚または他の組織の色素沈着 、または器官または身体部分のサイズまたは形態（例えば、豊胸またはその逆） を包含する身体特性への影響（抑制または促進）；摂食した脂肪、蛋白または炭 水化物の消化への影響；食欲、性欲、ストレス、認識（認識の疾患を包含）、鬱 （鬱病性疾患を包含）および暴力的行為（これらに限らず）を包含する行動特性 への影響；鎮痛効果または他の痛み軽減効果の提供；造血系以外の系統における 胚の幹細胞の分化および増殖の促進；ホルモンまたは内分泌活性；酵素の場合、 酵素欠乏の修正および関連疾患の治療；過剰増殖性疾患（例えば、乾癬のごとき ）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗体または補体に結合する能力）； ならびにワクチン組成物において抗原として作用してかかる蛋白またはかかる蛋 白と交差反応する他の物質もしくは存在に対する免疫応答を生じさせる能力。投与および用量 本発明蛋白（どのような源からであってもよく、組み換え法および非組み換え 法によるものを包含するが、これらに限らない）を、医薬上許容される担体と混 合して医薬組成物中に用いてもよい。かかる組成物は（蛋白および担体のほかに ）、希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および当該分野 でよく知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、 有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特 性は投与経路に依存する。本発明医薬組成物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔ ＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ− ７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、 ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、 Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、スロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリス ロポイエチンのごときサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有 していてもよい。医薬組成物はさらに、蛋白活性を増強し、あるいは治療におい てその活性または有用性を補う他の作用剤を含有していてもよい。かかるさらな る因子および／または作用剤を医薬組成物に含有させて、本発明蛋白との相乗効 果を発揮させ、あるいは副作用を最小化してもよい。逆に、特定のサイトカイン 、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症 剤の処方に本発明蛋白を含有させて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因 子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化してもよ い。 本発明蛋白は、多量体（例えば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー）または それ自体もしくは他の蛋白との複合体となって活性でありうる。結果的に、本発 明医薬組成物は、かかる多量体または複合体形態の本発明蛋白を含むものであっ てもよい。 本発明医薬組成物は、本発明蛋白と蛋白もしくはペプチド抗原との複合体の形 態であってもよい。蛋白および／またはペプチド抗原は、Ｂリンパ球ならびにＴ リンパ球に対して刺激シグナルを送達するであろう。Ｂリンパ球はその表面免疫 グロブリン受容体を通して抗原に応答するであろう。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ蛋白 による抗原提示後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通して抗原に応答するであろう。 ＭＨＣならびに宿主細胞のクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ遺伝子によりコー ドされたものを包含する構造上関連した蛋白は、Ｔリンパ球に対するペプチド抗 原の提示に役立つであろう。抗原成分は、精製ＭＨＣ−ペプチド複合体のみとし て、または直接Ｔ細胞にシグナルを送ることのできる同時刺激分子とともに供給 される。あるいはまた、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンおよび他の分子に結合し うる抗体を、本発明医薬組成物と混合することもできる。 本発明医薬組成物はリポソーム形態であってもよく、その中で本発明蛋白はさ らに他の医薬上許容される担体、脂質のごとき両親媒性作用剤（水溶液中でミセ ルのような凝集体形態、不溶性単層、液状結晶またはラメラ層として存在）と混 合されている。リポソーム処方に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド 、 スルファチジド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが、 これらに限らない。かかるリポソーム処方の製造は当業者のレベルの範囲内であ り、例えば、米国特許第４２３５８７１、４５０１７２８、４８３７０２８、お よび４７３７３２３号（参照によりそれらすべてを本明細書に記載されているも のとみなす）に記載されたようなものである。 本明細書の用語「治療上有効量」とは、有意な患者の利益、例えば、かかる症 状の徴候の改善、治癒、治癒速度の増大を示すに十分な医薬組成物または方法の 各有効成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の有効成分について用い る場合、該用語は当該成分のみをいう。有効成分の組み合わせに用いる場合、逐 次投与あるいは同時投与にかかわらず治療効果を生じる有効成分量の合計量をい う。 本発明の治療方法の実施において、治療上有効量の本発明蛋白を治療すべき症 状を有する哺乳動物に投与する。本発明方法に従って、単独またはサイトカイン 、リンホカインもしくは他の造血因子のごとき他の治療薬とともに本発明蛋白を 投与してもよい。１種またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の 造血因子と共投与する場合、本発明蛋白をサイトカイン、リンホカイン、他の造 血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子と同時または逐次投与してもよい。逐 次投与する場合、担当医師は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血 栓溶解因子もしくは抗血栓因子と本発明蛋白との組み合わせにおける適切な投与 順序を決定するであろう。 本発明医薬組成物中または本発明の実施に用いる本発明蛋白の投与を種々の慣 用的方法、例えば、経口的摂食、吸入、または皮内、皮下、または静脈注射で行 うことができる。患者への静脈注射が好ましい。 治療上有効量の本発明蛋白を経口投与する場合、本発明蛋白は錠剤、カプセル 、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発 明医薬組成物はゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントをさらに含有して いてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５ないし９５％の本発明蛋白、 好ましくは約２５ないし９０％の本発明蛋白を含有する。液体形態で投与する場 合、 水、ペトロレウム、動物または植物起源の油脂、例えばピーナッツ油、鉱油、大 豆油、またはゴマ油、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組成物 は、生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール類（ 例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコ ール）をさらに含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は、 約０．５ないし９０重量％の本発明蛋白、好ましくは約１ないし５０％の本発明 蛋白を含有する。 治療上有効量の本発明蛋白を静脈、皮内または皮下注射により投与する場合、 本発明蛋白はパイロジェン不含で、非経口的に許容される水溶液の形態であろう 。適切なｐＨ、等張性、安定性を有するかかる非経口的に許容される蛋白溶液の 調製は、当業者の範囲内である。静脈、皮内、または皮下注射用の好ましい医薬 組成物は、本発明蛋白のほかに、注射用塩化ナトリウム、リンゲル溶液、注射用 デキストロース、注射用デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、注射用乳酸 含有リンゲル溶液、または当該分野で知られている他の担体を含有すべきである 。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業 者に知られた他の添加物を含んでいてもよい。 本発明医薬組成物中の本発明蛋白の量は、治療すべき症状の性質および重さ、 ならびに患者がすでに受けていた治療の性質による。最終的には、担当医師が、 各患者を治療すべき本発明蛋白量を決定するであろう。まず、担当医師は、低用 量の本発明蛋白を投与し、患者の応答を観察する。最適治療効果が得られるまで 、より高用量の本発明蛋白を投与してもよく、最適治療効果が得られた時点で用 量をさらに増加させない。本発明方法を実施するための種々の医薬組成物は、体 重１ｋｇあたり約０．０１μｇないし約１００ｍｇの本発明蛋白（好ましくは、 体重１ｋｇあたり約０．１μｇないし約１０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあ たり０．１μｇないし約１ｍｇの本発明蛋白を含有すべきである。 本発明組成物を用いる静脈投与による治療の期間は、治療すべき疾病の重さな らびに各患者の状態および応答により変化させられるであろう。本発明蛋白の各 適用期間は、連続静脈投与の場合１２ないし２４時間の範囲であると考えられる 。 最終的には、担当医師が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与による治療の期間 を決定するであろう。 本発明蛋白を用いて動物を免役して、本発明蛋白と特異的に反応するポリクロ ーナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。蛋白全体またはそのフラグメン トを免疫原として用いてかかる抗体を得てもよい。ペプチド免疫源はカルボキシ 末端にシステイン残基をさらに含んでいてもよく、キーホールリムペット・ヘモ シアニン（ＫＬＨ）のごときハプテンに結合する。かかるペプチドを合成する方 法は当該分野において知られており、例えば、 R.P.Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85,2149-2154(1963)； J.L.Krstenansky,et.al.,FEBS Lett.211,10(1987)に記載のごときものがある。 本発明蛋白に結合するモノクローナル抗体は、本発明蛋白の免疫検出用の有用な 診断薬でありうる。本発明蛋白に結合する中和抗体は、本発明蛋白に関連した症 状の治療薬として有用でありうるし、さらに本発明蛋白の異常発現が関与してい るいくつかの形態の癌の治療におけるある種の腫瘍の治療において有用でありう る。癌細胞または白血球細胞の場合、本発明蛋白に対する中和モノクローナル抗 体は、本発明蛋白により媒介されうる癌細胞の転移蔓延の検出および予防に有用 でありうる。 骨、軟骨、腱または靭帯の再生に有用な本発明組成物に関して、治療方法は、 組成物を局所的、全身的、またはインプラントもしくはデバイスのごとく局部的 に投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成物は、も ちろん、パイロジェン不含の生理学的に許容される形態である。さらに、望まし くは、組成物をカプセル封入するかまたは粘性形態として注射して骨、軟骨また は組織ダメージ部位に送達してもよい。局所投与は傷の治癒および組織修復に適 する。上記組成物中に含有されていてもよい本発明蛋白以外の治療上有用な作用 剤を、代替的または付加的に、本発明方法における組成物と同時または逐次投与 してもよい。好ましくは、骨および／または軟骨形成のためには、組成物は、蛋 白含有組成物を骨および／または軟骨ダメージ部位に送達し、骨および軟骨の発 生のための構造を提供し、さらに最適には体内に吸収されうるマトリックスを含 有するであろう。かかるマトリックスは、他の移植される医学的器具に現在使用 されている材料からできていてもよい。 マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外 観および界面特性に基づく。組成物の特別な適用により適当な処方が決定されよ う。組成物用として可能なマトリックスは生分解性で、化学的に知られた硫酸カ ルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコ ール酸およびポリ無水物であってもよい。他の使用可能な材料は生分解性で、生 物学的によく知られたもの、例えば、骨または皮膚のコラーゲンである。さらに マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。 他の可能なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミ ネート、または他のセラミックスのごとき生分解性でなく、化学的に知られたも のである。マトリックスは上記タイプの材料の組み合わせ、例えばポリ乳酸およ びヒドロギシアパタイトあるいはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムを含んで いてもよい。バイオセラミックスを、組成物中、例えばカルシウム−アルミネー ト−ホスフェート中において変更してもよく、加工して孔サイズ、粒子サイズ、 粒子形状および生分解性を変化させてもよい。 １５０ないし８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔性粒子形態の乳酸およ びグリコール酸の５０：５０（モル重量）のコポリマーが現在のところ好ましい 。いくつかの適用例においては、カルボキシメチルセルロースまたは自己由来の 血餅のごとき隔離剤を用いてマトリックスからの蛋白組成物の解離を防止するこ とが有用であろう。 隔離剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒド ロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル メチルセルエオース、およびカルボキシメチルセルロースを包含するアルキルセ ルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを包含）のごときセルロース性材料で あり、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン性の塩が最も好ましい 。他の好ましい隔離剤は、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレ ングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよ び ポリ（ビニルアルコール）を包含する。本発明に有用な隔離剤の量は、全処方重 量に対して０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、この量は、 ポリマーマトリックスからの蛋白の脱離を防止し、組成物の適切な取り扱いを可 能にする量であるが、前駆細胞がマトリックスから浸潤し、そのことにより前駆 細胞の骨形成活性を促進する機会を蛋白に付与するようにするには、あまり多く ないようにする。 さらなる組成物において、本発明蛋白が骨および／または軟骨の欠損、傷、ま たは組織の治療に有益な他の作用剤と混合されていてもよい。これらの作用剤は 、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因 子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を 包含する。 また、目下のところ、治療組成物は獣医学的用途にも価値がある。詳細には、 ヒトのほかに、家畜およびサラブレッドのウマが本発明蛋白を用いるかかる治療 に望ましい患者である。 組織の再生に使用される蛋白含有医薬組成物の投与規則は、蛋白の作用を変化 させる種々の要因、例えば形成が望まれる組織重量、ダメージ部位、ダメージを 受けた組織の状態、傷のサイズ、必要な組織のタイプ（例えば、骨）、患者の年 齢、性別、および食事、感染の重さ、投与期間、ならびに他の臨床的要因を考慮 して医師が決定するであろう。用量は、復元に使用するマトリックスのタイプお よび医薬組成物中の他の蛋白の含有に応じて変更されてもよい。例えば、ＩＧＦ Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき他の既知増殖因子の最終組成物への添加 も用量に影響しうる。組織／骨の増殖および／または修復を、例えばＸ線、組織 形態学的調査およびテトラサイクリン標識により定期的に評価することにより経 過をモニターすることができる。 本発明ポリヌクレオチドを遺伝子治療に用いることもできる。かかるポリヌク レオチドをインビボまたはエクスビボで細胞に導入して哺乳動物対象中で発現さ せることができる。核酸を細胞または生物に導入するための他の知られた方法に より本発明ポリヌクレオチドを投与してもよい（ウイルスベクターに入れて、あ るいは裸のＤＮＡの形態として等があるが、これらに限らない）。 本発明蛋白存在下で細胞をエクスビボにおいて培養して増殖させ、あるいはか かる細胞に対する所望効果を生じさせ、あるいはかかる細胞中に所望活性を生じ させてもよい。次いで、処理された細胞を、治療目的で、インビボにおいて導入 することができる。 本明細書に引用した特許および文献を、参照により全体が本明細書に記載され ているものとみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 14/57 14/57 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／７３８，３６７ (32)優先日 平成８年10月25日(1996．10．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラバリー，エドワード・アール アメリカ合衆国01876マサチューセッツ州 トゥークスベリー、グリーン・メドー・ド ライブ90番 (72)発明者 レイシー，リサ・エイ アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州 アクトン、スクール・ストリート124番 (72)発明者 マーバーグ，デイビッド アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州 アクトン、オーチャード・ドライブ２番 (72)発明者 トレーシー，モーリス アメリカ合衆国02167マサチューセッツ州 チェスナット・ヒル、ウォルコット・ロー ド93番 (72)発明者 スパルディング，ビッキー アメリカ合衆国01821マサチューセッツ州 ビラリカ、メドーバンク・ロード11番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１４からヌクレオチド４３３までのヌクレ オチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の 全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の 成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｈ）生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド； （ｉ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４の全 長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｊ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードするポリヌクレオチド； （ｋ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４の成 熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｌ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードするポリヌクレオチ ド； （ｍ）配列番号：６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｎ）配列番号：６のヌクレオチド１４からヌクレオチド７３３までのヌクレ オチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｏ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｐ）生物学的活性を有する配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド； （ｑ）上記（ａ）〜（ｅ）または（ｉ）〜（ｎ）のポリヌクレオチドの対立遺 伝子変種であるポリヌクレオチド； （ｒ）上記（ｇ）、（ｈ）、（ｏ）または（ｐ）の蛋白の種相同体をコードす るポリヌクレオチド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチドを含む組成物。 ２．該ポリヌクレオチドが発現制御配列に作動可能に連結されている請求項１ の組成物。 ３．請求項２の組成物で形質転換された宿主細胞。 ４．該細胞が哺乳動物細胞である請求項３の宿主細胞。 ５．（ａ）請求項３の宿主細胞の培養を適当な培地中で増殖させ；ついで （ｂ）培養物から蛋白を精製する ことを含む蛋白の製造方法。 ６．請求項５の方法により製造される蛋白。 ７．成熟蛋白を含む請求項６の蛋白。 ８．以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む蛋白であって、 他の哺乳動物蛋白を実質的に含まない蛋白を含む組成物： （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸５２からアミノ酸１４０までのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント； （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９５ １の ｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列； （ｅ）配列番号：７のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号：７のアミノ酸１からアミノ酸１４０までのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメント；および （ｈ）受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃ ＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列。 ９．該蛋白が配列番号：２のアミノ酸配列を含む請求項８の組成物。 １０．該蛋白が配列番号：２のアミノ酸５２からアミノ酸１４０までのアミノ 酸配列を含む請求項８の組成物。 １１．さらに医薬上許容される担体を含む請求項８の組成物。 １２．治療上有効量の請求項１１の組成物を哺乳動物対象に投与することを含 む、医学的状態の予防、治療または改善方法。 １３．配列番号：１または配列番号：３のＤＮＡ配列に対応する遺伝子。 １４．該ポリヌクレオチドが配列番号：１のヌクレオチド配列を含む請求項１ の組成物。 １５．該ポリヌクレオチドが配列番号：１のヌクレオチド１４からヌクレオチ ド４３３までのヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。 １６．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたク ローンＣ１９５ １の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求 項１の組成物。 １７．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたク ローンＣ１９５ ４のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコード するポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 １８．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたク ローンＣ１９５ ４の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求 項１の組成物。 １９．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたク ローンＣ１９５ ４のｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコード するポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 ２０．該ポリヌクレオチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコード するポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 ２１．該ポリヌクレオチドが生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配 列のフラグメントを含む蛋白をコードしているポリヌクレオチドを含む請求項１ の組成物。 ２２．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単 離体Ｃ１９５ ４の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求項 １の組成物。 ２３．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単 離体Ｃ１９５ ４のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードす るポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 ２４．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単 離体Ｃ１９５ ４の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求項 １の組成物。 ２５．該ポリヌクレオチドが受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単 離体Ｃ１９５ ４のｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードす るポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 ２６．該蛋白が受託番号ＡＴＣＣ９８０７９として寄託されたクローンＣ１９ ５ １のｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列を含む請求項８の 組成物。 ２７．該蛋白が受託番号ＡＴＣＣ９８１９２として寄託された単離体Ｃ１９５ ４のｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列を含む請求項８の組 成物。 ２８．配列番号：５、配列番号：６または配列番号：８のｃＤＮＡ配列に対応 する遺伝子。 ２９．該ポリヌクレオチドが配列番号：６のヌクレオチド配列を含む請求項１ の組成物。 ３０．該ポリヌクレオチドが配列番号：６のヌクレオチド１４からヌクレオチ ド７３３までのヌクレオチド配列を含む請求項1の組成物。 ３１．該ポリヌクレオチドが配列番号：７のアミノ酸配列を含む蛋白をコード するポリヌクレオチドを含む請求項１の組成物。 ３２．該ポリヌクレオチドが生物学的活性を有する配列番号：７のアミノ酸配 列のフラグメントを含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１の組 成物。 ３３．該蛋白が配列番号：７のアミノ酸配列を含む請求項８の組成物。 ３４．該蛋白が配列番号：７のアミノ酸１からアミノ酸１４０までのアミノ酸 配列を含む請求項８の組成物。 ３５．該蛋白が配列番号：７のアミノ酸配列のフラグメントを含む請求項８の 組成物。