CN101177454B - Il-18突变体多肽及制备及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IL-18突变体多肽及其制备及用途。本发明属生物技术领域。本发明利用PCR定点突变技术,构建人白介素18突变体(hIL-18),克隆入含PR-PL启动子的温控载体,并在大肠杆菌中高效表达。利用表达的hIL-18突变体D134R治疗由IL-18造成损伤的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。具体的说是IL-18突变体多肽,及其制备及用途。本发明涉及利用PCR定点突变技术,构建人白介素18(hIL-18)突变体,克隆入含PR-PL启动子的温控载体,并在大肠杆菌中高效表达。利用表达的hIL-18突变体治疗由IL-18造成损伤的疾病。
背景技术
(一)IL-18的发现与结构
1989年,Nakamura等发现,痤疮丙酸杆菌(Propioibacterium acnes,P.acnes)和脂多糖(lipopolysacchride,LPS)导致的内毒素休克小鼠脾细胞能诱导干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)产生。将脾细胞培养上清纯化后的蛋白用IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)抗体中和均不能消除,提示这是一种不同的因子[1]。1995年,Okamura等从腹腔注射P.acnes和LPS致内毒素休克的小鼠肝脏中分离出一些多肽片段,根据其中两个多肽片段的氨基酸序列合成引物,从小鼠肝脏mRNA中扩增出一个不完全的cDNA片段,并以此作为探针筛选小鼠肝细胞cDNA文库,得到一全长的cDNA克隆,并在大肠杆菌中表达。所表达蛋白可诱导IFN-γ产生,命名为γ-干扰素诱导因子(IFN-γ-inducing factor,IGIF)[2]。
1996年,Ushio等用鼠IGIF cDNA作为探针,从正常人肝脏cDNA文库中分离出人的IGIF cDNA[3]。鉴于IGIF的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白质均不相同,并且发现它除了能诱导IFN-γ产生外,还有其它多种生物学功能,因而被认为是白介素家族新成员,并命名为白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)[3]。
IL-18前体与IL-1β前体相似,没有生物学活性。但两者都有IL-1β转换酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE or Caspase-1)的加工位点天冬氨酸残基(Asp),ICE可选择性地在特异性的位点切割,使之成为有活性的成熟蛋白。目前认为小鼠的IL-1β裂解位点是35Asp-36Asn,人的IL-1β裂解位点是36Asp-37Tyr。实验证明,ICE缺陷的小鼠可以生成IL-18前体,但不能将其转换成有活性的IL-18,LPS不能在这种小鼠诱生IFN-γ[4]。
折叠识别分析表明,IL-18的蛋白质结构是与IL-1相似的β-三叶草型结构。各种系的IL-18序列中都含有一段IL-1家族的标志性氨基酸序列,称为IL-1特征样序列:F-X(12)-F-X-S-X(6)-F-L[3]。该结构有3个“Y”型或“三叶草”状的单元构成,每个单元有4条β折叠链,2个发夹结构,故整个结构共有12条反向平行的β折叠链和6个发夹结构。其中6条β折叠链、3个发夹结构形成一桶状结构,其中央是一个巨大的疏水核心,而另6条β折叠链和3个发夹结构在桶底部作三角形排列,形成一个“桶盖”[5]。分析显示,位于第七、八β折叠链之间的Loop7对于其与受体的结合是非常重要的,其中Glu121是高度保守的氨基酸。
IL-1特征样序列
(二)IL-18的免疫学功能
NF-κB是重要的转录因子,其调节着免疫和炎症反应中大量基因的表达。IL-18与IL-18受体结合后,可引起IL-1受体相关蛋白激酶(IL-1receptor-associated linase,IRAK)的募集和磷酸化,活化的IRAK与肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated faactor-6,TRAF6)形成复合物,随后激活NF-κB诱导激酶(NF-κB inducing kinase,NIK)[6],进而激活NF-κB[7]。在IRAK基因缺陷小鼠,IL-18诱导的NF-κB信号被阻断,不能诱导Th1细胞产生IFN-γ及NK细胞介导的细胞毒作用[8,9]。研究发现,在KG-1细胞IL-18与NF-κB的结合位点位于IFN-γ基因调节区的-786~-776,称为KBB位点。该位点缺乏时,IL-18依赖的IκBα的降解、NF-κB的活化及IFN-γ的表达明显被抑制,表明该位点对于IL-18诱导IFN-γ基因的转录活化是必需的[10]。
除NF-κB信号途径外,酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)和丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)也参与IL-18激活的信号转导。p56(lck)(LCK)是参与IL-18诱导的信号转导中主要的PTK,单独使用IL-18就能使LCK和MAPK磷酸化而活化,当存在TCR/CD3共刺激时,这种激活作用就更强。因此,IL-18激活LCK-MAPK途径可能参与体内TCR/CD3介导的Th1细胞的免疫反应[11]。此外,IL-18也能诱导JNK(p54MAPK)和p38MAPK的激活[8,11]。最近又有实验证明,MyD88也是IL-18信号转导途径中很重要的蛋白质,也是IL-18信号在IL-18受体复合物和IRAK之间的接合器(adapter)。因此,当小鼠MyD88基因缺乏时,IL-18也不能促进IFN-γ的产生和增加NK细胞的活性,且IL-18诱导小鼠的Th1细胞NF-κB和JNK的激活被阻断[12]。
IL-18能刺激Th1细胞产生IFN-γ[2],还可促进刀豆素A(concanavalinA,ConA)刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)产生IFN-γ、IL-8和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulating factor,GM-CSF),并抑制IL-10的生成[3]。IL-18与IL-12还能协同促进NK细胞和CD40抗体活化的B细胞产生IFN-γ[3,13]。IL-18能促进T细胞增殖[14],并通过活化NF-κB使Th1细胞上的IL-2基因表达增加[15]。IL-18还可促进CD4+T细胞分化为Th1细胞[16]。IL-18还可以通过诱导CD3+/CD4+细胞和NK细胞表达TNF-α,从而促使CD14+细胞群合成IL-1β和IL-8[17]。此外,IL-18还能增强脾细胞中NK细胞的活性。这些最终导致机体免疫反应增强。
IL-18激活免疫反应后在介导免疫损伤上也有重要作用。IL-18促进Th1细胞Fas配体(Fas ligand,FasL)介导的细胞毒作用[18],增强CD8+杀伤性T细胞(CTL)的活性[19],诱导趋化因子CC和CXC的产生[20]。对于NK细胞,IL-18可增加FasL介导的细胞毒性[21],当与IL-12共同刺激时,这种作用进一步加强。IL-18与IL-12协同刺激NK细胞时,可增加其细胞毒性,并诱导大量穿孔素表达[22]。
(三)IL-18与免疫损伤性疾病
类风湿性关节炎(rheumatiod arthritis,RA)是以滑膜慢性炎症为特征的全身性自身免疫病,常导致骨关节软骨和近关节骨的损伤。RA的发病涉及T细胞、B细胞、巨噬细胞样细胞、成纤维样细胞等多种细胞.这些细胞的激活可以释放出多种细胞因子与炎性介质,如IL-1、IL-6、IL-18等,加重炎症反应,破坏关节软骨。
IL-18是一个前炎性细胞因子,在RA中发挥重要病理作用。与骨性关节炎相比,RA患者滑膜组织IL-18mRNA和蛋白表达明显升高。与此相应,在滑液中的淋巴细胞和Mφ上检测到IL-18受体。IL-18可诱导滑液CD14+巨噬细胞大量合成TNF-α。有报道RA患者血清IL-18升高,并在关节滑膜及其下层发现表达IL-18的细胞[23]。Olee T等人报道,IL-18可以抑制转移生长因子-β(TGF-β)诱导的软骨细胞增殖,促进正常人软骨细胞产生NO、iNOS、环氧合酶、IL-6、IL-1β、TNF-α和溶基质素的基因表达,证明IL-18可调节软骨细胞分解代谢、诱导前炎性因子合成、促进软骨降解。在IFN-γ基因缺陷小鼠右膝关节内注射链球菌细胞壁诱导产生关节炎之前,给予IL-18抗体可抑制关节肿胀,并使局部IL-18、TNF-α、IL-1水平下降[24]。
对胶原蛋白诱导的RA小鼠模型注射重组IL-18,发现RA发病率和病变程度较对照组明显增高。发病小鼠关节出现明显的滑膜增生、细胞浸润和关节软骨的破坏,同时产生大量的IFN-γ、TNF-α、IL-6[25,26]。最近又有研究表明,IL-18基因敲除DBA/1小鼠关节炎的发病率和病情严重程度较对照组明显下降。组织学显示关节的炎症和破坏减轻。对于牛II型胶原蛋白诱导的关节炎,IL-18基因敲除小鼠脾细胞和淋巴结细胞特异性的增殖和前炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12的生成减少[27]。上述结果表明IL-18在RA的发病中起着重要的作用,拮抗IL-18将是治疗RA的一种有效措施。
IL-18与重症肝炎的肝损伤关系密切。早期研究表明,IL-18抗体可完全阻止P.acnes和LPS导致的小鼠严重肝损伤,使血清转氨酶GOT、GPT降低[2]。IL-18基因敲除小鼠则对LPS诱导的内毒素性休克的敏感性下降[28]。给LPS致敏的BALB/C小鼠注射LPS后,IL-18mRNA表达一直稳定。若在LPS之前先给予IL-18抗体,不仅可抑制IFN-γ和TNF-α水平的升高,还可抑制FasL的表达,从而阻止肝损伤。Tsuji等研究发现,BALB/C小鼠注射P.acnes后一周,肝脏有大量Mφ和淋巴细胞浸润,并形成肉芽肿。再次给予LPS,发现血清IL-18水平明显升高,随后谷丙转氨酶升高,出现大面积肝坏死。此外,LPS可诱导肝脏柯否氏细胞释放IL-18,IL-18增加NK细胞FasL的表达,从而通过Fas依赖的肝细胞凋亡引起肝损伤[29]。IL-18可通过诱导IFN-γ、TNF-α和FasL的表达参与内毒素所致的肝损伤。
胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM),是一种T细胞介导的器官特异性自身免疫疾病。Rothe等人报道,给予小鼠环磷酰胺可引起自身免疫性胰腺炎和糖尿病。RT-PCR证实IDDM的动物模型NOD小鼠胰腺内有IL-18mRNA表达。注射环磷酰胺后3天,IL-18mRNA表达快速升高6倍。此外IL-18的基因位于小鼠第9号染色体Idd2区内,而Idd2基因区与胰岛素依赖性糖尿病的易感性有关[30]。这些均提示IL-18异常表达与NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发展密切相关。目前认为IL-18很可能通过IFN-γ介导了IDDM的病理过程。IFN-γ可诱导胰腺β细胞表达Fas,从而与表达FasL的T细胞相结合,引起β细胞的凋亡[31]。此外,IFN-γ可诱导胰岛β细胞表达IFN-调节因子I,使可诱导一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达增加,而局部产生的NO可引起β细胞的机能障碍和破坏[32]。
发明内容
本发明涉及一种IL-18突变体多肽。更加具体地说,这些突变是取代,优先选择高度保守的氨基酸取代。所述肽中发生突变的残基选自Glu—121。在实施例中,Glu—121被氨基酸Arg取代。
另外,本发明提供了编码IL-18突变体多肽的DNA。此外,本发明还提供了一种含有此突变体多肽DNA的温控载体,该载体能够在合适的宿主细胞中由温度控制表达IL-18突变体多肽。
本发明涉及IL-18突变体或其活性片段、或突变蛋白质或其任何一种其它蛋白质,它们比野生型(IL-18WT)活性更低。具体地说,IL-18野生型的一个或多个氨基酸,可被其他氨基酸取代,或被除去,或者可加入一个或多个氨基酸,以产生一种可以和IL—18受体结合但是没有或有较低活性的IL—18突变体。被突变的氨基酸可以有多种,但这种取代最好是非保守性取代。
一种IL-18突变体多肽,所述多肽是对IL-18的高度保守的氨基酸残基上的突变,所述突变是取代、或插入、或缺失。
所述突变选自IL-18的loop7区域中Glu—121氨基酸残基。
Glu—121残基由带正电荷的氨基酸残基所取代,或由非极性氨基酸所取代。
其表达载体为一种温控型表达载体,所述载体含PR-PL启动子,蛋白的表达由温度控制。
所述的温控型表达载体,其表达蛋白不仅包括各种取代、插入或缺失型IL-18突变体多肽,也包括利用其表达野生型IL-18或其它白细胞介素。
IL-18突变体多肽的用途,可以单独用于或与其它药物组合用于治疗与IL-18过表达有关的各种疾病。
IL-18突变体多肽的具体制备方法是:(1)采用重叠延伸PCR法,用二对引物P1与P3、P2与P4进行前两轮PCR,分别得到IL-18突变体的5′片段和3′片段,将这两个片段经酚/氯仿抽提纯化后,共同作为模板,再加入引物P1、P2进行第三轮PCR,得到突变体的全长cDNA;用NdeI、SalI酶切得到的PCR产物,然后与同样酶切的温控载体pJW2连接;将连接产物转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,DNA序列测定正确者,即为所需要的IL-18突变体表达载体;(2)采用热诱导技术诱导IL-18突变体表达载体表达IL-18突变体多肽,(3)采用的纯化为Sephadex G-75凝胶过滤一步纯化。
本发明的积极效果是:热诱导技术具有经济有效,易于操作等优点并且具备工业生产的基础。温控载体的独特酶切位点的设计使表达产物更接近于野生型的IL-18,突变体多肽复性后具有较高的生物学活性。(3)采用Sephadex G-75凝胶过滤一步纯化,简单有效。
附图说明
图1是IL-18突变体IL-18E121R的表达与纯化;
图中:1,标准蛋白;2,未诱导表达的菌体蛋白;3,诱导表达的菌体蛋白;4,超声后上清;5,超声后沉淀;6,尿素洗涤后沉淀;7,8M尿素溶解的沉淀;8,Sephadex G-75柱纯化产物。
图2是IL-18突变体IL-18E121R的IFN-γ诱生活性测定;
图3是IL-18突变体IL-18E121R及IL—18BP治疗类风湿性关节炎模型小鼠血清IL—6水平测定。
具体实施方式
以下结合优选实施例对本发明进一步叙述,并不构成对本发明范围的限制。也就是说,凡针对此位点的取代均在本专利的范围。使用本发明治疗由IL-18造成损害的疾病,包括类风湿性关节炎、肝损伤、胰岛素依赖性糖尿病等等也均在本专利的范围。
实施例1IL-18突变体多肽IL-18E121R的制备
(一)IL-18突变体表达载体的构建
IL-18与IL-1家族在结构上相似,但功能并不相同。将7个种系(人、大鼠、小鼠、马、牛、猪、狗)的IL-18与IL-1的氨基酸序列做了详尽比较,认为IL-18与IL-1同源性高的序列提示两者相同的特性,而同源性低的一些序列则有可能与IL-18特有的功能相关,尤其是在各种系IL-18中高度保守却不同于IL-1的位点。因此,在IL-18的loop7区域中选择Glu121进行突变。除狗IL-18以外,该位点在IL-18的6个种系中高度保守,而且该位点带有负电荷,可能以离子键与IL-18受体结合。我们将Glu121突变为Arg,改变该位点的电荷性状,观察该突变体对IL-18功能的影响。
根据已知的hIL-18序列,设计了4条引物:
P1:5′-GAGATATACATATGTACTTTGGCAAAC-3′
P2:5′-TTGCGTCGACAAGCTTTAGTCTTC-3′
划线处CATATG为NdeI酶切位点,GTCGAC为SalI酶切位点,加框处为引物中设计的突变位点。
采用重叠延伸PCR法,先由引物P1与P3、P2与P4进行前两轮PCR,分别得到突变体的5′片段和3′片段,将这两个片段经酚/氯仿抽提纯化后,加入同一反应体系,共同作为模板,再加入引物P1、P2进行第三轮PCR,得到突变体E121R的全长cDNA。用NdeI、SalI酶切得到的PCR产物,用低熔点琼脂糖凝胶回收,然后与同样酶切的载体pJW2连接。将连接产物转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,先进行酶切鉴定,最后进行DNA序列测定。
(二)重组IL-18突变体质粒的提取
利用pJW2中的抗氨苄青基因,筛选出阳性菌落。挑取单克隆菌落,在LB培养基中小量(3~5ml)扩增,按试剂盒说明书提取质粒。先离心收集细菌沉淀,加入250μl细胞悬浮液(50nmol/L Tris-HCl,PH7.5,10mmol/LEDTA,100g/mL RNase A)将沉淀悬浮,然后加入250μl细胞裂解液(0.2mol/LNaOH,1%SDS),颠倒混匀4~5次,放置1~5min使悬浮液变澄清后,加入10μl碱性蛋白酶,轻轻混合,静置5min,再加入350μl中和液(4.09mmol/L盐酸胍,0.759mol/L醋酸钾,2.12mol/L冰醋酸,PH4.2),混匀后室温14000g,离心10min。将上清转移至一特定收集管中,加入750μl洗脱液(60%乙醇,60mmol/L醋酸钾,10mmol/L Tris-HCl,PH7.5),室温14000g,离心1min,弃上清,再加入250μl洗脱液,室温14000g,离心2min,然后将收集管套入一新的1.5ml EP管中,加入适量无核酸酶水,14000g,离心1min,-20℃保存质粒。
(三)IL-18突变体的表达、纯化与复性
将含IL-18突变体cDNA重组质粒的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中32℃振荡培养过夜,次日以1∶50稀释到同样培养基中,继续在32℃摇床培养至对数生长中期,培养液光密度A600为0.5~0.6时,迅速升温至42℃继续培养4~5h。离心收集菌体,采用SDS-PAGE分析表达产物(分离胶浓度为15%,浓缩胶浓度为5%)。结果可见IL-18突变体,占菌体总蛋白的18%(图1)。本技术所采用的热诱导表达IL-18,优点是节约成本,经济有效,易于操作,并且为大规模工业生产打下了良好的基础。另一方面,温控载体的独特酶切位点的设计使表达产物更加接近于野生型的hIL-18。
包涵体的分离、洗涤及溶解:
以0.02mol/LpH6.8的磷酸缓冲液悬浮菌体,于冰浴中超声破碎3次,每次1min,10000g离心15min收集沉淀。以2mol/L尿素洗涤2次,每次2h,10000g离心15min收集沉淀。用8mol/L尿素室温溶解沉淀,10000g20min离心收集上清。
Sephadex G-75凝胶过滤:
8mol/L尿素溶解的上清经超滤浓缩后,用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)、8mol/L尿素、5mmol/L-巯基乙醇平衡的Sephadex G-75柱(2.5cm×95cm)纯化。上样后经上述溶液洗脱,流速为20ml/h,收集各组分.用SDS-PAGE分析纯化产物。结果显示蛋白纯度达到了90%以上(见图1)。
纯化产物的复性:
纯化产物的复性采用逐步稀释与透析相结合的方法,重组蛋白在室温下倍比稀释至终浓度为0.1mg/ml,然后在4℃复性液(PH7.4的PBS)中透析过夜,除去剩余的变性剂。
(四)IL-18突变体的活性测定
新鲜正常人全血10ml,加入等体积生理盐水稀释后,分别加入2个内有4ml淋巴细胞分离液的离心管中,2000rpm离心30min,然后将淋巴细胞转至一新离心管中,生理盐水洗涤后,离心收集细胞。用RPMI-1640培养液悬浮后细胞计数,以5×106细胞/ml接种到96孔板中,加入10%FCS、0.5%的双抗(青霉素+链霉素)以及终浓度为0.2mg/L的ConA。然后每孔分别加入100nmol/L的野生型或突变的重组hIL-18蛋白,于37℃,5%CO2培养箱中孵育48h,收集细胞上清,测定生物学活性。
双抗体夹心ELISA法检测IFN-γ含量:
在包被有抗人IFN-γ单抗的酶标条中,每孔加入50μl细胞上清和等体积的生物素化检测抗体,室温(20℃)孵育120min,然后加入100μl辣根过氧化物酶标记的亲和素,室温孵育30min,使生物素与亲和素充分结合,再加入底物显色,5~15min后加入终止液,用酶标仪测OD450nm值。以IFN-γ标准品做平行实验,绘制标准曲线,计算样品中IFN-γ的含量。以复性产物诱导人PBMC产生IFN-γ的能力为指标,测定hIL-18突变蛋白的生物学活性,结果显示,野生型IL-18可以诱导人PBMC产生IFN-γ,加入IL-18E121R几乎没有诱生IFN-γ的能力(见图2)。
实施例2 IL-18突变体多肽E121R治疗小鼠关节炎
(一)胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型的建立
用II型天然牛胶原免疫接种DBA/1小鼠诱导CIA,免疫后30天起,逐日检查小鼠的发病情况。发病后10天处死所有小鼠,用精密卡尺对出现疾病症状的第一个脚爪测定其肿胀程度并检测IL-6水平。
(二)IL-18突变体治疗关节炎
在首次出现疾病临床症状时开始对II型天然牛胶原免疫的DBA/1小鼠进行治疗。以2种不同浓度1、0.1mg/kg的IL-18E121R每日腹腔内注射,共10天。对照组小鼠分2组,一组注射IL—18结合蛋白(IL—18BP)作为治疗对照,另一组注射同样体积的生理盐水(0.9℅NaCl)作为阴性对照。
结果显示,用IL—18结合蛋白(IL—18BP)作为IL—18拮抗剂治疗动物关节炎可以在一定程度上抑制关节的肿胀,而给予同样剂量的IL-18突变体IL-18E121R(1mg/kg)则可以更加有效地抑制关节的肿胀程度,IL-18E121R的治疗效果要比同剂量的IL—18BP更加有效(见表1)。IL-18E121R治疗后还可以使血清IL—6水平降低(见图3)。IL—6是一种炎症标志,这些结果表明用IL-18E121R治疗患病小鼠可以减少动物炎症反应。而我们构建的IL-18E121R具有比IL—18BP更强的治疗效果,因此IL-18E121R突变体有望成为一种比IL—18BP更有效的治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的药物。
表1IL-18E121R治疗关节炎的效果
治疗组 | 肿胀程度(单位mm) |
阴性对照组生理盐水 | 3.96+1.08 |
IL-18BP1mg/kg | 2.23+0.40 |
IL-18E121R0.1mg/kg | 3.08+0.70 |
IL-18E121R1mg/kg | 1.46+0.60 |
图1是IL-18突变体IL-18E121R的表达与纯化;
图中:1,标准蛋白;2,未诱导表达的菌体蛋白;3,诱导表达的菌体蛋白;4,超声后上清;5,超声后沉淀;6,尿素洗涤后沉淀;7,8M尿素溶解的沉淀;8,Sephadex G-75柱纯化产物。
图2是IL-18突变体IL-18E121R的IFN-γ诱生活性测定;
图3是IL-18突变体IL-18E121R及IL—18BP治疗类风湿性关节炎模型小鼠血清IL—6水平测定。
Claims (3)
1.一种IL-18突变体多肽,其特征在于,多肽是对IL-18的高度保守的谷氨酸残基上的突变,突变选自IL-18的loop7区域中Glu-121氨基酸残基,Glu-121残基由精氨酸所取代。
2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于,其表达载体为一种温控型表达载体,所述载体含PR-PL启动子,蛋白的表达由温度控制。
3.一种IL-18突变体多肽在制备治疗关节炎的药物中的用途,所述的IL-18突变体多肽是对IL-18的高度保守的谷氨酸残基上的突变,突变选自IL-18的loop7区域中Glu-121氨基酸残基,Glu-121残基由精氨酸所取代。
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张智清等.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报6 2.1990,6(2),111-116. |
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