JP2022130427A - 改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】大規模に容易な製造プロセスで生産することができる改変されたＩＬ－７タンパク質を提供する。【解決手段】次の構造：Ａ－ＩＬ－７を有する改変されたインターロイキン－７であって、式中、Ａは、グリシン、メチオニン－メチオニン、グリシン－グリシン、メチオニン－グリシン、グリシン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－グリシン、メチオニン－グリシン－メチオニン、グリシン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－グリシン－グリシン、グリシン－メチオニン－グリシン、グリシン－グリシン－メチオニン、グリシン－グリシン－グリシン、及びメチオニン－メチオニン－メチオニン－メチオニンからなる群から選択されるオリゴペプチドであり、ＩＬ－７はインターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドである、改変されたインターロイキン－７である。【選択図】図１

Description

本発明は、改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用に関する。
インターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチド（以下、「ＩＬ－７」とする）は、Ｂ細胞およびＴ細胞により媒介される免疫応答を促進することができる免疫賦活性サイトカインであり、特にＩＬ－７は適応免疫系で重要な役割を果たしている。ＩＬ－７は大部分が骨髄および胸腺において間質細胞により分泌されるが、ケラチノサイト、樹状細胞、肝細胞、神経細胞、および上皮細胞によっても産生される（Heufler C et al., 1993, J. Exp. Med. 178 (3): 1109-14; Kroncke R et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26 (10): 2541- 4: Sawa Y et al., 2009, Immunity 30 (3): 447-57; Watanabe M et al., 1995, J. Clin. Invest. 95 (6): 2945-53）。
具体的には、ＩＬ－７はＴ細胞およびＢ細胞の生存および分化、リンパ系細胞の生存、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性の刺激、等を介して免疫機能を活性化し、特にＩＬ－７はＴ細胞およびＢ細胞の発達に重要である。ＩＬ－７は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合し、プレ－プロ－Ｂ細胞増殖刺激因子およびＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再配列のための補因子として機能する（Muegge K, 1993, Science 261 (5117): 93-5）。
さらに、ＩＬ－７はリンパ節組織誘導（ＬＴｉ）細胞を介してリンパ節の発達を調節し、ナイーブＴ細胞またはメモリーＴ細胞の生存および分裂を促進する。最近報告されたウイルス感染に関する臨床結果によると、ＩＬ－７はナイーブＴ細胞またはメモリーＴ細胞を維持する（Amila Patel, J Antimicrob Chemother 2010）。さらに、ＩＬ－７はＩＬ－２およびインターフェロン－γの分泌を増強することによってヒトにおいて免疫応答を高める。
すなわち、ＩＬ－７はＴ細胞、Ｂ細胞、および他の免疫細胞の生存、および増殖を促進するサイトカインであり、様々な病気、たとえばウイルス感染、癌、および免疫系傷害に適用可能な免疫治療薬として優秀な候補材料である。最近、悪性腫瘍およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関するいくつかの臨床研究で、人体における免疫の増加に対するＩＬ－７の効果が確認された（Fry TJ et al., 2002, Blood 99 (11): 3892-904; Muegge K et al., 1993, Science 261 (5117): 93-5; Rosenberg SA et al., J. Immunother. 29 (3): 313-9）。さらに、ＩＬ－７は、同種幹細胞の移植後の免疫回復（Snyder KM, 2006, Leuk. Lymphoma 47 (7): 1222-8）およびリンパ球減少症の治療にも使用される。
癌は生命を脅かす疾患である。癌細胞は、免疫細胞により認識されることなく成長することができるように免疫系を阻害することができる環境を提供する。癌患者は主として抗癌治療（たとえば化学療法、放射線療法）のためにＴ細胞が低減する免疫低下を示すか、または癌診断時に低減した数を示した。さらに、細胞障害性のＴリンパ球、エフェクターＴ細胞、およびマクロファージが癌組織内に蓄積するのに、癌細胞を効果的に排除することができない。さらに、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞の機能を阻害する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、等が癌組織内に存在するので、癌細胞の増殖を効果的に阻害することができない。
これらの状況の下で、免疫療法が最近脚光を浴びている。免疫療法は、現在癌治療に使用されている化学療法または放射線療法と組み合わせて使用することができる。特に、ＩＬ－７の利用は、Ｔ細胞の数が減少するリンパ球減少症を克服することにより免疫機能を増強するための代替案と考えられている。
慢性感染は、ウイルスを認識するＴ細胞の枯渇を誘発することにより持続させられる。たとえば、ウイルス、たとえばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染させることにより、初期の免疫応答が強く誘発されるが、ウイルス特異的Ｔ細胞の機能は時間と共に徐々に低下する。特に、ウイルス特異的Ｔ細胞の機能はＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＬ－１０受容体、ＴＧＦ－β受容体、等によって低減する。
しかし、ＩＬ－７は、ウイルス特異的Ｔ細胞の機能の損失を回復させるか、または免疫阻害シグナル系を克服することによりＴ細胞の機能の低下を阻害する（Pellegrini M, 2009 May; 15 (5): 528-36）。さらに、ＩＬ－７は、Ｔ細胞の増殖を誘発し、Ｂｃｌ－２の発現を増大させることによりＴ細胞の増殖および生存を促進する。
さらに、ＩＬ－７はサイトカインを産生し、サイトカインシグナル伝達を阻害するためのメディエーターであるＳＯＣＳ３の発現を阻害することによりサイトカインの機能を保持するのに役立つ。さらに、ＩＬ－７はＩＬ－２２の産生に起因する免疫病理学を低減させる（Som G. Nanjappa, Blood. 2011; 117 (19): 5123-5132, Marc Pellegrini, Cell 144, 601-613, February 18, 2011）。
しかし、医薬としての利用目的で組換えＩＬ－７を生産する場合、一般的な組換えタンパク質と比較して、不純物、ＩＬ－７分解量の増加という問題があり、大規模な生産を容易に達成することができない。かつて、Cytheris Inc.は、特別なジスルフィド結合を有するコンフォーマーである合成ＩＬ－７を開発した（Ｃｙｓ：１－４；２－５；３－６）（米国特許第７，５８５，９４７号）。しかし、合成ＩＬ－７の生産には複雑な変性プロセスが必要となるので、製造するプロセスは容易ではない。したがって、大規模に容易な製造プロセスで生産することができる改変されたＩＬ－７タンパク質を開発することには強いニーズがある。
これに関して、容易な製造プロセスにより大規模に生産することができる改変されたＩＬ－７が製造され、これによって本発明が完成された。
技術課題
本発明の１つの目的は改変されたＩＬ－７を提供することである。
本発明の別の目的は改変されたＩＬ－７を含む融合タンパク質を提供することである。
本発明のさらなる目的は、改変されたＩＬ－７またはそれを含む融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞、ならびに改変されたＩＬ－７またはそれを含む融合タンパク質を調製方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、改変されたＩＬ－７またはそれを含む融合タンパク質を含む医薬組成物、およびそれらの使用を提供する。
課題の解決
上記目的を達成するために、本発明は、１～１０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドが連結した改変されたＩＬ－７を提供する。
さらに、本発明は、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチドを含む第１のドメイン；メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメイン；およびインターロイキン－７融合タンパク質の半減期を延ばす第３のドメインを含む、ＩＬ－７融合タンパク質を提供する。
さらに、本発明は、改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含む発現ベクター、および発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに、本発明は、核酸、発現ベクター、および宿主細胞を用いて改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を生産または調製する方法を提供する。
さらに、本発明は、改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を用いて疾患を予防または治療する方法を提供する。
発明の有利な効果
本発明の改変されたＩＬ－７は変性プロセスなしに高収率で生産される。したがって、本発明の改変されたＩＬ－７またはそれを含む融合タンパク質は様々な医薬分野に適用可能である。
図１は、本発明の改変されたＩＬ－７またはそれを含む融合タンパク質を生産するための遺伝子構築物の模式図である。 図２は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質の一日当たりの１細胞単位生産性（ｐｇ／細胞／日、ｐ／ｃ／ｄ）の評価の結果を示し、図２Ａは培地中のＩＬ－７－ｈｙＦｃの量を示し、図２Ｂは培地中の培養ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃの量を示す。 図３は、様々な濃度の塩化ナトリウムに従ってＩＬ－７－ｈｙＦｃとそれを含むＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃとの間の安定性を比較した結果を示す。 図４は、様々な濃度の塩化ナトリウムに従ってＩＬ－７－ｈｙＦｃとＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃとの間のネイティブ－ＰＡＧＥを比較した結果を示す。 図５は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質の相対的生産性（図５Ａ）および純度（図５Ｂ）をそれぞれ比較した結果を示す。 図６は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質をＳＤラットモデルに皮下投与した後の時間に従って血清中薬物レベルを図示したグラフを示す。 図７は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質をＳＤラットモデルに皮下投与した後各々のタンパク質投与に従って抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生レベルを図示した結果を示す。 図８は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質をＳＤラットモデルに皮下投与した後時間に従って白血球（ＷＢＣ）の数を増加させる効果を図示したグラフを示す。 図９は、調製されたＩＬ－７融合タンパク質と標準の材料との間の活性を比較した結果を示す。 図１０は、致死性のインフルエンザ様疾患モデルにおける、調製されたＩＬ－７融合タンパク質の投与に従って体重の変化（図１０Ａ）および生存率の変化（図１０Ｂ）を図示したグラフを示す。 図１１は、癌細胞移植疾患モデルにおける、調製されたＩＬ－７融合タンパク質の投与に従って抗癌効果の形態学的観察の画像を示す。
本発明は次の構造：
Ａ－ＩＬ－７；
を有する改変されたＩＬ－７であって、
式中、Ａは１～１０個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、ＩＬ－７はインターロイキン７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドである、改変されたＩＬ－７を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチド」とは、ＩＬ－７と同じまたは類似の配列および活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本発明で他に規定されない限り、この用語は、ＩＬ－７融合タンパク質の第１のドメインと互換性がある概念として使用することができる。
ＩＬ－７は配列番号１～６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに、ＩＬ－７は、配列番号１～６の配列に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の配列同一性を有していてもよい。
ＩＬ－７はＩＬ－７タンパク質またはその断片を含んでいてもよい。特に、ＩＬ－７はヒト、ラット、マウス、サル、ウシ、またはヒツジに由来するものであってもよい。
具体的には、ヒトＩＬ－７は、配列番号１（Genbank受託番号P13232）で表されるアミノ酸配列を有していてもよく；ラットＩＬ－７は配列番号２（Genbank受託番号P56478）で表されるアミノ酸配列を有していてもよく；マウスＩＬ－７は配列番号３（Genbank受託番号P10168）で表されるアミノ酸配列を有していてもよく；サルＩＬ－７は配列番号４（Genbank受託番号NP_001279008）で表されるアミノ酸配列を有していてもよく；ウシＩＬ－７は配列番号５（Genbank受託番号P26895）で表されるアミノ酸配列を有していてもよく、ヒツジＩＬ－７は配列番号６（Genbank受託番号Q28540）で表されるアミノ酸配列を有していてもよい。
さらに、ＩＬ－７タンパク質またはその断片は様々に改変されたタンパク質またはペプチド、すなわち、変異体を含んでいてもよい。上記改変は、ＩＬ－７の機能を変更することなく少なくとも１つのタンパク質の野生型ＩＬ－７への置換、欠失、または付加の方法によって行ってもよい。これらの様々なタンパク質またはペプチドは野生型タンパク質に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有していてもよい。
慣習的に、野生型アミノ酸残基はアラニンで置換されるが、置換は全体のタンパク質電荷、すなわち、極性または疎水性に影響を及ぼさないかまたは弱い効果を与える保存アミノ酸置換で行われてもよい。
保存アミノ酸置換の場合、下記表１を参照してもよい。
Figure 2022130427000002
各々のアミノ酸に対して、追加の保存置換はそのアミノ酸の「ホモログ」を含む。特に、「ホモログ」とは、アミノ酸の側鎖のベータ位の側鎖にメチレン基（ＣＨ２）が挿入されたアミノ酸を意味する。「ホモログ」の例はホモフェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモセリン、等を含んでいてもよいが、それらに限定されることはない。
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－７タンパク質」は、「ＩＬ－７タンパク質およびその断片」を含む概念として使用してもよい。他に規定されない限り、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は互換性がある概念として使用してもよい。
改変されたＩＬ－７の構造において、ＡはＩＬ－７のＮ末端に直接連結していても、またはリンカーを介して連結していてもよく、他に規定されない限り、この用語はＩＬ－７融合タンパク質の第２のドメインと互換性があることができる概念として使用してもよい。
本発明で、ＡはＩＬ－７のＮ末端に連結していてもよい。Ａは１～１０個のアミノ酸を含むことで特徴付けられ、そのアミノ酸はメチオニン、グリシン、およびこれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
メチオニンおよびグリシンはヒトの体内で免疫応答を誘発しない。大腸菌（E. coli）で産生されたタンパク質治療薬は常にＮ末端にメチオニンを含むが、不利な反応は報告されていない。また、グリシンもＧＳリンカーとして広く使用されており、Dulaglutideとして市販の製品で免疫応答を誘発しない（Cell Biophys. 1993 Jan-Jun; 22(103):189-224）。
例示的な態様において、Ａはメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される１～１０個のアミノ酸を含むオリゴペプチド、好ましくは１～５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドであってもよい。たとえば、Ａはメチオニン、グリシン、メチオニン－メチオニン、グリシン－グリシン、メチオニン－グリシン、グリシン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－グリシン、メチオニン－グリシン－メチオニン、グリシン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－グリシン－グリシン、グリシン－メチオニン－グリシン、グリシン－グリシン－メチオニン、およびグリシン－グリシン－グリシンからなる群から選択されるいずれか１つのＮ末端配列を有していてもよい。具体的には、Ａはメチオニン、グリシン、メチオニン－メチオニン、グリシン－グリシン、メチオニン－グリシン、グリシン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－グリシン、メチオニン－グリシン－メチオニン、グリシン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－グリシン－グリシン、グリシン－メチオニン－グリシン、グリシン－グリシン－メチオニン、およびグリシン－グリシン－グリシンからなる群から選択されるアミノ酸配列により表されていてもよい。
本発明の別の側面は、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチドを含む第１のドメイン；メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメイン；およびインターロイキン－７融合タンパク質の半減期を延ばす第３のドメインを含む、ＩＬ－７融合タンパク質を提供する。
第３のドメインは第１のドメインまたは第２のドメインのＮ末端またはＣ末端に連結していてもよい。さらに、第１のドメインおよび第２のドメインを含むＩＬ－７は第３のドメインの両末端に連結していてもよい。
第３のドメインはインビボ半減期を増大するための融合パートナーであってもよく、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、長鎖非構造化親水性アミノ酸配列（long unstructured hydrophilic sequence）（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つを含んでいてもよい。
第３のドメインが免疫グロブリンのＦｃ領域であるときには、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域であってもよい。特に、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は、Ｆｃ受容体および／または補体との結合親和性の変更に起因して抗体依存性の細胞障害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性の細胞障害性（ＣＤＣ）が弱められたものであってもよい。改変された免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびこれらの組合せからなる群から選択されてもよい。具体的には、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域はＮ末端からＣ末端にかけてヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。特に、ヒンジ領域はヒトＩｇＤヒンジ領域を含んでいてもよく；ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＤのアミノ酸残基の一部およびヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基の一部を含んでいてもよく；ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の一部を含んでいてもよい。
さらに、２つの融合タンパク質が二量体を形成していてもよく、たとえば、第３のドメインがＦｃ領域である場合、Ｆｃ領域が互いに結合し、これにより二量体を形成してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」、または「Ｆｃ」とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが重鎖および軽鎖のその可変領域ならびに軽鎖定常領域（ＣＬ１）を含まないタンパク質をいい、さらに重鎖定常領域のヒンジ領域を含む。本発明において、ハイブリッドＦｃまたはそのハイブリッドＦｃ断片は「ｈＦｃ」または「ｈｙＦｃ」と呼んでもよい。
さらに、本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域変異体」とは、Ｆｃ領域内のアミノ酸の一部を置換するかまたは異なる種類のＦｃ領域を組み合わせることによって調製されたものをいう。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジ領域で切り取られることを防止することができる。具体的に、配列番号９の１４４番目のアミノ酸および／または１４５番目のアミノ酸が改変されてもよい。好ましくは、変異体は、１４４番目のアミノ酸ＫがＧまたはＳで置換されたもの、および１４５番目のアミノ酸ＥがＧまたはＳで置換されたものであってもよい。
さらに、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域またはＦｃ領域変異体は次式（Ｉ）：
［式（Ｉ）］
Ｎ’－（Ｚ１）ｐ－Ｙ－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｃ’
で表されていてもよい。
上記式（Ｉ）において、
Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり；
ｐは０または１の整数であり；
Ｚ１は、配列番号７の９０～９８位のアミノ酸残基のうちの、９８位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～９個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｙは、配列番号７の９９～１６２位のアミノ酸残基のうちの、１６２位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～６４個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｚ２は、配列番号７の１６３～１９９位のアミノ酸残基のうちの、１６３位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって４～３７個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｚ３は、配列番号８の１１５～２２０位のアミノ酸残基のうちの、２２０位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって７１～１０６個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；および
Ｚ４は、配列番号８の２２１～３２７位のアミノ酸残基のうちの、２２１位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって８０～１０７個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。
さらに、本発明のＦｃ断片は天然の糖鎖、天然の形態と比較して増大した糖鎖、もしくは減少した糖鎖を有する形態であってもよいし、または脱グリコシル化された形態であってもよい。免疫グロブリンＦｃ糖鎖は慣用の方法、たとえば化学的な方法、酵素的な方法、および微生物を用いる遺伝子組換え法によって改変されていてもよい。Ｆｃ断片から糖鎖を除去すると、第１補体成分Ｃ１のＣ１ｑ部分に対する結合親和性が急激に低下し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの低下または損失が起こり、それによりインビボで不必要な免疫応答を誘発しない。これに関して、脱グリコシル化または非グリコシル化（aglycosylated）形態の免疫グロブリンＦｃ領域は薬物担体として本発明の目的により適していてもよい。本明細書で使用される場合、用語「脱グリコシル化」とは、Ｆｃ断片から糖が酵素的に除去されているＦｃ領域を意味する。さらに、用語「非グリコシル化（aglycosylation）」は、Ｆｃ断片が原核生物、好ましくは大腸菌（E. coli）によりグリコシル化されない形態で産生されることを意味する。
さらに、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は配列番号９（ｈｙＦｃ）、配列番号１０（ｈｙＦｃＭ１）、配列番号１１（ｈｙＦｃＭ２）、配列番号１２（ｈｙＦｃＭ３）、または配列番号１３（ｈｙＦｃＭ４）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらに、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は配列番号１４（非溶解性マウスＦｃ）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本発明によると、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は米国特許第７，８６７，４９１号に記載されているものであってもよく、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域の生産は米国特許第７，８６７，４９１号の開示を参照して行ってもよい。
第２のドメインは第１のドメインのＮ末端に直接連結してもよい、またはリンカーによって連結してもよい。具体的には、その結果は第２のドメイン－第１のドメインまたは第２のドメイン－リンカー－第１のドメインの形態であってもよい。
第３のドメインは第１のドメインもしくは第２のドメインに直接連結してもよい、またはリンカーによって連結してもよい。具体的には、その結果は第２のドメイン－第１のドメイン－第３のドメイン、第３のドメイン－第２のドメイン－第１のドメイン、第２のドメイン－第１のドメイン－リンカー－第３のドメイン、第３のドメイン－リンカー－第２のドメイン－第１のドメイン、第２のドメイン－リンカー－第１のドメイン－リンカー－第３のドメイン、または第３のドメイン－リンカー－第２のドメイン－第１のドメインの形態であってもよい。
リンカーがペプチドリンカーである場合、接続はいかなる連結領域で起こってもよい。これらは、当技術分野で公知の架橋剤を用いてカップリングしてもよい。架橋剤の例はN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、および4-アジドサリチル酸；たとえばジスクシンイミジルエステル、たとえば3,3’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むイミドエステル、ならびに二官能性マレイミド、たとえばビス-N-マレイミド-1,8-オクタンを含んでいてもよいが、それらに限定されることはない。
さらに、リンカーはアルブミンリンカーまたはペプチドリンカーであってもよい。ペプチドリンカーはＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる１０～２０個のアミノ酸残基のペプチドであってもよい。
リンカーが化学結合からなる群から選択されるもので形成される場合、化学結合はジスルフィド結合、ジアミン結合、スルフィド－アミン結合、カルボキシ－アミン結合、エステル結合、および共有結合であってもよい。
例示的な態様において、本発明の改変されたＩＬ－７は、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチドおよび１～１０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを含むＡ－ＩＬ－７の構造を有していてもよい。
具体的な態様において、改変されたＩＬ－７は配列番号１５～２０からなるアミノ酸配列を有していてもよい。さらに、改変されたＩＬ－７は配列番号１５～２０からなるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を有していてもよい。
別の例示的な態様において、本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質は、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチドを含む第１のドメイン；メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメイン；および、第１のドメインのＣ末端にカップリングされた、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域である第３のドメインを含む。
ＩＬ－７融合タンパク質は配列番号２１～２５からなるアミノ酸配列を有していてもよい。さらに、ＩＬ－７融合タンパク質は配列番号２１～２５からなるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を有していてもよい。
本発明の別の側面は、改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
核酸分子は配列番号１５～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものであってもよい。核酸分子は配列番号２９～３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
核酸分子はシグナル配列またはリーダー配列をさらに含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「シグナル配列」は、生物学的に活性な分子薬物および融合タンパク質の分泌を指令する断片を意味し、宿主細胞中で翻訳された後に切り取られる。本発明のシグナル配列は小胞体（ＥＲ）膜を貫通するタンパク質の運動を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明の有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、たとえば、抗体１４．１８（Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202）、抗体重鎖シグナル配列、たとえば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683）、および当技術分野で公知の他のシグナル配列（たとえば、Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164参照）が含まれる。
シグナルペプチドの特性は当技術分野で周知であり、慣習的にシグナルペプチドは１６～３０個のアミノ酸を有しているが、それより多いかまたは少ない数のアミノ酸残基を含んでいてもよい。慣用のシグナルペプチドは塩基性のＮ末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域の３つの領域からなる。
中央の疎水性領域は、未成熟のポリペプチドの移行中膜の脂質二重層を貫通してシグナル配列を固定する４～１２個の疎水性残基を含む。開始後、シグナル配列は、ＥＲの内腔内でシグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素により切り取られることが多い。特に、シグナル配列は組織プラスミノーゲン活性化（ｔＰａ）の分泌性シグナル配列、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤ）のシグナル配列、または成長ホルモンであってもよい。好ましくは、哺乳動物、等を含む高等真核細胞で使用される分泌性シグナル配列を使用してもよい。さらに、分泌性のシグナル配列として、野生型のＩＬ－７に含まれるシグナル配列を使用してもよいし、または宿主細胞中の発現頻度が高いコドンで置換した後に使用してもよい。
本発明の別の側面は改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む、発現ベクターを提供する。
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、組み換えられる宿主細胞中に導入され、宿主細胞のゲノム内に挿入されるか、またはエピソームとして自発的に複製することができるヌクレオチド配列を含む核酸手段として理解される。ベクターは直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、およびこれらのアナログを含んでいてもよい。ウイルスベクターの例はレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含んでいてもよいが、これらに限定されることはない。
本明細書で使用される場合、標的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳、および融合タンパク質産物またはその断片の分泌を意味すると理解される。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターを導入することができる原核細胞および真核細胞を意味する。本明細書で使用される場合、用語「形質導入」、「形質転換」、および「トランスフェクト」とは、当技術分野で公知の技術を用いる細胞内への核酸（たとえば、ベクター）の導入を意味する。
本明細書で使用される場合、標的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物または抗体もしくはその抗体断片の分泌を意味すると理解される。
有用な発現ベクターはＲｃＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad）またはその変異体であってもよい。発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の連続的な転写を促進するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および転写後のＲＮＡの安定状態を増大するウシ成長ホルモンのポリアデニル化信号配列を含んでいてもよい。本発明の代表的な態様において、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの改変された形態であるｐＡＤ１５である。
別の側面において、本発明は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明のＤＮＡ配列の形質導入またはトランスフェクションによる標的タンパク質の発現および／または分泌に適当な宿主細胞を使用することができる。
本発明で使用するのに適当な宿主細胞の例は不死化ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊水由来細胞（ＣａｐＴ細胞）またはＣＯＳ細胞を含んでいてもよい。
さらに別の側面において、本発明は、発現ベクターにより形質転換された細胞を培養する工程；改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７を含む融合タンパク質を、培養プロセスで得られた培養物または細胞から収集する工程を含む、タンパク質を生産する方法を提供する。
改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７を含む融合タンパク質は、培地または細胞抽出物から精製してもよい。たとえば、組換えタンパク質が分泌された培地の上清を得た後、上清を商業市場で入手可能なタンパク質濃縮フィルター、たとえば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過装置で濃縮してもよい。その後、濃縮物を当技術分野で公知の方法で精製してもよい。たとえば、精製はプロテインＡにカップリングされたマトリックスを用いて行ってもよい。
さらに別の側面において、本発明は、メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有するポリペプチドのＮ末端に連結することを含む、改変されたＩＬ－７を調製する方法を提供する。
上記調製方法は異種の配列からなるポリペプチドを連結する工程をさらに含んでいてもよく、この方法によりＩＬ－７融合タンパク質を調製することができる。特に、異種の配列からなるポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
さらに別の側面において、本発明は、メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＩＬ－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結することにより、連結したポリヌクレオチドを調製し；連結したポリヌクレオチドを発現させて改変されたＩＬ－７タンパク質を収集することを含む、改変されたＩＬ－７を調製する方法を提供する。
上記調製方法は異種の配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを連結する工程をさらに含んでいてもよく、この方法によってＩＬ－７融合タンパク質を調製することができる。特に、異種の配列からなるポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
さらに別の側面において、本発明は、改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を含有する、疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質は、ナイーブもしくは前から存在するＴ細胞または移植されたＴ細胞の拡大または生存を促進するか、またはインビトロで単離されたＴ細胞凝集体を増殖させるために投与してもよい。
疾患は慢性肝炎、癌、または感染症であってもよい。癌は頭頸部癌または子宮頸癌であってもよく、慢性肝炎はＢ型肝炎またはＣ型肝炎であってもよい。さらに、感染症はウイルス感染であってもよく、ウイルスはインフルエンザウイルス、ＣＭＶ、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ウエストナイル熱ウイルス、およびデングウイルスからなる群から選択されてもよい。さらに、疾患はリンパ球減少症（lymphocytopenia）（リンパ球減少症（lymphopenia））またはリンパ球、殊にＴ細胞の少ない数によって引き起こされるあらゆる症状、疾患、および症候群であってもよい。
本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は患者への送達に適したいかなる非毒性の材料であってもよい。担体は蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、または不活性な固体であってもよい。さらに、あらゆる薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）が含有されてもよい。
さらに、本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を含有する医薬組成物は、様々な方法で対象に投与されてもよい。たとえば、組成物は非経口的に、たとえば、皮下に、筋肉内に、または静脈内に投与されてもよい。組成物は慣用の滅菌方法で滅菌してもよい。組成物は生理学的な条件の調節に必要な薬学的に許容される補助材およびアジュバント、たとえばｐＨ調節、毒性調節剤、およびこれらのアナログを含有していてもよい。具体的な例は、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含んでいてもよい。製剤に含ませる融合タンパク質の濃度は広く変化させてもよい。たとえば、融合タンパク質の濃度は重量に応じて約０．５％未満、一般にまたは少なくとも約１％から多くとも約１５％～２０％であってもよい。濃度は選択された特定の投与法、液量、粘度、等に基づいて選択されてもよい。
さらに別の側面において、本発明は、本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を活性成分として含有する組成物を投与することによって疾患を予防または治療する方法を提供する。
この方法は、治療上有効な量の本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を、それを必要とし、標的の疾患と直接関連するかまたは関連しない健康状態を有する対象に投与することを含む。対象は哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
本発明の組成物はいかなる経路で投与してもよい。本発明の組成物は直接投与（たとえば、注射を介した投与による局所、移植、または組織領域内への局所投与）または適当な手段を介するシステム（たとえば、非経口または経口）によって動物に供給してもよい。本発明の組成物が非経口的に静脈内、皮下、眼内、腹腔内、筋肉内、経口、直腸内、眼窩内、大脳内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、クモ膜下、大槽内、嚢内、鼻腔内、またはエアロゾル投与により投与される場合、組成物は好ましくは体液の水性または生理学的に適用可能な懸濁液またはその溶液の一部を含有する。このように、生理学的に許容される担体または輸送体を組成物に加え、患者に送達することができ、これは患者の電解質および／または体積バランスに負の影響を引き起こさない。したがって、生理学的に許容される担体または輸送体は生理食塩水であってもよい。
さらに、本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を含む核酸を含むＤＮＡ構築物（またはゲノム構築物）を遺伝子療法プロトコールの一部として使用してもよい。
本発明において、所望のタンパク質の機能を再構成または補足するために、特定の細胞中で融合タンパク質を発現することができる発現ベクターをなんらかの生物学的に有効な担体と共に投与してもよい。これは、所望のタンパク質またはＩＬ－７融合タンパク質をコードする遺伝子をインビボで細胞内に効率的に送達することができる任意の製剤または組成物であってもよい。
改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質をコードする核酸を用いる遺伝子療法の目的で、対象の遺伝子をウイルスベクター、組換え細菌プラスミド、または組換え真核プラスミドに挿入してもよい。ウイルスベクターは組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス－１、等を含んでいてもよい。ヒトに対する遺伝子療法のための、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の投与量は０．１ｍｇ～２００ｍｇの範囲でよい。例示的な態様において、ヒトの場合、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の好ましい用量は０．６ｍｇ～１００ｍｇの範囲でよい。別の例示的な態様において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸のヒトに対する好ましい用量は１．２ｍｇ～５０ｍｇの範囲でよい。
本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質の単位用量は０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。例示的な態様において、改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質の単位用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。別の代表的な態様において、ヒトの場合のタンパク質の単位用量は、０．０２ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。単位用量は治療する対象の疾患および副作用の存在によって変化してもよい。改変されたＩＬ－７タンパク質の投与は周期的なボーラス注射もしくは外部容器（たとえば、点滴バッグ）または体内（たとえば、生体侵食性移植片）からの連続的な静注、皮下、もしくは腹腔内投与によって行ってもよい。
本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質は、予防または治療しようとする疾患に対して予防または治療効果を有する他の薬物または生理学的に活性な材料と組み合わせて投与してもよいし、あるいは他の薬物と組み合わせて複合調製物に製剤化してもよく、たとえば、免疫刺激剤、たとえば造血成長因子、サイトカイン、抗原、およびアジュバントと組み合わせて投与してもよい。造血成長因子は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、またはＦｌｔ－３リガンドであってもよい。サイトカインはγインターフェロン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＲＡＮＴＥＳ、またはＢ７－１であってもよい。
本発明の改変されたＩＬ－７またはＩＬ－７融合タンパク質を含有する組成物を用いて疾患を予防または治療する方法はまた、他の薬物または生理学的に活性な材料と組み合わせて投与することを含んでいてもよく、併用投与の経路、投与期間、および用量は疾患の種類、患者の健康状態、治療または予防の目的、および組み合わせて投与する他の薬物または生理学的に活性な材料に応じて決定してもよい。
発明の形態
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。以下の実施例は本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例証するためのものである。
実施例１ オリゴペプチドがＩＬ－７にカップリングされた改変されたＩＬ－７タンパク質の調製
オリゴペプチドがＩＬ－７のＮ末端にカップリングされた改変されたＩＬ－７を調製した。ＩＬ－７としては、ヒトＩＬ－７の配列（配列番号１）を使用し、オリゴペプチドとして、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、ＭＭ、ＧＧ、ＭＧ、ＧＭ、ＭＭＭ、ＭＭＧ、ＭＧＭ、ＧＭＭ、ＭＧＧ、ＧＭＧ、ＧＧＭ、ＧＧＧ、ＤＤＤ、またはＭＭＭＭ配列を使用した。
図１Ａに示されているように、「Ａ」－ＩＬ－７の構造を有する様々な形態の改変されたＩＬ－７を調製した。この例では、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、ＭＭ、ＧＧ、ＭＧ、ＧＭ、ＭＭＭ、ＭＭＧ、ＭＧＭ、ＧＭＭ、ＭＧＧ、ＧＭＧ、ＧＧＭ、ＧＧＧ、ＤＤＤ、またはＭＭＭＭ配列を第２のドメイン（オリゴペプチド、「Ａ」）として使用した。オリゴペプチドに融合される第１のドメインとしてのＩＬ－７には、配列番号２８の核酸配列を使用した。ＩＬ－７がオリゴペプチドに融合した形態の全核酸配列を得、その後これを発現ベクターに挿入した。負の対照として、オリゴペプチド改変をもたないＩＬ－７タンパク質を同様の様式で調製した。
Ａ－ＩＬ－７遺伝子を含む発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。３００ｍＬの懸濁培養物に基づき、２０８．３ｕｇのＤＮＡおよび４１６．６ｕｇ（μＬ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｗ／ｗ）を用いてポリプレックスを調製し、次いでＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後、細胞培養物を得、ウェスタンブロットにかけることにより標的タンパク質の発現速度を評価した。次いで、培養物を８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、培養残渣を取り除き、細孔径０．２２μｍのボトルトップフィルターを用いてろ過した。その結果、Ｍ－ＩＬ－７、Ｇ－ＩＬ－７、ＭＭ－ＩＬ－７、ＧＧ－ＩＬ－７、ＭＧ－ＩＬ－７、ＧＭ－ＩＬ－７、ＭＭＭ－ＩＬ－７、ＭＭＧ－ＩＬ－７、ＭＧＭ－ＩＬ－７、ＧＭＭ－ＩＬ－７、ＭＧＧ－ＩＬ－７、ＧＭＧ－ＩＬ－７、ＧＧＭ－ＩＬ－７、ＧＧＧ－ＩＬ－７、ＤＤＤ－ＩＬ－７、およびＭＭＭＭ－ＩＬ－７の改変されたＩＬ－７を含有する培養液を得た。
実施例２ Ｆｃ領域がＩＬ－７のＣ末端にカップリングされたＩＬ－７融合タンパク質の調製
異種のアミノ酸配列からなるポリペプチドが改変されたＩＬ－７のＣ末端にさらにカップリングされたＩＬ－７融合タンパク質、すなわち、第２のドメイン－第１のドメイン－第３のドメインを調製した。第１のドメインとしては、ヒトＩＬ－７の配列（配列番号１）を使用し、第２のドメインとして、Ｍ、Ｇ、ＭＭ、ＧＧ、ＭＧ、ＧＭ、ＭＭＭ、ＭＭＧ、ＭＧＭ、ＧＭＭ、ＭＧＧ、ＧＭＧ、ＧＧＭ、ＧＧＧ、ＤＤＤ、またはＭＭＭＭ配列を使用した。第３のドメインとしては、Ｆｃ領域の配列（配列番号９または１４）を使用した。
図１Ｂに示されているように、第２のドメイン、第１のドメインおよび第３のドメインからなる様々な形態のＩＬ－７融合タンパク質を調製した。この例では、第２のドメインとして、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、ＭＭ、ＧＧ、ＭＧ、ＧＭ、ＭＭＭ、ＭＭＧ、ＭＧＭ、ＧＭＭ、ＭＧＧ、ＧＭＧ、ＧＧＭ、ＧＧＧ、ＤＤＤ、またはＭＭＭＭ配列を使用し；第１のドメインとして、ヒトＩＬ－７を使用し；第３のドメインとして、ハイブリッドＦｃ（ｈＦｃ、ｈｙＦｃ）またはマウス非溶解性Ｆｃを使用した。
特に、ハイブリッドＦｃとしては、米国特許第７，８６７，４９１号に開示されているｈＦｃ（ハイブリッドＦｃ）を使用した。ｈＦｃは、生理学的に活性なタンパク質にカップリングされることにより、現存する改変された免疫グロブリンのＦｃ領域と比較して優秀なインビボ半減期を示すことができる。
実施例１と同様の様式で遺伝子発現ベクターを調製し、トランスフェクトし、細胞を培養して、様々な形態のＩＬ－７融合タンパク質を含有する培養液を調製した。その結果、Ｇ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、Ｍ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＭＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＭＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＭＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＭＧＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＭＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＧＧＧ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、ＤＤＤ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、またはＭＭＭＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質を含有する培養液が得られた。さらに、対照群として、第１のドメインおよび第３のドメインからなるＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質を含有する培養液を作成した。
実施例３ 改変されたＩＬ－７および改変されたＩＬ－７融合タンパク質の生成および精製
上記実施例で生成した改変されたＩＬ－７タンパク質および改変されたＩＬ－７融合タンパク質の生成量を比較した。各々の融合タンパク質について、培養液中のタンパク質の量および細胞中に存在するタンパク質の量を測定した。
細胞外に分泌されたタンパク質の濃度は細胞培養液を得ることによって測定し、細胞中のタンパク質の量は細胞溶解によって得、濃度はＥＬＩＳＡ法によって測定した。一次抗体としては、ヒトＩＬ－７特異的抗体（Southern Biotech, カタログ番号10122-01）を使用し、二次抗体として、ビオチン（BD, カタログ番号554494）およびストレプトアビジン－ＨＲＰ（BD, カタログ番号554066）を使用した。
Ｎ末端へのオリゴペプチドのカップリングの存在による生産性の変化の結果を下記表２に示す。
Figure 2022130427000003
結果として、表２に示されているように、ＭＧＭ－ＩＬ－７の生成量は、オリゴペプチドがカップリングされてないＩＬ－７、またはメチオニンおよびグリシン以外のアミノ酸がカップリングされたＤＤＤ－ＩＬ－７と比較して増大した。
さらに、改変されたＩＬ－７のＣ末端にｈｙＦｃがさらに融合すると、生成したタンパク質は高い濃度で存在することが示され、相対総生産は約２．８倍の増大を示した。
実施例４ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の生産性の評価
実施例２で調製した遺伝子構築物のうち、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質の遺伝子の各々をｐＡＤ１５ベクターに挿入した。次いで、ｐＡＤ１５ベクターを付着または懸濁培養中のＣＨＯ ＤＧ４４細胞（Columbia University, USA）にエレクトロポレーション法によってトランスフェクトした。付着培養の場合、エレクトロポレーションの５時間後培地を１０％ｄＦＢＳ（Gibco, USA, 30067-334）、ＭＥＭα（Gibco, 12561, USA, カタログ番号12561-049）、ＨＴ（5-ヒドロキシトリプタミン、Gibco, USA, 11067-030）を含有する培地と交換した。トランスフェクションの４８時間後、培地をＨＴを含まない１０％ｄＦＢＳを含有するＭＥＭα培地と交換し、ＨＴ選抜を行った。ＨＴ選抜が完了したクローンを生産性の増幅のためにＭＴＸ増幅にかけ、細胞の安定化のために細胞を２または３回継代培養した。
改変されたＩＬ－７（Ａ－ＩＬ－７）およびＩＬ－７融合タンパク質（Ａ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ）の単位生産性（ｐｇ／細胞／日、ｐｃｄ、ｐ／ｃ／ｄ）をＨＴ選抜およびＭＴＸ増幅の間に評価した。継代培養中、培養上清を回収し、細胞の数を測定し、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（Bethyl, USA）を用いて上清から各々のタンパク質の量を測定した。単位生産性を下記式１に従って計算し、産生細胞株を評価した（ｐｇ／細胞／日、ｐｃｄ）：
［式１］
Figure 2022130427000004
単位生産性の評価により選択したクローンを用いて限界希釈クローニング（ＬＤＣ）を行い、結果として、増大した生産性を有する単細胞クローンを選択した。選択した単細胞クローンを、懸濁細胞株として無血清培地を用いて培養した。単一の継代培養を３日とし、３５回継代培養することによって長期安定性（ＬＴＳ）試験を評価し、その結果を図２に示す。
図２Ａに示されているように、オリゴペプチドがＮ末端にカップリングされてないＩＬ－７融合タンパク質は、ＭＴＸ濃度を増大しても、その生産性の増大を示さなかった。これに関して、生産性のさらなる改良のためにＭＴＸ治療を４倍まで行ったが、有効ではなかった。しかし、図２Ｂに示されているように、オリゴペプチドがＮ末端にカップリングされたＩＬ－７融合タンパク質（ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ）は、ＭＴＸ濃度依存的に有意な生産性の増大を示した。ＬＤＬ実施の後、タンパク質の生産性は約２８ｐｇ／細胞／日および約１６ｕｇ／ｍＬであることが示された。
以上のことから、オリゴペプチドをＩＬ－７タンパク質にカップリングすると、調製された組換えＩＬ－７の生産性の改良に対して優れた効果を示すことが可能であることが確認された。
実施例５ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の安定性の確認
上記実施例で得られたＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質の培養液サンプルを精製し、精製したタンパク質をサイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣにかけ、塩化ナトリウムの濃度によるタンパク質安定性を確認した。
まず、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質を緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。希釈したタンパク質を１ｍＬのシリンジおよび０．２ｕｍフィルターを用いてろ過し、バイアルに入れた。バイアルをインサートに挿入し、バイアルキャップで閉鎖した。タンパク質をそれぞれ２０μＬの量でＳＥ－ＨＰＬＣシステムに注入した。ＳＥ－ＨＰＬＣを下記条件下で実施し、その得られたピークの値から純度を確認した。
＜ＳＥ－ＨＰＬＣ実行条件＞
カラム：TSK-GEL G3000SW x Lカラム（7.8mm×300mm）（Tosoh, Japan）
カラム温度：２５℃
移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ、２００ｍＭ、または３００ｍＭ塩化ナトリウムの混合緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．６ｍＬ／分
分析時間：４０分
分析方法：アイソクラチック法
その結果、図３に示されているように、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質は、ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質と比較して、塩化ナトリウムの濃度が変化しても安定なパターンを示した。
実施例６ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質のネイティブ－ＰＡＧＥの確認
改変されたＩＬ－７融合タンパク質と実施例５で確認された塩化ナトリウムの濃度によるＩＬ－７融合タンパク質との間の安定性の差を以下のように再確認した。
具体的には、上記実施例と同じ条件下で調製されたＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃを用いて下記表３に記載される条件に従ってネイティブ－ＰＡＧＥを実行した。Ｇ－ＣＳＦ－ｈｙＦｃを対照群として使用した。
Figure 2022130427000005
結果として、図４に示されているように、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質では、ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質と比較して凝集体が生じなかったが、これはＳＥ－ＨＰＬＣの結果と一致している。
実施例７ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の培養物サンプルの分析
ＩＬ－７－ｈｙＦｃまたはＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質を産生することができる細胞株のうち最も高い生産性を有する細胞株を、実施例５および６の結果に従って選択した。次いで、継代培養した培養液を得、実施例５と同じ方法により同じ条件下でＳＥ－ＨＰＬＣを実行した。
結果として、図５Ａに示されているように、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃの相対的生産性は２，０９１％であり、これは１００％に設定された産生されたＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質の量と比較して約２１倍の増大であった。さらに、標的タンパク質の量を各々の宿主細胞により産生される総タンパク質に対して比較した場合、ＩＬ－７－ｈｙＦｃの純度は約１１．３％であったが、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃタンパク質の純度は約６６．４％であり、したがって約６倍の増大を示した（図５Ｂ）。
結果から、オリゴペプチドをＩＬ－７タンパク質にカップリングすると、調製された組換えＩＬ－７融合タンパク質の純度および生産性の改良に対して優れた効果を示すことができるということが確認された。
実施例８ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の薬物動態学的プロファイル
薬物動態学的プロファイル（ＰＫ）を、調製されたＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質の半減期および曲線下の面積（ＡＵＣ）を比較することによって確認した。
まず、雄性のSprague Dawley（ＳＤ）ラット（５ラット／群）に、各々の組換えタンパク質をそれぞれ０．２ｍｇ／ｋｇの量で皮下に投与した。投与の前ならびに投与の４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後に血液サンプルを集め、室温で３０分保存して血液サンプルを凝集させた。凝集した血液サンプルを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各々のサンプルの血液血清を得、ディープフリーザーに保存した。
開裂が起こっていない完全な形態の組換えタンパク質を特異的に検出するように設計された試験方法によってサンプルを分析した。具体的には、調製された組換えタンパク質を含有する生物サンプルをヒトＩＬ－７にカップリングされたマウス起源の捕捉抗体（R&D, カタログ番号MAB207）でコーティングされたプレートに装填した後、マウス起源のヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）にカップリングされるＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体（Southern Biotech, カタログ番号9190-05）を用いて標的タンパク質を検出する方法である。標準曲線の線形位置で分析される１０％スキムミルクを含有する１×ＰＢＳでの１０倍希釈によってサンプルを定量化した。結果は、各時点で血液中に残存するタンパク質量および曲線下の薬物濃度面積として図６に示す。
結果として、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質は同様なＡＵＣ値（約１．２倍）を示した。このように、第２のドメインであるオリゴペプチドの融合は、第１のドメインの薬物動態学に変化を生じないことが確認された。したがって、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質およびＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質はインビボで同様な薬物動態学的プロファイルを示すことができた。
実施例９ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の免疫原性
上で調製されたＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質の投与による抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生産する能力を比較することにより、各々のＩＬ－７融合タンパク質の抗原性を検討した。
まず、実施例８に記載したのと同様の様式で得られた血液サンプルを、ＩＬ－７－ｈｙＦｃまたはＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質で０．２ｕｇ／ウェルの量でコーティングされたプレートに装填した。次に、ＨＲＰがコンジュゲートされたラット免疫グロブリン抗体（Southern Biotech, カタログ番号1031-05）を用いてラットのＡＤＡを検出するように設計された試験方法を使用してサンプルを分析した。
特に、ＡＤＡの反応が正常なラット血清（負のカットオフ；ＮＣＯ）の反応と同じになるまでサンプルを希釈することによってサンプルを分析し、希釈倍率によるサンプルの反応を光学密度で測定した。結果を図７に示す。
結果として、図７に示されているように、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃが負のカットオフ（ＮＣＯ）に到達するのに必要とされる希釈倍率は同様であった。この結果から、第２のドメインであるオリゴペプチドの融合は抗原性を増大させないことが確認された。
実施例１０ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質の薬力学的プロファイル
上で調製されたＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質の投与による白血球（ＷＢＣ）の数を比較し、各々のタンパク質に対する薬力学的プロファイルを確認した。
まず、雄性ＳＤラット（５匹のラット／群）に、各々のタンパク質を０．２ｍｇ／ｋｇの量で皮下に投与した。次に、投与の前ならびに投与後第１、第２、および第３週にラットから血液サンプルを集めた。血液サンプルの凝集を防ぐために、サンプルをＥＤＴＡ処理したチューブに入れ、５分間混合し、安定化し、ＷＢＣの数を全血球数（ＣＢＣ）分析により分析した。
結果として、図８に示されているように、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質は同様な様式で投与後第２週目でＷＢＣの数を最高レベルに増加した。すなわち、第２のドメインであるオリゴペプチドの融合による薬力学的変化はない。したがって、ＩＬ－７－ｈｙＦｃおよびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質は同様な薬力学的プロファイルを示すことができるということが確認された。
実施例１１ 調製された改変されたＩＬ－７およびＩＬ－７融合タンパク質のインビトロ活性の比較
ネズミの未成熟Ｂリンパ球である２Ｅ８細胞（ATCC, TIB-239）を用いて生物活性の分析を実行した。
まず、細胞を９６－ウェルプレートに蒔き（１×１０５細胞／５０μＬ／ウェル）、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃを７５０ｐＭ～２．９３ｐＭの濃度に段階的に希釈し、ウェル上で処理した。細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で７０時間培養し、２０μＬ／ウェル濃度のＭＴＳで処理し、再びインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で４時間培養した。次いで、４９０ｎｍで吸光度を測定した。特に、ＷＨＯ国際標準のヒトＩＬ－７（ＮＩＢＳＣコード：９０／５３０、１００，０００単位）を対照群として使用した。ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ処理の濃度に従う較正曲線を作成し（４－パラメーターフィット）、分析の結果を図９に示す。
結果として、図９に示されているように、国際標準１００，０００単位に基づいて、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃのｌｏｇＥＣ５０に基づく活性は１２６，０００単位であり、ＰＬＡに基づく活性は３７１，０００単位であることが示された。これは、ＩＬ－７の分子の数を考慮すると、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃの活性は国際標準のヒトＩＬ－７のものと同様またはそれ以上であることを示している。
実施例１２ 致死性用量のインフルエンザに感染したモデルにおける調製された改変されたＩＬ－７融合タンパク質の予防および治療効果
致死性用量のインフルエンザをもつマウスモデルは、麻酔した後、鼻腔を介して３ＬＤ５０のＨ５Ｎ２ウイルス（Ａ／水鳥／韓国／Ｗ８１／２００５）を投与することによって調製した。一般に、ウイルスに感染したマウスは２～３日目から体重が減り始め、１週目以降から死に始める。このように調製した疾患モデルに、実施例２および４で調製されたＩＬ－７組換えタンパク質を鼻腔から投与し、ＩＬ－７－ｍＦｃ（マウスＦｃ）（配列番号２７）を対照群として使用した。
特に、Ｇ－ＣＳＦは初期段階のインフルエンザ感染を阻害し、好中球を増殖させることにより免疫応答を促進することができる。そこで、Ｇ－ＣＳＦ－ｈｙＦｃを別の実験群として使用した。
各実験群に付き６匹のマウスを使用し、致死性用量のインフルエンザに感染させる１４日前にＩＬ－７－ｍＦｃ（ＩＬ－７－マウスＦｃ）、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ、またはＧ－ＣＳＦ－ｈｙＦｃを鼻腔を介して投与した。その後、３ＬＤ５０のＨ５Ｎ２ウイルスを投与し、体重および生存率を２０日間観察した。
結果は、図１０に示されているように、全ての群で体重が低下し始めた（図１０Ａ）。しかし、その体重低減のギャップはＩＬ－７－ｍＦｃで処置した群およびＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃで処置した群で次第に減少し、次第に体重を回復し、その生存率は対照群のものと違って高かった。ＩＬ－７－ｍＦｃで処置した群は１００％生存し、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃで処置した群は８３％の生存率を示した（図１０Ｂ）。
ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃの効果がＩＬ－７－ｍＦｃのものより少し低く観察される理由は、種間の差に起因するようである。すなわち、マウスのインビボ系において、ヒトに由来するＦｃはマウスに由来するＦｃのものより低い機能を有する。
一方、ＰＢＳまたはＧ－ＣＳＦ－ｈｙＦｃで処置した群は非常に低い効果を示し、したがって、致死性用量のインフルエンザに感染したマウスの生存率は１０日で０％だった。
結論として、ＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃ組換えタンパク質はインフルエンザモデルで強い効果を示したが、Ｇ－ＣＳＦ－ｈｙＦｃはそうでなく、ＭＧＭ－ＩＬ－７がインフルエンザに極めて効果的であることを示している。
実施例１３ ＴＣ－１癌疾患を有するモデルにおける調製された改変されたＩＬ－７融合タンパク質の治療効果
子宮内膜癌の疾患モデルを調製するために、マウスの腹腔内に３ｍｇのデポプロペラを投与して生理の期間を調節した。４日で、マウスの膣内にノノキシノール－９（N9, USP, カタログ番号1467950）を投与して膣組織を刺激し、ＰＢＳで洗浄することにより残存するＮ９を除去した。次いで、癌細胞の子宮内への移植のために、１×１０５のＴＣ－１細胞（Dr. Jae-Tae LEE, School of Medicine, Kyungpook National University）を投与し、その１日後、１ｕｇのＭＧＭ－ＩＬ－７－ｈｙＦｃを子宮頸部内に投与した。
結果的に、融合タンパク質の投与の２８日後、ＴＣ－１腫瘍細胞を子宮頸部または膣内部に植え付け、増殖させた。すなわち、図１１に示されているように、細胞が増殖し、膣口の外に露出した。ＰＢＳを投与した対照群の場合、１０匹のマウスのうち６匹でＴＣ－１細胞の増殖が観察され、そのうちの１匹は癌細胞の過剰増殖のために死んだ。
対照的に、ＭＧＭ－ＩＬ－７融合タンパク質を投与した実験群では、１０匹のマウスのうち２匹のみでＴＣ－１細胞の増殖の症状を有することが観察され、死んだマウスはいなかった。したがって、改変されたＩＬ－７融合タンパク質は癌の予防および治療に効果的であることが確認された。
対照的に、ＭＧＭ－ＩＬ－７融合タンパク質を投与した実験群では、１０匹のマウスのうち２匹のみでＴＣ－１細胞の増殖の症状を有することが観察され、死んだマウスはいなかった。したがって、改変されたＩＬ－７融合タンパク質は癌の予防および治療に効果的であることが確認された。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 次の構造：
Ａ－ＩＬ－７
を有する改変されたインターロイキン－７であって、
式中、Ａは１～１０個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、
ＩＬ－７はインターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドである、改変されたインターロイキン－７。
［２］ 前記ＩＬ－７が配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、［１］に記載の改変されたインターロイキン－７。
［３］ ＡがＩＬ－７のＮ末端に結合している、［１］に記載の改変されたインターロイキン－７。
［４］ Ａがメチオニン、グリシン、メチオニン－メチオニン、グリシン－グリシン、メチオニン－グリシン、グリシン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－グリシン、メチオニン－グリシン－メチオニン、グリシン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－グリシン－グリシン、グリシン－メチオニン－グリシン、グリシン－グリシン－メチオニン、およびグリシン－グリシン－グリシンからなる群から選択されるいずれか１つである、［１］に記載の改変されたインターロイキン－７。
［５］ 以下のドメイン（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）：
（ａ）インターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドを含む第１のドメイン；
（ｂ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドを含む第２のドメイン；および
（ｃ）前記インターロイキン－７融合タンパク質の半減期を延ばす第３のドメインを含む、インターロイキン－７融合タンパク質。
［６］ 前記第３のドメインが前記第１のドメインまたは前記第２のドメインのＮ末端またはＣ末端に連結している、［５］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［７］ 前記第３のドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、長鎖非構造化親水性アミノ酸配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、［５］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［８］ 前記第３のドメインが改変された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、［５］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［９］ 前記改変された免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびこれらの組合せからなる群から選択される、［８］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［１０］ 前記改変された免疫グロブリンの前記Ｆｃ領域が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、
前記ヒンジ領域はヒトＩｇＤヒンジ領域を含み、
前記ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＤおよびヒトＩｇＧ４のＣＨ２ドメインのアミノ酸残基の一部を含み、
前記ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ４ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の一部を含む、［８］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［１１］ 前記改変された免疫グロブリンの前記Ｆｃ領域が次式（Ｉ）：
［式（Ｉ）］
Ｎ’－（Ｚ１）ｐ－Ｙ－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｃ’
（式中、
Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり；
ｐは０または１の整数であり；
Ｚ１は配列番号７の９０～９８位のアミノ酸残基のうちの、９８位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～９個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり； Ｙは配列番号７の９９～１６２位のアミノ酸残基のうちの、１６２位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～６４個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｚ２は配列番号７の１６３～１９９位のアミノ酸残基のうちの、１６３位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって４～３７個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｚ３は配列番号８の１１５～２２０位のアミノ酸残基のうちの、２２０位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって７１～１０６個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
Ｚ４は配列番号８の２２１～３２７位のアミノ酸残基のうちの、２２１位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって８０～１０７個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である）で表される、［８］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［１２］ 前記第３のドメインが配列番号９～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、［５］に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
［１３］ ［１］～［１２］のいずれか一に記載の前記改変されたインターロイキン－７または前記インターロイキン－７融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
［１４］ 前記核酸分子が配列番号１５～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、［１３］に記載の核酸分子。
［１５］ 前記核酸分子が配列番号２９～３９からなる群から選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、［１３］に記載の核酸分子。
［１６］ ［１３］～［１５］のいずれか一に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
［１７］ ［１６］に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
［１８］ （ａ）［１６］に記載の発現ベクターにより形質転換された細胞を培養する工程；および
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養物または細胞から改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質を収集する工程
を含む、タンパク質を調製する方法。
［１９］ メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインのＮ末端に連結することを含む、改変されたインターロイキン－７を調製する方法。
［２０］ メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインのＮ末端に連結する工程；および
前記第１のドメインのＣ末端を第３のドメインに連結する工程
を含み、
前記第３のドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、インターロイキン－７融合タンパク質を調製する方法。
［２１］ （ａ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインをコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結することにより、連結したポリヌクレオチドを調製する工程；および
（ｂ）前記連結したポリヌクレオチドを発現させることにより、改変されたインターロイキン－７を収集する工程
を含む、改変されたインターロイキン－７を調製する方法。
［２２］ （ａ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、第３のドメインをコードするポリヌクレオチドを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインをコードするポリヌクレオチドのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結することによって連結したポリヌクレオチドを調製する工程；および
（ｂ）前記連結したポリヌクレオチドを発現させることによってインターロイキン－７を収集する工程
を含む、インターロイキン－７融合タンパク質を製造する方法であって、
前記第３のドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、方法。
［２３］ ［１］～［１２］のいずれか一に記載の改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質を含む、疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［２４］ 薬学的に許容される担体をさらに含む、［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］ 前記疾患が癌、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、リンパ球減少症（lymphocytopenia）（リンパ球減少症（lymphopenia））およびウイルス感染からなる群から選択される、［２３］に記載の医薬組成物。
［２６］ ［１］～［１２］のいずれか一に記載の改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質および薬学的に許容される担体をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患を予防または治療する方法。
［２７］ 前記疾患が頭頸部癌、子宮頸癌、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびウイルス感染からなる群から選択される、［２６］に記載の方法。

Claims (27)

  1. 次の構造：
    Ａ－ＩＬ－７
    を有する改変されたインターロイキン－７であって、
    式中、Ａは１～１０個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、
    ＩＬ－７はインターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドである、改変されたインターロイキン－７。
  2. 前記ＩＬ－７が配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改変されたインターロイキン－７。
  3. ＡがＩＬ－７のＮ末端に結合している、請求項１に記載の改変されたインターロイキン－７。
  4. Ａがメチオニン、グリシン、メチオニン－メチオニン、グリシン－グリシン、メチオニン－グリシン、グリシン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－メチオニン－グリシン、メチオニン－グリシン－メチオニン、グリシン－メチオニン－メチオニン、メチオニン－グリシン－グリシン、グリシン－メチオニン－グリシン、グリシン－グリシン－メチオニン、およびグリシン－グリシン－グリシンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の改変されたインターロイキン－７。
  5. 以下のドメイン（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）：
    （ａ）インターロイキン－７またはそれと類似の活性を有するポリペプチドを含む第１のドメイン；
    （ｂ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドを含む第２のドメイン；および
    （ｃ）前記インターロイキン－７融合タンパク質の半減期を延ばす第３のドメイン
    を含む、インターロイキン－７融合タンパク質。
  6. 前記第３のドメインが前記第１のドメインまたは前記第２のドメインのＮ末端またはＣ末端に連結している、請求項５に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  7. 前記第３のドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、長鎖非構造化親水性アミノ酸配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項５に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  8. 前記第３のドメインが改変された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、請求項５に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  9. 前記改変された免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  10. 前記改変された免疫グロブリンの前記Ｆｃ領域が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、
    前記ヒンジ領域はヒトＩｇＤヒンジ領域を含み、
    前記ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＤおよびヒトＩｇＧ４のＣＨ２ドメインのアミノ酸残基の一部を含み、
    前記ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ４ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の一部を含む、請求項８に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  11. 前記改変された免疫グロブリンの前記Ｆｃ領域が次式（Ｉ）：
    ［式（Ｉ）］
    Ｎ’－（Ｚ１）ｐ－Ｙ－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｃ’
    （式中、
    Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり；
    ｐは０または１の整数であり；
    Ｚ１は配列番号７の９０～９８位のアミノ酸残基のうちの、９８位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～９個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
    Ｙは配列番号７の９９～１６２位のアミノ酸残基のうちの、１６２位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって５～６４個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
    Ｚ２は配列番号７の１６３～１９９位のアミノ酸残基のうちの、１６３位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって４～３７個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
    Ｚ３は配列番号８の１１５～２２０位のアミノ酸残基のうちの、２２０位のアミノ酸残基からＮ末端に向かって７１～１０６個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり；
    Ｚ４は配列番号８の２２１～３２７位のアミノ酸残基のうちの、２２１位のアミノ酸残基からＣ末端に向かって８０～１０７個の連続した前記アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である）で表される、請求項８に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  12. 前記第３のドメインが配列番号９～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のインターロイキン－７融合タンパク質。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の前記改変されたインターロイキン－７または前記インターロイキン－７融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
  14. 前記核酸分子が配列番号１５～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. 前記核酸分子が配列番号２９～３９からなる群から選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の核酸分子。
  16. 請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  17. 請求項１６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  18. （ａ）請求項１６に記載の発現ベクターにより形質転換された細胞を培養する工程；および
    （ｂ）工程（ａ）で得られた培養物または細胞から改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質を収集する工程
    を含む、タンパク質を調製する方法。
  19. メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインのＮ末端に連結することを含む、改変されたインターロイキン－７を調製する方法。
  20. メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインのＮ末端に連結する工程；および
    前記第１のドメインのＣ末端を第３のドメインに連結する工程
    を含み、
    前記第３のドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、インターロイキン－７融合タンパク質を調製する方法。
  21. （ａ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインをコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結することにより、連結したポリヌクレオチドを調製する工程；および
    （ｂ）前記連結したポリヌクレオチドを発現させることにより、改変されたインターロイキン－７を収集する工程
    を含む、改変されたインターロイキン－７を調製する方法。
  22. （ａ）メチオニン、グリシン、またはこれらの組合せからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む第２のドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、第３のドメインをコードするポリヌクレオチドを、インターロイキン－７の活性またはその類似の活性を有する第１のドメインをコードするポリヌクレオチドのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結することによって連結したポリヌクレオチドを調製する工程；および
    （ｂ）前記連結したポリヌクレオチドを発現させることによってインターロイキン－７を収集する工程
    を含む、インターロイキン－７融合タンパク質を製造する方法であって、
    前記第３のドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部、アルブミン、アルブミン結合性ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合性小分子、およびこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、方法。
  23. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質を含む、疾患を予防または治療するための医薬組成物。
  24. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記疾患が癌、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、リンパ球減少症（lymphocytopenia）（リンパ球減少症（lymphopenia））およびウイルス感染からなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変されたインターロイキン－７またはインターロイキン－７融合タンパク質および薬学的に許容される担体をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患を予防または治療する方法。
  27. 前記疾患が頭頸部癌、子宮頸癌、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびウイルス感染からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
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