JP5666110B2 - 高機能化hvj−eの開発 - Google Patents
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Description
[1]HVJのHNタンパク質のN末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変HNタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が111〜209アミノ酸の長さを有する、改変HNタンパク質;
[2]該部分アミノ酸配列が140〜180アミノ酸の長さを有する、上記[1]記載の改変HNタンパク質;
[3]下記(1)または(2)のポリペプチドである、上記[1]記載の改変HNタンパク質:
(1)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つHVJに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド;
[4]上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の改変HNタンパク質の残基及び第1の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変HNタンパク質残基のC末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質;
[5]機能性ポリペプチドがIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドである、上記[4]記載の融合タンパク質;
[6]IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドが一本鎖IL−12である、上記[5]記載の融合タンパク質;
[7]一本鎖IL−12が、下記(1)または(2)のポリペプチドである、上記[6]記載の融合タンパク質:
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチド;
[8]機能性ポリペプチドが抗体の定常領域(Fc)のCH2−CH3ドメインである、上記[4]記載の融合タンパク質;
[9]抗体の定常領域(Fc)のCH2−CH3ドメインがIgG2aに由来するものである、上記[8]記載の融合タンパク質;
[10]抗体の定常領域のCH2−CH3ドメインが、下記(1)または(2)のポリペプチドである、上記[9]記載の融合タンパク質:
(1)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインAとの結合活性を有するポリペプチド;
[11]上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の改変HNタンパク質、又は上記[4]〜[10]のいずれか1つに記載の融合タンパク質をコードする核酸;
[12]上記[8]〜[10]のいずれか1つに記載の第1の融合タンパク質、並びに
プロテインAのZZドメイン及び第2の機能性ポリペプチド残基を含む第2の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質とが、第1の融合タンパク質に含まれるCH2−CH3ドメインと第2の融合タンパク質に含まれるZZドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体;
[13]第2の機能性ポリペプチドが、一本鎖IL−12である、上記[12]記載のタンパク質複合体;
[14]一本鎖IL−12が、下記(1)または(2)のポリペプチドであり、且つZZドメインが、下記(3)または(4)のポリペプチドである、上記[13]記載のタンパク質複合体:
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
(3)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(4)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域(Fc)への結合活性を有するポリペプチド;
[15]上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の改変HNタンパク質、上記[4]〜[10]のいずれか1つに記載の融合タンパク質、または上記[12]〜[14]のいずれか1つに記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、HVJ−E;
[16]上記[6]もしくは[7]に記載の融合タンパク質または上記[13]もしくは[14]に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記[15]記載のHVJ−E;
[17]IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープ外側に提示する形で担持する、HVJ−E;
[18]IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドが、IL−12である、上記[17]記載のHVJ−E;
[19]IL−12が一本鎖IL−12である、上記[18]記載のHVJ−E;
[20]上記[6]もしくは[7]に記載の融合タンパク質または上記[13]もしくは[14]に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記[18]記載のHVJ−E;
[21]上記[17]〜[20]のいずれか1つに記載のHVJ−Eを有効成分として含む、抗癌剤;
[22]メラノーマ、前立腺癌、膀胱癌および大腸癌からなる群より選択される癌の治療または予防に用いられる、上記[21]記載の抗癌剤;
[23]1回当たりの投与量が、HVJ−Eとして1000HAU以下であり、かつ該HVJ−Eに含まれるIL−12として100pg以下であることを特徴とする、上記[21]記載のHVJ−Eを有効成分として含む抗癌剤;
[24]上記[21]記載のHVJ−Eの治療上有効量を癌患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法;
[25]1回当たりの投与量が、HVJ−Eとして1000HAU以下であり、かつ該HVJ−Eに含まれるIL−12として100pg以下であることを特徴とする、上記[24]記載の癌の治療方法;
を提供する。
例えば、改変HNタンパク質と一本鎖IL−12等のIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドとの融合タンパク質を用いることにより、エンベロープの外側に該ポリペプチドを提示する形で担持するHVJ−Eを得ることが可能である。
エンベロープの外側にIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドを提示する形で担持するHVJ−Eは、高い抗腫瘍効果を有しており、抗腫瘍剤として有用である。
癌の治療においては、外科的切除法、放射線治療法、化学療法などが存在するが、その根治は依然大きな課題である。本発明は、細胞実験および生体内実験を通じて、本発明の改良型HVJ−Eの癌への直接投与で、IFN−γの産生を誘導し、癌を著しく退縮させることを示した。
本発明は、センダイウイルス(HVJ)のHNタンパク質のN末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変HNタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が111〜209アミノ酸の長さを有する、改変HNタンパク質を提供する。
好ましくは、該部分アミノ酸配列が140〜180アミノ酸の長さを有する。
さらに好ましくは、本発明の改変タンパク質は、下記(1)または(2)のポリペプチドである:
(1)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つHVJに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
「実質的に同質の活性」における「活性」は、上述の「細胞膜へ局在する活性」、及び「HVJ−Eを構成する活性」を意味する。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同じであることを意味する。したがって、上記の各活性は同等(例えば、約0.5〜約2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度などの量的要素は異なっていてもよい。
(1)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つHVJに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドがあげられる。
(1)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインAのZZドメインとの結合活性を有するポリペプチド。
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
(3)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(4)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子のFc領域への結合活性を有するポリペプチド。
別の好ましい一実施態様としては、配列番号6に表されるアミノ酸配列の配列番号1〜160のポリペプチドにIgG2aのCH2−CH3ドメインのポリペプチドが機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を提供する。配列番号6に表されるアミノ酸配列の配列番号1〜160のポリペプチドをコードするDNAとしては前記の通りである。また、IgG2aのCH2−CH3ドメインポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号3に示される塩基配列の511〜1167までの塩基配列を含有するDNA、または配列番号3に示される塩基配列の511〜1167までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したCH2−CH3ドメインと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。
前記の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号5(または配列番号1または3)に示される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0.1% SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主の細胞内で機能可能なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、CAGプロモーター、β−アクチンプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV−TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。
宿主としては、例えば、動物細胞、動物などの分泌発現に適したものが用いられる。
動物としては、トランスジェニック系の確立した哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ)もしくはニワトリなどが挙げられる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263−267 (1995)(秀潤社発行)、Virology,52巻,456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
動物は、例えば、トランスジェニック動物の開発(シーエムシー出版),(2001)に記載の方法に従って形質転換することができる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM),ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM),RPMI 1640培地,199培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物である場合、遺伝子導入した受精卵から、常法に従ってトランスジェニック動物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動物の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
本実施例に用いる1本鎖IL−12(以下、scIL−12とも表す)との会合により抗腫瘍効果を向上させた改変HVJ−Eの作製スキームを図1に示す。図1では、この機能性分子がIL−12の場合を例として記載しているが、細胞表面の受容体に結合する各種の分子等、所望の機能性分子をこの方法でHVJ−Eの表面に提示させることができることは、当業者であれば容易に理解可能である。
すなわち、機能性ポリペプチドを提示するHVJ−Eには、イムノグロブリン(Ig)分子の定常領域(Fc)のCH2−CH3ドメインをウイルス表面に提示するFc−HNタンパク質と、所望の機能性ポリペプチドとプロテインAのZZドメインとを融合させたZZ融合タンパク質との、2種の融合タンパク質が用いられた。
まず、天然型HVJ−Eのウイルス粒子表面に提示されたHNタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域(Fc)に置換したHN−Fc融合タンパク質を作製し、これをHVJ−EのHNタンパク質の代わりにウイルス粒子に提示するFc−HN−HVJ−Eを作製した(図1a)。
より詳細には、HNタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域(Fc)に置換したHN−Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して該細胞でHN−Fc融合タンパク質を発現させた。この細胞に天然型HNタンパク質を持つ天然型HVJ−Eを感染させて増幅させた。すると、このウイルス増幅の過程で、細胞内で発現され細胞外にFcを提示していたHN−Fc融合タンパク質を粒子外被に取り込んでFc部を粒子表面に提示したウイルス(Fc−HN−HVJ−E)が細胞外に放出された(図2)。
次いで、一本鎖IL−12にプロテインAのZZドメイン(該ドメインがFcと結合する)を付加したscIL−12−ZZ融合タンパク質(ZZ−IL12)を作製した(図1b)。
Fc−HN−HVJ−EとZZ−IL12とを混合することで、Fc−HN−HVJ−Eの粒子表面のFcにZZ−IL12のZZドメインが結合して、ZZ−IL12とFc−HN−HVJ−Eとが会合し、HVJ−Eの粒子表面にIL−12が提示されたZZ−IL12−Fc−HN−HVJ−Eが得られた(図1a+b)。
より具体的に本実施例に用いたZZ−IL12−Fc−HN−HVJ−Eの作製方法を以下に記載するが、この記載により本発明の態様がこれに限定されるものではない。
(1)ウイルス粒子に取り込まれるために必要なHNタンパク質内の領域の特定
まず、ウイルス粒子に取り込まれ得るHN−Fc融合タンパク質を作製するにあたり、HNタンパク質のどの領域がウイルス粒子に取り込まれるために必須であるのかを特定した。
HNタンパク質中のウイルス粒子の外に提示される領域(細胞外ドメイン)のC末端側から欠失させて、6種類のリコンビナントHN発現ベクター(Full length HN、ecto−400aa−HN、ecto−300aa−HN、ecto−200aa−HN、ecto−100aa−HN、ecto−0aa−HN)を作製した(図3(a))。これらのリコンビナントHNは、免疫学的検出を可能とするために、便宜上、C末端側にMycタグを融合させた。このリコンビナントHN発現ベクターをサル腎臓細胞LLCMK2に導入し、その発現をウエスタンブロットにより確認したところ、所望の分子量の位置に各リコンビナントHNが発現されていた(図3(c))。このウエスタンブロットで検出される発現量がかなり少なかったecto−0aa−HN以外のリコンビナントHNについて、細胞内局在を免疫染色法で確認した。Triton存在下では、いずれも細胞質に検出されたが、Toriton非存在下で本来の細胞内局を見たところ、Full length HN 及びecto−100aa−HNのみが細胞膜表面に局在している事が明らかとなった(図3(b))。さらに、これらのリコンビナント HN 発現細胞に HVJ を感染させると、ecto−100aa−HN のみが感染細胞由来 HVJ に取り込まれていることが確認された(図3(d))。
また、上記と同様に、ecto−50aa−HN、ecto−80aa−HN、ecto−120aa−HNおよびecto−150aa−HNを作製して(図4(a))、同様に細胞内発現(図4(c))、細胞内局在(図4(b))およびウイルス粒子への取り込み(図4(d))を確認したところ、ecto−50aa−HNは、細胞内発現が低く、細胞膜表面への局在も確認できなかったが、ecto−80aa−HN、ecto−120aa−HNおよびecto−150aa−HNについては、十分に発現され細胞膜表面に局在することが確認された。ウイルス粒子への取り込みについては、ecto−80aa−HNおよびecto−120aa−HNにおいて、認められた(図4(d))。
以上より、C末端切断型のHNタンパク質がウイルス粒子に取り込まれるためには、HNタンパク質の細胞外ドメインのN末端側の少なくとも51残基以上、好ましくは80残基以上(N末端から111残基以上、好ましくは140残基以上)が必要であることがわかった。また、N末端部分アミノ酸配列の長さが209アミノ酸(好ましくは180アミノ酸)よりも長いと、かえってC末端切断型のHNタンパク質はウイルス粒子に取り込まれなくなることが分かった。
(2)Fc−HN−HVJの作製
次いで、上記ecto−100aa−HNを利用してFc−HN−HVJを作製した。まず、ecto−100aa−HNのMycタグのC末端側にマウスIgG2aFcドメインのCH2−CH3ドメインをさらに付加したFc融合ecto−100aa−HN(HN−Fc)を作製した(図5(a))。このHN−Fcについても、上記と同様の方法で、細胞内発現(図5(b))、細胞内局在(図5(c))、ウイルス粒子への取り込み(図5(d))を確認できた。さらに、このecto−100aa−HNのプロテインA結合能を調べるために、Fc−HNとプロテインAセファロースとの共沈実験を行った。ecto−100aa−HN発現LLCMK2およびFc−HN発現LLCMK2をそれぞれに溶解させてプロテインAセファロースと混合後、プロテインAセファロースを沈殿させた。ecto−100aa−HNはプロテインAセファロースと共沈せず、全て細胞溶解液(lysate)中に残ったが、Fc−HNはプロテインAセファロースと共沈し、プロテインAとの結合が可能である事が確認された(図5(e))。
プロテインAのZZドメインと一本鎖IL−12とを融合させて、ZZ−IL−12を作製した。まず、Lieschkeらの報告(Nature Biotechnology, 15, 35−40 (1997))にならって一本鎖IL−12(scIL12)を作製した。具体的には、IL−12の第一のサブユニットp40と第二のサブユニットp35との間にGly−Gly−Gly−Serからなるリンカーが3つ連結して挟まれ、さらにp40のN末端側にシグナルペプチドを連結したものである(図6(a))。本実施例においては、免疫学的検出の便宜のために、シグナルペプチドC端とp40サブユニットのN端との間にFlagおよびヘマグルチニン(HA)のタグを挿入し(Tag−scIL12)、さらに、HAタグのC端とp40サブユニットの間にプロテインAのZZドメインを挿入したものを遺伝子工学的常法により作製した(ZZ−scIL12)。また、ネガティブコントロールとしてp35サブユニットを欠損したものも作製した(ZZ−p40)。なお、このシグナルペプチドはタンパク質生成後切断される。これらが、IL−12として機能しうるかどうかを確認するために、Tag−scIL12、ZZ−scIL12およびZZ−p40について、脾細胞からのインターフェロンγ(IFNγ)の分泌刺激効果を測定した。マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、DC−Medium(RPMI(10%FBS、100unit/ml penicillin、0.1mg/ml streptomycin、10ng/ml GM−CSF、4nl/ml 2−mercaptethanole))で6日間培養後、浮遊細胞を樹状細胞(DC)として回収し、1×105cells/100μl/wellで96 well plateにまいた。
Tag−scIL12、ZZ−scIL12およびZZ−p40のそれぞれを、10 ng/mlの濃度となるよう各wellに加え(total 200 μl)、24h 37℃でインキュベーションし、96well plateを遠心(440×g、5 min)することで、上清を回収し、上清中のIFNγをELISAで測定した。その結果、ZZ−p40はIFNγ分泌誘導を示さなかったが、Tag−scIL12およびZZ−scIL12は共に、IFNγ分泌誘導を示し(図6(b))、ここで作製したZZ−scIL12がIL−12として作用することが確認された。
ZZ−scIL12が、Fc−HNを粒子表面に提示したHVJ(Fc−HN−HVJ)と結合して複合体を形成しうるかどうかを調べた。
上記Fc−HNの発現ベクターをLLCMK2に導入後、HVJを該細胞に1.5MOIにて感染させて増幅させたHVJを回収することにより、Fc−HNを粒子表面に提示したFc−HN−HVJを得た。このFc−HN−HVJ液(TFBバッファー:20mM Tris−HCl(pH7.0)、150mM NaCl、1mM MgCl2に懸濁)とZZ−scIL−12液(ZZ−scIL12発現ベクター導入CHO−K1培養上清(血清不含HAM’S F−12培地))とを、体積比1:20で混合し(4℃、一晩、転倒混和)、その後、ショ糖密度勾配による遠心分離(25−50%スクロース、100,000×g、11h)後、scIL12をHAタグに対する抗体で、HVJはHVJに発現しているMタンパク質に対する抗体で、それぞれショ糖濃度画分のウェスタンブロットにより検出した。Fc−HNを提示していないHVJとZZ−scIL12とを混合した場合は、ZZ−scIL12は低ショ糖濃度の画分に、HVJは高ショ糖濃度の画分に、それぞれ分離される(図7右上図)のに対し、Fc−HN−HVJと混合した場合には、ZZ−scIL12はFc−HN−HVJと同じ高ショ糖濃度の画分にも検出され、混合液中のZZ−scIL12はFc−HN−HVJと複合体を形成していることが確認された。なお、ZZドメインを有さないscIL−12(Tag−scIL12)はFc−HN−HVJと混合した場合でも、Fc−HN−HVJと同じ高ショ糖濃度の画分には検出されなかった(図7左下図)。したがって、Fc−HN−HVJとZZ−scIL−12とは、Fc部とZZドメインの結合を介して会合し複合体を形成するものと考える。
前述のようにして得られたFc−HN−HVJを、公知の方法(WO2006/011580など参照のこと)に従って精製し、Fc−HVJ−Eを得た。このFc−HVJ−EとZZ−scIL12とを上記と同様に混合し、血清中で37℃で0〜24時間インキュベートした後、上記同様にウエスタンブロットに供した。その結果、24時間のインキュベーションにおいても、ZZ−scIL12とFc−HVJ−Eの結合が維持されている事が確認された(図8)。
Fc−HVJ−Eを樹状細胞(DC)に対するZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eの作用を検討した。DCの調製は、マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、DC−Medium(RPMI(10%FBS、100unit/ml penicillin、0.1mg/ml streptomycin、10ng/ml GM−CSF、4nl/ml 2−mercaptethanole))で6日間培養した後、浮遊細胞(DC)を回収し、1×105cells/100μl/wellで96well plateにまいた。その後、天然型HVJ−E、Fc−HN−HVJ−EおよびZZscIL12と複合体を形成したZZ−scIL12結合型Fc−HN−HVJ−EHVJ−Eを、それぞれ10、50または100HAU(100μl培地中)を各ウェルに加え、24時間、37℃でインキュベーションした。この96well plateを440×g、5minで遠心し、上清を回収し、上清中のIFN−γおよびIL−6の量をELISAで測定した。その結果を図9に示す。ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eは、DCからのIFN−γ分泌を促進した(図9中図)。天然型HVJ−EおよびFc−HN−HVJ−EもIFN−γ分泌促進を誘導したが、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eが最もIFN−γ分泌促進能に優れていた。また、DCからのIL−6分泌促進能については、天然型HVJ−Eよりは低いものの、Fc−HN−HVJ−EおよびZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eとも、IL−6の分泌も促進させることが確認された(図9右図)。
さらにまた、脾臓細胞におけるIFN−γ分泌促進についても検討した。脾臓細胞は、マウス脾臓から脾細胞を回収後、塩化アンモニウム−トリス緩衝液を加えて赤血球を溶血させた後、細胞をsplenocyte−Medium(RPMI(10%FBS、100unit/ml penicillin、0.1mg/ml streptomycin、4nl/ml 2−mercaptethanole))に懸濁し、2×105cells/100μl/wellで96well plateにまいた。これに上記と同様に、天然型HVJ−E、Fc−HN−HVJ−EおよびZZ−scIL12 結合型Fc−HN−HVJ−EHVJ−Eを、それぞれ10、50または100HAU(100μl培地中)を、ならびにIL−12を25pg、50pgおよび250pg(100μl培地中)をそれぞれ、各ウェルに加え24h 37℃でインキュベーションした。この96well plateを440×g、5minで遠心し、上清を回収し、上清中のIFN−γの量をELISAで測定した。その結果を図10に示す。天然型HVJ−EおよびFc−HN−HVJ−Eは、脾臓細胞のIFN−γ分泌を誘導せず、IL−12も殆どIFN−γ分泌を誘導しなかったが、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−EはIFN−γ分泌を誘導した(図10)。すなわち、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eの脾細胞からのIFN−γ分泌促進に関しては、IL−12とHVJ−Eとの相加効果を上回るものである。
マウスの背にF10メラノーマをの皮内注入し、その腫瘍径が2〜4mmになったところでZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E(HVJ−E:100HAU、IL−12:250pg)を2日おきに3回腫瘍内注射をし、その後の腫瘍径や免疫系活性化能を測定した。
ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E投与後の腫瘍体積の増大はほとんど認められず、天然型HVJ−Eと比較しても明らかに強い腫瘍増殖抑制が認められた(図11左図)。なお、本発明者らは、同様の方法で、通常のHVJ−Eが前立腺癌の腫瘍体積の増加をほぼ90%以上抑制するという事実を発表しているが(WO2005/094878)、これに用いたHVJ−Eは5000HAUという高用量であり、Fc−HN−HVJ−E+ZZ−scIL12が、HVJ−Eの力価として100HAUという低用量でメラノーマに対して同レベルの効果を呈するということは驚くべき事実であった。また、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E投与群の4個体中、2個体は完全に寛解した。このことから、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eは、100HAUという低容量でも強力な抗腫瘍作用を示すことがわかった。
マウス背部の皮内に5×105 cellsのF10メラノーマを注入し、腫瘍が約3〜5mmになった時点で、天然型HVJ−E100HAUまたはZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E(HVJ−E:100HAU、IL−12:250pg)を腫瘍内に2日おきに3回投与した。最終投与から10日後に各マウスの脾細胞を採取した。
マイトマイシンCで処理(15μg/ml、45min、37℃)したF10メラノーマを、採取した脾細胞に10:1の割合で混合し(脾細胞:F10=2×107:2×106(5ml))、37℃で48h インキュベートした後、脾細胞を回収し、Mouse IFN−γ Development Module(R&D)のプロトコールに従ってELISPOTアッセイを行った。なお、ELISPOTアッセイにおいては、メンブレン上での脾細胞とマイトマイシンC処理F10メラノーマとの比は、脾細胞:F10=3×105:0.2×104(100μl/well)で行い、インキュベーションの時間は24時間とした。
天然型HVJ−Eに比べてZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eは、約5倍以上のIFN−γ分泌誘導効果を示した(図12左図)。
また、Cr51リリーシングCTLアッセイにより、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E刺激脾細胞による免疫系活性化を調べた。Cr51リリーシングCTLアッセイは、常法にしたがい、下記の要領で実施した。F10メラノーマをマイトマイシンCで処理(15μg/ml、45min、37℃)後、上記採取した脾細胞とメラノーマを10:1割合で混合し(脾細胞:F10=5×107:5×106(20ml))、37℃で7日間インキュベーションした。この際、培地にはIL−2(final 10ng/ml)を添加しておき、インキュベーション4日後には10mlの培地(5ng/ml IL−2含有)を再度添加した。脾細胞を回収し、96well plateに2×106、1×106、5×105、2.5×105、1.25×105、0.625×105 cells/100μl/wellの2倍希釈系列を作製する。また、ポジティブコントロールとして1%NP−40溶液、ネガティブコントロールとしてRPMI培地を使用した。F10メラノーマを5×106 cells/0.2mlに調整し、1.85MBqの51Crを加え、37℃、45minインキュベーションし、F10メラノーマを洗浄して2×104cells/100μl/wellで脾細胞をまいたプレートに加え、4hインキュベーションした。そのプレートを1000rpm、5minで遠心後、各wellの上清を100μl回収し、51Crを測定した。
その結果、やはりZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eは、天然型HVJ−Eに比べてかなり強いCTL活性を示した(図12右図)。
ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−E(HVJ−E:100HAU、IL−12:250pg)、またはZZドメインを有していないためFc−HVJ−Eとは結合しないTag−scIL12(IL−12:250pg)とHVJ−E100HAUとの混合液とを、上記同様F10メラノーマを注入し腫瘍が約2〜4mmになったマウスに腫瘍内に2日おきに3回投与した。初回投与から14日目において、各マウスの腫瘍を観察し、完全に腫瘍が消失したマウスの割合を図13に示す。ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eを投与した群では30%以上で腫瘍が全く消失し、それ以後再発することなく90日後でも生存していた。一方、Fc−HN−HVJ−Eと結合しないTag−scIL12とFc−HN−HVJ−Eとを共投与した群では、5%程度しか腫瘍寛解が認められなかった(図13)。このことから、IL−12とHVJ−Eとが結合して複合体を形成することで強い抗腫瘍活性を示すことがわかった。
このことは、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eの抗癌作用は、IL−12とHVJ−Eとが結合して複合体を形成した状態で癌細胞に作用することによって、IL−12とHVJ−Eというそれぞれに抗癌作用を奏するものの単なる組合せによる効果の増大を大きく上回るということを示している。
上記と同様、ZZ−scIL12結合型Fc−HVJ−Eを投与した場合と、同量のscIL12とHVJ−Eとを結合していない状態で併用投与した場合とにおける、脾細胞からのIFN−γ分泌促進刺激を調べた。F10メラノーマを注入し腫瘍が約3〜5mmになったマウスに腫瘍内に、HVJ−E単独、Fc−HVJ−E+ZZscIL12複合体(250pg scIL12/100HAU HVJ−E、またはFc−HVJ−EとTagscIL−12との混合液(250pg scIL12/100HAU HVJ−E)を、10、50または100HAU HVJ−Eを、2日おきに3回投与した。最終投与から10日後に各マウスの脾細胞を採取し、脾細胞から分泌されたIFN−γを定量した(図14)。その結果、高濃度投与時においては結合型、非結合型共に同程度に高いIFN−γ分泌を誘導するが、低濃度投与時においては結合型の方が非結合型と比較して高いIFN−γ分泌誘導を引き起こすことが明らかとなった。
Claims (22)
- HVJのHNタンパク質のN末端部分アミノ酸配列からなる改変HNタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が140〜180アミノ酸の長さを有する、改変HNタンパク質。
- 下記(1)または(2)のポリペプチドである、請求項1記載の改変HNタンパク質:(1)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号6の第1〜160アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つHVJに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。 - 請求項1または2に記載の改変HNタンパク質の残基及び第1の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変HNタンパク質残基のC末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質。
- 機能性ポリペプチドがIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドである、請求項3記載の融合タンパク質。
- IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドが一本鎖IL−12である、請求項4記載の融合タンパク質。
- 一本鎖IL−12が、下記(1)または(2)のポリペプチドである、請求項5記載の融合タンパク質:
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチド。 - 機能性ポリペプチドが抗体の定常領域(Fc)のCH2−CH3ドメインである、請求項3記載の融合タンパク質。
- 抗体の定常領域(Fc)のCH2−CH3ドメインがIgG2aに由来するものである、請求項7記載の融合タンパク質。
- 抗体の定常領域のCH2−CH3ドメインが、下記(1)または(2)のポリペプチドである、請求項8記載の融合タンパク質:
(1)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号4の第171〜389アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインAとの結合活性を有するポリペプチド。 - 請求項1または2に記載の改変HNタンパク質、又は請求項3〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の第1の融合タンパク質、並びにプロテインAのZZドメイン及び第2の機能性ポリペプチド残基を含む第2の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質とが、第1の融合タンパク質に含まれるCH2−CH3ドメインと第2の融合タンパク質に含まれるZZドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体。
- 第2の機能性ポリペプチドが、一本鎖IL−12である、請求項11記載のタンパク質複合体。
- 一本鎖IL−12が、下記(1)または(2)のポリペプチドであり、且つZZドメインが、下記(3)または(4)のポリペプチドである、請求項12記載のタンパク質複合体:
(1)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2の第103〜625アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つIFN−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
(3)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、(4)配列番号2の第42〜99アミノ酸に該当するアミノ酸配列において1または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域(Fc)への結合活性を有するポリペプチド。 - 請求項1または2に記載の改変HNタンパク質、請求項3〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または請求項11〜13のいずれか1項に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、HVJ−E。
- 請求項5もしくは6に記載の融合タンパク質または請求項12もしくは13に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、請求項14記載のHVJ−E。
- IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドをHVJのHNタンパク質のN末端部分アミノ酸配列からなる改変HNタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が140〜180アミノ酸の長さを有する、改変HNタンパク質のC末端に融合または結合させる形で担持する、HVJ−E。
- IFN−γ分泌促進能を有するポリペプチドが、IL−12である、請求項16記載のHVJ−E。
- IL−12が一本鎖IL−12である、請求項17記載のHVJ−E。
- 請求項5もしくは6に記載の融合タンパク質または請求項12もしくは13に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、請求項17記載のHVJ−E。
- 請求項16〜19のいずれか1項に記載のHVJ−Eを有効成分として含む、抗癌剤。
- メラノーマ、前立腺癌、膀胱癌および大腸癌からなる群より選択される癌の治療または予防に用いられる、請求項20記載の抗癌剤。
- 1回当たりの投与量が、HVJ−Eとして1000HAU以下であり、かつ該HVJ−EにHVJのHNタンパク質のN末端部分アミノ酸配列からなる改変HNタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が140〜180アミノ酸の長さを有する、改変HNタンパク質のC末端に融合または結合させる形で担持されるIL−12として100pg以下であることを特徴とする、請求項17〜19のいずれか1項に記載のHVJ−Eを有効成分として含む抗癌剤。
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