JP2004002461A - 表面複合リンホトキシン - Google Patents

Abstract

【課題】　抗炎症剤、腫瘍浸潤性リンパ球のエンハンサー、腫瘍増殖阻害剤、Ｔ細胞阻害剤およびＴ細胞活性化剤を提供すること。
【解決手段】　Ｎ末端部分に（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ、または、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎのアミノ酸配列を有する（６番目の位置における配列はＧとＬの混合であり、このことは多型性の可能性を示す）、ポリペプチド、またはこのポリペプチドとリンホトキシンとの複合体、またはこれらポリペプチドもしくは複合体に対する抗体、あるいはこれらポリペプチドもしくは複合体により媒介される事象を阻害するインヒビター。

Description

　本発明は、リンパ球および他の細胞型によって産生されるタンパク質ならびにそのタンパク質とリンホトキシン（ＬＴ）で形成される複合体に関する。より詳細には、本発明は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞系およびリンホカイン活性化キラー細胞の表面で同定される膜関連タンパク質であるｐ３３、ならびにｐ３３がＬＴと結合するときに生成する複合体に関する。本発明のｐ３３タンパク質は、細胞内に形成されるＬＴを細胞表面に保持するために有用であると考えられ、細胞表面において、ｐ３３／ＬＴ複合体は炎症調節剤、腫瘍増殖阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、Ｔ細胞活性化剤またはＨＩＶ調節剤として作用し得る。さらに、ｐ３３／ＬＴ複合体の抗腫瘍活性を、ｐ３３の遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞に及ぼし得る。

　本願に記載された発明は、米国国立衛生研究所からの補助認可ＣＡ３５６３８−０７−１０に基づいた研究の過程でなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

　腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とリンホトキシン（ＬＴ）は、当初その腫瘍の増殖を阻害する能力について注目された可溶性タンパク質である（Ｌ．Ｏｌｄ，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０巻，６３０頁，１９８５）。その後の研究によって、この両方のタンパク質は広範囲の活性をもっていることが実証された。例えばＴＮＦは、代謝制御の特異的な局面、エンドトキシンショックに対する応答、および造血細胞発生の調節に重要な役割を果しているようである（Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒら、「Ｔｈｅ　Ｈｉｓｔｏｒｙ，　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ」，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７巻，１９８８年；Ｍ．Ａｋａｓｈｉら，「Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｌｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」，Ｂｌｏｏｄ，７４巻，２３８３頁，１９８９年　Ｇ．Ｒｏｏｄｍａｎら，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ　ａｎｄ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」：Ｅｆｆｅｃｔｓ　Ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ＣＦＵ−Ｅ　Ａｎｄ　ＢＦＵ−Ｅ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｋ５６２，ＨＬ６０，Ａｎｄ　ＨＥＬ　Ｃｅｌｌｓ」，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５巻，９２８頁，１９８７年）。ＩＬ−１およびＩＬ−６とともに、ＴＮＦは炎症応答の主要な媒介因子（ｍｅｄｉａｔｏｒ）でもある［Ｄ．Ｃａｖｅｎｄｅｒら，「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌ１　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｂｙ　ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ」，Ａｍｅｒ．Ｊｏｕｒ．Ｐａｔｈ．，１３４巻，５５１頁，１９８９年；Ｒ．Ｃｏｔｒａｎら，「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｉｔｓ　Ｒｏｌｅ　Ｉｎ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ社，　Ｓｉｍｏｎｅｓｃｕ＆Ｓｉｍｏｎｅｓｃｕ編集，１９８８年，３３５頁）］。またＴＮＦはある条件下でＴ細胞の活性化に関与しているようである（Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら，「Ｔｈｅ　Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ−α　Ａｎｄ　−β　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４１巻，４９９頁，１９８８年；Ｎ．Ｄａｍｌｅら，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＩＬ−４　ＡＮＤ　ＴＮＦ−α　Ｄｕｒｉｎｇ　ＣＤ３−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ＣＤ３−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」，Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．，８巻，８５頁，１９８９年；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ−α　Ａｓ　Ａ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｆｏｒ　Ａｎ　ＩＬ−２−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ：Ｓｔｒｉｃｔ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ」，Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ，ｌｍｍｕｎ．、１４２巻，１２０３頁，１９８９年；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　α／Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ　Ｉｓ　Ａ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｆｏｒ　Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ」，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７巻，１４７２頁，１９８８年；Ｐ．Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈら，「Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）−α：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　ＴＮＦ−α−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｐｏｎｅｓｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１３８巻，１７８６頁，１９８７年）。

　ＬＴもほぼＴＮＦと類似した多くの活性をもっているが完全に同一ではなく、その活性には、腫瘍壊死性、抗ウイルス状態の誘発、多形核白血球の活性化、内皮細胞でのクラスＩの主要組織適合遺伝子複合体抗原の誘導、内皮細胞での接着分子の誘導、および成長ホルモンの刺激が含まれる（Ｎ．ＲｕｄｄｌｅとＲ．Ｈｏｍｅｒ，「Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ，４０巻，１６２〜１８２頁，１９８８年）。

　近年、ＴＮＦとＬＴの両者の遺伝子が単離およびクローニングされ、完全に特性が決定されて、両タンパク質の組換え形のものが入手できるようになっている（Ｐ．Ｇｒａｙら，「Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，Ａ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｗｉｔｈ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｎａｔｕｒｅ，３１２巻，１２１〜１２４頁，１９８４；Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａら，「Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ：Ｐｒｅｃｕｓｏｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　Ｔｏ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ　３１２巻，７２４頁，１９８４年）。

　ＴＮＦは幾つかの種類の細胞、例えば単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって産生される（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌら，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ　：Ｇｅｎｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１巻，５９７頁，１９８６年；Ｄ．Ｓｐｒｉｇｇｓら，「Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１巻，４５５頁，１９８８年；Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒら，「Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　Ｆｒｏｍ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ａｎｄ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　Ｃａｎ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１７巻，１８０７頁，１９８７年）。リンホトキシンの分泌は、活性化されたＴ細胞とある種のＢ−リンパ芽球性腫瘍だけの特異的な性質のようである（Ｎ．Ｐａｕ１ら，「Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ，，６巻，４０７頁，１９８８年）。

　また研究者達は、トランスメンブランタンパク質または受容体結合分子のいずれかとして各種の細胞表面に結合しているマウス型とヒト型のＴＮＦを検出している（Ｂ．Ｌｕｅｔｔｉｇら，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　Ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｔｗｏ　Ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ：Ａｎ　Ｉｎｔｅｇｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ａ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ａｔｔａｃｈｅｄ　Ｔｏ　Ｉｔｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４３巻，４０３４頁、１９８９年；Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，「Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｆｏｒｍ　ｏｆ　ＴＮＦ／Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ　Ｉｓ　ａ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＴＮＦ」，Ｃｅｌｌ，５３巻，４５〜５３頁，１９８８年；およびＭ．Ｋｉｎｋｈａｂｗａｌａら，「Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ａｄｄｉｔｉｏｎ　Ｔｏ　ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ」，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１巻，９４１〜９４６頁，１９９０年）。また、幾人かの研究者は、膜関連型のリンホトキシンはある種の環境下にてリンパ球の表面で発現させ得ることを示した（Ｊ．Ｈｉｓｅｒｏｄｔら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ（ＬＴ）　Ｏｎ　Ｍｉｔｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ａｎｔｉ−ＬＴ　Ａｎｔｉｓｅｒａ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ」，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎ．，３４巻，３２６−３３９頁，１９７７年；Ｃ．Ｗａｒｅら，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１２６巻，１９２７−１９３３頁，１９８１年；Ｕ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２３巻，２３３頁，１９８９年；Ｙ．Ａｂｅら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ，，８２巻，２３頁，１９９１年）。

　本発明の発明者らは、細胞内で産生されるＬＴを細胞膜上で標的とする新規な表面タンパク質ｐ３３を同定した。ｐ３３とＬＴは細胞膜で複合体（本願全体を通じて「ｐ３３／ＬＴ」と呼ぶ）として出現する。ｐ３３／ＬＴ複合体は、可溶性のＬＴタンパク質とＴＮＦタンパク質に類似した細胞溶解および細胞調節の活性を示す。ｐ３３タンパク質はＬＴに対して特異的な新規な受容体である（ｐ３３はＴＮＦと結合しない）。ＬＴと複合した膜関連ｐ３３は、１つの複合体として、Ｔ細胞が他の細胞と相互作用するための新規なリガントであり、標的細胞を溶解するのに有用である。

　（発明の要旨）
　本発明の新規なタンパク質をｐ３３と命名した。このタンパク質は、数種類のリンパ球細胞、すなわちＯＫＴ３で刺激された一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンおよびＰＭＡで刺激されたヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７の表面上に見い出される。それは、新規なＬＴとの複合体を形成する。

　ｐ３３は、免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定して分子量が３１〜３５ｋＤであり、Ｎ−連結グリコシル化性を示す。さらにこのタンパク質は、メチオニンとシステインの残基の両方を含有し、ＣＮＢｒで切断すると、メチオニン残基がＮ末端もしくはＣ末端の１〜２ｋＤ以内に位置していることが示される。

　細胞膜上のｐ３３は細胞内で産生されたＬＴと結合するので、細胞膜上にＬＴを標的とする。ｐ３３が存在しないと、ＬＴは細胞周囲の媒体中に分泌される。本発明のｐ３３／ＬＴ複合体および他のペプチド複合体（両者ともに非細胞関連性のもので細胞の表面にある）は、ＣＨＯ細胞中に発現された組み換えリンホトキシン（ｒＬＴ）に対して誘発されるポリクローナル抗血清、または天然のＬＴに対して誘発されるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）によって認識される。さらに、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体と他のポリペプチド複合体を認識する抗血清は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、すなわち同種刺激（すなわち、他の個体からのＴリンパ球の導入、これは「応答個体」のリンパ球によって異種（非自己）であると認識される）に対して期待されるＴリンパ球の増殖応答の標準的免疫検定法を妨害する［例えば、Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら，「Ｔｈｅ　Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ−α　ａｎｄ　−β　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｊ，Ｉｍｍｕｎ．，１４１巻、４９９頁，１９８８年参照）。

　細胞から単離されたｐ３３／ＬＴ複合体由来のＬＴタンパク質は配列決定を行うと、分泌されたリンホトキシンについて報告されている配列と正確に一致する配列、すなわち（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒが得られる（Ｐ．Ｇｒａｙら，「Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，Ａ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｗｉｔｈ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｎａｔｕｒｅ，３１２巻，１２１〜１２４頁，１９８４年）である。しかし本発明のｐ３３／ＬＴ複合体および他のポリペプチド複合体は、ヒトもしくは動物のリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシンおよびその活性フラグメントを含有し得る。

　本発明のｐ３３タンパク質および関連ポリペプチドのＮ末端部分は（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ、または、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎのアミノ酸配列を有している。６番目の位置における配列はＧとＬの混合であり、このことは多型性の可能性を示す。本発明のｐ３３タンパク質および他のポリペプチドは、これらの配列の一方または両方を有し得る。

　本発明の発明者らは、本発明のポリペプチド複合体が、Ｔ細胞活性化現象において重要であり、ならびにＴ細胞の活性化またはＴ細胞の抑制を行う組成物と方法、および炎症を治療するために用いる治療剤、または腫瘍細胞増殖もしくは新生物増殖の阻害のような細胞溶解活性を必要とする用途に有用であると考える。また、本発明の発明者らは、本発明のポリペプチド複合体は、腫瘍浸潤性リンパ球（「ＴＩＬ」）治療法において腫瘍浸潤性リンパ球の殺腫瘍特性を増強することを含む細胞性免疫療法に重要であると考える。またｐ３３に対する抗体、それに関連するポリペプチド、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体または他のポリペプチド複合体は、ＬＴと特定の受容体との重要な相互作用を阻害するので、公知のＴＮＦ受容体型によって媒介される現象以外の、ＬＴで媒介される現象に特異的に作用する。同様に、ＴＮＦ、ＬＴもしくはｐ３３／ＬＴに対する受容体、またはそれらの誘導体（例えば可溶性受容体免疫付着因子）は、本発明のポリペプチドおよび複合体を阻害するのに用いられ得る。

　本発明は、以下を提供する：
　項目１．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、細胞に結合されていないポリペプチド。

　項目２．さらに分子量が３１から３５ｋＤである、項目１に記載のポリペプチド。

　項目３．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードして発現させるＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＡＮ。

　項目４．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードして発現させるＤＮＡ配列を有する、組換えＤＮＡ分子。

　項目５．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードして発現させるＤＮＡ配列でトランスフェクトされた、培養単細胞宿主または動物およびヒト細胞の群から選択される、宿主。

　項目６．腫瘍浸潤性リンパ球、リンホカインで活性化されたキラー細胞およびキラー細胞の群から選択される、項目５に記載の宿主。

　項目７．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの生成方法であって、形質転換された項目５に記載の宿主を培養し、次いで、該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法。

　項目８．アミノ末端部分が、（配列番号２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（配列番号３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、細胞に結合されていないポリペプチド複合体。

　項目９．非リンホトキシンポリペプチドの分子量が、３１から３５ｋＤである、項目８に記載の複合体。

　項目１０．項目７に記載の方法で生成されたポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、細胞に結合されていないポリペプチド複合体。

　項目１１．リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、項目８〜１０のいずれかに記載の複合体。

　項目１２．リンホトキシンエピトープの量を、上記エピトープを産生し分泌する細胞の表面に増大させる方法であって、項目３に記載のＤＮＡ配列で上記細胞をトランスフェクトし、そして上記ＤＮＡを細胞で発現させる工程を包含する、方法。

　項目１３．腫瘍浸潤性リンパ球の標的とする腫瘍を殺す活性を増大する方法であって、上記リンパ球を項目３に記載のＤＮＡ配列でトランスフェクトし、そして形質転換されたリンパ球を患者に導入する工程を包含する、方法。

　項目１４．前記形質転換されたリンパ球を、項目３に記載のＤＮＡ配列によるトランスフェクションの前または後に、リンホカインとともにインキュベートする、項目１３に記載の方法。

　項目１５．前記リンホカインが、ＩＬ−２である、項目１４に記載の方法。

　項目１６．前記リンパ球を、最初患者から単離し、次に同じ患者に導入して戻す、項目１３〜１５のいずれかに記載の方法。

　項目１７．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を含有する、ＨＩＶ感染症の拡大、重篤症状もしくは免疫不全作用を阻止もしくは軽減する、組成物。

　項目１８．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を含有する、ＨＩＶ感染症の拡大、重篤症状もしくは免疫不全作用を阻止、治療または軽減する、方法。

　項目１９．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を含有する、新生物の拡大、重篤症状もしくは作用を阻止、治療もしくは軽減する、組成物。

　項目２０．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を投与することを包含する、新生物の拡大、重篤症状もしくは作用を阻止、治療もしくは軽減する、方法。

　項目２１．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を含有する、炎症もしくは炎症性疾患の拡大、重篤症状もしくは作用を阻止、治療もしくは軽減する、組成物。

　項目２２．項目１または項目２に記載のポリペプチド、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド複合体、および上記ポリペプチドのいずれかに対する複合体からなる群より選択されるポリペプチドの有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を投与することを包含する、炎症もしくは炎症性疾患の拡大、重篤症状もしくは作用を阻止、治療もしくは軽減する、方法。

　（発明の詳細な説明）
　本願に記載された発明を十分に理解し得るように、以下に詳細な説明を述べる。

　本発明は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。また好ましくは、このポリペプチドは３１〜３５ｋＤの分子量を有する。最も好ましくは、それはｐ３３である。本発明のポリペプチドは細胞表面に関連あるいは無関連で有り得る。

　本発明のポリペプチド複合体は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎおよび（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびリンホトキシンを含有する。その複合体としてさらに好ましいのはｐ３３／ＬＴである。これらの複合体は細胞と関連、あるいは無関連であり得る。

　本発明のポリペプチド複合体は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現された組換えリンホトキシン（ｒＬＴ）に対して誘発される多特異的（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗血清および市販の抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）によって認識されるもので、これはこの複合体がＬＴエピトープを示すことを意味する。さらに、この複合体を認識する同じモノクローナル抗血清が混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻止するが、モノクローナル抗ｒＬＴ抗体はＭＬＲを阻止しないので、本発明の複合体はＴ細胞の活性化に重要な役割を果たしているようである。また本発明の発明者らは、これらの複合体が可溶性ＬＴもしくはＴＮＦと類似のＴ細胞調節活性および細胞毒性活性を有していると考えている。

　また本発明は、前記アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードして発現させるＤＮＡ配列で特に構成されたＤＮＡ、そのＤＮＡで特徴づけられる組換えＤＮＡ分子、そのＤＮＡでトランスフェクトされた培養物中の単細胞宿主もしくは動物およびヒトの細胞の群から選択される宿主、およびそのＤＮＡおよび上記組換えＤＮＡ分子と宿主とを使用して、そのＤＮＡにコードされたポリペプチドを産生する組換え方法に関する。

　（流動細胞蛍光分光分析法）
　本発明の発明者らは、まず第一に、流動細胞蛍光分光分析法を用いて、Ｔ細胞表面におけるＬＴ関連エピトープの発現を実証した。本発明の発明者らは、ＯＫＴ３モノクローナル抗体で活性化されたヒト末梢血単核細胞が、抗ｒＬＴ抗血清と反応することによって、ＬＴ関連エピトープの発現を示すことを観察した。抗ｒＬＴ血清だけがＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞に結合し、抗ｒＴＮＦ血清は結合しなかった。

　また本発明の発明者らは、ヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７（Ｃ．Ｗａｒｅら、「Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ａｎｄ　Ｋｉｌｌｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｂｙ　Ａｎｔｉ−ＣＤ３　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｏｒ　Ｌｅｃｔｉｎｓ　Ａｎｄ　Ｐｈｏｒｂｏｌ　Ｅｓｔｅｒ」，Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．，５巻、３１３頁、１９８６年）、ＰＭＡによる刺激で分泌されるＬＴおよびＰＭＡ刺激によって発現される表面ＬＴ関連エピトープを観察した。また本発明の発明者らは、ＰＭＡで活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞は、ＬＴを中和する抗体をウサギ抗ｒＬＴ抗血清から除去することができるが、対照のＵ９３７細胞（全ての表面ＬＴ型を欠いている）は除去できないことを実証した。本発明の発明者らは、さらに細胞受容体を過剰の可溶性ＴＮＦもしくはＬＴで飽和させ、このことが染色に対して全く影響を与えないということを観察することによって、ウサギ抗ｒＬＴ抗血清がウサギＬＴと結合した（複合した）（生成した複合体は次にＩＩ−２３．Ｄ７細胞上の細胞ＬＴ／ＴＮＦ受容体と結合する）という可能性を除外した。これらの検定により、このハイブリドーマのＬＴ関連エピトープが真にＬＴと関連していることが実証ざれる。

　本発明の発明者らはまた、抗血清を過剰なｒＬＴで前処理を行うと、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を染色する抗血清の能力を阻害するが、ｒＴＮＦで前処理を行っても全く影響がないことを観察した。この検定結果は、リンホトキシン関連エピトープに対する抗血清の特異性を実証した。

　刺激されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、染色する前にトリプシン処理したところ、そのシグナルが失われた。このことは抗血清によって認識されるエピトープがタンパク質であることを実証している。

　また、本発明の発明者らは、ＬＴ遺伝子で安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（可溶性ＬＴのみを産生する）が抗ＬＴ抗血清で染色されないことを示すことによって、ＣＨＯ由来の混入物は、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面に誘導されたタンパク質を抗血清が認識することに寄与していないことを実証した。

　（免疫沈降）
　本発明の発明者らはさらに、これらの表面ＬＴ関連タンパク質を次のようにして特性を決定した。すなわちＰＭＡで活性化したＩＩ−２３．Ｄ７の表面ヨウ素化（^１２５Ｉ標識化）を行うかまたは代謝標識化（^３５Ｓ−Ｍｅｔもしくは^３５Ｓ−Ｃｙｓ）を行い、次いで細胞膜を界面活性剤で可溶化し、そして標識されたＬＴ関連タンパク質を免疫沈降させた。

　表面ヨウ素化法と免疫沈降法を組合せることによって、抗ＬＴ抗血清によって認識される２つのタンパク質、すなわち２５〜２６ｋＤ型（以後ＬＴと呼ぶ）および３１〜３５ｋＤ型（以後ｐ３３と呼ぶ）が明らかになった。本発明の発明者らは、同じウサギ由来の免疫前血清と抗ｒＴＮＦウサギ血清はいずれも、ヨウ素化されたＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来のこれらのバンドを免疫沈降させないことを観察した。ヨウ素化されて免疫沈降されたバンドの一次元部分ＣＮＢｒペプチドマッピングは、２５〜２６ｋＤ型（ＬＴ）が、ヨウ素化された組換えＬＴと同じパターンで切断されることを示したが、このことはＬＴと可溶性ＬＴの相関関係を強めている。ヨウ素化された３１〜３５ｋＤ型（ｐ３３）はＣＮＢｒによっては切断されなかった。このことはヨウ素化された３１〜３５ｋＤ型が公知のＬＴ遺伝子産物とは異なることを示している。

　さらに本発明の発明者らは、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインで代謝標識化し、次いで免疫沈降させることによって、前記ＬＴとｐ３３のタンパク質の特性を決定した。システインおよびメチオニンの分布は、ＴＮＦとＬＴの識別および各々の型の識別を、それらのシグナル配列の有無に関わらず行う方法を提供する（Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、「Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｆｏｒｍ　Ｏｆ　ＴＮＦ／Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ　Ｉｓ　Ａ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｏｆ　ＴＮＦ」，Ｃｅｌｌ，５３巻、４５頁、１９８８年）。分泌されたＴＮＦはシステインを含有しているがメチオニンは含有していない。一方分泌されたＬＴはメチオニンだけを含有し、システイン残基を含有していない。しかしＬＴはそのシグナル配列中に１つのシステイン残基を有しているが、ＴＮＦはそのシグナル配列中に２つのメチオニン残基を有している。

　本発明の発明者らは、ＰＭＡで処理したＩＩ−２３．Ｄ７細胞の別の培養物を^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインで標識化し、その培養培地およびその細胞から、免疫反応性タンパク質を沈降させた。次にその免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付したところ、^３５Ｓ−メチオニンで標識した細胞の培地由来の免疫沈降物は２５ｋＤ型のＬＴを示し、一方^３５Ｓ−システインで標識した細胞の培地由来の免疫沈降物は分泌されたＬＴに対して想定されるパターンを示さなかった。洗浄したこれらの細胞を分析したところ、２５〜２６ｋＤ　ＬＴ型および３３ｋＤ　ｐ３３型の両方を示した。これらの結果は、表面ヨウ素化法を用いて観察した膜関連型と一致した。

　２５〜２６ｋＤＬＴはシステインを欠いていたが、これはリーダー配列のプロセシングを示す。また本発明の発明者らは、３３ｋＤ　ｐ３３が、^３５Ｓ−メチオニンと^３５Ｓ−システインの両者を組込み、それ自体２５ｋＤ　ＬＴ型とは異なるものと識別することを観察した。典型的には、その受容体に結合したＬＴは、ＢＯＳＣＯＥＳ（すなわちビス［２−［スクシンイミドオキシカルボニルオキシ］エチル］スルホン；米国、イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ社）のような化学的リンカーを用いて受容体に架橋結合させることができる（Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｒｅｗｓら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｔｕｍｏｒ−Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ（ＬＴ）　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４４巻、２５８２頁、１９９０年）。本発明の発明者らは、表面をヨウ素化したＩＩ−２３．Ｄ７細胞を架橋剤で処理したとき、２５〜２６ｋＤ　ＬＴもしくは３３ｋＤ　ｐ３３の関連型と別の膜タンパク質との間に関連性はないことを観察した。この検定によって、受容体結合が、ＬＴとｐ３３が細胞膜と結合した状態で維持される機序ではないことが実証された。さらにｐ３３の部分配列の分析結果は、２つのＴＮＦ受容体型のいずれとも関連がないことを示した（Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８巻、１０１９頁、１９９０年；Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ，６１巻、３６１頁、１９９０年）。

　（アフィニティークロマトグラフィー）
　さらにアフィニティークロマトグラフィーによって、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のｐ３３とＬＴのタンパク質の特性決定を行った。我々、本発明の発明者らは、ＰＭＡで処理されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のｐ３３とＬＴがヒラマメのレクチンに結合することを観察したが、このことは各型の糖タンパク質の構造を示している。従って、ヒラマメレクチン・クロマトグラフィーの工程を抗血清アフィニティークロマトグラフィーの前の精製工程として利用した。我々は、ＰＭＡで処理したＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質を界面活性剤で可溶化し、これをヒラマメレクチン・セファロースに結合させ、α−メチルマンノシドで溶離した。我々は、抗ＬＴ抗血清によって特異的に認識される前記のタンパク質を正確に評価するために、対照のＩｇＧと抗ＬＴ−ＩｇＧのアフィニティーカラムを調製した。次にヒラマメレクチンに結合したタンパク質をこれらのカラムに塗布した。我々は、これらのカラムを低ｐＨで溶離したところ、抗ＬＴアフィニティーカラムから、ｐ３３とＬＴのタンパク質が放出されることを観察した。その溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、表面をヨウ素化したＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来の免疫沈降タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果とよく似ていた。この比較によって、同様のタンベク質が上記の２つの方法によって精製されることが実証された。

　我々は、アフィニティー精製中に約２５ｋＤのＬＴ型が、１９〜２０ｋＤ型もしくは「ｄｅｓ２０」型に切断されるようであることを観察した。ＲＰＭＩ　１７８８腫瘍細胞系（Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌら、「Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｆｒｏｍ　１７８８　Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０巻、２３３４〜２３４４頁、１９８５年）から天然ＬＴを最初に単離するときにも、Ｎ末端が切断された２０ｋＤ　ＬＴ型が得られた。この「ｄｅｓ−２０」天然ＬＴ型中のメチオニンの３つのうちの１つが失われ、無傷の分子とは異なるＣＮＢｒ切断パターンを示す。アフィニティー精製を行ったＬＴタンパク質の一次元ＣＮＢｒ消化を行ったところ、端を切取られた天然ＬＴ型と一致した切断パターンが実証されたので、我々は、アフィニティー精製に付した「ｄｅｓ−２０」ＬＴ型は、恐らく、天然ＬＴ「ｄｅｓ−２０」型について観察されたのと類似の切断からもたらされるものと結論した。

　我々はさらに、ｐ３３の部分ＣＮＢｒ切断を行うとダブレットが生成することを観察した。ｐ３３タンパク質が起こしたこの切断パターンは、１つのメチオニン残基が存在し、その含有されているメチオニンは、Ｃ末端もしくはＮ末端から５〜２０の残基の範囲内に存在することを実証した。このパターンは、ｐ３３が公知のＬＴ配列全部を含有していないことを示唆した。

　我々は、ｐ３３タンパク質がさらに、抗原で活性化された一次細胞毒性Ｔリンパ球クローンによって発現されることを観察した。これらの細胞に代謝標識し、次いで抗ｒＬＴによって免疫沈降したところ、少量のＬＴとともにｐ３３が生成した。これらの結果によって、ｐ３３が一次Ｔ細胞とＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマで形成されることが実証された。

　（ｐ３３とＬＴタンパクの初期精製）
　我々は、次の一般的な工程を用いてこれらのＬＴおよびｐ３３タンパク質を精製した。我々は、最初に、ホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）をＩＩ−２３．Ｄ７細胞に添加した。２４時間後、我々はその細胞を収集して、血清を含有しない冷却されたＲＰＭＩ培地で洗浄した。冷却した細胞のペレットに氷冷溶菌緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＮＰ−４０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌおよびアジ化ナトリウム）を加え、次ぎにべンズアミジン、フェニルメチルスルホニルクロリド（ＰＭＳＦ）およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ダイズトリプシンインヒビター、ペプスタチンおよびアプロチニンを新たに添加した。細胞をダウンスホモジナイザーでゆるやかに均質化し、得られた細胞溶解物を遠心分離した。上清を遠心分離して上清を集めた。得られた上清を、ＣａＣｌ_２とＭｎＣｌ_２を予め添加した溶菌緩衝剤と平衡化させたヒラマメレクチンセファロースカラムに注入した。ＣａＣｌ_２とＭｎＣｌ_２を含有する溶菌緩衝液でカラムを洗い、次にα−メチルマンノシドを含有する溶菌緩衝液で溶解した。溶出液画分をプールし、ウサギ抗ｒＬＴセファロースアフィニティーカラムに直接接続されたウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフィニティーカラムに直接注入した。両方のカラムを、ＥＤＴＡを含有する同じ溶菌緩衝液で洗浄し、次に、ＮＰ−４０の代わりにＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いた溶菌緩衝液で洗浄した。上記の洗浄したカラムを、個々に、ＭＥＧＡ−８、グリシン、ＮａＣｌ、ベンズアミジンおよびＥＤＴＡの溶液で溶離した。ｐＨシフトを行ってから初めての画分をプールし、凍結乾燥し、ＳＤＳ含有の水に再懸濁させ、ＨＥＰＥＳおよびＳＤＳの溶液に対して透析した。得られた透析画分をｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥し水に再度懸濁させた。得られた懸濁液の一部をＬａｅｍｍｌｉ充填緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動を行った。そのタンパク質を銀染色法で目視可能にした。

　我々は、ＰＭＡの処理で起こるような細胞活性化の後でのみ、ＬＴエピトープがＩＩ−２３．Ｄ７Ｔ細胞ハイブリドーマの表面上に存在することを観察した。これに反して一次Ｔ細胞上に存在している場合、ＰＭＡで処理すると表面抗原が失われる。その上に、我々は、組換えＬＴ（ＣＨＯ細胞中に産生される）および天然ＬＴ（例えば米国、マサチューセッツ州、ボストン、Ｇｅｎｚｙｍｅ社）に対するポリクロナール抗血清およびウサギ抗ヒト−リンホトキシン抗血清はＬＴエピトープを認識するということを見出した。

　また我々は、ｐ３３とＬＴを認識する我々の抗血清はＭＬＲを阻止するが、可溶性ＬＴを認識する特定のモノクローナル抗体はＭＬＲを阻止しないことを観察した（Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、「Ｔｈｅ　Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ−α　Ａｎｄ　−β　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４１巻、４９９頁、１９８８年）。それ故に、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体はＴ細胞活性化の媒介因子であり得る。

　細胞溶解物から得られた免疫沈降物中に、ｐ３３がＬＴとともに存在しているということは、ｐ３３が抗原的にＬＴに関連しているか、もしくはｐ３３がＬＴに結合されているか、またはその両方であることを示唆している。この問題点に取組むために、^３５Ｓ−メチオニンで標識した細胞由来の２５ｋＤと３３ｋＤのバンドをウサギポリクローナル抗ｒＬＴ血清で免疫沈降させ、切取ったゲルのスライスから溶離し、抗ｒＬＴのポリクローナル血清もしくはｍＡｂで再度免疫沈降を行った。ＬＴはいずれの抗ｒＬＴ抗体でも免疫沈降されたが、ｐ３３は免疫沈降されなかった。このことはｐ３３が抗原的にＬＴに関連していないことを示唆している。これらの観察結果は、ｐ３３が物理的にＬＴと関連していることを示した。

　表面ＬＴとｐ３３が複合体を形成するという仮説をさらに研究するために、我々は、未変性条件と変性条件下で等電点電気泳動法（ＩＥＦ）の実験を行った。その理由は、ＬＴとｐ３３が物理的に結合しているならば、未変性条件下で複合体として集まるが、変性条件下では別々の物質として集まるはずであるからである。ＬＴとｐ３３に対して別個の等電点（ｐＩ）が、二次元のゲル分析（変性条件）によって測定された（図９Ａ）。ＬＴ（ｐ２５）には、ｐＩが６．５〜７．３の範囲内にある５つの荷電異性体があり、一方ｐ３３には、ｐＩが５．５〜６．０の範囲内にある４つの荷電異性体がある。しかし未変性条件下で等電点電気泳動法を実施したとき、ＬＴとｐ３３はともにｐＩが６．３〜７．２の範囲内にある広いバンドとして集まった（図１０Ａ、６〜８のレーン）。それ故に、ｐ３３の泳動は未変性条件では有意に遅れた。

　（ＬＴとｐ３３のさらなる精製と同定）
　我々は、その後、下記の一般的な工程を利用してこれらのＬＴとｐ３３のタンパク質を精製した。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞をウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地内で増殖させ、５０　ｌのＲＰＭＩから細胞を集め、その細胞を培地中に再度懸濁させ、次にホルボールミリストイルアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間活性化した後、遠心分離によって細胞を集め、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水で洗浄した。この最終の細胞ペレットを冷溶菌緩衝液に懸濁させ、そのペレットを一回、窒素キャビテータ（ｃａｖｉｔａｔｏｒ）に通過させた。溶解された細胞を遠心分離し上清を排棄した。得られたペレットを、界面活性剤含有の溶菌緩衝液中で一夜抽出し、再度遠心分離に付した。

　界面活性剤で可溶化された膜を含有する上清を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（１０）に結合させたモノクローナル抗リンホトキシンで構成されたアフィニティー樹脂に添加し、その懸濁液を一夜振撮させた。上記樹脂を小さなカラム内に集めてｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０含有のＨＥＰＥＳで洗浄し、次いで、１％　Ｗ／Ｖ　のＭＥＧＡ−８含有の同じ緩衝液で洗浄した。次に、結合したタンパク質を、ＭＥＧＡ−８含有グリシン緩衝液で溶離し、各画分をトリス塩基で直ちに中和した。各画分中のｐ３３とＬＴの存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と銀染色によって決定した。上記のタンパク質を含有する画分をプールし、ＳＤＳを添加し、その集められた画分を０．１×ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に対して透析した（ＭＥＧＡ−８の界面活性剤を除くために何度も透析液を変えた）。次いで透析された溶液を凍結乾燥し、もとの容積の１／１０の水中に再懸濁させた。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に展開させ、ＰｒｏＢｌｏｔ膜上にブロットし、次いでクーマシー・ブルー染料で染色した。ｐ３３と２５ｋＤ　ＬＴのバンドを切取り、それをタンパク質配列決定装置にかけた。１２０ＰＴＨアミノ酸分析機に連結された４７０Ａ型Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ配列決定装置を使用し、エドマン分解法によって、Ｎ末端の配列を得た。膜関連リンホトキシンバンドの配列が、分泌されたリンホトキシンについて報告された配列、すなわち（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ（Ｐ．Ｇｒａｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，Ａ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｗｉｔｈ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２巻、１２１〜１２４頁、１９８４年）と正確に一致することを見出した。結合したｐ３３タンパク質のＮ末端部は、（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎまたは（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎのアミノ酸配列を含有していた。６番目の位置における配列は、グリシンとロイシンの両者の混合物であり、多形性の可能性を示した。ｐ３３のタンパク質は、これらの配列の一方もしくは両方を有している。

　表面ＬＴ型が検出された各々の場合、我々はさらにｐ３３を検出することができた（すなわち、ＰＭＡで活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７において、活性化されたＣＴＬクローンとＨｕｔ−７８細胞は、構成的に表面ＬＴ型を発現する）。ＬＴは、表面ＬＴ型が存在しないときにはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞とＢリンパ芽球細胞系から分泌され、およびｐ３３が存在する場合は表面に結合したＬＴと関連があるため、我々は、ｐ３３はＬＴを標識化し細胞表面で結合すると結論した。生化学的にｐ３３とＬＴが、非変性等電点電気泳動ゲル上ではともに泳動するが、該複合体が尿素で分解されるとこれら２つのタンパク質は別個に泳動する（図９Ａと１０Ａ参照）。これらの観察結果から、我々は、ＬＴとｐ３３が細胞表面上に複合体として存在すると結論するに至った。

　（ｐ３３とＬＴおよびｐ３３／ＬＴ複合体の使用の可能性）
　可溶性ＬＴと、本発明の好ましいｐ３３／ＬＴ複合体のＬＴが見かけ上同等であると考えれば、本発明の複合体は、抗炎症の組成物と方法での用途のみならず、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化もしくはＴ細胞抑制の用途を含む多数の可能性をもっていると期待される。また高度に精製されたｐ３３は、本発明のｐ３３および他のタンパク質をコードするＤＮＡを単離するのに有効なプローブを合成するのに有用である。このようなＤＮＡ配列、その配列を含有する組換えＤＮＡ分子、ならびに、そのＤＮＡ配列でトランスフェクトされた、培養中の単細胞宿主および動物もしくはヒトの細胞は、前記の組成物および治療法に使用する、他のヒトタンパク質を実質的に含有していない本発明のポリペプチド類を大量に生産するのに利用し得る。

　より具体的には、本発明の精製したｐ３３タンパク質は、種々の部分およびフラグメントのアミノ酸配列を決定するのに利用し得る。さらにこれらのアミノ酸配列、およびこれらの配列をコードする縮重ＤＮＡ配列は、本発明のｐ３３および他のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の種々のＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに潜在的に有用な一連のＤＮＡプローブを設計するために利用できる。このようなライブラリーには、本発明のｐ３３タンパク質を産生することが実証されている組織もしくは細胞系から調製される染色体遺伝子バンクおよびｃＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリーが含まれる。このような細胞系には当該技術分野で公知の細胞系が含まれている。

　本発明のポリペプチド複合体および好ましくはｐ３３／ＬＴ複合体を表面に発現するリンパ球は、腫瘍細胞を破壊する能力を増強させたサブセットである。このサブセットは、ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）もしくはＴＩＬ細胞（腫瘍浸潤性リンパ球細胞）の治療法に有用であろう（Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｓｉｋｏｒａ，「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅａｐｙ」，Ｊｏｕｒ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１７巻，１９１頁、１９８９年）。

　また本発明のポリペプチドとポリペプチド複合体に対する抗体もしくは抗体誘導体は、例えば洗い出し法もしくは流動細胞蛍光分光選別法のような通常の免疫学的方法で、上記の細胞集団を増大させるのに有用である（Ｌ．Ｊ．ＷｙｓｏｃｋｉおよびＵ．Ｌ．Ｓａｔｏ，「Ｐａｎｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻、２８４４頁，１９７８年）。

　さらに、本発明のポリペプチドおよび複合体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、リンホトキシンと腫瘍壊死因子が使用されている用途と類似の細胞調製もしくは治療法の用途に有用であると考えられる。

　本発明の複合体およびポリペプチドまたは、これらからもしくはこれらのアミノ酸配列を用いて誘導もしくは合成されるペプチド、またはその塩もしくはその医薬として許容される誘導体の投与は、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞抑制または抗炎症の活性を示す薬剤の従来許容されている投与法で実施し得る。これらの投与法には、経口、非経口、皮下、静脈、病巣内または局所の投与法が含まれる。さらに、本願で提供される配列の情報によって、ｐ３３をコードするｃＤＮＡを単離し配列を決定することができ、ｐ３３に対する組換え遺伝子、およびこれに基づいた関連ポリペプチドは、例えばＴＩＬ療法、すなわちｐ３３遺伝子をＬＴ遺伝子とともにまたはＬＴ遺伝子なしで、腫瘍から単離したＴ細胞に導入し、次いで患者に導入する方法において治療上有用である。その細胞を患者から採取し、本発明のポリペプチドをコードして発現するＤＮＡ配列でトランスフェクトし、そのトランスフェクションの前もしくは後に、リンホカイン好ましくはＩＬ−２とともにインキュベートして患者に戻すことが一層好ましい。そのトランスフェクトされたＴ細胞（いまやｐ３３を発現し、従ってＬＴを複合する）はそれらが取り出された元の腫瘍に戻り、そこでＬＴの殺腫瘍作用が腫瘍に直接及ぼされる。同様に、ＬＡＫ細胞に導入されてこの細胞をトランスフェクトするｐ３３遺伝子は、細胞上の表面複合体の数を増大し、それらの活性を強化すると考えられる。

　一般に、ＬＴとＴＮＦは、同じセットの受容体と相互作用すると考えられる（この受容体は５５ｋＤと８０ｋＤのＴＮＦ受容体と呼ぶ：Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８巻、１０１９頁、１９９０年；Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ，６１巻、３６１頁、１９９０年）。それにもかかわらずＬＴとＴＮＦが示す生物学的力価の定量的パターンは著しく異なり、ＬＴはＴＮＦよりはるかに力価が低いことが多い（例えばＢｒｏｗｎｉｎｇとＲｉｂｏｌｉｎｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ前記文献参照）。これらの観察結果は既存の受容体結合データと調和させることは困難である。ｐ３３／ＬＴ複合体はＬＴに対して、ＬＴが他のまだ不確定な受容体と相互作用するような独特の特性を与える可能性がある。この場合、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体と他の複合体は、ＬＴもしくはＴＮＦとは異なる独特の生物学的特性を有しているであろう。ｐ３３／ＬＴ複合体は、このようなｐ３３／ＬＴもしくはｐ３３特異的受容体を同定しクローニングするのに利用できる。その上、この複合体は、別の用途で新規な生物学的活性を示し得る。

　また多数のＴ細胞系とマクロファージ細胞系がＨＩＶウイスルに感染しうるということが知られているが、組織培養でこのウイルスを増殖させるのに、実際にはごく小数の細胞系しか有効でない。例えば、Ｈ９系、最初にＧａｌｌｏらが利用したＨｕｔ−７８の誘導体（Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４巻、４９７−５００頁、１９８４年）および他のヒトリンパ球系のＣ８１６６がＨＩＶを増殖するのに有効である（Ｍ．ＳｏｍａｓｕｎｄａｒａｎおよびＨ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２巻、１５５４−１５５７頁，１９８８）。表面ＬＴの発現または表面ＬＴ発現の容量によって、所定の細胞がＨＩＶ増殖の良い標的になる可能性がある。

　ＴＮＦの役割はＨＩＶの増殖を促進することであるといわれている（Ｌ．Ｏｓｂｏｒｎら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６巻、２３３６頁、１９８９年；Ｚ．ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＡ．Ｆａｕｃｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１巻，１７６頁，１９９０年；Ｃ．Ｌｏｃａｒｄｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４巻、５８７４頁，１９９０年，Ｇ．Ｏｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ　８７巻，７８２頁，１９９０年）。本発明の発明者らは、ＩＩ−２３．Ｄ７系がＨＩＶ菌株ＩＩＩＢに感染しうるが、ＰＭＡで処理するとこのウイルスの感染が劇的に増大することを見い出した。Ｈｕｔ−７８細胞系は表面ＬＴ型を、構成的に発現することが見い出されたが、Ｃ８１６６系は表面ＬＴがＰＭＡ処理の後に出現するという点で、ＩＩ−２３．Ｄ７と似ている。ＩＩ−２３．Ｄ７のＨＩＶに対する感染性、および感染可能な細胞系と表面ＬＴの発現の関係に関するこれらの結果を考慮して、これらの細胞系は本発明のｐ３３／ＬＴ複合体と他のポリペプチドと複合体が調節の役割をするので、ＨＩＶが感染し複製するのに良い宿主であり得ると提唱する。ＬＴ遺伝子がＨＩＶの転写活性化物質ＴＡＴの発現によって誘導されることが実証されており（Ｋ．Ｓａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻，２００９１頁，１９９０年）、さらに、ＨＴＬＶ−１の感染がＬＴの発現を誘導することも報告されている（Ｎ．Ｐａｕｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４巻，５４１２頁，１９９０年；Ｅ．Ｔｓｈａｃｈｌｅｒら，「Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ」（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ社，１９９０年）Ｗ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ編集，１０５頁）。従って、ＨＩＶの感染によるＬＴの誘導とその結果起こるｐ３３／ＬＴ複合体もしくは他の複合体の発現、またはこれらのタンパク質を作る能力がある細胞系内に、ＰＭＡ処理によってｐ３３／ＬＴもしくは他の複合体の発現を誘導することはウイルスの複製を増強する働きをし得る。この理由から、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体もしくは他のポリペプチド複合体、もしくはこれらの複合体の可溶型、もしくは本発明のｐ３３および他のポリペプチドに対する抗体もしくは特異的に結合するタンパク質（例えば可溶性受容体）は少なくとも部分的にＨＩＶの増殖を阻害もしくは阻止し得る。

　これらの治療法に用いられる組成物には種々の形態が有り得る。例えば固体、半固体および液体の剤形があり、例えば錠剤、丸剤、散剤、液体の水剤もしくは懸濁剤、坐剤、注射用および輸液用の水剤、遺伝療法剤が含まれる。好ましい剤形は、目的とする投与法と治療用途によって決まる。また組成物は、好ましくは、通常の医薬として許容される担体を含有し、他の医薬、担体、遺伝子キャリヤ例えば腫瘍浸潤性リンパ球治療剤、アジュバント賦形剤、その他例えばヒト血清アルブミンもしくは血漿製剤を含有させてもよい。好ましくは、組成物は、一回投与量の形態であり、１日当り１回以上投与される。

　本発明の組成物は、取り扱う対象の特定の臨床症状を治療するのに有効な投与量で投与される。所定の用途に対する特定の投与量の決定は、例えば患者の症状と体重、所望の治療の範囲および患者の治療に対する耐性を考慮して、十分に当業者の裁量中にある。

　以下に、本発明のｐ３３／ＬＴ複合体と、これの特性を決定するのに用いる方法を説明する実施例を示す。これらの実施例は本発明を限定するものではない。

　本発明の発明者らは、実施例で下記の実験法を使用した。

　（抗血清）
　組換えヒトＬＴ（ｒＬＴ）を、安定してトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系によって発現させ、血清を含有しない調整培地に分泌させた。一連のセファロースＳ，ヒラマメレクチン・セファロースおよびＦＰＬＣ　Ｍｏｎｏ　Ｑのカラムクロマトグラフィーの工程によって、上記血清なしの調整培地から分泌されたｒＬＴを精製した。ＣＨＯ細胞由来のｒＬＴ調製物の特性はすでに報告されている（Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，「Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　Ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｏｆ　Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｌｉｎｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４３巻，１８５９頁，１９８９年）。本発明の発明者らは、完全フロイントアジュバント中の２５μｇの未変性ｒＬＴを用い、リンパ節法（Ｍ．Ｓｉｇｅｌら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｂｙ　Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｔｏ　Ｌｙｍｐｈ　Ｎｏｄｅｓ」，Ｍｅｔ．Ｅｎｚ．，９３巻、３頁、１９８３年）によって、２匹のウサギ（４と５）を免疫した。第３のウサギ（６）を同じ方法で、完全フロイントアジュバント中の２５μｇの変性ｒＬＴを用いて免疫した。この変性ｒＬＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとこれに続く０．１％ＳＤＳ−カルボナート緩衝液へのエレクトエリューション（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって調製した。

　上記の方法を用いて、３つの抗ｒＬＴ抗血清を調製した。すなわち未変性ｒＬＴに対する２つと、ＳＤＳで変性されたｒＬＴに対する３番目のものである。未変性タンパク質で免疫する（ウサギ４および５）ことによって生成した抗血清は１：２０００〜５０００の希釈度で５０単位／ｍｌの溶液を中和し得た。変性ｒＬＴに対して生成した血清（ウサギ６）は中和力価を欠いていたが、ウエスタンブロット上でｒＬＴに対して弱い反応性を有していた。どの抗血清もｒ−ヒトＴＮＦを中和し得なかったし、またウサギ６由来の抗血清に非常に弱い力価が認めらることを除いてＥＬＩＳＡプレートに結合したｒ−ヒトＴＮＦを認識し得なかった。ウサギ６由来の抗血清のみがウエスタンブロット分析法でｒＬＴを認識し得た。

　４番目のウサギを組換えヒトＴＮＦで免疫した。次のような古典的な免疫化法によってポリクローナル抗ｒＴＮＦウサギ血清を調製した。すなわち、完全フロイントアジュバント中の組換えヒトＴＮＦ［（Ｄ．Ｗｅｉｒら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎ　Ｆｏｕｒ　Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ８「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｎｉｍａｌｓ」）由来のＥ．ｃｏｌｉを用い、次いで不完全フロイントアジュバント中のもので追加免疫を行って調製した。免疫化によってｒＴＮＦに対して生成した血清は、優れた中和力価をもっていた。ＴＮＦに対する中和モノクローナル抗体は報告されている（Ｌｉａｎｇ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ／Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ」）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３７巻、８４７頁、１９８６年）。免疫する前の血清を、対照として使用するために、全動物から集めた。

　（細胞増殖とＴ細胞活性化）
　さきに述べたＬＴでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＢｒｏｗｎｉｎｇとＲｉｂｏｌｉｎｉ，「Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　Ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｏｎ　ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｏｆ　Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｌｉｎｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４３巻、１８５９−１８６７年）を除き、全細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。

　細胞は、１％グルタミン、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）で補充したＲＰＭＩ　１６４０培地（「完全ＲＰＭＩ」と呼ぶ）で増殖させたが、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞だけは、上記と同じ補充をしたダルベッコの修正イーグル培地で増殖させた。ヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３は、ヒトＣＥＭ腫瘍系と活性化末梢Ｔリンパ球を融合させて得たものであり、さらにサブクローニングした（ＩＩ２３−Ｄ．７）（Ｃ．Ｗａｒｅら，「Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ａｎｄ　Ｋｉｌｌｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｂｙ　Ａｎｔｉ−ＣＤ３　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｏｒ　Ｌｅｃｔｉｎｓ　Ａｎｄ　Ｐｈｏｒｂｏｌ　Ｅｓｔｅｒ」，Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．５巻、３１３頁、１９８６年）。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ヘパリンを通したガラス管に入れ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離器で単離し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。２ｘ１０^６細胞／ｍｌのＰＢＬを、１μｇ／ｍｌインドメタシンの存在下、１：５００希釈度のＯＫＴ３調整培地で処理し（最終的に約２ｎｇ／ｍｌ）、いくつかの試験では１０ｎｇ／ｍｌ　ｒＬＴ−２（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で処理した。ヒトＣＴＬ−クローンを次の文献（Ｌ．Ｇｒｅｅｎら、「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　Ｂｙ　Ｃｌｏｎｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ｊｏｕｒ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ．，１３５巻，４０３４頁，１９８５年）に記載されているようにして製造し、放射線照射された刺激細胞（抗原）またはＥ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚから提供された抗ＣＤ２モノクローナル抗体の組み合わせ（Ｔ１１_２＋Ｔ１１_３）のいずれかによって活性化させた。

　（流動細胞計測法）
　１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中に細胞を０℃で再懸濁させた。ヒトＩｇＧとともに予備インキュベーションを行った後、所望の抗血清を含有する追加培地を添加した。典型的には細胞は、抗ｒＬＴおよび抗ｒＴＮＦの血清を１：２００の比率で最終的に希釈したものとともに、６０〜９０分間インキュベートした。次に細胞を、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで、上記培地中、フルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（米国、ノースカロライナ州、ダーハム、Ｃａｐｐｅｌ社）の１：５００希釈物とともに最低６０分間インキュベートした。次に細胞を一回洗浄し、次に直接分析するか、またはいくつかの場合は０．５％パラホルムアルデヒドを用いて０℃にて１０分間固定してから分析した。上記の二色分析を行った。但し、第２抗体の段階で、フィコエリトリン標識したＬｅｕ−４、Ｌｅｕ−２、Ｌｅｕ−Ｍ３もしくはＬｅｕ−１６もしくはＬｅｕ−１９（米国、カリフォルニア州、マウンテン・ビュー、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を添加した。表面に結合したＬＴとＩＬ−２受容体のレベルとの比較を、フルオレセイン標識した抗ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）抗体（米国、カリフォルニア州、マウンテン・ビュー，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、別個の単色分析により行った。分析はＦＡＣＳｔａｒの装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて行った。

　（活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７による中和抗ｒＬＴ抗体の吸収）
　ＩＩ−２３．Ｄ７とＵ９３７前単球細胞（１×１０^６細胞／ｍｌ）を、完全ＲＰＭＩ培地中の１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡによって８時間刺激した。細胞（１×１０^８）を培地中で３回洗浄し、上清を吸引して乾燥ペレットを得た。その細胞を、抗ｒＬＴ血清（ウサギ４由来）の１：１０００希釈物を含有する培地１ｍｌに再度懸濁させ、混合しながら氷上で１．５時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって抗血清から除いた。吸収された抗血清（免疫前と免疫後の両方）を、同容積（５０μｌ）の１５Ｕ／ｍｌのｒＬＴ含有培地と混合し、室温で２０分間インキュベートした。得られた混合物を培地で順次希釈し、Ｌ９２９細胞（０．１ｍｌ）に添加し、さらに２４時間インキュベートした。Ｌ．Ｇｒｅｅｎら「Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｆｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｔｏ　ｔｈｅ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｎｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ」Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，７０巻　２５７〜２６８頁、１９８４年に記載されているＭＴＴ検定法によって細胞生存度を測定した。

　（Ｔ細胞の^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインによる代謝標識化）
　ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％　ｖ／ｖ　透析ＦＢＳおよび２％　ｖ／ｖの通常のＲＰＭＩ（冷担体添加）で補充され、システインを含有していないか、または、メチオニンを含有していないＲＰＭＩ　１６４０培地中に細胞を移した。細胞の濃度を２〜３ｘ１０^５細胞／ｍｌに調節し、得られた適切な培地に^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインを１００〜２００μＣｉ／ｍｌのレベルで添加した。新しく活性化されたＰＢＬの場合、上清をゆるやかに除去し、細胞を遠心分離し、標識した培地中に再懸濁させ、元の付着集団に戻した。１２〜１８時間の標識化時間の後、細胞を下記のようにして洗浄し溶解させた。ＰＢＬについては、細胞をピペットで取り出し、付着集団を、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで処理して部分的に取り出した。

　（免疫沈降）
　標識した細胞の溶解物０．２〜０．５ｍｌに、ウサギ血清２〜４μｌを添加した。その試料を１〜２時間４℃で放置した。次に洗浄したプロテインＡセファロース（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の６０〜７５％懸濁液の６０μｌを添加し、得られた試料を４℃で６〜１８時間振盪した。得られたプロテインＡセファロースのペレットを、カルシウム／マグネシウムなしのＰＢＳに１％のＮＰ−４０を溶解した溶液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳローディング緩衝液５０μｌ中に再度懸濁させた。典型的には、単一の溶解試料を、免疫前抗ｒＬＴ血清、抗ｒＴＮＦ血清、および最後に免疫後抗ｒＬＴ抗血清で順次免疫沈降を行った。一組の実験で、細胞溶解液に５ｍＭのＣａＣｌ_２とＭｎＣｌ_２を添加し、その細胞溶解液を、洗浄したヒラマメレクチン・セファロースの７５％懸濁液の７５μｌとともに一夜振盪した。そのセファロースをＮＰ−４０／ＰＢＳで２回洗浄し、次に、０．２５Ｍ　α−メチルマンノシド含有の１％ＮＰ−４０／ＰＢＳの７５μｌずつで３回続けて溶離した。得られた洗浄液をプールして免疫沈降の手順を実施した。

　（ウサギ抗ｒＬＴアフィニティーカラム）
　プロテインＡセファロースを用い酸性ｐＨで溶離することによって、抗ｒＬＴ血清（ウサギ４由来）から免疫グロブリンの画分を精製した。溶出されたＩｇＧ含有画分をＰＢＳに対して透析し、アミコン（ａｍｉｃｏｎ）濾過によって濃縮した。抗ｒＬＴ−ＩｇＧ溶液（６ｍｇ／ｍｌ濃度のものを１５ｍｌ）を、８ｍｌのＡｆｆｉ−ｇｅ１　１０樹脂（カリフォルニア州、リッチモンド、Ｂｉｏｒａｄ社）に、説明書どおりに結合させた。非特異的ウサギＩｇＧ（ノース・カロライナ州、ダーハム、Ｃａｐｐｅｌ社）を使って同一のアフィニティーカラムを製造した。両方のカラムを、ＰＢＳ、１％ＮＰ−４０含有１ＭアセテートｐＨ３．０、および最後にプロテアーゼインヒビターを含有していない溶菌緩衝液で洗浄した。

　（ｐ３３およびＬＴの精製）
　ＩＩ−２３．Ｄ７細胞（１５　ｌ）を、５×１０^５細胞／ｍｌの密度まで増殖させ、ホルボールミリスティックアセテート（ＰＭＡ）を加えて最終濃度を２５ｎｇ／ｍｌにした。２４時間後、細胞を集め、血清を含有しない冷ＲＰＭＩ培地中で洗浄した。７ｘ１０^９の細胞を含有する冷却した細胞ペレットに、氷冷した溶菌緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１％　ｖ／ｖ　ＮＰ−４０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．１％アジ化ナトリウム）に新たに５ｍＭベンズアミジン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド（ＰＭＳＦ）と０．２５ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、１０μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビター、０．７μｇ／ｍｌペプチスタチンおよび１０μｇ／ｍｌアプロチニンを加えた液１００ｍｌを添加した。細胞をダウンスホモジネーターを使って均一化し、得られた溶解細胞液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を６０，０００×ｇで９０分間遠心分離に付して上清を集めた。

　上記高速遠心分離によって得た上清に５ｍＭ　ＣａＣｌ_２と５ｍＭ　ＭｎＣｌ_２を添加した。得られた上清を、溶菌緩衝液およびＣａＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２の混合物と平衡化させた２０ｍｌのヒラマメレクチン・セファロースカラム（ニュージャージー州、ピスカタウエイ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に注入した。そのカラムを溶菌緩衝液（ＣａＣｌ_２とＭｎＣｌ_２含有）で洗浄し、次いで０．２５Ｍ　α−メチルマンノシドを含有する溶菌緩衝液でカラムを溶離した。

　ヒラマメレクチンの溶出液の画分を集めて５０ｍｌの容積にして、これを２ｍｌのウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフニティーカラムに直接注入した。このカラムを２ｍｌのウサギ抗ｒＬＴセファロースアフィニティーカラムに直接接続した。両方のカラムをＥＤＴＡを含有する同じ溶菌緩衝液で洗浄し、続いて、１％　ＮＰ−４０を１％　ｗ／ｖ　ＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、インディアナ州、インディアナポリス、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で置換した溶菌緩衝液で洗浄した。

　洗浄した上記カラムを個々に、１％ＭＥＧＡ−８、５０ｍＭグリシン　ｐＨ２．５、０．０５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭベンズアミジンおよび２ｍＭ　ＥＤＴＡで溶離した。最初の２０ｍｌをｐＨシフトを行ってからプールし、そのプールしたものを凍結乾燥し、これを０．０５％のＳＤＳを含有する水の１ｍｌ中に再懸濁させ、その懸濁液を、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、０．０５％ＳＤＳおよび０．１％ＭＥＧＡ−８に対して透析した。透析して得た画分を、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥し、０．１５ｍｌの水に再度懸濁させた。懸濁液の一部をＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に電気泳動させた。銀で染色してｐ３３およびＬＴのタンパク質を目視可能にした。

　（ＩＩ−２３．Ｄ７細胞表面のヨウ素化）
　対照のＩＩ−２３．Ｄ７細胞もしくはＰＭＡで誘発したＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、カルシウム／マグネシウムを含有していないＰＢＳ中で充分に洗浄し、１ｍＭ　ＰＭＳＦと０．２５ｍＭ　ＮＥＭで処理し、ついで２回洗浄した。５０μｇのｉｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社）でコートした１２×７５ｍｍのガラス管に、０．３ｍｌの細胞（合計１×１０^７）および１〜２ｍＣｉの^１２５ヨウ化ナトリウムを入れた。細胞を定期的に撹拌しながら室温で２５分間放置し、１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳで３回洗浄し、次いで上記の溶菌緩衝液に再懸濁させた。エッペンドルフの遠心分離器に２分間かけて核を除去した。得られた上清をさらに１５分間遠心分離に付した。透明になった上清を免疫沈降処理に付した。

　（一次元ＣＮＢｒペプチドのマッピング）
　１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｌａｅｍｍ１ｉゲル上に、試料を短距離、電気泳動させ、適切なゲルの部分を切取った。そのゲルスライスを、１．０ｍｌの０．１Ｎ　ＨＣ１、０．２％の２−メルカプトエタノール（新しいＣＮＢｒ　７００ｍｇ／ｍｌを９０％ギ酸１ｍｌ当り含有する液１５μｌを含有）中で１時間すすいだ。次にそのスライスを取出し、０．１Ｍ　トリス−Ｃｌ　ｐＨ８．０で５分間洗浄し、２５ｍＭ　トリス−Ｃｌ　ｐＨ８．０で５分間洗浄し、最後に１×Ｌａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で１０分間洗浄した。得られたスライスを、１２％アクリルアミドのスタッキングゲル含有の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｌａｅｍｍｌｉゲルにロードした。ペプチドのバンドを銀染色もしくは乾燥したゲルのオートラジオグラフィーで目視可能にした。

　（再免疫沈降）
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した抗原の再免疫沈降を、標識がついているバンドをゲルから切取り、ＴＢＳ、０．２％ＳＤＳ中で１０分間再水和し、次にゲルスライスをさいの目の小片に切断した。１ｍｌ　ＴＢＳ、０．２％ＳＤＳ中、室温で８時間、回転させながらインキュベートすることによってタンパク質を溶離した。溶離した後、ゲルの小片を遠心分離によって除き、上清にＮＰ−４０を添加して最終濃度を２％にした。溶離されたタンパク質を上記のようにして免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再分析した。

　（等電点電気泳動（ＩＥＦ））
　二次元ＩＥＦを、Ｐ．Ｈ．Ｏ’ＦａｒｒｅｌｌがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０巻、４００７〜４０２１頁、１９７５年に報告しているのとほとんど同様に実施した。^１２５Ｉで標識した抗原をＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出液から免疫沈降させ、その沈降させたタンパク質を、９．５Ｍの尿素を含有する１００μｌのオファーレル試料緩衝液中で、１００℃にて５分間加熱することによって溶離した。溶離されたタンパク質を、最終濃度２％のアンフォリン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）（ｐＨ範囲３〜１０、Ｓｉｇｍａ社）を含有する１４ｃｍ×３ｍｍのチューブゲル上に、室温で１６時間一定電圧（４００Ｖ）で等電点電気泳動を行った（ファーストディメンション）。セカンドディメンションの等電点電気泳動は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。

　未変性（非変性）条件下のＩＥＦについては、^１２５Ｉで標識した細胞抽出物を、尿素が存在することを除いて上記と同一のチューブゲル上に、直接、等電点電気泳動を行った。標識がついている抽出物（２００μｌの容積）を１００，０００×ｇ（３０ｐｓｉ、空気除去）で１０分間遠心分離し、次にチューブゲルにロードした。等電点電気泳動は、前記と同条件下にて４℃で実施した。チューブゲルを取出して１ｃｍつづの切片にスライスし、各スライスを１ｍｌ　ＴＢＳ、２％ＮＰ−４０、２ｍＭ　ＰＭＳＦ中で、回転させながら、室温で８時間インキュベートすることによって、タンパク質を溶離した。次に、溶離されたタンパク質を含有する上清を免疫沈降させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。変性および未変性のチューブゲルの両者のｐＨ勾配を、平行に並んでいるゲルからの個々のスライスのｐＨ値を測定して決定した。

　（Ｔ細胞増殖の検定）
　ウシ胎児血清の代わりに１０％ヒト同一個体由来血清、１μｇ／ｍｌのインドメタシンおよび５０Ｕ／ｍｌのポリミキシンＢを使うこと以外、上記と同様の完全ＲＰＭＩに、ＰＢＬを単離して再懸濁させた。ＭＬＲの実験では同一個体由来の血清は応答個体の血清であった。異なるドナー由来の刺激細胞（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ　ｃｅｌｌ）に３０００ラドの線量を照射した。ウサギ血清を５６℃で１時間予熱し、希釈し、減菌濾過を行い、増殖検定に使用した。９６の丸底ウエル付プレート中で０．２ｍｌの細胞（合計１×１０^５）を、５μｇ／ｍｌのフォトヘマグルチニン、１〜２ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３または１．５〜２×１０^５の被照射刺激細胞を用いて、種々の抗血清もしくはサイトカインの存在下または非存在下にて処理した。３日後（ＰＨＡもしくはＯＫＴ３の活性化）または５日後（ＭＬＲ）、細胞を^３Ｈ−チミジンで短時間標識して、収集し計測した。

　（実施例１：Ｔ細胞はその表面にＬＴ関連エピトープを発現する）
　上記の条件下でヒト末梢単核細胞（ＰＭＮ）をＯＫＴ３をモノクローナル抗体で活性化し、２日間培養した後、流動細胞蛍光分光分析法を使って、ｐ３３／ＬＴ複合体関連型の発現について分析した。１つの実験において（結果は図１に示す）、新しいＰＢＬを、ＯＫＴ３とＩＬ２とともに３日間培養し、ついで抗血清の１：２００希釈液で染色して、未変換性ｒＬＴ（図１の「ＬＴ−４」と「ＬＴ−５」のパネルはそれぞれウサギ４と５由来のものである）、変性ｒＬＴ（図１の「ＬＴ−６」のパネルはウサギ６由来のものである）および未変換性ｒＴＮＦ（図１の「ＴＮＦ」パネルはウサギ７由来のものである）を得た。細胞は、各動物由来の免疫後の血清（図１のパネルの実線）または免疫前の血清（図１のパネルの点線）で染色を行った。図１は、ウサギ４と５由来の抗ｒＬＴ血清だけが、活性化された末梢Ｔ細胞上のエピトープを認識したことを示している。

　図２に示す実験では、１０ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡを用いるかまたは用いずに、１５時間、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を処理し、次いで図１の実験に記載したのと同様にして、ウサギ４の抗ｒＬＴ免疫後血清（図２のパネルの実線）またはウサギ４の免疫前の血清（図２のパネル中の点線）で染色を行った。図２に示すように、Ｔ細胞ハイブリドーマのＩＩ−２３．Ｄ７［ホルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激するとＬＴを合成する］は、ＰＭＡで活性化すると表面ＬＴ関連エピトープを発現することが見出されたのである。

　Ｔ細胞上のＬＴ関連エピトープがＬＴ関連するものであり、ＣＨＯ細胞由来の組換えＬＴ調製物のある種の夾雑物によるものではないことを確認するために、ウサギ４由来の抗血清の１：１０００希釈物を、ＰＭＡで活性化させて洗浄したＩＩ−２３．Ｄ細胞もしくはＵ９３７細胞で処理した。図３に示す実験では、抗ｒＬＴ血清の１ｍｌの試料（１：１０００抗ＬＴ−４）を、細胞なし（白四角印）、１×１０^８Ｕ９３７細胞（白丸印）、ＰＭＡで活性化された１×１０^８のＩＩ−２３．Ｄ７細胞（黒四角印）、またはＰＭＡで活性化された１×１０^７のＩＩ−２３．Ｄ７細胞（黒丸印）で処理した。１：４０００の最終希釈物が最初のウエル中に存在するように、吸収された抗血清の希釈物を、Ｌ９２９細胞毒性検定法におけるｒＬＴの限界量に添加した。この検定法によって、ＬＴが２４時間以内に、マウス線維芽細胞系のＬ９２９を殺す性能が測定される（Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒｅａｄｅ，Ｃ．Ｆ．Ｗａｒｅ，「Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｎｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０巻、２５７頁、１９８４年）。２４時間後、ＭＴＴ読み出しを用いて細胞生存度を評価した。図３に示すのは、光学密度（細胞生存度に比例する）対吸収された抗血清の希釈度のグラフである。データは２つのウエルの平均値であり、２つのデータは記号が定義する範囲内であった。図３に示すように、標準のＬ９２９細胞毒性検定法における、吸収された抗血清の中和力価の分析結果は、活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞がＬＴ中和抗体を除去し、一方Ｕ９３７は無効力であることを実証した。これのデータは、膜表面上の抗原構造が実際にＬＴに関連していることを示している。

　Ｔ細胞の表面にＬＴ関連エピトープが明らかに存在していることのいくつかの説明を試験するために、ハイブリドーマのＩＩ−２３．Ｄ７にさらにいくつかの処理を行った。まず、抗血清中のＬＴ：抗体複合体が該ハイブリドーマのＴＮＦ／ＬＴ受容体と結合し得るという可能性を除外した。ＴＮＦおよびＬＴは両方とも、上記複合体内に抗体結合エピトープを存在させることができる三量体の構造をもっている。しかし細胞のＴＮＦ受容体が可溶性ＴＮＦもしくはＬＴでさきに飽和されると表面の染色に対しては全く影響がなかった。このような飽和によって、免疫複合体がかような受容体に結合するのを阻止されたのであろう。

　ｐＨ３の乳酸の処理では（結合しているＴＮＦをその受容体から放出できる）、シグナルに対して影響はなかった。これはＬＴが受容体に捕捉されていないことを示唆している。しかしＩＩ−２３．Ｄ７細胞に結合している^１２５Ｉ−ＬＴを利用する実験は、受容体に捕捉されたＬＴは、酸性ｐＨ下でその受容体から外すことはＴＮＦより難しいことを示した。

　染色の前に細胞をゆるやかにトリプシン処理するとシグナルが失われるに至るが、これはエピトープがタンパク質であることを示している。表面関連ＬＴがホスファチジルイノシトールで連結されているか否かを決定するために、細胞をホスファチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼＣで処理した。ＰＩ連結抗原のＬＦＡ−３が放出されうる条件下で（Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｎｄ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ２）」，Ｎａｔｕｒｅ，３２９巻、８４２頁、１９８７年）、ＬＴエピトープに対して全く影響がなかった。

　ＬＴ遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、予めＰＭＡで活性化されていてもいなくても染色することができなかった。このことは、ウサギを免疫するのに用いた元のｒＬＴ中のＣＨＯ由来の夾雑物に対する抗体が、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の染色に寄与するのに充分な量で存在していなかったことを示している。同様に、ＬＴ調製物に混入しているウシ胎児血清タンパク質に対して生成する抗体は、染色が１０％ウシ胎児血清中で行われるので、Ｔ細胞の染色に影響はないであろう。

　抗ｒＬＴ血清をｒＬＴで前処理すると、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞上のＬＴ型の染色を阻止したが、抗ｒＴＮＦで前処理しても上記の染色を阻止しなかった。

　（実施例２：Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７上のＬＴ関連タンパクの免疫沈隆）
　ＰＭＡで活性化させたＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面をヨウ素化し、その細胞を溶解し、界面活性剤に可溶化した、標識膜タンパク質を免疫沈降させてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果、２つのタンパク質が抗ｒＬＴ抗血清によって認識されることが分かった。図４Ａは、免疫前（ＰＲＥ）もしくは免疫後（ＰＯＳＴ）の抗ｒＬＴ血清（ウサギ４由来）で沈降させた、ヨウ素化表面タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。

　図４Ａに示すように、予想された大きさのＬＴと関連する２５〜２６ｋＤの分子量型（「ＬＴ」）が観察され、また約３３ｋＤの別の型（「ｐ３３」）がみとめられた。同じウサギ由来の免疫前血清（図４Ａの免疫前（ＰＲＥ）のカラム）と抗ｒＴＮＦウサギ血清のいずれも、ヨウ素化された、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７由来のどのバンドも免疫沈降させることができなかった。

　ヨウ素化バンドの一次元部分ＣＮＢｒペプチドマッピングは、２５〜２６ｋＤ型がヨウ素化ｒＬＴと同一のパターンで切断されることを示し、したがってこのバンドをＬＴと同定している。図４Ｂに示す実験において、パネルＡから２５〜２６ｋＤと３３ｋＤのバンドを切取り、制限ＣＮＢｒ切断を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ型に電気泳動させた。比較のために、平行して行ったｒＴＮＦとｒＬＴの両方の切断結果を図４Ｂに示す。得られたゲルはオートラジオグラフィーで目視可能にした。レーン１はｒＴＮＦを示し、レーン２はｒＬＴを示し、レーン３はＬＴを示し、およびレーン４はｐ３３を示す。ＣＮＢｒフラグメントの大きさが増大しているのは、天然ＬＴの炭水化物の量が増大していることを示す。ヨウ素化された３３ｋＤ型はＣＮＢｒで切断されなかった（レーン４）。このことはｐ３３が公知のＬＴ遺伝子産物とは異なることを示している。ｒＴＮＦは、タンパク質中にメチオニンを含有していないのでＣＮＢｒで切断されなかった（レーン１）。

　本発明の発明者らは、さらにこれらのＬＴ関連表面型を特徴づけるために、^３５Ｓ−メチオニンと^３５Ｓ−システインによる代謝標識付けを免疫沈降と結び付けて行った。ＴＮＦ／ＬＴの対の場合、システインとメチオニンの分布によって、ＴＮＦとＬＴ、およびシグナル配列のあるのとないものとの型を、膜ＴＮＦ型についての研究で利用されたように（Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、「Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｆｏｒｍ　ｏｆ　ＴＮＦ／Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ　Ｉｓ　ａ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＴＮＦ」，Ｃｅｌｌ，５３巻、４５〜５３頁、１９８８年）、識別することができる。充分にプロセッシングされたサイトカイン類、すなわち分泌された型態の場合、ＴＮＦはシステインを含有しメチオニンを含有しないが、一方リンホトキシンはメチオニンだけを含有し、システインを含有しない。しかしＬＴはシグナル配列ドメイン内に２つのシステイン残基を含有し、およびＴＮＦはそのＮ末端領域にメチオニン残基を含有している。ＩＩ−２３．Ｄ７はハイブリドーマ細胞の別個の培養物を^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインで標識し、次いで免疫反応性タンパク質を沈降した。１つの試験の結果を図５に示しているが、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を１０ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡで活性化し、同時に^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインで８時間標識付けを行った。培地および溶解した細胞の両者を、免疫前（ウサギ４）（Ｐ）、抗ｒＴＮＦ（Ｔ）および抗ｒＬＴ（ウサギ４）（Ｌ）の血清で、この順序にて連続して免疫沈降させた。図５は、分泌されたタンパク質を含有する上澄み液または洗浄させた細胞由来の免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー分析に結果を示す。「ｓ−ＴＮＦ」は、^３５Ｓ−メチオニンで標識した抗ｒＴＮＦで細胞から免疫沈降されたバンドを示し、これはプロセッシングされていないＴＮＦの２６ｋＤ型と推定して帰属させた。「Ｍｅｔ」と「Ｃｙｓ」は使用した^３５Ｓ−標識アミノ酸を意味する。^３５Ｓ−システインを含有するこれらのレーンは^３５Ｓ−メチオニンを含有するレーンよりも長時間暴露させた。これらの細胞由来の上澄み液において（標識をつけた「分泌されたもの」）、ＬＴの２５ｋＤ型（「ＬＴ」）は、ＰＭＡ処理の後、^３５Ｓ−メチオニンで標識された細胞によって放出されたが、^３５Ｓ−システインで標識された細胞によっては放出されなかった。このパターンは充分プロセッシングされて、分泌されるＬＴに対して期待される。暴露が長いと上澄み液中に痕跡量のＴＮＦが認められ、標識の取り込みは充分にプロセッシングされ分泌されるＴＮＦについて期待されるのと同様である。本発明の発明者らは、低レベルのＴＮＦまたはｍＲＮＡのレベルで、ＬＴが顕著に発現することを観察した（ＳｈａｍａｎｓｋｙおよびＷａｒｅ、未刊行の観察結果）。洗浄された細胞（「細胞内」と標識をつけたレーン）を分析した結果、２５〜２６ｋＤのＬＴと３３ｋＤのｐ３３の両者が存在していることが分かった。２５〜２６ｋＤと３３ｋＤの型の相対的な量は、表面ヨウ素化を用いて観察した量と一致した。２５〜２６ｋＤ表面ＬＴ型はシステインを欠いており、これはリーダー配列のプロセシングを示す。３３ｋＤ型は、^３５Ｓ−メチオニンと^３５Ｓ−システインの両者を取り込んだ。図５に示すフィルムをより長時間暴露すると（図示せず）、約２６〜２７ｋＤの位置に、細胞由来の抗ＴＮＦで免疫沈降されたバンドが存在することが分かった。そのバンドは、標識システインと標識メチオニンの両方を取り込んでいることは示した。標識付けはシステインによる場合の方が強い。ｃｙｓ：ｍｅｔ比は２６ｋＤ−ＴＮＦ型の場合４：１であるから、この標識付けのパターンはこのバンドの同一性を確認している。

　細胞溶解物由来の免疫沈降物中にｐ３３とともにＬＴが存在するということは、ｐ３３が抗原物にＬＴに関連しているか、もしくはｐ３３がＬＴに結合しているか、またはその両方であることを示唆している。この問題を検討するために、^３５Ｓ−メチオニンで標識した細胞由来の２５ｋＤと３３ｋＤのバンドを、ウサギポリクローナル抗ｒＬＴ血清で免疫沈降させ、切取ったゲル切片から溶離し、次いで抗ｒＬＴポリクローナル血清もしくはｍＡｂで再度免疫沈降させた。ＬＴは両方の抗ｒＬＴ抗体で免疫沈降させることができたがｐ３３はできなかった。このことはｐ３３が抗原的にＬＴに関連していないことを示唆している。これらの観察結果は、ｐ３３がＬＴと物理的に結合していることを示した。本発明の発明者らは、３３ｋＤタンパク質はＬＴに対して抗原的には関連しておらず、単にＬＴと共沈降すると信ずるものである。

　表面ヨウ素化もしくは代謝標識によって、ＬＴもしくはＴＮＦと結合する公知の５５ｋＤもしくは８０ｋＤのＴＮＦ／ＬＴ受容体型を検出できた。恐らくその理由は、Ｔ細胞が活性化する間に受容体が急速に失われるかである（Ｃ．Ｗａｒｅら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｅ　ＣＴＬ　Ｌｙｔｉｃ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ｂｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ」，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｔ，ＬｏｔｚｅおよびＯ．Ｊ．Ｆｉｎｎ編集，１３５巻、１２１〜１２８頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）１９９０）。

　（実施例３：ＩＩ−２３．Ｄ７の表面ＬＴ型の生化学的特性の決定）
　ＰＭＡで処理したＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のＬＴ関連型をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。本発明の発明者らは、免疫沈降法を用いて、ｐ３３とＬＴがともにヒラマメ（ｌｅｎｔｉｌ）・レクチンセファロースに結合したことを見出した。このことは糖タンパク質の構造を示している。界面活性剤で可溶化されたＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質をヒラマメ・レクチンセファロースに結合させ、α−メチルマンノシドで溶離し、次いでアフィニティー精製に付した。これらのタンパク質が抗ｒＬＴ血清によって特異的に認識されることをより正確に評価するために、対照のＩｇＧのカラムと抗ＩｇＧのカラムを調製した。これらのカラムを低ｐＨで溶離したところ、抗ｒＬＴカラムから約１００〜２００ｎｇの２つのＬＴ型が放出された。

　図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）もしくは免疫後（ＰＯＳＴ）のウサギ血清から調製した抗ｒＬＴアフィニティーカラムから溶離されたタンパク質のＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析結果を示す。図６Ｂには、パネルＡのゲルから３３ｋＤと２０ｋＤのバンドを切取り、制限ＣＮＢｒ切断を行い次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系に電気泳動を行わせた。比較のために、図６Ｂは、平行して実施した。ｒＴＮＦとｒＬＴ（ＣＨＯ由来）のＣＮＢｒ切断の結果を示す。これらのゲルは銀で染色した目視可能にした。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、表面をヨウ素化したＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を免疫沈降させたもののゲルとよく似ていた。このことは類似のタンパク質が精製されたことを示す。

　アフィニティー精製中、２５ｋＤのＬＴ型は１９〜２０ｋＤ型に切断されるようである。すなわち、このＬＴ型は、本来の完全な組換えＣＨＯ細胞由来のＬＴと共泳動する。ＲＰＭＩ　１７８８腫瘍系から天然のＬＴを最初に単離したときもＮ末端が切断した「ｄｅｓ−２０」ＬＴ型が生成した。そのアフィニティーで精製されたタンパク質を一次元ＣＮＢｒ消化したところ、切断された２０ｋＤのＬＴ型がおそらくこのＬＴ型が端を切り取られていることを示すＣＮＢｒ切断パターンをもっていることを示した。「ｄｅｓ−２０」ＬＴ型中の１つのメチオニンが失われているので、切断パターンは本来の完全なＬＴ型と異なるであろう。３３ｋＤタンパク質（ｐ３３）はＣＮＢｒによる切断時にダブレットを生成したが、このことから、単一のメチオニンがＣ末端もしくはＮ末端から５０〜２０の残基内に存在するにちがいないと推定した。この切断パターンは、３３ｋＤのタンパク質が公知のＬＴ型とは有意に異なることを示している。表面をヨウ素化した３３ｋＤタンパク質のＣＮＢｒ切断分析結果はよく似た結果を示したが、ヨウ素化によって達成できる分割はダブレットを目視可能にするには不十分であった。ヨウ素化したｒＬＴ、ｒＴＮＦおよびＩＩ−２３．Ｄ７ＬＴ型をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ｖ８で消化したこところ、ｒＬＴと２５〜２６ｋＤのＩＩ−２３，Ｄ７型を消化に対して耐性であることを示した。このことは上記のタンパク質がＬＴに帰属することを確認している。３３ｋＤのタンパク質は、ｒＴＮＦとよく似たパターンでいくつかの小さなフラグメントに切断された。

　図７において、免疫沈降された表面ヨウ素化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で分割して、表面関連２５〜２６ｋＤタンパク質（「ｓＬＴ」）と３３ｋＤタンパク質（「ｐ３３」）のバンドを切り取った。得られた切片を、Ｎ−グルカナーゼ（Ｎ−Ｇ１ｙ）、ノイラミニダーゼとＯ−グルカナーゼ（Ｏ−Ｇｌｙ）の混合物、またはこれらの３種の酵素全部で消化した。消化した切片を再度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、乾燥したゲルのオートラジオグラムを示す。図７に示すように、ヨウ素化した表面ＬＴを免疫沈降させ、続いてＮ−グルカナーゼもしくはＯ−グルカナーゼまたは両方で消化したところ、２５〜２６ｋＤのＬＴ型がＮ連結したオリゴ糖を含有していることを示した。この２５〜２６ｋＤのＬＴ型はＮ連結部位を１つだけ含有し、このことはＮ−グルカナーゼで消化した場合の大きさの変化とよく関連している。同様に３３ｋＤ型（ｐ３３）は、Ｎ−グリカナーゼ処理すると約３ｋＤの大きさを失った。このことは、Ｎ連結オリゴ糖が１つ存在していることを示唆している。２５〜２６ｋＤ　ＬＴ型とは異なり、Ｏ−グルカナーゼで処理してもｐ３３の分子量に影響はなかった。しかしグリカナーゼによって切断しないことが炭水化物を欠いていることの決定的な証拠ではない。

　（実施例４：ＬＴの再免疫沈降）
　ｐ３３とＬＴが共沈降するということは、これらのタンパク質が、抗原的に関連しているか、または物理的に結合していることを示唆している。この問題を解決するために、本発明の発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたＬＴ（ｐ２５）タンパク質とｐ３３タンパク質が免疫沈降することできるか否かを試験した。^１２５Ｉもしくは^３５Ｓ−Ｍｅｔで標識したＬＴとｐ３３をまず免疫沈降で部分的に精製し次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。標識バンドを切取り、緩衝液中で再水和し、次いでタンパク質を溶離した。溶離したタンパク質を、ポリクローナルもしくはモノクローナルの抗ｒＬＴ抗体を用いて第２回目の免疫沈降を行った（図１０）。ウサギ抗ｒＬＴはＬＴを再度免疫沈降させたが（「ｐ２５」、レーン２）、ｐ３３を免疫沈降させなかった（レーン３）。抗ｒＬＴｍＡｂはＬＴを免疫沈降させ（レーン５）、２１ｋＤタンパク質（「ｐ２１」、レーン４）は以下に示すようにＬＴの前駆体であるが、ｐ３３を沈降させなかった（レーン６）。この結果は、ＬＴとｐ３３がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された後、ポリクローナとモノクローナルの抗ｒＬＴ抗体はＬＴと反応できるがｐ３３と反応できないことを示している。このデータは、ｐ３３は抗原的にＬＴと関連していない証拠を与える。しかし推定上のこのｐ３３の交差反応性エピトープは変性後に失われるが一方ＬＴエピトープは本来の完全なままで残るという可能性を捨てることはできない。

　図８は、^１２５Ｉおよび^３５Ｓ−Ｍｅｔで標識したｐ２５とｐ３３のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶離しこれを再沈降した結果を示す。^１２５Ｉで標識したＩＩ−２３．Ｄ７細胞（レーン２、３）および^３５Ｓ−で標識した細胞（レーン４、５、６）由来のＬＴとｐ３３の種を、前記のようにしてゲル切片から溶離した。溶出物を、抗ｒＬＴ血清（レーン２、３）もしくは抗ｒＬＴｍＡｂ（レーン４、５、６）で免疫沈降させ、次にその再沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートランジオグラフィーで分析した。レーン１はｐ２５とｐ３３を同定するための対象のレーンである。

　（実施例５：ＬＴとｐ３３の等電点電気泳動）
　図９と１０（各々、オートラジオグラフ（９Ａ，１０Ａ）と、泳動距離対ｐＨをグラフにした校正曲線（９Ｂ，１０Ｂ）で構成されている）は、変性条件下（図９）および未変性条件下（図１０）での等電点電気泳動分折の結果を示す。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の抽出物から免疫沈降させた、^１２５Ｉ標識ｐ２５とｐ３３について、上記のようにして、二次元ゲル分析を行った。この二次元ゲル分析は、尿素の存在下変性条件下で実施した（図９Ａ）。これに対して、未変性ＩＥＦは尿素なしで１％ＮＰ−４０中で実施した。まず、^１２５Ｉ標識ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の抽出物を４°でチューブゲルに等電点電気泳動を行わせた。この泳動をさせた後、チューブゲルを１ｃｍずつの切片に切断し、泳動させたタンパク質をこれらの切片から溶離し、免疫沈降させ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０Ａ）。ゲルレーン１〜１２から免疫沈降させた物質はチューブゲルの切片２〜１３に相当する。ｐＨの勾配を、変性チューブゲルと未変性チューブゲールの両方について１ｃｍのゲル区分ごとに生成させた。これらの結果は、それぞれ、各々のオートラジオグラムの下方に図９Ｂと図１０Ｂとして示す。

　（実施例６：ＬＴ発現の調節）
　以下に示す表Ｉは、ＬＴの表面型の発現について、種々の細胞型の流動細胞蛍光分光分析法を用いて行った試験の結果を要約したものである。

　これらの試験からの最も衝撃的な観察結果は、表面ＬＴのＴ細胞のみへの発現の制限であった。Ｌｅｕ−Ｍ３とい単球マーカーとｌｅｕ−４（ＣＤ３）という抗体を、二色流動細胞蛍光分光分析法に用いて、各細胞集団を別個に観察した。この分析で、表面ＴＮＦと表面ＬＴとの間に著しい相違点があることが分かった。すなわち単球は表面ＴＮＦだけを発現したが、一方Ｔ細胞は表面ＬＴだけを発現した。この結果を図１１に示す。

　図１１に示す試験において、ＰＢＬは、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、インターフェロン−γ（２００Ｕ／ｍｌ）およびＯＫＴ３（１ｎｇ／ｍｌ）の混合物で８時間処理し、次にＬＴ（ウサギ５由来の抗ｒＬＴ血清）またはＴＮＦ（ウサギ７由来の抗ｒＴＮＦ血清）に対して染色し、次いでＦＩＴＣ抗ウサギ標識化を行った。細胞をフィコエリトリン−Ｌｅｕ−４すなわちｐａｎＴ細胞マーカー、またはフィコエリトリン−Ｌｅｕ−Ｍ３すなわち単球マーカーで対比染色を行った。「Ｔ細胞パネル」はＬｅｕ−４^＋細胞により判別され、一方「単球」のパネルはＬｅｕ−Ｍ３^＋細胞により判別された。細胞は、免疫前の血清（点線）もしくは免疫後の血清（実線）で染色された。単球腫瘍系ＨＬ−６０とＵ９３７はＬＴに対し染色しなかった。二色流動細胞蛍光分光分析法を用いて、活性化ＰＢＬのＴ４とＴ８のサブクラスが、同じレベルの表面関連ＬＴを発現することが見出された。一般に、ＬＴを発現できる一次Ｔ細胞は表面ＬＴ型を発現できるようである。

　３種のヒトドナーを試験した結果、表面ＬＴ型は、新たに単離された休止末梢Ｔ細胞に存在していることが分かった。ＰＢＬの場合、この細胞をＯＫＴ３で活性化させるかまたは単にＩＬ−２で処理すると発現が増大する。本発明の発明者らは、蛍光チャネル番号を用いて、ＯＫＴ３による活性化の際の表面ＬＴとＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の両者の発現の定量を試みた。ＯＫＴ３による最大の表面ＬＴの誘発は、バルク培養物中のＩＬ−２受容体のピーク発現（ＴＡＣ発現）より先行するようである。したがって、表面に結合さ
れたＬＴ型（ｐ３３／ＬＴ複合体）は初期のＴ細胞活性化抗原のようである。抗Ｔ１１と同様異系抗原が、クローンニングされた細胞毒性Ｔ細胞の表面にＬＴを出現させることができることが見出された。同様に、ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマの表面にＬＴの出現を誘発するにはＰＭＡによる刺激が必要であった。Ｔ細胞活性化によって表面ＬＴ型が増大するようである。末梢リンパ球は、ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマとは異なり、ＰＭＡ処理の後、非常に速やかに表面ＬＴ型を下方調整する。同様に、ＯＫＴ３で活性化されたＰＢＬ集団のＤｒ^＋細胞の二色分析において、Ｄｒ^＋細胞は、活性化が進んだ段階ではＴ細胞を含んでいるはずであるが、表面ＬＴ型を欠いていた。

　新しいＰＢＬの高いレベルのＩＬ−２による活性化によって、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）が生成した。図１２の抗ｒＬＴとｌｅｕ−１９を用いる二色流動細胞蛍光分光分析の結果に示すように、ＮＫ／ＬＡＫ細胞マーカーは、表面ＬＴ型のＬＡＫ細胞発現がＴ細胞ハイブリドーマのＩＩ−２３．Ｄ７に似ていることを示した。図１２に示した試験において、ＰＢＬは、２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−２とともに５日間培養し、次いで二色分析を行うため、上記したのと同様に、フィコエリトリンで標識をつけたｌｅｕ−１９と抗ｒＬＴ（ウサギ５）で染色した。図１２は、免疫前の血清（点線）もしくは免疫後の血清（実線）染色されたｌｅｕ−１９^＋細胞の表面ＬＴのレベルを示す。したがってＬＡＫ細胞は、主要細胞タイプの表面ＬＴ型を最高のレベルでもっているようである。

　（実施例７：全体のＴＮＦもしはＬＴのＴ細胞活性化に対する機能上の関連）
　ＴＮＦおよびＬＴのＴ細胞活性化プロセスに対する機能上の関連を試験するために、本発明の発明者らは、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）検定とＯＫＴ３活性化検定にウサギ抗ｒＬＴと抗ｒＴＮＦの血清を用いた。ＭＬＲは、個体のＴ細胞が他人のＴ細胞を異質として認識し、その存在に対して、増殖で応答する能力を試験する標準的な免疫学的検定法である。以下に示す表ＩＩは種々の応答個体／刺激要因物質の組合わせを用いて行ったＭＬＲ試験から得たデータを示す。

　^ａ％変化は、応答個体細胞単独のバックグランドに対する補正を行った後の^３Ｈ−チミジン取り込みの増減を意味する．
　^ｂ刺激要因物質細胞は、３０００ラドの線量の照射を受け「＊」印を付けてある。刺激物質集団の増殖のレベルは明かに低い。応答個体：刺激物質の比率は１／１．５であった．
　^ｃｒＴＮＦとｒＬＴは１０ｎｇ／ｍｌのレベルまで添加した．
　^ｄ抗血清は５６℃で１時間加熱して不活性化し濾過し、最終的に１：２５０の希釈度で使用した．
　^ｅモノクローナル抗ＴＮＦは精製マウスＩｇＧ_２ａ抗体であり２μｇ／ｍｌで使用し、この場合の対照は純品のマウスＵＰＣ１０（ＩｇＧ_２ａ）であった．
　^ｆこれらの場合、免疫グロブリンの画分は、血清から精製し、５０μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。

　表ＩＩに示すように、中和抗ｒＬＴ血清（ウサギ４と５）は、５日間評価した結果、増殖応答を阻害し、一方免疫前血清または非中和性抗ｒＬＴ（ウサギ６）血清はおだやかな刺激作用をもっていた。先に報告されているように（Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、「Ｔｈｅ　Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ−α　Ａｎｄ　−β　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｊ．ｌｍｍｕｎ．，１４１巻、４９９頁、１９８８年）、ポリクローナルおよびモノクローナルの抗ＴＮＦ調製物も阻害性であった。これらの検定は過剰の刺激物質細胞条件下で行ったので阻害は最適でないかもしれない。表ＩＩで使用した血清レベルは幾分高いが、他の試験（データは記載していない）では、１：１０００の抗体希釈物は依然として阻害性であった。またＰＨＡもしくはＯＫＴ３で刺激されたＴ細胞の増殖もわずかに阻害された（データは記載していない）。これらのデータは、Ｔ細胞表面上のＬＴもしくはＬＴ関連エピトープがＴ細胞の活性化に関与していることを示した。

　ＭＬＲ検定と中和モノクローナル抗体を用いる以前の研究では、Ｔ細胞活性化とこの系における次の増殖に、ＴＮＦは関連があったがＬＴは関連がなかった（Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、前記文献）。その研究において、モノクローナル抗ｒＬＴ抗体はＭＬＲ検定に対して影響しなかった。本発明の発明者の研究は、中和ポリクローナル抗ＣＨＯ細胞由来ｒＬＴ血清が部分的にＭＬＲを阻害できることを示しており、このことは、この系におけるある型のＬＴの役割を示唆している。この相違の理由は明らかでないが、これらの抗体調製物の性質になんらかの差異があるものかもしれない。そのモノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドで架橋された天然ＬＴ（ＲＰＭＩ　１７８８が分泌したもの）に対して生成したが、ポリクローナル抗ｒＬＴ血清は、未変性ｒＬＴ（組換えＣＨＯ細胞由来）をフロイントアジュバントとともにリンパ節に直接注射して調製した。後者の系で成功した蓄積効果は、マウスを免疫することが困難であることが報告されている（Ｔ．Ｂｒｉｎｇｍａｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ａｌｐｈａ　ａｎｄ　Ｂｅｔａ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｆｏｒ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ａｎｄ　Ａｓ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｈｂｒｉｄｏｍａ，６巻、４８９頁、１９８７年）ことからみて重要であったと考えられる。これらのデータは、本発明のポリクローナル抗ｒＬＴ血清のＭＬＲに対する阻害作用は、通常のＬＴ型の認識ではなくて、血清による表面ＬＴ型め認識の結果であることを示唆している。

　（実施例８：ＬＴおよび関連タンパク質ｐ３３の精製）
　ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、ウシ胎児血清を１０％含有するＲＰＭＩ培地内で増殖させ、５０　ｌのＲＰＭｌ培地から細胞を集め、これを４×１０^６細胞／ｍｌの濃度で培地内に再懸濁させ、次いで５０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリストイルアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間活性化させた後、細胞を遠心分離で集めてダルベッコのリン酸緩衝液で洗浄した。最後の細胞ペレット（４×１０^１０細胞）を、２００ｍｌの冷溶菌緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０；０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのべンズアミジン、１０μｇ／ｍｌずつのダイズトリプシン阻害剤、アプロチニン、キモスタチン、ロイペプチン、およびアンチパイン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、ならびに１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）に懸濁させ、次いでペレットは一回窒素キャビテーターを通過させた。溶解させた細胞を、５０．２　Ｔｉローターで、４０，０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離して上澄み液を排棄した。１％　ｗ／ｖの　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０界面活性剤含有の溶菌緩衝液１２０ｍｌで、ペレットを一夜抽出し、次いで上記のようにして遠心分離した。

　界面活性剤で可溶化された膜タンパク質を含有する上澄み液を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ　１０（ＢｉｏＲａｄ）に結合させたモノクローナル抗リンホトキシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した抗腫瘍壊死因子−β）で構成されたアフィニティー樹脂２ｍｌに添加し、得られた樹脂を一夜振盪した。上記樹脂を小さなカラムに集め、１％のＮｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０を含有する５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０で洗浄し、次ぎに１％　ｗ／ｖ　ＭＥＧＡ−８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する同じ緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、１％　ｗ／ｖ　ＭＥＧＡ−８含有５０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．５で溶離し、各画分を直ちにトリス塩基で中和した。各画分中のｐ３３とＬＴの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と銀による染色で測定した。これらのタンパク質を含有する面分を集め、ＳＤＳを添加して最終濃度０．１％　ｗ／ｖとし、次ぎにそのプールを０．１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に対して透析した（ＭＥＧＡ−８界面活性剤を除くために緩衝液は何度も取り換えた）。透析溶液を凍結乾燥し、もとの容積の１／１０の水に再懸濁させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に展開させ、ＰｒｏＢｌｏｔ膜（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にプロットし、次いでクーマシー・ブルー染料で染色した。ｐ３３と２５ｋＤ　ＬＴのバンドを切り取り、タンパク質配列決定装置にかけた。１２０Ａ　ＰＴＨアミノ酸分析器に連結されたモデル４７０Ａ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ配列決定装置を用い、エドマン分解法によって、Ｎ末端の配列を得た。膜関連リンホトキシンのバンドの配列が、分泌されたリンホトキシンについて報告されている配列、すなわち（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒと正確に一致することが見い出された。ｐ３３バンドのタンパク質Ｎ末端の配列は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎまたは（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎであった。６番目のサイクルの配列はＧｌｙとＬｅｕの両者の混合物のようであった。このことは、多型性の可能性を示している。ｐ３３タンパク質は、これらの配列の一方もしくは両方をもっている。

　上記の方法によってｐ３３を精製してプロット上の１つのバンドにすることができる。アフィニティー樹脂から溶離されたタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーで分離することは、当業者であればだれでもできるはずである。例えば、前記複合体は尿素によって解離させることができ、ＬＴとｐ３３のタンパク質は、１％非イオン界面活性剤（例えばＭＥＧＡ−８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と尿素とを含有するトリス−Ｃｌ緩衝液ｐＨ８．０中、塩句配溶離法を用いるＭＯＮＯ　Ｑ　ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。このクロマトグラフィーの方法は、タンパク質の電荷の差に基づいて分離を行う。上記の２つのタンパク質は、電荷の差に基づいて等電点電気泳動法（前記事項参照）で分離することができ、この方法ではｐ３３／ＬＴ複合体を解離させるのに尿素を用いる。アフィニティークロマトグラフィー、尿素／非イオン界面活性剤中での解離およびイオン交換のクロマトグラフィーをこのように組み合わせることによって、可溶性ｐ３３またはｐ３３／ＬＴ複合体を精製することができる。

　（実施例９：クローンニング方法）
　Ａ：タンパク質の配列によって、そのタンパク質をコードすると考えられる核酸配列を予測することができる。本発明の発明者らは、ｐ３３をクローンニングするために、６アミノ酸のセグメントをコードする１７量体のオリゴヌクレオチド配列のプールを利用している。原則としてどんなセグメントでも利用できる。ＰＭＡで誘発されたＩＩ−２３．Ｄ７とＨｕｔ−７８（ＰＭＡなし）（両方ともに、いくつかの非造血系、例えばＨＴ１０８０、ＭＥ−１８０、ＭＣＦ−７およびＲＬ−９５由来のＲＮＡと同様にｐ３３を発現するはずである）由来のＲＮＡのノーザンブロットをプローブするために、放射能標識したオリゴヌクレオチドのプールを利用する。たとえ他の細胞がＬＴを分泌することができても（但しＬＴを細胞表面に誘導しない）、ＬＴはＴ細胞上にのみ観察されるので、本発明の発明者らは、ｐ３３は、Ｔ細胞内でのみ発現されると考えている。また本発明の発明者は、Ｔ細胞内で優先的に発現される約１．０ｋｂより大きい（３０ｋＤのタンパク質をコードするため）ｍＲＮＡがあると考えている。本発明の発明者らは、正しいプローブのプールを見い出したならば、そのプローブを用いてＲＭＡで誘発されたＩＩ−２３．Ｄ７　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。その正しいクローンは、安定してｒＬＴでトランスフェクトされ構造的にＬＴを分泌するＣＨＯ細胞系内で、ＬＴに表面を標的にさせるであろう（ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＲｉｂｏｌｉｎｉ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，上記文献）。

　Ｂ：ｐ３３／ＬＴ複合体を得るためには、ＬＴとｐ３３の両方が必要であるが、両者のクローンが同じ細胞内にトランスフェクトされる可能性は非常に低いので通常の発現クローンニング法は役に立たない。発現ベクター中の、ＩＩ−２３．Ｄ７由来ｃＤＮＡライブラリーおよびＬＴ　ｃＤＮＡでＣＯＳ細胞のような哺乳動物の細胞をトランスフェクトすると、ＬＴとｐ３３の両方のＤＮＡでトランスフェクトされたこれらの細胞の中の表面にＬＴを向かわせるはずである。ＣＯＳ細胞をＬＴだけでトランスフェクトすると表面ＬＴ型は出現するに至らない。ＬＴとｐ３３の両方を発現する細胞は抗ＬＴ抗体に対して選別されるであろう（Ａ，ＡｒｕｆｆｏおよびＢ．Ｓｅｅｄ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ＣＤ２８　ｃＤＮＡ　ｂｙ　ａ　Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ＣＯＳ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８５７３〜８５７７頁、１９８７年）。ＰＭＡで誘発されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞系はこの状態で非常にうまく選別する。したがって本発明の発明者らは、ＬＴでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のｐＣＤＭ８ベクター系中のＰＭＡ誘発ＩＩ−２３．Ｄ７ライブラリーをスクリーングすればｐ３３のクローンが得られると考えている。

　（配列表）

図１は、ＯＫＴ３で刺激されＩＬ−２で増大された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、３つの異なるウサギ抗ｒＬＴ抗血清と反応し、ウサギ抗ｒＴＮＦ抗血清とは全く反応しないことを示す、流動細胞蛍光分光分析結果を示す。 図２は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７の細胞表面上にＬＴ関連エピトープが存在することを示す（ＰＭＡ処理後）流動細胞蛍光分光分析結果を示す。 図３は、ＰＭＡで活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞が抗ｒＬＴ抗体と結合する能力を示す。抗ｒＬＴ抗血清の試料を、ＰＭＡで処理されたＵ９３７細胞（非ＬＴ産生）細胞、（白丸印）、ＰＭＡで活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞（１０^８，黒四角印；１０^７，−・−印）および細胞なし（対照、白四角印）とともにインキュベートした。インキュベートを行った後、細胞なしの抗血清の系列希釈液をｒＬＴに添加して、Ｌ９２９細胞（ＬＴ−感受性細胞）に対する細胞毒性の検定に使用した。このグラフは、ｒＬＴを中和する抗体が、活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞によって抗血清から除去されたことを示している。 図４は、ＰＭＡで活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来の^１２５Ｉで標識された表面タンパク質の免疫沈降を示す、２つのオートラジオグラフ（ＡとＢ）である。図４Ａは、免疫後のウサギ抗ｒＬＴ抗血清によって約２５ｋＤの表面タンパク質（ＬＴ）と約３３ｋＤの表面タンパク質（ｐ３３）が免疫沈降されるが、免疫前のウサギ血清では免疫沈降されないことを示す。図４Ｂは、図４Ａの２５ｋＤと３３ｋＤのバンドの一次元ＣＮＢｒ切断マップを示し、Ｅ．ｃｏｌｉ内で産生された組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）およびＣＨＯ細胞内で産生された組換えリンホトキシン（ｒＬＴ）と比較している（Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，「Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　Ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｌｉｎｅｓ」，Ｊ，Ｉｍｍｕｎ，，１４３巻，１８５９頁，１９８９年）。なお、両方ともＣＮＢｒによる切断あり（＋）と、なし（−）について比較している。 図５は、^３５Ｓ−メチオニンもしくは^３５Ｓ−システインで代謝的に標識されたＰＭＡ刺激ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来のＴＮＦおよびＬＴに関連するタンパク質の免疫沈降を示すオートラジオグラフである。この図は、メチオニン含有の約２５ｋＤの表面タンパク質（ＬＴ）；およびメチオニン並びにシステインを含有する約３３ｋＤの表面タンパク質（ｐ３３）が抗ｒＬＴ抗血清（Ｌ）によって認識されるが、免疫前の血清（Ｐ）もしくは抗ｒＴＮＦ抗血清（Ｔ）によっては認識されないことを示している。またこれらのオートラジオグラフは、活性化されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞も２６ｋＤ型のＴＮＦを産生し可溶性リンホトキシンを分泌し得ることを示している。 図６は、抗ｒＬＴ血清で認識された、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来のこれらタンパク質のアフィニティー精製ＣＮＢｒペプチドマッピングを示す。図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）もしくは免疫後（ＰＯＳＴ）のウサギ血清から調製された抗ＬＴアフィニティーカラムから溶離されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す。図６Ａは約３３ｋＤと約２０ｋＤのタンパク質のバンドが、免疫前血清（ＰＲＥ）を用いて調製したアフィニティーカラムには結合しなかったが、抗ｒＬＴ抗血清（ＰＯＳＴ）を用いて作製したアフィニティーカラムには結合したことを示す。図６Ｂは、上記のＰＯＳＴカラムから溶離された約３３ｋＤおよび約２０ｋＤのタンパク質の部分ＣＮＢｒ切断結果を、ｒＴＮＦとｒＬＴと並列して比較して示す。得られたゲルは銀染色することによって黙視可能にした。 図７は、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞から免疫沈降させた約２５ｋＤおよび約３３ｋＤの^１２５Ｉで標識されたタンパク質（それぞれ「ｓＬＴ」およびｐ３３と呼ぶ）を、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙ）で、ノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼ（Ｏ−ｇｌｙ）の混合物で、またはこれら３酵素全部で処理したもののオートラジオグラフを示す。 図８は、ｐ３３とＬＴが免疫原的に関連があるか否かをさらに調べるために、共沈降されたｐ３３とＬＴのタンパク質を再度免疫沈降させた結果を示す。 図９（図９Ａと９Ｂで構成されている）は、免疫沈降されたｐ３３とｐ２５（ＬＴ）のタンパク質を変性条件下で等電点電気泳動法に付した試験結果を示す。 図１０（図１０Ａと１０Ｂで構成されてる）は、免疫沈降されたｐ３３とｐ２５（ＬＴ）のタンパク質を未変性条件下で等電点電気泳動法に付した試験結果を示す。図９と図１０を総合すると、ｐ３３とＬＴが変性可能な複合体であることを示している。 図１１は、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γおよびＯＫＴ３の混合物で刺激した後、Ｔ細胞と単球に別々に発現される表面タンパク質の流動細胞蛍光分光分析の結果を示す。刺激されたＰＢＬのプールから分離されたＴ細胞が、抗ｒＬＴ抗血清で認識される表面タンパク質（ＬＴ）を発現し、一方同プールから分離された単球が抗ｒＴＮＦ抗血清で認識される表面タンパク質（ＴＮＦ）を発現することが観察された。 図１２は、ＩＬ−２で処理されたｌｅｕ−１９⁻細胞とｌｅｕ−１９^＋細胞（すなわちナチュラルキラー細胞）上の表面ＬＴ型の流動細胞蛍光分光分析結果を示す。標識したｌｅｕ−１９と抗ｒＬＴの両者による、ＩＬ−２で処理されたＰＢＬの分析によって、リンホカインで活性化されたキラー細胞（ＬＡＫ細胞）が表面ＬＴ型を発現することが確認される。

Claims (9)

1. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；あるいは
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド、
   により媒介される事象を妨害する、インヒビター。
2. 前記妨害される事象がＴ細胞活性化である、請求項１に記載のインヒビター。
3. 前記妨害される事象が、リンホトキシンと結合して、複合体を形成することである、請求項１に記載のインヒビター。
4. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド；
   　（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のリンパ球膜型ポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、ポリペプチド複合体；あるいは
   　（ｉｘ）　（ｖｉｉｉ）の複合体であって、該リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、複合体
   の活性を阻害するインヒビター。
5. 前記妨害される事象がＴ細胞活性化である、請求項４に記載のインヒビター。
6. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド；
   　（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のリンパ球膜型ポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、ポリペプチド複合体；あるいは
   　（ｉｘ）　（ｖｉｉｉ）の複合体であって、該リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、複合体；
   　（ｘ）上記（ｉ）〜（ｉｘ）に対する抗体、
   および薬学的に受容可能な担体を含む、ＨＩＶ感染症の蔓延、重篤度あるいは免疫不全作用を予防、もしくは軽減するための組成物。
7. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド；
   　（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のリンパ球膜型ポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、ポリペプチド複合体；あるいは
   　（ｉｘ）　（ｖｉｉｉ）の複合体であって、該リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、複合体；
   　（ｘ）上記（ｉ）〜（ｉｘ）に対する抗体、
   および薬学的に受容可能な担体、
   を含む、新生物の蔓延、重篤度あるいは作用を予防、治療もしくは軽減するための組成物。
8. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド；
   　（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のリンパ球膜型ポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、ポリペプチド複合体；あるいは
   　（ｉｘ）　（ｖｉｉｉ）の複合体であって、該リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、複合体；
   　（ｘ）上記（ｉ）〜（ｉｘ）に対する抗体、
   および薬学的に受容可能な担体を含む、炎症あるいは炎症性疾患の蔓延、重篤度あるいは作用を予防、治療もしくは軽減するための組成物。
9. （ｉ）アミノ末端部分に、配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉ）アミノ末端部分に、配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎにおいて１または数個のアミノ酸欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含む、３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｉｉ）　アミノ末端部分に配列番号２のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｉｖ）アミノ末端部分に配列番号３のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎの一部を含むアミノ酸配列を含む３１〜３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと複合体を形成し得る、ポリペプチド；
   　（ｖ）　３１〜３５ｋＤの分子量を有し、かつメチオニン残基およびシステイン残基の両方を有するリンパ球膜ポリペプチドであって、該ポリペプチドがリンホトキシンと結合し得、かつＯＫＴ−３に刺激された一次Ｔ細胞および抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンの表面上に位置づけ可能である、リンパ球膜ポリペプチド；または
   　（ｖｉ）ＯＫＴ３に刺激された一次Ｔ細胞または抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローンのようなＴ細胞の表面上にＬＴ関連エピトープを発現し、免疫沈降法と組み合わせた表面ヨウ素化により該細胞の表面上に発現された３１〜３５ｋＤのポリペプチドを単離することによって得られるリンパ球膜ポリペプチド；
   　（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードし発現させるＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列で本質的に構成されている、ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、培養における単細胞宿主、または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法により生成されたポリペプチド；
   　（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のリンパ球膜型ポリペプチド、およびリンホトキシンを含有する、ポリペプチド複合体；あるいは
   　（ｉｘ）　（ｖｉｉｉ）の複合体であって、該リンホトキシンが、ヒトもしくは動物のネイティブリンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌されたリンホトキシン、または上記のいずれかのリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される、複合体；
   　（ｘ）上記（ｉ）〜（ｉｘ）に対する抗体、
   および薬学的に受容可能な担体を含む、患者の免疫応答を調整するための組成物。
   

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