JPH0415063A - ヒトトロンボモジュリンを固定化した抗血栓性材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトトロンボモジュリンをスペーサーを介し
て、不溶性担体に共有結合により固定化した抗血栓性材
料に関する。

（従来の技術］ 近年、人工臓器などの医用材＄４の開発の重要性が高ま
っているが、この技術においては、生体適合性の問題が
存在し、特に血液凝固をひきおこして血栓を生成しない
性質、即ち抗血栓性が特に要求される。

医用材料に抗血栓性を持たせるための方法としては、大
きく分けて、材ネ１自体の物理化学的性状を工夫する方
法と、材料に抗血栓作用を有する生理活性成分を固定化
する方法の２つが挙げられる。

このうち、生理活性成分を固定化する方法については、
近年、血栓形成の機序が分子レベルでかなり明らかにな
り、血栓形成を抑制する因子や形成された血栓を熔解す
る因子が多く見つかっているため、これらを利用するこ
とが試みられている。

ここで、生理活性成分の固定化については、大きく次の
２つに分けることができる。即ち、１）イオン結合によ
る固定化や材料への包理による固定化のように、生理活
性成分を徐放するタイプのもの、２）共有結合により固
定化することにより、抗血栓性作用を材料近傍に限定す
るタイプのもの、の２つが挙げられる。このうち、１）
の徐放性のものは、生理活性成分が血液中に放出される
ことによる副作用の問題がある。さらに、徐放が進んだ
時の徐放の安定性の問題や、完全に放出された後は抗血
栓性作用は期待できなくなるなどの問題もある。

次に、固定化される生理活性成分については、血栓形成
のどの過程に作用するかにより、大きく３種類に分けら
れる。即ち、１）血液凝固因子の活性を抑えるもの、２
）血小板の活性化を抑えるもの、及び、３）形成した血
栓を溶解する作用を持つもの、の３種類に分けられる。

１）では、ヘパリン、アンチトロンビンＩ［［、）ロン
ボモジュリンなどカ、２）では、プロスタグランジン、
アスピリン、スルフィンピラゾンなどが、３）ではウロ
キナーゼなどが挙げられる。

トロンボモジュリンは、抗血栓性作用のある生理活性成
分として、近年、注目されている（鈴木宏治、山本修司
、「臨床病理」、８１号、１３４ページ）。トロンボモ
ジュリンは、トロンビンと可逆的に結合し１：１の複合
体を形成することにより、トロンビンの血液凝固系およ
び血小板に対する凝集促進作用を促進する。さらに、ト
ロンビンによるプロティンＣの活性化を促進して血液凝
固を抑制する。また、トロンボモジュリンのアミノ酸配
列の一部であるペプチドまたはその相同変異体もトロン
ビンによるプロティンＣの活性化を促進することが判明
している（特開昭６４−６２１９号公報）。

さらに、トロンボモジュリンの抗血栓性を利用する目的
で、ウシ肺由来のトロンボモジュリンを生理学的に許容
し得る担体に固定して成る抗血栓性材料が開示されてい
る（特開昭６１−８２７６０号公報）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記特開昭６１８２７６０号公報に開示されているウシ
肺由来トロンボモジュリンは純度および構造が明確でな
い。これらのことは、実際の抗血栓性材料を作成する時
には、抗血栓性の再現性に大きく影響することになる。

さらに、トロンボモジュリンの取得に関しても、詳細は
不明であるため、この点でも抗血栓性の再現には問題が
残る。

〔問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、由来、構造の明確なヒトトロンボモジュ
リンを、不溶性担体に固定化した抗血栓性材料を鋭意検
討した結果、スペーサーを介して、共有結合によりヒト
トロンボモジュリンを不溶性担体に固定化したものが、
抗血栓性材料として好適であることを見い出し、本発明
をなすに至った。

本発明にかかわるヒトトロンボモジュリンは、たとえば
、ヒト肺組織から精製したトロンボモジュリンをその一
例として挙げることができる。このトロンボモジュリン
の取得方法および精製方法については、たとえば、特開
昭６４−６２１９号公報の参考例２に記載される方法を
用いることができる。さらに遺伝子工学的手法によって
も、本発明にかかわるヒトトロンボモジュリンを得るこ
とができる（特開昭６４−６２１９号公報）。

さらに、ヒトトロンボモジュリンとしては、トロンボモ
ジュリン分子をそのまま用いてもよいし、トロンボモジ
ュリンの構造の一部分の構造を有するペプチドまたは該
ペプチドを含む構造を有するペプチドを用いてもよい、
トロンボモジュリンの構造の一部分の構造を有するペプ
チドとしては、次式（１） ％式％ で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とする、
トロンビンによるプロティンＣの活性化を促進する作用
を有するペプチドまたはその相同変異体を挙げることが
できる。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できる。また、不溶性担体の形状は、
粒子状、繊維状、中空糸状、膜状などいずれの公知の形
状も用いることができる。不溶性担体は、スペーサーを
共有結合により固定化するのに利用できる官能基を有す
るものであれば、材質は特に限定されない。該官能基を
不溶性担体自体が持たない場合でも、適当な化学的修飾
によりヒトトロンボモジュリンの固定化に利用し得る官
能基を生じさせることができるものは、本発明に使用す
ることができる。

このような不溶性担体の例としては、アガロース系、デ
キストラン系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、
ガラス系、活性炭系、ポリアミド系、ポリエステル系、
ポリウレタン系、ビニル化合物の重合体などを挙げるこ
とができる。

スペーサーの不溶性担体への固定化には、共有結合が用
いられる。また、スペーサーとヒトトロンボモジュリン
の間の結合も、共有結合が用いられる。これらの共有結
合を形成させる方法としては、固定化酵素、アフィニテ
ィクロマトグラフイーで通常用いられる公知の活性化方
法および結合方法を用いることができる。

本発明にかかわるスペーサーは、線状分子の両端にある
強イオン性基でない親水性官能基がそれぞれヒトトロン
ボモジュリンの官能基と不溶性担体の官能基と直接に、
または、官能基を活性化して得られる活性基と反応して
共有結合した構造を有し、ヒトトロンボモジュリンとプ
ロティンＣおよび／またはトロンビンとが十分相互作用
し得る長さであることが好ましい。

線状分子としては、たとえば、両末端の親水性官能基の
間に、メチレン鎖、アミド結合、エーテル結合などを有
したものが挙げられる。該線状分子の長さは、該分子の
末端に固定化されたヒトトロンボモジュリンが、プロテ
ィンＣおよび／またはトロンビンと十分に相互作用し得
る長さであれば特に限定されないが、炭素数１〜５００
に相当する分子長であることが好ましい。実用的には炭
素数３〜３５０に相当する分子長がより好ましい。

具体的には、６−アミノヘキサン酸、β−アラニン、グ
リシン、グリシルグリシン、グリシルグリシルグリジン
、アミノエタノール、２．２’　　−ジアミノジエチル
エーテル、ポリグリシン、ポリエチレングリコールおよ
びその誘導体、ポリプロピし／ングリコールおよびその
誘導体などを挙げることができる。

また、両端にアミノ基を有するジアミン、両端にカルボ
キシル基を有するジカルボン酸なども用いることができ
る。

ジアミンの例としては、ｌ、２−ジアミノエタン、１．
３−ジアミノプロパン、１．４−ジアミノブタン、１．
５−ジアミノペンクン、１．６ジアミノヘキサン、１７
−ジアミノへブタン、１８−ジアミノオクタン、１．９
−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカンなどを挙
げることができる。また、ジカルボン酸の例としては、
ンユウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、ピメリン酸、スペリン酸などを挙げることができる
。また、ポリエチレングリコールの誘導体としては、た
とえば、次式（ＩＩ）で示される構造を有するものを挙
げることができる。

ＬＮＣＬＣＬＣｔｌｚＯ（ＣｔｈＣＬＯ）−ＣＩＩｔＣ
Ｉｌ□ＣＪＩ、Ｎｉ１！（ｎ＝１〜１６０）　−（ＩＩ
　） さらに、ポリプロピレングリコールの誘導体としては、
たとえば次式ＣＩ［Ｉ）で示される構造を有するものを
挙げることができる。

Ｃ１１゜ ＋１．ＮＣＩｈＣ１１□Ｃ１１！０（Ｃ１１−Ｃ１１，
０）ｌｌＣ１Ｉ□ＣＩＩ□ＣＩＩ□Ｎｌ＋□（ロー１〜
１６０）・・・　（Ｉｌｌ）スペーサーは単一種でも、
また二種以上の共存でもよい。また、単一種の線状分子
を固定化した後に、該線状分子の末端に他の種類の線状
分子を固定化してスペーサーとしても良い。このような
例として、たとえば、不溶性担体にグルタル酸などのジ
カルボン酸を固定化した後に、前記式（ＩＩ）で示され
るポリエチレングリコールの誘導体をさらに固定化さゼ
たものを挙げることができる。

」二記の線状分子の不溶性担体への固定化、および該線
状分子の末端へのヒトトロンボモジュリンの固定化には
、官能基を活性化したいわゆる活性基を生成させた後に
目的の物質を反応させて固定化する方法を用いてもよい
し、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて反応させたい
官能基を反応させて固定化する方法を用いてもよい。

不溶性担体を活性化しで生成する活性基とじては次のも
のを挙げることができる。ここでいう活性基とは、スペ
ーサーとなる線状分子またはヒトトロンボモジュリンの
アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、カルボ
キシル基などの活性水素を存する求核反応基と反応し得
る基であり、具体的には、イミダゾリルカルバメート基
、イミドカーボネート基、シアネートエステル基、エポ
キシ基、カーボネート基、ブロモアセチル基、ハロゲン
化トリアジン基、トレシル基などを挙げることができる
。

本発明の抗血栓性材料の抗血栓性の指標としては、たと
えば、活性化部分トロンボプラスチン時間を挙げること
ができる。活性化部分トロンボプラスチン時間は、血漿
の内因系凝固系の全過程での凝固時間であり、抗血栓性
を有する物質が存在するとその時間が延長するため、抗
血栓性の指標となる。

〔発明の効果〕

本発明の抗血栓性材料は、抗血液凝固作用と血小板凝集
抑制作用および血栓溶解作用を有するヒトトロンボモジ
ュリンを、スペーサーを介して共有結合により不溶性担
体に固定化しであるため、スペーサーのないものと比べ
て抗血栓性が大きいという利点を有している。

さらに、本発明の抗血栓性材料は、構造の明確なヒトト
ロンボモジュリンを用いるため、再現性のよい抗血栓性
材料を作成することが期待される。

以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例］ 実施■ ヒトトロンボモジュリンとして、特開昭６４６２１９号
公報の記載に従い、遺伝子工学的手法によって得たトロ
ンボモジュリンを用いた。また、不溶性担体としてはガ
ラスピーズを用いた。

Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピル基を表
面に有するガラスピーズ（シグマ社製、アミノ基含量３
２３μ顛ｏｌ／ｇ）１．０ｇを０．２Ｍのリン酸緩衝化
生理食塩水（ｐＨ５，０）９ｍｆに懸濁させた。ゲルタ
ン酸４２．６　ｍ　ｇと、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド・−塩酸塩１．２
４　ｇを、０．２Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ５，
０）５ｍβに溶解し、１時間、水冷下で撹拌して得た溶
液と、上記の懸濁液とを混合した。この混合により得ら
れた懸濁液を、水冷下で２４時間、撹拌した。次に、両
末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（商品
名サンブライト、分子ｉ１３５００、日本油脂■製）１
．１３ｇを、０．２Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＨ
５，０）６ｍｊｌ！に溶解して得た溶液を上記の懸濁液
に加え、水冷下、２４時間、撹拌した。

上記のようにして得られたスペーサー付担体を０．２Ｍ
のリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ５，０）で洗浄した。

次に、ヒトトロンボモジュリン３ｍｇを、０．２Ｍのリ
ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＨ５，０）３ｍｊ２に溶解し
た溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・−塩酸塩を４ｍｇ／ｍＩ！の濃
度で含む溶液（０，２Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ
５，０））０．１８ｍｆを加え、水冷下、１時間、撹拌
した。該溶液を、上記のスペーサー付担体を０．２Ｍの
リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ５，０）８ｍｌに懸濁さ
ゼた懸濁液に加えて、水冷下、４８時間、撹拌すること
によりヒトトロンボモジュリン固定化担体を得た。

このようにして得られた担体の抗血栓性の指標として、
活性化部分トロンボプラスチン時間を測定した。

新鮮なヒト血液と３，８％クエン酸ナトリウム水溶液の
９：１混和液を、４°Ｃで１０分間遠心分則して得たヒ
ト血漿１００μβと、上記のヒトトロンボモジュリン固
定化担体１００μｒに、ハ］・ロンチン（ヘーリングヘ
ルケ社製）１００μｌを加え、３７°Ｃで２分間インギ
ュヘートした。この後、０、０５　Ｍの塩化カルシウム
水溶液１００μＥを加えて凝固を開始させ、フィブリン
が生成するまでの時間を測定した。

これにより得られた活性化部分トロンボプラスチン時間
は、１７３秒であった。

此較韮土 ガラスピーズとヒトトロンボモジュリンの間にスペーサ
ーを介さないこと以外は、実施例１とほぼ同様にして担
体を得た。即ち、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミ
ノプロピル基を表面に有するガラスピーズ１．Ｏｇを０
．２　Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ５，０）８ｍ
ｆｆｉに懸濁させた。次に、ヒトトロンボモジュリン３
ｍｇを、０．２　Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ５
，０）３ｍｆに熔解した溶液に、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・−塩酸塩
を４ｍｇ／ｍｐの濃度で含む溶液（０，２Ｍリン酸緩衝
化生理食塩水（ｐＨ５，０））０．１８ｍｌを加えて得
られた溶液に上記の懸濁液を加えて、水冷下、４８時間
、撹拌した。

このようにして得られたヒトトロンボモジュリン固定化
担体の抗血栓性の指標として、実施例１に示した方法で
、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定したところ
、１５２秒であった。

ル較炭Ｉ Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピル基を表
面に有するガラスピーズを用いて、実施例１の方法によ
り活性化部分トロンボプラスチン時間を測定したところ
、１１２秒であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトトロンボモジュリンを、不溶性担体にスペーサーを
   介して共有結合により固定化した抗血栓性材料。