KR850001496B1 - 유로키나제의 고정화법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

유로키나제의 고정화법

제1도는 실시예 6의 고정화 유로키나제의 분리표.

제2도는 온도에 대한 고정화 유로키나제와 비고정화 유로키나제의 저항성 비교표.

제3도는 사람의 혈장에 의한 고정화 유로키나제와 비고정화 유로키나제의 활성도 비교표.

제4도는 셀룰로오즈관의 내부를 유로키나제로 고정화하는 실시도.

본 발명고 더 좋은 효능을 갖고 있는 주사용 유로키나제와 항혈액응고물질(antithrombogenic material)을 만들기 위한 유로키나제(urokinase)의 담체(matrix)에의 효율적인 고정화법에 관한 것이다.

인간의 뇨에서 분리되는 유로키나제는 특이적으로 혈액내의 플라스미노겐(plasminogen)을 플라스민(plasmin)으로 전환시켜 응고된 혈액중의 피브린(fibrin)을 피브린 분해산물(fabrin degradation product)로 용해시키는 효소이다. 그러므로 유로키나제는 인체에 주사하면 혈관내에 응고되어 있는 피브린을 용해시켜 혈액의 자유로운 흐름을 유도하므로 이 성질을 이용하여 혈액응고로 인하여 발생되는 여러가지 질병, 예컨데 심근 경색중, 동맥혈전증의 치료에 널리 사용되며, 또한 고혈압치료의 보조치료제로도 우리나라 뿐만 아니라, 세계적으로 많이 사용되고 있다.

이와같은 유로키나제의 좋은 임상효과로 인해, 값은 비교적 저렴한 반면 미생물로 부터 분리한 제재의 단점인 항체가 생성되며 독성이 있는 스트렙토키나제(streptokinase)를 임상적으로 주로 사용하던 유럽에서도 최근에 비교적 쉬운 여러가지 분리 및 농축의 방법이 개발됨에 따라 안전성이 높은 유로키나제의 사용으로 점차 전환되어 가고 있는 실정이다. 그러나 유로키나제는 값이 비싸며 또한 계속 짧은 간격으로 높은 단위를 주사하여야 그 활성을 나타내는 단점을 가지고 있다. 그러므로 경제적인 문제뿐만 아니라, 번거로운 반복주사의 필요성을 줄이기 위하여 약리학적 상승작용을 이용하는 방법, 즉 덱스트란 설페이트와 같이 주사를 한다든가(Throm. Res. 13,1125,1978), 효소자체를 변형하여 생체내에서의 안정성(biological half­life)을 높이는 방법이 있다. 유로키나제를 변형하여 더 효능이 좋은 주사용 유로키나제를 만들기 위한 목적 및 생체내의 이식에 쓰이는 특히 혈액과 접촉하는 인공혈관이나 인공심장 및 인공신장기와 같은 체의 순환기구에 있어서, 혈액이 자신의 혈관이 아닌 이물질에 의하여 응고하여 계속적인 사용과 반복사용을 불가능하게 하므로 이것을 극복하기 위한 목적으로 여러가지의 방법을 강구하고 있다.

본 발명은 이의 일환으로 유로키나제를 이용하여 인공이식물질(prothetic material) 또는 체의 순환기구의 표면을 처리하여 종래의 여러가지 단점을 해결한 것이다.

이렇게 효소인 유로키나제의 안정성을 높혀서 생체내의 반감기를 연장시키거나 이물질에 처리를 하여 항혈액응고 능력을 높혀 지속적인 사용을 가능케 하기 위하여 고정화 방법을 연구하는 바, 효소의 고정화방법(enzyme imnobilization)은 담체에 효소를 고정화함으로써 효소의 안정성의 증가와 효소의 회수를 간편하게 할 수 있으므로 재 사용이 가능하게 되는 중의 여러가지의 유리한 점이 있다. 유로키나제의 경우에도 그 안정성을 높이는 방법으로 공유결합법(covalent bonding)이나 흡착법(adsorption) 등의 고정화가 시도되었으나, 흡착법은 유로키나제가 혈액과의 접촉에 의해 담체에서 이탈하여 비접합 요소와 같이 작용하므로 안정성면에서 좋은 효과를 기대할 수 없고 가장 이상적인 방법은 담체와 공유 결합시켜 활성과 안정성을 높이는 것이다. 물론 효소의 공유결합에 의한 고정화방법은 담체와 효소의 선정에 따라 알맞는 방법을 채택하여야만 하며, 또한 고정화시 중요한 문제는 담체와 효소와의 공간적인 배열에 의한 입체장애의 문제를 생각하여야 한다. 이것은 고분자인 효소가 최대활성도를 나타내기 위해서는 효소 자체가 움직인 수 있는 유동성과 담체와 효소 사이의 거리가 아주 중요하게 작용한다. 그러므로 효소의 고정화에 있어서 담체로부터 적당한 거리를 유지하게 해주는 것이 아주 중요한 요건이 된다. 이것은 기질(substrate)이 단백질인 유로키나제의 경우 더욱 중요한 문제이다. 본 발명자들은 상기의 사실들에 근거하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 비교적 간단한 방법에 의하여 유로키나제를 담체에 고정화할 뿐만 아니라, 또한 적당한 거리를 담체로 부터 유지시켜 최대 활성도를 나타낼 수 있게 하는 것이며, 그 안정성의 증가와 항응고 능력의 향상을 그 목적으로 한다.

상기의 목적은 본 발명에 의하여 성취할 수 있는데, 본 발명은 담체의 모델로 세파로즈(Sepharose 4B : 스웨던국, 파마시아사, 리미티드제)와 수용성 담체인 덱스트란(Dextran : 미국, 시그마사, 리미티드제) 및 인공신장 투석기에 쓰이는 셀룰로오즈관(Cellulose hollow fiber : 독일국, 엔카사, 리미티드제)이나 셀룰로오즈막(cellulose membrane)을 사용하여 이것을 적당한 방법으로 활성화한 후 직접 유로키나제를 고정화하거나, 스페이서(spacer)를 결합시킨 다음 이 스페이서의 말단을 적당한 방법으로 활성화하여 유로키나제를 고정화하는 방법이다.

담체로 사용된 세파로즈는 수불용성 다당류로써 수산기를 많이 함유하고 있기 때문에 브롬화시안(CNBr)에 의해 간단히 활성화할 수 있다. 이렇게 브롬화시안으로 활성화된 세파로즈에 직접 유로키나제를 고정화 하거나 세파로즈와 NH₂-(CH₂)_n-COOH나 NH₂-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH(여기서 n,m은 정수) 를 반응시키면 세파로즈-NH(CH₂)_n-COOH나 세파로즈 -NH(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH가 되는데 여기서 n이나 m의 수를 적당히 선정하여 담체로부터 고정화되는 유로키나제의 위치를 조절할 수 있었다.

상기의 세파로즈 -NH(CH₂)_n-COOH나 세파로즈-NH(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH를 적당한 방법 예를들면, N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)를 이용한 유로키나제의 고정화를 위한 카르복실기의 활성화는 유기 무극성 용매(organic nonpoler solvent), 좋기로는 디옥산(dioxane)존재하에서 탈수 시약에 의해 카르복실기와 반응시키고 마지막 단계인 유로키나제와의 결합은 중성 pH, 즉, pH5.0-9.0 가장 적합하기로는 pH7.0-7.5의 0.1M Na₂HPO₄와 0.1M NaH₂PO₄를 동량 혼합한 완충액(이하 인산완충액이라 한다)이나 0.1M NaH₂B₂O₇과 0.1M NaHB₂O₇을 동량 혼합한 완충액(이하 붕산 완충액이라 한다) 또는 0.1M NaHCO₃와 0.1M Na₂CO₃를 통량 혼합한 완충액(이하 중탄산 완충액이라 한다) 또는 채액과 등장의 식염용액에서 6-8시간 가량 반응시키는 것이 가장 활성이 높음을 알았다. 이것은 교반이나 진탕에 의해서도 가능하고 활성화시킨 담체를 컬럼(colum)에 채운 후 여기에 중성의 유로키나제 용액을 통과시킴으로써도 가능했다. 이렇게 담체인 세파로즈와 결합한 유로키나제는 약산성 완충용액, 채액과 등장의 식염수, 2M 요소용액과 약알카리성 용액으로 세척한 후 채액과 등장의 식염용액속에서 보관하는 것이 가장 좋다는 것이 판명되었다. 본 발명에 의하면 스페이서가 NH₂-(CH₂)_n-COOH인 경우에는 n이 5-7,NH₂-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH인 경우에는 m이 2일때는 n은 2와 3이 가장 활성이 높았고, 이것은 입체 장애의 해제와 효소의 용액내에서의 유등성의 증가에 기인하고 있다고 생각된다. 본 발명에 의한 고정화 수율은 33-68%의 아주 우수한 수율을 보였다. 본 발명에 의하여 만들어진 고정화 유로키나제는 실험실 조건에서 정량을 해 본 결과 높은 활성 뿐만 아니라, 좋은 안정성도 갖고 있었다. 온도의 상승에 의한 안정성도 유로키나제에 비해 고정화 유로키나제가 현저히 높았다. 그러나 상기의 고정화 방법과는 달리 N-히드록시 숙신 이미드를 이용하는 것과 같은 양의 세파로즈를 동량의 유로키나제와 같이 가교제(cross­linking agent; CMC,DEC 등)의 존재하에서 고정화하는 방법은 활성이 거의 나타나지 않을 정도로 수율이 아주 낮았다.(0.5%)

그러므로 본 발명에 의한 고정화법은 효소인 유로키나제의 사용에 있어서 아주 유용한 방법이란 것이 판명되었다. 이렇게 제조된 고정화 유로키나제는 직접 체외순환시스템(extra­corporeal system)으로써 사용이 가능할 뿐 아니라, 플라스미노겐으로부터 유로키나제가 들어있지 않는 플라스민을 제조하는 데 사용하면 아주 간단하다. 또한 이 고정화법을 다른 담체에 그대로 이용할 수 있었는데, 예를들면, 인공장기의 표면에 이 고정화법을 이용하여 유로키나제를 고정화하면 항 혈액응고용 표면(antithrombogenic surface)이나 관(tube)을 만들수 있어서 아주 응용성이 높고 또한 수용성 덱스트란이나 다른 수용성 무독성 고분자에 적용하면 보통 시판의 주사용 유로키나제 보다 안정성이 높은 수용성 고정화 유로키나제를 만들 수가 있었다.

수용성 덱스트란을 담체로 이용하여 유로키나제를 고정화하는 경우 수용성 주사용 덱스트란(평균분자량 : 40,000∼70,000)을 브롬화시안으로 쉽게 활성화시킬 수 있었는데, 이때에는 세파로즈의 경우와는 달리 브롬화시안을 두번에 나누어 넣으며 탄산나트륨 용액을 사용하지 않고 자동 pH조절기(pH stat : 스위스국, 브틴크단사, 리미티드제)로 반응액중의 pH를 항상 일정하게 유지하면서 활성화하며, 세척은 반투막을 사용하여 투석을 시키는 것이 가장 좋다는 것을 알았다. 활성화시 pH는 8.5-12.5, 가장 적합하기로는 pH10-11로 맞추어 주는 것이 가장 좋고, 1시간후 pH를 9.0으로 내리는 것이 덱스트란을 가장 많이 활성화시킬 수 있었다. 또한 브롬화시안대 덱스트란의 비는 0.2 : 1-0.6 : 1이 좋으며, 가장 적합하기로는 0.4 : 1-0.6 : 1이었다. 이런 조건에서 활성화된 덱스트란에 유로키나제 용액을 반응시켜 고정화 유로키나제를 제조하였는데, 이때 활성화된 덱스트란과 유로키나제의 비율은 10 : 1 내지 50 : 1이 가장 적합하였고, 반응시간은 6시간 이상이 좋았다. 반응후에는 글리신(glycine)을 넣어서 반응을 종결시키는 방법이 그냥 세척하는 것보다 안정성이 좋았다. 이렇게 만들어진 수용성 덱스트란에 고정화된 유로키나제는 수용성이며, 온도에 대한 저항성, 안정성, 사람과 흰쥐(rat)의 혈장에 의한 저해도에 있어서도 비결합 유로키나제보다 아주 높은 저항성과 안정성을 보였다. 또한 담체를 세파로즈로 사용하는 것과 같이 수용성 덱스트란도 스페이서를 이용하여 고정화하는 방법이 아주 좋은 효과가 있었는데, 이것은 옥시란(oxirane ; 1,4-butanediol diglycidyl ether)을 이용하여 덱스트란을 활성화하고 유로키나제를 고정화하는 방법으로써 그냥 활성화하여 고정화 하는 방법보다 약 2배 이상의 좋은 수율, 비활성도(specific activity)의 보유율 3배 이상이었으며, 이렇게 옥시란으로 활성화시킨 다음 고정화한 유로키나제도 위의 브롬화시안으로 활성화시킨 다음 고정화한 유로키나제와 같은 안정성과 저향성을 보유하고 있었다.

또한 항혈액응고능력을 갖고 있는 표면이나 관을 제조하기 위하여 담체를 셀룰로오즈막이나 관을 사용하여 유로키나제를 담체 표면에 고정화시키는 경우는 세파로즈의 경우와 같이 알카리 조건에서 활성화시키기하여 탄산나트륨 용액을 사용하는데, 이때 0.5N 탄산나트륨 용액의 사용이 브롬화시안의 용해도나 활성에 있어서 가장 적합하였다. 브롬화시안의 양은 1g/40mι탄산나트류 용액을 사용하여 2분 내지 10분간 반응시켜서 셀룰로오즈막이나 관에 고정화시킨 유로키나제를 얻을 수 있는데, 이때 고정화되는 양은 사용되는 유로키나제의 순도와 양에 따라 증가하는 경향을 보였다. 이렇게 고정화된 유로키나제 셀룰로오즈막이나 관은 인산완충용액과 2M 요소용액으로 세척한 후 다시 인산완충용액으로 잔류하는 요소용액을 세척하였다. 반응신간 중 7분 이후 부터는 셀룰로오즈막이나 관이 너무 많은 반응을 받아서 약해지고 끊어지기 때문에 적정반응시간은 3내지 5분이 가장 적합하였다. 이렇게 고정화된 셀룰로오즈막이나 관은 0.85% 식용용액이나 인산완충용액(pH7.5), 4℃에서 보관할 때 한달 이상이 지나도 전혀 활성이 줄지 않았으며, 반복 사용도 가능했다. 또한 이런 고정화법을 이용하여 시판의 셀룰로오즈 인공 신장기 셋트를 담체로 사용해서 유로키나제를 고정시킬 수도 있다.

본 발명에 있어서 유로키나제의 활성도 측정은 씨티에이(CTA)법에 따라 시행하였으며, 피브린 평판법(fibrin plate method)에 의한 활성도 측정도 병행하였다. 또한 고정화 유로키나제의 바활성도는 세파로즈에 고정된 유로키나제의 경우, 단백질을 산의 완전분해에 의한 아미노산의 구성량으로, 덱스트란에 고정화된 경우에는 폴린단백질 정량법(Folin-Lowry method)으로 계산하여 산출하였다. 본 발명을 실시예로서 상술하면 다음과 같다.

[실시예 1]

세파로즈 4B(Sepharose 4B)10mι에 10mι의 증루수와 2M탄산나트륨 20mι을 넣은 후 약 0.5mι의 아세토니트릴(CH₃CN)에 1g의 브롬화시안을 녹인 용액을 넣고 2분간 잘 교반하였다. 그후 이것을 중탄산 완충용액과 붕산완충용액으로 잘 씻은 후 이담체를 붕산완충용액(pH7.5) 10mι에 넣고 유로키나제 50㎎(30CTA단위/㎎ 단백질)을 가하고 하루정도 4℃에서 섞어준 후 이것을 약 300mι씩의 증류수와 식염수 용액, 2M요소용액과 붕산완충용액으로 잘 세척하여 고정화된 유로키나제를 얻었다. 이것은 처음 넣어준 양의 약30%정도의 활성을 간직하고 있었다. 이렇게 제조된 고정화 유로키나제는 체액과 등장인 식염용액속에 넣어 4℃에서 보관한다.

[실시예 2]

실시예 1에서 제조된 브롬화시안으로 활성화시킨 세파로즈 4B 10mι에 pH를 9.0으로 맞춘 10m mole의 NH₂-(CH₂)_n-COOH가 들어 있는 용액 10mι에 넣고 하룻동안 교반시킨 후 NH₂-(NH₂)_n-COOH가 결합된 세파로즈 4B를 증류수와 중탄산완충용액과 0.1M 초산용액 및 0.05M 가성소오다 용액으로 세척하였다.

그후 말단의 카르복실기를 활성화시키기 위하여 30mι무수디옥산에 넣은 후 400㎎의 N-히드록시숙신이미드와 600㎎의 디사이크로헥실 카드보다 이이미드(DCC)를 섞어서 70분 동안 반응시켰다. 그후 이 담체를 디옥산과 에틸알코올로 잘 씻은 다음 잠시 공기 중에서 담체를 말린 후에 50㎎(30CTA 단위/㎎ 단백질)의 유로키나제가 들어 있는 붕산완충용액 (pH7.4) 10mι에 섞어서 6시간 동안 반응시켰다. 그후 고정화된 담체를 물과 2M요소 등으로 세척한 후 체액과 등장의 식염용액에 넣어서 4℃에서 보관하였다. 이 고정화 유로키나제는 n의 수에 따라 다르나 30-75%의 활성을 보였다. 상세한 수율은 표 1과 같다.

[실시예 3]

실시예 2에서와 같은 방법으로 세파로즈 4B에 NH₂(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH를 결합시키고, 그후 말단의 카르복실시를 상기와 같이 N-히드록시숙신이미드로 활성화하여 50㎎(30CTA 단위㎎/단백질)의유로키나제로 처리한 후 역시 상기의 방법으로 세척하였다.

이것은 처음 넣어 준 야의 약 50-70%의 활성을 보유하고 있었고 m＝2일 때의 수율을 자세히 표시하면 표 1과 같다.

[표 1]

유로키나제 고정화시의 수율

[실시예 4]

실시예 2에서 제조된 세파로즈 4B-NH-(CH₂)_n-COOH을 상기의 방법으로 N-히드록시숙신이미드를 사용하여 활성화 한 후 이것을 1.4㎝×10㎝컬럼에 붕산완충용액(pH7.0)을 사용하여 충전하고 그후 50㎎의 유로키나제용액(pH7.0)을 서서히 통과시키고 그후에 증류수와 2M 요소 용액으로 세척하여 컬럼에는 고정화된 유로키나제만 남기고 고정화되지 않은 유로키나제를 제거하고 이 컬럼에 플라스미노겐용액을 통과시켜 유로키나제가 들어있지 않는 플라스민을 얻었다.

[실시예 5]

실시예 1,2,3에서 제조된 고정화 유로키나제가 갖고 있는 비활성도를 측정하기 위하여 각각 1mι씩의 고정화 유로키나제를 6N염산에 넣고 시험관을 완전히 밀봉한 후 110℃에서 하룻동안 분해시킨 다음 이 분해산물을 아미노산 분석기에 의해 정량하여 수용성 유로키나제와 비교하는 방법으로 고정화 유로키나제가 보유하는 단백질 양으로부터 비활성도를 산출하였다. 이 결과는 실시예 1에서 제조된 고정화 유로키나제의 48%에 비해서 실시예 2와 3에서 제조된 고정화 유로키나제는 100-210%의 비활성도를 보유하고 있었다.

[실시예 6]

덱스트란 1g을 100mι증류수에 넣은 후 잘 녹이고, 0.5N 가성소오다 용액으로 pH10.5로 맞추었다. 그후 서서히 교반하면서 고체브롬화시안 0.5N을 반으로 나누어 30분 간격으로 가했다. 반응은 상온에서 실시하며 자동 pH조절기를 사용하여 0.5N 가성소오다용액을 가하면서 pH10.5로 유지시켰다. 반응이 끝난후 0.1M염산으로 반응액을 pH9.0으로 떨어뜨렸다. 그후 이 용액을 4℃에서 2시간동안 탄산나트륨에 의해서 pH9.0으로 맞추어진 증류수에서 투석시킨 후 고체의 유로키나제 50㎎(30CTA 단위/㎎ 단백질)을 넣고 잘 교반시켰다. 이때 계속 pH는 9.0으로 유지시켰다. 교반하면서 4℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 글리신 용액(0.5㎎ 글리신/㎎ 덱스트란)을 가하여 4℃에서 12시간 더 반응시킴으로써 반응을 종결시켰다. 그후 이반응물을 동결 건조후 덱스트란에 고정화된 유로키나제를 이 반응물로부터 분리하기 위하여 겔 여과법을 사용해서 분리하였다. 세파덱스 지-200컬럼(Sephadex G-200, 90㎝×1.5㎝)을 인산완충용액으로 평형화시키고 약간의 인산완충용액에 녹인 반응물을 넣어서 서서히 컬럼을 통과시키고 3mι씩 자동 분획기로 받았다. 분획번호 21부터 31까지의 것을 합하여 동결건조하여 덱스트란에 고정화된 유로키나제를 얻었다. (제1도)이 때 고정화시의 수율은 6-8%였으며, 비활성도는 약 15%였다. 단백질 양으로 산출된 고정화된 양은 46%있다.

[실시예 7]

덱스트란 300㎎을 30mι의 증류수에 녹인 후 교반하면서 옥시란 25mι을 가한다음 반응액에 0.6M 가성소오다 용액(5㎎ 나트륨보로히드라이드/mι을 포함)을 2.5mι을 가했다. 반응은 교반하면서 25℃에서 12시간 동안 진행시키고 그후 4℃에서 2시간 동안 투석시켰다. 투석액은 실시예 6에서와 같았고, 투석후에 유로키나제 10㎎(30CTA단위/㎎ 단백질)을 가하여 고정화시켰다. 반응은 4℃에서 20시간 동안 진행시키고 고정화된 유로키나제의 분리는 실시예 6의 경우와 같이 겔여과법을 사용하였다. 고정화시의 수율은 10-11%였으며, 비활성도는 35-40%였고 단백질 양으로 산출해 본 고정화된 양은 30%였다.

[실시예 8]

실시예 6과 7에서 제조된 덱스트란에 고정화된 유로키나제와 비고정 유로키나제의 열에 대한 안정성을 비교하기 위하여 60℃와 70℃에서 보관하면서 처음은 10분, 나중에는 30분 간격으로 활성을 비교하였다. 활성도는 피브린 평판법으로 조사하였다 . 이 결과 덱스트란에 고정화된 유로키나제는 60℃에서 2시간 보관후 에도 40-50%의 활성을 보유하였으나, 비고정 유로키나제는 동 조건에서 5-20%의 활성도를 보유하였고, 70℃에서는 20분동안에 고정화 유로키나제는 30%, 비고정 유로키나제는 10%의 활성만을 보유하였다. 자세한 것은 제2도와 같다. 또한 덱스트란에 고정화된 유로키나제와 비고정 유로키나제를 사람의 혈액에서 분리한 혈장과 같이 섞은 후 활성을 측정한 결과는 제3도와 같다.

[실시예 9]

실시예 6의 방법으로 덱스트란을 활성화시킨 다음 유로키나제(주사용, 녹십자사, 200 CTA단위/㎎단백질)를 고정화시킨후 겔 여과법을 사용하여 고정화된 유로키나제를 분리하였다. 활성도는 500CTA단위/3㎎단백질이었다. 각각의 220g정도의 숫 흰쥐의 대퇴부 정맥으로 비고정 유로키나제 2700 CTA단위(1.4㎎ 단백질/2.0mι의 체액과 등장의 식염수), 비고정 유로키나제와 덱스트란의 혼합을 3,000 CTA단위(1.5㎎ 단백질/2.5mι의 체액과 등장의 식염수), 상기의 덱스트란에 고정화된 유로키나제 500 CTA 단위를 주사하고 0,10분 20분, 30분, 1시간, 1시간 30분 후에 각각의 흰쥐의 대퇴부 동맥으로 혈액을 채취한 후 3.8%구연산 용액으로 처리해서 혈장을 분리하여 혈장의 피브린 평판상의 용해능을 비교한 결과 덱스트란 고정화 유로키나제의 경우에서만 용해 활성이 검출되었다.

상시의 실험시 흰쥐의 마취는 우레탄(urethane)으로 행하였다.

[실시예 10]

먼저 0.5g의 브롬화시안을 0.5M 탄산나트륨 용액 20mι에 녹인후, 여기에 셀룰로오즈관(길이 270mm, 바깥지름 200μm, 두께 11μm) 10개를 담근후 서서히 교반하며 반응시켰다. 5분후 활성화된 셀룰로오즈관을 각각 50mι씩의 차가운 0.1M 증탄산나트륨완충용액(pH9.5), 증류수, 0.1M 인산완충용액(pH7.5)로 세척하였다. 세척된 관을 유로키나제(200 CTA 단위/㎎단백질) 1㎎이 10mι의 상기의 인산 완충용액에 녹인 용액에 넣고 4℃에서 24시간 동안 방치하여 고정화시켰다. 그후 이 고정화된 유로키나제를 상기의 인산완충용액과 2M요소용액, 다시 인산완충용액으로 잘 세척하였다. 이렇게 셀룰로오즈에 고정화시킨 유로키나제는 프브린 평판에서 활성도 측정시 0.3-0.6CTA단위/㎠관의 활성을 보유하고 있었으며, 4℃에서 한달 보관후에도 처음과 같은 활성을 보유하였고, 또한 반복적으로 활성도 측정을 하여 본 결과 10-30%의 활성을 계속 유지하였다.

[실시예 11]

셀룰로오즈관의 안쪽을 활성화하여서 고정화하기 위하여 제4도와 같은 구조를 만들고, 펌프로 순환시키면서 고정화하였다. 즉, 실시예 10에서와 같이 제조된 탄산나트륨 용액을 5분간 순환시킨후 세척도 같은 방법으로 하고 그후 유로키나제 용액 2000 CTA단위/㎎단백질)을 4℃에서 24시간 동안 순환시킴으로 고정화하였다. 그후 다시 상기의 용액으로 순환하면서 세척을 한후 4℃의 0.85% 체액과 등장의 식염수나 0.1M 인산완충용액(pH7.5)하에서 보관하였다.

Claims (10)

1. 수용성 담체나 수불용성 담체 또는 인공 장기의 표면을 브롬화시안을 사용하여 활성화시킨 다음, 유로키나제와 반응시키는 유로키나제의 고정화 방법.
2. 제1항에서, 수용성 담체로 덱스트란을 사용하는 방법.
3. 제1항에서, 수불용성 담체로 세파로즈 4B를 사용하는 방법.
4. 제1항에서, 인공 장기로 셀룰로오즈 막이나 관을 사용하는 방법.
5. 수용성 담체나 수불용성 담체를 브롬화시안으로 처리한 다음 스페이성와 반응시키고, 이어서 N-히드록시숙신이미드로 활성화시킨 후, 유로키나제와 반응시키는 유로키나제의 고정화방법.
6. 제5항에서, 수용성 담체로 덱스트란을 사용하는 방법.
7. 제5항에서, 수불용성 담체로 세파로즈 4B를 사용하는 방법.
8. 제5항에서, 스페이서로 NH₂-(CH₂)_n-COOH(단 n은 2-7이다)를 사용하는 방법.
9. 제5항에서, 스페이서로 NH₂-(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_m-COOH(단, n은 2-5이고, m은 2-7이다)를 사용하는 방법.
10. 수용성 담체 덱스트란을 옥시란을 사용하여 활성화시킨 다음 유로키나제와 반응시키는 유로키나제의 고정화 방법.

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