JPS59146587A - 固定化酵素の製法 - Google Patents
固定化酵素の製法Info
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- JPS59146587A JPS59146587A JP2191883A JP2191883A JPS59146587A JP S59146587 A JPS59146587 A JP S59146587A JP 2191883 A JP2191883 A JP 2191883A JP 2191883 A JP2191883 A JP 2191883A JP S59146587 A JPS59146587 A JP S59146587A
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- immobilized
- enzymes
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技１ｉＥｉ ’ｙ）野〕
この発明は、触媒等として用いられる固定化酵素の製法
に関すめ。
に関すめ。
し′ｌ！￥壜技術〕
近年、省資源、省エネルギ一対策か工業的製造過程（ブ
「−Ｉセス）の上Ｑておいて大きな課題の一つとなって
いる。この課砥の解決法の一つと［７て、ｊし来、生体
内部シておいて非常ＶＣ穏やかに、しかも迅速１１′Ｃ
Ｉシ学反応の触媒作用全行なう微生物や酵素等の生体触
媒を工業的に利用する技術が確立さｈ、つつある。生体
触媒に１常温常圧という穏やかな条件−（゛！持定の物
ｒｔ Ｋつい−Ｃのみ反応を促進させるため、従来の化
学反応工程（プロセス）と比較ｑてエネルギー的に有利
であるばかりでなく、７り染問題や騒音問題を発生して
外界に悪影響を及ぼすことも極めて少ない。加えて、生
体触媒を用いるようにするよ、従来多段の反応工程が必
要てあったものか、単一の反応工程ですむようＶＣｆｘ
Ａ （二ともある。このように、微生物や酵素傳の生
体反応の工業へのＡ・１」用は極めて有用な手段の一つ
となつ−Ｃいる。ｌ−かし、微生物や酵素は一般に水浴
性であって（天然には水浴性の形で存在す７．））、従
来ではこのことが工業的に利用するｖｃｈ形態的に不１
１１な点となっていた。すなわち、俗解Ｌ／こ酵素や微
生物伊反応使用後に反応系から除去する必鼓があるから
である。−ｆ：こで、１μ」らかの手段をｊ（１いて酵
素や微生物を水不溶性にすること等、これらを固定化す
ることが提案された。すなわち、Ｐ１イ素や微生物を水
不溶性の担体と結合させたり、酵素同志を結合させてよ
り高分子化させること等Ｌｔζよって固定化するのであ
る。このような固定化の手段を用いることによって反応
毎の酵素や微生物の回収が容易になり、従来回分式で行
なっていた生体反応を連続式で行なうことができるよう
になる。址た、この固定化手段の採用に上って一般的（
では次のような長所が生じる。すなわち、比較的高価な
微生物や酵素の消失が防止できることによるコスト而で
の軽減、反応終了後に不純物として微生物や酵素が含−
ｉｉ′１．ないために生成物の純度か高まるといったよ
うな長所である。また、固定化酵素や固定化微生物をバ
イオセンサに応用できるといった長所も一万で生じる。
「−Ｉセス）の上Ｑておいて大きな課題の一つとなって
いる。この課砥の解決法の一つと［７て、ｊし来、生体
内部シておいて非常ＶＣ穏やかに、しかも迅速１１′Ｃ
Ｉシ学反応の触媒作用全行なう微生物や酵素等の生体触
媒を工業的に利用する技術が確立さｈ、つつある。生体
触媒に１常温常圧という穏やかな条件−（゛！持定の物
ｒｔ Ｋつい−Ｃのみ反応を促進させるため、従来の化
学反応工程（プロセス）と比較ｑてエネルギー的に有利
であるばかりでなく、７り染問題や騒音問題を発生して
外界に悪影響を及ぼすことも極めて少ない。加えて、生
体触媒を用いるようにするよ、従来多段の反応工程が必
要てあったものか、単一の反応工程ですむようＶＣｆｘ
Ａ （二ともある。このように、微生物や酵素傳の生
体反応の工業へのＡ・１」用は極めて有用な手段の一つ
となつ−Ｃいる。ｌ−かし、微生物や酵素は一般に水浴
性であって（天然には水浴性の形で存在す７．））、従
来ではこのことが工業的に利用するｖｃｈ形態的に不１
１１な点となっていた。すなわち、俗解Ｌ／こ酵素や微
生物伊反応使用後に反応系から除去する必鼓があるから
である。−ｆ：こで、１μ」らかの手段をｊ（１いて酵
素や微生物を水不溶性にすること等、これらを固定化す
ることが提案された。すなわち、Ｐ１イ素や微生物を水
不溶性の担体と結合させたり、酵素同志を結合させてよ
り高分子化させること等Ｌｔζよって固定化するのであ
る。このような固定化の手段を用いることによって反応
毎の酵素や微生物の回収が容易になり、従来回分式で行
なっていた生体反応を連続式で行なうことができるよう
になる。址た、この固定化手段の採用に上って一般的（
では次のような長所が生じる。すなわち、比較的高価な
微生物や酵素の消失が防止できることによるコスト而で
の軽減、反応終了後に不純物として微生物や酵素が含−
ｉｉ′１．ないために生成物の純度か高まるといったよ
うな長所である。また、固定化酵素や固定化微生物をバ
イオセンサに応用できるといった長所も一万で生じる。
すなわち、微生物や酵素が浴液中の特定物質とだけ反応
することを第１」用しで、微生物あるいは酵素により消
失あるいけ生成する電気化学的検知物質（例えば、酵素
、過酸化水素等）を電気化学的に検知することで、化学
量論比から特定物質を定量分析することが可能となるの
である。
することを第１」用しで、微生物あるいは酵素により消
失あるいけ生成する電気化学的検知物質（例えば、酵素
、過酸化水素等）を電気化学的に検知することで、化学
量論比から特定物質を定量分析することが可能となるの
である。
こ７′７．までに提案された酵素の固定化法は、一般に
三つの方法、すなわち担体結合法、架橋法および包括１
１に大別することができる。もっとも普通の場合につい
で述ベハ、ば、担体結合法は酵素を担体に結合させて水
不溶性とする方法であって、その結合様式によって、さ
らに共有結合法、物理的吸着法およびイオン結合法の三
つに細分される。
三つの方法、すなわち担体結合法、架橋法および包括１
１に大別することができる。もっとも普通の場合につい
で述ベハ、ば、担体結合法は酵素を担体に結合させて水
不溶性とする方法であって、その結合様式によって、さ
らに共有結合法、物理的吸着法およびイオン結合法の三
つに細分される。
架橋法は酵素を２個もしくはそれ以上の官能基を侑する
試薬（架橋剤）と反応させ、酵素同士を架橋剤で結合さ
せて水不溶性とする方法、包括法は酵素をゲルの微細な
格子の中（・τ包み込んだり（格子型）、半透膜性のポ
リマーの皮膜によって被覆する（マイクロカプセル型）
カｉである。
試薬（架橋剤）と反応させ、酵素同士を架橋剤で結合さ
せて水不溶性とする方法、包括法は酵素をゲルの微細な
格子の中（・τ包み込んだり（格子型）、半透膜性のポ
リマーの皮膜によって被覆する（マイクロカプセル型）
カｉである。
しかしながら、前記のような従来の固定化法では、固定
化時に酵素が変性、失活して得られる固定化酵素の活性
が低いものとなめことが多かった。
化時に酵素が変性、失活して得られる固定化酵素の活性
が低いものとなめことが多かった。
この発す」け、活性の高い固定化酵素を得ることができ
る固定化酵素の製法を掃供すＱものである。
る固定化酵素の製法を掃供すＱものである。
ｒ発見Ｊの開示〕
発シ］者らは活性の高い固定化ｔｎ素をっくるこ表ので
きる製法を得ようとしてωｆ究を重ねた。その結果、基
質の存在下で酵素を固定化すく）ようにすればよいとい
うことを見出し、ここにこの発すＪを完成した。
きる製法を得ようとしてωｆ究を重ねた。その結果、基
質の存在下で酵素を固定化すく）ようにすればよいとい
うことを見出し、ここにこの発すＪを完成した。
すなわち、この発明は、基質の存在トで酵素を固定１し
することを特徴とする固定化酵素の製法をその要旨と１
．ている。以下、この発明を詳しく脱環ｊする。
することを特徴とする固定化酵素の製法をその要旨と１
．ている。以下、この発明を詳しく脱環ｊする。
この発明で用いられる酵素の種類は物に限定さｈない。
他方、基質は固定化する酵素に触媒されつるものであれ
ば種類は特に限定されない。たとえｅよ、インベルター
ゼを固定する場合はショ糖等、トリプシンを固定する場
合はベンゾイル−Ｌ−アルギニンニーｐ−ニトロアニリ
ド等、グルコーヌ号キシターセを固定する場合はグルコ
ース等をそれぞれ用いる。
ば種類は特に限定されない。たとえｅよ、インベルター
ゼを固定する場合はショ糖等、トリプシンを固定する場
合はベンゾイル−Ｌ−アルギニンニーｐ−ニトロアニリ
ド等、グルコーヌ号キシターセを固定する場合はグルコ
ース等をそれぞれ用いる。
この発明は、基質の存在Ｆて゛酵素を固定化するところ
が従来の製法と異なる。両者を混ぜ合わせる時機は、固
定１Ｌを行なう前であれは特に限定されない、３固定化
は従来用いられている固定化方法と回じ方法を用いて行
なう。この酵素の固定化万人の種類は特に限定されない
。押体結合法のイオン結合法を利用して酵素を固定化す
る場合は、たとえば、酵素および基質を含む浴液に担体
となるイオン交換樹脂″＄を加えて、イオン交換樹脂Ｖ
こ［Ｗ素をイオン結合させる。用体結合法の架橋法を利
用１−で酵素を固定化する場合（は、たとえは、」」１
体を架橋剤に浸したあどこｈを酵素と基質を１１む浴液
に加えたり、相体に酵素、基ｌムおよび架橋剤を含む溶
液を塗布したり１−で、酵素と押体とを架橋剤で架橋す
る１、包括法を用いる場合は、たとえば、酵素および基
質を含む浴液に重合性試薬を加え、重合性試薬を重合さ
せ゛で重合体に酵素を包括させる。
が従来の製法と異なる。両者を混ぜ合わせる時機は、固
定１Ｌを行なう前であれは特に限定されない、３固定化
は従来用いられている固定化方法と回じ方法を用いて行
なう。この酵素の固定化万人の種類は特に限定されない
。押体結合法のイオン結合法を利用して酵素を固定化す
る場合は、たとえば、酵素および基質を含む浴液に担体
となるイオン交換樹脂″＄を加えて、イオン交換樹脂Ｖ
こ［Ｗ素をイオン結合させる。用体結合法の架橋法を利
用１−で酵素を固定化する場合（は、たとえは、」」１
体を架橋剤に浸したあどこｈを酵素と基質を１１む浴液
に加えたり、相体に酵素、基ｌムおよび架橋剤を含む溶
液を塗布したり１−で、酵素と押体とを架橋剤で架橋す
る１、包括法を用いる場合は、たとえば、酵素および基
質を含む浴液に重合性試薬を加え、重合性試薬を重合さ
せ゛で重合体に酵素を包括させる。
この発明にかかる固定化酵素の製法では、固定化の前に
酵素と基質とが混合された状態ｔ／ｌ’ｌするので、同
定化時に酵素が変性、失活する恐〕１が少なく々つでい
る。したがって、活性の高い固定化酵素か得られる。こ
れは、固定化時、酵素の活性部位が基質により覆われ保
護（保蔽）されるためと考えられる。なお、この発明に
かかる固定化酵素の製法を用いれば、出力電流値の高い
酵素電極が得らハることかわかった。これはやはり、固
定化時に酵素の変性、失活の発生が少ないためと考えら
ｔｌ−００廿だ、従来の製′ｆｋに比べ、固定化に要す
る１祐間が短くなる（固定化反応が促進さ１１．る）と
ともに酵素固定１Ｌ率が高くなる傾向にあることもわか
った。
酵素と基質とが混合された状態ｔ／ｌ’ｌするので、同
定化時に酵素が変性、失活する恐〕１が少なく々つでい
る。したがって、活性の高い固定化酵素か得られる。こ
れは、固定化時、酵素の活性部位が基質により覆われ保
護（保蔽）されるためと考えられる。なお、この発明に
かかる固定化酵素の製法を用いれば、出力電流値の高い
酵素電極が得らハることかわかった。これはやはり、固
定化時に酵素の変性、失活の発生が少ないためと考えら
ｔｌ−００廿だ、従来の製′ｆｋに比べ、固定化に要す
る１祐間が短くなる（固定化反応が促進さ１１．る）と
ともに酵素固定１Ｌ率が高くなる傾向にあることもわか
った。
この発明にかかる固定化酵素の製法では、基質の存在１
・で酵素を固定化するようにするので、活性の高い固定
化酵素が得られる。
・で酵素を固定化するようにするので、活性の高い固定
化酵素が得られる。
つき゛に、実弛例および比較例について説明する。
［実施例］〕
イオン交換樹脂ＩＲＡ−９４を水で洗浄したのち、５
’Ｃ’−ＣＯ，ＯＬＭ−酢酸緩衝液（１）Ｈ５，０）中
にこのイオン交換（ａ１脂を分散した。他力、０．０１
Ｍ−酢酸緩衝液（ｐＨ５，Ｑ）に２８質のショ糖を加え
て濃度を２０ｍＭに調整Ｉ−だ。このショ糖浴液（５°
Ｃ）にインベルターゼを加工て溶解させ、インベルター
ゼの濃度金１．２ ｍｇ／Ｗｄ！にしたあと、先に処理
したイオン交換樹脂をこの溶液に分散させ、５℃で１６
６時間回転撹拌行なった。撹拌終ｒ後、イオン交換（耐
重をろ別し、充分洗浄してイオン交換樹脂に、インベル
ターゼが固定された固定化酵素（固定化標品）を得だ。
’Ｃ’−ＣＯ，ＯＬＭ−酢酸緩衝液（１）Ｈ５，０）中
にこのイオン交換（ａ１脂を分散した。他力、０．０１
Ｍ−酢酸緩衝液（ｐＨ５，Ｑ）に２８質のショ糖を加え
て濃度を２０ｍＭに調整Ｉ−だ。このショ糖浴液（５°
Ｃ）にインベルターゼを加工て溶解させ、インベルター
ゼの濃度金１．２ ｍｇ／Ｗｄ！にしたあと、先に処理
したイオン交換樹脂をこの溶液に分散させ、５℃で１６
６時間回転撹拌行なった。撹拌終ｒ後、イオン交換（耐
重をろ別し、充分洗浄してイオン交換樹脂に、インベル
ターゼが固定された固定化酵素（固定化標品）を得だ。
ろ液よりＩ；ｏｗｒｙらの方法を用いて酵素固定化率を
測定した。才だ、固定化酵素を用いて、４００℃、（１
０１Ｍ酢酸緩衝液中でショ糖の加水分解反応を行ない、
生成物の還元糖をＤＮＳ法（ジニトロサリチル酸法）を
用いて定量することにより酵素活性を測定１〜だ。測定
結果を第１表Ｑて示す。
測定した。才だ、固定化酵素を用いて、４００℃、（１
０１Ｍ酢酸緩衝液中でショ糖の加水分解反応を行ない、
生成物の還元糖をＤＮＳ法（ジニトロサリチル酸法）を
用いて定量することにより酵素活性を測定１〜だ。測定
結果を第１表Ｑて示す。
ただし、酵素活性は未固定の酵素の活性を１００とする
相対活性であられした。
相対活性であられした。
比較例１と１−で、基質（ショ糖）を用いなかったほか
は実１血例】上回様に１〜でイオン交換位１脂にインベ
ルターゼが固定された固定化酵素をつくり、酵素固定化
率と酵素活性を測定した。この側′ｆ結果も第１表に示
す。
は実１血例】上回様に１〜でイオン交換位１脂にインベ
ルターゼが固定された固定化酵素をつくり、酵素固定化
率と酵素活性を測定した。この側′ｆ結果も第１表に示
す。
第１表より、実施例１は比較例１に比べて酵素固定率が
高く、実施例１で得られた固定化酵素は比較例１−（：
得らｈ９たものに比べて相対活性が高いことがわかる。
高く、実施例１で得られた固定化酵素は比較例１−（：
得らｈ９たものに比べて相対活性が高いことがわかる。
（実施例２Ｊ
平均粒径；３０〜４０メツシユの多孔性ガラスピーズを
２（支）（Ｖ／Ｖ ）のＴ−アミノプロピルトリエトキ
シソラン−アセトン浴液に４５℃で１２時間浸したあと
、アセトンで洗浄した。つき−に、このガラスピーズ全
５℃の１弘グルタルアルデヒド水浴７夜ンこ３０分間浸
したあと、水で洗浄した。ｌ−’Ｊプシンの濃度が３
ｍｇ／ｉでベンゾイル−Ｌ−アルキニン−’ｐ’−ニト
ロアニリド塩酸（基質）の濃度が８ ｍＭの浴液に、先
に処理したガラスピーズを加え、５℃で２時間回転撹拌
を行なった。撹拌終了後ろ過を行ない多孔性ガラスピー
ズにトリプシンが固定された固定化酵素を得た。ろ液か
ら酵素固定１率合・測定した。また、得られた固定化酵
素ヲ用いて、０．８５ｍＭのベンゾイル−Ｌ−−γルギ
ニンーｐ−−ニトロ了ニリト塩酸の分解反応を行な、い
、生成するｐ−ニドロア＝リシを波長４１０ｎｍで追跡
、比色定量することにより酵素活性を測定ｌ−だ。
２（支）（Ｖ／Ｖ ）のＴ−アミノプロピルトリエトキ
シソラン−アセトン浴液に４５℃で１２時間浸したあと
、アセトンで洗浄した。つき−に、このガラスピーズ全
５℃の１弘グルタルアルデヒド水浴７夜ンこ３０分間浸
したあと、水で洗浄した。ｌ−’Ｊプシンの濃度が３
ｍｇ／ｉでベンゾイル−Ｌ−アルキニン−’ｐ’−ニト
ロアニリド塩酸（基質）の濃度が８ ｍＭの浴液に、先
に処理したガラスピーズを加え、５℃で２時間回転撹拌
を行なった。撹拌終了後ろ過を行ない多孔性ガラスピー
ズにトリプシンが固定された固定化酵素を得た。ろ液か
ら酵素固定１率合・測定した。また、得られた固定化酵
素ヲ用いて、０．８５ｍＭのベンゾイル−Ｌ−−γルギ
ニンーｐ−−ニトロ了ニリト塩酸の分解反応を行な、い
、生成するｐ−ニドロア＝リシを波長４１０ｎｍで追跡
、比色定量することにより酵素活性を測定ｌ−だ。
測定結果を第２表に示す。
比較例２として、基質を用いなかったほかは実施例２と
同様にして多孔性ガラスピースにトリプシンが固定され
た固定化酵素をつくり、酵素固定率と酵素活性を６（（
１定した。この測定結果も第２表に示す。
同様にして多孔性ガラスピースにトリプシンが固定され
た固定化酵素をつくり、酵素固定率と酵素活性を６（（
１定した。この測定結果も第２表に示す。
第 ２ 表
第２表より、実施例２は比較例２に比べて酵素固定率が
高く、実施例２で得ら・れた固定化酵素は比較例２で得
られたものに比べて相対活性が高いことがわかる。
高く、実施例２で得ら・れた固定化酵素は比較例２で得
られたものに比べて相対活性が高いことがわかる。
〔実施例３〕
白金板（５ｍｍ Ｘ ５ ｍｍ Ｘ ５０μｍ厚）を濃
硝酸中し′Ｌ′ｌふ・い−ＵｌｏｏｏＣで１０分間処理
したのち、１チ（ｖ／ｖ）ｌ・リン「〕〕ルシシシーヘ
キサン浴液に４５℃′こ２４時間浸しくｐＨ，３−４）
、つ＠Ｖｃｉｏｏ°゛Ｃて′１０分間乾燥した。他力、
１０係パラホルムアノ１デヒド水浴Ｈ，４ｏＩ）グルコ
ースオキシダーゼ水浴ｌｌ（１００条グルコース水浴液
をｌ：２：２の割合−’Ｃ’ ？ＩＡ １−Ｙして混合
浴液をつくり、この混合浴液をマイク「１シリシシを用
いて白金板上に塗布１−た。つき４・て、白金板全乾燥
させ、水で洗ｆｐシて白金板にグルコースオキシダーゼ
が固定さｈだ固定化酵素を得た。
硝酸中し′Ｌ′ｌふ・い−ＵｌｏｏｏＣで１０分間処理
したのち、１チ（ｖ／ｖ）ｌ・リン「〕〕ルシシシーヘ
キサン浴液に４５℃′こ２４時間浸しくｐＨ，３−４）
、つ＠Ｖｃｉｏｏ°゛Ｃて′１０分間乾燥した。他力、
１０係パラホルムアノ１デヒド水浴Ｈ，４ｏＩ）グルコ
ースオキシダーゼ水浴ｌｌ（１００条グルコース水浴液
をｌ：２：２の割合−’Ｃ’ ？ＩＡ １−Ｙして混合
浴液をつくり、この混合浴液をマイク「１シリシシを用
いて白金板上に塗布１−た。つき４・て、白金板全乾燥
させ、水で洗ｆｐシて白金板にグルコースオキシダーゼ
が固定さｈだ固定化酵素を得た。
比較例３とｌ、 −Ｃ、グルコースを用いないほか＋ｄ
。
。
実１．亜例３吉同様にして白金板にグルコースオキシダ
ーゼか固定さ）また同定比１′ｙＰふをイ↓≠た。
ーゼか固定さ）また同定比１′ｙＰふをイ↓≠た。
実施例；３で＋１にら力、た固定１１酵素を酵素電極上
［７，５ＣＥ（飽、＋［１甘コウ市極）を対極としてグ
ルコース濃度、）：出力電流値の関係音調べた。７結果
を第１図（こ示ず３）７′こたし、測定条件は、（ｉ
７ ｍＭＩＪン酸緩抽Ｊ液（ｐＨ７，５）金的媒として
、グルコース濃度を０〜１０”Ｍの間を変１Ｌさせるこ
々とし、液温は３０℃とした。また、ボテンンヨメタツ
）（’ｔｌｉｉ＆計伺）により酵素電極ｅて斗０．７
Ｖ （対ＳＣＥ ）の電用ヲ印加し、ポテンショスタッ
ト（により出力′電流値を測定することとり、た。比較
例：うで得らｈ／ζ固定化酵素を酵素電極とし、前記と
同じ条Ｐ１−でグルコース濃度と出力電流値の関係を調
べた０、この結果も第１図に示す。
［７，５ＣＥ（飽、＋［１甘コウ市極）を対極としてグ
ルコース濃度、）：出力電流値の関係音調べた。７結果
を第１図（こ示ず３）７′こたし、測定条件は、（ｉ
７ ｍＭＩＪン酸緩抽Ｊ液（ｐＨ７，５）金的媒として
、グルコース濃度を０〜１０”Ｍの間を変１Ｌさせるこ
々とし、液温は３０℃とした。また、ボテンンヨメタツ
）（’ｔｌｉｉ＆計伺）により酵素電極ｅて斗０．７
Ｖ （対ＳＣＥ ）の電用ヲ印加し、ポテンショスタッ
ト（により出力′電流値を測定することとり、た。比較
例：うで得らｈ／ζ固定化酵素を酵素電極とし、前記と
同じ条Ｐ１−でグルコース濃度と出力電流値の関係を調
べた０、この結果も第１図に示す。
第１図より、実施例３で得らカーだ固定化酵素を酵素電
極として用いた場合では、比較例３ Ｔ ｔ！＋ら１＋
−たものを用いた場合（／（比べ、出力ＮＴ、流値が高
くなっているこ吉がわかる。こバーは、実施例３では比
較例３に比べて固定化部Ｑて酵素の変・Ｖｌ−７火７舌
が少なかったためと考えらｈる。
極として用いた場合では、比較例３ Ｔ ｔ！＋ら１＋
−たものを用いた場合（／（比べ、出力ＮＴ、流値が高
くなっているこ吉がわかる。こバーは、実施例３では比
較例３に比べて固定化部Ｑて酵素の変・Ｖｌ−７火７舌
が少なかったためと考えらｈる。
〔実施例４〜７Ｊ
実施例４〜７てば、つぎのようにし−で固定１１″、酵
素をつくった。
素をつくった。
アクリル了ミドモノマー１．５ｇとＮ−Ｎ’−メナｌ／
ンビスアクリルアミドｏ、 ｏ ｓ ｇを（，１，０１
Ｍ ａ−酸緩衝１８Ｍ （ｐＨ５） ７．５ ｍｌＶζ
溶解さ）すると吉もＱ′ζ１シペルターセ１０ｍｇ と
所定腋のショ糖とを蒸留水１０ ｍｅに俗解させた。実
施例４〜７では、順にシＥＪ糖の使用最を増やすように
した。両浴液をすｔ」°や＜ａｈして撹拌を行ない、混
合浴液をつくつｌｃｏ ）’ルエシ、クロロホルムおヨ
ヒスバン８０（非・イオン活性剤）を７２：２７：０．
２５の割合で混合し−でつく″）だ有機混合温媒にこの
混合浴液を分散し／こあと、窒素、ゲスを吹き込んだ（
Ｎ ｇａｓでバブリン・グした）Ｏつき゛に、この浴液
に０．５ ｇ／Ｊの＜ＮＨ４）２３２０ｓ （ペルオ
キソ二硫酸アンモニウム）浴’１Ｑｔ−０，１ｙｄとべ
・Ｎ・Ｎ１・Ｎ″テトラメナルエナレンジアミン０１
ｍｅとを１へ加１２．３０〜４０分後、得ら７Ｉた重合
体を・ビーカー中で冷トル１ンを用いて洗浄［７、さら
に０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄［７−Ｃ
固定化酵素を得た。実施例４〜７で得らｈだ固定化酵素
を用い−Ｃショ糖を基質とする酵素反応を行ない、酵素
活性′ｆｆ：ＤＮＳ法を用いて測定した。３用すたゾ」
糖浴液の濃度は０．５Ｍ古し、反応温度は４０．０“′
（二とした。測定結果を第２図に示す。
ンビスアクリルアミドｏ、 ｏ ｓ ｇを（，１，０１
Ｍ ａ−酸緩衝１８Ｍ （ｐＨ５） ７．５ ｍｌＶζ
溶解さ）すると吉もＱ′ζ１シペルターセ１０ｍｇ と
所定腋のショ糖とを蒸留水１０ ｍｅに俗解させた。実
施例４〜７では、順にシＥＪ糖の使用最を増やすように
した。両浴液をすｔ」°や＜ａｈして撹拌を行ない、混
合浴液をつくつｌｃｏ ）’ルエシ、クロロホルムおヨ
ヒスバン８０（非・イオン活性剤）を７２：２７：０．
２５の割合で混合し−でつく″）だ有機混合温媒にこの
混合浴液を分散し／こあと、窒素、ゲスを吹き込んだ（
Ｎ ｇａｓでバブリン・グした）Ｏつき゛に、この浴液
に０．５ ｇ／Ｊの＜ＮＨ４）２３２０ｓ （ペルオ
キソ二硫酸アンモニウム）浴’１Ｑｔ−０，１ｙｄとべ
・Ｎ・Ｎ１・Ｎ″テトラメナルエナレンジアミン０１
ｍｅとを１へ加１２．３０〜４０分後、得ら７Ｉた重合
体を・ビーカー中で冷トル１ンを用いて洗浄［７、さら
に０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄［７−Ｃ
固定化酵素を得た。実施例４〜７で得らｈだ固定化酵素
を用い−Ｃショ糖を基質とする酵素反応を行ない、酵素
活性′ｆｆ：ＤＮＳ法を用いて測定した。３用すたゾ」
糖浴液の濃度は０．５Ｍ古し、反応温度は４０．０“′
（二とした。測定結果を第２図に示す。
ｋ−／′こし、満１．１Ｑｔｌは固定１１時の反応浴液
のショ糖濃度、縦軸は酵素活性を−それぞれあられし、
酵素活性は固定化前の酵素の活性を１００とする相対活
性であられ１〜だ。比較例４として、ショ糖（基ＪＡ）
を用いなかったほかは実施例４〜７と同じようにして固
定１Ｌ酵素をつくり、得られた固定化酵素について酵素
活性を測定１−だ。この測定結果も第２図に示す。
のショ糖濃度、縦軸は酵素活性を−それぞれあられし、
酵素活性は固定化前の酵素の活性を１００とする相対活
性であられ１〜だ。比較例４として、ショ糖（基ＪＡ）
を用いなかったほかは実施例４〜７と同じようにして固
定１Ｌ酵素をつくり、得られた固定化酵素について酵素
活性を測定１−だ。この測定結果も第２図に示す。
第２図より、実施例４〜７で得らノ１−だ固定化酵素は
いずれも比較例１−’／Ｚ得らＪ−またものに比べて活
性が高いことがわかる、。
いずれも比較例１−’／Ｚ得らＪ−またものに比べて活
性が高いことがわかる、。
第１図はグルコース濃度と出力電流値の関係をあられす
グラフ、第２メ」は固定旧世心の反応溶液のシ三７糖儂
度さ固定１１−酵素の活性との［ｔ（１係をあられすグ
ラフである。 代理人 升理士 松 本 武 彦 干−続右（ｉ上書：中介） 昭和５９年 １月１３日 特許庁長官 殿 １、 ．１ｓ件の表示 １、＝１０５８年特許願第０２１９１．８号２、発明の
名称 清■定イはガ素の製法 ３、補正をする考 事件との関係 特許出［臥 イー１ 所 犬販府ｉ１１世市：に″−裸１
真１０４８番地名 称（５８３）松下電工株式会にＬ 代 表 考 イし表取締役 小 林 郁４、代
理人 ５、補正により増加する発明の数 な し ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 （１） 明細書第２頁第１１行ないし第１３行に［゛
熔解した酵素・・・必要があるからであ４〕。」とある
を、１−反応使用後、熔解した酵素は反応系から除去す
る必要があり、熔解した微生物は回収する・二とが好ま
しいからである１′と訂正する。
グラフ、第２メ」は固定旧世心の反応溶液のシ三７糖儂
度さ固定１１−酵素の活性との［ｔ（１係をあられすグ
ラフである。 代理人 升理士 松 本 武 彦 干−続右（ｉ上書：中介） 昭和５９年 １月１３日 特許庁長官 殿 １、 ．１ｓ件の表示 １、＝１０５８年特許願第０２１９１．８号２、発明の
名称 清■定イはガ素の製法 ３、補正をする考 事件との関係 特許出［臥 イー１ 所 犬販府ｉ１１世市：に″−裸１
真１０４８番地名 称（５８３）松下電工株式会にＬ 代 表 考 イし表取締役 小 林 郁４、代
理人 ５、補正により増加する発明の数 な し ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 （１） 明細書第２頁第１１行ないし第１３行に［゛
熔解した酵素・・・必要があるからであ４〕。」とある
を、１−反応使用後、熔解した酵素は反応系から除去す
る必要があり、熔解した微生物は回収する・二とが好ま
しいからである１′と訂正する。
Claims (1)
- （１）基質の存在下で酵素を固定化することを特徴とす
る固定化酵素の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2191883A JPS59146587A (ja) | 1983-02-12 | 1983-02-12 | 固定化酵素の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2191883A JPS59146587A (ja) | 1983-02-12 | 1983-02-12 | 固定化酵素の製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59146587A true JPS59146587A (ja) | 1984-08-22 |
Family
ID=12068455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2191883A Pending JPS59146587A (ja) | 1983-02-12 | 1983-02-12 | 固定化酵素の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59146587A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006513715A (ja) * | 2003-03-28 | 2006-04-27 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ | 熱安定酵素の製造方法 |
-
1983
- 1983-02-12 JP JP2191883A patent/JPS59146587A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006513715A (ja) * | 2003-03-28 | 2006-04-27 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ | 熱安定酵素の製造方法 |
| JP4740598B2 (ja) * | 2003-03-28 | 2011-08-03 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ | 熱安定酵素の製造方法 |
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