JP2006513715A - 熱安定酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

高い温度での生物学的処理に有用な、転移温度（Ｔｍ）の高い熱安定ブドウ糖酸化酵素の製造方法で、前記製造方法は、活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、さらにステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程からなり、また前記熱安定ブドウ糖酸化酵素の使用方法、および熱安定酵素、である。

Description

（発明の属する分野）
高い温度での生物学的処理に有用な、熱安定酵素である高い転移温度（Ｔｍ）を有するブドウ糖酸化酵素の製造方法で、前記製造方法は、活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、さらにステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩(sodium cyanoborohydride)を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程からなり、また前記熱安定酵素の使用方法、および熱安定酵素、である。

（発明の背景および従来技術）
参考文献としてここに、Ｍ．Ｄ．ゴーダ、Ｍ．Ｓ．タッカおよびＮ．Ｇ．カランスによる「たんぱく質を基にした安定化剤の電流バイオセンサ効果を用いた固定化ブドウ糖酸化酵素の安定化に関する研究」（２００１）（エレクトロアナリシス、１３巻１０号、８４９〜８５５頁）を挙げる。筆者らは、たんぱく質を基にした安定化剤を用いることでブドウ糖酸化酵素が熱変性に対して安定性を示すことを報告している。たんぱく質を基にした安定化剤は高価であり、膜上の固定化酵素には適しているが、カラム反応器が固体マトリクス上に固定化される酵素と共に通常用いられるフローインジェクションに基づく分析システムで用いるには適していない。従って、本願発明は、酵素のより簡便な方法による固定化に有用であり、フローインジェクション分析に基づくバイオセンサシステム、あるいはより安定性のある生物変換反応のバイオリアクタに用いられる。

参考文献としてここに、Ｌ．ボアホン、フ・レンキおよびＤ．ジャキによる「修飾Ｙ−ゼオライトマトリックス中の酵素の固定化特性とその電流ブドウ糖バイオセンサへの応用」（１９９７）（アナリティカルケミストリ、６９巻、２３４３〜２３４８頁）を挙げる。筆者らは、カーボンペースト電極を用いた電流ブドウ糖バイオセンサへ応用するために、修飾Ｙ−ゼオライトマトリクス中での酵素の固定化によって、ブドウ糖酸化酵素を安定化させることを報告している。本研究の欠点は、Ｙ−ゼオライトマトリクスは微粒子形状であり、充填カラム内で液体の流れを妨げるため、フローインジェクション分析システムに適していないことである。

ケイ化技術はこれまで、酵素の効率的な固定化のために固体支持体の表面修飾に用いられてきた。この技術では、アルキル基のようなシラン中の非反応基は、疎水性を呈し（スロボディアノコバ、１９７９）、表面を荷電状態にさせる。この働きの効果は、用いられるシランの表面の粗さ、濃度および型に依存する（バーティア、１９９９およびクラス、１９９９）。この目的に用いられるシランの濃度は、通常２％より低い。しかしながら、シランを固定化酵素の安定性を高めるために用いるという報告はない。

（本願の目的）
本願発明の主な目的は、熱的に安定な酵素を製造する方法を開発することである。

本願発明の他の主な目的は、ブドウ糖酸化酵素の熱安定酵素を製造する方法を開発することである。

本願発明のさらなる目的は、熱安定酵素を高い温度で用いる方法を開発することである。

（本願の要約）
高い温度での生物学的処理に有用な、転移温度（Ｔｍ）の高い熱安定酵素の製造方法で、前記製造方法は、活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、さらにステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程からなり、また前記熱安定ブドウ糖酸化酵素の使用方法、および熱安定酵素、である。

（本願発明の詳細な説明）
従って、本願発明は、高い温度での生物学的処理に有用な、転移温度（Ｔｍ）の高い熱安定酵素の製造方法に関し、前記製造方法は、活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、さらにステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程からなり、また前記熱安定酵素の使用方法、および熱安定酵素、に関する。

高い温度での生物学的処理に有用な、転移温度（Ｔｍ）の高い、熱的に安定なブドウ糖酸化酵素を製造する方法は、下記の工程からなる。

○活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、
○ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、
○加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、
○処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、
○ステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、
○ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、
○ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程。

本願発明の他の実施形態においては、ガラスビーズは直径が０．５〜０．７５ｍｍの範囲である。

本願発明の他の実施形態においては、アミノプロピルトリエトキシシランの濃度は１〜８％の範囲である。

本願発明の他の実施形態においては、処理された酵素は８０℃の温度で１〜４時間保持しても安定である。

本願発明の他の実施形態においては、グルタルアルデヒドの濃度は２．０〜３．０％の範囲である。

本願発明の他の実施形態においては、グルタルアルデヒドの濃度は約２．５％である。
本願発明の他の実施形態においては、リン酸緩衝溶液の濃度は１００〜３００ｍＭの範囲である。

本願発明の他の実施形態においては、ビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩で１〜３時間の間、約３００Ｃで処理し、さらに約４℃で約１２〜２４時間処理する。

本願発明の他の実施形態においては、シアノ化ホウ化水素のナトリウム塩の濃度は、ガラスビーズ１ｇ当たり２５〜７５ｍｇの範囲である。

本願発明の他の実施形態においては、グリシンの濃度は０．０５〜０．５Ｍである。
本願発明の他の実施形態においては、酵素はブドウ糖酸化酵素である。

本願発明の他の実施形態においては、ガラスビーズを約５％の硝酸液中で約８０℃で約３時間煮沸させて活性化する。

本願発明の他の実施形態においては、ビーズ1ｇに対し、５００〜１５００国際単位の範囲の酵素をさらす。

本願発明の他の実施形態においては、固定化された酵素は、４℃で、濃度範囲が０．００１〜００５％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中に保存される。

本願発明の他の実施形態においては、熱的に安定な酵素は転移温度（Ｔｍ）約８０℃を示す。

本願発明の他の実施形態においては、熱的に安定なブドウ糖酸化酵素を温度約８０℃の酵素的工程において用いる方法であり、その方法は酵素を基質にさらす工程と、所望の製品を得る工程からなる。

本願発明の他の実施形態においては、前記酵素はバイオリアクタで用いられる。
本願発明の他の実施形態においては、前記酵素はフローインジェクション分析に基づいたバイオセンサで用いられる。

本願発明の他の実施形態においては、酵素的工程は食品加工および醗酵工程である。
本願発明の他の実施形態においては、請求項１６に記載の方法において、酵素はブドウ糖酸化酵素である。

本願発明の他の実施形態においては、温度約８０℃の酵素的工程で有用である。
本願発明の他の実施形態においては、上記記載の酵素はブドウ糖酸化酵素である。

本願発明は、バイオリアクタ用途、特にフローインジェクション分析に基づくバイオセンサにおける用途に有用な熱的に安定な酵素の製造工程に関する。

本願発明の他の実施形態においては、酵素の熱的安定性は、固定化酵素に基づいたバイオセンサの利用において重要であり、バイオセンサは食品加工および醗酵工程の監視用途に用いられる。ブドウ糖酸化酵素はブドウ糖バイオセンサに用いられる酵素であり、熱安定性の向上が実用化の課題となっている。酵素の熱安定性はまた、より高温を必要とする生化学プロセスでも必要とされている。多くの酵素および生物派生物質は、熱的に不安定で５０〜６０℃を超える温度では用いることができない。一部の酵素は、安定剤を取り入れる固定化技術を用いることによって安定化させることが可能である。安定化された酵素バイオリアクタは、たんぱく質固定化研究や工程を監視するため、あるいは酵素生物変換反応のためのバイオセンサ用の熱安定プローブの製造のような、より高温での用途に用いられることが可能である。

本願発明の他の実施形態においては、本願発明の実施形態において、ガラスビーズのケイ化は、１〜８％ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によって行われる。

本願発明の他の実施形態においては、本願発明の他の実施形態において、酵素の活性化支持体に対するカップリング反応中に形成されるシッフ塩基の還元に用いられるシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩は、ガラスビーズ１ｇに対して２５〜７５ｍｇ程度である。

さらに本願発明の他の実施形態においては、固定化された酵素支持体上の未使用領域をブロックするために用いられるグリシンの濃度は、０．０５〜０．１５Ｍである。

ガラスビーズ（直径０．５〜０．７５ｍｍ）の洗浄は、蒸留水ですすぎ、濃硝酸中で１時間煮沸することによって行われ、５％硝酸溶液中でビーズを８０℃で３時間煮沸し、さらに蒸留水で３〜４回すすいで活性化が行われ、そしてアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランを蒸発析出させることによってケイ化が行われる。アミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出は、シランの25ｍｌ乾燥アセトン溶液が用いられ、既知の方法（Ｈ．ウィータル、（１９７６）「無機支持体物質のための共有カップリング結合方法」（Ｋ．モシュバッハ編、メソッド イン エンザイモロジ、４４巻、アカデミックプレス、ニューヨーク、１０章、１３４〜１４８頁より））によって行われた。

本願発明の他の実施形態においては、フラスコ中のシランに、活性化された１グラムのガラスビーズが加えられ、室温で３時間反応が行われた。次に、減圧することによって、アセトンが気化させられ、ガラスビーズ表面のシラン析出物を得た。そしてビーズは、１１５℃のオーブン内で一晩加熱し、グルタルアルデヒドの２．５％リン酸緩衝溶液を用いて真空下で１時間処理、さらに減圧しないで１時間処理し、蒸留水および緩衝液でそれぞれ３〜４回完全に洗浄して培養された。緩衝液に溶解したブドウ糖酸化酵素１０００国際単位をケイ化ビーズ１ｇに混合し、間欠的に振とうさせながら室温で３時間放置する。次に、生成されたシッフ塩基を還元するために、シアノ化ホウ化水素のナトリウム塩２５〜７５ｍｇを加え、室温で１〜３時間放置し、さらに４℃で１２〜２４時間保持した。

本願発明の他の実施形態においては、固定化された酵素支持体上の未使用領域は、０．０５〜０．１５Ｍグリシン溶液を加え室温で１時間放置し、さらに蒸留水と緩衝液でそれぞれ３回洗浄することによって、ブロックされた。微生物汚染を防止するため、０．００２％アジ化ナトリウムを緩衝液に加えた後、固定化された酵素は４℃で貯蔵された。

本願発明の他の実施形態においては、ブドウ糖酸化酵素１００国際単位をｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝溶液１ｍｌに溶解し、その酵素溶液を水浴中で３０℃から５℃ずつ３時間保持して７５℃まで温度を上げて培養させることによって、溶解性のブドウ糖酸化酵素の熱安定性が確かめられる。３０分ごとに試料を採取し、酵素をブドウ糖の５０−ｇ／ｌ溶液中で培養して酵素活性化度をチェックし、電流電極によって測定される溶存酸素濃度の低下として活性化度を記録する。

本願発明の他の実施形態においては、濃度の異なるシラン溶液を用いてガラスビーズ上に固定化されたブドウ糖酸化酵素の熱安定性が、固定化された酵素溶液をｐH６．０の１００ｍＭリン酸緩衝溶液に懸濁させ、水浴中で３０℃から５℃ずつ３時間保持して７５℃まで温度を上げて培養することによって測定される。３０分ごとに試料を採取し、固定化酵素試料を内径３．５ｍｍ、長さ４０ｍｍのポリカーボネートカラムに流し、残留活性化度を決定するが、気泡がカラム内に入らないように注意し、カラムを以下に述べるフローインジェクション分析システムに固定する。

本願発明の他の実施形態においては、フローインジェクション分析システムでは緩衝液用と試料用に２つのポンプを用いる。試料はバルブから注入されるが、バルブは自動制御または手動制御が可能である。試料は次に１分間に０．８−ｍｌの速さで流れる緩衝液中で透析される。そして透析された試料は固定化酵素カラムを通るが、固定化酵素カラムでは生化学反応が起こって、溶存酸素濃度の低下を引き起こしているので、溶存酸素電極を用いて電圧低下を測定することによって溶存酸素濃度を測定する。

本願発明の他の実施形態においては、ブドウ糖をｐＨ６．５リン酸緩衝溶液を用いてモル濃度５０ｍＭとなるように新しく調製し、微生物汚染を防止するため０．００２％アジ化ナトリウムを加え、変旋光のために４時間保持し、２００μｌ／分の速度で３０秒間注入する。酵素活性化度は、電極の出力電圧が継続的に低下し、上昇前の約２分間で最低を記録する結果となる。ベースラインと応答電圧最低値の違いをブドウ糖濃度に対してプロットする。フローインジェクション分析システムの操作は文献（Ｍ．Ａ．カマー、Ｍ．Ｓ．タッカ、Ｓ．センタラン、Ｖ．センタラン、Ｎ．Ｇ．カランス、Ｒ．ハッティカール、Ｂ．マティアソン、２００１）に記載の通りである。

本願発明の他の実施形態においては、ブドウ糖の５０−ｇ／ｌ溶液を固定化酵素カラムに通し、ブドウ糖酸化酵素の活性化度を、電流電極によって測定された溶存酸素濃度の低下として測定する。

本願発明の他の実施形態においては、残留活性化度は下記の式から算出された。
残留活性化度Ａ（％）＝（ｂ／a）ｘ１００
ここで、ａ＝熱処理前の活性化度、ｂ＝熱処理後の活性化度である。

全ての酵素安定化実験では、用いられる試料中のブドウ糖濃度は５０ｇ／ｌであり、２５〜７５℃の範囲において、温度が、異なる濃度のアミノプロピルトリエトキシシラン中のブドウ糖酸化酵素の安定性に与える影響を検討する。

転移温度（Ｔｍ）は、３時間培養後も酵素が初期活性化度の５０％を維持する最高温度である。

酵素の半減期（Ｔ1/2）は、温度７０℃において酵素が初期活性化度の５０％を維持する時間である。

本願発明の他の実施形態においては、本願発明の新規性は、酵素を修飾しないにもかかわらず、あるいは固定化のために支持体を改良する以外に添加剤を加えないにもかかわらず、固定化酵素が安定化することである。

以下に示す実施例は、本願発明を説明するためのものであり、従って本願発明の範囲を限定するものではない。

直径０．５〜０．７５ｍｍのガラスビーズ１ｇを最初に蒸留水で洗浄し、次に濃硝酸中で１時間煮沸し、５％硝酸溶液中でビーズを８０℃で３時間煮沸し、さらに蒸留水で４回すすいで活性化した。２％シランをアセトン中で蒸発析出させることによってガラスビーズをケイ化した（ウィータル、１９６９）。ケイ化された支持体を１１５℃のオーブン中で一晩加熱し、グルタルアルデヒドの２．５％リン酸緩衝溶液を用いて真空下で１時間処理、さらに減圧しないで１時間処理した。支持体を蒸留水および緩衝液でそれぞれ３回完全に洗浄した。

緩衝液に溶解したブドウ糖酸化酵素１０００国際単位を、支持体１ｇに混合し、間欠的に振とうさせながら温度３０℃で３時間放置した。そしてこの溶液にシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩５０ｍｇを加え、温度３０℃で１時間、さらに４℃で１９時間放置して、生成されたシッフ塩基を還元した。固定化された酵素支持体を水および緩衝液でそれぞれ５回洗浄した。０．１Ｍグリシン溶液を加え、温度３０℃で１時間放置し、さらに蒸留水と緩衝液でそれぞれ３回洗浄し、支持体上の未使用領域をブロックした。微生物汚染を防止するため、０．００２％アジ化ナトリウムを緩衝液に加えた。固定化酵素溶液の熱安定性を前述の方法で測定したところ、転移温度（Ｔｍ）は６５℃、半減期（Ｔ1/2）は１時間半であった。３時間保持後の活性化度は、当初の値の９２％であった。

シラン濃度４％のものを用いた以外は実施例１と同様にして、ブドウ糖酸化酵素の固定化を行った。３時間保持後の活性化度は、当初の値の２５０％であり、転移温度は７５℃に上昇し、半減期（Ｔ1/2）は１９時間であった。

シラン濃度６％のものを用いた以外は実施例２と同様にして、ブドウ糖酸化酵素の固定化を行った。３時間保持後の活性化度は、当初の値の６０％であり、転移温度は７０℃で、Ｔ1/2は１３時間であった。

固定化されていないブドウ糖酸化酵素１００国際単位をｐＨ６．０の１００−ｍＭリン酸緩衝溶液１ｍｌに溶解し、熱安定性を測定した。３時間保持後の活性化度は、当初の値の５．２％であり、可溶性酵素の転移温度（Ｔｍ）は４５．６℃、半減期（Ｔ1/2）は１／２時間であった。

本願発明の主な特徴は以下に示すとおりである。
１．固定化酵素システムは、たんぱく質固定化研究や工程監視に用いられるバイオセンサなどの、高温での用途に用いることが可能である。
２．このシステムは、バイオセンサ用途のための熱安定性に優れたプローブの製造に用いることが可能である。
３．ガラスビーズは経済的に優れた酵素固定化の支持体であり、検体をオンラインで分析するフローインジェクション分析システムに用いられる充填床反応器や充填カラム用途に適している。
４．熱に弱い酵素や生体物質を、適当な濃度のシランを用いて安定化させ、高温で用いることが可能である。ケイ化を用いるこの安定化方法は、固定化マトリクスとして他のケイ酸塩含有材料に対しても使用可能性がある。

Claims (19)

1. 約８０℃という高い温度での生物学的処理に有用な、高い転移温度（Ｔｍ）を有し、熱安定性を有する固定化されたブドウ糖酸化酵素の製造におけるケイ化工程において、
   Ｉ． 活性化ガラスビーズをアセトン中でアミノプロピルトリエトキシシランの蒸発析出によってケイ化する工程、
   ＩＩ． ケイ化されたガラスビーズを約１１５℃で一晩加熱する工程、
   ＩＩＩ． 加熱処理されたガラスビーズをｐＨ約６．０のリン酸緩衝溶液中でグルタルアルデヒドを用い、真空下および減圧しないでそれぞれ１時間処理する工程、
   ＩＶ． 処理されたガラスビーズを約３０℃で３〜５時間の保持時間中に間欠的に振とうさせながら酵素にさらす工程、
   Ｖ． ステップ（ｄ）のビーズをシアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて処理することにより、前工程で得られたシッフ塩基を還元する工程、
   ＶＩ． ガラスビーズ上に固定化された熱安定酵素を得る工程、
   ＶＩＩ． ガラスビーズ上の未使用領域をグリシンでブロック化する工程
   を有することを特徴とするケイ化工程。
2. 前記ガラスビーズは直径０．５〜０．７５mmである請求項１記載の工程。
3. 前記アミノプロピルトリエトキシシランの濃度が１〜８％の範囲である請求項１記載の工程。
4. 前記処理された酵素は、８０℃の温度で１〜４時間保持しても安定である請求項１記載の工程。
5. 前記グルタルアルデヒドの濃度が２．０〜３．０％の範囲である請求項１記載の工程。
6. 前記グルタルアルデヒドの濃度が約２．５％である請求項５記載の工程。
7. 前記リン酸緩衝溶液の濃度が１００〜３００mＭの範囲である請求項１記載の工程。
8. シアノ化ホウ化水素のナトリウム塩を用いて、ビーズを約３００Ｃで１〜３時間、さらに約４℃で約１２〜２４時間処理する請求項１記載の工程。
9. 前記シアノ化ホウ化水素のナトリウム塩の濃度が、ガラスビーズ１グラム当たり２５〜７５ｍｇである請求項１記載の工程。
10. 前記グリシンの濃度が０．０５〜０．５Ｍの範囲である請求項１記載の工程。
11. ガラスビーズを約５％の硝酸液中で約８０℃で約３時間煮沸させて活性化する請求項１記載の工程。
12. ビーズ1ｇに対し、５００〜１５００国際単位の範囲の酵素をさらす請求項１記載の工程。
13. 固定化された酵素は、４℃で、濃度範囲が０．００１〜００５％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中に保存される請求項１記載の工程。
14. 熱的に安定な酵素は転移温度（Ｔｍ）約８０℃を示す請求項１記載の工程。
15. 請求項１記載の熱安定酵素を、酵素を基質にさらす工程および所望の製品を得る工程からなる、温度約８０℃の酵素的工程において用いる方法。
16. 前記酵素がバイオリアクタで用いられる請求項１５記載の方法。
17. 前記酵素がフローインジェクション分析に基づくバイオセンサに用いられる請求項１５記載の方法。
18. 前記酵素的工程は食品加工および醗酵工程である請求項１５記載の方法。
19. 温度約８０℃の酵素的工程で有用な請求項１記載の熱安定性を有する酵素。