JP2944194B2 - 固定化酵素の製造法 - Google Patents
固定化酵素の製造法Info
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- JP2944194B2 JP2944194B2 JP30552190A JP30552190A JP2944194B2 JP 2944194 B2 JP2944194 B2 JP 2944194B2 JP 30552190 A JP30552190 A JP 30552190A JP 30552190 A JP30552190 A JP 30552190A JP 2944194 B2 JP2944194 B2 JP 2944194B2
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- enzyme
- immobilized
- maleic anhydride
- immobilized enzyme
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化酵素の製造法に関し，詳しくは酵素の
固定化率および酵素活性発現率の高い共有結合した固定
化酵素を得るものである。
固定化率および酵素活性発現率の高い共有結合した固定
化酵素を得るものである。
（従来の技術） 従来の固定化酵素の製造法としては，担体に酵素を
物理的に吸着させる物理吸着法，担体に酵素をイオン
的に結合させるイオン結合法，担体に酵素を共有結合
により結合させる共有結合法，高分子物質のマトリッ
クス中やカプセル中に酵素を封じこめる包括法などがあ
り，酵素の特性や酵素反応方式により使い分けられてい
る（千畑一郎「固定化酵素」講談社，昭和50年）。
物理的に吸着させる物理吸着法，担体に酵素をイオン
的に結合させるイオン結合法，担体に酵素を共有結合
により結合させる共有結合法，高分子物質のマトリッ
クス中やカプセル中に酵素を封じこめる包括法などがあ
り，酵素の特性や酵素反応方式により使い分けられてい
る（千畑一郎「固定化酵素」講談社，昭和50年）。
（発明が解決しようとする課題） しかし，物理吸着法の場合には酵素が担体より遊離し
やすく，イオン結合法の場合には反応時のpH変化により
酵素が担体より遊離することが多いし，また包括法の場
合には酵素の漏れが生じたり，基質の移動が妨げられる
といった欠点がある。一方，共有結合の場合には酵素が
担体より遊離することはなく，また酵素が露出している
ので包括法のような基質移動阻害を発生しない。
やすく，イオン結合法の場合には反応時のpH変化により
酵素が担体より遊離することが多いし，また包括法の場
合には酵素の漏れが生じたり，基質の移動が妨げられる
といった欠点がある。一方，共有結合の場合には酵素が
担体より遊離することはなく，また酵素が露出している
ので包括法のような基質移動阻害を発生しない。
しかし，化学反応により共有結合を生成する際酵素が
失活したり，担体と酵素との共有結合を生成する拠点が
多くなる場合，酵素が自由な状態をとれなくなったり，
活性中心に結合する可能性が高くなり共有結合による固
定化酵素は一般にかなり低い活性しか示さない。また，
例えば特開昭61−141884号公報にみられるように固定化
に使用する担体の調整が複雑で２段階以上の反応を必要
とする場合が多いなどの問題点を有していた。
失活したり，担体と酵素との共有結合を生成する拠点が
多くなる場合，酵素が自由な状態をとれなくなったり，
活性中心に結合する可能性が高くなり共有結合による固
定化酵素は一般にかなり低い活性しか示さない。また，
例えば特開昭61−141884号公報にみられるように固定化
に使用する担体の調整が複雑で２段階以上の反応を必要
とする場合が多いなどの問題点を有していた。
近年，固定化酵素が幅広い分野で利用されるようにな
ると共に酵素が担体より遊離することなくしかも活性の
高い固定化酵素が求められている。
ると共に酵素が担体より遊離することなくしかも活性の
高い固定化酵素が求められている。
本発明は容易に調製できる担体に多くの固定化酵素を
安定に結合させ，しかも活性を十分発揮することが可能
な固定化酵素を得る方法を提供することを目的とする。
安定に結合させ，しかも活性を十分発揮することが可能
な固定化酵素を得る方法を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記のごとき問題点を解決するために鋭
意検討した結果，グラフト重合により得られる無水マレ
イン酸を有する担体に酵素を固定化することによってこ
の様な目的を達成することを見いだし本発明に到達し
た。
意検討した結果，グラフト重合により得られる無水マレ
イン酸を有する担体に酵素を固定化することによってこ
の様な目的を達成することを見いだし本発明に到達し
た。
すなわち，本発明は高分子材料表面に無水マレイン酸
を放射線グラフト重合させた後，直接酵素溶液と反応さ
せることを特徴とする固定化酵素の製造法を要旨とする
ものである。
を放射線グラフト重合させた後，直接酵素溶液と反応さ
せることを特徴とする固定化酵素の製造法を要旨とする
ものである。
本発明においては無水マレイン酸を高分子材料表面に
グラフト重合させる際，他のモノマーをスペーサーとし
て加え，高分子材料表面にグラフト共重合させることも
可能である。無水マレイン酸と共重合させるスペーサー
としては２−ヒドロキシエチルメタクリレート，アクリ
ルアミドなどが挙げられる。
グラフト重合させる際，他のモノマーをスペーサーとし
て加え，高分子材料表面にグラフト共重合させることも
可能である。無水マレイン酸と共重合させるスペーサー
としては２−ヒドロキシエチルメタクリレート，アクリ
ルアミドなどが挙げられる。
また，本発明において無水マレイン酸とグラフト重合
させる高分子材料としてはポリ塩化ビニルポリウレタ
ン，ポリエチレン，エチレン−酢酸ビニル共重合体など
が挙げられ，これら高分子材料は目的に応じてチュー
ブ，フィルム，シート，繊維などの形態を有する。
させる高分子材料としてはポリ塩化ビニルポリウレタ
ン，ポリエチレン，エチレン−酢酸ビニル共重合体など
が挙げられ，これら高分子材料は目的に応じてチュー
ブ，フィルム，シート，繊維などの形態を有する。
本発明において用いられる酵素としては，例えばアル
コール脱水素酵素，乳酸脱水素酵素，グルコース−６−
リン酸脱水素酵素，グルコールオキシダーゼ，ルシフェ
ラーゼ,L−アミノ酸オキシダーゼ，カタラーゼ，チロシ
ナーゼ，パーオキシダーゼなどの酸化還元酵素，ヘキソ
キナーゼ，リボヌクレアーゼなどのトランスフェラー
ゼ，リパーゼ，アセチルコリンエステラーゼ，ステロイ
ドエステラーゼ，アミラーゼ，セルラーゼ，デキストラ
ナーゼ，インベルターゼ，ペプシン，レンニン，トリプ
シン，キモトリプシン，パパイン，フィシン，トロンビ
ン，カリクレイン，ストレプトキナーゼ，ウロキナー
ゼ，組織プラスミノーゲンアクチベーター，プラスミ
ン，アスパラギナーゼ，ウレアーゼ，ペニシリンアミダ
ーゼ，アピラーゼなどの加水分解酵素，ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ，アスパルターゼ，スレオニンデアミダ
ーゼなどのリアーゼ，グルコースイソメラーゼなどのイ
ソメラーゼ，チロシル−tRNAシンターゼ，アセチルCoA
シンターゼなどのリガーゼなどが代表的なものとして挙
げられる。一般に酵素はアミノ酸がペプチド結合したタ
ンパク質であるので，本発明の固定化酵素の製造法は酵
素の種類に限定されることなく酵素全般に適用できる。
コール脱水素酵素，乳酸脱水素酵素，グルコース−６−
リン酸脱水素酵素，グルコールオキシダーゼ，ルシフェ
ラーゼ,L−アミノ酸オキシダーゼ，カタラーゼ，チロシ
ナーゼ，パーオキシダーゼなどの酸化還元酵素，ヘキソ
キナーゼ，リボヌクレアーゼなどのトランスフェラー
ゼ，リパーゼ，アセチルコリンエステラーゼ，ステロイ
ドエステラーゼ，アミラーゼ，セルラーゼ，デキストラ
ナーゼ，インベルターゼ，ペプシン，レンニン，トリプ
シン，キモトリプシン，パパイン，フィシン，トロンビ
ン，カリクレイン，ストレプトキナーゼ，ウロキナー
ゼ，組織プラスミノーゲンアクチベーター，プラスミ
ン，アスパラギナーゼ，ウレアーゼ，ペニシリンアミダ
ーゼ，アピラーゼなどの加水分解酵素，ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ，アスパルターゼ，スレオニンデアミダ
ーゼなどのリアーゼ，グルコースイソメラーゼなどのイ
ソメラーゼ，チロシル−tRNAシンターゼ，アセチルCoA
シンターゼなどのリガーゼなどが代表的なものとして挙
げられる。一般に酵素はアミノ酸がペプチド結合したタ
ンパク質であるので，本発明の固定化酵素の製造法は酵
素の種類に限定されることなく酵素全般に適用できる。
本発明においては，高分子材料表面に無水マレイン酸
を放射線照射によりグラフト重合させる。この処理のた
めの溶媒としては，上記化合物に対して不活性な溶媒
（上記化合物を溶解するが反応性官能基とは反応しない
溶媒），例えばアセトンメチルエチルケトン，ベンゼ
ン，トルエン，ジメチルスルホキシドあるいはこれらの
混合溶媒などに溶解した溶液を用いることができる。
を放射線照射によりグラフト重合させる。この処理のた
めの溶媒としては，上記化合物に対して不活性な溶媒
（上記化合物を溶解するが反応性官能基とは反応しない
溶媒），例えばアセトンメチルエチルケトン，ベンゼ
ン，トルエン，ジメチルスルホキシドあるいはこれらの
混合溶媒などに溶解した溶液を用いることができる。
グラフト重合にはγ−線，電子線などの放射線を線量
率１〜10kGy/hで１〜５時間照射することにより行う。
処理を行う温度，圧力などの条件は得に限定されないが
好ましくはこれら溶液の沸点以下の温度，好ましくは常
圧で窒素雰囲気下が望ましい。
率１〜10kGy/hで１〜５時間照射することにより行う。
処理を行う温度，圧力などの条件は得に限定されないが
好ましくはこれら溶液の沸点以下の温度，好ましくは常
圧で窒素雰囲気下が望ましい。
また，グラフト共重合させる無水マレイン酸とスペー
サーとして用いる化合物の比率（モル比）は好ましくは
2:1〜1:10で，これらモノマーの全濃度は好ましくは１
〜5mol/lである。一般に無水マレイン酸の比率が低い条
件でグラフト共重合させた場合の方が高い活性の固定化
酵素が得られる。
サーとして用いる化合物の比率（モル比）は好ましくは
2:1〜1:10で，これらモノマーの全濃度は好ましくは１
〜5mol/lである。一般に無水マレイン酸の比率が低い条
件でグラフト共重合させた場合の方が高い活性の固定化
酵素が得られる。
本発明においては，次いで酵素溶液に無水マレイン酸
グラフト重合物を浸漬することにより酵素の固定化を行
う。固定化処理のための酵素溶液は好ましくは酵素を水
あるいは生理食塩水などに溶かした溶液として使用され
る。
グラフト重合物を浸漬することにより酵素の固定化を行
う。固定化処理のための酵素溶液は好ましくは酵素を水
あるいは生理食塩水などに溶かした溶液として使用され
る。
酵素溶液中には必要に応じて安定化剤などを含んでい
てもよく，また酵素溶液で処理を行うに際しての温度，
時間の条件は，好ましくは常温以下の温度，好ましくは
１時間以上である。
てもよく，また酵素溶液で処理を行うに際しての温度，
時間の条件は，好ましくは常温以下の温度，好ましくは
１時間以上である。
（実施例） 以下，実施例によって本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 全モノマー濃度3mol/l,無水マレイン酸と２−ヒドロ
キシルエチルメタクリレートのモノマー組成を1:3とし
たアセトン溶液にポリウレタンチューブを加え,60Co−
γ線を線量率10kGy/h,窒素雰囲気下，常温常圧下で１時
間同時照射することによりグラフト共重合反応を行っ
た。照射後，チューブを取り出しアセトンでよく洗浄し
た後，メタノールでさらに洗浄し乾燥させた。このチュ
ーブを処理面積当り300unit/cm2となるように調整され
たウロキナーゼ緩衝溶液中に浸漬し,7℃で48時間放置し
固定化反応を行った。
キシルエチルメタクリレートのモノマー組成を1:3とし
たアセトン溶液にポリウレタンチューブを加え,60Co−
γ線を線量率10kGy/h,窒素雰囲気下，常温常圧下で１時
間同時照射することによりグラフト共重合反応を行っ
た。照射後，チューブを取り出しアセトンでよく洗浄し
た後，メタノールでさらに洗浄し乾燥させた。このチュ
ーブを処理面積当り300unit/cm2となるように調整され
たウロキナーゼ緩衝溶液中に浸漬し,7℃で48時間放置し
固定化反応を行った。
得られたチューブの酵素活性はペプチド−MCA法を用
いて測定し，固定化量は担体1cm2当りのウロキナーゼの
活性，すなわちunit/cm2で表わした。
いて測定し，固定化量は担体1cm2当りのウロキナーゼの
活性，すなわちunit/cm2で表わした。
この時のウロキナーゼの固定化量は32unit/cm2であっ
た。
た。
比較例１ 無水マレイン酸ないし２−ヒドロキシエチルメタクリ
レートをグラフト共重合反応させていないポリウレタン
チューブにウロキナーゼを実施例１と同様の方法で固定
化させたところ得られた固定化酵素の活性は0.3unit/cm
2であった。
レートをグラフト共重合反応させていないポリウレタン
チューブにウロキナーゼを実施例１と同様の方法で固定
化させたところ得られた固定化酵素の活性は0.3unit/cm
2であった。
（発明の効果） 本発明の製造法によれば，より多くの酵素を共有結合
により容易にしかも高い活性発現率で固定化することが
可能である。また，本発明の製造法により得られた固定
化酵素は通常の固定化酵素と同様に取り扱えるので物質
変換反応，物質生産反応など幅広い酵素反応に効率よく
使用することができる。
により容易にしかも高い活性発現率で固定化することが
可能である。また，本発明の製造法により得られた固定
化酵素は通常の固定化酵素と同様に取り扱えるので物質
変換反応，物質生産反応など幅広い酵素反応に効率よく
使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 11/08 C07K 17/08 C08J 7/00 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】高分子材料表面に無水マレイン酸を放射線
グラフト重合させた後，直接酵素溶液と反応させること
を特徴とする固定化酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30552190A JP2944194B2 (ja) | 1990-11-07 | 1990-11-07 | 固定化酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30552190A JP2944194B2 (ja) | 1990-11-07 | 1990-11-07 | 固定化酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04173090A JPH04173090A (ja) | 1992-06-19 |
| JP2944194B2 true JP2944194B2 (ja) | 1999-08-30 |
Family
ID=17946152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30552190A Expired - Lifetime JP2944194B2 (ja) | 1990-11-07 | 1990-11-07 | 固定化酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2944194B2 (ja) |
-
1990
- 1990-11-07 JP JP30552190A patent/JP2944194B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04173090A (ja) | 1992-06-19 |
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Legal Events
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