JPH04173090A - 固定化酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化酵素の製造法に関し、詳しくは酵素の固
定化率および酵素活性発現率の高い共有結合した固定化
酵素を得るものである。

（従来の技術） 従来の固定化酵素の製造法としては、■担体に酵素を物
理的に吸着させる物理吸着法、■担体に酵素をイオン的
に結合させるイオン結合法、■担体に酵素を共有結合に
より結合させる共有結合法。

■高分子物質のマトリックス中やカプセル中に酵素を封
じこめる包括法などがあり、酵素の特性や酵素反応方式
により使い分けられている（千畑−部「固定化酵素Ｊｅ
ｌｌ、談社、昭和５０年）。

（発明が解決しようとする課題） しかし、物理吸着法の場合には酵素が担体より遊離しや
すく、イオン結合法の場合には反応時のｐＨ変化により
酵素が担体より遊離することが多いし、また包括法の場
合には酵素の漏れが生じたり１基質の移動が妨げられる
といった欠点がある。

一方、共有結合の場合には酵素が担体より遊離すること
はなく、また酵素が露出しているので包括法のような基
質移動阻害を発生しない。

しかし、化学反応により共有結合を生成する際酵素が失
活したり、担体と酵素との共有結合を生成する拠点が多
くなる場合、酵素が自由な状態をとれなくなったり、活
性中心に結合する可能性が高くなり共有結合による固定
化酵素は一般にがなり低い活性しか示さない。また１例
えば特開昭６１−１４１８８４号公報にみられるように
固定化に使用する担体の調整が複雑で２段階以上の反応
を必要とする場合が多いなどの問題点を有してぃた。

近年、固定化酵素が幅広い分野で利用されるようになる
と共に酵素が担体より遊離することなくしかも活性の高
い固定化酵素が求められている。

本発明は容易に調製できる担体に多くの固定化酵素を安
定に結合させ、しかも活性を十分発揮することが可能な
固定化酵素を得る方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記のごとき問題点を解決するために鋭意
検討した結果、グラフト重合により得られる無水マレイ
ン酸を有する担体に酵素を固定化することによってこの
様な目的を達成することを見いだし本発明に到達した。

すなわち２本発明は高分子材料表面に無水マレイン酸を
放射線グラフト重合させた後、直接酵素溶液と反応させ
ることを特徴とする固定化酵素の製造法を要旨とするも
のである。

本発明においては無水マレイン酸を高分子材料表面にグ
ラフト重合させる際、他のモノマーをスペーサーとして
加え、高分子材料表面にグラフ（・共重合させることも
可能である。無水マレイン酸と共重合させるスペーサー
としては２−ヒドロキシエチルメタクリレート　アクリ
ルアミドなどが挙げられる。

また２本発明において無水マレイン酸とグラフト重合さ
せる高分子材料としてはポリ塩化ビニルポリウレタン、
ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などが挙
げられ、これら高分子材料は目的に応じてチューブ４フ
イルム、シート、繊維などの形態を有する。

本発明において用いられる酵素としては１例えばアルコ
ール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、チロシ
ナーゼ１パーオキシダーゼなどの酸化還元酵素、ヘキソ
キナーゼ、リボヌクレアーゼなどのトランスフェラーゼ
、リパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ステロイド
エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナ
ーゼ、インベルターゼ、ペプシン、レンニン、トリプシ
ン、キモトリプシン、パパイン、フィシン、トロンビン
、カリクレイン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、
組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミン、ア
スパラギナーゼ。

ウレアーゼ、ペニシリンアミダーゼ、アビラーゼなどの
加水分解酵素、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アスパ
ルターゼ、スレオニンデアミダーゼなどのリアーゼ、グ
ルコースイソメラーゼなどのイソメラーゼ、チロシル−
ｔＲＮＡシンターゼ。

アセチルＣｏＡシンターゼなどのりガーゼなどが代表的
なものとして挙げられる。一般に酵素はアミノ酸がペプ
チド結合したタンパク質であるので。

本発明の固定化酵素の製造法は酵素の種類に限定される
ことなく酵素全般に適用できる。

本発明においては、高分子材料表面に無水マレイン酸を
放射線照射によりグラフト重合させる。

この処理のための溶媒としては、上記化合物に対して不
活性な溶媒（上記化合物を溶解するが反応性官能基とは
反応しない溶媒）１例えばアセトンメチルエチルケトン
、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシドあるいは
これらの混合溶媒などに溶解した溶液を用いることがで
きる。

グラフト重合にはγ−線線型電子線どの放射線を線量率
１〜１０ｋＧｙ／ｈで１〜５時間照射することにより行
う。処理を行う温度、圧力などの条件は特に限定されな
いが好ましくはこれら溶液の沸点以下の温度、好ましく
は常圧で窒素雰囲気下が望ましい。

また、グラフト共重合させる無水マレイン酸とスペーサ
ーとして用いる化合物の比率（モル比）は好ましくは２
：１〜１：１０で、これら七ツマ−の全濃度は好ましく
は１〜５ｍｏｌ／１である。−般に無水マレイン酸の比
率が低い条件でグラフト共重合させた場合の方が高い活
性の固定化酵素が得られる。

本発明においては１次いで酵素？＠液に無水マレイン酸
グラフト重合物を浸漬することにより酵素の固定化を行
う。固定化処理のための酵素溶液は好ましくは酵素を水
あるいは生理食塩水などに熔かした溶液として使用され
る。

酵素溶液中には必要に応じて安定化剤などを含んでいて
もよく、また酵素溶液で処理を行うに際しての温度２時
間の条件は、好ましくは常温以下の温度、好ましくは１
時間以上である。

（実施例） 以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ 全モノマー濃度３ｍｏｌ／Ｉ　、無水マレイン酸と２−
ヒドロキシルエチルメタクリレートのモノマー組成を１
：３としたアセトン溶液にポリウレタンチューブを加え
、６°Ｃｏ−γ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、窒素雰囲気
下、常温常圧下で１時間開時照射することによりグラフ
ト共重合反応を行った。照射後、チューブを取り出しア
セトンでよく洗浄した後、メタノールでさらに洗浄し乾
燥させた。このチューブを処理面積当り３００　ｕｎｉ
ｔ／ｃｎ＋”となるように調整されたウロキナーゼ緩衝
溶液中に浸漬し、７°Ｃで４８時間放置し固定化反応を
行った。

得られたチューブの酵素活性はペプチド−ＭＣＡ法を用
いて測定し、固定化量は担体１．ｃｍ”当りのウロキナ
ーゼの活性、すなわちｕｎｉｔ／ｃｓ＋”で表わした。

この時のウロキナーゼの固定化量は３２　ｕｎｉｔ／Ｃ
償２であった。

比較例１ 無水マレイン酸ないし２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ートをグラフト共重合反応させていないポリウレタンチ
ューブにウロキナーゼを実施例１と同様の方法で固定化
させたところ得られた固定化酵素の活性は０．３　ｕｎ
ｉｔ／ｃ＋＋＋”であった。

（発明の効果） 本発明の製造法によれば、より多くの酵素を共有結合に
より容易にしかも高い活性発現率で固定化することが可
能である。また１本発明の製造法により得られた固定化
酵素は通常の固定化酵素と同様に取り扱えるので物質変
換反応、物質生産反応など幅広い酵素反応に効率よく使
用することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）高分子材料表面に無水マレイン酸を放射線グラフ
   ト重合させた後、直接酵素溶液と反応させることを特徴
   とする固定化酵素の製造法。