JPH0716410B2 - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，酵素の固定化方法に関するものであり，更に
詳しくはポリウレタンに酵素を固定化する場合の改良さ
れた方法に関するものである。

（従来の技術） 一般に酵素反応は，酵素を水に溶解した状態で行われる
が，近年酵素の回収，再使用，酵素の安定化，酵素反応
の連続化などを目的として酵素を水に不溶な固体表面に
結合し（酵素の固定化），酵素を固体触媒化した状態で
用いることが行われるようになり，種々の方面において
利用されてきている。

なかでも線維素溶解活性酵素を担体表面に固定化した材
料は，抗血栓性材料として医療用材料分野においては，
非常に有用な材料となっている。すなわち，血液にとっ
て異物である物質が血液と接触すると，血液凝固反応が
起こり，最終的にいわゆる血栓塊を形成する。この血栓
形成反応は生体にとっては非常に巧妙に仕組まれた自己
防衛反応なのであるが，生体への異物挿入ということが
病気の治療や診断を目的としてなされた場合，この血栓
形成により治療や診断という本来の目的が果たせなくな
るばかりでなく，かえって新たな合併症を作り出した
り，場合によっては血栓が原因で死に至ることさえある
のである。

しかるに近年の医療の進歩にともない生体にとって異物
である材料を生体に挿入するということはますます多く
なりつつあり，それだけ抗血栓性材料に対する要求も強
くなってきている。

一方，ポリウレタンは優れた物性，化学的安定を有する
ことにより多方面において使用されている材料である。
その意味でポリウレタンに酸素を固定化した材料は酵素
の触媒作用を期待することができるばかりでなく，その
素材が有する優れた物性を利用することができる点にお
いて大きな意義がある。

酵素を担体へ固定化する方法は，すでに多くの方法が提
案され，ポリウレタンに酵素を固定化する方法もすでに
提案されている。例えば，特公昭59−50337号公報には
ポリウレタンに酵素を固定化するに際して，ポリウレタ
ンの末端基を利用して，直接酵素をポリウレタンに共有
結合的あるいはイオン結合的に固定化するか，又はポリ
ウレタンの末端基をアミノ基，カルボキシル基，酸無水
物基，酸クロリド基，アジド基などの反応性に富む官能
基に変えたのちこれらの官能基を利用して，酵素を固定
化する方法が提案されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし，上記のような従来法では酵素の固定化量の十分
大きいものを得ることが困難であるという問題点を有し
ていた。

酵素の固定化量は一般に多ければ多いほど大きい触媒作
用を期待することができて有用である。酵素の固定化量
を多くするためには，例えば，前記特公昭59−50337号
公報の場合のごとく末端基を利用するときは，その末端
基を増加させることにより酵素の固定化を増大させるこ
とができる。しかし，末端基を増加させることは，分子
量を低下させることであり，ポリウレタン素材の有する
優れた物性も損なわれてしまう。

したがって，ポリウレタン素材の有する優れた物性も損
なうことなく，かつ容易な方法でポリウレタンに，より
多くの酵素を固定化する方法が望まれていた。

本発明はポリウレタン素材の有する優れた物性を損なう
ことなく，かつ容易な方法で多くの酵素を固定化する方
法を提供することを目的とするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは，上記のごとき問題点を解決するために鋭
意検討の結果，ポリウレタンを熱水で前処理することに
よってこのような目的を達成しうることを見出し，本発
明に到達した。

すなわち，本発明は，ポリウレタンを，ポリウレタンと
酵素のいずれとも反応しうる官能基を有する高分子化合
物を含む溶液で処理したのち，酵素溶液で処理すること
によりポリウレタンに酵素を固定化するに際し，該高分
子化合物を含む溶液で処理する前にポリウレタンをあら
かじめ50〜100℃の熱水で処理することを特徴とするポ
リウレタンに酵素を固定化する方法を要旨とするもので
ある。

本発明においてポリウレタンとは，主鎖の繰り返し単位
中にウレタン結合を有する高分子化合物のことであり，
工業的には主としてポリイソシアネートとポリオールと
の重付加反応により製造される。ポリイソシアネートと
しては，例えばトルエンジイソシアネート，キシレンジ
イソシアネート，ナフタレンジイソシアネート，ジフエ
ニルメタンジイソシアネート，ジシクロヘキシルメタン
ジイソシアネート，フエニレンジイソシアネート，エチ
レンジイソシアネート，シクロヘキシレンジイソシアネ
ート，トリフエニルメタントリイソシアネート，トルエ
ントリイソシアネートなどがあげられる。ポリオールと
しては，例えばエチレングリコール，プロピレングリコ
ール，ブチレングリコール，ジエチレングリコール，シ
クロヘキサングリコールなどのポリオール，ポリエチレ
ンオキシドグリコール，ポリプロピレンオキシドグリコ
ール，ポリテトラメチレンオキシドグリコール，ポリエ
チレンオキシド−ポリプロピレンオキシドグリコールな
どのポリエーテルポリオールなどがあげられる。また，
ポリオールとしては例えばコハク酸，グルタル酸，アジ
ピン酸，セバシン酸，イソフタル酸，テレフタル酸，フ
タル酸などのジカルボン酸とエチレングリコール，プロ
ピレングリコールなどのグリコールとの縮合によって得
られる両末端に水酸基を有するポリエステルをあげるこ
ともできる。さらに，これらポリオールの一部をポリア
ミン，ポリチオール，ポリカルボン酸などの他の活性水
素化合物に置き換えたものであってよい。これらのポリ
ウレタンは目的に応じてチューブ，フイルム，シート，
繊維などの形態を有する。また，ポリウレタン以外の材
質からなる成形体表面にポリウレタンの皮膜を形成させ
たものであってもよい。

また，本発明において用いられる酵素としては，例えば
アルコール脱水素酵素，乳酸脱水素酵素，グルコース−
６−燐酸脱水素酵素，グルコースオキシターゼ，ルシフ
エラーゼ,L−アミノ酸オキシターゼ，カタラーゼ，チロ
シナーゼ，パーオキシターゼ等の酸化還元酵素，ヘキソ
ナーゼ，ピルビン酸脱水酵素，カルバメートキナーゼ，
アセテートキナーゼ，リポヌクレアーゼなどのトランス
フエラーゼ，リパーゼ，アセチルコリンエステラーゼ，
ステロイドエステラーゼ，アミラーゼ，セルラーゼ，デ
クストラナーゼ，インベルターゼ，ペプシン，レニン，
トリプシン，キモトリプシン，パパイン，フイシン，ト
ロンビン，カリクレイン，ストレプトキナーゼ，ウロキ
ナーゼ，組織プラスキノーゲンアクチベーター，プラス
ミン，ブリノラーゼ，アスパラキナーゼ，ウレアーゼ，
ペニシリンアミダーゼ，アピラーゼなどの加水分解酵
素，ピルビン酸デカルボキシラーゼ，アルバルターゼ，
スレオニンデアミナーゼなどのリアーゼ，グルコースイ
ソメラーゼなどのイソメラーゼ，チロシル−TRNAシンセ
ターゼ，アセチル−CoAシンセターゼなどのリガーゼな
どが代表的なものとしてあげられる。これらのうち，特
にストレプトキナーゼ，ウロキナーゼ，組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター，プラスミン，ブリノラーゼなど
のいわゆる線維素溶解活性酵素は，抗血栓性材料を製造
する上において有用性が高い。

また，本発明においてポリウレタンと酵素のいずれとも
反応しうる官能基を有する高分子化合物とは，ポリウレ
タンの末端基であるイソシアナート基，アミノ基，水酸
基などや，酵素のアミノ基カルボキシル基などと反応す
ることのできる官能基を有する高分子化合物を意味し，
好ましい具体例としては酸無水物基を有する高分子化合
物，例えば無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体，エチレン−無水マレイン酸共重合体，スチレン−
無水マレイン酸共重合体など，ホルミル（アルデヒド）
基を有する高分子化合物，例えばアクロレインの重合
体，ジアルデヒドでんぷん，酸クロリド基を有する高分
子化合物，例えばメタアクリル酸クロリドの重合体，エ
ポキシ基を有する高分子化合物，例えばグリシジル（メ
タ）アクリレート，あるいはイソシアナート基を有する
高分子化合物などをあげることができる。これらのなか
で無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体は取
扱の容易さ，安全性，反応性などの点で，特に医療用材
料分野に用いる場合には好ましい。

本発明においては，ポリウレタンを上記のように高分子
化合物を含む溶液で処理する前に，ポリウレタンの熱水
処理を行うことが必要である。

ポリウレタンの熱水処理は，ポリウレタンを熱水に接触
させること行われ，より具体的には，例えば単に熱水中
に浸漬する，撹拌下に熱水中に浸漬する，さらには通水
下に熱水中に浸漬するなどの方法を採用することができ
る。熱水の中には，必要に応じてポリウレタンの物性を
損なうことのない他の物質，例えば塩類，有機溶媒，界
面活性剤などが含まれていてもよい。熱水の温度は50〜
100℃，好ましくは65〜80℃である。熱水処理に行う時
間は特に限定されないが，一般的に言って熱水の温度が
低い場合には処理時間は長く，熱水の温度が高い場合に
は処理時間は短くてよい。例えば,100℃に近い温度であ
れば１〜５時間程度,50℃に近い温度であれば10時間以
上が好ましいが，これらの処理時間は実験的に容易に決
定できるのでその中から最も経済的な条件を選んで設定
することができる。

本発明においては，熱水処理を行った後，上記高分子化
合物を含む溶液による処理を行う。この処理のための溶
液としては，上記高分子化合物を，好ましくは0.001〜1
0wt％程度，とくに好ましくは0.01〜5wt％程度の濃度で
不活性溶媒（この高分子化合物を溶解するが反応性官能
基とは反応しない溶媒），例えばアセトン，メチルエチ
ルケトン，ベンゼン，トルエンあるいはこれらの混合溶
媒などに溶解した溶液を用いることができる。この場合
における処理とは，ポリウレタンとかかる溶液とを接触
させることで行われ，単なる浸漬処理，撹拌下での浸漬
処理，通液下での浸漬処理などいずれの方法でも行うこ
とができる。処理を行う温度，時間は，特に限定されな
いが，好ましくはこれらの溶液の沸点以下の温度で，好
ましくは１分以上処理を行うことにより目的を達成する
ことができる。

本発明においては，次いで酵素溶液で処理を行うことに
より酵素の固定化を行う。固定化処理のための酵素溶液
は，好ましくは酵素を水あるいは生理食塩水などに溶か
した溶液として使用される。酵素溶液中には必要に応じ
て安定剤などを含んでいてもよく，また酵素溶液で処理
を行うに際しての温度，時間の条件は，好ましくは常温
以下の温度，好ましくは１時間以上である。

（実施例） 以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。

なお，例中，線維素溶解活性は金井，金井編著「臨床検
査法提要」を改訂増補25版（金原出版）VI−105を参照
し，人フイブリノーゲン水溶液にトロンビン生理食塩水
溶液を添加して作成したフイブリン平板に試料を置き,3
7℃24時間放置後試料の周囲に溶解されたフイブリン平
板の溶解窓の面積を長径×短径（mm²）で表すことによ
り測定した。

実施例1,比較例１ 4,4′−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート，ポ
リテトラメチレンエーテルグリコール及びテトラメチレ
ングリコールを重合することによって得られたエーテル
型脂環式ポリウレタン（Thermedix社,Tecoflex）から成
形された外径1.6mm,内径1.2mmのチユープを65℃に加熱
された蒸溜水中に24時間浸漬した。処理を行ったチユー
ブを真空乾燥により水分を除去したのち，無水マレイン
酸−メチルビニルエーテル共重合体（GAF社,GANTREZ AN
139）4wt％を含有する脱水アセトン溶液中に１時間浸漬
した。その後，アセトンで十分洗浄を行い，真空乾燥に
よりアセトンを除去した。ついで，このチユーブを,1/1
0M酢酸バツフアーが10vol％添加され，ウロキナーゼが
処理面積当たり130unit/cm²となるように調液されたウ
ロキナーゼ生理食塩水溶液中に浸漬し,7℃で48時間放置
した。処理後のチユーブは蒸溜水で繰り返し洗浄を行っ
たのち,24時間真空に引くことにより乾燥を行った。

得られたチユーブを長さ2mmに切断し，その線維素溶解
活性を測定したところ，フイブリン平板の溶解面積は48
4mm²であった。

比較のため熱水処理を行わなかった以外は，実施例１と
全く同じ操作をすることによって作成したチユーブの線
維素溶解活性は225mm²と低い値であった。

実施例2,比較例２ 4,4′−ジフエニルメタンジイソシアネート，ポリテト
ラメチレンエーテルグリコール及びテトラメチレングリ
コールを重合することによって得られたエーテル型芳香
族ポリウレタン（化成アツプジヨン社，ペレセン）から
成形された外径1.6mm,内径1.2mmのチユーブを,80℃の熱
水中に６時間浸漬した。

熱水処理を行ったチユーブは真空乾燥により水分を除去
したのち，無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体（GAF社,GANTREZ AN139）4wt％を含有する脱水アセ
トン溶液中に１時間浸漬した。その後，アセトンで十分
洗浄を行い，真空乾燥によりアセトンを除去した。つい
で，このチユーブを,1/10M酢酸バツフアーが10vol％添
加され，ウロキナーゼが処理面積当たり130unit/cm²と
なるように調液されたウロキナーゼ生理食塩水溶液中に
浸漬し,7℃で48時間放置した。処理後のチユーブは蒸溜
水で繰り返し洗浄を行ったのち24時間真空に引くことに
より乾燥を行った。

得られたチユーブを長さ2mmに切断し，その繊維素溶解
活性を測定したところ，フイブリン平板の溶解面積は50
6mm²であった。

比較のため熱水処理を行わなかった以外は，全く同じ操
作をすることによって作成したチユーブの線維素溶解活
性は210mm²と低い値であった。

実施例３〜9,比較例３ 実施例１で用いたものと同じチユーブについて，熱処理
条件を表１の示すごとく変えて処理を行った。処理後，
実施例１と同様にしてウロキナーゼの固定化を行った。

得られたチユーブの線維素溶解活性は表１に示すとおり
であった。表１から明らかなように,40℃という低い温
度においては長時間処理を行っても効果は認められなか
った。

実施例10,比較例４ 4,4′−ジフエニルメタンジイソシアネートとポリテト
ラメチレンエーテルグルコールとを重合することによっ
て得た両末端がイソシアネート基である芳香族ポリウレ
タンオリゴマーを，鎖延長剤としてエチレンジアミンを
使用して重合を行ってポリウレタンを得た。

得られたポリウレタンから厚さ約0.2mmのポリウレタン
シートを形成し，ついでこのシートを80℃の熱水中に６
時間浸漬した。

熱水処理を行ったシートは真空乾燥により水分を除去し
たのち，無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合
体（GAF社,GANTREZ AN139）1wt％を含有する脱水アセト
ン溶液中に0.5時間浸漬した。その後，アセトンで十分
洗浄を行い，真空乾燥によりアセトンを除去した。つい
で，このシートを,1/10M酢酸バツフアーが1vol％添加さ
れ，ウロキナーゼが処理面積当たり100unit/cm²となる
ように調液された，ウロキナーゼ生理食塩水溶液中に浸
漬し,20℃で24時間放置した。処理後のシートは蒸溜水
で繰り返し洗浄を行ったのち,24時間真空に引くことに
より乾燥を行った。

得られたシート直径5mmの円形に切断し，その線維素溶
解活性を測定したところ，フイブリン平板の溶解面積は
460mm²であった。

比較のため熱水処理を行わなった以外は，実施例10と全
く同じ操作をすることによって作成したシートの線維素
溶解活性は175mm²と低い値であった。

（発明の効果） 本発明によれば，容易に，より多くの酵素をポリウレタ
ンに固定化することが可能である。

本発明によって酵素の固定化されたポリウレタンはポリ
ウレタン本来の優れた物性を損なうことなく有し，しか
も酵素の触媒作用も大きい材料である。そして，とくに
ストレプトキナーゼ，ウロキナーゼ，組織プラスミノ−
ゲンアクチベーター，プラスミン，ブリノラーゼなどの
いわゆる線維素溶解活性酵素の固定化されたポリウレタ
ンは，抗血栓性材料として血管内留置カテーテル，排液
用ドレーンチユープ，バイパスチユーブなどの医療用材
料として極めて有用である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリウレタンを，ポリウレタンと酵素のい
   ずれとも反応しうる官能基を有する高分子化合物を含む
   溶液で処理したのち，酵素溶液で処理することによりポ
   リウレタンに酵素を固定化するに際し，該高分子化合物
   を含む溶液で処理する前にポリウレタンをあらかじめ50
   〜100℃の熱水で処理することを特徴とするポリウレタ
   ンに酵素を固定化する方法。
2. 【請求項２】酵素が線維素溶解活性酵素である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】線維素溶解活性酵素がウロキナーゼである
   特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】ポリウレタンと酵素のいずれとも反応しう
   る官能基を有する高分子化合物が無水マレイン酸−メチ
   ルビニルエーテル共重合体である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。