JPS6135829B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は滅菌された固定化酵素の製造法に関す
る。さらにくわしくは、滅菌された担体を滅菌さ
れた酵素溶液により処理することを特徴とする滅
菌された固定化酵素の製造法に関する。

近年、固定化酵素を医療分野に応用することが
試みられる。たとえばウロキナーゼをフイラメン
ト、チユーブなどに固定化することにより抗血栓
を有する縫合糸、排液チユーブ、血管カテーテル
が得られている。〔大城ら、人工臓器、６巻、237
頁（1977年）、杉立ら、人工臓器、７巻、214頁
（1978）〕。さらに白血病の治療に用いるアスパラ
ギナーゼ、遊離ヘモグロビンの吸着、除去に用い
るハプトグロビンなどが固定化されている〔K.
Venkatasubramanianら，Enzyme
Engineering，２巻、439頁（1975年）、大城ら、
人工臓器、６巻75頁（1977年）〕 これらの固定化酵素を医療に用いるに際して
は、固定化酵素を滅菌しなければならないが、滅
菌の過程で固定化酵素の活性が消失あるいは減少
するという欠点があつた。

本研究者らは、上記のごとき問題に鑑み固定化
酵素を直接滅菌することなく、滅菌された固定化
酵素を製造する方法を開発すべく種々検討した結
果、滅菌された担体を滅菌された酵素溶液により
処理することによつて滅菌された高活性の固定化
酵素を得ることができることを見出し、本発明に
到達したものである。

本発明における担体とは、酵素が固定化される
べき支持体のことである。担体は、粉末、ゲル、
チユーブ、フイラメント、ステープル、スポン
ジ、布、中空糸、フイルム、シート、膜などの形
状を有する。これら担体の素材としては、たとえ
ばセルロース、でんぷん、デキストラン、アガロ
ースコラーゲン、絹、羊毛などの天然高分子物
質、ポリエステル、ポリアミド、ポリビニルアル
コールポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリ
スチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポ
リ（メタ）アクリル酸、ポリアクリロニトリル、
ポリウレタン、シリコーン、ポリエチレンイミ
ン、ポリ無水マレイン酸、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリ塩化ビニルなどの合成高分子物
質、活性炭、ガラス、アルミナ、シリカゲル、カ
オリナイトなどの無機物質があげられる。これら
の担体へは、公知の共有結合法、イオン結合法、
物理吸着法などの方法により酵素が固定化される
が、共有結合法の場合には、たとえばカルボキシ
ル基、アミノ基、クロロホルミル基、ジアゾニウ
ム基、アジド基、エポキシ基、ホルミル基、ブロ
モアセチル基、イソシアナート基、カルボン酸無
水物基、イミドカーボネート基などの反応性官能
基を有する担体を用いる必要があり、イオン結合
法の場合には、たとえばカルボキシレート基、ス
ルホネート基、アンモニウム基、スルホニウム
基、ホスホニウム基などのイオン交換基を有する
担体を用いる必要がある。これらの反応性官能基
あるいはイオン交換基を有する担体は、たとえば
次のような方法により製造することができる。

(1) 反応性官能基、イオン交換基を有するモノマ
ーを単独重合するかあるいは共重合して得られ
る高分子物質を適当な形状に成形する。

(2) 合成高分子物質、天然高分子物質、無機物質
に反応性官能基あるいはイオン交換基を導入し
た後適当な形状に成形する。

(3) 成形された担体に反応性官能基を導入するか
あるいはイオン交換基を導入する。

本発明における滅菌された担体とは、すべての
微生物が殺滅されるかまたは除去された担体のこ
とである。滅菌された担体は、たとえば乾熱滅菌
法、高圧蒸気滅菌法、煮沸滅菌法、放射線滅菌
法、紫外線滅菌法、高周波滅菌法、ガス滅菌法、
薬液滅菌法などの公知の滅菌法の中から担体に適
した滅菌法を適用することにより得られる。たと
えば耐熱性の悪い担体に対しては、加熱滅菌法、
乾熱滅菌法、高圧蒸気滅菌法、煮沸滅菌法などの
熱による滅菌法を適用することは好ましくない。

さらに耐熱水性の悪い担体に対しては、高圧蒸
気滅菌法、煮沸滅菌法を適用することは好ましく
ない。エチレンオキシド、ホルムアルデヒドなど
のガス、エタノール、イソプロパノール、フエノ
ール、クロールヘキジン、第４級アンモニウム塩
などの薬液により滅菌する場合には、それら薬液
と担体とが反応しないような条件下で滅菌するこ
とが好ましい。

滅菌された酵素溶液とは、すべての微生物が殺
滅されるかまたは除去された酵素溶液のことであ
る。酵素溶液は熱に対して不安定であるので、メ
ンブランフイルター、磁製フイルターまたはガラ
スフイルターなどの濾過装置を用いて濾過し、微
生物を除去する濾過滅菌法を適用するのが好まし
い。さらに滅菌され酵素溶液は、滅菌された酵素
を滅菌された液に溶解することによつて得られ
る。

本発明において用いられる酵素は、たとえばウ
ロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プリノラー
ゼ、プラスミン、アンチトロンピン、アンクロ
ツドトロンボプラスチン、トロンビン、バトロク
ソビン、クロタラーゼ、キモトリプシン、トリプ
シン、ブロメライン、リゾチーム、アミラーゼ、
カタラーゼ、ウリアーゼ、アルギナーゼ、アスパ
ラギナーゼ、フエニルピルベートオキシダーゼ、
炭酸脱水酵素、ハプトグロビンなどのような医療
に用いられる酵素である。これらの酵素は水に溶
解されるかあるいはエタノール、プロパノール、
ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホキ
シド、ジメチルホルムアミドなどと水との混合液
に溶解される。

この際、必要に応じてPHの調節、塩、安定剤な
どの添加を行なうことができる。

本発明の特徴とする滅菌された担体の滅菌され
た酵素溶液による固定化処理は、滅菌された担体
を滅菌された酵素溶液に接触せしめることにより
行なわれる。この処理を行なうに際しては、使用
するすべての器具を滅菌したのち、無菌箱または
無菌設備内で無菌的に操作しなければならない。
この際、担体の表面を更新するため、撹拌、振と
う、循環などの操作を加えることが好ましい。

固定化された酵素と直接滅菌する従来の方法に
比べて、本発明の方法に従つて滅菌された固定化
酵素を製造する場合は、滅菌の過程で酵素活性が
消失あるいは減少することなく、高活性の固定化
酵素が得られるという特長がある。

本発明の方法によりたとえばウロキナーゼ、ス
トレプトキナーゼなどの線溶活性酵素が固定化さ
れたモノフイラメント、チユーブなどは優れた抗
血栓性を有するので、縫合糸、排液、チユーブ、
血管カテーテルなどとして用いられる。

以下、実施例を示し、本発明をさらに具体的に
説明する。

なお、滅菌効果の確認は、厚生省告示第444号
「プラスチツク製縫合糸基準」の無菌試験に従い
微生物の発育の有無を調べることにより行なつ
た。

実施例 １ ナイロン６製のモノフイラメント（直径0.2
mm）を次のように処理した。

(1) 2wt％のポリエチレンイミンと2wt％のジシ
クロヘキシルカーボジイミドとを含むメタノー
ル溶液中において室温でかきまぜた後、メタノ
ールで洗浄し、乾燥した。

(2) ついで、4wt％の無水マレイン酸―メチルビ
ニルエーテル共重合体と0.8wt％の無水ニトロ
フタル酸とを含むアセトン溶液中において室温
でかきまぜた後、アセトンで洗浄し、乾燥し
た。

(3) ついで、140℃で５時間乾熱滅菌を行なつ
た。

(4) ついで、滅菌されたウロキナーゼ（持田製薬
ウロナーゼ6000単位）を滅菌された生理食塩液
（大塚製薬、静脈、皮下注射用）に溶解して得
られたウロキナーゼ溶解（600単位／ml）に滅
菌後のモノフイラメントを浸漬して24時間７℃
にて放置した後、滅菌された生理食塩水により
洗浄した。なお、この操作は、すべて無菌箱内
で無菌的に行なつた。

上記のようにして得られたウロキナーゼ固定化
モノフイラメントの無菌試験を行なつたところ、
微生物の発育は認められなかつた。固定化ウロキ
ナーゼの活性測定は、金井、金井編著「臨床検査
法提要」改訂第27版（金原出版）―100を参照
し、人フイブリノーゲン水溶液にトロンビン生理
食塩水溶液を添加してフイブリン平板にて測定し
た。ウロキナーゼ固定化モノフイラメントをフイ
ブリン平板上におき、37℃で24時間放置したとこ
ろ、モノフイラメントのまわりのフイブリン膜を
巾２cmにわたつて溶解した。

比較のため(3)の乾熱滅菌を行なわず、かつ(4)の
処理において無菌的操作を行なわずにウロキナー
ゼを固定化したモノフイラメントを次の３種類の
方法で滅菌した。

(A) 乾熱滅菌、140℃、５時間 (B) 煮沸滅菌、20分間 (C) エチレンオキシドによるガス滅菌、150mg／
30℃、６時間 滅菌されたモノフイラメントの無菌試験を行な
つたところＡ，Ｂ，Ｃいずれの方法により滅菌さ
れたモノフイラメントについても微生物の発育は
認められなかつた。また、滅菌されたモノフイラ
メントの活性測定を行なつたところＡ，Ｂ，Ｃの
方法により滅菌されたモノフイラメントはフイブ
リン膜をそれぞれ巾０cm、0.5cm、1.5cmにしか溶
解しなかつた。

実施例 ２ ウロキナーゼの代わりにストレプトキナーゼ
（カビ社製カビキナーゼ）を用いるほかは、実施
例１と同様な方法で滅菌されたストレプトキナー
ゼ固定化モノフイラメントを作成した。得られた
ストレプトキナーゼ固定化モノフイラメントの活
性をフイブリン平板により測定したところモノフ
イラメントは巾1.6cmにわたつてフイブリン膜を
溶解した。

比較のため実施例１と同様に(3)の乾熱滅菌を行
なわず、かつ(4)の処理において無菌的操作を行な
わずにストレプトキナーゼを固定化したモノフイ
ラメントを実施例１における３種類の滅菌方法
Ａ，Ｂ，Ｃで滅菌した。

滅菌されたモノイラメントの無菌試験を行なつ
たところＡ，Ｂ，Ｃいずれの方法により滅菌され
たモノフイラメントについても微生物の発育は認
められなかつた。

また、滅菌されたモノフイラメントの活性測定
を行なつたところＡ，Ｂ，Ｃの方法により滅菌さ
れたモノフイラメントは、フイブリン膜をそれぞ
れ巾０cm，0.2cm，1.2cmにしか溶解しなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 滅菌された担体を滅菌された酵素溶液により
   処理することを特徴とする滅菌された固定化酵素
   の製造法。 ２ 酵素が線溶活性酵素である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ 線溶活性酵素がウロキナーゼである特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 ４ 線溶活性酵素がストレプトキナーゼである特
   許請求の範囲第２項記載の方法。