JP3529821B2 - アミノ化された固体表面にカルボキシ基を有する生体分子を結合させる方法 - Google Patents

アミノ化された固体表面にカルボキシ基を有する生体分子を結合させる方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、アミノ化された表面
に生体分子含有カルボキシ基を結合することによって種
々の表面の生体適合性を増強する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】人間の
体内或いは体表面において使用する代用血管、合成の眼
球内レンズ、電極、カテーテル等、或いは体外の装置と
して人体に接続して手術や透析を援助する医療用装置が
よく知られている。しかしながら、医療用装置中での上
記のような生体材料の使用が、急速なトロンボゲンの作
用のような不利な人体反応を刺激することがある。種々
の血漿たんぱくは、可塑性の表面で血小板と線維素析出
を開始させる役割をする。これらの作用が血流を妨げる
ために、血管の収縮をもたらし、後に続く炎症性反応
が、医療用装置の機能の減少をもたらす。
【０００３】「生体材料」は、体液に対してほぼ完全に
不溶性であり、人体内或いは体表面上に置くか、体液に
接触するように考えられかつ製造される材料として定義
される。理想的には、生体材料は、血液凝固、組識死
亡、腫瘤形成、アレルギー反応、異物反応（拒絶反
応）、炎症性反応のような人体内で望ましくない反応を
誘発せず、意図した目的のために機能するように必要と
された強度、弾性、透過性、適応性のような物理的性質
を持ち、容易に浄化、製造、滅菌でき、人体に皮下埋設
されてかなりの時間に渡りその物理的性質と機能を保持
するものである。
【０００４】ここで使用されているように、もし生物に
とってまさに有益な効果を有する生物学的な液体及び／
又は組識と接触して機能する能力があれば、生体材料の
固体の表面は「生物学的適応性」を有するものとして特
徴付けられる。長期の生体適合性は、宿主有機体の障害
を減少させるために望まれる。生体材料のための改良さ
れた生体適合性への１つのアプローチは、発育因子、抗
菌物質、抗トロンボゲン剤及び細胞結合プロテインのよ
うな種々の「生体分子」を材料の表面に結合することで
ある。
【０００５】そのような生体分子を結合するために多く
のアプローチが提案されてきた。１つのそのようなアプ
ローチが、Ｓｏｌｏｍｏｎ氏等の米国特許第４，５２
１，５６４号に述べられている。この特許では、抗トロ
ンボゲン剤が固体のウレタン重合体支持材に結合され
る。ポリビニールアミンやポリアルキレンアミンのよう
な高分子物質のアミンが、アミノ化された表面を供給す
るために、第１に共有結合的にポリウレタン基質に結合
される。それから抗トロンボゲン剤が、共有結合的にア
ミノ化された基質に結合される。抗トロンボゲン形成剤
は、カルボジイミドを有する抗トロンボゲン剤をまず活
性化して共有結合的に結合させ、そして基質材料のアミ
ノ化された表面と反応させる。しかしながらＦｕｎａｈ
ａｓｈｉ氏等がＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ誌（１２６巻、第４１４−４２１ページ、１
９８２年発行）に「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ
ｈｒｅｅ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎ
ｄ ＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎＩＩＩ」と題して掲載し
た論文では、カルボジイミドを使用することによって親
和性クロマトグラフィー支持のために抗トロンボゲン剤
（ヘパリン）を結合し、その生体活性の多くと共に生体
分子を供給するカルボキシ基が、カルボジイミドに反応
し、それによってかなり抗トロンビンＩＩＩ摂取を減少
させることが言及されている。
【０００６】それゆえに活性を有しその上に共有結合的
に結合された生体分子を有している生物学的適応性表面
を提供することが本発明の目的である。それらの生体活
性を保持する一方で、アミノ化された表面にカルボキシ
基を有する生体分子を共有結合的に結合することが本発
明の目的でもある。カルボジイミドの使用によって結合
された生体分子の生体活性を守ることも、本発明の目的
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】我々は、生体分子をカル
ボジイミドと反応させることによって生体分子のカルボ
キシ基の活性化を達成し、カルボジイミド活性化生体分
子を固体表面と反応させて生体分子を共有結合的にアミ
ノ化された固体表面に結合させ、そして選択的に生体分
子にカルボキシ基を再生させ、アミノ化された固体の表
面に複数のカルボキシ基を有する生体分子を結合させる
方法を発見した。カルボキシ基の復元は、弱加水分解に
よってなし得る。限定されるものではないが、弱和加水
分解が、共有結合的に結合された生体分子に機能的カル
ボキシ基から生体分子とカルボジイミドの間での反応か
ら副産物として形成されたＮ−アシル尿素基を取り除
き、それによってアミノ化された固体表面から生体分子
を吸収することなく生体分子の機能の多くを回復する。
【０００８】この方法は、例えば、グラフト重合された
アミン機能化アクリルアミド含有ポリマーを有する基質
或いはアミン終結スペーサー分子を結合した基質などグ
ラフト重合されたアミン官能基を有している高分子物質
の基質のように、アミノ化された固体表面で使用でき
る。生体分子は、複数のカルボキシル官能基を有する生
体分子で、そして好ましくは例えばヘパリン、ストレプ
トキナーゼ、組識プラスミノゲン賦活物質（ＴＰＡ）或
いはウロキナーゼのような非トロンボゲン血液適合性表
面或いはフィブロネクチンやラミニンのような細胞結合
プロテインを供給する能力があるものである。使用され
たカルボジイミドは、好ましくは化学構造がＲ1 Ｎ＝Ｃ
＝ＮＲ2 の水溶性カルボジイミドである。ここでＲ1 は
アルキル基かシクロアルキル基であり、Ｒ2 は例えば１
−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩や１−シクロヘキシル１−３−（２−
モルホリノエタン）カルボジイミドのようなアルキルア
ミンかシクロアルキルアミン基である。
【０００９】弱加水分解によるカルボキシ基の選択的な
回復は、カルボキシ基を回復するために効果的な時間に
渡って緩衝剤の存在下で表面と生体分子を培養すること
によって行なえる。好ましくは反応は、およそｐＨ８〜
１１の範囲、０〜７０℃の温度範囲そして約１〜２４時
間の範囲で実行する。例えば、結合させた生体分子を有
する表面を、水溶性炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝８．
２）の１Ｍ溶液に浸し、３時間に渡って６０℃で加熱す
る。生体分子とアミノ化された固体表面の間の化学結合
がそのまま保たれるので、この処理は選択的である。
【００１０】本発明に従って生物学的適応性を与えられ
た固体の表面が、合成或いは自然の材料で、生理的な液
体に不溶性であって、そして第一級或いは第二級アミン
基を含むものが望ましい。表面は、生物の組識及び／又
は液体と接触して機能するために作られている素子の一
個以上の表面である。素子のこのアミノ化された固体表
面のための基質は、例えば磨かれたチタンかステンレス
鋼のような種々の適当な金属、或いはポリウレタン、ポ
リビニルピロリドン、シリコーンエラストマー、ポリエ
チレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリテ
トラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステ
ル、フルオロポリマー、ポリアクリレート（ポリメタク
リレートを含む）のようなポリマー、無機質或いは水酸
化リン灰石などのセラミックス、骨、皮膚、歯などの人
間や動物組織、木材、繊維素、圧縮炭素などの有機物質
そしてガラス、ゴム、木材などの他の自然の及び合成の
材料である。この発明に従って生物学的適応性表面と共
に供給され得る素子には、人工血管、分離管や膜、血液
酸素付加器管や膜、限外濾過膜、大動脈内バルーン、血
液嚢、カテーテル、縫合、柔軟な或いは剛性の組識人工
補装具、合成人工補装具、人工臓器、そしてコンタクト
レンズのような目のために水晶体を含む。限定されるも
のではないが、弱加水分解が、生体分子に共有結合的に
結合された機能的カルボキシ基からＮ−アシル尿素基を
取り除き、それによってアミノ化された固体表面から生
体分子を吸収することなく生体分子の機能の多くを回復
する。
【００１１】もし基質材料がその表面に第一級或いは第
二級アミンを持たないならば、基質材料にアミン含有化
学物質部分を結合させるか吸収させることによって、そ
のようなアミン基を表面に加えることができる。グラフ
トは共有結合或いはイオン化結合によってなされる。例
えば、ポリビニールアミンかポリアルキルイミンはＳｏ
ｌｏｍｏｎ氏等の米国特許第４，５２１，５６４号に開
示された方法によってポリウレタンに共有結合的に結合
させ得る。またたとえば、アミノシランは、Ｐｉｎｃｈ
ｕｋ氏の米国特許５，０５３，０４８号に開示されてい
るように結合させることができる。さらに、たとえばＨ
ｏｆｆｍａｎ氏等の米国特許第３，８２６，６７８号で
開示されるように、グラフト重合されたアクリルアミド
含有ポリマーは、放射線グラフト（アミン機能化が続
く）によって結合させることができる。アミン終端スペ
ーサー分子を結合した基質が望ましい。
【００１２】スペーサー分子は、固体表面に結合可能な
分子或いは化合物であり、上記表面の表面から突出し、
生体分子を固定できる。スペーサーは生体分子の活性部
位を支持材から外側へ向けて保持し、能率的に体液に接
触させる。スペーサーは、それは分子の終端に対向して
位置する少なくとも２つ反応性官能基を有する有機的な
分子から得る。そのような基は、結合能力がある結合媒
体として固体表面への、そして生体分子へのスペーサー
の役目を果たす。スペーサー上の複数の反応性官能基
は、同一であるかもしれないし或いは異なるかもしれな
い。それらは固体表面に沿って生体分子から突出するカ
ルボキシル官能基を有する形態共有結合に利用可能なア
ミン官能基を供給する。支持材とスペーサー分子の間の
カップリング反応を遂行するには公知の方法を採用すれ
ばよい。本発明で使用できるスペーサーの適当な例とし
ては、例えばＣ２からＣ１２のジアミン（たとえば、
１，６−ジアミノヘキサン）、エチレンジアミン四酢
酸、６−アミノカプロン酸、アミノプロピルトリエキシ
−シラン及びホモシステインチオラクトンがある。ポリ
ペプチドとプロテインは本発明でもスペーサーとして使
用できる。そして、もし所望ならば複数のカップリング
剤を同じ表面で使用できる。
【００１３】生体分子は、複数のカルボキシ基を有する
いかなる生体分子でもあり得る。そして本発明によれ
ば、生体材料の生体適合性を改良するために、生体材料
の表面に結合される。生体分子は、内皮細胞発育因子、
上皮細胞発育因子、骨芽細胞発育因子、繊維芽細胞発育
因子、血小板由来発育因子、神経性の発育因子或いは血
管形成発育因子のような発育因子、或いはリゾチーム或
いはペニシリンのような抗菌物質、ヘパリン、分別され
たヘパリン（例えばＡＴ−ＩＩＩ列で）、ヘパラン、ヘ
パラン硫酸塩エステル、コンドロイチン硫酸塩エステ
ル、変性デキストラン、アルブミン、ストレプトキナー
ゼ、組識プラスミノゲン賦活物質（ＴＰＡ）、或いはウ
ロキナーゼのような抗トロンボゲン剤フィブロネクチン
やラミニンのような細胞結合プロテイン、コラーゲンの
ようなトロンボゲン物質、或いはヒアルロン酸、キトサ
ン、メチルセルロースのような親水性ポリマー、及び他
のプロテイン、炭水化物、脂肪酸である。
【００１４】使用するカルボジイミドは既に述べたよう
に、好ましくは化学構造Ｒ1 Ｎ＝Ｃ−ＮＲ2 の水溶性カ
ルボジイミドである。ここでＲ1 はアルキル基かシクロ
アルキル基、Ｒ2 は１−エチル−３−（３−ジメチル−
アミノプロピルカルボジイミド塩酸塩或いは１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエタン）カルボジイミ
ドのようなアルキルアミンかシクロアルキルアミン基で
ある。アミノ化された固体の表面への生体分子の反応結
合で第１のステップは、Ｏ−アシル尿素エステルを形成
するために、生体分子上のカルボキシ基とカルボジイミ
ド分子の間の反応である。これは化学式１に示すような
反応で、水溶液中で行なわれる。
【化１】
【００１５】室温で反応させてもよいが、この反応は、
好ましくは約ｐＨ５で冷たい溶液（０〜４℃）で行わせ
るとよい。生体分子はカルボジイミドと共に前処理し
て、アミノ化された支持体或いはカルボジイミドと接触
させ、生体分子とアミノ化された支持体を付随反応させ
る。この処理でカルボジイミドは、生体分子のカルボキ
シ基に反応し（化学式１）、不安定Ｏ−アシル尿素エス
テルを形成し（化学式２）、求核性の置換に影響する。
アミンとの反応が、適当なアミド結合の形成をもたらし
（化学式２）、生体分子の有効な固定化を生じさせる。
残りの活性化されたエステル基の部分が、加水分解を受
ける。一方、元のカルボキシ基をブロックしかつ生体活
性を弱めて、残りのものは比較的に安定したＮ−アシル
尿素基への分子内転位を受ける（化学式３）。
【化２】
【化３】 なお化学式２中の（１）は化学式１を、同じく化学式３
中の（２）は化学式２を示す。
【００１６】弱加水分解によるカルボキシ基の選択的な
回復は、カルボキシ基を回復するために効果的な時間に
渡って緩衝剤の存在下で表面と生体分子を培養すること
によって行なえる。好ましくは反応は、およそｐＨ８〜
１１の範囲、０〜７０℃の温度範囲そして約１〜２４時
間の範囲で行なう。例えば、結合させた生体分子を有す
る表面を、水溶性炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝８．２）
の１Ｍ溶液に浸し、３時間に渡って６０℃で加熱するこ
とができる。生体分子とアミノ化された固体の表面の間
のカルボキシ基による化学結合がそのまま保たれるの
で、このカルボキシ基機能性の回復のための処理は選択
的である。この反応は化学式４に示す通りである。
【化４】 なお化学式４中の（３）は化学式３を示す。
【００１７】
【実施例】以下、本発明の特定の実施例を説明する。
【００１８】
【実施例１】ポリウレタンサンプルは、グラフト重合さ
れたアクリルアミド表面と共に供給した。サンプルは、
Ｓｈｅｒｍａｎ Ｔｒｅａｔｅｒｓコロナ試験機（型式
ＨＴ３、入力電圧６５０Ｖ、出力電圧１３ｋＶ）を使用
してコロナ処理した。電極間隔５ｍｍでシート材料の両
面に６列或いは１２列で０．２５ｋＷを印加した。処理
されたシートは、アクリルアミド溶液１００ｇ毎に１．
７５ｍｌのセリウムイオン溶液（水に１３．７ｇのセリ
ウム硝安と１５．７５ｇの発煙硝酸を混合して２５０ｍ
ｌの水溶液とした）を加えて撹拌した脱泡していないア
クリルアミドの４０重量％溶液に入れた。
【００１９】試験試料は、モノマー溶液と室温で１時間
に渡って反応させた。その後、試験試料をモノマー溶液
から取り除いて、徹底的に脱イオン水ですすいだ。それ
から、緩く結合されたポリマー分子鎖を取り除くため
に、試験試料を６０℃の水中で一晩培養した。それから
グラフト重合されたゲルでカルボン酸基を添加するため
に、サンプルを６０℃において０．２Ｍの炭酸塩緩衝剤
（ｐＨ＝１０．５）に浸した。その後、０．５Ｍのエチ
レンジアミン−２ＨＣｌと０．５Ｍの４−モルホルノエ
タンスルホン酸を含有しｐＨ＝５．０とした緩衝液でサ
ンプルを培養することによって、これらのグループにエ
チレンジアミンを結合させた。水溶性カルボジイミド
は、０．１Ｍの濃度になり、アミノ化は室温で１時間行
なわれた。それから試験試料を、０．２Ｍの酢酸エステ
ル緩衝剤（ｐＨ＝４．６）と１ＭのＮａＣｌと十分な水
量で徹底的にすすいだ。
【００２０】
【実施例２】試験試料は、カルボジイミド結合によって
共有結合的に結合されたヘパリンを有するアミノ化され
たポリウレタンサンプルとした。共有結合形の結合は、
室温とそれ以下の低温条件（氷浴）の両方で比較試験し
た。試験試料は、ブタの腸管の粘膜からとったヘパリン
５ｍｇ／ｍｌの緩衝液（０．５Ｍの４−モルホルノエタ
ンスルホン酸、ｐＨ＝５．０）からなる冷たい溶液に浸
した。水溶性カルボジイミド（１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）は
０．０１Ｍの濃度とした。試験試料は溶液中で撹拌し
て、６時間に渡って反応させた。それから溶液を静かに
デカンターに移し、サンプルを徹底的に脱イオン水と１
ＭのＮａＣｌと１ＭのＮａＨＣＯ３ですすぎ、脱イオン
水で再びすすいだ。試験試料の１つのグループを、Ｎａ
ＨＣＯ３の１Ｍ溶液に６０℃において３時間浸し、その
後脱イオン水で付加的にすすいだ。サンプルは、生体活
性試験まで０．２Ｍのリン酸塩（ｐＨ＝６．８）内に貯
蔵した。培養した抗トロンビンＩＩＩを有する表面との
接触によってトロンビンが不活性化される程度を決める
ことによって生体活性試験を行なった。結果として単位
表面ごとに活性化されたトロンビンの量を表１で示す。
【表１】
【００２１】
【実施例３】以下の方法によりフィブロネクチンを本発
明によるアクリルアミドグラフト重合基質に結合させた
ものである。加水分解されたアクリルアミドグラフト重
合試験試料を、０．５Ｍのエチレンジアミン（ｐＨ＝
５．０）で緩衝した０．５Ｍのモルホルノエタンスルホ
ン酸（ＭＥＳ）溶液に加えた。この溶液に１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
（ＥＤＣ）を０．００５Ｍの最終濃度に達するまで加
え、撹拌しつつ室温において１／２時間反応させた。サ
ンプルを脱イオン水中で短時間すすいだ後、室温におい
て１／２時間撹拌しつつ、０．５重量％グルタルアルデ
ヒド／０．１Ｍホウ酸塩溶液（ｐＨ＝９．０）に浸し
た。その後、サンプルを脱イオン水で徹底的に水洗し、
続いて１重量％ポリエチレンイミン／０．１Ｍホウ酸塩
溶液（ｐＨ＝９．０）にサンプルを１／４時間入れ、室
温で撹拌した。イミンリンケージと遊離アルデヒド基の
減少によって表面を安定化する０．１Ｍのナトリウムシ
アノボロボランを含む０．２Ｍ酢酸エステル緩衝溶液
（ｐＨ＝４．６）での処理によってサンプルのアミン機
能化が生じた。
【００２２】それから、フィブロネクチン分子をカルボ
ジイミドと反応させてフィブロネクチン分子のカルボキ
シ基を活性化し、かつカルボジイミド活性化フィブロネ
クチン分子をアミン機能化基質表面と反応させることに
よって、フィブロネクチンをアミン機能化された基質表
面上へ固定させた。アミン機能化基質を、０．２２ｍｇ
／ｍｌの親和物質（４．５５６重量％のフィブロネクチ
ン）を含む０．５ＭのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝５．０）
に加え、そして０．１Ｍの最終濃度に達するまでＥＤＣ
をこの溶液に加えた。撹拌しつつこの反応を３時間に渡
って０〜４℃の温度で行なわせた。そして、試験試料を
十分な量の脱イオン水、１ＭのＮａＣｌと１ＭのＮａＨ
ＣＯ3 ですすぎ、さらに再び脱イオン水ですすいだ。カ
ルボキシ基の回復を、その後弱加水分解によって行なわ
せた。フィブロネクチン分子を有するサンプルを、１Ｍ
のＮａＨＣＯ3 溶液（ｐＨ＝８．２）中において３７℃
で８時間培養した。
【００２３】
【実施例４】以下の方法によりフィブロネクチンを本発
明によるアクリルアミドグラフト重合基質に結合させた
ものである。加水分解されたアクリルアミドグラフト重
合試験試料を、ｐＨ＝４に調整した０．１重量％ポリエ
チレンイミン溶液に入れた。この溶液に１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）を０．０１Ｍの最終濃度に達するまで加えた。撹
拌しつつこの反応を１／２時間に渡って室温で行なわせ
た。それからフィブロネクチンを実施例３の試験試料に
固定した。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、活性を有しその上に共
有結合的に結合された生体分子を有する生物学的適応性
表面であって、生体活性を保持する一方で、アミノ化さ
れた表面にカルボキシ基を有する生体分子を共有結合的
に結合したものを容易に得ることができるようになり、
これによって生体分子の生体活性を効率的に守ることこ
とができるようになるという効果が得られる。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のステップからなる、アミノ化され
    た固体表面にカルボキシ基を有する生体分子を結合させ
    る方法。 （ａ）上記生体分子をカルボジイミドと反応させ、上記
    生体分子のカルボキシ基を活性化し、 （ｂ）カルボジイミド活性化した上記生体分子を上記固
    体表面と反応させ、上記固体表面に生体分子を共有結合
    させ、 （ｃ）上記ステップ（ａ）の間に失っている上記生体分
    子へのカルボキシ基機能性を選択的に回復させる。
  2. 【請求項２】 上記カルボキシ基機能性の選択的な回復
    が、弱加水分解によってなされる請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 以下のステップからなる、アミノ化され
    た固体表面にカルボキシ基を有する生体分子を結合させ
    る方法。 （ａ）上記生体分子をカルボジイミドと反応させ、上記
    生体分子のカルボキシ基を活性化し、 （ｂ）カルボジイミド活性化した上記生体分子を上記固
    体表面と反応させ、上記固体表面に上記生体分子を共有
    結合させ、 （ｃ）共有結合された上記生体分子からＮ−アシル尿素
    基を取り除く。
  4. 【請求項４】 上記Ｎ−アシル尿素基の除去が、弱加水
    分解によってなされる請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 上記固体表面が、固体の基質にグラフト
    重合されたアミン機能基を有するポリマーを含む請求項
    １または３の方法。
  6. 【請求項６】 上記ポリマーが、アミン基により機能化
    されたアクリルアミドポリマーである請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 上記固体の基質が、ポリウレタン、シリ
    コーンエラストマー、ポリオレフィン、フルオロポリマ
    ー、ポリエステル及びポリアクリレートからなるグルー
    プから選択された高分子物質の基質である請求項５の方
    法。
  8. 【請求項８】 上記生体分子が、発育因子、抗菌物質、
    抗トロンボゲン剤、細胞結合プロテインからなるグルー
    プから選択された請求項１または３の方法。
  9. 【請求項９】 上記生体分子がヘパリンである請求項８
    の方法。
  10. 【請求項１０】 上記生体分子がフィブロネクチンであ
    る請求項８の方法。
  11. 【請求項１１】 上記カルボジイミドは、化学構造Ｒ１
    Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２を有し、Ｒ１がアルキル基或いはシクロ
    アルキル基であり、Ｒ２がアルキルアミンかシクロアル
    キルアミン基である請求項１または３の方法。
  12. 【請求項１２】 上記カルボジイミドが、１−（３−ジ
    メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩
    酸塩である請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 上記弱加水分解を、０〜７０℃の温度
    範囲で行なう請求項２または４の方法。
  14. 【請求項１４】 上記弱加水分解をおよそｐＨ８〜１１
    の範囲で行なう請求項２または４の方法。
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