JPS6398384A - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素の固定化方法に関するものであり、更に
詳しくはポリウレタンに酵素を固定化する場合の改良さ
れた方法に関するものである。

（従来の技術） 一般に酵素反応は、酵素を水に溶解した状態で行われる
が、近年酵素の回収、再使用、酵素の安定化、酵素反応
の連続化などを目的として酵素を水に不溶な固体表面に
結合しく酵素の固定化）。

酵素を固体触媒化した状態で用いることが行われるよう
になり１種々の方面において利用されてきている。

なかでも線維素溶解活性酵素を担体表面に固定化した材
料は、抗血栓性材料として医療用材料分野においては、
非常に有用な材料となっている。

すなわち、血液にとって異物である物質が血液と接触す
ると、血液凝固反応が起こり、最終的にいわゆる血栓塊
を形成する。この血栓形成反応は生体にとっては非常に
巧妙に仕組まれた自己防衛反応なのであるが、生体への
異物挿入ということが病気の治療や診断を目的としてな
された場合、この血栓形成により治療や診断という本来
の目的が果たせなくなるばかりでなく、かえって新たな
合併症を作り出したり、場合によっては血栓が原因で死
に至ることさえあるのである。

しかるに近年の医療の進歩にともない生体にとって異物
である材料を生体に挿入するということはますます多く
なりつつあり、それだけ抗血栓性材料に対する要求も強
くなってきている。

一方、ポリウレタンは優れた物性９化学的安定ヲ存する
ことにより多方面において使用されている材料である。

その意味でポリウレタンに酸素を固定化した材料は酵素
の触媒作用を期待することができるばかりでなく、その
素材が有する優れた物性を利用することができる点にお
いて大きな意義がある。

酵素を担体へ固定化する方法は、すでに多くの方法が提
案され、ポリウレタンに酵素を固定化する方法もすでに
提案されている。例えば、特公昭５９−５０３３７号公
報にはポリウレタンに酵素を固定化するに際して、ポリ
ウレタンの末端基を利用して、直接酵素をポリウレタン
に共有結合的あるいはイオン結合的に固定化するか、又
はポリウレタンの末端基をアミノ基、カルボキシル基。

酸無水物基、酸クロリド基、アジド基などの反応性に冨
む官能基に変えたのちこれらの官能基を利用して、酵素
を固定化する方法が提案されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、上記のような従来法では酵素の固定化量の十分
大きいものを得ることが困難であるという問題点を有し
ていた。

酵素の固定化量は一般に多ければ多いほど大きい触媒作
用を期待することができて有用でる。酵素の固定化量を
多くするためには３例えば、前記特公昭５９−５０３３
７号公報の場合のごとく末端基を利用するときは、その
末端基を増加させることにより酵素の固定化を増大させ
ることができる。しかし、末端基を増加させることは９
分子量を低下させることであり、ポリウレタン素材の有
する優れた物性も損なわれてしまう。

したがって、ポリウレタン素材の有する優れた物性も損
なうことなく、かつ容易な方法でポリウレタンに１より
多くの酵素を固定化する方法が望まれていた。

本発明はポリウレタン素材の有する優れた物性を損なう
ことなく、かつ容易な方法で多くの酵素を固定化する方
法を提供することを目的とするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記のごとき問題点を解決するために鋭
意検討の結果、ポリウレタンを熱水で前処理することに
よってこのような目的を達成しうろことを見出し１本発
明に到達した。

すなわち２本発明は、ポリウレタンを、ポリウレタンと
酵素のいずれとも反応しうる官能基を有する高分子化合
物を含む溶液で処理したのち、酵素溶液で処理すること
によりポリウレタンに酵素を固定化するに際し、咳高分
子化合物を含む溶液で処理する前にポリウレタンをあら
かじめ５０〜１００℃の熱水で処理することを特徴とす
るポリウレタンに酵素を固定化する方法を要旨とするも
のである。

本発明においてポリウレタンとは、主鎖の繰り返し単位
中にウレタン結合を有する高分子化合物のことであり、
工業的には主としてポリイソシアネートとポリオールと
の重付加反応により製造される。ポリイソシアネートと
しては１例えばトルエンジイソシアネート、キシレンジ
イソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、ジフェ
ニルメタンジイソシアネート、ジシクロへキシルメタン
ジイソシアネート、フェニレンジイソシアネート。

エチレンジイソシアネート、シクロへキシレンジイソシ
アネート、トリフェニルメタントリイソシアネート、ト
ルエントリイソシアネートなどがあげられる。ポリオー
ルとしては２例えばエチレングリコール、プロピレング
リコール、ブチレングリコール、ジエチレングリコール
、シクロヘキサングリコールなどのポリオール、ポリエ
チレンオキシドグリコール、ポリプロピレンオキシドグ
リコール、ポリテトラメチレンオキシドグリコール。

ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドグリコ
ールなどのポリエーテルポリオールなどがあげられる。

また、ポリオールとしては例えばコハク酸、グルタル酸
、アジピン酸、セバシン酸。

イソフタル酸、テレフタル酸、フタル酸などのジカルボ
ン酸とエチレングリコール、プロピレングリコールなど
のグリコールとの縮合によって得られる両末端に水酸基
を有するポリエステルをあげることもできる。さらに、
これらポリオールの一部をポリアミン、ポリチオール、
ポリカルボン酸などの他の活性水素化合物に置き換えた
ものであってもよい。これらのポリウレタンは目的に応
じてチューブ、フィルム、シート、繊維などの形態を有
する。また、ポリウレタン以外の材質からなる成形体表
面にポリウレタンの皮膜を形成させたものであってもよ
い。

また５本発明において用いられる酵素としては。

例えばアルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素。

グルコース−６−燐酸脱水素酵素、グルコースオキシタ
ーゼ、ルシフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ、カ
タラーゼ、チロシナーゼ、パーオキシダーゼ等の酸化還
元酵素、ヘキソナーゼ、ピルビン酸脱水酵素、カルバメ
ートキナーゼ、アセテートキナーゼ、リボヌクレアーゼ
などのトランスフェラーゼ、リパーゼ、アセチルコリン
エステラーゼ、ステロイドエステラーゼ、アミラーゼ、
セルラーゼ、デクストラナーゼ、インベルターゼ。

ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン。

パパイン、フィシン、トロンビン、カリクレイン。

ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター、プラスミン、プリノラーゼ、アス
パラキナーゼ、ウレアーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ア
ビラーゼなどの加水分解酵素。

ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルバルターゼ。

スレオニンデアミナーゼなどのりアーゼ、グルコースイ
ソメラーゼなどのインメラーゼ、チロシルーＴＲＮＡシ
ンセターゼ、アセチル−ＣｏＡシンセターゼなどのりガ
ーゼなどが代表的なものとじてあげられる。これらのう
ち、特にストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラ
スミノーゲンアクチベーター、プラスミン、ブリノラー
ゼなどのいわゆる線維素溶解活性酵素は、抗血栓性材料
を製造する上において有用性が高い。

また１本発明においてポリウレタンと酵素のいずれとも
反応しうる官能基を有する高分子化合物とは、ポリウレ
タンの末端基であるイソシアナート基、アミノ基、水酸
基などや、酵素のアミノ基カルボキシル基などと反応す
ることのできる官能基を有する高分子化合物を意味し、
好ましい具体例としては酸無水物基を有する高分子化合
物２例えば無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体、エチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−
無水マレイン酸共重合体など、ホルミル（アルデヒド）
基を有する高分子化合物２例えばアクロレインの重合体
、ジアルデヒドでんぷん。

酸クロリド基を有する高分子化合物１例えばメタアクリ
ル酸クロリドの重合体、エポキシ基を有する高分子化合
物１例えばグリシジル（メタ）アクリレート、あるいは
イソシアナート基を有する高分子化合物などをあげるこ
とができる。これらの無水マレイン酸−メチルビニルエ
ーテル共重合体は取扱の容易さ、安全性１反応性などの
点で、特に医療用材料分野に用いる場合には好ましい。

本発明においては、ポリウレタンを上記のように高分子
化合物を含む溶液で処理する前に、ポリウレタンの熱水
処理を行うことが必要である。

ポリウレタンの熱水処理は、ポリウレタンを熱水に接触
させることで行われ、より具体的には。

例えば単に熱水中に浸漬する。攪拌下に熱水中に浸漬す
る。さらには通水下に熱水中に浸漬するなどの方法を採
用することができる。熱水の中には。

必要に応じてポリウレタンの物性を損なうことのない他
の物質５例えば塩類、有機溶媒、界面活性剤などが含ま
れていてもよい。熱水の温度は５０〜１００℃、好まし
いくは６５〜８０℃である。

熱水処理を行う時間は特に限定されないが、一般的に言
って熱水の温度が低い場合には処理時間は長く、熱水の
温度が高い場合には処理時間は短く一１〇− てよい。例えば、１００℃に近い温度であれば１〜５時
間程度、５０℃に近い温度であれば１０時間以上が好ま
しいが、これらの処理時間は実験的に容易に決定できる
のでその中から最も経済的な条件を選んで設定すること
ができる。

本発明においては、熱水処理を行った後、上記高分子化
合物を含む溶液による処理を行う。この処理のための溶
液としては、上記高分子化合物を。

好ましくは０．００１〜１０−ｔ％程度、とくに好まし
くは０．０１〜５ｗｔ％程度の濃度で不活性溶媒（この
高分子化合物を溶解するが反応性官能基とは反応しない
溶媒）７例えばアセトン、メチルエチルケトン、ベンゼ
ン、トルエンあるいはこれらの混合溶媒などに溶解した
溶液を用いることができる。

この場合における処理とは、ポリウレタンとかかる溶液
とを接触させることで行われ、単なる浸漬処理、攪拌下
での浸漬処理１通液下での浸漬処理などいずれの方法で
も行うことができる。処理を行う温度１時間は、特に限
定されないが、好ましくはこれらの溶液の沸点以下の温
度で、好ましくは１分以上処理を行うことにより目的を
達成することができる。

本発明においては２次いで酵素溶液で処理を行うことに
より酵素の固定化を行う。固定化処理のための酵素溶液
は、好ましくは酵素を水あるいは生理食塩水などに溶か
した溶液として使用される。

酵素溶液中には必要に応じて安定剤などを含んでいても
よく、また酵素溶液で処理を行うに際しての温度１時間
の条件は、好ましくは常温以下の温度、好ましくは１時
間以上である。

（実施例） 以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。

なお１例中、線維素溶解活性は金井、金井編著「臨床検
査法提要」改訂増補２５版（金属出版）Ｖｌ−１０５を
参照し２人フィブリノーゲン水溶液にトロンビン生理食
塩水溶液を添加して作成したフィブリン平板に試料を置
き、３７℃２４時間放置後試料の周囲に溶解されたフィ
ブリン平板の溶解窓の面積を長径×短径（ｍｍ”）で表
すことにより測定した。

実施例１．比較例１ ４．４′−ジシクロへキシルメタンジイソシアネート、
ポリテトラメチレンエーテルグリコール及びテトラメチ
レングリコールを重合することによって得られたエーテ
ル型脂環式ポリウレタン（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｘ社、Ｔｅ
ｃｏｆｌｅｘ　）から成形された外径１．６１ｍ、内径
１．２１１のチューブを６５℃に加熱された１溜水中に
２４時間浸漬した。処理を行ったチューブを真空乾燥に
より水分を除去したのち。

無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体（ＧＡ
Ｆ社、　ＧＡＮＴＲＥＺ　ＡＮ１３９　）　　４ｗｔ％
を含有する脱水アセトン溶液中に１時間浸漬した。その
後。

アセトンで十分洗浄行い、真空乾燥によりアセトンを除
去した。ついで１　このチューブを、１／１０Ｍ酢酸バ
ッファーが１０ｖｏ１％添加され、ウロキナーゼが処理
面積当たり１３０　ｕｎｉｔ／　ｃＪとなるように調液
されたウロキナーゼ生理食塩水溶液中に浸漬し、７℃で
４８時間放置した。処理後のチューブは蒸溜水で繰り返
し洗浄を行ったのち、２４１３一 時間真空に引くことにより乾燥を行った。

得られたチューブを長さ２韮に切断し７その線維素溶解
活性を測定したところ、フィブリン平板の溶解面積は４
８４．ｍ２であった。

比較のため熱水処理を行わなかった以外は、実施例１と
全く同じ操作をすることによって作成したチューブの線
維素溶解活性は２２５龍２と低い値であった。

実施例２．比較例２ ４．４′−ジフェニルメタンジイソシアネート。

ポリテトラメチレンエーテルグリコール及びテトラメチ
レングリコールを重合することによって得られたエーテ
ル型芳香族ポリウレタン（化成アップジョン社、ベレセ
ン）から成形された外径１．６１ｍ、内径１．２ｕのチ
ューブを、８０℃の熱水中に６時間浸漬した。

熱水処理を行ったチューブは真空乾燥により水分を除去
したのち、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体ＣＧＡＦ社、　ＧＡＮＴＲＥＺ　ＡＮ１３９）４ｗ
ｔ％を含有する脱水アセトン溶液中に１時間浸−１４＝ 消した。その後、アセトンで十分洗浄を行い、真空乾燥
によりアセトンを除去した。ついで、このデユープを、
１／ＩＯＭ酢酸バッファーが１０ｖｏ１％添加され、ウ
ロキナーゼが処理面積当たり１３０ｕｎｉｔ／ｃＪとな
るように調液されたウロキナーゼ生理食塩水溶液中に浸
漬し、７℃で４８時間放置した。処理後のチューブは蒸
溜水で繰り返し洗浄を行ったのち２４時間真空に引くこ
とにより乾燥を行った。

得られたチューブを長さ２ｆｌに切断し、その線維素溶
解活性を測定したところ、フィブリン平板の溶解面積は
５０６１ｍ”であった。

比較のため熱水処理を行わなかった以外は、全く同じ操
作をすることによって作成したチューブの線維素溶解活
性は２１０ｎ２と低い値であった。

実施例３〜９．比較例３ 実施例１で用いたものと同じチューブについて。

熱水処理条件を表１の示すごとく変えて処理を行った。

処理後、実施例１と同様にしてウロキナーゼの固定化を
行った。

得られたチューブの線維素溶解活性は表１に示すとおり
であった。表１から明らかなように、４０℃という低い
温度においては長時間処理を行っても効果は認められな
かった。

表１ 実施例１０．比較例４ ４．４′−ジフェニルメタンジイソシアネートとポリテ
トラメチレンエーテルグリコールとを重合することによ
って得た両末端がイソシアネート基である芳香族ポリウ
レタンオリゴマーを、鎖延長剤としてエチレンジアミン
を使用して重合を行ってポリウレタンを得た。

得られたポリウレタンから厚さ約０．２ｎのポリウレタ
ンシートを形成し、ついでこのシートを８０℃の熱水中
に６時間浸漬した。

熱水処理を行ったシートは真空乾燥により水分を除去し
たのち、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合
体（ＧＡＦ社、　ＧＡＮＴＲＥＺ　ＡＮ１３９　）１ｗ
ｔ％を含有する脱水アセトン溶液中に０．５時間浸漬し
た。その後、アセトンで十分洗浄を行い。

真空乾燥によりアセトンを除去した。ついで、このシー
トを、１／ＩＯＭ酢酸バッファーが１０νＯＩ％添加さ
れ、ウロキナーゼが処理面積当たり１００ｕｎｉｔ／ｃ
Ｊとなるように８周液された。ウロキナーゼ生理食塩水
溶液中に浸漬し、２０℃で２４時間放置した。処理後の
シートは蒸溜水で繰り返し洗浄を行ったのち、２４時間
真空に引くことにより乾燥を行った。

得られたシート直径５■の円形に切断し、その線維素溶
解活性を測定したところ、フィブリン平板の溶解面積は
４６０ｍ２であった。

比較のため熱水処理を行わなかった以外は、実施例１０
と全く同じ操作をすることによって作成したシートの線
維素溶解活性は１７５ｍｍ２と低い値であった。

（発明の効果） 本発明によれば、容易に、より多くの酵素をポリウレタ
ンに固定化することが可能である。

本発明によって酵素の固定化されたポリウレタンはポリ
ウレタン本来の優れた物性を損なうことなく有し、しか
も酵素の触媒作用も大きい材料である。そして、とくに
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、　Ｍｉｍプラスミ
ノーゲンアクチベーター。

プラスミン、ブリノラーゼなどのいわゆる線維素溶解活
性酵素の固定化されたポリウレタンは、抗血栓性材料と
して血管内留置カテーテル、排液用ドレーンチューブ、
バイパスチューブなどの医療用材料として極めて有用で
ある。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリウレタンを、ポリウレタンと酵素のいずれと
   も反応しうる官能基を有する高分子化合物を含む溶液で
   処理したのち、酵素溶液で処理することによりポリウレ
   タンに酵素を固定化するに際し、該高分子化合物を含む
   溶液で処理する前にポリウレタンをあらかじめ５０〜１
   ００℃の熱水で処理することを特徴とするポリウレタン
   に酵素を固定化する方法。
2. （２）酵素が線維素溶解活性酵素である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）線維素溶解活性酵素がウロキナーゼである特許請
   求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）ポリウレタンと酵素のいずれとも反応しうる官能
   基を有する高分子化合物が無水マレイン酸−メチルビニ
   ルエーテル共重合体である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。