JPS6020997B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

従来、酵素反応は酵素の水溶液中で酵素を基質に反応さ
せるバッチ方式によっていたが、近年、酵素を水不溶性
の担体に固定化し、固体触媒と同様に取扱うことのでき
る固定化酵素が注目され、一部では既に実用化されてい
る。

このような固定イ技酵素は使用される過程でその酵素活
性が漸次低下し、逐には実質的に失活して使用に耐えな
くなる。

実質的に失活した固定イ捉酵素は、従来は、アルカリ処
理等適宜の手段によって可逆的に酵素を担体から離脱さ
せ得るときには、かかる手段によって迫体を回収し、そ
うでないときには廃棄されている。しかし、前者によれ
ば操作が煩雑であり、後者によれば担体が再利用されず
、非経済的である。本発明者らは、実質的に失活した固
定イＱ酵素の有効利用を図るべく鋭意研究した結果、担
体を含む場合には迫体を含め、固定イＱ酵素に既に固定
化されている失活酵素を担体として利用し、新たに活性
酵素をこのような迫体に固定化するに際して、活性酵素
の少なくとも一部を上記失活酵素の官能基に直接又は間
接に共有結合させると、酵素の固定化量や活性収率が増
大し、及び／又は酵素活性の持続性が高まることを見出
して、本発明に到ったものである。

従って、本発明の目的は一般的には固定イＱ酵素の製造
方法を提供することであり、特に、実質的に失活した酵
素が固定化されている固定イは酵素を坦体とみなし、こ
れに新たに活性酵素を固定化して、改善された性質、特
性を有する固定イＱ酵素を得る方法を提供することであ
る。

本発明は、担体に酵素を共有結合させる固定化酵素の製
造方法において、担体として実質的に失活した酵素が固
定化されている固定化酵素を用い、この坦体に新たに活
性酵素を固定化するに際し、その少なくとも一部を上記
失活した酵素の有する官能基に共有結合させることを特
徴とする。

即ち、本発明の方法は、実質的に失活した酵素が固定化
されている固定イＱ酵素（以下、固定イ抜酵素恒体とい
う。）を新たに活性酵素を固定化するための迄体として
用いて、新たな固定イび酵素（以下、再生固定化酵素と
いう。）を得るものである。固定イ牧野素担体は、従来
より知られている通常の恒体に酵素を共有結合させた固
定化酵素が実質的に失活したものや、酵素を努群喬法で
結合した固定イ抜酵素が実質的に失活したものが好まし
く用いられるが、必要ならば包括法、吸着法等による固
定化酵素が実質的に失活したものも用いられる。

固定イは酵素坦体において実質的に失活した酵素が固定
化されている担体は、従来より普通に用いられているも
のを含み、具体例としてセルロース、デキストラン、ア
ガロース等の多糖類誘導Ｚ体、ポリアクリルアミドゲル
、エチレン、酢酸ピニル共重合体ケン化物、多孔性ガラ
ス等が挙げられる。固定化酵素担体の形状は任意であっ
てよく、例えば粒状、シート状、チューブ状等である。
Ｚ固定イＱ鞍素
担体に新たに酵素を固定化する手段としては、従釆から
知られている共有結合法が用いられる。即ち、酵素担体
における失活酵素はＱ−又はごーアミノ基、Ｑ−、Ｐ一
又はｙーカルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、
イミダゾ２ール基、フェノール基等の官能基を有してい
るので、これらの官能基にジアゾ法、ベプチド法、アル
キル化法、架橋試薬による結合法等により適宜に結合さ
れるが、好ましくはグルタルアルデヒド、テレフタルア
ルデヒド等の−分子内に２個以上のアルデヒド基を有す
るポリァルデヒドを架橋試薬に用い、固定イＱ酵素担体
の失活酵素のアミノ基と活性酵素のアミノ基とを努群海
することによって固定化される。また、活性酵素の固定
化時にアルブミンのような水可溶性非酵素性結合剤タン
パ３ク質を共存させることもできる。本発明の方法にお
いて固定化酵素担体の失活酵素と新たに固定化すべき活
性酵素とは、失活酵素の残存活性、目的とする酵素反応
等に応じて同一でも異なっていてもよいが、好ましくは
同一の酵素が用いられる。

また、予め固定イ技鱗素担体を熱やアルカリ処理により
完全に失活せしめ、８Ｕ異の酵素を固定化してもよい。
必要に応じて二種以上の異なる酵素を固定化することも
できる。本発明の方法は固定化酵素担体の有する官能基
４に共有結合させ得る限りは特に制限されることなく任
意の酵素に適用できる。

これら酵素の具体例としては、アミノ酸オキシダーゼ、
カタラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコース・オ
キシダーゼ、グルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシ
ダーゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ベルオ
キシダーゼ、６ーホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アス
パラギン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン
酸アミノトランスフエラーゼ、グリシンアミノトランス
フヱラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトラン
スフェラーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトラン
スフヱラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミン
メチルトランスフエラーゼー、ピルビン酸キナーゼ、フ
ラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、６ーリジンアセチル
トランスフエラーゼ、ロィシンアミ／べブチダーゼのよ
うな転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンヱス
テラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナー
ゼ、Ｌーアルギニンデイミナーゼ、インベルタ−ゼ、ワ
レアーゼ、ウリカーゼ、ワロキナーゼ、エステラ−ゼ、
８ーガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン
、トリプシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオ
チダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、
ベクチナーゼ、へスベリジナーゼ、ペプシン、ベニシリ
ナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホス
フアタ−ゼ、ラクターゼ、リバーゼ、リポヌクレアーゼ
、レンニのような加水分解酵素、アスパラギン酸デカル
ポキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニア
リアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマ
ラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテター
ゼのようなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースホスフヱートイソメラーゼ、
グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニン
ラセマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシンター
ゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルヒン酸シンターゼの
ようなリガーゼを挙げることができる。本発明は以上の
ように、実質的に失活した酵素が固定化されている固定
イＱ酵素を損体とし、この失活酵素の官能基に新たに活
性酵素の少なくとも一部を共有結合させるものであり、
これによって、理由は明確ではないが、固定化藤素担体
の製造と同じ条件でこの固定化酵素担体に新たに酵素を
共有結合させるとき、新たに得た固定イＱ酵素は酵素活
性の持続性が高まり、或いは酵素活性が顕著に高まり、
従って、実質的に失活した間定イ技酵素の再利用と同時
に改善された岡定イは酵素を得ることができる。以下に
実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実
施例に限定されるものではない。

実施例５０〜１００メッシュのＢｉｏ一ＧｅＩ Ｐ一３
００（ポリアクリルアミドゲル）１５夕を３００の【容
量のポリプロピレン製三角フラスコに仕込み、これに予
め９び０に加熱した無水エチレンジアミン１００Ｍを加
えて、９０ｑｏの温度で２時間反応させた。

急冷後、０．１Ｍ食塩水で十分に洗浄してエチルアミノ
化ポリアクリルアミドゲルを得た。アミノェチル基の結
合量は担体の単位湿潤体積当り３．５５×１０‐５Ｍで
あった。尚、以下、単位体積はすべて湿潤状態での体積
である。このアミ／エチル化担体を０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に分散させ、３７０の温度においてグ
ルタルアルデヒドを系の５％（Ｗ／Ｖ）となるように加
え、１即時間反応させた後、蒸留水で洗浄してアルデヒ
ド化担体を得た。

次に、グルコースィソメラーゼのリン酸緩衝液（０．１
Ｍ、ｐＨ７．４）に、同じ緩衝液で緩衝化した上記アル
デヒド化担体を加え、グルコースイソメラーゼ濃度が０
．紙％（２８仇伽における吸光度ＯＤ２８ｏ：５．００
）となるように調整し、室温で２独時間反応させた。

このようにして得られた固定化酵素を２Ｍ食塩水で、次
に０．２Ｍ食塩水で十分に洗浄し、０．２Ｍ食塩水中に
保存した。

酵素の固定化量は、上記洗浄液と酵素原液とのＯＤ２８
ｏの差から求め、また、担体体積は０．２Ｍ食塩水中に
６時間浸債後の充填容量から、空隙率を０．４０として
求めた。

この結果、この固定化酵素における酵素固定化量は担体
の単位体積当り４．８のｏであり、活性は単位体積当り
６３０Ｕ、活性吸率は６０％であった。但し、酵素活性
は、グルコースィソメラーゼをＩＭグルコース、２仇Ｍ
トリス及び１伽Ｍ硫酸マグネシウムを含有する溶液（斑
８０）中、６０ｑｏの温度で回分式反応を行ない、生じ
たフラクトースをシステインーカルバゾール法にて測定
し、１時間にｌｒＭのフラクトースを生じる酵素量をＩ
Ｕとした。この間定イＱ酵素をカラムに充填し、酵素反
応を継続して行なわせたところ、４０日後に活性は当初
の３０％にまで低下した。

そこで、この固定化酵素損体を０．１Ｍリン酸緩衝液で
餌７．４に調整した５％（Ｗ／Ｖ）のグルタルアルデヒ
ド水溶液に５℃の温度で一夜濠澄して反応させた後、蒸
留水で洗浄し、次にグルコースィソメラーゼのリン酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に浸没し、グルコースィ
ソメラーゼ濃度が０．総％となるように調整し、室温で
２独時間反応させた。

次に、２Ｍ食塩水緩衝液で十分に洗浄した後、０．２Ｍ
食塩水中に保存した。タ このようにして得た新たに固
定化酵素には、迫体の単位体積当り７．４のｏのグルコ
ースィソメラーゼが固定されており、活性は単位体積当
り１０５０虹、活性収率は６５％であって、迫体として
の固定イ控酵素の当初に比べ、酵素の固定化量、酵素０
活性、活性収率いずれにおいても改善されたことが示さ
れる。

実施例 ２ エチレン一酢酸ビニル共重合体（エチレン単位含量筋重
量％、日本合成化学工業■ソアレックスタＦＨ）の斑モ
ル％ケン化物２０夕を水１０の【ーアセトン２０の‘一
ジメチルスルホキシド７０の‘混合溶剤に溶解し、ガラ
ス坂上に厚さ３００″に塗布した後、５０℃の水中に１
時間浸糟して凝固、膜化させ、ガラス板から剥離して十
分に水洗した。

０ 次に、３０℃においてＩＮ塩酸１００の【に２５％
グルタルアルデヒド水溶液２５の‘を分散させ、この分
散液中に上記膜を２独寿間浸糟した後、水、メタノール
の順で十分に洗浄し、膜状挺体を得た。

リゾチーム（シグマ社製、４雌００Ｕ／ｍｃ）を０．１
タ％濃度にリン酸塩緩衝液（０．０９Ｍ、ｐＨ７．５）
に溶解し、７℃の温度で上記膜状担体１０のを一晩浸潰
した後、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で十
分に洗浄して、間定イ塊酵素を得た。

光路長１仇のセルに６６肌ｍにおける吸光度が００．７
となるよ うに調整したＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｙｓ
ｏｄｅｊｋｔｉｃｕｓ懸濁リン酸塩緩衝液（０．０８Ｍ
、餌７．０）５の‘に上記固定化酵素１のを１０分間浸
潰し、６６仇ｍにおける吸光度を１分間当り０．００１
減少させるときの酵素活性をＩＵとするとき、滋．ＩＵ
／地の活性を示した。

この固定化酵素を新たに調整した上記と同じ緩衝液に１
０分間浸頚し、酵素活性を測定した。このようにして同
じ反応をｌｑ回線返して、酵素活性の変化を調べた。結
果を図面に示す（線Ａ）。このようにして酵素活性が当
初の約４０％にまで低下した固定イ○酵素を迫体として
用い、新たにリゾチームを固定化した。

即ち、固定イＱ酵素迫体を０．１Ｍリン酸緩衝液でｐＨ
７．５に調整した５％グルタルァルデヒド水溶液に室温
で２岬寿間浸潰して反応させた後、蒸留水で洗浄し、次
に、このアルデヒド化担体リゾチームの０．１％リン酸
緩衝液（０．０９Ｍ、ｐＨ７．５）に７℃の温度で一夜
浸潰し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で十分
に洗浄し、リゾチーム固定化膿を得た。このリゾチーム
固定化膜を前記と同機にして酵素反応を繰返し行なわせ
、酵素活性を測定した。

結果を図面に示す（線Ｂ）。新たに得た固定化酵素は担
体としての固定イ携繋素に比べ初期の活性において僅か
に劣るものの、活性の持続性は著しく改善されている。

【図面の簡単な説明】

図面は迫体としての固定イ技酵素の活性の持続性（線Ａ
）と、この固定化酵素担体に酵素が固定化された間定イ
Ｑ酵素の活性の持続性（線Ｂ）の一例を比較して示すグ
ラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 担体に酵素を共有結合させる固定化酵素の製造方法
   において、担体として実質的に失活した酵素が固定化さ
   れている固定化酵素を用い、この担体に新たに活性酵素
   を固定化するに際し、その少なくとも一部を上記失活し
   た酵素の有する官能基に共有結合させることを特徴とす
   る固定化酵素の製造方法。