JPH02182192A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は有機溶媒金主とする溶媒中で酵素反応を行なわ
せる方法に関するものであシ、さらに詳しくは膜に固定
化した酵素を用いて、該膜中に基質の有機溶媒溶銭金通
過させることにより効率よく反応を行なわせる方法に関
する。

（従来の技術） 有機溶媒を主とする溶媒中で酵素反応を行なわせること
は水溶性のあまり良くない基質を反応させる際などに有
用であり、粉末状の酵素？用いる方法、固定化酵素上用
いる方法、化学修飾した酵素？用いる方法、逆ミセル中
に閉じ込めた酵素を用いる方法などが知られている。こ
れらのうち、固定化酵５１用いる方法としては親水性の
ゲル中に酵素全包括固定化する方法、多孔性粒子の細孔
内に架橋により固定化する方法、セライト等の無機物粒
子表面に吸着させる方法などが用いられている。これら
については例えば「最新版バイオリアクター」昨ＩＰＣ
第３章に詳しく述べられている。

この様な固定化酵素？有機溶媒中で用いることにより例
えば加水分解酵素がその逆反応の会成反応の触媒となっ
たり転位反応全促進したシすることが認められてお９、
その反応特性は溶媒中の水分量によって大きく影響され
るが全く水の無い系では不活性である。活性な状態では
酵素およびその周囲、すなわち酵素の存在する細孔内や
ゲル内部にはある程度の鎗の水が存在していると考えら
れている。このため有機溶媒中の固定化酵素？用いる反
応方法に於ては、水に溶けにくいことが多い基質分子全
親水的環境にある酵素に対していかに効率よく供給する
かが重要である。

（発明が解決しようとする課題） 固定化酵素の有機溶媒中での利用に際しては、従来、酵
素が固定化された担体會基質溶液中で攪拌して反応させ
たり、カラムに充填して基質溶液を流す方法が行なわれ
ているが、これらの方法では担体内部の溶液の移動は十
分とは言えず酵素の本来の活性？十分利用できていない
。

本発明の目的はしたがって、酵素ケ固定化した担体の内
部での基質溶液の移動を速くすることによシ有機溶媒を
主とする溶媒中での酵素反応全効率良く行なう方法を提
供することである。

（課題全達成するための手段） 本発明のこれら′の目的は、有機溶媒を主とする溶媒に
溶解した基質業、圧力を用いて酵素奮固足化した膜中に
通過させることにより酵素反応全行なうことで達成され
た。

本発明で用いる膜の材質は、用いる有機溶媒系に不溶の
ものであれば何であっても良く特に限定されるものでは
無いが、例えばセルロース、キトサン、クルコマノナン
。ポリビニルアルコール。

エチレン−ビニルアルコール共ｉ１体、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリイ
ミド、セラミックスなどは広範囲の有機溶媒系に耐性が
あり好ましく、その中でもセルロース葡生成分とする膜
は蛋白質の非特異吸着が少ないため特に好ましい。膜の
形状としては平らな膜、中空系１′＃状のいずれでも良
く、膜厚は膜強度の点から７０３ｍ以上が好ましいう又
、本発明では膜中に溶液奮Ｊ力過させるため、微小な孔
を持つ膜が好ましく、０．／μ〜２０μの半均孔径金持
つ濾過膜（ミクロフィルター、ｐ紙など）や排除限界分
子量が／　０００〜／　、０００．０００である限外濾
過膜が特に好ましい。膜の構造としては厚さ方向で孔径
の変化しないもの（例えばＦ紙など）であっても良いが
、孔径の変化するいわゆる非対称膜が特に好ましい。

本発明に於て使用する酵素の線類に特に制限は無いが、
例えば・ξノミイン、トリプシン、キモトリプシン、ペ
プシン、プロメライン、サーモライシン、カルボ゛キシ
ペプチダーゼ、β−ガラクトシダーセ、β−グルコシダ
ーゼ、β−フルクトンダーｔ’　、　’）　ハーゼ、ホ
スホリノξ−ゼ、コレステロールエステラーゼ、などの
加水分解酵素、コレステロルオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、グリセロルオキシダーゼなどの酸化還元酵素は
特に好１しく用いることができる。

これらの酵素？担体に固定化する方法については、多官
能性試薬を用いて酵素量全架橋する方法や、酵素を担体
に共有納会、静電相互作用、物理吸着等の方法で固定化
するなどの公知の方法が利用できる。これらの方法につ
いては例えばＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　　ｖｏｌ　４′ｕ”や°“固定化生体触媒″
（千畑一部編・講談社）に詳しく述べられている。

本発明の方法によって行なう反応の種類としては有機溶
媒に溶ける基質に対する反応であれば何であってもよい
が、例えばペプチド脅威およびその他のアミド会成、エ
ステル合成、脂質のエステル交換並びにペプチドおよび
その他のアミドの加水分解、エステルの加水分解、脂質
の加水分解などが代表的なものである。

本発明に於て使用できる有機溶媒には特に制限は無いが
例として次の様なものが挙げられる。水と混ざる溶媒と
してはメタノール、エタノール。

エチレンクリコール、クリセロール、アセトン。

ジオキサン、テトラヒドロフラン、　Ｎ、、　Ｎ’−ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど、又、
水と混ざりにくい溶媒としてはｎ−プロピルアルコール
、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、５
ｅｃ−ｉｆルアルコール、ｔブチルアルコール、ｎ−オ
クタツール、ジエチルエーテル、ジインプロピルエーテ
ル、酢酸エチル。

酢酸ｎ−ブチル、塩化メチレン、クロロホルム。

四塩化炭素、ｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン、ｎ−オクタ
ン、イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエ
ン、キ７レンなどがある。

基質溶液？酵素を固定化した膜中に透過させる際の流速
は、約０．０３〜約２ｎｔｌ１分、、イ２が好ましく、
又反応温度は７０〜７００Ｃが好−ましい。

使用に適した装置としてはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ　　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　ｖｏｌ、
）（、ｐＪ＆　Ａ（／り２り）、Ｓ、５ｏｕｒｉｒａｊ
ａｎ著「ＲｅｖｅｒｓｅＯｓｍｏｓｉＳ」、Ｌｏｇｏｓ
　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｌｉｍ１ｔｅｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　（／　タフ０）ｐｐ、
ｚｔ〜２７、特公昭６２−夕３／ｊ／号などにＳ己載さ
れている装置が挙げられる。

（発明の効果） 膜の微細孔内に固定化された酵素の反応効率を大きく左
右するのは基質の酵素への供給と生成物の膜外′＼の除
去の速度であるが、特に少蓋の水を含む有機溶媒系での
反応に於ては酵素近傍が比較的水の多い系となるため水
溶性の低い基質の拡散にとっては不利な粂件である。こ
のため圧力を用いて倣孔内に基質上強制的に送り込むこ
とにより拡散に頼らずに基質全供給することができ、反
応の効率音大きく向上させることができる。

又、＠細孔内の流れにより生成物金除去するため、溶解
性の劣る生成物・副生成物による反応阻害も受けにくい
。さらに、暎に固定化した酵系ケ用いるため、ケル？充
填したカラム型リアクタで見られたいわゆる「チャンネ
リング現象」即ち、ゲルの一部にしか液が流れないため
酵素の一部しか利用できない現象がなく、酵素全有効に
利用することができる。

（実施例） 次に実施例金あげて本発明を更に詳細に説明するが本発
明はこれらに限定されるものではない。

実施例／、サーモライシン固定化暎による２−アスノξ
ルテーム合成 活性化したセルロース膜に化学結仕法で酵素？固定化し
、酢酸エチル溶媒中でジペプチドの合成？行なった。

膜の活性化 セルロース製ミクロフィルターＦＲ１’Ｏ（富士写真フ
ィルム■ｇ　）　／　２００　ｃｍ　２にＮ−ヒドロキ
シサクシンイミドクロロフオルメ−ト３０７とアセトニ
トリル１０θｄ會加える。水冷下で攪拌しながらピリジ
ン３０ｍ１ｆ滴下し、続いて≠０°Ｃで３θ分間振とり
する。その後膜全メタノールおよびアセトンで良く洗浄
して活性化セルロース膜を得た。

サーモライシンの固定化 サーモラ（シフｊＯｍｇｆ／　７ｍＭのＣａＣｌ２に含
むｐ　Ｈざ、０のｏ、ｏｚＭホウ酸バッファー！０ｒｎ
ｌに溶解する。濾過用の弘７ａφフィルターホルダーに
セットした活性化セルロース膜にサーモライクン溶液？
ペリスタポンプ金用りで＋　　’Ｃ約３ｔｄ１分の速度
で透過させ、５時間循環することによシ固定化した。次
に残った活性基ケ除くために１７．／Ｍエタノールアミ
ン水溶液？！−グ００で２時間循環嘔せ、最後にバッフ
ァー液を透過させて十分Ｉｌｌ洗浄した。酵素の固定化
量は溶液中に残った酵素？ニンヒドリン反応によシ定址
した。

Ｚ−アスノｔルテーム脅威 溶媒としては、２夕０Ｃに於て−ｔｍＭＣａα２金含む
ｏ、ｏｒＭモルホリノエタンスルホン酸バッファー（ｐ
Ｈ７，ｊ）で飽和させた酢酸エチル音用いた。以下では
これ全酢酸エチル系溶媒と呼ぶ。

基質は１００ｍＭのＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ルとａｏｍｙｌのベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パラキンｖ葡酢戚エチル系溶媒に溶かして用いた。

フィルターホルダー（４’７ｍ＋φ）にセットしたサー
モライシン固定化膜にペリスタポンプを用いて基質溶液
コｏｗＬｚ−２ｘｓ　０Ｃで透過・循環させ、２時間後
に生成したＺ−アス・ξルテーム’１ｋＨＰＬＣにより
定量した。基質の流速は約３ｄ／分であった。結果？第
１表に示した。

比較例へ 実施例１に示したサーモライシン固定化膜？用い、基質
葡強制的に透過させるのでは無く基質溶液中で振と９す
る方法でＺ−アスパルテーム乞合成した。

実施例／、と同じ基質溶液ＪＯｔｒｄｆ中に実施ｙＸＪ
ｉ、と同じサーモライシン固定化膜（同じ面積、即ち≠
７闇φ）を入れ、２ｊ　０Ｃで振とうしてＺ−アスパル
テーム會台成させた。λ時間振とう後に生成したＺ−ア
ス・ξルテームを月ＰＬＣで定量し酵素の比活性を求め
た。結果全第１表に示した。

り ／　０ 第１表 ／／−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 基質を有機溶媒を主とする溶媒に溶解した溶液を圧力を
   用いて酵素を固定化した膜中を通過させることにより酵
   素反応を行なわせる方法。