KR20000015993A - 가교된 단백질 결정 제제 및 유기 용매 중에서 상기 제제를촉매로서 사용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 선택적 화학 반응을 수행하기 위한 생촉매 작용 기술의 응용에 관한 것이다. 한 실시태양에 있어서, 본 발명은 가교된 단백질 결정 제제 및 유기 용매를 포함한 화학 반응에서 상기 제제를 촉매로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 가교된 단백질 결정 제제를 제조하는 방법 및 상기 제제를 사용하여 공업적 규모의 화학적 공정에 사용되는 반응을 비롯한 유기 용매 중에서의 화학 반응을 최적화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

가교된 단백질 결정 제제 및 유기 용매 중에서 상기 제제를 촉매로서 사용하는 방법
정밀 화학 물질 및 약품의 공업적 규모의 합성에 있어서 단백질, 예를 들면 효소를 촉매로서 사용하는 것은 최근에 대단한 관심의 대상이 되고 있다[케이. 파버 및 엠.씨.알. 프란센, Trends in Biochem. Tech., 11, pp. 461-70(1993)]. 효소는 입체적(stereo-), 위치적(regio-) 및 화학적(chemo-) 선택성 방식으로 화학 반응을 수행하는데 유용한 도구인 것으로 인지되고 있다. 온화한(mild) 조건하에서도 작용하는 효소의 능력, 용이한 처분 및 미량의 폐기물 산출은 효소의 사용과 관련된 또 다른 이점이다. 또한, 효소는 유기 용매 중에서 촉매 반응에 사용하여 기질 및 생성물을 용해시키고, 생성율을 증가시키기 위해 반응 속도 및 평형 상태를 조절할 수 있다.
효소는 현행 비효소 기술보다 인상적인 합성 가능성을 제공하지만, 이들 효소의 상업적 이용은 불리한 점, 예를 들면 불량한 안정성, 성능에 있어서 가변성, 분리와 정제의 곤란, 취급의 곤란, 고비용 및 긴 반응 시간에 의해 제한받고 있다. 게다가, 유기 용매는 효소와 비상용성인 경우가 많기 때문에, 효소 분해 또는 불활성화를 유도한다[에이.엠. 클리바노브, "Asymmetric Transformations Catalyzed by Enzymes in Organic Solvents", Acc. Chem. Res., 23, pp. 114-20(1990)]. 효소가 유능한 공업적 촉매로서 작용하기 위해, 효소는 제조 공정의 실질적인 환경에서 지나친 간섭을 받지 않은 채로 작용할 수 있어야 한다. 그러한 환경은 극성 유기 용매, 비극성 유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매를 포함한다. 유기 용매에 대한 효소의 낮은 활성 및 혐오성은 일반적인 유기 합성에서 효소 단백질을 광범위하게 사용하는데 있어서 장애물로 여전히 존재하고 있다. 비록 그러한 합성이 효소에 의해 촉진되는 경우가 있다고 할지라도, 그러한 공정은 대개 효소를 기질보다 더 많은 중량으로 사용해야 하는 공정이다: 참고 문헌[알.보바라 등, Tetrahedron: Asymmetry, 2, pp. 931-38(1991); 와이.-에프. 왕 등, J. Am. Chem. Soc., 110, pp. 7200-05(1988); 에이. 팔로머 등, Chirality, 5, pp. 320-28(1993) 및 브이. 고터 등, Tetrahedron, 47, pp. 9207-14(1991)].
이러한 불리한 점들을 극복하기 위해 고안된 2가지 방법, 즉 효소 정제 방법과 효소 고정화 방법은 상기 불리한 점들을 어느 정도 해소하였다. 그러나, 상기 방법들은 유기 용매 중에서 효소 활성 또는 효소 안정성의 손실이라는 문제점을 해결하지 못하였다. 고정화 방법은 고비용을 발생시키고 지지체의 첨가에 의해 효소의 활성을 희석시킴으로써 상기 불리한 점들을 실제로 더 악화시켰다. 또한, 효소 정제 방법은 추가 비용을 발생시키고, 대부분의 경우 유기 용매 중에서 효소 활성을 증가시키지 못하였다. 예를 들면, 유기 용매 중에서 정제된 리파아제의 가능한 합성상 이점은 실제 파악되지 않고 있다[티.니시오 및 엠. 카미무라, Agric. Biol. Chem., 52, pp 2631-32(1988); 티. 야마네 등, Biotechnol. Bioeng., 36, pp. 1063-69(1990)]. 정제된 리파아제의 비용은 미정제 리파아제의 비용보다 더 많은 반면, 유기 용매 중에서 상기 정제된 리파아제의 안정성 및 활성은 미정제 리파아제보다 더 낮다[알. 보바라 등, Biotechnol. Lett., 15, pp. 169-74(1993); 이. 위트제 등, Biotechnol. Bioeng., 41, pp. 171-78(1993); 지.오톨리나 등, Biotechnol. Lett., 14, pp. 947-52(1992)].
최근 연구에 의해 밝혀진 바에 의하면, 유기 용매 중에서 효소의 활성은 수분 함유량, 촉매 입자의 크기와 형태 구조, 및 효소의 미시적 환경에 직접 관계가 있다[에이.엠. 클리바노브, "Enzymatic Catalysis in Anhydrous Organic Solvent" , Trend in Biochem. Sci., 14, pp. 141-44(1989)]. 이러한 인자들은 탄수화물, 유기 완충제 또는 염을 사용하여 효소의 동결 건조된 복합체를 제조함으로써 조정할 수 있다[케이. 다불리스 및 에이.엠. 클리바노브, Biotechnol. Bioeng., 41, pp. 566-71(1993); 에이.디. 블랙우드 등, Biochim. Biophys. Acta, 1206, pp. 161-65(1994); 와이.엘. 크흐멜니트스키 등, J. Am. Chem. Soc., 116, pp. 2647-48(1994)]. 그러나, 유기 용매 중에서 촉매 반응에 사용되는 효소를 제조하기 위해 동결 건조법을 광범위하게 이용하지만, 그 효과는 충분히 이해되지 않아 경우에 따라서 상기 동결 건조법은 현저한 효소의 가역적인 변성을 발생시킬 수 있다[케이. 다불리스 및 에이.엠. 클리바노브, Biotechnol. Bioeng., 41, pp. 566-71(1993)].
유기 용매를 포함한 생물학적 변환(biotransformations)에서 낮은 효소 활성의 문제를 다룬 또 다른 연구에서는 계면 활성제를 사용하는 방법을 포함하고 있다. 연구 보고된 바에 의하면, 리파아제를 광 가교성 수지 프리폴리머로 고정화시키기 전에 첨가되거나, 반응 배양 혼합물에 첨가되는 비이온성 계면 활성제는 효소 활성을 증가시켰다[비. 노르드비 및 에이치. 홀름센, "Effect of Polyhydroxy Compounds on the activity of Lipase from Rhizopus arrhizus in Organic Solvent", in Biocatalysis in Non-Conventional Media, 제이. 트램퍼 등 (Ed.), pp. 355-61(1992)]. 리파아제 효소를 도포하기 전에 또는 동시에 소수성 지지체에 비이온성 계면 활성제(1종 이상의 지방산 부위를 포함함)를 도포하여 제조한 고정화된 리파아제 효소는 종래의 고정화된 효소와 비교하여 효소 전환 방법에서 활성이 있음이 입증되었다[PCT 특허 출원 WO 94/28118호].
계면 활성제는 리파아제의 효소 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있다[에스. 보르네만 등., "The Effect of Surfactants on Lipase-Catalysed Hydrolysis of Esters: Activities and Stereo Selectivity", Biocatalysis, 11, pp. 191-221(1994)]. 그럼에도 불구하고, 계면 활성제를 효소의 수용액과 혼합하고, 이 혼합물을 탈수시킨 다음, 최종 형성된 효소 생성물을 효소로서 사용하면, 유기 용매 중에서 강화된 활성을 갖는 것으로 알려졌다[PCT 특허 출원 WO 95/17504호]. 또한, 계면 활성제 또는 지질은 효소를 유기 용매 중에 용해시켜 화학 반응 속도를 증가시키기 위해 효소를 코팅하는데 사용되었다[엠. 고토 등, "Design of Sufactants Suitable for Sufactant-coated Enzymes as Catalysts in Organic Media", J. Chem. Eng. Jpn., 26, pp. 109-11(1993); 엔. 카미야 등, "Sufactant-Coated Lipase Suitable for the Enzymatic Resolution of Methanol as a Biocatalyst in Organic Media", Biotechnol. Prog., 11, pp. 270-75(1995)]. 이러한 절차를 거친 후, 효소는 유기 용매에 용해될 수 있게 되었다. 또한, 유기 물질에 용해될 수 있는 효소 복합체는 문헌[브이.엠. 파라드카 및 제이.에스. 도르딕, J. Am. Chem. Soc., 116, pp. 5009-10(1994)(프로테아제)와, 와이. 오카하타 등, J.Org. Chem., 60, pp. 2240-50(1995)(리파아제)]에 기재되어 있다.
가교된 효소 결정["CLEC(상품명)"] 기술의 출현은 상기 언급한 불리한 점들을 해결하기 위한 독특한 방법을 제공하였다[엔.엘. 에스티. 클레어 및 엠.에이. 네비아, J. Am. Chem. Soc., 114, pp. 7314-16(1992)]. 가교된 효소 결정은 보통 효소(가용성 효소 또는 고정화된 효소) 작용과 비상용성인 환경하에 활성을 유지한다. 그러한 환경은 고온에서의 장시간 노출 및 극단적인 pH 상태를 포함한다. 또한, 유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서, 가교된 효소 결정은 가용성 효소 또는 종래의 고정화된 효소보다 훨씬 더 큰 안정성과 활성을 나타낸다. 그렇게 많은 생촉매 작용 공정은 세부적인 조건하에서 효소의 안정성 및 활성에 따라 좌우되기 때문에, 가교된 효소 결정은 공업용, 임상용 및 연구용 설비내의 효소로 유리하게 사용된다. 따라서, 가교된 효소 결정은 유기 합성 반응에 있어서 주목되는 범용 촉매로서 생촉매 작용의 분야에서 상당한 진보를 보이고 있다[알.에이. 페르시쉐티 등, "Cross-Linked Enzyme Crystals(CLEC) of Thermolysin in the Synthesis of Peptides", J. Am. Chem. Soc., 117, pp. 2732-37(1995) 및 제이.제이. 랄론드 등, J. Am. Chem. Soc., 1117, pp. 6845-22(1995)].
일반적으로, 단백질 촉매 작용 기술의 진보에도 불구하고, 유기 용매 중에서 높은 활성을 지닌 촉매에 대한 요구가 여전히 존재하고 있는 실정이다.
본 발명은 선택적 화학 반응을 수행하기 위한 생촉매 기술의 응용에 관한 것이다. 한 실시태양에 있어서, 본 발명은 가교된 단백질 결정 제제 및 유기 용매를 포함한 화학 반응에서 상기 제제를 촉매로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 가교된 단백질 결정 제제를 제조하는 방법 및 상기 제제를 사용하여 공업적 규모의 화학적 공정에 사용되는 반응을 비롯한 유기 용매 중에서의 화학 반응을 최적화시키는 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매를 포함한 화학 반응에 있어서 촉매로서 높은 활성 및 생산율을 나타내는 가교된 단백질 결정 제제를 제공한다. 유리하게도, 상기 활성 및 생산율의 정도는 가용성 단백질 또는 종래의 고정화된 단백질보다 더 크다. 또한, 본 발명은 가교된 단백질 결정 제제를 제조하는 방법 및 상기 제제를 사용하여 공업적 규모의 생촉매 작용에 사용되는 반응을 비롯한 유기 용매 중에서의 화학 반응을 최적화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 계면 활성제 및 유기 용매의 존재하에서 가교된 단백질 결정을 건조시킴으로써 제조한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 계면 활성제 및 유기 용매의 존재하에서 가교된 단백질 결정을 동결 건조시킴으로써 제조한다.
발명에 대한 상세한 설명
본 명세서에서 설명하고 있는 본 발명을 보다 충분하게 이해하기 위해, 이하 상세한 설명을 하고자 한다. 설명에 있어서, 다음과 같은 용어들을 사용한다.
유기 용매--본질상 비수성인 모든 용매.
수성 용매-유기 용매의 혼합 용매--유기 용매 n%와 수성 용매 m%을 포함하는 혼합물(여기서, n은 1 내지 99이고, m은 100-n임).
유기 용매의 혼합물--2종 이상의 서로 상이한 유기 용매를 임의의 비율로 배합한 배합물.
가교된 단백질 결정 제제--가교된 단백질 결정과 1종 이상의 추가 부형제, 예를 들면 계면 활성제, 염, 완충제, 탄수화물 또는 중합체의 혼합물로서 슬러리가 아니라, 건조되어 자유 유동성을 갖는 분말 또는 동결 건조된 형태로 존재함.
촉매 활성의 유효량--일정한 기간에 걸쳐 도포된 영역을 보호하고, 복원하며, 해독시키는데 효과적인 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제의 양.
반응성 국부용 조성물--일정한 기간에 걸쳐 도포된 영역을 보호하고, 복원하며, 해독시키는데 효과적인 조성물.
본 발명의 가교된 단백질 결정 제제는 수 많은 공업적 규모의 화학 합성 절차의 전형적인 극심한(harsh) 용매 환경하에서 높은 활성을 보유하고 있기 때문에 매우 바람직하다. 상기 제제의 결정 특성의 결과로서, 이러한 제제의 가교된 단백질 결정 성분은 가교된 결정 부피의 전반에 걸쳐 균일성을 달성한다. 이러한 균일성은, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매를 서로 교환한 경우에도, 결정 격자를 구성하는 단백질 분자들 사이의 분자간 접촉 및 화학적 가교 결합에 의해 유지된다. 이러한 용매 중에서도, 단백질 분자는 상호 균일한 거리를 유지하여 가교된 단백질 결정 제제 내에 매우 뚜렷하게 형성된 안정한 소공을 형성함으로써 촉매에 대한 기질의 출입 뿐만 아니라 생성물의 회수를 용이하게 한다. 이러한 가교된 단백질 결정에 있어서, 격자간의 상호 작용은 화학적 가교 결합에 의해 고정되어 있을 때, 변성, 특히 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서의 변성을 억제하는데 있어서 매우 중요하다. 결정 격자 내의 가교된 단백질 결정 및 구성 성분 단백질은 유기 용매에서 단순 분산(monodisperse)을 유지하여 응집 문제를 피할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제의 가교된 단백질 결정 성분의 특징은 유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 높은 정도의 활성에 기여한다.
유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 활성 이외에도, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 단백질 가수분해, 극도의 온도 및 극도의 pH에 매우 큰 내성을 갖는다. 가교된 단백질 결정 단위 부피당 활성은 종래의 고정화된 단백질 또는 농축된 용해성 단백질의 활성보다 현저하게 더 크다. 이것은 제제의 가교된 단백질 결정 성분 내의 단백질 농도가 이론적 한계에 근접하게 존재하기 때문이다.
이러한 이점들에 의해, 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제는 반응 효율을 현저하게 개선시킬 수 있다. 이러한 이점들은 높은 작업 처리량을 요구하는 가혹한 조건 또는 상황하에 개선된 생성율을 제공함으로써 공정 조작 화학자들로 하여금 반응 조건에 대해 관심을 보다 덜 쏟고, 생성율을 최대화시키는 것에 집중하게 한다.
본 발명의 가교된 단백질 결정 제제의 단백질 성분은, 예를 들면 효소 또는 항체를 비롯한 모든 단백질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 활성이 동량의 미정제 형태 또는 순수한 형태의 상기 단백질 활성보다 약 1.7 배 이상 더 큰 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 제제의 활성의 정도는 동량의 미정제 형태 또는 순수한 형태의 상기 단백질의 활성보다 약 1.7 배 내지 약 90 배 더 크다.
또한, 본 발명은 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 4.3 배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 4 배 내지 약 442 배 더 큰 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제는 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 고형물 1 mg 당 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 더 크고, 그와 같은 고유 활성은 약 50 배 이상 더 큰 활성, 약 100 배 이상 더 큰 활성, 약 200 배 이상 더 큰 활성 및 약 300 배 이상 더 큰 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 그 활성이 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 계면 활성제를 전혀 함유하지 않는 가교된 단백질 결정 제제의 활성보다 19 배 이상 더 큰 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제는 그 활성이 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 계면 활성제를 전혀 포함하지 않는 가교된 단백질 결정 제제의 활성보다 약 19 배 내지 약 100 배 이상 더 큰 것을 특징으로 할 수 있다.
전술한 모든 가교된 단백질 결정 제제에 있어서, 언급된 활성 정도는 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서, 또는 양 용매 중에서 나타날 수 있다. 이러한 활성 정도는 가교된 효소 결정 제제를 비롯한 모든 유형의 가교된 단백질 결정 제제가 지니고 있는 특징이다.
본 발명의 가교된 단백질 결정 제제는 다수의 화학 공정 중 어느 한 공정에 사용할 수 있다. 이러한 공정으로는 공업용 규모의 공정 및 연구용 규모의 공정, 예를 들면 정밀 화학 물질 및 약품의 유기 합성 공정, 그러한 생성물을 제조하기 위한 중간체의 합성 공정, 키랄 합성 공정 및 광학적으로 순수한 약품과 정밀 화학 물질을 위한 분리 공정을 들 수 있다. 효소 전환 공정으로는 입체선택성(streoselective) 반응, 입체특이성(stereospecific) 반응 및 위치선택성(regioselective) 반응을 비롯한 산화 반응, 환원 반응, 첨가 반응, 가수분해 반응, 제거 반응, 재배열 반응, 에스테르화 반응 및 비대칭 전환 반응을 들 수 있다. 이러한 반응들을 사용하여 제조할 수 있는 생성물로는 키랄성 유기 분자, 펩티드, 탄수화물, 지질 및 기타 화학종을 들 수 있다.
상기 열거한 반응 중 어느 하나를 수행할 때, 당업자라면 특정 반응에 선택된 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매는 가교된 단백질 결정의 단백질 성분 뿐만 아니라 가교된 단백질 결정을 안정화시키는데 사용되는 계면 활성제와 상용성을 지녀야 한다는 것을 인지할 수 있다. 유기 용매는 디올, 폴리올, 폴리에테르, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 유기 용매의 예로는 톨루엔, 옥탄, 테트라히드로푸란, 아세톤 및 피리딘을 들 수 있다. 추가의 예로는 수 혼화성 용매 또는 수 불혼화성 용매와 같은 소수성 용매 또는 극성 유기 용매, 예를 들면, 디에틸렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 폴리(에틸렌 글리콜), 트리에틸렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 1,2-부탄디올, 2,3-디메틸-2,3-부탄디올, 1,2-부탄디올, 디메틸 타르트레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)의 모노알킬 에테르, 폴리(에틸렌 글리콜)의 디알킬 에테르 및 폴리비닐피롤리돈 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
한 실시태양에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 기질과 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매의 존재하에서 기질에 작용하는 1종 이상의 단백질(이 단백질은 가교 결합된 단백질 결정 제제임)을 배합하고, 이 배합물을 상기단백질이 기질에 작용하여 선택된 생성물을 생성시킬 수 있는 조건하에서 유지시킴으로써, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 선택된 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 제조할 수 있는 생성물의 예로는 키랄성 유기 분자, 펩티드, 탄수화물 및 지질을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 제제가 표적 물질 또는 분자에 결합할 수 있는 능력에 의해 샘플로부터 상기 표적 물질 또는 분자를 정제하거나 분리하는 방법에 사용할 수 있다. 이러한 분리 방법은 단백질을 샘플 내의 표적 물질 또는 분자와 결합시켜 복합체를 형성시킬 수 있는 조건하에서 가교된 단백질 결정 제제를 임의의 수단에 의해 상기 표적 물질 또는 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 복합체를 상기 샘플로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 고형 지지체에 결합되거나, 칼럼 내에 충전되거나 비이드 위로 적층될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 샘플, 예를 들면 유체 내의 표적 피분석 물질을 검출하는 바이오센서의 성분으로서 사용할 수 있다. 이러한 바이오센서는 (a) 단백질이 표적 피분석 물질에 또는 상기 표적 피분석 물질이 침전하는 반응에서의 반응물에 작용하는 활성을 가지고 있는 것인, 가교된 단백질 결정 제제와, (b) 상기 가교된 단백질 결정 제제와 (1) 단백질이 작용하는 피분석 물질 또는 (2) 상기 피분석 물질이 침전하는 반응에서의 반응물을 함유하는 샘플 사이를 접촉시킬 수 있는 재료를 포함하는, 상기 가교된 단백질 결정 제제에 대한 보유 수단, 및 임의로 (c) 피분석 물질의 존재 또는 부재의 신호를 생성시키는 신호 변환기로 구성된다. 피분석 물질 또는 반응물에 대해 단백질의 활성을 검출하기 위한 수단은 pH 전극, 광 검출 장치, 열 검출 장치 및 전하를 검출하기 위한 수단으로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 신호 변환기는 광학 변환기, 전기 변환기, 전자기 변환기 및 화학 변환기로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 샘플내 성분을 개질시키거나 샘플, 예를 들면 유체 샘플내 성분을 분해 및 제거하기 위한 체외 장치에 사용할 수 있다. 이러한 체외 장치는 (a) 단백질이 성분에 또는 이 성분이 침전하는 반응에서의 반응물에 작용하는 활성을 가지고 있는 것인, 가교된 단백질 결정 제제와, (b) 상기 가교된 단백질 결정 제제와 (1) 단백질이 작용하는 성분 또는 (2) 이 성분이 침전하는 반응에서의 반응물을 함유하는 샘플 사이를 접촉시킬 수 있는 재료를 포함하는, 상기 가교된 단백질 결정 제제에 대한 보유 수단으로 구성된다. 이러한 체외 장치에 있어서, 보유 수단은 상기 가교된 단백질 결정 제제가 함유되어 있는 다공성 재료 또는 상기 가교된 단백질 결정 제제가 존재하는 튜브를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 바이오센서 또는 체외 장치에서 종래의 가용성 또는 고정화된 단백질 대신 유리하게 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 가교된 단백질 결정 제제를 사용하는 것은 종래의 가용성 단백질 또는 고정화된 단백질을 주성분으로 하는 바이오센서 및 체외 장치보다 더 높은 감응도, 체적당 생산율 및 작업 처리량을 특징으로 하는 바이오센서 및 체외 장치를 제공한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 크로마토그래피 기술에 사용할 수 있다. 이러한 기술로는 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 키랄성 크로마토그래피를 들 수 있다. 샘플의 크로마토그래피는 상기 샘플의 성분이 단백질과 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서 상기 샘플을 가교된 단백질 결정 제제와 접촉시키고, 이어서 상기 성분을 분리된 분획물로서 회수함으로써, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매의 존재하에 수행할 수 있다. 가교된 단백질 결정 제제는 충전된 크로마토그래피 칼럼 내에 함유될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제는 가스상 반응기, 예를 들면 가스상 반응을 위한 접촉 전환기에 사용할 수 있다. 예를 들면, 가스를 가교된 단백질 결정 제제로 충전된 칼럼에 통과시켜 가스를 분해할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 다양한 환경적 응용에 사용할 수 있다. 이러한 제제는 유막 제거와 같은 환경적 목적을 위한 종래의 가용성 단백질 또는 고정화된 단백질 대신 사용할 수 있다. 예를 들면, 1종 이상의 유기 용매를 유막에 첨가하고, 이어서 가교된 단백질 결정 제제를 첨가하였다.
또한, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 공기 여과와 관련된 공기 정화에 사용할 수 있다. 예를 들면, 공기를 가교된 단백질 결정 물질로 충전된 칼럼에 통과시켜 분해하고 불필요한 모든 오염 물질을 여과시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 가교된 단백질 결정을 계면 활성제와 배합하여 배합물을 형성시키는 단계와 유기 용매의 존재하에서 가교된 단백질 결정과 계면 활성제의 배합물을 건조시켜 가교된 단백질 결정 제제를 형성시키는 단계를 포함하여 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 가교된 단백질 결정의 활성을 증가시키는 방법을 포함한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 가교된 단백질 결정 제제는 피부 보호 및 해독을 위한 국부용 크림 및 로션의 성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 제제는 화장품에서 항산화제로서 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 사람 및 다른 포유 동물을 비롯한 모든 개체는 제제가 도포된 영역을 보호하고 복원시키며 해독시키는데에 있어서 충분한 시간 동안 촉매 활성 유효량의 가교된 단백질 결정 제제를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 방식으로 치료 받을 수 있다. 예를 들면, 가교된 단백질 결정 제제를 임의의 상피에 국부적으로 투여할 수 있다. 이러한 상피는 경구 표면, 안(眼) 표면, 귀 표면, 및 코 표면을 포함한다.
가교된 단백질 결정 제제는 국부 투여에 사용되는 종래의 다양한 데포우(depot) 형태로 사용하여 반응성 국부용 조성물을 제공할 수 있다. 이러한 조성물의 예로는 반고형상 투여 제형과 액상 투여 제형, 예를 들면, 액상 용액 또는 현탁액, 젤, 크림, 유화액, 로션, 슬러리, 분말, 스프레이, 포움, 페이스트, 연고(ointment와 salve), 진정제 및 점적제를 들 수 있다. 또한, 가교된 단백질 결정 제제를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 종래의 모든 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 및 보조제의 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 완충제, 예를 들면 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면 프로타민 설페이트, 인산일수소나트륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘, 트리실리케이트, 셀룰로오스계 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다. 국부 또는 젤 베이스 형태인 경우 부조제의 예로는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 우드 왁스 알콜을 들 수 있다.
대안적으로, 가교된 단백질 결정 제제는 드레싱, 스폰지, 스트립, 플라스터, 밴디지, 패취 또는 글로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 건강 관리 기구 내에 제제화시킬 수 있다.
투여 및 투여량 섭생법의 가장 효과적인 형태는, 소정의 효과, 사전 치료(사전 치료가 있을 경우), 개개인의 건강 상태와 가교된 단백질 결정 제제에 대한 반응 및 치료 의사의 판단에 의해 좌우된다. 가교된 단백질 결정 제제는 단 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 약학적으로 허용 가능한 모든 국부 제형으로 투여할 수 있다.
담체 물질과 배합하여 단일 투여 제형을 제조할 수 있는 가교된 단백질 결정 제제의 양은 국부 투여의 특정한 형태, 제제, 투여 농도 또는 투여 횟수에 따라 다양하게 좌우된다. 전형적인 조제는 가교된 단백질 결정 제제 약 0.1%(w/w) 내지 약 99%(w/w), 바람직하게는 약 1%(w/w) 내지 약 10%(w/w)를 함유한다.
개인의 증상을 개선시키고자 할 경우, 가교된 단백질 결정 제제는 필요하다면 투여량을 지속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 투여시 투여량과 투여 횟수 또는 둘 다는 증상의 함수로서 개선된 증상이 나타날 때 줄일 수 있다. 증상이 완화되어 소정의 수준에 도달할 때, 치료는 중단해야 한다. 그러나, 개인은 어떠한 증상의 재발에 대해 장기간 동안 간헐적인 치료가 필요할 수 있다.
본 발명에 있어서, 가교된 단백질 결정 제제의 조제는, 본 발명에 참고 인용하고 있는 PCT 특허 출원 WO92/02617호에 개시되어 있는 바와 같이, 단백질을 결정화시키는 단계 및 단백질을 가교시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 가교된 단백질 결정 제제는 가교된 효소 결정 제제에 대해 하기에서 예시하고 있는 바와 같이 제조하였다.
가교된 효소 결정 제제의 제조-효소 결정화시키는 단계
효소 결정은 수용액 또는 수용액 함유 유기 용매로부터 효소의 조절된 침전에 의해 성장한다. 조절해야 할 조건은, 예를 들면 용매의 증발 속도, 적절한 보조 용질과 완충제의 존재, pH 및 온도를 포함한다. 단백질의 결정화에 영향을 미치는 다양한 인자의 포괄적인 개설서가 문헌[맥퍼슨, Methods Enzymol., 114, pp. 112-20(1985)]으로 발행되어 있다.
문헌[맥퍼슨 및 길릴랜드, J. Crystal Growth, 90, pp. 51-59(1988)]에는 결정화되는 단백질 및 핵산의 포괄적인 목록 뿐만 아니라 이들이 결정화되는 조건이 개시되어 있다. 결정 및 결정화 방법에 관한 요약 뿐만 아니라 용해된 단백질 및 핵산 결정 구조의 배위물에 대한 개요는 브룩해븐(Brookhaven) 국립 시험 연구소의 프로테인 데이타 뱅크에 의한 것이다[베른스테인 등, J. Mol. Biol., 112, pp. 535-42(1977)]. 이들 참고 문헌은, 적절하게 가교된 효소 결정의 형성에 대한 예비서로서, 미리 결정화된 효소를 결정화시키기 위한 필요 조건을 결정하는데 이용할 수 있고, 기타 효소에 대한 결정화 방법의 기준이 될 수 있다. 대안적으로, 합리적인 시행 착오 연구 방법은, 효소에 대한 허용 가능한 순도를 달성할 수 있다는 점에서, 대부분의 경우 많은 효소에 대한 적합한 결정화 조건을 제시할 수 있다: 예를 들면, 참고 문헌[씨.더블유. 카터, 주니어 및 씨.더블유. 카터, J. Biol. Chem., 254, pp. 12219-23(1979)].
결정화시켜 본 발명에 따른 제제의 가교된 효소 결정 성분을 형성시킬 수 있는 효소로는 가수분해 효소, 이성질화 효소, 리아제, 리가제, 전이 효소 및 산화 환원 효소를 들 수 있다. 가수분해 효소의 예로는 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제, 에스테라제, 리파제, 니트릴아제, 히단토인아제, 아스파라기나제, 우레아제, 서브틸리신 및 기타 프로테아제 및 리소자임을 들 수 있다. 리아제의 예로는 알돌리아제 및 히드록시니트릴 리아제를 들 수 있다. 산화 환원 효소의 예로는 글루코스 산화 효소, 알콜 탈수소 효소 및 기타 탈수소 효소를 들 수 있다.
X선 회절 분석에 요구되는 큰 단일 결정은 본 발명에 따른 가교된 효소 결정 제제에 사용할 필요가 없다. 미정질 형태가 바람직하다.
일반적으로, 결정은 결정화시키고자 하는 효소를 적절한 수성 용매 또는 적절한 침전제, 예를 들면 염 또는 유기물을 함유하는 수성 용매와 배합시킴으로써 제조한다. 용매는 실험적으로 결정된 온도에서 단백질과 배합하여 적절하게 결정화를 유도하고, 효소의 활성 및 안정성을 유지할 수 있다. 용매는 임의로 2가 양이온과 같은 보조 용질, 보조 인자 또는 차오트로프(chaotrope) 뿐만 아니라 pH를 조정하기 위한 완충제 화학종을 포함할 수 있다. 보조 용질 및 이 용질의 농도는 실험적으로 결정하여 결정화를 용이하게 할 필요가 있다. 공업적 규모의 공정에 있어서, 결정화를 유도하는 조절된 침전은 회분식 공정으로 단백질, 침전제, 보조 용질 및 임의로 완충제의 단순 배합에 의해 가장 잘 수행할 수 있다. 대안적으로 실험실상의 결정화 방법, 예를 들면 투석법 또는 증기 확산법을 채택하여 사용할 수 있다. 앞서 언급한 맥퍼슨 및 길릴랜드 문헌은 결정화에 관한 문헌의 개관에서 적합한 조건의 포괄적인 항목들을 게재하고 있다. 경우에 따라서, 가교제와 결정화 매질 간의 비상용성은 결정을 보다 적합한 용매 시스템으로 변화시키는데 필요하다.
전술한 결정화 조건에 대해 수많은 효소가 공업적 및 실험적 화학 공정에서 실질적인 촉매로서 상당한 가능성을 가지고 있기 때문에, 본 발명에 따른 가교된 효소 결정 제제를 제조하는데 사용할 수 있다. 그러나, 대부분의 상기 인용한 참고 문헌상에 기재된 조건은 대부분의 경우에 있어서 약간 큰 회절 특성의 결정을 생성할 수 있도록 최적화시킨 것이라는 점에 유의해야 한다. 따라서, 당업자들은 가교된 효소 결정을 제조하는데 사용되는 보다 작은 결정을 대규모로 생산하는 생산율이 높은 공정을 제공하도록 그러한 조건들을 어느 정도 조정하는 것이 필요할 수 있다.
가교된 효소 결정 제제의 제조-효소 결정을 가교시키는 단계.
일단 효소 결정이 적합한 매질에서 성장되면, 그 효소 결정은 가교시킬 수 있다. 가교시키는 단계는 결정의 성분인 효소 분자간의 공유 결합을 유도함으로써 결정 격자의 안정화를 형성시킨다. 이것은 효소를 다른 대체적인 반응 환경으로 전달시키는 데, 그렇지 않을 경우에 반응 환경은 결정 격자의 존재 또는 천연 단백질의 존재에 대해서는 부적합할 수 있다. 가교시키는 단계는 2작용기 시약을 비롯한 광범위하게 다양한 다작용기 시약에 의해 달성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 의하면, 가교제는 글루타르알데히드이다. 기타 이용 가능한 가교제의 대표적인 목록은, 예를 들면 참고 카탈로그(피어스 케미컬 컴파니의 카탈로그, 1990)에 기재되어 있다.
글루타르알데히드와 가교시키면 주로 결정 격자 내의 리신 아미노산 잔류물끼리 그리고 결정 격자 내의 효소 분자끼리 강한 공유 결합을 형성한다. 가교 상호 반응은 결정에서 구성 효소 분자가 다시 용액 속으로 들어 가는 않게 하여, 효과적으로 효소 분자를 미정질 미립자(길이는 평균적으로 10-1mm 이하 또는 동일한 것이 바람직함)내로 불용성화 또는 고정화시킨다.
가교된 효소 결정 제제의 제조-가교된 효소 결정을 계면 활성제에 노출시키는 단계
전술한 바와 같이, 가교된 효소 결정은 유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 계면 활성제와 접촉하는 반응으로 효소 결정 제제를 제조하는 데 사용할 수 있다. 가교된 효소 결정을 계면 활성제에 노출시킨 후, 유기 용매의 존재 하에서 건조시켜 형성시킨 가교된 효소 결정 제제는 유기 용매 및 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 특히 활성적이고 안정적이다. 이하 가교된 효소 결정 제제 및 이들 제제의 제조에 대한 상세한 설명은 가교된 단백질 제제에 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 가교된 효소 결정 제제를 제조하는데 유용한 계면 활성제로는 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제 또는 양쪽성 계면 활성제 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 바람직한 계면 활성제는 가교된 효소 결정 제제를 제조하는데 사용하고자 하는 가교된 효소 결정의 특정한 효소 성분에 따라 좌우된다. 이것은 특정한 효소에 의해 촉매 활성화된 반응을 기본으로 하는 일반적인 검색 절차를 수행함으로써 결정할 수 있다. 이러한 검색 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 검색 절차는 실시예 6 내지 실시예 8에 설명되어 있다.
유용한 양이온성 계면 활성제의 예로는 아민, 아민 염, 술포늄, 포스포늄 및 4급 암모늄 화합물을 들 수 있다. 이러한 양이온성 계면 활성제의 특정한 예로는 메틸 트리옥틸암모늄 클로라이드(Aliquate 336)와 N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탤로우(tallow)-1,3-디아미노프로판(EDT-20', PEG-10 탤로우)을 들 수 있다.
유용한 음이온성 계면 활성제의 예로는 선형 알킬벤젠 술포네이트, 알파-올레핀 술포네이트, 알킬 술페이트, 알콜 에톡시 술페이트, 카르복실산, 황산 에스테르 및 알칸 술폰산을 들 수 있다. 이러한 음이온성 계면 활성제의 특정한 예로는 트리톤 QS-30(Anionic), 에로졸 22, 디옥틸 술포숙시네이트(AOT), 알킬 나트륨 술페이트(Niaproof): 유형-4와 유형-8 및 알킬(C9∼C13) 나트륨 술페이트(TEEPOL HB7)을 들 수 있다.
안정화에 유용한 비이온성 계면 활성제는 노닐 페놀 에톡실레이트, 알콜 에톡실레이트, 소르비탄 트리올레이트, 비이온성 블록 공중합체 계면 활성제, 폴리에틸렌 옥사이드 또는 페놀 알콜 또는 지방산의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제의 예로는 폴리옥시에틸렌 에테르: 4 라우릴 에테르(Brij 30)와 23 라우릴 에테르(Brij 35); 옥틸 페녹시 폴리에톡시에탄올(Tritons): Tx-15, Tx-100, Tx-114, Tx-405, DF-16, N-57, DF-12, CF-10 및 CF-54; 폴리에틸렌소르비탄: 모노라우레이트(Tween 20); 소르비탄: 세스퀴올레이트(Arlacel 83)과 트리올레이트(Span 85); 폴리글리콜 에테르(Tergitol): 유형 NP-4, 유형 NP-9, 유형 NP-35, 유형 TMN-10, 유형 15-S-3, 유형 TMN-6(2,6,8, 트리메틸-4-노닐옥시폴리에틸렌옥시에탄올) 및 유형 15-S-40을 들 수 있다.
일반적으로, 가교된 효소 결정 제제를 제조하기 위해, 계면 활성제는 계면 활성제가 가교된 효소 결정과 평형을 이루고/이루거나 가교된 효소 결정을 침투할 수 있도록 충분한 양으로 가교된 효소 결정 함유 용액에 첨가해야 한다. 이러한 양은 가교된 효소 결정 대 계면 활성제의 중량비가 약 1:1 내지 약 1:5, 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1:2로 제공되는 양이다. 가교된 효소 결정은 약 5 분 내지 약 24 시간 동안, 바람직하게는 약 30 분 내지 약 24 시간 동안 계면 활성제와 접촉시킨다. 이러한 접촉을 수행한 후, 가교된 효소 결정/계면 활성제 배합물을 유기 용매의 존재하에서 건조시켜 가교된 효소 결정 제제를 형성시킬 수 있다.
유기 용매 및 건조 시간의 선택은 가교된 효소 결정 제제를 제조하는데 사용되는 특정한 가교된 효소 결정 및 특정한 계면 활성제에 따라 좌우된다. 그럼에도 불구하고, 용매 및 건조 시간은 제제로 하여금 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 최대 활성 및 안정성을 갖도록 하는 수분 함량에 의해 특징 지워지는 가교된 효소 결정 제제를 제공할 수 있는 것들이어야 한다. 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 건조 시간은 약 5분 내지 약 24 시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 약 24 시간일 수 있다. 건조 단계에서 사용되는 유기 용매는 전체 혼합물의 약 10 중량% 내지 약 90 중량%, 바람직하게는 전체 혼합물의 약 40 중량%내지 약 80 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
대안적으로, 가교된 효소 결정/계면 활성제 배합물은 유기 용매의 존재하에서 동결 건조시킬 수 있다. 동결 건조는 약 30 분 내지 약 18 시간 동안 수행할 수 있다.
형성된 가교된 효소 결정 제제는 최종 제제의 중량을 기준으로 하여 계면 활성제 약 10 중량% 내지 약 70 중량%, 바람직하게는 약 25 중량% 내지 약 45 중량%를 포함하여야 한다.
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하려고 한 것이 아니다.
실시예
실시예 1-가교된 LPS 결정 제제의 제조
미정제 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 리파제(PS 30 리파제-Amano)("LPS") 15 kg의 슬러리를 증류된 탈이온수 100 L에 용해시키고, 증류된 탈이온수를 더 첨가하여 부피를 200 L로 만들었다. 현탁액을 공기 추진력 광속 혼합기(Air Drive Lightning mixer)에서 실온 하에 2 시간 동안 혼합시키고, 이어서 0.5 μ 필터에 여과시켜 셀라이트를 제거하였다. 이어서, 혼합물을 한외 여과시키고, 3k 중공 섬유 필터막 카트리지를 사용하여 10 L(121.4 g)로 농축시켰다. 고체 아세트산 칼슘을 20 mM Ca(CH3COO)2의 농도로 첨가하였다. 필요한 경우, 진한 아세트산을 첨가하여 pH를 5.5로 조정하였다. 혼합물을 가열하여 온도 30℃로 유지하였다. 황산 마그네슘을 0.2 M 농도로 첨가하고, 이어서 글루코폰(glucopon)을 1% 농도로 첨가하였다.
이어서, 마지막으로 이소프로판올을 23%의 농도로 첨가하였다. 형성된 용액을 30℃에서 30 분 동안 가열한 후, 2 시간에 걸쳐 30℃에서 20℃로 냉각시켰다. 이어서, 결정화를 16 시간 동안 진행시켰다.
결정을 침전시키고, 말단에 10 ml 피펫을 갖는 티곤 튜빙(tygon tubing)을 구비한 연동식 펌프를 사용하여 가용성 단백질을 제거하였다. 또한, 갓 분리한 결정화 용액(23% 이소프로필 알콜, 0.2 M MgSO4, 1% 글루코폰, 20 mM Ca(CH3COO)2, pH 5.5)은 단백질의 농도를 30 mg/ml(파장 280에서 측정한 용액 1 mg/ml의 O.D. = 1.0, 파장 280에서 분광 기기를 사용하여 측정하였음)로 만들었다. 결정 생성량은 약 120 g이었다. 이어서, 결정 용액을 다음과 같이 가교시켰다.
50% 글루타르알데히드의 1 부피를 0.1 M 트리스 4 부피와 혼합하여 가교제의 2 리터 분취량(aliquot)을 제조하였다. 이어서, 효소 1g 당 가교제 13.5 ml을 사용하여 가교시켰다. 보다 구체적으로, 가교제의 분취량 0.4 ml를 전체 첨가 시간 2 시간에 걸쳐 효소 슬러리 1 ml(30 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 8 시간 동안 계속 가교시켰다. 완충제(10 mM 트리스, 10 mM CaCl2, pH 7.0)의 대략 1.5 결정 슬러리 부피로 필터 프레스 내의 가교된 결정을 충분히 세척함으로써 가교 반응을 중단시켰다.
상기 제조한 가교된 LPS 효소 결정의 분취량 30 mg을 보관 완충제(10 mM 트리스, 10 mM CaCl2, pH 7.0)에 현탁시키고, 이 혼합물을 실온에서 소결된(sintered) 유리 깔대기(약 10 μ 내지 20 μ의 다공성을 지님)에 부어 넣었다. 효소 결정을 계면 활성제 EDT-20', EPG-10 탤로우 아미노프로필아민에 하기 설명한 바와 같이 노출시켰다. 이러한 계면 활성제는 후술된 실시예 6에서 설명하고 있는 검색 방법에 의해 선택하였다.
완충된 상기 가교된 LPS 결정을 소결된 유리 깔대기(상기 언급한 바와 같음)에 여과시키고, 효소 결정을 습윤 상태로 공정 전반에 걸쳐 유지시켰다. 상기 깔대기 내의 가교된 효소 결정의 높이가 60 ml인 것으로 측정되었다. 계면 활성제 N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탤로우-1,3-디아미노프로판(EDT-20', PEG-10 탤로우)을 용매 2-부탄온과 함께 계면 활성제:가교된 효소 결정의 비율이 1:1(계면 활성제 30 g: LPS 30 g = 30 ml)이 되도록 첨가하였다. 이것은 전체 60 ml인 2-부탄온 30 ml와 계면 활성제 30 ml의 혼합물을 가교된 효소 결정의 정상부에 쏟아 부음으로써 수행하였다. 완만하게 흡인(suction)을 수행함으로써, 가교된 효소 결정을 계면 활성제로 코팅하여 케이크상의 효소가 건조되지 않도록 하였다. 실온에서 30 분이 경과한 후, 혼합물을 기류하에 건조 용기(프릿화된 압력 필터 깔대기)에 이송하여, 칼 피셔(Karl Fisher) 적정법에 의해 측정하였을 때, 수분 함량이 약 1% 내지 3%가 되게 하였다.
또한, 본 발명에 따른 LPS 가교된 결정 제제는 상품명 치로클렉(ChiroCLEC)-PC[메사추세츠주 캠브리지 소재의 알투스 바이올로직스로부터 구입함)로 시판중인 가교된 LPS 결정 고체를 사용하여 제조할 수도 있다.
실시예 2-가교된 CRL 결정 제제의 제조
분말 형태의 캔디다 루고사(Candida rugosa) 리파제("CRL")(Amano) 분취량 5 kg을 셀라이트 5 kg과 혼합시키고, 증류된 탈이온수 102 L에 용해시킨 다음, 증류된 탈이온수를 더 첨가하여 부피를 200 L로 만들었다. 현탁액을 공기 추진력 광속 혼합기에서 실온 하에 2 시간 동안 혼합시키고, 이어서 0.5 μ 필터에 여과시켜 셀라이트를 제거하였다. 이어서, 혼합물을 한외 여과시키고, 3k 중공 섬유 필터막 카트리지를 사용하여 14 L(469 g)로 농축시켰다. 고체 칼슘 아세테이트를 5 mM Ca(CH3COO)2의 농도로 첨가하였다. 필요한 경우, 진한 아세트산을 첨가하여 pH를 4.8로 조정하였다. 혼합물을 가열하여 온도 25℃로 유지하였다. (100%) 2-메틸-2,4-펜탄디올 "MPD"의 분취량 3.5 L와 결정 시이드(단백질 0.5 g)을 첨가하였다. 형성된 용액을 밤새 동안 교반하였다. 이어서, 결정화를 밤새동안 계속하여 약 17 시간 내지 20 시간 동안 진행시켰다.
결정을 침전시키고, 말단에 10 ml 피펫을 갖는 티곤 튜빙을 구비한 연동식 펌프를 사용하여 가용성 단백질을 제거하였다. 또한, 갓 분리한 결정화 용액(20% MPD, 5 mM Ca(CH3COO)2, pH 4.8)은 단백질의 농도를 35 mg/ml(파장 280에서용액 1 mg/ml의 O.D. = 1.0)로 만들었다. 결정 생성량은 약 217 g이었다. 이어서, 결정 용액을 다음과 같이 가교시켰다.
50% 글루타르알데히드의 1 부피를 0.3 M 붕산 나트륨 완충제(pH 9.0) 1 부피와 혼합하고, 이 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 가열함으로써 가교제를 제조하였다. 이어서, 상기 혼합물을 방치하여 실온까지 냉각시키고, 필요한 경우 HCl를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이어서, 효소 1g 당 가교제 3.885 ml(1.949 g)을 사용하여 가교시켰다. 보다 구체적으로, 가교제의 분취량 1686 ml를 전체 첨가 시간 2 시간에 걸쳐 가교제를 서서히 펌핑함으로써 효소 슬러리 217 g에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 방치하여 16 시간 동안 더 가교시켰다. 처음에 물 30 L로 그리고 나중에 2 M 염화나트륨과 완충제(10 mM 트리스, 10 mM CaCl2, pH 7.0)로 1 μ 필터를 구비한 뷔너(Buchner) 깔대기 내의 가교된 결정을 충분히 세척함으로써 가교 반응을 중단시켰다.
상기 제조한 가교된 CRL 효소 결정의 분취량 6 g을 보관 완충제(10 mM 트리스, 10 mM CaCl2, pH 7.0) 100 ml에 현탁시키고, 이 혼합물을 실온에서 소결된유리 깔대기(약 10 μ 내지 20 μ의 다공성을 지님)에 부어 넣었다. 이어서, 완충제를 효소로부터 제거하였다. 효소 결정을 계면 활성제 테르지톨 유형 TMN-6에 하기 설명한 바와 같이 노출시켰다. 이러한 계면 활성제는 후술된 실시예 8에서 설명하고 있는 검색 방법에 의해 선택하였다.
완충된 상기 가교된 CRL 결정을 소결된 유리 깔대기(상기 언급한 바와 같음)에 여과시키고, 효소 결정을 습윤 상태로 공정 전반에 걸쳐 유지시켰다. 상기 깔대기 내의 가교된 효소 결정의 높이가 34 ml인 것으로 측정되었다. 계면 활성제를 용매 2-부탄온과 함께 계면 활성제:가교된 효소 결정의 비율이 1:1(CRL 6 g: 계면 활성제 6 g = 5.7 ml)이 되도록 첨가하였다. 이것은 전체 34 ml인 2-부탄온 28.3 ml와 계면 활성제 5.7 ml의 혼합물을 가교된 효소 결정의 정상부에 쏟아 부음으로써 수행하였다. 완만한 흡인을 수행함으로써, 가교된 효소 결정을 계면 활성제로 코팅하여 케이크상의 효소가 건조되지 않도록 하였다. 실온에서 30 분이 경과한 후, 혼합물을 기류하에 건조 용기(프릿화된 압력 필터 깔대기)에 이송하여, 칼 피셔 적정법에 의해 측정하였을 때, 수분 함량이 약 7% 내지 13%가 되게 하였다.
또한, 본 발명에 따른 CRL 가교된 결정 제제는 상품명 치로클렉(ChiroCLEC)-CR[메사추세츠주 캠브리지 소재의 알투스 바이올로직스로부터 구입함)로 시판중인 가교된 CRL 결정 고체를 사용하여 제조할 수 있다.
실시예 3-가교된 ABL 결정 제제의 제조
바실루스 리체니포르미스 서브틸리신 A(Bacillus licheniformis subtilisin A)("ABL")(Alcalase)의 슬러리 30 kg 또는 25 L의 슬러리를 공기 추진력 광속 혼합기에서 15% Na2SO450 L와 혼합시켰다. 결정 시이드(단백질 0.27 g)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 온도 30℃에서 유지시켰다. 이어서, 3일 내지 4일 동안 결정화를 계속 진행시켰다. 1μ 필터를 구비한 뷔너 깔대기를 사용하여 모 액체를 제거하였다.
결정을 15% Na2SO4(pH 5.5) 50 L로 세척한 후, 15% Na2SO4(pH 5.5) 40 L에 현탁시켰다. 결정 생성량은 약 1069 g이었다. 이어서, 결정 용액을 다음과 같이 가교시켰다.
효소 1 g 당 가교제인 50% 글루타르알데히드 1.68 ml을 사용하여 가교시켰다. 보다 구체적으로, 가교제의 분취량 1796 ml를 전체 첨가 시간 30 분 내지 1시간에 걸쳐 효소 1069 g에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 혼합시키고, 4시간 동안 계속 pH를 5.5로 유지하였다. 세척의 수행율이 2 ms/cm이 될 때까지 물로 필터 프레스 내의 가교된 결정을 충분하게 세척함으로써 가교 반응을 중단시켰다.
상기 제조한 가교된 ABL 효소 결정의 분취량 20 g을 보관 완충제(0.1 NaAc, 20 mM CaCl2, pH 5.7) 100 ml에 현탁시키고, 이 혼합물을 실온에서 소결된유리 깔대기(약 10 μ 내지 20 μ의 다공성을 지님)에 부어 넣었다. 효소 결정을 계면 활성제 테르지톨 유형 15-S-3에 하기 설명한 바와 같이 노출시켰다. 이러한 계면 활성제는 후술된 실시예 7에서 설명하고 있는 검색 방법에 의해 선택하였다.
완충된 상기 가교된 ABL 결정을 소결된 유리 깔대기(상기 언급한 바와 같음)에 여과시키고, 효소 결정을 습윤 상태로 공정 전반에 걸쳐 유지시켰다. 상기 깔대기 내의 가교된 효소 결정의 높이가 50 ml인 것으로 측정되었다. 계면 활성제를 용매 이소프로판올과 함께 계면 활성제:가교된 효소 결정의 비율이 1:1.5(ABL 30 g: 계면 활성제 30 ml = 50 ml)가 되도록 첨가하였다. 이것은 전체 50 ml인 이소프로판올 20 ml와 계면 활성제 30 ml의 혼합물을 가교된 효소 결정의 정상부에 쏟아 부음으로써 수행하였다. 완만한 흡인을 수행함으로써, 가교된 효소 결정을 계면 활성제로 코팅하여 케이크상의 효소가 건조되지 않도록 하였다. 실온에서 30 분이 경과한 후, 혼합물을 기류하에 건조 용기(프릿화된 압력 필터 깔대기)에 이송하여, 칼 피셔 적정법에 의해 측정하였을 때, 수분 함량이 약 1% 내지 4%가 되게 하였다.
대안적으로, ABL 가교된 효소 결정의 습윤 상태의 케이크 15 g을 계면 활성제 20 g 및 이소프로판올 30 ml와 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 30분 동안 배양하였다. 이어서, 용매와 계면 활성제를 흡인에 의해 전술한 바와 같이 제거하였다. 이어서, 습윤 상태의 가교된 효소 결정을 동결 건조 용기에 이송시키고, 드라이 아이스 중의 아세톤에서 30분 동안 동결시켰다. 이어서, 동결 건조 용기를 동결 건조기에 이송하여 30분 동안 방치하였다.
전술한 바와 같이 제조한 동결 건조된 가교된 효소 결정 제제를 유기 용매 중에서 사용하기 전에 실온 또는 4℃에서 보관할 수 있다. 동결 건조된 효소 결정 제제를 실온에서 보관할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 ABL 가교된 결정 제제는 상품명 치로클렉(ChiroCLEC)-BL[메사추세츠주 캠브리지 소재의 알투스 바이올로직스로부터 구입함)로 시판중인 가교된 ABL 결정 고체를 사용하여 제조할 수도 있다.
실시예 4-유기 용매 중에서의 가교된 효소 결정 제제의 활성
알콜, 산 및 아민의 분해(resoution)에 있어서 전술한 바와 같이 제조한 가교된 효소 결정 제제 또는 미정제 효소 제제의 활성을 하기 표 1에 기재하였다. 효소 활성을 HPLC 및 가스 크로마토그래피("GC")에 의해 시험 분석하였다. 표 1의 데이타를 생성시키는 구체적인 분해 방법은 다음과 같이 수행하였다.
에스테르 교환반응에 의한 (+/-) 멘톨의 분해
7.5 ㎕(0.15%) H2O을 포함하는 톨루엔 1 ml 중의 (+/-) 멘톨(449 mM)의 용액을 실시예 2에서 제조한 가교된 CRL 결정 제제와 혼합하여 5 분 동안 교반하여 미세한 현탁액을 얻었다. 비닐 아세테이트(449 mM)를 첨가하고, 형성된 현탁액을 25℃에서 4 시간 동안 교반하였는데, 이때 모세관(capillary) 가스 크로마토그래피("GC") 분석에 의하면 전환율이 15%이었다. GC 조건을 다음과 같이 하였다: DB1701 15 m × 0.25 mm GC 칼럼, 25 mm 필름 두께(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언티픽의 제품); 헬륨 유속 = 25 cm/sec; 온도 프로그램: 초기 = 1분 동안 119℃, 구배1= 130℃까지 5℃/분 그리고 이 온도에서 0.3 분, 구배2= 175℃까지 70℃/분 그리고 이 온도에서 1.86 분; 체류 시간: 2.85 분[(+) 멘톨] 및 4.77 분[에스테르]. 반응을 촉매의 흡인 여과에 의해 정지시켰다. 생성물 에스테르의 광학 순도를 GC 분석에 의해 측정한 결과 99.4% 거울상 이성질체 과량("ee")을 나타내었다.
키랄성 GC 조건은 다음과 같이 하였다: 사이클로덱스(Cyclodex) B 25 m 모세관 GC 칼럼, 25 mm i.d.(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언틱픽의 제품); N2유속 = 1 ml/분; 온도 프로그램: 초기 = 5 분 동안 90℃, 구배 = 1℃/분, 최종 = 10 분 동안 115℃; 체류 시간: 24.90 분[(+) 멘톨], 25.40 분[(-) 멘톨], 35.97 분[(-) 에스테르] 및 36.11 분[(+) 에스테르].
n-아밀 알콜을 사용한 이부프로펜(Ibuprofen)의 에스테르화 반응
(R,S)-이부프로펜(97 mM)을 이소옥탄 1 ml에 용해시켰다. 이 용액에 n-아밀 알콜 460 ml와 실시예 2에서 제조한 가교된 CRL 결정 제제 1 mg을 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 교반하고, n-아밀 이부프로펜의 생성물을 HPLC에 의해 처리하였다. 24 시간이 경과한 후, 전환율은 28%에 도달하였다.
키랄성 HPLC 조건을 다음과 같이 하였다: 산: (R,R) 웰크(Whelk)-O1(일리노이주 모톤 그로브 소재의 레지스 테크놀로지스의 제품) 5 mm, 100 Å, 25 cm 칼럼; 이동상=헥산 0.5% 아세트산; 30 분에 걸쳐 아세트산이 없는 헥산을 산성화된 헥산으로 대체하였다(동일한 속도로); 헬륨 유속 = 1 ml/분; UV 검출은 254 nm에서 수행함; 체류 시간: 에스테르인 경우 16.7 분과 19.2 분, 산인 경우 21.8 분과 28.1분.
에스테르화 반응에 의한 (R,S)-2-히드록시헥산온산의 분해
n-BuOH(1069 mM)을 함유하는 톨루엔 1 ml 중의 (R,S) 2-히드록시헥산온산(532 mM)의 용액에 실시예 2에서 제조한 가교된 CRL 결정 제제 10 mg을 첨가하였다. 형성된 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 자기적으로 교반하였는데, 이 때 모세관 GC 분석에 의하면 전환율이 45%이었다. GC 조건을 다음과 같이 하였다: DB1701 15 m × 0.25 mm GC 칼럼, 25 mm 필름 두께(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언티픽의 제품); 헬륨 유속 = 25 cm/sec; 온도 프로그램: 초기 = 5 분 동안 110℃, 구배 = 200℃까지 20℃/분; 샘플 제조: 헥산 1 ml 중의 반응 혼합물 10 ㎕을 헥산 중의 MeOH 100 ㎕ 및 TMS-디아조메탄-2M 100 ㎕와 혼합하여 제조함; 체류 시간: 2.12 분[메틸 에스테르] 및 6.46 분[부틸 에스테르]. 반응을 촉매의 흡인 여과에 의해 정지시켰다. 생성물 부틸 에스테르와 산(이 산의 메틸 에스테르)의 광학 순도를 키랄성 GC 분석에 의해 측정하였다.
키랄성 GC 조건은 다음과 같이 하였다: 사이클로덱스(Cyclodex) B 25 m 모세관 GC 칼럼, 25 mm i.d.(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언틱픽의 제품); N2유속 = 1 ml/분; 온도 프로그램: 초기 = 30 분 동안 80℃, 구배 = 5℃/분, 최종 = 10 분 동안 170℃; 체류 시간: 27.80 분[R-메틸 에스테르], 31.03 분[S-메틸 에스테르], 44.30 분[R-부틸 에스테르] 및 44.50 분[S-부틸 에스테르].
에스테르교환 반응에 의한 펜에틸 알콜의 분해
톨루엔 1 ml 중의 펜에틸 알콜 200 mM와 비닐 아세테이트 200 mM의 용액에 실시예 1에서 제조한 가교된 효소 결정 제제 1.2 mg을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 촉매를 원심 분리에 의해 제거하여 반응을 중단시켰다. 전환율과 광학 순도를 키랄성 GC에 의해 측정하였다.
키랄성 GC 조건은 다음과 같이 하였다: 사이클로덱스 모세관 GC 25 m 칼럼, 25 mm i.d.(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언틱픽의 제품); N2유속 = 1 ml/분; 온도 프로그램: 초기 = 4 분 동안 100℃, 구배 = 135℃까지 5℃/분 그리고 135℃에서 2 분, 144℃까지 2℃/분 그리고 144℃에서 5 분, 150℃까지 5℃/분 그리고 150℃에서 2 분; 체류 시간: 12.08 분[(S)-에스테르], 12.47 분[(R)-에스테르], 12.25 분[(R)-알콜] 및 12.55 분[(S)-알콜]. 전환율은 41.7%이었으며, 이 전환율에서의 생성물 및 기질의 ee는 E 값 297에 대하여 각각 98.5%와 70.42%이었다. E 값은 문헌[씨.에스. 첸 등, J. Am. Chem. Soc., 104, pp. 7294-99(1992)]에 의해 계산하였다. 억제에 의해 영향을 받거나 미정제 효소에 의해 촉매 활성화되는 반응에 대해 E의 적용성을 결정하는 경우에는, 문헌[제이.제이. 랄론드 등, J. Am. Chem., Soc., 117, pp. 6845-52(1995)]을 참조하여였다.
(±)-술카톨(Sucathol)의 분해
톨루엔 1 ml 중의 (±)-술카톨 80 mM와 비닐 아세테이트 120 mM의 용액에 실시에 1에서 제조한 가교된 LPS 결정 제제 4 mg을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 이어서, 촉매를 여과에 의해 제거하였다. 생성물 및 잔류 출발 물질의 광학 순도를 키랄상 GC 칼럼을 사용한 GC에 의해 직접 분석하였다. 잔류 출발 물질 및 생성물 알콜의 ee는 각각 98% 이상과 51.3% 이었다.
키랄성 GC 조건은 다음과 같이 하였다: 사이클로덱스 B 모세관 GC 25 m 칼럼, 25 mm i.d.(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언틱픽의 제품); N2유속 = 1 ml/분; 온도 프로그램: 초기 = 10 분 동안 90℃, 구배 = 5℃/분, 최종 = 20 분 동안 130℃; 체류 시간: 12.50 분[(S)-술카톨], 14.43 분[(R)-술카톨], 12.32 분[(S)-술카톨 아세테이트] 및 15.12 분[(R)-술카톨 아세테이트]. 전환율은 66.1%이었다. 계산한 결과 E 값은 27이었다.
(±)-2-옥탄올의 분해
톨루엔 1 ml 중의 (±)-2-옥탄올 80 mM와 비닐 아세테이트 120 mM의 용액에 실시예 1에서 제조한 가교된 LPS 결정 제제 4 mg을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 이어서, 촉매를 여과에 의해 제거하였다. 아세테이트 생성물의 광학 순도를 키랄상 GC 칼럼을 사용한 GC에 의해 직접 분석하였다. 측정한 결과, ee는 63.0%이었다. 잔류 알콜은 피리딘 중의 부티르산 무수물과 반응시켜 상응하는 부티레이트로 전환시켰다. 이어서, 부티레이트 유도체의 광학 순도를 GC에 의해 분석하였다. 그 ee는 83.7%이었다.
키랄성 GC 조건은 다음과 같이 하였다: 사이클로덱스 B 모세관 GC 25 m 칼럼, 25 ㎛ i.d.(캘리포니아주 폴솜 소재의 제이 & 더블유 사이언틱픽의 제품); N2유속 = 1 ml/분; 온도 프로그램: 초기 = 10 분 동안 90℃, 구배 = 2℃/분, 최종 = 20 분 동안 130℃; 체류 시간: 15.66 분[(S)-2-옥탄올 아세테이트], 16.93 분[(R)-2-옥탄올 아세테이트], 26.49 분[(S)-옥탄올 부티레이트] 및 26.95 분[(R)-2-옥탄올 부티레이트]. 전환율은 57.1%이었다. 계산한 결과 E 값은 9.8이었다.
트립타민(Tryptamine)의 분해
tert-부탄올 1 ml 중의 트립타민 200 mM와 2,2,2-트리플루오로에틸 부타노에이트 400 mM의 용액을 실시예 3에서 제조한 가교된 ABL 결정 제제 16 mg과 함께 40℃의 회전식 진탕기에서 배양하였다. 소정의 전환율에 도달하였을 때, 촉매를 원심 분리에 의해 제거하고, 에틸 아세테이트를 사용하여 세척하였다. 배합된 유기 혼합물을 진공하에 증발시켜 잔류물을 생성시킨 후, 이 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 잔류 트립타민 및 부틸 아미드 생성물을 생성시켰다. 부틸 아미드 생성물의 광학 순도를 키랄성 HPLC에 의해 직접 분석하였다. 잔류 아민은 메틸 클로로포르메이트와 반응시켜 우레탄 유도체로 전환시킨 후, 키랄성 HPLC에 의해 광학 순도를 분석하였다: ee는 20% 전환율에서 94%이었고, R-알파메틸트립타민의 경우 ee는 53% 전환율에서 98% 이상이었다.
키랄성 HPLC 조건은 다음과 같이 하였다: 키라셀(Chiracel) OJ 25 cm 칼럼(펜실베니아주 엑스톤 소재의 키랄 테크놀로지스의 다이셀 케미컬 인코포레이티드의 디비젼으로부터 구입함), 부틸 아미드인 경우; 이동상 = 80% 헥산(0.1% TFA를 지님), 20% 이소프로판올(0.1% TFA를 지님); 헬륨 유속 = 1 ml/분; UV 검출은 254 nm에서 수행함; 체류 시간: 9.3 분[D-부틸 아미드 생성물], 11.2 분[L-부틸 아미드 생성물], 24.8 분[D-우레탄 유도체] 및 27.6 분[L-우레탄 유도체].
전술한 각각의 분해 방법을 하기 표 1 아래의 각주 (b)에 기재된 효소 농도를 사용하여 가교된 효소 결정 제제에 대응하는 미정제 효소 제제를 이용하여 수행하였다.
상기 표 1에서, 속도를 25℃에서 μmol/분 × mg으로 나타내었고, 농도를 괄호 안에 넣어 기재하였다.
상기 표의 제2열에서, "VA"는 비닐 아세테이트를 표기한 것이고, "TFB"는 트리플루오로에틸 부티레이트를 표기한 것이었다. 제3열에서, 미정제 효소 제제의 수분 함량은 각각 CRL인 경우 9.3%이고, LPS인 경우 2.5%이며, 그리고 ABL인 경우 5%이었다.
상기 표 1의 제4열에서, 가교된 효소 결정 제제의 수분 함량은 각각 CRL인 경우 13.3%이고, LPS인 경우 2.3%이며, ABL인 경우 2.5%이었다. 가교된 효소 결정 제제의 최종 제제에 존재하는 계면 활성제의 양은 각각 CRL인 경우 16 (중량/중량)%이고, LPS인 경우 40 (중량/중량)%이며, ABL인 경우 50 (중량/중량)%이었다.
상기 표 1의 제6열에서, 미정제 제제 내의 CRL, LPS 및 ABL의 총 단백질 함량은 각각 10%, 0.7% 및 7%이었다. 미정제 ABL의 단백질 함량은 50 (중량/중량)%이었다.
상기 표 1의 제7열에서, 반응 속도 및 거울상 선택성은 사이클로덱스 B 칼럼, (R,R)웰크-O1(이부프로펜) GC 칼럼 및 키라셀 OJ(메틸트립타민) 칼럼을 사용하여 분석하였다. E 값은 문헌[씨.에스. 첸 등, J. Am. Chem. Soc., 104, pp. 7294-99(1992)]에 따라 계산하였다. 억제에 의해 영향을 받거나 미정제 효소에 의해 활성화되는 반응에 대해 E의 적용성을 결정하는 경우에는, 문헌[제이.제이. 랄론드 등, J. Am. Chem., Soc., 117, pp. 6845-52(1995)]을 참조하였다.
상기 표 1의 제8열에 있어서, Eapp는 전환율이 낮은 생성물의 거울상 이성질체 과량을 기준으로 하여 비가역적인 경우와 같이 계산하였다.
표 1에서 입증한 바와 같이, 3개의 상이한 효소(2개의 리파제와 1개의 서브틸리신)의 가교된 효소 결정 제제 및 이것의 미정제 효소 제제는 유기 용매의 존재하에서 현저할 정도로 상이한 활성 차이를 나타내었다. 가교된 효소 결정 제제는 중량을 기준으로 하여 미정제 효소 제제보다 훨씬 더 활성이 크고(4열과 5열), 모든 반응에 있어서 단백질 1 mg 당 상기 제제의 고유 활성도 마찬가지로 보다 높았다(6열). 따라서, 예를 들면 멘톨 또는 술카톨의 분해에 있어서 동일한 활성을 달성시키기 위해서는 약 300 배 적은 양의 촉매를 사용할 수 있다. CRL 및 ABL의 경우에 있어서, 미정제 효소 제제와 가교된 효소 결정 제제 사이에 활성의 현저한 차이는 수분 함량의 차이에 기여할 수 없었다. 미정제 CRL 및 ABL 제제를 건조시켜 가교된 효소 결정 제제의 수분 함량(CRL인 경우 13.3%와 ABL인 경우 2.5%)과 동일한 수분 함량으로 만들었을 때, 활성은 12% 이하로 차이가 났다.
이것은 정제 리파제가 유기 용매 중에서 불균일한 형태로 매우 큰 활성을 가질 수 있다는 것을 가장 먼저 입증한 것이다. 또한, 가교된 CRL 결정 제제는 상이한 선택성을 지닌 오염 물질을 함유하는 미정제 CRL 제제보다 훨씬 더 큰 거울상 선택성을 나타내었다(표, 1-3행). 이러한 경우, 가교된 효소 결정 제제의 증가된 거울상 선택성은 경쟁하는 가수분해 효소를 제거함으로써 얻어진 것이었다[랄론드 등, J. Am. Chem., Soc., 117, pp. 6845-52(1995)].
가교된 효소 결정 제제를 유기 가용성 리파제 복합체와 비교하여 설명할 수 있다. 펜에틸 알콜(19.5 μmol/분 × mg) 및 술카톨(1.48 μmol/분 × mg)의 분해에 있어서 LPS 가교된 효소 결정의 고유 활성은 동일한 반응에서 가용성 복합체에 의해 달성되는 활성보다 더 크거나 동일하다[지. 오톨리나 등, Biotechnol. Lett., 14, pp. 947-52(1992) 및 오카하타 등, J. Org. Chem., 60, pp. 2240-50(1995)]. 그러나, 이러한 복합체의 용해도는 많은 유기 용매에서 제한되어 있기 때문에, 높은 전체 반응 속도를 달성하기 어렵다. 반대로, 본 발명에 따른 가교된 효소 결정 제제는 불용성이기 때문에 보다 많은 양을 사용하여 분리와 재활용을 용이하게 수행할 수 있었다.
계면 활성제가 본 발명의 가교된 효소 결정 제제의 특징인 활성 강화에 중요한 역할을 하였다(후술하는 실시예 9 참조).
여려 효과들을 종합해 보면, 가교된 효소 결정 형태 내의 정제 리파제의 활성이 극적으로 증가하는 것을 설명할 수 있다. 예를 들면, 양쪽성 계면 활성제의 존재는 미정제 제제에서 상이한 오염 물질, 예를 들면 지질, 셀라이트 및 기타 단백질에 의해 부분적으로 달성될 수 있는 양쪽성 리파제의 수분 함량 및 고유한 형태 구조를 보다 양호하게 유지하는데 도움을 줄 수 있다. 결국, 계면 활성제는 소수성 기질 분자를 강하게 결합되어 있는 물 층에 통과시켜 효소의 결합 부위로 이동시키는 것을 간단히 용이하게 할 수 있다. 가교된 효소 결정 제제 활성에 영향을 미치는 계면 활성제의 효과를 명확하게 설명하기 위해서는 보다 많은 연구가 필요하지만, 상기 효과는 이러한 현상의 실제적 결과에 비추어 보면 명백한 것이다. 즉, 가교된 효소 결정 제제의 높은 고유 활성, 순도 및 안정성으로부터 유기 용매 중에서 높은 촉매 생산율을 얻었다.
실시예 5-효소의 생산율
제조상 규모로 유기 용매 중에서 가교된 효소 결정 제제의 생산율을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 LPS 가교된 효소 결정(고형물 1.3 mg; 단백질 1 mg)에 의해 활성화되는 톨루엔(100 mL) 중의 비닐 아세테이트(50 mmol; 4.3 g)와 sec-펜에틸 알콜(50 mmol; 6.1 g)의 분해 방법을 선택하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였는데, 이때의 전환율은 50%에 도달하였다. 부피 생산율을 30 g/l로 하고, 기질 대 촉매의 비를 4600로 부여할 때, 펜에틸 아세테이트의 분리된 생성량은 4.5 g(98.5% ee)이었다. sec-펜에틸 알콜 100 mmol을 사용할 때, 72 시간이 경과한 후의 생성율은 8000에 도달하였다.
저분자량의 합성 촉매의 높은 생산율은 고분자량 효소보다 더 중요한 이점을 가지고 있다[이.엔. 자콥슨 및 엔.에스. 피네이, Chemistry & Biology, 1, pp. 85-90(1994)]. 본 실시예에서는 가교된 효소 결정 제제가 고분자량이고 효소 반응 매질에 대해 아주 특이하지만, 가장 우수한 합성 촉매와 비교하여도 아주 높은 생산성의 촉매임을 입증하였다.
실시예 6-LPS에 사용하기 위한 계면 활성제의 검색
가교된 LPS 결정의 샘플을 실시예 1과 같이 제조하였다. 각각의 샘플을 상이한 계면 활성제에 노출시킨 후, 실시예 1에서 사용된 유기 용매 존재 하에 건조시켰다. 건조 단계는 계면 활성제와 유기 용매의 부피 1 ml에서 수행하였다. 또한, 가교된 LPS 결정을 실시예 1과 같이 제조하고, 상기와 같이 건조시키면서 계면 활성제에는 노출시키지 않았다. 효소 활성은 펜에틸 알콜의 분해 방법으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 톨루엔 1 ml 중의 sec-펜에틸 알콜 200 mM과 비닐 아세테이트 200 mM을 건조된 가교된 LPS 결정의 샘플 1.2 mg에 첨가하고, 그 일부를 계면 활성제에 노출시키며, 또 다른 그 일부를 계면 활성제에 노출시키지 않았다. 반응을 30 분 동안 진행시킨 후, 전환율(%)을 가스 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
실시예 7-ABL에 사용하기 위한 계면 활성제의 검색
가교된 ABL 결정의 샘플을 실시예 3에서 제조하였다. 각각의 샘플을 상이한 계면 활성제에 노출시킨 후, 실시예 3에서 사용된 동일한 유기 용매의 존재 하에서 건조시켰다. 건조 단계는 계면 활성제와 유기 용매의 부피 1 ml에서 수행하였다. 또한, 가교된 ABL 결정을 실시예 3과 같이 제조하고, 상기와 같이 건조하면서 계면 활성제에는 노출시키지 않았다. 효소 활성은 이소옥탄 중에서N-Ac-PheOMe의 n-프로판올과의 에스테르 교환 반응으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 80% 이소옥탄 중의 N-아세틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르 1 ml(11 mg)과 20% 1-프로판올을 건조된 가교된 ABL 결정의 샘플 1 mg에 첨가하고, 그 일부를 계면 활성제에 노출시키며, 또 다른 그 일부는 계면 활성제에 노출시키지 않았다. 반응을 30 분 동안 진행시킨 후, 전환율(%)을 가스 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 결과를 하기 표 3a 내지 표 3b에 기재하였다.
실시예 8-CRL에 사용하기 위한 계면 활성제의 검색
가교된 CRL 결정의 샘플을 실시예 2와 같이 제조하였다. 각각의 샘플을 상이한 계면 활성제에 노출시킨 후, 실시예 2에서 사용된 동일한 유기 용매의 존재 하에서 건조시켰다. 건조 단계는 계면 활성제와 유기 용매의 부피 1 ml에서 수행하였다. 또한, 가교된 CRL 결정을 실시예 2와 같이 제조하고, 상기와 같이 건조하면서 계면 활성제에는 노출시키지 않았다. 효소 활성은 톨루엔 중에서 n-아밀 알콜의 에틸 아세테이트와의 에스테르 교환 반응으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 에틸 아세테이트 중의 n-아밀 알콜 184 nM과 톨루엔 1 ml를 건조 가교된 CRL 결정의 샘플 2 mg에 첨가하고, 그 일부를 계면 활성제에 노출시키며, 또 다른 그 일부는 계면 활성제에 노출시키지 않았다. 반응을 30 분 동안 진행시킨 후, 전환율(%)을 가스 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 기재하였다.
실시예 9-계면 활성제의 효과
본 실시예에서는 본 발명에 따른 가교된 효소 결정 제제에 의해 나타난 활성 강화에 미치는 계면 활성제의 중요한 역할을 입증하였다. 계면 활성제를 사용하지 않고 실시예 1 내지 실시예 3의 가교된 효소 결정 제제의 결정과 유사한 수분 함량을 지니도록 건조시켰다는 것을 제외하고는, 실시예 1 내지 실시예 3에서 설명한 바와 같이 가교된 효소 결정을 제조하였다. 그러한 수분 함량의 정도는 CRL인 경우 수분 함량 13.3%이고, LPS인 경우 수분 함량 1.7% 내지 2%이며, ABL인 경우 수분 함량 2.2% 내지 2.4%이었다.
각각의 효소 샘플에 대하여, 건조 단계는 실시예 1, 실시예 2 또는 실시예 3의 특정 효소에 사용한 것과 동일한 용매를 보다 작은 양(1 ml)으로 사용하여 수행하였다. 이어서, 각각의 효소에 대하여 실시예 6 내지 실시예 8에서 설명한 시험 분석으로 전환율(%) 이외에 초기 활성의 정도를 측정하였다. 또한, 실시예 1 내지 실시예 3의 효소(CRL 시험 분석: 실시예 8, LPS 시험 분석: 실시예 6, ABL 시험 분석: 실시예 7)에 대한 각각의 시험 분석으로 실시예 1 내지 실시예 3의 가교된 효소 결정 제제 각각의 초기 효소 활성을 측정하였다. 실시예 1 내지 실시예 3의 가교된 효소 결정 제제의 초기 활성과 비교한 바에 의하면, 계면 활성제를 사용하지 않고 건조시킨 가교된 효소 결정 제제의 초기 활성은 ABL인 경우 19배, LPS인 경우 79배 그리고 CRL인 경우 100배 더 낮았다.
실시예 10-계면 활성제의 검색
본 발명에 따른 가교된 효소 결정 제제를 제조할 때 사용하기 위해 다수의 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 비이온성 계면 활성제를 검색하는 대안적인 절차를 사용하였다. 이러한 검색 절차에서는, 실시예 6 내지 실시예 8에서와 같이 제조한 가교된 효소 결정 제제의 효소 활성은 유기 용매의 존재하에서 주어진 계면 활성제로 건조시킨 후, 실온에서 12 일 보관 저장한 다음에 측정하였다. CRL의 건조된 샘플의 활성은 실시예 8에서 설명한 바와 같이, 톨루엔 중에서 n-아밀 알콜의 에틸 아세테이트와의 에스테르 교환 반응으로 측정하였다. ABL의 건조된 샘플의 활성은 실시예 7에서 설명한 바와 같은, 이소옥탄 중에서 N-Ac-PheOMe의 n-프로판올과의 에스테르 교환 반응으로 측정하였다. LPS의 건조된 샘플의 활성을 실시예 6에서 설명한 바와 같은, 펜에틸 알콜의 분해 방법으로 측정하였다. 다수의 계면 활성제에 노출된 효소는 건조시킨 후에 높은 활성을 나타내었지만, 단지 일부만이 보관 후에도 그러한 높은 활성을 유지하였다. 이러한 실시예에 사용된 계면 활성제 이외에도, 다른 여러 계면 활성제, 즉 CRL인 경우 트리톤 및 디옥틸 술포숙신에이트와 ABL인 경우 디옥틸 술포숙신에이트 및 4 라우릴 에테르는 보관 후에도 높은 활성을 나타내는 가교된 효소 결정 제제를 제공하였다.
이상, 본 발명에 대한 다수의 실시 태양을 설명하였지만, 본 발명의 기본 구성을 변경하여 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 기타 실시 태양을 제공할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 보호 범위는 실시예에 의해 전술한 특정 실시 태양에 의해 정해지는 것이 아니라 후술하는 첨부된 청구의 범위에 의해서 정하여 진다.

Claims (67)

  1. 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 활성이 동량의 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 1.7배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  2. 제1항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 활성이 동량의 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 1.7배 내지 약 90배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  3. 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 4.3배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  4. 제3항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 4배 내지 약 442배 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  5. 제3항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 50배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  6. 제3항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 100배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  7. 제3항에 있어서, 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 200배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  8. 제3항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 고형물 1 mg 당 고유 활성이 미정제 형태 또는 순수한 형태의 단백질의 활성보다 약 300배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  9. 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 활성이 계면 활성제를 포함하지 않는 가교된 단백질 결정의 활성보다 약 19배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  10. 제9항에 있어서, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 상기 제제의 활성이 계면 활성제를 포함하지 않는 가교된 단백질 결정의 활성보다 약 19배 내지 약 100배 이상 더 큰 것을 특징으로 하는 가교된 단백질 결정 제제.
  11. 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항 있어서, 상기 제제가 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 비이온성 계면 활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 계면 활성제를 포함하는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 계면 활성제가 상기 제제의 약 10 중량% 내지 약 70 중량%를 구성하는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 계면 활성제가 상기 제제의 약 25 중량% 내지 약 45 중량%를 구성하는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  14. 제11항에 있어서, 상기 음이온성 계면 활성제가 선형 알킬벤젠 술포네이트, 알파-올레핀 술포네이트, 알킬 술페이트, 알콜 에톡시 술페이트, 카르복실산, 황산 에스테르 및 알칸 술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  15. 제11항에 있어서, 상기 양이온성 계면 활성제가 아민, 아민 염, 술포늄, 포스포늄 및 4급 암모늄 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  16. 제11항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제가 노닐 페놀 에톡실레이트, 알콜 에톡실레이트, 소르비탄 트리올레이트, 비이온성 블록 공중합체 계면 활성제, 폴리에틸렌 옥사이드, 페놀 알콜의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체 및 지방산의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  17. 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질 결정이 미정질인 가교된 단백질 결정 제제.
  18. 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질이 효소 또는 항체인 가교된 단백질 결정 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단백질이 가수분해 효소, 이성질화 효소, 리아제, 리가제, 전이 효소 및 산화 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인 가교된 단백질 결정 제제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 효소가 가수분해 효소인 가교된 단백질 결정 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 가수분해 효소가 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제, 에스테라제, 리파제, 니트릴아제, 히단토인아제, 프로테아제, 아스파라기나제, 우레아제 및 리소자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  22. 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제가 동결 건조된 형태인 가교된 단백질 결정 제제.
  23. 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유기 용매가 디올, 폴리올, 폴리에테르, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유기 용매가 톨루엔, 옥탄, 테트라히드로푸란, 아세톤, 피리딘, 디에틸렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 폴리(에틸렌 글리콜), 트리에틸렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 1,2-부탄디올, 2,3-디메틸-2,3-부탄디올, 1,2-부탄디올, 디메틸 타르트레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)의 모노알킬 에테르, 폴리(에틸렌 글리콜)의 디알킬 에테르, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 가교된 단백질 결정 제제.
  25. 하기 (a) 단계와 (b) 단계를 포함하여, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 단백질을 사용하여 선택된 생성물을 제조하는 방법:
    (a) 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매의 존재하에서 기질에 작용하는, 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제인 1종 이상의 단백질과 1종 이상의 기질을 배합하는 단계와,
    (b) (a) 단계에서 생성된 배합물을 상기 단백질이 상기 기질에 작용하여 선택된 생성물을 생성시킬 수 있는 조건 하에서 유지시키는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 상기 생성물이 키랄성 유기 분자, 펩티드, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 단백질이 효소 또는 항체인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단백질이 가수분해 효소, 이성질화 효소, 리아제, 리가제, 전이 효소 및 산화 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 효소가 가수분해 효소인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 가수분해 효소가 서몰리신, 엘라스타제, 에스테라제, 리파제, 니트릴아제, 히단토인아제, 프로테아제, 아스파라기나제, 우레아제 및 리소자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 유기 용매가 디올, 폴리올, 폴리에테르, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유기 용매가 톨루엔, 옥탄, 테트라히드로푸란, 아세톤, 피리딘, 디에틸렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 폴리(에틸렌 글리콜), 트리에틸렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 1,2-부탄디올, 2,3-디메틸-2,3-부탄디올, 1,2-부탄디올, 디메틸 타르트레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)의 모노알킬 에테르, 폴리(에틸렌 글리콜)의 디알킬 에테르, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 하기 (a) 단계와 (b) 단계를 포함하여, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매 중에서 가교된 단백질 결정의 활성을 증가시키는 방법:
    (a) 가교된 단백질 결정을 계면 활성제와 배합하여 배합물을 생성시키는 단계와,
    (b) 가교된 단백질 결정과 계면 활성제의 배합물을 유기 용매의 존재하에서 건조시켜 가교된 단백질 결정 제제를 형성시키는 단계.
  34. 제33항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 배합물은 가교된 단백질 결정 대 계면 활성제의 중량비 약 1:1 내지 약 1:5로 구성되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 배합물은 가교된 단백질 결정 대 계면 활성제의 중량비 약 1:1 내지 약 1:2로 구성되는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 가교된 단백질 결정과 계면 활성제를 약 5 분 내지 약 24 시간의 기간 동안 배합하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 가교된 단백질 결정과 계면 활성제를 약 30 분 내지 약 24 시간의 기간 동안 배합하는 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 계면 활성제가 (b)단계에서 생성된 가교된 단백질 결정 제제의 약 10 중량% 내지 약 70 중량%를 구성하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 계면 활성제가 (b)단계에서 생성된 가교된 단백질 결정 제제의 약 25 중량% 내지 약 45 중량%를 구성하는 것인 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 계면 활성제가 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 비이온성 계면 활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 음이온성 계면 활성제가 선형 알킬벤젠 술포네이트, 알파-올레핀 술포네이트, 알킬 술페이트, 알콜 에톡시 술페이트, 카르복실산, 황산 에스테르 및 알칸 술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 양이온성 계면 활성제가 아민, 아민 염, 술포늄, 포스포늄 및 4급 암모늄 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제가 노닐 페놀 에톡실레이트, 알콜 에톡실레이트, 소르비탄 트리올레이트, 비이온성 블록 공중합체 계면 활성제, 폴리에틸렌 옥사이드, 페놀 알콜의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체 및 지방산의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 단백질이 효소 또는 항체인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 단백질이 가수분해 효소, 이성질화 효소, 리아제, 리가제, 전이 효소, 산화 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 효소가 가수분해 효소인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 가수분해 효소가 서몰리신, 엘라스타제, 에스테라제, 리파제, 니트릴아제, 히단토인아제, 프로테아제, 아스파라기나제, 우레아제 및 리소자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 제40항에 있어서, 상기 유기 용매가 디올, 폴리올, 폴리에테르, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 유기 용매가 톨루엔, 옥탄, 테트라히드로푸란, 아세톤, 피리딘, 디에틸렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 폴리(에틸렌 글리콜), 트리에틸렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 1,2-부탄디올, 2,3-디메틸-2,3-부탄디올, 1,2-부탄디올, 디메틸 타르트레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)의 모노알킬 에테르, 폴리(에틸렌 글리콜)의 디알킬 에테르, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  50. 하기 (a) 단계와 (b) 단계를 포함하여, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매를 포함한 샘플로부터 물질을 분리하는 방법:
    (a) 단백질이 상기 샘플내의 분리시키고자 하는 물질과 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서, 상기 샘플을 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제와 접촉시키는 단계와,
    (b) 상기 샘플로부터 상기 복합체를 분리하는 단계.
  51. 제50항에 있어서, 상기 단백질이 효소 또는 항체인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 가교된 단백질 결정 제제가 고형 지지체에 결합되는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 고형 지지체가 친화성 칼럼 또는 비이드인 방법.
  54. 하기 (a) 단계와 (b) 단계를 포함하여, 유기 용매 또는 수성 용매-유기 용매의 혼합 용매의 존재하에서 샘플의 크로마토그래피를 수행하는 방법:
    (a) 샘플의 성분이 단백질과 결합할 수 있는 조건하에서, 상기 샘플을 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제와 접촉시키는 단계와,
    (b) 상기 성분을 분리된 분획물로서 회수하는 단계.
  55. 제54항에 있어서, 상기 단백질이 효소 또는 항체인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 가교된 단백질 결정 제제가 충전된 크로마토그래피 칼럼 내에 존재하는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 크로마토그래피가 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 키랄성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 하기 (a)와 (b)를 포함하는, 샘플내 표적 피분석 물질을 검출하기 위한 바이오센서:
    (a) 표적 피분석 물질에 또는 상기 표적 피분석 물질이 침전하는 반응에서의 반응물에 대해 활성을 갖는, 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제와,
    (b) 상기 가교된 단백질 결정 제제를 (1) 단백질이 작용하는 피분석 물질 또는 (2) 이 피분석 물질이 침전하는 반응에서의 반응물을 포함하는 샘플과 접촉시킬 수 있는 재료로 이루어진, 상기 가교된 단백질 결정 제제를 위한 보유 수단.
  59. 제58항에 있어서, 상기 피분석 물질의 존재 또는 부재의 신호를 발생시키는 신호 변환기를 더 포함하는 것인 바이오센서.
  60. 제59항에 있어서, 상기 피분석 물질 또는 반응물에 대한 단백질의 활성을 검출하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 바이오센서.
  61. 제60항에 있어서, 상기 피분석 물질 또는 반응물에 대한 단백질의 활성을 검출하기 위한 상기 수단이 pH 전극, 광 감응 장치, 열 감응 장치 및 전하를 검출하기 위한 수단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오센서.
  62. 제59항에 있어서, 상기 신호 변환기가 광학 변환기, 전기 변환기, 전자기 변환기 및 화학 변환기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오센서.
  63. 하기 (a)와 (b)를 포함하는, 샘플의 성분을 개질시키기 위한 체외 장치:
    (a) 성분에 또는 이 성분이 침전하는 반응에서의 반응물에 작용하는 활성을 갖는, 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제와,
    (b) 상기 가교된 단백질 결정 제제를 (1) 단백질이 작용하는 성분 또는 (2) 이 성분이 침전하는 반응에서의 반응물을 포함하는 샘플과 접촉시킬 수 있는 재료로 이루어진, 상기 가교된 단백질 결정 제제를 위한 보유 수단.
  64. 제63항에 있어서, 상기 보유 수단이 상기 가교된 단백질 결정 제제가 보유되어 있는 다공성 재료 또는 상기 가교된 단백질 결정 물질이 존재하는 튜브를 포함하는 것인 체외 장치.
  65. 촉매 활성 유효량의 제1항, 제3항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 가교된 단백질 결정 제제와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 반응성 국부용 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 가교된 단백질 결정 제제가 상기 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 99 중량%를 구성하는 것인 반응성 국부용 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 가교된 단백질 결정 제제가 상기 조성물의 약 1 중량% 내지 약 10 중량%를 구성하는 것인 반응성 국부용 조성물.
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