DE69738648T2

DE69738648T2 - Formulierungen vernetzter proteinkristalle und ihre verwendung als katalysatoren in organischen lösungsmitteln

Info

Publication number: DE69738648T2
Application number: DE69738648T
Authority: DE
Inventors: Nazer K. Worcester KHALAF
Original assignee: Altus Biologics Inc
Current assignee: Altus Biologics Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2017-05-21
Also published as: AR007211A1; EP0906417B1; US6042824A; AU3072897A; DE69738648D1; US5932212A; IN191060B; DK0906417T3; KR20000015993A; ZA974325B; ID17817A; EP0906417A1; JP2000514282A; ATE393216T1; WO1997044445A1; JP4279351B2; JP2008061652A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Biokatalysatoren-Technologie für die Durchführung von ausgewählten chemischen Reaktionen. In einer Ausführungsform betrifft diese Erfindung Formulierungen vernetzter Proteinkristalle und ihre Verwendung als Katalysatoren bei chemischen Reaktionen an denen organische Lösungsmittel beteiligt sind. Diese Erfindung stellt ebenfalls Verfahren für die Herstellung von Formulierungen vernetzter Proteinkristalle und Verfahren für ihre Verwendung bereit, um chemische Reaktionen in organischen Lösungsmitteln zu optimieren, einschließlich solchen, die bei chemischen Prozessen in industriellem Maßstab verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verwendung von Proteinen wie z. B. Enzymen als Katalysatoren bei der Synthese von Spezialchemikalien und Arzneimitteln im industriellen Maßstab erfuhr in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit [K. Faber und M. C. R. Franssen, Trends in Biochem. Tech., 11, S. 461–470 (1993)]. Enzyme sind als nützliche Werkzeuge für die Durchführung von chemischen Reaktionen in einer stereo-, regio- und chemoselektiven Weise anerkannt. Die Fähigkeit von Enzymen unter milden Bedingungen zu wirken, die einfache Entsorgung und die minimale Produktion von Abfall sind weitere Vorteile, die mit ihrer Verwendung verbunden sind. Enzyme werden auch für die Katalyse in organischen Lösungsmitteln verwendet, um Substrate und Produkte in Lösung zu bringen und um Reaktionskinetiken und das Reaktionsgleichgewicht zu manipulieren, damit die Produktausbeute erhöht wird.
Obwohl Enzyme ein beeindruckendes synthetisches Potenzial gegenüber der derzeitigen nicht-enzymatischen Technologie aufweisen, ist ihre kommerzielle Verwendung durch Nachteile eingeschränkt wie z. B. geringe Stabilität, Schwankungen in der Leistung, schwierige Isolierung und Reinigung, schwierige Handhabung, hohe Kosten und lange Reaktionszeiten. Darüber hinaus sind organische Lösungsmittel oft nicht mit Enzymen verträglich, was zum Abbau oder zur Inaktivierung der Enzyme führt [A. M. Klibanov, „Asymmetric Transformations Catalysed by Enzymes in Organic Solvents", Acc. Chem. Res., 23, S. 114–120 (1990)]. Damit Enzyme als aktive industrielle Katalysatoren fungieren können, müssen sie in der Lage sein, ohne allzu starke Eingriffe in der geeigneten Umgebung von Herstellungsprozessen zu funktionieren. Solche Umgebungen umfassen polare und nicht-polare organische Lösungsmittel und wässrig-organische Lösungsmittelgemische. Die niedrige Aktivität von Enzymen und ihre Abneigung gegenüber organischen Lösungsmitteln stellen nach wie vor die Hürden für eine weitverbreitete Verwendung dieser Proteine bei organischen Routinesynthesen dar. Sogar dann, wenn solche Synthesen durch Enzyme katalysiert werden, ist es nicht unüblich, Prozesse zu beobachten, bei denen pro Gewichtsanteil mehr Enzym als Substrat verwendet wird. Vergleiche zum Beispiel mit R. Bovara et al., Tetrahedron: Asymmetry, 2, S. 931–938 (1991); Y.-F. Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 110, S. 7200–7205 (1988); A. Palomaer et al., Chirality, 5, S. 320–328 (1993) und V. Gotor et al., Tetrahedron, 47, S. 9207–9214 (1991).
Zwei Verfahren, die entworfen wurden, um diese Nachteile – die Enzymreinigung und die Enzymimmobilisierung – zu beheben, haben sich mit einigen dieser Nachteile beschäftigt. Sie haben jedoch das Problem des Verlusts der Enzymaktivität oder Stabilität in organischen Lösungsmitteln nicht gelöst. Tatsächlich hat die Immobilisierung diese Probleme sogar verstärkt, indem höhere Kosten anfallen und die Aktivität des Enzyms durch die Hinzufügung von Trägermaterialien verdünnt wurde. Die Enzymreinigung verursacht ebenfalls zusätzliche Kosten und versagt in den meisten Fällen bei der Erhöhung der Enzymaktivität in organischen Lösungsmitteln. So konnten zum Beispiel die potenziellen synthetischen Vorteile durch gereinigte Lipasen in organischen Lösungsmitteln nicht realisiert werden [T. Nishio und M. Kamimura, Agric. Biol. Chem., 52, S. 2631–2632 (1988); T. Yamane et al., Biotechnol. Bioeng., 36, S. 1063–1069 (1990)]. Die Kosten für gereinigte Lipasen sind höher als diejenigen für ihre entsprechenden Rohformen, während ihre Stabilität und Aktivität in organischen Lösungsmitteln niedriger sind [R. Bovara et al., Biotechnol. Lett., 15, S. 169–174 (1993); E. Wehtje et al., Biotechnol. Bioeng., 41, S. 171–178 (1993); G. Ottolina et al., Biotechnol. Lett., 14, S. 947–952 (1992)].
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Enzymaktivität in organischen Lösungsmitteln eng mit dem Wassergehalt, der Größe und der Gestalt der Katalysator-Teilchen und der Mikroumgebung des Enzyms in Beziehung stehen [A. M. Klibanov, „Enzymatic Catalysis in Anhydrous Organic Solvents", Trends in Biochem. Sci., 14, S. 141–144 (1989)]. Diese Parameter wurden eingestellt, indem gefriergetrocknete Komplexe von Enzymen mit Kohlenhydraten, organischen Puffern oder Salzen hergestellt wurden [K. Dabulis und A. M. Klibanov, Biotechnol. Bioeng., 41, S. 566–571 (1993); A. D. Blackwood et al., Biochim. Biophys. Acta, 1206, S. 161–165 (1994); Y. L. Khmelnitsky et al., J. Am. Chem. Soc., 116; S. 2647–2648 (1994)]. Es wird jedoch, trotz der breiten Verwendung der Gefriertrocknung bei der Herstellung von Enzymen für die Katalyse in organischen Lösungsmitteln, ihre Auswirkungen nicht vollständig verstanden, und sie kann in einigen Fällen eine signifikante reversible Denaturierung von Enzymen verursachen [Dabulis und Klibanov, vorstehend].
Andere Ansätze bezüglich des Problems der niedrigen Enzymaktivität bei Biotransformationen, an denen organische Lösungsmittel beteiligt sind, umfassten die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln. Es wurde berichtet, dass nichtionische oberflächenaktive Mittel, die vor der Immobilisierung von Lipase zu einem photo-vernetzbarem Prä-Polymer-Harz zugegeben wurden, oder dem Reaktions-Inkubations-Gemisch zugegeben wurden, die Enzymaktivität erhöhen [B. Nordvi und H. Holmsen, „Effect of Polyhydroxy Compounds an the activity of Lipase from Rhizopus arrhizus in Organic Solvent", in: Biocatalysis in Non-Conventional Media, J. Tramper et al., (Hrsg.), S. 355–361 (1992)].
Immobilisierte Lipase-Enzyme, die durch die Verwendung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (das mindestens eine Fettsäure-Einheit enthält) zu einem hydrophoben Träger vor oder gleichzeitig mit der Verwendung des Lipase-Enzyms hergestellt wurden, weisen bei enzymatischen Umwandlungsprozessen Aktivität auf, die mit der der herkömmlichen immobilisierten Enzyme vergleichbar ist [PCT-Patentanmeldung WO 94/28118 ].
Es wurde behauptet, dass oberflächenaktive Mittel die enzymatische Aktivität von Lipasen vermindern [S. Bornemann et al., „The Effects of Surfactants an Lipase-Catalysed Hydrolysis of Esters: Activities and Stereo Selectivity" Biocatalysis, 11, S. 191–221 (1994)]. Dennoch wurden oberflächenaktive Mittel mit einer wässrigen Lösung eines Enzyms gemischt, das Gemisch wurde entwässert und das so erhaltene Enzympräparat wurde als Katalysator verwendet, von dem behauptet wurde, dass er eine erhöhte Aktivität in organischen Lösungsmitteln aufweist [PCT-Patentanmeldung WO 95/17504 ]. Oberflächenaktive Mittel oder Lipide wurden auch verwendet um Enzyme zu beschichten, um sie in organischen Lösungsmitteln zu lösen, und dadurch die chemischen Reaktionsraten zu steigern [M. Goto et al., „Design of Surfactants Suitable for Surfactant-Coated Enzymes as Catalysts in Organic Media", J. Chem. Eng. Jpn., 26, S. 109–111 (1993); N. Kamiya et al., „Surfactant-Coated Lipase Suitable for the Enzymatic Resolution of Methanol as a Biocatalyst in Organic Media", Biotechnol. Prog., 11, S. 270–275 (1995)]. Nach diesem Verfahren werden die Enzyme in organischen Lösungsmitteln löslich. Enzymkomplexe, die in organischen Stoffen löslich sind, werden auch in V. M. Paradkar und J. S. Dordick, J. Am. Chem. Soc., 116, S. 5009–5019 (1994) (Proteasen) und in Y. Okahata et al., J. Org. Chem., 60, S. 2240–2250 (1995) (Lipasen) beschrieben.
Der Beginn der Technologie vernetzter Enzymkristalle (crosslinked enzyme crystal, „CLEC^TM") stellte einen einzigartigen Ansatz für die Lösung der vorstehend beschriebenen Nachteile dar [N. L. St. Clair und M. A. Navia, J. Am. Chem. Soc., 114, S. 7314–7316 (1992)]. Vernetzte Enzymkristalle behalten ihre Aktivität in Umgebungen bei, die normalerweise mit der Funktion des Enzyms (löslich oder immobilisiert) unverträglich sind. Solche Umgebungen umfassen eine verlängerte Aussetzung gegenüber hohen Temperaturen und extremen pH-Werten. Darüber hinaus weisen vernetzte Enzymkristalle in organischen Lösungsmitteln und in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen sowohl eine Stabilität als auch eine Aktivität auf, die weit über die ihrer löslichen oder auf herkömmliche Weise immobilisierten entsprechenden Gegenstücke hinausgeht. Da so viele Biokatalyseprozesse von der Stabilität und der Aktivität eines Enzyms unter suboptimalen Bedingungen abhängig sind, werden vernetzte Enzymkristalle bei industriellen, klinischen und Forschungs-Einrichtungen als Enzyme vorteilhaft verwendet. Daher stellen vernetzte Enzymkristalle einen wichtigen Fortschritt auf dem Gebiet der Biokatalyse als attraktive und breit einsetzbare Katalysatoren für organische Synthesereaktionen dar [R. A. Persichetti et al., „Cross-Linked Enzyme Crystals (CLECs) of Thermolysin in the Synthesis of Peptides", J. Am. Chem. Soc., 117, S. 2732–2737 (1995) und J. J. Lalonde et al. J. Am. Chem. Soc., 1117, S. 6845–6852 (1995)].
Trotz dem Fortschritt der Proteinkatalyse-Technologie im Allgemeinen besteht immer noch ein Bedarf an Katalysatoren, die eine hohe Aktivität in organischen Lösungsmitteln aufweisen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Formulierungen vernetzter Proteinkristalle bereit, die hohe Aktivität und Produktivität als Katalysatoren bei chemischen Reaktionen aufweisen, an denen organische Lösungsmittel oder wässrig-organische Lösungsmittelgemische beteiligt sind. Der Grad der Aktivität und der Produktivität sind in vorteilhafter Weise höher als derjenige von löslichen oder auf herkömmliche Weise immobilisierten Proteinen. Diese Erfindung stellt ebenfalls Verfahren für die Herstellung von Formulierungen vernetzter Proteinkristalle bereit sowie Verfahren für ihre Verwendung, um chemische Reaktionen in organischen Lösungsmitteln zu optimieren, einschließlich solchen, die bei der Biokatalyse in industriellem Maßstab verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Formulierung vernetzter Proteinkristalle:

(a) einen vernetzten Proteinkristall; und
(b) ein oberflächenaktives Mittel, wobei das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln; wobei die Formulierung eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 1,7-mal größer ist als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen vernetzter Proteinkristalle durch Trocknung vernetzter Proteinkristalle in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels und eines organischen Lösungsmittels hergestellt. In einer zweiten Ausführungsform dieser Erfindung werden die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle durch Gefriertrocknung vernetzter Proteinkristalle in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels und eines organischen Lösungsmittels hergestellt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann, wird die folgende detaillierte Beschreibung angegeben. In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet: Organisches Lösungsmittel – jedes Lösungsmittel nicht-wässriger Herkunft.
Wässrig-organisches Lösungsmittelgemisch – ein Gemisch, das n% organisches Lösungsmittel, wobei n zwischen 1 und 99 m% liegt, und Wasser umfasst, wobei m 100 – n ist.
Gemisch organischer Lösungsmittel – eine Kombination von mindestens zwei verschiedenen organischen Lösungsmitteln in beliebigem Verhältnis.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle – ein Gemisch aus vernetzten Proteinkristallen mit einem oder mehreren zusätzlichen Excipienten wie z. B. oberflächenaktiven Mitteln, Salzen, Puffern, Kohlenhydraten oder Polymeren, eher in einer getrockneten frei-fließenden Pulverform oder in gefriergetrockneter Form, als ein Brei.
Katalytisch wirksame Menge – eine Menge einer Formulierung eines vernetzten Proteinkristalls dieser Erfindung, die ausreicht, die Fläche auf der sie angewendet wird, über einige Zeit hinweg zu schützen, zu reparieren oder zu entgiften.
Reaktive topische Zusammensetzung – eine Zusammensetzung, die ausreicht, die Fläche auf der sie angewendet wird, über einige Zeit hinweg zu schützen, zu reparieren oder zu entgiften.
Die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle dieser Erfindung sind besonders vorteilhaft, da sie ihre hohe Aktivität in rauen Lösungsmittelumgebungen beibehalten, die für viele chemische Syntheseverfahren im industriellen Maßstab typisch sind. Als Ergebnis ihrer kristallinen Natur erreichen die vernetzten Proteinkristallbestandteile dieser Formulierungen eine Gleichförmigkeit über das gesamte vernetzte Kristallvolumen. Diese Gleichförmigkeit wird durch intermolekulare Kontakte und chemische Vernetzungen zwischen den Proteinmolekülen, die das Kristallgerüst bilden, aufrechterhalten, sogar dann, wenn zwischen organischen oder gemischten wässrig-organischen Lösungsmitteln ausgetauscht wird. Die Proteinmoleküle behalten sogar in solchen Lösungsmitteln einen einheitlichen Abstand voneinander bei und bilden gutdefinierte stabile Poren innerhalb der Formulierung vernetzter Proteinkristalle, die den Zugang des Substrats zu dem Katalysator sowie die Entfernung des Produkts erleichtern. In diesen vernetzten Proteinkristallen sind die Gerüst-Wechselwirkungen, wenn sie durch chemische Vernetzungen fixiert sind, besonders wichtig für die Verhinderung von Denaturierung, vor allem in organischen Lösungsmitteln oder in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen. Die vernetzten Proteinkristalle und die beteiligten Proteine innerhalb des Kristallgerüsts verbleiben in organischen Lösungsmitteln in monodispersem Zustand, wodurch das Problem der Aggregation vermieden wird. Diese Eigenschaften der vernetzten Proteinkristallbestandteile der Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle dieser Erfindung tragen zu dem hohen Aktivitätsgrad dieser Formulierungen in organischen und in wässrig-organischen Lösungsmitteln bei.
Neben ihrer Aktivität in organischen Lösungsmitteln und in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen sind die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung besonders resistent gegenüber Proteolyse, extremen Temperaturen und extremen pH-Werten. Die Aktivität pro Volumeneinheit des vernetzten Proteinkristalls ist signifikant höher als diejenige von auf herkömmliche Weise immobilisierten Proteinen oder aufkonzentrierten löslichen Proteinen. Dies kommt daher, weil die Proteinkonzentrationen innerhalb der vernetzten Proteinkristallbestandteile der Formulierungen nahe an den theoretischen Grenzwerten liegen.
Dank dieser Vorteile erlauben die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle der vorliegenden Erfindung eine bedeutende Verbesserung der Reaktionseffizienz. Sie liefern verbesserte Ausbeuten unter rauen Bedingungen oder in Situationen, die einen hohen Durchsatz erfordern, was den Verfahrens-Chemikern erlaubt, sich auf die Maximierung der Ausbeute mit wenig Bedenken um die Reaktionsbedingungen zu konzentrieren.
Der Proteinbestandteil der Formulierungen der vernetzen Proteinkristalle der Erfindung kann jedes beliebige Protein sein, einschließlich zum Beispiel ein Enzym oder einen Antikörper.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle durch Aktivität entweder in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert, die mindestens etwa 1,7 mal größer ist als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist der Aktivitätsgrad solcher Formulierungen zwischen etwa 1,7 mal und etwa 90 mal größer als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Die Erfindung umfasst auch Formulierungen vernetzter Proteinkristalle, die durch eine spezifische Aktivität pro Milligramm Feststoff in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert sind, die mindestens etwa 4,3 mal größer ist als diejenige des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form. Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle gemäß der Erfindung können auch durch eine spezifische Aktivität pro Milligramm Feststoff in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert sein, die zwischen etwa 4 mal und etwa 442 mal größer ist als diejenige des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form. Und Formulierungen vernetzter Proteinkristalle der Erfindung können auch durch eine spezifische Aktivität pro Milligramm Feststoff in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert sein, die einen Aktivitätsgrad aufweist, der größer ist als derjenige des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form, und welcher ausgewählt ist aus mindestens etwa 50 mal größerer, mindestens etwa 100 mal größerer, mindestens 200 mal größerer und mindestens etwa 300 mal größerer Aktivität.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle durch Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert, die mindestens 19 mal größer ist als die Aktivität von vernetzten Proteinkristallen, die kein oberflächenaktives Mittel enthalten. Die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle können auch durch Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch charakterisiert sein, die zwischen etwa 19 mal und etwa 100 mal größer ist als die Aktivität der vernetzten Proteinkristalle, die kein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Bei allen vorstehend beschriebenen Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle können die angegebenen Aktivitätsgrade entweder in organischen Lösungsmitteln oder in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen oder in beiden Lösungsmitteln erreicht werden. Solche Aktivitätsgrade kennzeichnen alle Arten von Formulierungen vernetzter Proteinkristalle einschließlich Formulierungen vernetzter Enzymkristalle.
Die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle dieser Erfindung können bei jedem beliebigen einer Reihe von chemischen Verfahren verwendet werden. Solche Verfahren umfassen industrielle Prozesse und Prozesse im Forschungsmaßstab wie z. B. die organische Synthese von Spezialchemikalien und Arzneimitteln, die Synthese von Zwischenstufen für die Herstellung solcher Produkte, die chirale Synthese und die Auftrennung von optisch reinen Arzneimitteln und Spezialchemikalien. Enzymatische Umwandlungsprozesse umfassen Oxidationen, Reduktionen, Additionen, Hydrolysen, Eliminierungen, Umlagerungen, Veresterungen und asymmetrische Umwandlungen einschließlich stereoselektiver, stereospezifischer und regioselectiver Reaktionen. Produkte, die unter Verwendung dieser Reaktionen hergestellt werden können, umfassen chirale organische Moleküle, Peptide, Kohlenhydrate, Lipide und andere chemische Stoffarten.
Bei der Durchführung einer beliebigen der vorstehend aufgelisteten Reaktionen wird den Fachleuten deutlich sein, dass es sich bei dem organischen Lösungsmittel oder dem wässrig-organischen Lösungsmittel, das für eine bestimmte Reaktion ausgewählt wurde, um eines handeln sollte, das mit dem Proteinbestandteil des vernetzten Proteinkristalls sowie mit dem oberflächenaktiven Mittel, das zur Stabilisierung des vernetzten Proteinkristalls verwendet wird, verträglich ist. Organische Lösungsmittel können ausgewählt werden aus Diolen, Polyolen, Polyethern, wasserlöslichen Polymeren und Gemischen dieser. Beispiele für organische Lösungsmittel umfassen Toluol, Octan, Tetrahydrofuran, Aceton und Pyridin. Weitere Beispiele umfassen hydrophobe oder polare organische Lösungsmittel wie z. B. mit Wasser mischbare oder mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, Diethylenglycol, 2-Methyl-2,4-pentandiol, Poly(ethylenglycol), Triethylenglycol, 1,4-Butandiol, 1,2-Butandiol, 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol, 1,2-Butandiol, Dimethyltartrat, Monoalkylethern von Poly(ethylenglykol), Dialkylethern von Poly(ethylenglykol) und Polyvinylpyrrolidon oder Gemische davon.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Erfindung Verfahren für die Herstellung eines ausgewählten Produkts in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch, durch Kombinieren von mindestens einem Substrat und mindestens einem Protein, das auf das Substrat in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels oder eines wässrig-organischen Lösungsmittelgemisches einwirkt, das Protein ist als Formulierung vernetzter Proteinkristalle, und Beibehalten der Kombination unter Bedingungen, die es dem Protein ermöglichen, auf das Substrat einzuwirken, wodurch das ausgewählte Produkt hergestellt wird. Produkte, die durch solche Verfahren hergestellt werden können, umfassen zum Beispiel chirale organische Moleküle, Peptide, Kohlenhydrate und Lipide.
Die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß der Erfindung können auch bei Verfahren für die Reinigung oder die Abtrennung eines Stoffes oder Moleküls von Interesse aus einer Probe verwendet werden, und zwar dank der Fähigkeit der Formulierung an das Substrat oder das Molekül von Interesse binden zu können. Solche Trennverfahren umfassen den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Formulierung eines vernetzten Proteinkristalls mit dem Substrat oder Molekül von Interesse durch beliebige Mittel, unter Bedingungen, die es dem Protein erlauben, an das Substrat oder das Molekül von Interesse in der Probe zu binden, um einen Komplex zu bilden, und den Schritt der Abtrennung des Komplexes von der Probe. Bei solchen Verfahren können die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle mit einem festen Träger verbunden, in eine Säule gepackt oder auf Kügelchen angelagert werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle als Bestandteil eines Biosensors für den Nachweis eines Analyten von Interesse in einer Probe wie zum Beispiel einer Flüssigkeit verwendet werden. Ein solcher Biosensor umfasst (a) die Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei das Protein die Aktivität aufweist, auf den Analyten von Interesse oder auf einen Recktanten einer Reaktion, an der der Analyt von Interesse teilnimmt, einzuwirken; (b) eine Rückhaltevorrichtung für die Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Rückhaltevorrichtung ein Material umfasst, das einen Kontakt zwischen der Formulierung vernetzter Proteinkristalle und der Probe ermöglicht, und wobei die Probe entweder (1) den Analyten, auf den das Protein einwirkt, oder (2) einen Recktanten einer Reaktion, an der der Analyt teilnimmt, enthält; und gegebenenfalls (c) einen Signalüberträger, der ein Signal bei Anwesenheit oder bei Abwesenheit des Analyten produziert. Die Vorrichtung für den Nachweis der Aktivität des Proteins auf den Analyten oder den Recktanten kann ausgewählt werden aus pH-Elektroden, Lichtsensor-Vorrichtungen, Wärmesensor-Vorrichtungen und Geräte für den Nachweis von elektrischen Ladungen. Der Signalüberträger kann ausgewählt werden aus optischen Übermittlern, elektrischen Übermittlern, elektromagnetischen Übermittlern und chemischen Übermittlern.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle in extrakorporalen Vorrichtungen für die Veränderung eines Bestandteils einer Probe oder für den selektiven Abbau oder die Entfernung eines Bestandteils einer Probe wie z. B. einer flüssigen Probe verwendet werden. Solche extrakorporalen Vorrichtungen umfassen (a) eine Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei das Protein die Aktivität aufweist, auf den Bestandteil oder auf einen Recktanten einer Reaktion, an der der Bestandteil teilnimmt, einzuwirken; und (b) eine Rückhaltevorrichtung für die Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Rückhaltevorrichtung ein Material umfasst, das einen Kontakt zwischen der Formulierung vernetzter Proteinkristalle und der Probe ermöglicht, und wobei die Probe entweder (1) den Bestandteil, auf den das Protein einwirkt, oder (2) einen Recktanten einer Reaktion, an der der Bestandteil teilnimmt, enthält. Bei solchen extrakorporalen Vorrichtungen kann die Rückhaltevorrichtung ein poröses Material umfassen, auf dem die Formulierung vernetzter Proteinkristalle fixiert ist, oder ein Röhrchen, in dem die Formulierung vernetzter Proteinkristalle vorliegt.
Daher können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung vorteilhaft anstelle herkömmlicher löslicher oder immobilisierter Proteine in Biosensoren und extrakorporalen Vorrichtungen verwendet werden. Solche Verwendungen der Formulierungen vernetzter Proteinkristalle dieser Erfindung stellen Biosensoren und extrakorporale Vorrichtungen bereit, die durch höhere Grade der Empfindlichkeit, der Volumenproduktivität und des Volumendurchsatzes charakterisiert sind, als diejenigen Biosensoren und extrakorporalen Vorrichtungen, die auf herkömmlichen löslichen oder immobilisierten Proteinen basieren.
Alternativ können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung bei chromatographischen Verfahren verwendet werden. Solche Verfahren umfassen die Größenausschluss-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie und chirale Chromatographie. Die Chromatographie einer Probe kann in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels oder eines wässrig-organischen Lösungsmittelgemisches durchgeführt werden, durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit der Formulierung vernetzter Proteinkristalle unter Bedingungen, die es den Bestandteilen der Probe erlauben, an das Protein zu binden und einen Komplex zu bilden, und Sammeln der Bestandteile als getrennte Fraktionen. Die Formulierung vernetzter Proteinkristalle kann in einer gepackten Chromatographiesäule enthalten sein.
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle in Gasphasen-Reaktoren verwendet werden wie z. B. in katalytischen Konvertern für Gasphasenreaktionen. Zum Beispiel kann Gas durch eine Säule geleitet werden, die mit der Formulierung eines vernetzten Proteinkristalls gepackt wurde, welche das Gas abbaut.
Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung können auch bei verschiedenen Anwendungen in der Umwelt verwendet werden. Sie können anstelle herkömmlicher löslicher oder immobilisierter Proteine für Umweltzwecke verwendet werden wie z. B. für die Beseitigung von Ölschlämmen. So können zum Beispiel eines oder mehrere organische Lösungsmittel dem Ölschlamm zugesetzt werden und anschließend die Formulierung vernetzter Proteinkristalle.
Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß der vorliegenden Erfindung können auch für die Luftreinigung in Verbindung mit einer Filtration der Luft verwendet werden. Zum Beispiel kann Luft durch eine Säule geleitet werden, die mit der Formulierung vernetzter Proteinkristalle gepackt wurde, um alle unerwünschten Verunreinigungen abzubauen und herauszufiltern.
Diese Erfindung umfasst auch Verfahren für die Steigerung der Aktivität von vernetzten Proteinkristallen in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch, umfassend die Schritte des Kombinierens des vernetzten Proteinkristalls mit einem oberflächenaktiven Mittel, um eine Kombination herzustellen, und des Trocknens der Kombination aus den vernetzten Proteinkristallen und dem oberflächenaktiven Mittel in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels zur Bildung der Formulierung vernetzter Proteinkristalle.
Alternativ können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung als Inhaltsstoffe in topisch anzuwendenden Cremen und Lotionen für den Schutz oder die Entgiftung der Haut verwendet werden. Sie können auch als Antioxidationsmittel in Kosmetika verwendet werden.
Gemäß dieser Erfindung kann jedes Individuum einschließlich des Menschen und anderer Säugetiere auf pharmazeutisch verträgliche Weise mit einer katalytisch wirksamen Menge einer Formulierung vernetzter Proteinkristalle über einen bestimmten Zeitraum behandelt werden, der ausreicht, die Fläche, auf die sie angewendet wird, zu schützen, zu reparieren oder zu entgiften. Zum Beispiel können die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle auf jeder beliebigen Epitheloberfläche topisch verabreicht werden. Solche Epitheloberflächen umfassen orale, okulare, auditive und nasale Oberflächen.
Die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle können in einer Vielzahl von üblichen Depotformen vorliegen, die für die topische Anwendung verwendet werden, um wirksame topische Zusammensetzungen bereitzustellen. Diese umfassen zum Beispiel halbfeste und flüssige Dosierungsformen wie z. B. flüssige Lösungen oder Suspensionen, Gele, Cremes, Emulsionen, Lotionen, Schlämme, Pulver, Sprays, Schäume, Pasten, Salben, Balsame und Tropfen. Zusammensetzungen, die die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle enthalten, können auch beliebige übliche pharmazeutisch verträgliche Träger oder Hilfsstoffe enthalten. Diese Träger und Hilfsstoffe umfassen zum Beispiel Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Puffersubstanzen wie z. B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Glycerid-Teilgemische aus gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie z. B. Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesium, Trisilikat, auf Cellulose basierende Stoffe und Polyethylenglycol. Hilfsstoffe für topische oder auf Gelen basierende Formen können zum Beispiel Natrium-carboxymethyl-cellulose, Polyacrylate, Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Block-Polymere, Polyethylenglycol und Holzwachs-Alkohole umfassen.
Alternativ können die Formulierungen vernetzter Proteinkristalle in Mitteln für die Gesundheitspflege formuliert werden, ausgewählt aus Verbänden, Schwämmen, Strips, Heftpflaster, Bandagen, Pflaster oder Handschuhen.
Die wirkungsvollste Weise der Verabreichung und das Dosierungsschema werden von der gewünschten Wirkung, einer eventuell vorausgegangenen Therapie, dem Gesundheitszustand des Individuums und der Antwortreaktion auf die Formulierung des vernetzen Proteinkristalls sowie der Beurteilung durch den behandelnden Arzt abhängen. Die Formulierung vernetzter Proteinkristalle kann in jeder beliebigen pharmazeutisch verträglichen topischen Dosierungsform verabreicht werden, einmalig oder über eine Reihe von Behandlungen.
Die Menge der Formulierung vernetzter Proteinkristalle, die mit Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, wird in Abhängigkeit von der bestimmten Weise der topischen Verabreichung, der Formulierung, der Höhe der Dosis oder der Häufigkeit der Dosis variieren. Ein typisches Präparat wird zwischen etwa 0,1% und etwa 99%, bevorzugt zwischen etwa 1% und etwa 10% der Formulierung eines vernetzten Proteinkristalls (Gew./Gew.) enthalten.
Nach der Verbesserung des Zustandes des Individuums kann, sofern nötig, eine Dosis der Formulierung vernetzter Proteinkristalle zur Aufrechterhaltung verabreicht werden. Anschließend können die Dosis oder die Häufigkeit der Verabreichung oder beide in Abhängigkeit von den Symptomen auf ein Maß vermindert werden, auf dem der verbesserte Zustand beibehalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Maß abgemildert worden sind, sollte die Behandlung abgeschlossen werden. Es kann jedoch sein, dass die Individuen langfristig eine Zwischenbehandlung nach erneutem Auftreten der Symptome benötigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Herstellung der Formulierungen vernetzter Proteinkristalle die Schritte der Kristallisierung und Vernetzung des Proteins, die wie in der PCT-Patentanmeldung WO92/02617 beschrieben durchgeführt werden können, welche hierin als Referenz aufgenommen ist. Alternativ können die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle hergestellt werden, wie es nachstehend für die Formulierung vernetzter Enzymkristalle erläutert wird.
Herstellung von Formulierungen vernetzter Enzymkristalle – Enzymkristallisierung Enzymkristalle werden durch die kontrollierte Präzipitation des Enzyms aus einer wässrigen Lösung oder aus einer wässrigen Lösung, die organische Lösungsmittel enthält, angezogen. Die Bedingungen, die kontrolliert werden müssen, umfassen zum Beispiel die Verdunstungsrate des Lösungsmittels, die Anwesenheit von geeigneten Co-gelösten Substanzen und Puffern, der pH-Wert und die Temperatur. Eine zusammenfassende Übersicht über die unterschiedlichen Faktoren, die die Kristallisierung von Proteinen beeinflussen, wurde durch McPherson, Methods Enzymol., 114, S. 112–120 (1985) veröffentlicht.
McPherson und Gilliland, J. Crystal Growth, 90, S. 51–59 (1988) haben umfassende Listen von Proteinen und Nucleinsäuren zusammengestellt, die kristallisiert wurden, sowie die Bedingungen, unter denen sie kristallisiert wurden. Ein Kompendium von Kristallen und Kristallisierungsprotokollen sowie eine Hinterlegung der Koordinaten bekannter Protein- und Nucleinsäure-Kristallstrukturen wird in der Protein-Datenbank am Brookhaven National Laborstory geführt [Bernstein et al., J. Mol. Biol., 112, S. 535–542 (1977)]. Diese Referenzen können verwendet werden, um die Bedingungen zu bestimmen, die für die Kristallisierung eines Enzyms nötig sind, das bereits kristallisiert wurde, und zwar als Auftakt für die Bildung eines geeigneten vernetzten Enzymkristalls, und die Kristallisierungsstrategie für andere Enzyme leiten. Alternativ kann eine intelligente Trial-and-Error-Suchstrategie in den meisten Fällen zu geeigneten Kristallisierungsbedingungen für viele Enzyme führen, vorausgesetzt, dass ein gewisser Reinheitsgrad für das Enzym erreicht werden kann [vergleiche z. B. mit C. W. Carter, Jr. und C. W. Carter, J. Biol. Chem., 254, S. 12219–12223 (1979)].
Enzyme, die kristallisiert werden können, um den Bestandteil einer Formulierung eines vernetzten Enzymkristalls gemäß dieser Erfindung zu bilden, umfassen Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Ligasen, Transferasen und Oxidoreduktasen. Beispiele für Hydrolasen umfassen Thermolysin, Elastase, Esterase, Lipase, Nitrilase, Hydantoinase, Asparaginase, Uresse, Subtilisin und andere Proteasen sowie Lysozym. Beispiele für Lyasen umfassen Aldolasen und Hydroxynitril-Lyase. Beispiele für Oxidoreduktasen umfassen Glucose-Oxidase, Alkohol-Dehydrogenase und andere Dehydrogenasen.
Zur Verwendung in den Formulierungen vernetzter Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung sind die großen Einzelkristalle, die man für die Röntgenstreuungsanalyse benötigt, nicht erforderlich. Mikrokristalline Niederschläge sind geeignet.
Im Allgemeinen werden die Kristalle durch die Kombination des zu kristallisierenden Enzyms mit einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel oder mit einem wässrigen Lösungsmittel, das geeignete Präzipitationsmittel wie z. B. Salze oder organische Stoffe enthält, hergestellt. Das Lösungsmittel wird mit dem Protein bei einer Temperatur kombiniert, von der experimentell bestimmt wurde, dass sie für die Induktion der Kristallbildung und die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität und Enzymstabilität geeignet ist. Das Lösungsmittel kann gegebenenfalls Co-gelöste Substanzen wie zweiwertige Kationen, Cofaktoren oder Chaotrope enthalten, sowie bestimmte Pufferarten, um den pH-Wert zu kontrollieren. Der Bedarf an Co-gelösten Substanzen und ihre Konzentrationen werden experimentell bestimmt, um die Kristallisation zu ermöglichen. Bei einem Prozess im industriellen Maßstab kann die kontrollierte Präzipitation, welche zur Kristallisation führt, am besten durch eine einfache Kombination von Protein, Präzipitationsmittel, co-gelösten Substanzen und gegebenenfalls Puffern im Batch-Verfahren durchgeführt werden. Alternative Labor-Kristallisierungsverfahren wie z. B. Dialyse oder Dampfdiffusion können ebenfalls angepasst werden. McPherson, vorstehend zitiert, und Gilliland, vorstehend zitiert, enthalten eine umfangreiche Liste an geeigneten Bedingungen in ihren Übersichtsartikeln über die Literatur zur Kristallisierung. Gelegentlich kann eine Unverträglichkeit zwischen dem vernetzenden Reagenz und dem Kristallisationsmedium einen Austausch der Kristalle in ein besser geeignetes Lösungsmittelsystem erforderlich machen.
Viele der Enzyme, für die die Kristallisierungsbedingungen bereits beschrieben wurden, weisen ein beträchtliches Potenzial als praktisch anwendbare Katalysatoren bei chemischen Prozessen in der Industrie und im Labor auf, und können verwendet werden, um die Formulierungen der vernetzten Proteinkristalle gemäß dieser Erfindung herzustellen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Bedingungen, die in den meisten der vorstehend zitierten Referenzen beschrieben wurden, so optimiert wurden, dass sie in den meisten Fällen zu einigen wenigen großen Kristallen führen, die eine Qualität für die Diffraktions-Analyse aufweisen. Dementsprechend wird von den Fachleuten erkannt werden, dass einige Anpassungen gegenüber diesen Bedingungen nötig sein können, um einen Prozess mit hoher Ausbeute für die Herstellung kleinerer Kristalle in großem Maßstab bereitzustellen, der für die Produktion vernetzter Enzymkristalle verwendet wird.
Herstellung von Formulierungen vernetzter Enzymkristalle – Vernetzung der Enzymkristalle
Nachdem die Enzymkristalle in einem geeigneten Medium angezogen wurden, können sie vernetzt werden. Die Vernetzung führt zu der Stabilisierung des Kristallgerüsts durch die Einführung kovalenter Bindungen zwischen den vorliegenden Enzymmolekülen des Kristalls. Dies ermöglicht die Übertragung des Enzyms in eine andere Reaktionsumgebung, die unter anderen Umständen mit der Existenz des Kristallgerüsts oder sogar mit der Existenz des intakten Proteins unverträglich wäre. Die Vernetzung kann durch eine Vielzahl an multifunktionellen Reagenzien erfolgen, einschließlich bifunktioneller Reagenzien. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das vernetzende Agenz Glutaraldehyd. Hinsichtlich einer repräsentativen Liste anderer verfügbarer Vernetzungs-Reagenzien vergleiche zum Beispiel mit dem Katalog der Pierce Chemical Company aus dem Jahr 1990.
Vernetzung mit Glutaraldehyd bildet starke kovalente Bindungen vorwiegend zwischen den Lysin-Aminosäureresten innerhalb und zwischen den Enzymmolekülen in dem Kristallgerüst. Die Wechselwirkungen durch die Vernetzung hindern die Enzymmolekülbestandteile des Kristalls daran zurück in Lösung gehen, wodurch die Enzymmoleküle wirksam zu mikrokristallinen Partikeln unlöslich gemacht oder immobilisiert werden (bevorzugt mit Längen, die im Durchschnitt gleich oder weniger als 10^–1 mm betragen).
Herstellung von Formulierungen vernetzter Enzymkristalle – Exposition der vernetzen Enzymkristalle gegenüber oberflächenaktiven Mitteln
Vernetzte Enzymkristalle, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, können dazu verwendet werden, Formulierungen vernetzter Enzymkristalle für Reaktionen in organischen Lösungsmitteln und in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen herzustellen, indem sie mit einem oberflächenaktiven Mittel in Kontakt gebracht werden. Nach Exposition der vernetzten Enzymkristalle gegenüber dem oberflächenaktiven Mittel und anschließender Trocknung in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels ist die so erhaltene Formulierung des vernetzten Enzymkristalls in organischen Lösungsmitteln und in wässrig-organischen Lösungsmittegemischen besonders aktiv und stabil. Die Einzelheiten, die nachstehend im Hinblick auf die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle und ihre Herstellung beschrieben werden, sind in gleicher Weise auf die Formulierungen von vernetzten Proteinkristallen anwendbar.
Oberflächenaktive Mittel, die für die Herstellung der Formulierungen vernetzter Enzymkristalle gemäß dieser Erfindung nützlich sind, umfassen kationische, anionische, nicht-ionische oder amphotere oberflächenaktive Mittel oder Gemische dieser. Das bevorzugte oberflächenaktive Mittel ist abhängig von dem bestimmten Enzymbestandteil des vernetzten Enzymkristalls, der verwendet werden soll, um die Formulierung des vernetzten Enzymkristalls herzustellen. Dies kann durch die Durchführung eines routinemäßigen Screening-Verfahren bestimmt werden, das auf einer Reaktion basiert, die durch das bestimmte Enzym katalysiert wird. Solche Screening-Verfahren sind den Fachleuten wohlbekannt. Erläuternde Screening-Verfahren werden in den Beispielen 6–8 beschrieben.
Beispiele für nützliche kationische oberflächenaktive Mittel umfassen Amine, Aminsalze, Sulfonium-, Phosphonium- und quarternäre Ammoniumverbindungen. Spezifische Beispiele für solche kationischen oberflächenaktiven Mittel umfassen:
Methyl-trioctyl-ammoniumchlorid (Aliquat 336)
N,N',N'-Polyoxyethylen(10)-N-Talg-1,3-diaminopropan (EDT-20, PEG-10 Talg).
Nützliche anionische oberflächenaktive Mittel umfassen zum Beispiel lineares Alkylbenzolsulfonat, Alpha-olefinsulfonat, Alkylsulfat, Alkohol-ethoxysulfat, Carboxylsäuren, Schwefelsäureester und Alkansufonsäuren. Beispiele für anionische oberflächenaktive Mittel umfassen:
Triton QS-30 (anionisch)
Aerosol 22
Dioctyl-sulfosuccinat (AOT)
Alkyl-Natriumsulfat (Niaproof):
Typ 4 Typ 8
Alkyl-(C9-C13) Natriumsulfate (TEEPOL HB7).
Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, die für die Stabilisierung nützlich sind, umfassen Nonyl-Phenol-ethoxylat, Alkoholethoxylat, Sorbitantrioleat, nicht-ionische Block-Copolymer-oberflächenaktive Mittel, Polyethylenoxid oder Polyethylenoxid-Derivate von Phenolalkoholen oder Fettsäuren. Beispiele für nicht-ionische oberflächenaktive Mittel umfassen:
Polyoxyethylenether:
4-Laurylether (Brij 30)
23-Laurylether (Brij 35)
Octylphenoxy-polyethoxyethanol (Triton-Reihe):
Tx-15
Tx-100
Tx-114
Tx-405
DF-16
N-57
DF-12
CF-10
CF-54
Polyoxyethylensorbitan:
Monolaurat (Tween 20)
Sorbitan:
Sesquioleat (Arlacel 83)
Trioleat (Span 85)
Polyglycolether (Tergitol):
Typ N P-4
Typ N P-9
Typ NP-35
Typ TMN-10
Typ 15-S-3
Typ TMN-6 (2,6,8,-Trimethy-4-nonyloxy-polyethylenoxy-ethanol)
Typ 15-S-40.
Im Allgemeinen sollte bei der Herstellung der Formulierungen vernetzter Enzymkristalle das oberflächenaktive Mittel einer Lösung, die einen vernetzten Enzymkristall enthält, in einer Menge zugegeben werden, die ausreicht, es dem oberflächenaktiven Mittel zu ermöglichen, sich mit den vernetzen Enzymkristallen zu äquilibrieren und/oder in sie einzudringen. Eine solche Menge ist eine, die ein Gewichtsverhältnis von vernetzten Enzymkristallen zu oberflächenaktivem Mittel zwischen etwa 1:1 und etwa 1:5, bevorzugt zwischen etwa 1:1 und 1:2 ergibt. Die vernetzen Enzymkristalle werden mit dem oberflächenaktiven Mittel über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden in Kontakt gebracht, bevorzugt zwischen etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden. Nach diesem Kontakt kann die Kombination aus vernetztem Enzymkristall und oberflächenaktivem Mittel in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels getrocknet werden, um die Formulierung vernetzter Enzymkristalle zu bilden.
Die Wahl des organischen Lösungsmittels und die Dauer der Trocknungszeit werden von den bestimmten vernetzten Enzymkristallen und dem bestimmten oberflächenaktiven Mittel abhängen, die verwendet wurden, um die Formulierungen vernetzter Enzymkristalle zu bilden. Dennoch sollten das Lösungsmittel und die Trocknungszeit so gewählt werden, dass sie eine Formulierung vernetzter Enzymkristalle ergeben, die durch einen Wassergehalt charakterisiert ist, welcher der Formulierung eine maximale Aktivität und Stabilität in organischen Lösungsmitteln oder in wässrig-organischen Lösungsmittelgemischen verleiht. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung kann die Trocknungszeit zwischen etwa 5 Minuten und etwa 24 Stunden betragen, bevorzugt zwischen etwa 30 Minuten und etwa 24 Stunden. Das bei dem Trocknungsschritt verwendete organische Lösungsmittel kann in einer Menge zwischen etwa 10 Gew.-% und etwa 90 Gew.-% des gesamten Gemisches vorliegen, bevorzugt zwischen etwa 40 Gew.-% und etwa 80 Gew.-% des Gesamtgemisches.
Alternativ kann die Kombination aus vernetztem Enzymkristall und oberflächenaktivem Mittel in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels gefriergetrocknet werden. Die Gefriertrocknung kann über einen Zeitraum zwischen etwa 30 Minuten und etwa 18 Stunden erfolgen.
Die so erhaltene Formulierung vernetzter Enzymkristalle sollte zwischen etwa 10 Gew.-% und etwa 70 Gew.-% an oberflächenaktivem Mittel bezogen auf das Gewicht der fertigen Formulierung enthalten, bevorzugt enthält sie zwischen etwa 25 Gew.-% und etwa 45 Gew.-% des oberflächenaktiven Mittels bezogen auf das Gewicht der fertigen Formulierung.
Damit diese Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele angeführt. Diese Beispiele dienen nur dem Zweck der Erläuterung und dürfen nicht so ausgelegt werden, dass sie den Rahmen der Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Herstellung der Formulierung vernetzter LPS-Kristalle
Ein Brei aus 15 kg roher Lipase aus Pseudomonas cepacia (PS 30 Lipase – Amano) („LPS") wurde in 100 L destilliertem deionisiertem Wasser gelöst und das Volumen wurde mit zusätzlichem destilliertem deionisiertem Wasser auf 200 L aufgefüllt. Die Suspension wurde in einem Air-Drive-Lightning-Mischgerät 2 Stunden bei Zimmertemperatur gemischt und dann durch einen 0,5 μm-Filter filtriert, um das Celite zu entfernen. Dann wurde das Gemisch ultrafiltriert und auf 10 L (121,4 g) unter Verwendung einer 3K-Hohlfaser-Filtermembran-Kartusche aufkonzentriert. Es wurde festes Calciumacetat bis zu einer Konzentration von 20 mM Ca(CH₃COO)₂ zugegeben. Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Essigsäure auf 5,5 eingestellt, sofern nötig. Das Gemisch wurde auf eine Temperatur von 30°C erwärmt und bei dieser Temperatur gehalten. Es wurde Magnesiumsulfat bis zu einer Konzentration von 0,2 M gefolgt von Glucopon bis zu einer Konzentration von 1% zugegeben. Anschließend wurde Isopropanol bis zu einer Endkonzentration von 23% zugefügt. Die so erhaltene Lösung wurde 30 Minuten bei 30°C gemischt und dann über einen Zeitraum von 2 Stunden von 30°C auf 12°C abgekühlt. Dann wurde die Kristallisation für einen Zeitraum von 16 Stunden ablaufen gelassen.
Es wurde den Kristallen erlaubt sich abzusetzen und lösliches Protein wurde unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe mit einem Tygon-Schlauch, an dessen Ende eine 10 ml-Pipette befestigt war, entfernt. Es wurde frische Kristallisierungslösung (23% Isopropylalkohol, 0,2 M MgSO₄, 1% Glucopon, 20 mM Ca(CH₃COO)₂, pH-Wert 5,5) zugegeben, um die Proteinkonzentration auf 30 mg/ml einzustellen (O. D. 280 einer 1 mg/ml-Lösung = 1,0; gemessen unter Verwendung eines Spektralphotometers bei einer Wellenlänge von 280 nm). Die Ausbeute an Kristallen betrug etwa 120 Gramm. Dann wurde die Kristalllösung wie folgt vernetzt.
Es wurde ein 2-Liter-Aliquot an Vernetzungsmittel hergestellt, indem 1 Volumen von 50% Glutaraldehyd mit 4 Volumina von 0,1 M Tris (pH-Wert 9,25) gemischt wurden. Dann wurde die Vernetzung unter Verwendung von 13,5 ml Vernetzungsmittel pro Gramm Enzym durchgeführt. Genauer wurde ein 0,4 ml-Aliquot des Vernetzungsmittels einem ml des Enzymbreis (30 mg/ml) über einen Gesamtzeitraum für die Zugabe von 2 Stunden zugegeben. Für die Vernetzung wurde das Gemisch 8 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch intensives Waschen der vernetzten Kristalle in einer Filterpresse mit dem etwa 1,5-fachen Volumen an Puffer (10 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0) pro Volumen Kristallbrei beendet.
Ein Aliquot von 30 Gramm der vorstehend hergestellten vernetzten LPS-Enzym-Kristalle wurde in 340 ml Aufbewahrungspuffer (10 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0) suspendiert und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur in einen Trichter aus gesintertem Glas (Porosität ca. 10–20 μm) gegossen. Die Enzymkristalle wurden dem oberflächenaktiven Mittel EDT-20; PEG-10-Talg Aminopropylamin ausgesetzt wie nachstehend beschrieben. Dieses oberflächenaktive Mittel wurde mit Hilfe des Screening-Verfahrens ausgewählt, das nachstehend in Beispiel 6 beschrieben wird.
Der Puffer über den vernetzten LPS-Kristallen wurde in einem Trichter aus gesintertem Glas abfiltriert (vorstehend beschrieben), wobei die Enzymkristalle bei dem ganzen Vorgang feucht gehalten wurden. Die Höhe der vernetzten Enzymkristalle in dem Trichter wurde gemessen und sie betrug 60 ml. Es wurde das oberflächenaktive Mittel N,N',N-Polyoxyethylen(10)-N-Talg-1,3-diaminopropan (EDT-20', PEG-10-Talg) zusammen mit dem Lösungsmittel 2-Butanon zugegeben, so dass das Verhältnis zwischen oberflächenaktivem Mittel und vernetzten Enzymkristallen 1:1 betrug (30 g oberflächenaktives Mittel : 30 g LPS = 30 ml). Dies erfolgte, indem ein Gemisch von 30 ml 2-Butanon und 30 ml oberflächenaktivem Mittel, d. h. insgesamt 60 ml, oben auf die vernetzten Enzymkristalle gegossen wurde. Dann wurde ein schwacher Unterdruck angelegt, um sicherzustellen, dass die vernetzten Enzymkristalle mit dem oberflächenaktiven Mittel beschichtet wurden, wobei dies so erfolgte, dass der Enzymkuchen nicht austrocknete. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch dann in ein Trocknungsgefäß (ein Druckfiltertrichter mit Fritte) überführt und in einem Luftstrom bis zu einem Wassergehalt von etwa 1–3%, wie durch eine Titration nach Karl Fischer bestimmt, getrocknet.
Die Formulierungen der vernetzten LPS-Kristalle gemäß dieser Erfindung können auch unter Verwendung vernetzter LPS-Kristalle hergestellt werden, die unter dem Handelsnamen ChiroCLEC-PC verkauft werden, und von Altus Biologics, Inc. (Cambridge, Massachusetts) erhältlich sind.
Beispiel 2 – Herstellung der Formulierung vernetzter CRL-Kristalle
Ein Aliquot von 5 kg Lipase aus Candida rugosa („CRL") in Pulverform (Amano) wurde mit 5 kg Celite gemischt und in 102 L destilliertem deionisiertem Wasser gelöst und das Volumen wurde mit destilliertem deionisiertem Wasser auf 200 L aufgefüllt. Die Suspension wurde in einem Air-Drive-Lightning-Mischgerät 2 Stunden bei Zimmertemperatur gemischt und dann durch einen 0,5 μm-Filter filtriert, um das Celite zu entfernen. Dann wurde das Gemisch ultrafiltriert und auf 14 L (469 g) unter Verwendung einer 3K-Hohlfaser-Filtermembran-Kartusche aufkonzentriert. Es wurde festes Calciumacetat bis zu einer Konzentration von 5 mM Ca(CH₃COO)₂ zugegeben. Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Essigsäure auf 4,8 eingestellt, sofern nötig. Das Gemisch wurde auf eine Temperatur von 25°C erwärmt und bei dieser Temperatur gehalten. Es wurden ein 3,5 L-Aliquot an (100%) 2-Methyl-2,4-pentandiaol „MDP" und Impfkristalle (0,5 g Protein) zugegeben. Die so erhaltene Lösung wurde über Nacht gemischt. Dann wurde die Kristallisation über einen Zeitraum von etwa 17–20 Stunden über Nacht ablaufen gelassen.
Es wurde den Kristallen erlaubt sich abzusetzen und lösliches Protein wurde unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe mit einem Tygon-Schlauch entfernt, an dessen Ende eine 10 ml-Pipette befestigt war. Es wurde frische Kristallisierungslösung (20% MDP, 5 mM Ca(CH₃COO)₂, pH-Wert 4,8) zugegeben, um die Proteinkonzentration auf 35 mg/ml einzustellen (O.D. 280 einer 1 mg/ml-Lösung = 1,0). Anschließend wurde dieser Schritt wiederholt. Die Ausbeute an Kristallen betrug etwa 217 Gramm. Dann wurde die Kristalllösung wie folgt vernetzt.
Das Vernetzungsmittel wurde durch Mischung von 1 Volumen von 50% Glutaraldehyd mit 1 Volumen von 0,3 M Natriumborat-Puffer (pH-Wert 9,0) und Erhitzen des Gemisches bei 60°C für eine Stunde hergestellt. Das Gemisch wurde stehen gelassen bis es auf Zimmertemperatur abgekühlt war, wobei der pH-Wert sofern nötig mit HCl auf 6,0 eingestellt wurde. Dann wurde die Vernetzung unter Verwendung von 3,885 ml (1,949 g) Vernetzungsmittel pro Gramm Enzym durchgeführt. Genauer wurde ein 1686 ml-Aliquot des Vernetzungsmittels zu 217 g des Enzymbreis durch langsames Zupumpen des Vernetzungsmittels über einen Gesamtzeitraum für die Zugabe von 2 Stunden zugegeben. Dann wurde das Gemisch weitere 16 Stunden bei Zimmertemperatur zur Vernetzung stehen gelassen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch intensives Waschen der vernetzten Kristalle in einem Büchnertrichter mit einem 1 μm-Filter zuerst mit 30 L Wasser und dann mit 2 M Natriumchlorid und Puffer (10 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0) beendet.
Ein Aliquot von 6 Gramm der vorstehend hergestellten vernetzten CRL-Enzym-Kristalle wurde in 100 ml Aufbewahrungspuffer (10 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0) suspendiert und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur in einen Trichter aus gesintertem Glas (Porosität ca. 10–20 μm) gegossen. Dann wurde der Puffer von dem Enzym entfernt. Die Enzymkristalle wurden wie nachstehend beschrieben dem oberflächenaktiven Mittel Tergitol Typ TMN-6 ausgesetzt. Dieses oberflächenaktive Mittel wurde mit Hilfe des Screening-Verfahrens ausgewählt, das nachstehend in Beispiel 8 beschrieben wird.
Der Puffer über den vernetzten CRL-Kristallen wurde in einem Trichter aus gesintertem Glas abfiltriert (wie vorstehend beschrieben), wobei die vernetzten Enzymkristalle bei dem ganzen Vorgang feucht gehalten wurden. Die Höhe der vernetzten Enzymkristalle in dem Trichter wurde gemessen und sie betrug 34 ml. Das oberflächenaktive Mittel wurde zusammen mit dem Lösungsmittel 2-Butanon zugegeben, so dass das Verhältnis zwischen oberflächenaktivem Mittel und vernetzten Enzymkristallen 1:1 betrug (6 g CRL : 6 g oberflächenaktives Mittel = 5,7 ml). Dies erfolgte, indem ein Gemisch von 28,3 ml 2-Butanon und 5,7 ml oberflächenaktivem Mittel, d. h. insgesamt 34 ml, oben auf die vernetzten Enzymkristalle gegossen wurde. Dann wurde ein schwacher Unterdruck angelegt, um sicherzustellen, dass die vernetzten Enzymkristalle mit dem oberflächenaktiven Mittel beschichtet wurden, und dies erfolgte so, dass der Enzymkuchen nicht austrocknete. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch dann in ein Trocknungsgefäß (ein Druckfiltertrichter mit Fritte) überführt und in einem Luftstrom bis zu einem Wassergehalt von etwa 7–13%, wie durch eine Titration nach Karl Fischer bestimmt, getrocknet.
Die Formulierungen der vernetzten CRL-Kristalle gemäß dieser Erfindung können auch unter Verwendung vernetzter CRL-Kristalle hergestellt werden, die unter dem Handelsnamen ChiroCLEC-CR verkauft werden, und von Altus Biologics, Inc. (Cambridge, Massachusetts) erhältlich sind.
Beispiel 3 – Herstellung der Formulierung vernetzter ABL-Kristalle
Ein Brei von 30 kg oder 25 L Subtilisin A aus Bacillus licheniformis („ABL") (Alcalase) wurde in einem Air-Drive-Lightning-Mischgerät mit 50 L 15% Na₂SO₄ (pH-Wert 5,5) gemischt. Es wurden Impfkristalle (0,27 g Protein) zugegeben und das Gemisch wurde bei einer Temperatur von 30°C gehalten. Dann wurde die Kristallisation über einen Zeitraum von 3–4 Tagen ablaufen lassen. Die Mutterlauge wurde unter Verwendung eines Büchnertrichters mit einem 1 μm-Filter entfernt.
Die Kristalle wurden mit 50 L 15% Na₂SO₄ (pH-Wert 5,5) gewaschen und dann in 40 L 15% Na₂SO₄ (pH-Wert 5,5) suspendiert. Die Ausbeute an Kristallen betrug etwa 1069 Gramm. Dann wurde die Kristalllösung wie folgt vernetzt.
Die Vernetzung wurde unter Verwendung von 1,68 ml 50% Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel pro Gramm Enzym durchgeführt. Genauer wurde ein 1796 ml-Aliquot des Vernetzungsmittels zu 1069 g Enzym über einen Gesamtzeitraum für die Zugabe von 30 Minuten bis 1 Stunde zugegeben. Das Gemisch wurde für die Vernetzung 4 Stunden bei Zimmertemperatur gemischt, wobei der pH-Wert die ganze Zeit über auf 5,5 gehalten wurde. Die Vernetzungsreaktion wurde durch intensives Waschen der vernetzten Kristalle in einer Filterpresse mit Wasser beendet, bis die Leitfähigkeit der Waschlösung 2 ms/cm betrug. Dann wurden die vernetzten Enzymkristalle in Puffer (0,1 M NaAc, 20 mM CaCl₂, pH-Wert 5,7) suspendiert.
Ein Aliquot von 20 Gramm der vorstehend hergestellten vernetzten ABL-Enzym-Kristalle wurde in 100 ml Aufbewahrungspuffer (0.1 M NaAc, 20 mM CaCl₂, pH-Wert 5,7) suspendiert und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur in einen Trichter aus gesintertem Glas (Porosität ca. 10–20 μm) gegossen. Die Enzymkristalle wurden gegenüber dem oberflächenaktiven Mittel Tergitol Typ 15-S-3 exponiert wie nachstehend beschrieben. Dieses oberflächenaktive Mittel wurde mit Hilfe des Screening-Verfahrens ausgewählt, das nachstehend in Beispiel 7 beschrieben wird.
Der Puffer über den vernetzten ABL-Kristallen wurde in einem Trichter aus gesintertem Glas abfiltriert (wie vorstehend beschrieben), wobei die vernetzten Enzymkristalle bei dem ganzen Vorgang feucht gehalten wurden. Die Höhe der vernetzten Enzymkristalle in dem Trichter wurde gemessen und sie betrug 50 ml. Das oberflächenaktive Mittel wurde zusammen mit dem Lösungsmittel Isopropanol zugegeben, so dass das Verhältnis zwischen oberflächenaktivem Mittel und vernetzten Enzymkristallen 1:1,5 betrug (30 g ABL : 30 ml oberflächenaktives Mittel = 50 ml). Dies erfolgte, indem ein Gemisch von 20 ml Isopropanol und 30 ml oberflächenaktivem Mittel, d. h. insgesamt 50 ml, oben auf die vernetzten Enzymkristalle gegossen wurde. Dann wurde ein schwacher Unterdruck angelegt, um sicherzustellen, dass die vernetzten Enzymkristalle mit dem oberflächenaktiven Mittel beschichtet wurden, und dies erfolgte so, dass der Enzymkuchen nicht austrocknete. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch dann in ein Trocknungsgefäß (ein Druckfiltertrichter mit Fritte) überführt und in einem Luftstrom bis zu einem Wassergehalt von etwa 1–4%, wie durch eine Titration nach Karl Fischer bestimmt, getrocknet.
Alternativ können 15 g feuchter Kuchen aus vernetzten ABL-Enzymkristallen mit 20 g oberflächenaktivem Mittel und 30 ml Isopropanol gemischt werden. Dann kann das Gemisch 30 Minuten inkubiert werden. Anschließend können das Lösungsmittel und das oberflächenaktive Mittel durch Absaugen entfernt werden, wie vorstehend beschrieben. Dann können die feuchten vernetzten Enzymkristalle in ein Gefriertrockungsgefäß überführt werden und mit Aceton in Trockeneis 30 Minuten eingefroren werden. Anschließend wird das Gefriertrockungsgefäß in das Gefriertrockungsgerät überführt und 30 Minuten getrocknet.
Gefriergetrocknete Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle, die wie vorstehend beschriebenen hergestellt wurden, können bei Zimmertemperatur oder bei 4°C vor ihrer Verwendung in organischen Lösungsmitteln aufbewahrt werden. Gefriergetrocknete Formulierungen vernetzter Enzymkristalle können bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden.
Die Formulierungen der vernetzten ABL-Kristalle gemäß dieser Erfindung können auch unter Verwendung vernetzter ABL-Kristalle hergestellt werden, die unter dem Handelsnamen ChiroCLEC-BL verkauft werden, und von Altus Biologics, Inc. (Cambridge, Massachusetts) erhältlich sind.
Beispiel 4 – Aktivität der Formulierungen vernetzter Enzymkristalle in organischen Lösungsmitteln
Die Aktivitäten der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle, die wie vorstehend hergestellt wurden, oder die ihrer entsprechenden Rohformen bei der Aufspaltung von Alkoholen, Säuren und Aminen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Enzymaktivität wurde durch HPLC und Gaschromatographie („GC") gemessen. Die bestimmten Aufspaltungen mit denen die Daten der Tabelle 1 erhalten wurden, wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Aufspaltung von (+/–) Menthol durch Transveresterung
Eine Lösung von (+/–) Menthol (449 mM) in 1 ml Toluol, enthaltend 7,5 μl (0,15%) H₂O, wurde mit 4 mg der Formulierung vernetzter CRL-Kristalle, die in Beispiel 2 hergestellt worden war, 5 Minuten gerührt bis eine feine Suspension erhalten wurde. Es wurde Vinylacetat (449 mM) zugegeben und die so erhaltene Suspension wurde 4 Stunden bei 25°C gerührt, zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Kapillar-Gaschromatographie- („GC") Analyse eine Umwandlung von 15% an. Die GC-Bedingungen waren wie folgt: DB1701 15 m × 0,25 mm GC-Säule, 25 mm Filmdicke (J & W Scientific, Folsom, CA); Helium-Durchflussrate bei 25 cm/sec; Temperaturprogramm: zu Beginn = 1 Minute bei 119°C, Gradient₁-Rate = 5°C/min bis 130°C über 0,3 Minuten, Gradient₂-Rate = 70°C/min bis 175°C über 1,86 Minuten. Retentionszeiten: 2,85 Minuten [(+)-Menthol], 4,77 Minuten [Ester]. Die Reaktion wurde durch Filtration mit Absaugen des Katalysators beendet. Die optische Reinheit des Esterprodukts wurde mittels GC-Analyse zu 99,4% Enantiomeren-Überschuss („ee") bestimmt.
Die chiralen GC-Bedingungen waren wie folgt: Cyclodex B 25 m Kapillar-GC-Säule, 25 mm i. D. (J & W Scientific, Folsom, CA); N₂-Durchflussrate bei 1 ml/min; Temperaturprogramm: zu Beginn = 5 Min. bei 90°C, Gradientenrate = 1°C/min, abschließend = 10 Minuten bei 115°C. Retentionszeiten: 24,90 Minuten [(+)-Menthol], 25,40 Minuten [(–)-Menthol], 35,97 Minuten [(–)-Ester], 36,11 Minuten [(+)-Ester].
Veresterung von Ibuprofen mit n-Amylalkohol
(R,S)-Ibuprofen (97 mM) wurde in 1 ml Isooctan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 460 mM n-Amylalkohol und 1 mg der in Beispiel 2 hergestellten Formulierung vernetzter CRL-Kristalle gegeben. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur gerührt und die Produktion von n-Amyl-Ibuprofen wurde durch chirale HPLC verfolgt. Nach 24 Stunden hatte die Umwandlung 28% erreicht.
Die chiralen HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Säure: (R,R) Whelk-O1 (Regis Technologies, Morton Grove, IL) 5 mm, 100 A, 25 cm-Säule. Mobile Phase = Hexan + 0,5% Essigsäure. Über einen Zeitraum von 30 Minuten wurde das angesäuerte Hexan gegen Hexan ohne Essigsäure (bei gleich bleibender Rate) ausgetauscht. Helium-Durchflussrate = 1 ml/min, UV-Nachweis bei 254 nm. Retentionszeiten: 16,7 und 19,2 Minuten für den Ester, 21,8 und 28,1 Minuten für die Säure.
Aufspaltung von (R, S)-2-Hydroxyhexansäure durch Veresterung
Einer Lösung von (R,S)-2-Hydroxyhexansäure (532 mM) in 1 ml Toluol, enthaltend n-BuOH (1060 mM), wurden 10 mg der in Beispiel 2 hergestellten Formulierung vernetzter CRL-Kristalle zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde bei 25°C auf einem Magnetrührer gerührt; zu diesem Zeitpunkt zeigte die Kapillar-GC-Analyse eine Umwandlung von 46% an. Die GC-Bedingungen waren wie folgt: DB1701 15 m × 0,25 mm GC-Säule, 25 mm Filmdicke (J & W Scientific, Folsom, CA); Helium-Durchflussrate bei 25 cm/sec; Temperaturprogramm: zu Beginn = 5 Minuten bei 110°C, Gradientenrate = 20°C/min bis 200°C. Probenherstellung: 10 μl Reaktionsgemisch in 1 ml Hexan mit 100 μl MeOH und 100 μl TMS-diazomethan-2M in Hexan. Retentionszeiten: 2,12 Minuten [Methylester], 6,46 Minuten [Butylester]. Die Reaktion wurde durch Filtration mit Absaugen des Katalysators beendet. Die optische Reinheit des Butylesters und der Säure (in Form ihres Methylesters) wurden durch chirale GC-Analyse bestimmt.
Die chiralen GC-Bedingungen waren wie folgt: Cyclodex B 25 m Kapillar-GC-Säule, 25 mm i. D. (J & W Scientific, Folsom, CA); N₂-Durchflussrate bei 1 ml/min; Temperaturprogramm: zu Beginn = 30 Minuten bei 80°C, Gradientenrate = 5°C/min, Abschließend: 10 Minuten bei 170°C. Retentionszeiten: 27,80 Minuten [R-Methylester], 31,03 Minuten [S-Methylester], 44,30 Minuten [R-Butylester] und 44,50 Minuten [S-Butylester].
Aufspaltung von Phenethylalkohol durch Transveresterung
Zu 200 mM Phenethylalkohol und 200 mM Vinylacetat in 1 ml Toluol wurden 1,2 mg der Formulierung vernetzter LPS-Kristalle gegeben, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Der Katalysator wurde durch Zentrifugation entfernt, um die Reaktion zu beenden. Die Umwandlung und die optische Reinheit wurden durch chirale GC bestimmt.
Die chiralen GC-Bedingungen waren wie folgt: 25 m Cyclodex-Kapillar-GC-Säule, 25 mm i. D. (J & W Scientific, Folsom, CA); N₂-Durchflussrate bei 1 ml/min; Temperaturprogramm: zu Beginn = 4 Minuten bei 100°C, Gradientenrate = 5°C/min bis 135°C und 2 Minuten bei 135°C, 2°C/min bis 144°C und 5 Minuten bei 144°C, 5°C/min bis 150°C und 2 Minuten bei 150°C. Retentionszeiten: 12,08 und 12,47 Minuten für den (S)-beziehungsweise den (R)-Ester; 12,25 und 12,55 Minuten für den (R)-beziehungsweise den (S)-Alkohol. Die Umwandlung betrug 41,7% und der Enantiomeren-Überschuss ee des Produkts und des Substrats bei dieser Umwandlung betrugen 98,5% beziehungsweise 70,42% mit einem E-Wert von 297. E wurde gemäß C. S. Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 104, S. 7294–7299 (1982) berechnet. Vergleiche mit J. J. Lalonde et al., J. Am. Chem. Soc., 117, S. 6845–6852 (1995) hinsichtlich einer Diskussion über die Anwendbarkeit von E-Werten für Reaktionen, die einer Hemmung unterliegen oder die durch Rohenzyme katalysiert werden.
Aufspaltung von (±)-Sulcatol
Zu einer Lösung von 80 mM (±)-Sulcatol und 120 mM Vinylacetat in 1 ml Toluol wurden 4 mg der Formulierung vernetzte LPS-Kristalle gegeben, die in Beispiel 1 hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde der Katalysator durch Filtation entfernt. Die optische Reinheit des Produkts und des verbliebenen Ausgangsmaterials wurden unter Verwendung einer chiralen GC-Säule mittels GC direkt bestimmt. Der Enantiomeren-Überschuss ee des verbliebenen Ausgangsmaterials und des Produkt-Alkohols betrugen >98%, beziehungsweise 51,3%.
Die chiralen GC-Bedingungen waren wie folgt: 25 m Cyclodex-B-Kapillar-GC-Säule, 25 mm i. D. (J & W Scientific, Folsom, CA); Helium-Durchflussrate bei 1 ml/min; Temperaturprogramm: zu Beginn = 10 Minuten bei 90°C, Gradientenrate = 5°C pro Minute, abschließend 20 Minuten bei 130°C. Retentionszeiten: (S)-Sulcatol 12,50 Minuten; (R)-Sulcatol 12,32 Minuten; (S)-Sulcatolacetat 14,43 Minuten; (R)-Sulcatolacetat 15,12 Minuten. Die Umwandlung betrug 66,1%. Der E-Wert wurde zu 27 berechnet.
Aufspaltung von (±)-2-Octanol
Zu einer Lösung von 80 mM (±)-2-Octanol und 120 mM Vinylacetat in 1 ml Toluol wurden 4 mg der Formulierung vernetzter LPS-Kristalle gegeben, die in Beispiel 1 hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde der Katalysator durch Filtration entfernt. Die optische Reinheit des Acetat-Produkts wurde unter Verwendung einer chiralen GC-Säule mittels GC direkt bestimmt. Der Enantiomeren-Überschuss ee wurde zu 63,0% bestimmt. Der verbliebene Alkohol wurde durch Reaktion mit Buttersäureanhydrid in Pyridin in sein entsprechendes Butyrat umgewandelt. Die optische Reinheit des Butyrat-Derivats wurde anschließend mittels GC analysiert. Der Enantiomeren-Überschuss ee betrug 83,7%.
Die chiralen GC-Bedingungen waren wie folgt: 25 m Cyclodex-B-Kapillar-GC-Säule, 25 μm i. D. (J & W Scientific, Folsom, CA); Helium-Durchflussrate bei 1 ml/min; Temperaturprogramm: zu Beginn = 10 Minuten bei 90°C, Gradientenrate = 2°C pro Minute, abschließend 20 Minuten bei 130°C. Retentionszeiten: (S)-2-Octanolacetat 15,66 Minuten; (R)-2-Octanolacetat 16,93 Minuten; (S)-2-Octanolbutyrat 26,49 Minuten; (R)-2-Octanolbutryrat 26,95 Minuten. Die Umwandlung betrug 57,1%. Der E-Wert wurde zu 9,8 berechnet.
Aufspaltung von Tryptamin
Eine Lösung von 200 mM Tryptamin und 400 mM 2,2,2-Trifluorethyl-butanoat in 1 ml tert.-Butanol wurde mit 16 mg der Formulierung vernetzter ABL-Kristalle, die in Beispiel 3 hergestellt worden war, auf einem Rotationsschüttler bei 40°C inkubiert. Als der gewünschte Grad der Umwandlung erreicht war, wurde der Katalysator durch Zentrifugation entfernt und mit Ethylacetat gewaschen. Die kombinierten organischen Gemische wurden im Vakuum abgedampft, um einen Rest zu erhalten, der anschließend durch Silikagel-Chromatographie gereinigt wurde, um das verbliebene Tryptamin und das Butylamid-Produkt zu erhalten. Die optische Reinheit des Butylamid-Produkts wurde durch chirale HPLC direkt analysiert. Das verbliebene Amin wurde in das entsprechende Urethan-Derivat durch Behandlung mit Methylchlorformiat überführt und auf optische Reinheit mittels chiraler HPLC analysiert; ee = 94% bei 20% Umwandlung; R-Alphamethyltryptamin ee > 98% bei 53% Umwandlung.
Die Bedingungen bei der chiralen HPLC waren wie folgt: Chiracel OJ-25 cm-Säule (Chiral Technologies, Exton, PA; eine Abteilung der Daicel Chemical, Inc.) für Butylamid; mobile Phase = 80% Hexan (mit 0,1% TFA), 20% Isopropanol (mit 0,1% TFA), Helium-Durchflussrate = 1 ml/min; UV-Nachweis bei 254 nm. Retentionszeiten: D-Butylamid-Produkt 9,3 Minuten und L-Butylamid-Produkt 11,2 Minuten. D-Urethan-Derivat 24,8 Minuten und L-Urethan-Derivat 27,6 Minuten.

Jede der vorstehend beschriebenen Aufspaltungen wurde mit dem entsprechenden Rohenzym der Formulierung vernetzter Enzymkristalle unter Verwendung der in der Fußnote (b) zu Tabelle 1 aufgelisteten Enzymkonzentrationen durchgeführt. Tabelle 1 – Enzym-katalysierte Aufspaltungen in organischen Lösungsmitteln

Verbindung	Acylierungsmittel und Lösungsmittel	Enzym	Vernetzter Enzymkristall × 10³ ^a	Rohenzym × 10^3b	Vernetzter Enzymkristall /Rohenzym; gleiches Protein a,b	Vernetzter Enzymkristall^a	Rohenzym^b
Menthol [449 mM]	VA [449 mM] in Toluol	CRL	1220	4	62	»100	16
Ibuprofen [97 mM]	n-Amylalkohol [460 mM] in Isooctan	CRL	57,5	0,13	90	»100	7,2
Hydroxy-hexansäure [532 mM]	BuOH [1060 mM] in Toluol	CRL	85	2,2	7,9	55	2
Sec.-PhenethylAlkohol [200 mM)	VA [200 mM] in Toluol	LPS	15.000	90	1,7	»100	»100
Sulcatol [80 mM]	VA [120 mM] in Toluol	LPS	6.700	20	3,4	28	35
2-Octanol [80 mM]	VA [120 mM] in Toluol	LPS	11.700	44,5	2,6	9,8	9,9
Methyl-tryptamin [200 mM]	TFB [400 mM] in tert.-BuOH	ABL	12,5	2,9	3,6	41	46

^a Die Konzentrationen an vernetztem Enzymkristall betrugen 4, 1, 10, 1,2, 0,4, 0,4 und 16 mg/ml.
^b Die Konzentrationen an Rohenzym betrugen bei 20; beziehungsweise 15, 50, 8,3, 40, 40 und 28 mg/ml, ausgehend vom Anfang bis zum Ende der Tabelle.

In der Tabelle 1 sind die Raten in μmol/min × mg bei 25°C angegeben und die Konzentrationen werden in Klammern gezeigt.
In Spalte 2 der Tabelle bezeichnet „VA" Vinylacetat und „TFB" bezeichnet Trifluorethylbutyrat. In Spalte 3 betrug der Wassergehalt der Rohenzym-Präparate 9,3%, 2,5% und 5% für CRL, beziehungsweise für LPS und ABL.
In Spalte 4 der Tabelle 1 betrug der Wassergehalt der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle 13,3%, 2,3% und 2,5% für CRL, beziehungsweise für LPS und ABL. Die Mengen an oberflächenaktivem Mittel in den fertigem Präparaten der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle betrugen 16%, 40% und 50% (Gew./Gew.) für CRL, beziehungsweise für LPS und ABL.
In Spalte 6 der Tabelle 1 betrug der Gesamt-Proteingehalt in den Rohpräparaten von CRL, LPS und ABL 10%, beziehungsweise 0,7% und 7%. Der Proteingehalt des rohen ABL betrug 50% (Gew./Gew.).
In Spalte 7 wurden die Reaktionsraten und die Enantiomeren-Selektivität mittels Cyclodex-B- und (R,R)-Whelk-O1-(Ibuprofen) GC-Säulen sowie einer Chiracel OJ-Säule (Methyltryptamin) untersucht. E wurde gemäß C. S. Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 104, S. 7294–7299 (1982) berechnet. Vergleiche mit J. J. Lalonde et al., J. Am. Chem. Soc., 117, S. 6845–6852 (1995) hinsichtlich einer Diskussion über die Anwendbarkeit von E-Werten für Reaktionen, die einer Hemmung unterliegen oder die durch Rohenzyme katalysiert werden.
In Spalte 8 wurde E_app wie für einen irreversiblen Fall berechnet, basierend auf einem Enantiomeren-Überschuss des Produkts bei einer geringen Umwandlung.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, weisen die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle der drei verschiedenen Enzyme (zwei Lipasen und Subtilisin) und ihre entsprechenden Rohformen deutlich unterschiedliche Aktivitäten in Gegenwart organischer Lösungsmittel auf. Die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle waren auf Gewichtsbasis (Spalte 4 und 5) viel aktiver als ihre entsprechenden Rohformen, und bei allen Reaktionen war ihre spezifische Aktivität pro mg Protein ebenfalls höher (Spalte 6). Um zum Beispiel die gleiche Aktivität bei der Aufspaltung von Menthol oder Sulcatol zu erreichen, ist es daher möglich, etwa 300-mal weniger Katalysator zu verwenden. Im Falle von CRL und ABL können die drastischen Unterschiede in den Aktivitäten zwischen den Rohenzym-Präparaten und den Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle nicht Unterschieden in den Wassergehalten zugeschrieben werden. Wenn CRL- und ABL-Rohpräparate bis auf den gleichen Wassergehalt wie die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle (13,3% für CRL und 2,5% für ABL) getrocknet wurden, veränderten sich die Aktivitäten um weniger als 12%.
Wir glauben, dass hiermit zum ersten Mal gezeigt wurde, dass reine Lipasen in heterogener Form in organischen Lösungsmitteln äußerst aktiv sein können.
Darüber hinaus weisen die Formulierungen der vernetzten CRL-Kristalle eine viel höhere Enantiomeren-Selektivität als das CRL-Rohpräparat auf, das Verunreinigungen mit unterschiedlicher Selektivität enthält (Tabelle, Einträge 1–3). In diesem Fall beruhte die erhöhte Enantiomeren-Selektivität der Formulierung vernetzer Enzymkristalle auf der Entfernung kompetitierender Hydrolasen [Lalonde et al., siehe vorstehend].
Der Vergleich der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle mit den in organischen Lösungsmitteln lösbaren Lipase-Komplexen ist aufschlussreich. Die spezifische Aktivität des vernetzten LPS-Enzymkristalls bei der Aufspaltung von Phenethylalkohol (19,5 μmol/min × mg) und Sulcatol (1,48 μmol/min × mg) ist entweder gleich oder höher als die Aktivitäten, die bei den gleichen Reaktionen durch lösliche Komplexe erreicht werden [G. Ottolina et al., Biotechnol. Lett., 14, S. 947–952 (1992) und Okahata et al., (1995), vorstehend]. Die Löslichkeit dieser Komplexe ist jedoch in vielen organischen Lösungsmitteln begrenzt, wodurch es schwierig wird, die hohen Gesamt-Reaktionsraten zu erreichen. Andererseits können die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle gemäß dieser Erfindung in wesentlich höheren Mengen eingesetzt werden und erlauben aufgrund ihrer Unlöslichkeit leichte Abtrennung und Recycling.
Wir glauben, dass oberflächenaktive Mittel eine entscheidende Rolle bei der beobachteten Aktivitätssteigerung spielen, welche die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle dieser Erfindung charakterisiert. Vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel 9.
Für den deutlichen Anstieg der Aktivität der reinen Lipasen in Form der vernetzen Enzymkristalle kann eine Kombination von Wirkungen verantwortlich sein. So kann zum Beispiel die Anwesenheit von amphiphilen oberflächenaktiven Mitteln dazu beitragen, einen besseren Wasserausgleich und die native Konformation der amphiphilen Lipasen aufrecht zu erhalten, was in Rohpräparaten zum Teil durch unterschiedliche Verunreinigungen wie z. B. Lipide, Celite und andere Proteine erreicht wird. Und schließlich können die oberflächenaktiven Mittel auch nur einfach den Transfer von hydrophoben Substratmolekülen durch die Schicht von fest gebundenem Wasser an die Bindungsstelle eines Enzyms erleichtern. Obwohl mehr Arbeit erforderlich ist, um den genauen Mechanismus der Auswirkungen von oberflächenaktiven Mitteln auf die Aktivität der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle aufzuklären, sind die praktischen Auswirkungen dieses Phänomens sofort deutlich: hohe spezifische Aktivität, Reinheit und Stabilität der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle führen zu einer hohen Produktivität des Katalysators in organischen Lösungsmitteln.
Beispiel 5 – Enzymatische Produktivität
Um die Produktivität der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle in organischen Lösungsmitteln in präparativem Maßstab aufzuzeigen, wählten wir die Aufspaltung von sec.-Phenethylalkohol (50 mmol; 6,1 g) mit Vinylacetat (50 mmol; 4,3 g) in Toluol (100 mL), die durch vernetzte LPS-Enzymkristalle (1,3 mg Festkörper; 1 mg Protein) katalysiert wird. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, zu diesem Zeitpunkt hatte die Umwandlung 50% erreicht. Die isolierte Ausbeute an Phenethylacetat betrug 4,5 g (98,5% ee) und ergab eine volumetrische Produktivität von 30 g/l und ein Substrat-zu-Katalysator-Verhältnis von 4600. Die Produktivität erreichte nach 72 Stunden 8000 wenn 100 mmol sec.-Phenethylalkohol verwendet wurden.
Man nimmt an, dass die hohe Produktivität von niedermolekularen synthetischen Katalysatoren den entscheidenden Vorteil gegenüber Enzymen darstellt, die ein hohes Molekulargewicht aufweisen [E. N. Jacobsen und N. S. Finney, Chemistry & Biology, 1, S. 85–90 (1994)]. Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass trotz des hohen Molekulargewichts und dem für ein Enzym völlig unüblichen Reaktionsmedium, die Formulierungen vernetzter Enzymkristalle hoch produktive Katalysatoren darstellen, die sogar im Vergleich mit den besten synthetischen Katalysatoren besser abschneiden.
Beispiel 6 – Screening nach oberflächenaktiven Mitteln für LPS
Proben aus vernetzten LPS-Kristallen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Jede Probe wurde gegenüber einem unterschiedlichen oberflächenaktiven Mittel exponiert und dann in Gegenwart des organischen Lösungsmittels getrocknet, das in Beispiel 1 verwendet worden war. Die Trocknung wurde in einem Volumen von 1 ml an oberflächenaktivem Mittel und organischem Lösungsmittel durchgeführt. Zusätzlich wurden die vernetzten LPS-Kristalle wie in Beispiel 1 hergestellt und wie vorstehend ohne eine Aussetzung gegenüber einem oberflächenaktiven Mittel getrocknet. Die enzymatische Aktivität wurde bei der Aufspaltung von Phenylethylalkohol gemessen.
Noch spezifischer wurden 200 mM sec.-Phenethylalkohol und 200 mM Vinylacetat in 1 ml Toluol zu 1,2 mg-Proben von trockenen vernetzten LPS-Kristallen gegeben, von denen einige gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren und einige nicht gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren. Die Reaktion wurde 30 Minuten ablaufen gelassen, dann wurde der Prozentsatz der Umwandlung durch Gaschromatographie gemessen. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Beispiel 7 – Screening nach oberflächenaktiven Mitteln für ABL
Proben aus vernetzen ABL-Kristallen wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Jede Probe wurde gegenüber einem unterschiedlichen oberflächenaktiven Mittel exponiert und dann in Gegenwart des gleichen organischen Lösungsmittels getrocknet, das in Beispiel 3 verwendet worden war. Die Trocknung wurde in einem Volumen von 1 ml an oberflächenaktivem Mittel und organischem Lösungsmittel durchgeführt. Zusätzlich wurden die vernetzten ABL-Kristalle wie in Beispiel 3 hergestellt und wie vorstehend ohne Aussetzung gegenüber einem oberflächenaktiven Mittel getrocknet. Die enzymatische Aktivität wurde bei der Transveresterung von N-Ac-PheOMe mit n-Propanol in Isooctan gemessen.

Noch spezifischer wurden 1 ml (11 mg) N-Acetyl-L-Phenylalanin-methylester und 20% 1-Propanol in 80% Isooctan zu 1 mg-Proben der trockenen vernetzten ABL-Kristalle gegeben, von denen einige gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren und einige nicht gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren. Die Reaktion wurde 30 Minuten ablaufen gelassen, dann wurde der Prozentsatz der Umwandlung durch Gaschromatographie gemessen. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Oberflächenaktives Mittel		% Umwandlung
Anionische oberflächenaktive Mittel:	Aerosol 22	30
	Dioctyl-sulfosuccinat (AOT)	98
	Alkyl-Natriumsulfat (Niaproof)
	Typ 4	69
	Typ 4	51
	Alkyl-(C9-C13)Natriumsulfate
	(TEEPOL HB7)	33
Kationische oberflächenaktive Mittel:	Methyl-triocytl-ammoniumchlorid
	(Aliquat 336)	93
	N,N',N'-Polyoxyethylen
	(10)-N-Talg-1,3-
	diaminopropan
	(EDT-20, PEG-10 Talg)	83

Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel:	Polyoxyethylenether:
	4-Laurylether (Brij 30)	93
	23-Laurylether (Brij 35)	91
	Octyl-phenoxy-polyethoxyethanol
	(Tritone):
	Tx-15	43
	Tx-100	87
	Tx-114	89

	Polyoxyethylen-sorbitan-Monolaurerat (Tween 20)	75
	Sorbitan:
	Sesquioleat (Arlacel 83)	39
	Trioleat (Span 85)	38
	Polyglycolether (Tergitol):
	Typ N P-4	89
	Typ N P-9	88
	Typ N P-35	95
	Typ TMN-6 (2,6,8-Trimethyl-4-nonyloxypolyethylenoxyethanol	85
	Typ TMN-10	91
	Typ 15-S-3	95
	Typ 15-S-40	88
	Kein oberflächenaktives Mittel	3

Beispiel 8 – Screening nach oberflächenaktiven Mitteln für CRL
Proben aus vernetzen CRL-Kristallen wurden wie in Beispiel 2 hergestellt.
Jede Probe wurde gegenüber einem unterschiedlichen oberflächenaktiven Mittel exponiert und dann in Gegenwart des gleichen organischen Lösungsmittels getrocknet, das in Beispiel 2 verwendet worden war. Die Trocknung wurde in einem Volumen von 1 ml an oberflächenaktivem Mittel und organischem Lösungsmittel durchgeführt. Zusätzlich wurden die vernetzten ABL-Kristalle wie in Beispiel 2 hergestellt und wie vorstehend ohne Aussetzung gegenüber einem oberflächenaktiven Mittel getrocknet. Die enzymatische Aktivität wurde bei der Transveresterung von N-Amylalkohol mit Ethylacetat in Toluol gemessen.

Noch spezifischer wurden 184 nM n-Amylalkohol in Ethylacetat und 1 ml Toluol zu 2 mg-Proben von trockenen vernetzten CRL-Kristallen gegeben, von denen einige gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren und einige nicht gegenüber oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt worden waren. Die Reaktion wurde 30 Minuten ablaufen gelassen, dann wurde der Prozentsatz der Umwandlung durch Gaschromatographie gemessen. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Oberflächenaktives Mittel		% Umwandlung
Anionische oberflächenaktive Mittel:	Aerosol 22	12
	Dioctyl-sulfosuccinat (AOT)	13
	Triton QS-30	13
Kationische oberflächenaktive Mittel:	EDT-20, PEG-10 Talg	9
Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel:	Octyl-phenoxy-polyethoxyethanol
	Tx-15	16
	Tx-114	17
	DF-16	9
	N-57	9
	N P-4	11
	Polyoxyethylen-sorbitan:
	Monolaurerat (Tween 20)	11
	Sorbitan:
	Sesquioleat (Arlacel 83)	15
	Polyglycolether (Tergitol)
	Typ TMN-6	16
	Typ 15-S-3	12
	Typ 15-3-40	10
	Kein oberflächenaktives Mittel	0

Beispiel 9 – Wirkungen von oberflächenaktiven Mitteln
Das folgende Beispiel zeigt die entscheidende Rolle der oberflächenaktiven Mittel bei der Aktivitätssteigerung, die die Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle gemäß dieser Erfindung aufweisen. Wir stellten die vernetzten Enzymkristalle wie in den Beispielen 1–3 beschrieben her, mit der Ausnahme, dass wir sie bis zu einem Wassergehalt trockneten, der ähnlich dem der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle in diesen Beispielen war, jedoch ohne oberflächenaktive Mittel zu verwenden. Diese Wassergehalte betrugen 13,3% Wassergehalt für CRL; 1,7–2% Wassergehalt für LPS und 2,2–2,4% Wassergehalt für ABL.

Bei jeder Enzymprobe wurde die Trocknung in Gegenwart des gleichen Lösungsmittels durchgeführt, welches für das jeweilige Enzym in Beispiel 1, 2 oder 3 in kleinerem Maßstab (1 ml) verwendet worden war. Dann maßen wir den anfänglichen Aktivitätsgrad anstelle des Prozentsatzes der Umwandlung mit den Testansätzen, die in den Beispielen 6–8 für das entsprechende Enzym beschrieben wurden. Wir maßen ebenfalls die anfängliche Aktivität jeder Formulierung der vernetzten Enzymkristalle der Beispiele 1–3 mit dem entsprechenden Testansatz für das jeweilige Enzym (CRL-Testansatz: Beispiel 8; LPS-Testansatz: Beispiel 6; ABL-Testansatz: Beispiel 7). Beim Vergleich mit den anfänglichen Aktivitätsgraden der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle aus den Beispielen 1–3 waren die anfänglichen Aktivitäten der vernetzten Enzymkristalle, die ohne oberflächenaktive Mittel getrocknet worden waren, 19-fach (ABL), 79-fach (LPS) und mehr als 100-fach (CRL) niedriger. Tabelle 5

Enzym	% Feuchtigkeit	anfängliche Aktivität (μmol/min × mg)	Enzym (mg/ml)
CRL trocken kein oberflächenaktives Mittel	13,5	0,0	3,5
CRL trocken oberflächenaktives Mittel	13,2	0,25	2,0
LPS trocken kein oberflächenaktives Mittel	2,3	0,09	5,3
LPS trocken oberflächenaktives Mittel	2,0	7,1	0,1
ABL trocken kein oberflächenaktives Mittel	2,4	0,03	6,6
ABL trocken oberflächenaktives Mittel	2,2	0,58	0,3
Prozentsatz (%) an oberflächen aktivem Mittel in den Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle
Enzym	% oberflächenaktives Mittel
CRL	25–30
LPS	40–45
ABL	40–45

Beispiel 10 – Screening nach oberflächenaktiven Mitteln
Wir verwendeten ein alternatives Verfahren, um eine Reihe an anionischen, kationischen und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln für die Verwendung bei der Herstellung der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle gemäß dieser Erfindung zu screenen. Bei diesem Screening-Verfahren wurde die Enzymaktivität der Formulierungen der vernetzten Enzymkristalle, die wie in den Beispielen 6–8 hergestellt worden waren, nach der Trocknung der vernetzten Enzymkristalle in einem bestimmten oberflächenaktiven Mittel in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels und nach 12 Tagen Aufbewahrung bei Zimmertemperatur gemessen. Die Aktivität der trockenen CRL-Proben wurde durch die Transveresterung von n-Amylalkohol mit Ethylacetat in Toluol gemessen, wie in Beispiel 8 beschrieben. Die Aktivität der trockenen ABL-Proben wurde mittels der Transveresterung von N-Ac-PheOMe mit n-Propanol in Isooctan gemessen, wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Aktivität der trockenen LPS-Proben wurde durch die Aufspaltung von Phenylethylalkohol gemessen, wie in Beispiel 6 beschrieben. Obwohl Enzyme, die gegenüber mehreren der oberflächenaktiven Mittel exponiert worden waren, nach der Trocknung eine hohe Aktivität aufwiesen, behielten nur einige wenige diesen hohen Spiegel nach der Lagerung bei. Neben den oberflächenaktiven Mitteln, die in diesen Beispielen verwendet wurden, lieferten auch einige andere – Tritone und Dioctyl-sulfosuccinat bei CRL und Dioctyl-sulfosuccinat und 4-Laurylether bei ABL – Formulierungen vernetzter Enzymkristalle hohe Aktivität nach der Lagerung.
Obwohl wir hierin vorstehend eine Reihe an Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben haben, ist es offensichtlich, dass unsere grundlegenden Konstruktionen verändert werden können, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, welche die Verfahren und die Zusammensetzungen dieser Erfindung verwenden. Daher wird anerkannt werden, dass der Rahmen dieser Erfindung durch die Ansprüche definiert wird, die hieran im Anhang erscheinen, und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die hierin vorstehend als Beispiele angeführt wurden.

Claims

Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Formulierung umfasst: (a) einen vernetzten Proteinkristall; und (b) ein oberflächenaktives Mittel, wobei das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln; wobei die Formulierung eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 1,7 mal größer ist als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 1, wobei die Formulierung eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die zwischen etwa 1,7 mal und etwa 90 mal größer ist als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Formulierung umfasst: (a) einen vernetzten Proteinkristall; und (b) ein oberflächenaktives Mittel, wobei das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln; wobei die Formulierung eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 4,3 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Formulierung umfasst: (a) einen vernetzten Proteinkristall; und (b) ein oberflächenaktives Mittel, wobei das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln; wobei die Formulierung ferner eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die zwischen etwa 4 mal und etwa 442 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 3, wobei die Formulierung eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 50 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 3, wobei die Formulierung eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 100 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 3, wobei die Formulierung eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 200 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 3, wobei die Formulierung eine spezifische Aktivität pro Milligramm des Feststoffs in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 300 mal größer ist als die des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle, wobei die Formulierung umfasst: (a) einen vernetzten Proteinkristall; und (b) ein oberflächenaktives Mittel, wobei das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln; wobei die Formulierung ferner eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 19 mal größer ist als die Aktivität vernetzter Proteinkristalle, die kein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 9, wobei die Formulierung eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die zwischen etwa 19 mal und etwa 100 mal größer ist als die Aktivität vernetzter Proteinkristalle, die kein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das oberflächenaktive Mittel zwischen etwa 10 und etwa 70 Gew.% der Formulierung umfasst.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 11, wobei das oberflächenaktive Mittel zwischen etwa 25 und etwa 45 Gew.% der Formulierung umfasst.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das anionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearem Alkylbenzolsulfonat, Alpha-Olefinsulfonat, Alkylsulfat, Alkoholethoxysulfat, Carbonsäuren, Schwefelsäureestern und Alkansulfonsäuren.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Aminsalzen, Sulfonium-, Phosphonium- und quarternären Ammoniumverbindungen.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nonylphenolethoxylat, Alkoholethoxylat, Sorbitantrioleat, nicht-ionischen Blockcopolymer-oberflächenaktiven Mitteln, Polyethylenoxid, Polyethylenoxid-substituierte phenolischen Alkoholen und Polyethylenoxid-substituierten Fettsäuren.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei der Proteinkristall ein Mikrokristall ist.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das Protein ein Enzym oder ein Antikörper ist.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 17, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Ligasen, Transferasen und Oxidoreduktasen.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 18, wobei das Enzym eine Hydrolase ist.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 19, wobei die Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thermolysin, Elastase, Esterase, Lipase, Nitrilase, Hydantoinase, Protease, Asparaginase, Uresse und Lysozym.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei die Formulierung in gefriergetrockneter Form vorliegt.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Octanen, Diolen, Polyolen, Polyethern, wasserlöslichen Polymeren und Gemischen davon.
Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß Anspruch 22, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Toluol, Octan, Tetrahydrofuran, Aceton, Pyridin, Diethylenglycol, 2-Methyl-2,4-pentandiol, Poly(ethylenglycol), Triethylenglycol, 1,4-Butandiol, 1,2-Butandiol, 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol, Dimethyltartrat, Monoalkylethern von Poly(ethylenglycol), Dialkylethern von Poly(ethylenglycol), Polyvinylpyrrolidon und Gemischen davon.
Reaktive topische Zusammensetzung, umfassend eine katalytisch wirksame Menge der Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Reaktive topische Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei die Formulierung vernetzter Proteinkristalle zwischen etwa 0,1 und etwa 99 Gew.% der Zusammensetzung umfasst.
Reaktive topische Zusammensetzung gemäß Anspruch 25, wobei die Formulierung vernetzter Proteinkristalle zwischen etwa 1 und etwa 10 Gew.% der Zusammensetzung umfasst.
Verfahren zur Steigerung der Aktivität der vernetzten Proteinkristalle in einem organischen Lösungsmittel oder einem vermischten wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kombinieren der vernetzten Proteinkristalle mit einem oberflächenaktiven Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus an ionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln, um eine Kombination hervorzubringen; und (b) Trocknen der Kombination von vernetzten Proteinkristallen und oberflächenaktivem Mittel in der Gegenwart eines organischen Lösungsmittels oder eines wässrig-organischen Lösungsmittelgemischs, um eine Formulierung vernetzter Proteinkristalle zu erzeugen.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Formulierung eine Aktivität in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch hat, die mindestens 1,7 mal größer ist als die Aktivität einer gleichwertigen Menge des Proteins entweder in Rohform oder in reiner Form.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei in Schritt (a) die Kombination ein Gewichtsverhältnis der vernetzten Proteinkristalle zu oberflächenaktivem Mittel zwischen etwa 1:1 und etwa 1:5 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei in Schritt (a) die Kombination ein Gewichtsverhältnis von vernetzten Proteinkristallen zu oberflächenaktivem Mittel zwischen etwa 1:1 und etwa 1:2 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei in Schritt (a) die vernetzten Proteinkristalle und das oberflächenaktive Mittel für eine Zeitspanne zwischen etwa 5 Minuten und etwa 24 Stunden kombiniert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei in Schritt (a) die vernetzten Proteinkristalle und das oberflächenaktive Mittel für eine Zeitspanne zwischen etwa 30 Minuten und etwa 24 Stunden kombiniert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das oberflächenaktive Mittel zwischen etwa 10 und etwa 70 Gew.% der in Schritt (b) erzeugten Formulierung vernetzter Proteinkristalle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei das oberflächenaktive Mittel zwischen etwa 25 und etwa 45 Gew.% der in Schritt (b) erzeugten Formulierung vernetzter Proteinkristalle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das anionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearem Alkylbenzolsulfonat, Alpha-Olefinsulfonat, Alkylsulfat, Alkoholethoxysulfat, Carbonsäuren, Schwefelsäureestern und Alkansulfonsäuren.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Aminsalzen, Sulfonium-, Phosphonium- und quarternären Ammoniumverbindungen.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nonylphenolethoxylat, Alkoholethoxylat, Sorbitantrioleat, nicht-ionischen Blockcopolymer-oberflächenaktiven Mitteln, Polyethylenoxid, Polyethylenoxid-substituierten phenolischen Alkoholen und Polyethylenoxid-substituierten Fettsäuren.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Protein ein Enzym oder ein Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Ligasen, Transferasen und Oxidoreduktasen.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei das Enzym eine Hydrolase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei die Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thermolysin, Elastase, Esterase, Lipase, Asparaginase, Nitrilase, Hydantoinase, Protease, Uresse und Lysozym.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Octanen, Diolen, Polyolen, Polyethern, wasserlöslichen Polymeren und Gemischen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Toluol, Octan, Tetrahydrofuran, Aceton, Pyridin, Diethylenglycol, 2-Methyl-2,4-pentandiol, Poly(ethylenglycol), Triethylenglycol, 1,4-Butandiol, 1,2-Butandiol, 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol, Dimethyltartrat, Monoalkylethern von Poly(ethylenglycol), Dialkylethern von Poly(ethylenglycol), Polyvinylpyrrolidon und Gemischen davon.
Verfahren zum Herstellen eines ausgewählten Produkts in einem organischen Lösungsmittel oder einem wässrig-organischen Lösungsmittelgemisch unter Verwendung eines Proteins, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kombinieren mindestens eines Substrats und mindestens eines Proteins, das in der Gegenwart eines organischen Lösungsmittels oder eines wässrig-organischen Lösungsmittelgemischs auf das Substrat einwirkt, wobei das Protein eine Formulierung vernetzter Proteinkristalle gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 9 ist; und (b) Halten der in Schritt (a) erzeugten Kombination unter Bedingungen, die dem Protein erlauben, auf das Substrat einzuwirken und dadurch das ausgewählte Produkt zu erzeugen.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei das Produkt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus chiralen organischen Molekülen, Peptiden, Kohlehydraten und Lipiden.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei das Protein ein Enzym oder ein Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Ligasen, Transferasen und Oxidoreduktasen.
Verfahren gemäß Anspruch 47, wobei das Enzym eine Hydrolase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei die Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thermolysin, Elastase, Esterase, Lipase, Nitrilase, Hydantoinase, Protease, Asparaginase, Uresse und Lysozym.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei mindestens eines der organischen Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Octanen, Diolen, Polyolen, Polyethern, wasserlöslichen Polymeren und Gemischen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Toluol, Octan, Tetrahydrofuran, Aceton, Pyridin, Diethylenglycol, 2-Methyl-2,4-pentandiol, Poly(ethylenglycol), Triethylenglycol, 1,4-Butandiol, 1,2-Butandiol, 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol, Dimethyltartrat, Monoalkylethern von Poly(ethylenglycol), Dialkylethern von Poly(ethylenglycol), Polyvinylpyrrolidon und Gemischen davon.